Đồ án tốt nghiệp: Nghiên cứu sự tích luỹ protein và lectin trong các giai đoạn sinh trưởng và phát triển của cây đậu ngự (Phaseolus lunatus L.) trồng trên bãi bồi ven sông Thừa Thiên Huế

Chia sẻ: Nguyễn Thế Anh | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:49

Thêm vào BST

Báo xấu

180
lượt xem 39
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Có kết cấu gồm 4 phần, trong đó phần 1 giới thiệu tổng quan về tài liệu, phần 2 trình bày về đối tượng và phương pháp nghiên cứu, phần 3 giới thiệu về kết quả và bàn luận, phần 4 trình bày về kết luận và kiến nghị. Đồ án tốt nghiệp với đề tài trên sẽ giúp các bạn có thêm tài liệu tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Đồ án tốt nghiệp: Nghiên cứu sự tích luỹ protein và lectin trong các giai đoạn sinh trưởng và phát triển của cây đậu ngự (Phaseolus lunatus L.) trồng trên bãi bồi ven sông Thừa Thiên Huế

LỜI CẢM ƠN Trước tiên Chúng Tôi xin gửi lời cám ơn chân thành sâu sắc tới các Thầy Cô giáo trong Trường Đại học Khoa học Huế nói chung và các Thầy Cô giáo trong khoa Sinh học, bộ môn Công nghệ Sinh học nói riêng đã tận tình giảng dạy, truyền đạt cho Chúng Tôi những kiến thức, kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian qua. Đặc biệt Chúng Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Thầy giáo Cao Đăng Nguyên và Cô giáo Lê Thị Hà Thanh, Thầy và Cô đã tận tình giúp đ ỡ, tr ực tiếp chỉ b ảo, hướng dẫn Chúng Tôi suốt quá trình làm đồ án tốt nghiệp. Trong thời gian làm việc với Thầy và Cô, Chúng Tôi không ngừng tiếp thu thêm nhiều kiến thức bổ ích mà còn học tập được tinh thần làm việc, thái độ nghiên cứu khoa học nghiêm túc, hiệu quả. Đây là những điều rất cần thiết trong quá trình học tập và công tác sau này. Sau cùng Chúng Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè đã động viên, đóng góp ý kiến và giúp đỡ trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành đồ án tốt nghiệp.
MỤC LỤC Contents LỜI CẢM ƠN......................................................................................................... 1 Contents.................................................................................................................... 2 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT........................................................................ 1 DANH MỤC BẢNG................................................................................................ 2 DANH MỤC ĐỒ THỊ VÀ HÌNH VẼ..................................................................... 3 MỞ ĐẦU.................................................................................................................. 4 PHẦN 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................................ 6 I. SƠ LƯỢC VỀ PROTEIN................................................................................... 6 1. Những đặc trưng chung của protein................................................................. 6 2. Cấu trúc protein.................................................................................................. 7 2.1. Thành phần hoá học của protein.................................................................... 7 2.2. Đơn vị cấu tạo cơ sở của protein –Amino acid............................................. 7 2.3. Các bậc cấu trúc của phân tử protein............................................................ 8 2.3.1. Cấu trúc bậc nhất (cấu trúc sơ cấp).......................................................... 8 2.3.2. Cẩu trúc bậc II (cấu trúc thứ cấp)............................................................. 8 2.3.3. Cấu trúc bậc III............................................................................................. 8 2.3.4. Cấu trúc bậc IV............................................................................................. 9 3. Phân loại protein................................................................................................. 9 3.1. Protein đơn giản............................................................................................... 9 3.2. Protein phức tạp............................................................................................. 10 4. Chức năng sinh học của protein...................................................................... 10 4.1. Xúc tác............................................................................................................. 10 4.2. Vận tải............................................................................................................ 10 4.3. Chuyển động.................................................................................................. 10
4.4. Bảo vệ............................................................................................................. 10 4.5. Truyền xung thần kinh.................................................................................. 11 4.6. Điều hoà......................................................................................................... 11 4.7. Kiến tạo và chống đỡ cơ học...................................................................... 11 4.8. Dự trữ dinh dưỡng....................................................................................... 11 II. VÀI NÉT VỀ LECTIN...................................................................................... 11 1. Sơ lược lịch sử nghiên cứu lectin.................................................................... 11 2. Tình hình nghiên cứu lectin trên thế giới và ở Việt nam..............................14 2.1. Tình hình nghiên cứu lectin trên thế giới..................................................... 14 2.2. Tình hình nghiên cứu lectin ở Việt Nam...................................................... 15 3. Tính phổ biến của lectin trong tự nhiên......................................................... 16 3.1. Sự phân bố lectin trong thực vật.................................................................. 16 3.1.1. Phân loại và trình tự của lectin thực vật.................................................. 16 3.1.2. Độc tỉnh của lectin thực vật....................................................................... 17 3.1.3. Phân lập lectin thực vật.............................................................................. 17 3.2. Sự phân bố lectin trong động vật................................................................. 18 3.3.Sự phân bố lectin trong ví sinh vật................................................................ 19 3.4. Sự định khu cửa lectin trong tế bào và cơ thể sinh vật.............................. 19 PHẦN 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................20 I. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU........................................................................... 20 II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................................................................... 20 1. Dụng cụ và hóa chất......................................................................................... 20 2. Xử lý mẫu vật................................................................................................... 20 3. Phương pháp xác định hoạt độ lectin............................................................. 22 3.1. Hoạt độ chung (HĐC).................................................................................... 23 3.2. Hoạt độ riêng (HĐR)..................................................................................... 23 3.3. Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp quang phổ.....................23
3.4. Nghiên cứu đặc trưng củaprotein bằng điện diSDS-PAGE...................... 23 PHẦN 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN.................................................................. 25 I. SỰ TÍCH LUỸ PROTEIN VÀ LECTIN........................................................... 25 1. SỰ TÍCH LŨY PROTEIN................................................................................. 25 1.1. Giai đoạn mọc................................................................................................ 25 1.2. Giai đoạn lá đơn............................................................................................. 26 1.3. Giai đoạn 1 lá kép........................................................................................... 26 1.4. Giai đoạn 2 lá kép........................................................................................... 27 1.5. Giai đoạn 3 lá kép........................................................................................... 27 1.6. Giai đoạn (n-1) lá kép..................................................................................... 28 1.8. Giai đoạn hoa rộ............................................................................................. 29 1.9. Giai đoạn làm quả.......................................................................................... 29 1.10. Giai đoạn làm quả rộ................................................................................... 30 1.11. Giai đoạn làm hạt......................................................................................... 31 1.12. Giai đoạn quả chắc...................................................................................... 31 1.13. Giai đoạn chín sinh lý................................................................................... 32 1.14. Giai đoạn chín thu hoạch............................................................................. 32 2. SỰ TÍCH LŨY LECTIN.................................................................................... 39 3. Nghiên cứu phổ điện di protein....................................................................... 41 PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.............................................................. 42 1. KẾT LUẬN........................................................................................................ 42 2. KIẾN NGHỊ........................................................................................................ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO..................................................................................... 43 I.TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT..................................................................................... 43
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ConA Concanavalin A Đv Đơn vị HAA Hemaglutinatiing Activity HĐC Hoạt độ chung HĐR Hoạt độ riêng HIV Human Immuno-deficiency Vius kDa Kilo Dalton Mgpr Miligam protein PHA Phytohemagglutinin PBS Phosphate Buffered Saline OD Optical Density SDS-PAGE Sodium Đoecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis TEMED Tetramethylethylenediamine APS Ammonumpersulfate X Cơ quan không có hoặc không nghiên cứu 1
DANH MỤC BẢNG Số hiệu Nội dung Trang 1.1 Khối lượng và cấu trúc phân tử của một số protein 5 2.1 Các thời kỳ sinh trưởng và phát triển của đậu ngự 20 3.1.1 Sự tích lũy protein ở giai đoạn mọc 24 3.1.2 Sự tích lũy protein ở giai đoạn lá đơn 25 3.1.3 Sự tích lũy protein ở giai đoạn lá kép 25 3.1.4 Sự tích lũy protein ở giai đoạn 2 lá kép 26 3.1.5 Sự tích lũy protein ở giai đoạn 3 lá kép 26 3.1.6 Sự tích lũy protein ở giai đoạn (n-1) lá kép 27 3.1.7 Sự tích lũy protein ở giai đoạn ra hoa 27 3.1.8 Sự tích lũy protein ở giai đoạn ra hoa rộ 28 3.1.9 Sự tích lũy protein ở giai đoạn làm quả 28 3.1.10 Sự tích lũy protein ở giai đoạn làm quả rộ 29 3.1.11 Sự tích lũy protein ở giai đoạn làm hạt 29 3.1.12 Sự tích lũy protein ở giai đoạn quả chắc 30 3.1.13 Sự tích lũy protein ở giai chín sinh lý 30 3.1.14 Sự tích lũy protein ở giai đoạn chín thu hoạch 31 3.1.15 Sự tích lũy protein ở tất cả các giai đoạn 37 3.2.1 Sự tích lũy lectin có hoạt độ riêng 37 2
DANH MỤC BIỂU ĐỒ Số hiệu Nội dung Trang 3.1.1 Sự tích lũy protein ở giai đoạn mọc 24 3.1.2 Sự tích lũy protein ở giai đoạn lá đơn 25 3.1.3 Sự tích lũy protein ở giai đoạn lá kép 25 3.1.4 Sự tích lũy protein ở giai đoạn 2 lá kép 26 3.1.5 Sự tích lũy protein ở giai đoạn 3 lá kép 26 3.1.6 Sự tích lũy protein ở giai đoạn (n-1) lá kép 27 3.1.7 Sự tích lũy protein ở giai đoạn ra hoa 27 3.1.8 Sự tích lũy protein ở giai đoạn ra hoa rộ 28 3.1.9 Sự tích lũy protein ở giai đoạn làm quả 28 3.1.10 Sự tích lũy protein ở giai đoạn làm quả rộ 29 3.1.11 Sự tích lũy protein ở giai đoạn làm hạt 29 3.1.12 Sự tích lũy protein ở giai đoạn quả chắc 30 3.1.13 Sự tích lũy protein ở giai chín sinh lý 30 3.1.14 Sự tích lũy protein ở giai đoạn chín thu hoạch 31 3.1.15 Sự tích lũy protein ở tất cả các giai đoạn 37 3.2.1 Sự tích lũy lectin có hoạt độ riêng 37 DANH MỤC ĐỒ THỊ VÀ HÌNH VẼ 3
Số hiệu Nội dung Trang 3.1.1 Sự tích lũy protein ở lá qua các giai đoạn 33 3.1.2 Sự tích lũy protein ở thân qua các giai đoạn 33 3.1.3 Sự tích lũy protein ở rễ qua các giai đoạn 34 3.1.4 Sự tích lũy protein ở hoa qua các giai đoạn 34 3.1.5 Sự tích lũy protein ở quả qua các giai đoạn 35 3.1.6 Sự tích lũy protein ở hạt qua các giai đoạn 35 3.1.7 Mối tương quan trong sự tích lũy protein ở tất cả các 37 bộ phận và giai đoạn. 3.1.8 Sự tích lũy lectin 39 3.1.9 Phổ điện di protein 41 MỞ ĐẦU Protein tham gia mọi hoạt động sống trong cơ thể sinh vật, từ việc tham gia xây dựng tế bào, mô, đến tham gia hoạt động xúc tác và nhiều chức năng khác... 4
Ngày nay, khi hiểu rõ vai trò to lớn của protein đối với cơ thể sống, người ta càng thấy rõ tính chất duy vật và ý nghĩa của định nghĩa thiên tài của Anghen F. : “sống là phương thức tồn tại của những thể protein”. Với sự phát triển của khoa học, vai trò và ý nghĩa của protein ngày càng được khẳng định, protein là cơ s ở vật ch ất của sự sống [17]. Với vai trò và tiềm năng ứng dụng to lớn, công nghệ protein trở thành một hướng nghiên cứu quan trọng của công nghệ sinh học và đã đạt được những thành tựu đáng chú ý ứng dụng vào các lĩnh vực khác nhau của cuộc sống như nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm, đặc biệt trong lĩnh vực y dược học với việc tạo ra các loại thuốc quý hiếm như insulin, các globulin miễn dịch, các kháng thể đơn dòng, các yếu tố đông máu, thuốc chống HIV.. [17]. Trong các thành tựu đạt được không thể không nhắc tới protein lectin. Lectin là một trong những hợp chất được phát hiện cách đây hơn một thế kỷ và hiện nay vẫn đang thu hút sự quan tâm nghiên cứu bởi hoạt tính và các ch ức năng đặc biệt của nó. Bản chất của lectin là protein mà chủ yếu là glycoprotein, có khả năng gây ngưng kết các tế bào hồng cầu người và động vật, một số tế bào lạ và đặc hiệu với một số loại đường. Tuy không có nguồn gốc miễn dịch nhưng các nhà khoa học đã chứng minh rằng chúng có vai trò trong miễn dịch của thực vật, có khả năng gây ngưng kết với các tế bào dị thường và ác tính, vi khuẩn, virus và kháng nguyên lạ... Hơn nữa, lectin là hợp chất phân bố rộng trong tự nhiên (có ở cả thực vật, động vật và vi sinh vật), đặc biệt là ở các cây họ Đậu. Vì vậy, nguồn nguyên liệu để chiết xuất lectin rất đa dạng và phong phú [31]. Việc điều tra, nghiên cứu để tạo các chế phẩm lectin có hoạt tính cao đang được chú ý ở Việt Nam và nhiều nguồn lectin đang được nghiên cứu chủ yếu là ở động thực vật. Đã có nhiều công trình nghiên cứu của các tác giả như Đỗ Ngọc Liên, Cao Đăng Nguyên, Nguyễn Quốc Khang và các cộng sự khác được công bố trên các đối tượng khác nhau, làm cơ sở cho các ứng dụng thực tiễn của lectin trong miễn dịch cũng như trong y học [2, 3, 6, 7, 19,20]. Lectin phân bố rộng, đặc biệt có nhiều trong các cây họ Đậu, chính vì vậy mà các cây họ Đậu là đối tượng được tập trung vào nghiên cứu nhiều nhất. Đ ậu ngự cũng là một đối tượng được quan tâm. Trong quá trình phát triển, ở các giai đoạn khác nhau cũng như ở các điều kiện ngoại cảnh khác nhau, cây đậu sẽ có sự tích luỹ protein cũng như lectin khác nhau. Hiện nay, chưa có công trình nào công bố một cách đầy đủ về sự tích luỹ của protein và lectin ừong các giai đoạn phát triển của cây. Vì vậy, để hiểu rõ hơn về protein và lectin của cây đậu ngự, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu sự tích luỹ protein và lectin trong các giai đoạn sinh trưởng và phát triển của cây đậu ngự ( Phaseolus lunatus L.) trồng trên bãi bồi ven sông Thừa Thiên Huế” 5
PHẦN 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU I. SƠ LƯỢC VỀ PROTEIN 1. Những đặc trưng chung của protein Protein được phát hiện làn đầu tiên ở thế kỷ XVIII (1745 bởi Beccari); mới đầu được gọi là albumin (lòng trắng trứng). Mãi đến năm 1838, Mulder làn đ ầu tiên đưa ra thuật ngữ protein (xuất phát từ chữ Hy lạp proteos nghĩa là “đầu tiên”, “quan trọng nhất”. Biết được tầm quan trọng và nhu cầu xã hội về protein, đ ến nay nhiều cồng trình nghiên cứu và sản xuất hợp chất này đã đ ược công b ố, đã đem lại nhiều ý nghĩa hết sức to lớn phục vụ cho nhân loại. Vì vậy, nhiều nhà khoa học trên thế giới đã vinh dự nhận được giải thưởng Nobel về các lĩnh vực nghiên cứu liên quan đến protein [17]. Protein là hợp chất hữu cơ có ý nghĩa quan trọng bậc nhất trong cơ thể sống, về mặt số lượng, nó chiếm không dưới 50% trọng lượng khô của tế bào, về thành phần cấu trúc, protein được tạo thành chù yếu từ các amino acid qua liên kết peptide Cho đến nay, người ta đã thu được nhiều loại protein ở dạng sạch cao có thể kết tinh được và đã xác định được thành phần các nguyên tố hoá học, thông thường trong cấu trúc của chúng gồm bốn nguyên tố chính là C, H, O, N với tỷ lệ C: 50%, H: 7%, O: 23% và N: 16%. Đặc biệt tỷ lệ N trong protein khá ổn đ ịnh. Nhờ tính chất này để định lượng protein theo phương pháp Kjeldahl, người ta tính lượng N rồi nhân với hệ số 6,25. Ngoài ra trong protein còn gặp một số nguyên tố khác như S: 0-3% và p, Fe, Zn, Cu.[17]. Khối lượng phân tử, ký hiệu là Mr (được tính bằng Dalton) của các loại protein thay đổi trong những giới hạn rất rộng, thông thường từ hàng trăm cho đến hàng triệu. Ví dụ: insulin có khối lượng phân tử bằng 5.733 Dalton, glutamat- dehydrogengenase trong gan bò có khối lượng phân tử bằng 1.000.000 Dalton (Bảng l.l). Bảng 1.1. Khối lượng và cấu trúc phân tử của một số protein. Protein Khối Số gốc Số chuỗi lượng amino acid polipeptide (Dalton) Glucagon 3482 29 1 Insulin 5733 51 2 Ribonuclease (tụy bò) 12.64 124 1 Lysozyme (lòng trắng trứng) 13.93 129 1 Myoglobin (tim ngựa) 16.89 153 1 6
Chymotripsin (tụy bò) 22.6 241 3 Hemoglobin (người) 64.5 574 4 Albumin (huyết thanh người) 68.5 550 1 Hexokinase (men bia) 96 800 4 Tryptophan-synthetase (E.coli) 117 975 4 ϒ-globulin (ngựa) 149 l25 4 Glycogen-phosphorylase (cơ thỏ) 495 4.1 4 Glutamatedehydrogengenase (bò) 1.000.000 8.3 40 Synthetase của acid béo (men bia) 2.300.000 20 21 Virus khảm thuốc lá 40.000.000 336.5 2.13 Protein có vai trò vô cùng quan trọng trong cơ thể của tất cả các sinh vật, nhóm chất này tham gia vào mọi hoạt động sống của cơ thể, chúng có chức năng từ việc tham gia xây dựng tế bào, mô đến tham gia hoạt động xúc tác, điều khiển các quá trình trao đổi chất của cơ thể [ 17] 2. Cấu trúc protein 2.1. Thành phần hoá học của protein Tất cả các protein đều chứa các nguyên tố C, O, N, H, một số còn chứa lượng nhỏ S. Tỷ lệ phần trăm khối lượng các nguyên tố này trong phân tử protein như sau: C từ 50 đến 55%; o từ 21 đến 24%; N từ 15 đến 18%; H từ 6,5 đến 7,3%; S từ 0 đến 0,24% [1]. Ngoài các nguyên tố trên, một số protein còn chứa một lượng rất ít các nguyên tố khác như P, Fe, Zn, Cu, Mn, Ca. 2.2. Đơn vị cấu tạo cơ sở của protein –Amino acid Protein là polymer của các amino acid nối với nhau bằng các liên kết cộng hóa trị là liên kết peptide. Protein có thể bị thủy phân tạo thành các amino acid tự do bằng nhiều phương pháp khác nhau. Người ta đã xác định protein được cấu trúc từ 20 loại amino acid khác nhau [17]. Amino acid là chất hữu cơ mà phân tử chứa ít nhất một nhóm carboxyl (COOH) và ít nhất một nhóm amin (NH2), trừ prolin chi có nhóm NH (thực chất là một acid imin). Trong phân tử amino acid đều cổ các nhóm COOH và NH2 gắn với carbon ở vị trí α. Hầu hết các amino acid thu nhận được khi thủy phân protein đều ở dạng L- α amino acid. Như vậy, các protein chỉ khác nhau ở mạch nhánh, hay còn gọi là chuỗi bên (thường được ký hiệu: R) [17]. 7
2.3. Các bậc cấu trúc của phân tử protein 2.3.1. Cấu trúc bậc nhất (cấu trúc sơ cấp) Cấu trúc bậc I là trình tự sắp xếp các gốc amino acid trong mạch polypeptide cấu trúc này được giữ vũng nhờ liên kết peptide (liên kết cộng hóa tr ị [1,17]. Liên kết peptiđe (-CO-NH-) được tạo thành do phản ứng kết hợp giữa nhóm α-carboxyl của một amino acid này với nhóm α-amin của một amino acid khác, loại đi một phân tử nước [1]. Những protein đồng thể của những loài khác nhau có một số gốc amino acid tương đối không đổi ở những vị trí đặc biệt và có những gốc amino acid thay đổi, nghĩa là ở những loài khác nhau, các amino acid khác nhau có thể thay thế cho nhau. Ví dụ: insulin của nhiều loài khác nhau có những amino acid khác nhau ở vị trí 8, 9, 10. Cấu trúc bậc I là bản dịch c ủa mã di truyền, việc xác định cấu trúc bậc I là cơ sở để tổng hợp nhân tạo protein bằng phương pháp hóa học hoặc bằng các biện pháp công nghệ sinh học [17]. 2.3.2. Cẩu trúc bậc II (cấu trúc thứ cấp) Cấu trúc bậc II là tượng tác không gian giữa các gốc amino acid ở gần nhau trong mạch polypeptide. Nói cách khác, là dạng không gian cục bộ của từng phần trong mạch polypeptide. Cấu trúc này được làm bền nhờ các liên kết hydro được tạo thành giữa các liên kết peptide ở gần kề nhau, cách nhau những khoảng xác định [1,17 ]. Theo Paulin và Cori (1951) cấu trúc bậc II của protein bao gồm hai kiểu chính là xoắn α và phiến gấp β. Ngoài ra còn có kiểu xoắn collagen được tìm thấy trong phân tử collagen [17].. 2.3.3. Cấu trúc bậc III Cấu trúc bậc III là tương tác không gian giữa các gốc amino acid ở xa nhau trong mạch polypeptide, là dạng cuộn lại trong không gian của toàn mạch polypeptide (hình dạng chung của chuỗi polypeptide). Trong nhiều protein hình cầu có chứa các gốc Cys, sự tạo thành các liên kết disulfur giữa các gốc Cys ở xa nhau trong mạch polypeptide, làm cho mạch bị cuộn lại đáng kể. Các liên kết khác như tương tác Van der Waals, liên kết tĩnh điện, liên kết hydro giữa các mạch bên của các gốc amino acid. .. đều tham gia làm bền cấu trúc bậc III. Vì vậy khi phá vỡ các liên kết này phân tử bị duỗi ra đồng thời làm thay đổi một số tính chất của nó, đặc biệt là tính tan và hoạt tính xúc tác của nó. Kết quả nghiên cứu nhiều protein cho thấy chính trình tự sắp xếp các gốc amino acid trong chuỗi polypeptide chứa những thông tin cần thiết để hình thành cấu trúc bậc III [1]. 8
2.3.4. Cấu trúc bậc IV Đối với các phân tử protein bao gồm hai hay nhiều chuỗi polypeptide hình cầu, tương tác không gian (sự xắp xếp) giữa các chuỗi này trong phân tử gọi là cấu trúc bậc IV. Mỗi chuỗi polypeptide này gọi là “phần dưới đơn vị” (subunit). Chúng gắn với nhau nhờ các liên kết hydro, tương tác Van der Waals giữa các nhóm phân bố trên bề mặt của các phần dưới đơn vị [ 1 ]. Phân tử protein có cấu trúc bậc IV có thể phân ly thuận nghịch thành các phần dưới đơn vị. Khi phân ly, hoạt tính sinh học của nó bị thay đổi hoặc có thể mất hoàn toàn [1]. 3. Phân loại protein Protein gồm hàng trăm, hàng ngàn amino acid nối với nhau bằng liên kết peptide tạo nên một hay nhiều chuỗi polypeptide có cấu trúc rất phức tạp. Căn cứ sự có mặt hay vắng mặt của một số thành phần có bản chất không phải protein mà người ta chia protein thành hai nhóm lớn [17]: 3.1. Protein đơn giản Protein đơn giản là những phân tử mà thành phần cấu tạo của nó gồm hoàn toàn amino acid. Ví dụ, một số enzyme của tụy bò như ribonuclease gồm hoàn toàn amino acid nối với nhau thành một chuỗi polypeptide duy nhất (có 124 gốc amino acid, khối lượng phân tử 12.640 Dalton), chymotripsin gồm toàn amino acid nối với nhau thành chuỗi polypeptide (có 241 gốc amino acid, khối lượng phân tử 2.600 Dalton)... Dựa theo khả năng hoà tan trong nước hoặc trong dung dịch đệm muối, kiềm hoặc dung môi hữu cơ người ta có thể chia các protein đơn giản ra một số nhóm nhỏ như: - Albumin: tan trong nước, bị kết tủa ở nồng độ muối (NH4) 2SO4 khá cao (70-100%). - Globulin: không tan hoặc tan ít trong nước, tan trong dung dịch muối loãng của một số muối trungtính như NaCl, KCl, Na2 SO4..., và bị kết tủa ở nồng độ muối (NH4)2SO4 bán bão hoà. - Prolamin: không tan trong nước hoặc dung dịch muối loãng, tan trong ethanol, isopanol 70-80%. - Glutein: chỉ tan trong dung dịch kiềm hoặc acid loãng. - Histon: là protein có tính kiềm dễ tan trong nước, không tan trong dung dịch amoniac loãng. 9
3.2. Protein phức tạp Protein phức tạp là những protein mà thành phần phân tử của nó ngoài các α- amino acid như protein đơn giản còn có thêm thành phần khác có bản chất không phải là protein còn gọi là nhóm thêm (nhóm ngoại). Tuỳ thuộc vào bản chất của nhóm ngoại, người ta chia các protein phức tạp ra các nhóm nhỏ và thương gọi tên các protein đó theo bản chất nhóm ngoại: - Lipoprotein: nhóm ngoại là lipid. - Nucleoprotein: nhóm ngoại là acid nucleic. - Glycoprotein: nhóm ngoại là carbohydrate và dẫn xuất của nó. - Phosphoprotein: nhóm ngoại là acid phosphoric - Cromoprotein: nhóm ngoại là hợp chất có màu. Tuỳ theo tính chất của từng nhóm ngoại mà có những màu sắc khác nhau như đỏ (ở hemoglobin), vàng (ở flavoprotein)... [17]. 4. Chức năng sinh học của protein Trong cơ thể, protein đảm nhận nhiều chức năng khác nhau như: 4.1. Xúc tác Các protein có chức năng xúc tác cho phản ứng gọi là enzyme. Hầu hết cảc phản ứng trong cơ thể sống đều do enzyme xúc tác, từ các phản ứng đơn giản như hydrate hoá CO2 cho đến các phản ứng phức tạp như sao chép di truyền... [1]. 4.2. Vận tải Một số protein cỏ vai trò như những xe tài vận chuyển chất trong cơ thể, ví dụ như hemoglobin, mioglobin (ở động vật có xương sống), hemoxianin (ở động vật không xương sống) kết hợp với O2 và vận chuyển chúng đi khắp cơ thể [1]. 4.3. Chuyển động Nhiều protein tham gia trực tiếp trong quá trình chuyển động như: cò cơ, chuyển vị trí của nhiễm sắc thể trong phân bào, di động tinh trùng.. .[1]. 4.4. Bảo vệ Các kháng thể trong máu động vật có xương sống là những protein đặc biệt cỏ khả năng nhận biết và bắt những chất lạ xâm nhập cơ thể như protein lạ, virus, vi khuẩn [1] - Các inteferon là các protein do tế bào động vật có xương sống tổng hợp và tiết ra để chống lại sự nhiễm virus. 10
- Các protein tham gia vào quá trình đông máu có vai trò bảo vệ cơ thể sống khỏi bị mất máu. - Ở một số thực vật có chứa các protein có tác đụng độc với động vật ngay cả ở liều lượng thấp. Chúng có tác dụng bảo vệ thực vật khỏi sự phá hoại của động vật. 4.5. Truyền xung thần kinh Một số protein có vai trò làm trung gian cho phản ứng trả lời của tế bào thần kinh đối với các kích thích đặc hiệu, ví dụ như vai trò của sắc tố thị giác rodopxin ở màng lưới mắt [1]. 4.6. Điều hoà Một số protein có chức năng điều hoà quá trình truyền thông tin di truyền, điều hoà quá trình trao đổi chất [1]. - Các protein điều hòa quá trình biểu hiện gen như các repressor protein ở vi khuẩn có thể làm ngừng sự tổng hợp của enzyme của các gen tương ứng. - Các protein có hoạt tính hoormo, các protein ức chế đặc hiệu enzyme đều có chức năng điều hoà quá trình trao đổi chất khác nhau. 4.7. Kiến tạo và chống đỡ cơ học Các protein này thường có dạng sợi như sclerotin có trong lớp vỏ ngoài của sâu bọ; fibroin của tơ tằm, tơ nhện; colagen, elastin của mô liên kết, mô xương... [1]. 4.8. Dự trữ dinh dưỡng Protein còn là chất dinh dưỡng quan trọng cung cấp các amino acid cho phôi phát triển. Ví dụ, ovalbumin của lòng trắng trứng, gliadin của hạt lúa mì, zein của ngô... các protein dự trữ khác như casein của sữa feritine của lá lách [l]. II. VÀI NÉT VỀ LECTIN 1. Sơ lược lịch sử nghiên cứu lectin Thuật ngữ hemagglutinin hay còn gọi là phytoagglutinin (agglutinin thực vật) xuất hiện cuối thế kỷ 19 đã được dùng để chi những protein có khả năng gây ngưng kết hồng cầu người và động vật, chủ yếu được tìm thấy ở các mẫu chiết từ thực vật [31]. Năm 1888, trong luận án tiến sĩ của mình ở đại học Dorpat, Peter Herman Stillmark đã tách chiết được một hemagglutinin từ hạt của cây thầu dầu Ricinus communis mà ông gọi là ricin. Đây được coi là phát hiện đầu tiên về lectin và đ ặt 11
nền móng cho các nghiên cứu về lectin sau này [31]. Ricin là một hemagglutinin có độc tính cao đối với các tế bào eukaryote và được xếp vào họ protein bất hoạt ribosom-RIP nhóm 2 (Xia et al.,2003; Hoiseth et al.,2005). Sau đó, Stillmark tiếp tục tìm thấy một hợp chất có tính chất tương tự ricin đ ược chiết từ hạt đay Croton tiglium và được gọi là crotin [31]. Vào năm 1891, H. Hellin tìm thấy một hemagglutinin độc ở cây đậu Abrus precatorius, gọi là abrin. Sự phát hiện ra ricin, crotin, abrin đã thu hút sự chú ý c ủa nhiều nhà khoa học. Đáng chú ý là nghiên cứu của Paul Erlich ở Royal Institute of Experieinental Therapy (Frankfìưt), ông đã sử dụng chúng làm kháng nguyên mô hình cho các nghiên cứu miễn dịch, từ đó ông xây dựng một số nguyên lý cơ bản về miễn dịch học vào những năm 1890 [31]. Cùng với các hemagglutinin thực vật, các hemagglutinin động vật cũng dần được khám phá. Những công trình nghiên cứu lectin động vật đầu tiên chủ yếu trong ngành động vật không xương sống. Năm 1898, Edfstand cho rằng các tế bào mô của một số loài động vật không xương sống có chứa các chất có hoạt tính tương tự như ricin, gây ngưng kết hồng cầu cúa một số loài động vật như lợn, bò [28]. Nouguchi phát hiện chất gây ngưng kết ở sam (Limulus polyphenus) (1903) và tôm hùm (Homarus amricanus) (1907) [30]. Các nhà khoa học đã kết luận rằng ricin có bản chất là protein từ các công bố của Lansteiner và Raubischeck vào năm 1903 về các tính chất làm ngumg kết hồng cầu người và động vật như tan được trong nước, bị kết tủa bởi acetol, alcol bằng các phản ứng biure, phản ứng xantoprotein và các amino acid vòng [33] Năm 1926, James B. Summer (Ithaca, New York) là người đầu tiên tinh sạch một loại protein từ đậu rựa (Canavalia ensiformis) có tên gọi là concanavalin A (ConA) [31]. Những năm 1940, với các công trình nghiên cứu độc lập của hai nhà khoa học William C. Boyd tại trường đại học Boston và Karl O.Rankonen tại trường đại học Helsinki (Phần Lan) đã khám phá, chứng minh tính đặc hiệu nhóm máu người của hemaglutinin. Họ phát hiện dịch chiết thô của đậu ngự (Phaseolus limensis) và đậu tằm (Vicia craccci) ngưng kểt đặc hiệu hồng cầu nhóm máu A, trong khi đó dịch chiết thô của đậu Lotus tetragonolobus làm ngưng kết đặc hiệu hồng cầu nhóm máu O [31]. Trong những năm 1950, Walter JT Morgan và Winifred M. Watkins ở Viện Lister (London) đã phát hiện ra rằng sự ngưng kết hồng cầu nhóm máu A do đậu ngự (.Phaseolus limensis) bị ức chế mạnh nhất bởi -N-acetyl-D-galactosamin và sự ngưng kết hồng cầu nhóm máu O do đậu Lotus tetragonolobus bị ức chế mạnh nhất bởi α-L-fucose. Họ kết luận ràng α-N-acetyl-D-galactosamin và α-L-fucose là những yếu tố quyết định tính đặc hiệu nhóm máu A, O tương ứng [31]. Đây là 12
một trong những bằng chứng đầu tiên về tính đặc hiệu đường của các hemagglutinin. Dựa vào khả năng ngưng kết đặc hiệu hồng cầu các nhóm máu khác nhau của các agglutinin thực vật, Boyd và Shapleigh (1954) gọi chúng là lectin, theo tiếng Latin là legere, nghĩa là chọn ra [31]. Mặc dù sau này, các nhà khoa học cho rằng số lượng các lectin có khả năng ngưng kết các tế bào hồng cầu đặc hiệu nhóm máu là rất ít, chiếm khoảng 25% tổng số các lectin đã tìm thấy [33]. Vào năm 1960, Peter C. Nowell tại đại học Pennsylvania ở Philadenphia, người đầu tiên phát hiện ra lectin đậu đỏ (Pheolus vulgaris) cỏ khả năng kích thích tế bào lympho nguyên phân. Từ đó, lectin kích thích phân bào đ ược s ử dụng làm công cụ nghiên cứu quá trình truyền tín hiệu vào tế bào và phân tích các phản ứng hóa sinh xảy ra trong quá trình kích thích bạch cầu trong điều kiện invitro. Vào các năm 1963 và 1965, Joseph C. Aub đã phát hiện agglutinin mầm lúa mì (WGA) có khả năng ngưng kết mạnh các tế bào ác tính tại bệnh viện Masachusetts ở Boston. Phát hiện này đã cung cấp những bằng chứng đầu tiên cho thấy sự thay đ ồi c ủa các phân tử đường trên bề mặt tế bào liên quan đến sự phát triển của bệnh ung thư và nó dẫn đến giả thuyết là tất cả các tế bào ung thư đ ều có chung tính ch ất bị gắn kết đặc hiệu với lectin. Tuy nhiên, hiện nay giả thuyết này đã bị bác bỏ [31]. Cho đến đầu những năm 1970, sự hiện diện của hemaglutin đã được tìm thấy trong nhiều sinh vật, chủ yếu là ở thực vật nhưng rất ít trong số chúng được tinh sạch và chủ yếu bằng các kỹ thuật cổ điển. Một số lectin được tinh sạch vào thời điểm này gồm Con A, lectin đậu tương, đậu xanh, mầm lúa mi, nấm Agarỉcus campestris (Sharon và Lis, 1972). Cùng thời điểm này lectin động vật cũng đã được phát hiện như lectin của lươn (Springer và Desai , 1971), ốc (Hammarstrốm và Kabat, 1969), và cua móng ngựa (Marchalonis và Edelman, 1968) [31]. Cũng trong thời gian này, cấu trúc phân tử của lectin đã bắt đầu được nghiên cứu. Lectin đầu tiên được giải trình tự là Con A (Edlman và cộng sự, 1972). Cũng trong năm 1972, Edman và cộng sự nghiên cứu độc lập với Karl Hardman và Clinton F.Ainsworth cùng tìm ra được cấu trúc 3D của Con A bằng phương pháp chụp ảnh tia X [31]. Bắt đầu từ cuối những năm 1980, một lượng thông tin đáng kể về lectin đã được nghiên cứu bằng cách sử dụng phương pháp chụp ảnh tinh thể tia X và các đột biến điểm. Năm 1988, Kurt Drikamer ở đại học Columbia (New York) dựa trên sự phân tích chuỗi amino acid của lectin động vật đã xác định được vùng nhận diện carbohydrate của lectin và đặt tên là CDR [31]. Kể từ lúc phát hiện đến nay, số lượng của các lectin đã biết về tính chất và cấu trúc còn rất khiêm tốn . Vì vậy, lectin vẫn là lĩnh vực đ ược nhiều nhà khoa học quan tâm đến, và hứa hẹn sẽ có nhiều đóng góp vào đời sống. 13
2. Tình hình nghiên cứu lectin trên thế giới và ở Việt nam 2.1. Tình hình nghiên cứu lectin trên thế giới Kể từ khi phát hiện cho đến đầu thế kỷ XX, các nghiên cứu lectin chỉ mang tính điều tra cơ bản và tiến hành một cách rời rạc ở các đối tượng khác nhau, hầu hết chỉ ở thực vật. Mãi đến đầu những năm 1960 với hai khám phá lớn c ủa Peter C. Nowell (1960) về khả năng kích thích phân bào của lectin đậu đỏ (Phaseolus vulgaris) và Joseph C. Aub phát hiện lectin mầm lúa mì (WGA) có khả năng ngưng kết mạnh các tế bào ác tính (Aub và cộng sự, 1963,1965), lectin mới bắt đầu thu hút sự chú ý của các nhà khoa học như Sumner và Howell (1936), William C. Boýd và Karl O. Renkonen (1940), Walterr J. T.Morgan và Winifred M. Watkins [31]. Cho đến đầu những năm 1970, việc nghiên cứu lectin vẫn chỉ tập trung chủ yếu ở thực vật, một số ở động vật và vi sinh vật được phát hiện và cổ rất ít lectin được tinh sạch gồm có: Con A, lectin hạt đậu tương, hạt đậu xanh, mầm lúa mì, nấm Agaricus campestris, lươn (springer và desai 1971), lectin ốc (Hammarstrổm và Kabat, 1969), và cua móng ngựa (Marchalonis và Edelman, 1968) [31]. Số lượng letin được tinh sạch tăng lên đáng kể từ khi Agrawal và Golstein sử dụng sắc ký ái lực để tinh sạch Concavalin A vào năm 1965. Cho đến nay, sắc ký ái lực vẫn là phương pháp hiệu quả được sử dụng trong các phòng thí nghiệm để tách chiết và tinh sạch lectin [37]. Lectin động vật cũng được ghi nhận khá sớm, nhưng cho đến giữa những năm 1970 chỉ có lectin của lươn, ốc, cua móng ngựa được phân lập và mô tả. Năm 1974, Gilbert Ashwell và Anatol G. Morell là những người đầu tiên phân lập được lectin động vật có vú. Kể từ đầu những năm 1980, nhờ vào sự ra đời của kỹ thuật tái tổ hợp một số lượng lớn các lectin động vật đã được tinh sạch và nghiên c ứu [31]. Việc xác định trình tự amino acid và cấu trúc không gian của các lectin được thực hiện từ những năm 1970, nhưng với tốc độ khá chậm. Nhưng kể từ những năm 1980 với các kỹ thuật hiện đại như kỹ thuật tái tổ hợp, chụp ảnh tinh thể tia X, sử dụng đột biến điểm thì đến nay đã có hơn 200 lectin được giải trình tự và mô tả cấu trúc bậc 3 [31]. Hiện nay, với sự trợ giúp của khoa học kỹ thuật, các nhà khoa học đang tập trung nghiên cứu các tính chất của lectin để ứng dụng vào đời sống. Theo các nhà khoa học Pháp, lectin từ hạt mít mật (Artọcarpus heterophyỉlus) có khả năng tương tác đặc hiệu với virus HIV ở pha đầu tiên của sự nhiễm bệnh suy giảm miễn dịch AIDS, do đó quá trình nhiễm virus HIV có thể bị kìm hãm và hạn chế khả năng mắc bệnh (Favero et al, 1993; Corbeau et al, 1994). Lectin ở lá hành được các nhà khoa học Ẩn Độ chứng minh là có khả năng chống được rầy aphid, côn trùng gây hại ở thực vật [29]. Theo Hao C. Z. Và cộng sự, lectin từ nấm Agrocybe aegerita 14
cỏ khả năng ức chế sự phát triển các tế bào khối u ở người [32]. Áp dụng kỹ thuật chuyển gen, các nhà khoa học đã tiến hành chuyển gen lectin vào một số cây làm thực phẩm giúp phòng ngừa sâu bệnh như ở khoai tây (Nick Birch, 2002). Một số nhà khoa học sử dụng lectin trong chẩn đoán ung thư gọi là phương pháp “lectin microarray” [39]. 2.2. Tình hình nghiên cứu lectin ở Việt Nam Việc nghiên cứu lectin ở Việt Nam đã được triển khai có quy mô bắt đầu từ sự hợp tác quốc tế về khoa học giữa các trường Đại học Tổng hợp Paris 7 (Cộng hoà Pháp) với trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội (ĐHQG HN). Quá trình nghiên cứu lectin của các nhà khoa học Việt Nam bước đầu đã có những kết quả rất khả quan, nghiên cứu theo ba hướng chính: Hướng thứ nhất là điều tra sự phân bố lectin trong các loài thực vật và động vật ở Việt Nam. Ở thực vật, các nhà khoa học đã cho thấy sự phong phú của các loài cỏ chứa lectin, đặc biệt là các cây họ Đậu (Fabaceae). Theo tác giả Nguyễn Thị Thịnh và cộng sự có đến 90% loài cây họ Đậu có chứa lectin, trong đó hai loài đậu l ục lạc lá tròn (Crotalaris striata DC.) và đậu dải đỏ (Vigna unguỉculata) đặc hiệu với nhóm máu A của người, nhưng lại chưa phát hiện được giống đậu đặc hiệu với nhóm máu B của người [25]. Ở động vật, Nguyễn Diệu Thuý và Cao Phương Dung đã công bố có khoảng 31% loài nhuyễn thể Việt Nam cũng có hoạt tính lectin [26]. Riêng vùng biển Thừa Thiên Huế, tác giả Cao Đăng Nguyên và Nguyễn Quốc Khang, 1998 đã công bố 75% loài nhuyễn thể chứa lectin, tuy nhiên các tác giả cũng chưa phát hiện được một loài lectin nào đặc hiệu nhóm máu một cách tuyệt đối [19]. Với các kết quả này có thể khẳng định rằng lectin khá phổ biến trong các loài động thực vật ở nước ta. Hướng nghiên cứu thứ hai là tách chiết, tinh sạch và nghiên cứu cấu trúc phân tử và đặc tính của các lectin từ các loài thực vật và động vật ở Việt Nam. Với hướng nghiên cứu này nổi bật có các công trình nghiên cứu của tác giả Đỗ Ngọc Liên vào những năm đầu của thập niên 90 về lectin ở hạt chay, nụ hoa hòe, các ỉoàỉ mít, các ỉoài đậu và lectỉn trong máu sam biển [7,8,10,12,13,14]. Tiếp theo, Nguyễn Quốc khang đã tinh sạch và nghiên cứu tính chất của lectin sam biển, hạt mướp đắng, nhị hoa sen và hoa cây thiên lý [2,3,4], sau đó cùng với Cao Đăng Nguyên và cộng sự đã nghiên cứu tách chiết lectin động vật như loài trìa mỡ (Meretrix Meretrix Linne), cá nheo (Parasilurus asotus), cá chình hoa và cá chình Nhật (Anguilia bengalesnis, Anguila mamorata) [5,19,22]. 15
Năm 2008, tác giả Cao Đãng nguyên, Đặng Thị Thảo và Nguyễn Bá Hai đã tách chiết và nghiên cứu tính chất của lectin trong một vài loài ở l ớp chân b ụng sống ở nước ngọt tại Thừa Thiên Huế [23]. Hướng thứ ba là nghiên cứu ứng dụng của các loại lectin. Hướng nghiên cứu này đang được các nhà khoa học Việt Nam chú ý hơn trong những năm gần đây, chủ yếu tập trung vào các lectin ứng dụng trong y học, hỗ trợ điều trị các căn bệnh khác nhau và cũng đã có một số kết quả đáng quan tâm. Chẳng hạn như, năm 1989, Nguyễn Quốc Khang sử dụng lectin trong chẩn đoán thai sớm, 7 năm sau được ứng dụng rộng rãi [6]. Đỗ Ngọc Liên và Nguyễn Lệ Phi (1992) sử dụng lectin mít tố nữ (Artocarpus champeden) để tinh chế IgAi trong huyết thanh của người bằng sắc ký ái lực [13]. Năm 1994, Đỗ Ngọc liên sử dụng lectin hạt chay để chẩn đoán miễn dịch ký sinh trùng Schistosoma mamsoni [11]. Năm 1999, Cao Đăng Nguyên và Bùi Thái Hằng khi nghiên cứu lectin trìa mỡ (Meretrix meretrỉx lnné) thấy rằng lectin này phản ứng với nhiều protein có nguồn gốc khác nhau, đặc biệt vói các protein có ý nghĩa trong y học như: α- foetoprotein, a-inteferon và IgG [18]. Năm 2003, các tác giả Đỗ ngọc Liên và Trần Thị Phương Liên đã nghiên cứu đáp ứng miễn dịch kháng thể IgA1 và IgG trong huyết thanh bệnh nhân ưng thư gan và leukaemia cấp bằng phương pháp ELISA-LECTIN [9, 15]. Năm 2006, tác giả Nguyễn Hạnh Phúc cho thấy vai trò của lectin sam (Tachypteus tridentatus) sử dụng trong chẩn đoán huyết thanh học [24]. Năm 2008, tác giả Trần Thị Phương Liên đã sử dụng lectin để xác định kháng thể và kháng nguyên của một số bệnh ung thư thường gặp [16]. 3. Tính phổ biến của lectin trong tự nhiên. Tính phổ biến của lectin trong tự nhiên rất phong phú, cụ thể là chúng được tìm thấy ở hầu hết giới sinh vật, từ virus, vi khuẩn, tảo, nấm cho đ ến thực vật bậc cao, động vật có xương sống và ở cả con người [31]. 3.1. Sự phân bố lectin trong thực vật. 3.1.1. Phân loại và trình tự của lectin thực vật. Họ lectin đặc trưng nhất của thực vật là Legumiosae. Họ này bao gồm các lectin như ConA, agglutinin đậu tương, lectin đậu lăng. Hai họ nhỏ khác của lectin thực vật đã được mô tả là Gramineae (lectin ngũ cốc, chẳng hạn như lectin mầm lúa mì) và Solanaceae (lectin của khoai tây và cà chua). Vì sự đa dạng rất l ớn của các lectin đặc hiệu carbohydrate thực vật, một số nhà nghiên cứu phân loại chúng theo loại carbohydrate mà chúng nhận ra, ví dụ lectin liên kết galactose hoặc lectin liên kết GlcNAc. Các lectin họ Đậu và lectin ngũ cốc khác nhau cơ bản về cấu trúc bậc 1, bậc 2, bậc 3 và trong những sửa đồi hậu dịch mã và các yêu càu đối với kim loại cho hoạt tính liên kết với carbohydrate [36]. 16