Giáo trình Vi sinh vật học part 4

Chia sẻ: Afasg Agq | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:26

Thêm vào BST

Báo xấu

183
lượt xem 68
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Ta gọi thể tích bình là v (lít), tốc độ dòng đi vào là f (lít/giờ). Do đó tốc độ pha loãng (còn gọi là hệ số pha loãng) D = f/v (đại lượng D biểu thị sự thay đổi thể tích sau một giờ). Nếu vi khuẩn không sinh trưởng và phát triển, chúng sẽ bị rút khỏi bình nuôi cấy với thể tích: v- = dX = D.X dt Như vậy mật độ vi khuẩn trong bình giảm, ta có công thức tính: X = X0. e-Dt Tốc độ sinh trưởng của quần thể vi khuẩn trong bình...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Giáo trình Vi sinh vật học part 4

97 không đổi, nghĩa là bình môi trường đi vào đã được bù bởi dòng môi trường đi ra với cùng một tốc độ. Ta gọi thể tích bình là v (lít), tốc độ dòng đi vào là f (lít/giờ). Do đó tốc độ pha loãng (còn gọi là hệ số pha loãng) D = f/v (đại lượng D biểu thị sự thay đổi thể tích sau một giờ). Nếu vi khuẩn không sinh trưởng và phát triển, chúng sẽ bị rút khỏi bình nuôi cấy với thể tích: dX v- = - = D.X dt Như vậy mật độ vi khuẩn trong bình giảm, ta có công thức tính: X = X0. e-Dt Tốc độ sinh trưởng của quần thể vi khuẩn trong bình biểu thị bởi phương trình: dX v+ = = μ.X dt Như vậy mật độ vi khuẩn trong bình tăng theo phương trình: X = X0. eμt Tốc độ thay đổi cuối cùng (tăng hoặc giảm) mật độ vi khuẩn trong nuôi cấy liên tục là sự sai khác giữa độ tăng v+ và độ giảm v-: dX v = v+ - v- = = (μ - D).X dt Nếu μ > D => v > 0: mật độ vi khuẩn trong bình tăng. Nếu μ < D => v < 0: mật độ vi khuẩn trong bình giảm. Nếu μ = D => v = 0: mật độ tế bào không tăng không giảm theo thời gian, quần thể vi khuẩn ở trong trạng thái cân bằng động học. Nếu bình thí nghiệm có thiết bị duy trì μ luôn luôn bằng D ta sẽ thu được quần thể vi khuẩn sinh trưởng và phát triển theo lũy thừa, thường xuyên ở một mật độ tế bào không đổi và không phụ thuộc và thời gian. Trong trường hợp như vậy không những kích thước trung bình của tế bào, trạng thái sinh lý của chúng mà cả môi trường nuôi cấy đều không đổi và không phụ thuộc vào thời gian. Điều này, một mặt tạo điều kiện cho việc nghiên cứu sinh trưởng và sinh lý của tế bào vi khuẩn, mặt khác cải thiện quá trình sản xuất vi sinh vật ở qui mô công nghiệp. Chemostas và turbidostas là hai thiết bị nuôi cấy trong đó ta có thể duy trì được điều kiện μ = D. Nuôi cấy tĩnh được xem như hệ thống đóng, quần thể tế bào sinh trưởng phải trải qua các pha mở đầu, logarid, ổn định và tử vong. Mỗi pha
98 sinh trưởng được đặc trưng bởi những điều kiện nhất định. Việc điều khiển tự động khó thực hiện. Nuôi cấy liên tục, trái lại, là hệ thống mở có khuynh hướng dẫn đến việc thiết lập một cân bằng động học. Yếu tố thời gian ở đây trong phạm vi nhất định bị loại trừ. Tế bào được cung cấp những điều kiện môi trường không đổi, nhờ việc điều chỉnh tự động (hình 4.3). Chemosta Turbidost Hình 4.3 Nuôi cấy liên tục trong chemostas (trái) và turbidostas (phải) V. Sự kìm hãm sinh trưởng và sự diệt khuẩn 1. Các phương pháp khử trùng 1.1. Khử trùng bằng nhiệt - Khử trùng bằng phương pháp Pasteur Cơ sở của phương pháp này là làm nóng vật liệu ở nhiệt độ dưới 1000C nhằm tiêu diệt tất cả các vi sinh vật trong các môi trường dễ bị hỏng khi đun sôi như sữa, bia, rượu vang... Khử trùng kiểu Pasteur có thể ở 600C trong 30 phút hoặc 750C trong 15 phút hay 800C trong 10 phút. - Khử trùng bằng cách đun sôi Người ta dùng nồi Koch hay nồi Arnola để khử trùng. Nồi hấp được cấu tạo bằng thùng hai vỏ kim loại. Nước ở thùng ngoài được đun sôi, hơi nước sẽ vào thùng trong. Nhiệt độ hơi nước sôi không vượt quá 1000C. Ở
99 nhiệt độ này tế bào sinh dưỡng bị tiêu diệt, nhưng bào tử vẫn còn khả năng nảy mầm. Ngoài phương pháp trên người ta còn có thể đun sôi trực tiếp các dụng cụ bằng kim loại, cao su, kim tiêm và xylanh trong thời gian khoảng 10 phút. - Khử trùng bằng phương pháp hấp gián đoạn Các môi trường dinh dưỡng, các ống bằng cao su và một số dụng cụ dễ bị hỏng khi khử trùng ở nhiệt độ cao. Vì vậy cần phải khử trùng bằng cách đun sôi lặp lại 3 lần trong 3 ngày kế tiếp nhau. Lần đun thứ nhất trong 30 - 45 phút làm cho các tế bào sinh dưỡng đều bị chết, nhưng bào tử vẫn còn sống. Sau đó để môi trường, dụng cụ đã khử trùng vào tủ ấm 28 - 300C. Ở nhiệt độ này trong môi trường thích hợp, các bào tử sẽ nảy mầm. Trong lần khử trùng thứ hai các tế bào vừa mới nảy mầm lại bị tiêu diệt. Để đảm bảo hoàn toàn vô trùng ta tiếp tục khử trùng lần thứ 3 trong ngày thứ 3 kế tiếp. - Khử trùng bằng nồi hấp áp lực (Autoclave) Phương pháp này dựa trên nguyên tắc làm nóng môi trường bằng hơi bão hòa ở áp suất cao hơn 1atm. Nồi hấp áp lực cao làm bằng kim loại, có hai vỏ và có khả năng giữ áp suất cao. Vỏ trong là thùng khử trùng, nơi để các dụng cụ, môi trường cần khử trùng. Thùng khử trùng có nắp van thoát khí, có áp kế để xác định áp suất hơi nước, có van bảo hiểm để xì hơi khi áp suất quá mức cần thiết và để nồi khỏi bị nổ. Khoảng trống giữ hai lớp vỏ là ngăn chứa hơi nước được nối với phểu. Nước trong nồi phải đủ đến mức quy định đã khắc trên ống đo nước, phía trên của thùng có lỗ để đưa hơi nước vào thùng trong. Nồi hấp được đậy kín bằng các khóa van xung quanh. Chuẩn bị môi trường để khử trùng: các dụng cụ chứa môi trường chỉ được chứa đến 2/3 thể tích và nút kín bằng nút bông. Nút bông không được chặt quá để khỏi ngăn cản sự cung cấp ôxy cho vi sinh vật và không lỏng quá dễ bị vi sinh vật bên ngoài xâm nhập vào môi trường, đáy nút bông phải gọn tròn không dài quá hoặc ngắn quá. Khi phân phối môi trường tuyệt đối không để môi trường dính vào miệng ống nghiệm, bình hay nút bông. Dụng cụ xếp vào nồi khử trùng phải ngay ngắn, không xếp quá sít nhau, để cho hơi nước dễ đi qua. Khi khử trùng bằng nồi áp lực cao, áp suất trong nồi tăng lên làm cho nhiệt độ tăng theo. Khi chọn chế độ khử trùng phải chú ý pH của môi trường, pH dưới 5,5 thạch bị thủy phân và khi nguội không có khả năng tạo gel. Nếu môi trường kiềm, khi khử trùng sẽ gây kết tủa sắt, caramen hóa đường. Để tránh các hiện tượng trên, trong khi khử trùng phải để môi trường có pH trung tính, sau khi khử trùng phải trung hòa lại môi trường đến mức pH
100 cần thiết. Môi trường sau khi khử trùng được giữ trong tủ ấm 300C trong 2-3 ngày để kiểm tra độ vô trùng. - Khử trùng bằng sức nóng khô Cách khử trùng này tiến hành trong tủ sấy ở nhiệt độ 160 - 1700C trong 2 - 3 giờ. Ở điều kiện này các tế bào sinh dưỡng và bào tử của vi sinh vật đều bị tiêu diệt. Cách khử trùng này được sử dụng để khử trùng các dụng cụ thủy tinh. Ống nghiệm, bình tam giác trước khi khử trùng cần được nút kín bằng nút bông. Các pipette, hộp petri, que gạt phải được gói kín bằng giấy báo, trước khi sử dụng mới được mở ra. - Khử trùng bằng cách đốt trên ngọn lửa Cách khử trùng này dùng để khử trùng que cấy vi sinh vật, các dụng cụ bằng sắt (kim, kẹp, gắp, dao, kéo...), một số dụng cụ thủy tinh (đũa thủy tinh, que gạt...). Muốn khử trùng ta đưa đi đưa lại nhiều lần dụng cụ trên ngọn lửa đèn cồn, bằng cách này mọi vi sinh vật bám trên bề mặt dụng cụ đều bị tiêu diệt. 1.2. Khử trùng không bằng nhiệt - Dùng nến lọc vi khuẩn Một số chất hữu cơ như huyết thanh, albumine trong môi trường dễ bị biến tính khi khử trùng bằng nhiệt độ cao nên phải khử trùng bằng cách lọc qua các dụng cụ lọc vi khuẩn. Các lỗ của màng lọc nhỏ hơn kích thước của tế bào vi khuẩn. Loại dụng cụ thường dùng hiện nay là loại lọc seltz, loại này có 2 bộ phận. Một bộ phận hình viên trụ ở phía trên, dùng để chứa dịch lọc, một bộ phận hình phễu ở phía dưới. Hai bộ phận được gắn vào nhau và được cố định lại nhờ 3 đinh ốc. Mỗi lần lọc, người ta đặt vào giữa 2 bộ phận một màng lọc tròn bằng amian hay bằng nitrocellulose dày khoảng 3 - 5cm (màng lọc chỉ dùng một lần). - Khử trùng bằng hóa chất Hóa chất được dùng để khử trùng bảo quản nguyên vật liệu và để làm sạch phòng thí nghiệm, bệnh viện. Khi sử dụng hóa chất cần lưu ý tới nồng độ thích hợp, không gây độc đối với con người. Sàn nhà, bàn ghế trong phòng được lau bằng các dung dịch sát trùng như chloramine 0,5 - 3%, hoặc nước phenol 3 - 5%. Sử dụng cồn sát trùng để lau các dụng cụ thủy tinh như que gạt, phiến kính, lá kính, đũa thuỷ tinh... - Khử trùng bằng tia tử ngoại, ánh sáng mặt trời Tia tử ngoại có bước sóng 13 - 400 nm đều có tác dụng diệt khuẩn. Để khử trùng buồng nuôi cấy, phòng thí nghiệm, người ta chiếu tia tử ngoại trong khoảng 30 - 40 phút.
101 Tia sáng mặt trời có bước sóng 330 - 400 nm cũng có tác dụng diệt khuẩn. Vì thế trong một số trường hợp người ta có thể phơi nắng các dụng cụ của phòng thí nghiệm 2 - 3 giờ sau khi đã được rửa sạch. 2. Các phương pháp bảo quản 1. Cấy truyền thường xuyên trên thạch nghiêng hoặc trích sâu vào thạch. Sau khi đã sinh trưởng vi khuẩn được giữ trong tủ lạnh +40C. Phương pháp này đơn giản nhất và thường được dùng nhưng kém hiệu quả nhất. 2. Bảo quản dưới dầu vô trùng: dầu paraffin vừa ngăn cản môi trường khô vừa làm giảm trao đổi chất gây cản trở sự xâm nhập của ôxy. 3. Bảo quản trong cát hoặc đất sét vô trùng: do cấu trúc lí - hóa cát và đất sét đều là những vật chất tốt mang các tế bào vi sinh vật, chủ yếu là các bào tử. Sau khi làm khô không khí cát (hoặc đất sét) cùng với vi khuẩn có thể bảo quản tế bào rất lâu. 4. Đông khô: là phương pháp hoàn thiện và có hiệu quả nhất. Vi khuẩn được trộn với môi trường thích hợp (sữa, huyết thanh...) rồi làm lạnh và làm khô nhờ băng khô. Sau mấy năm bảo quản tế bào vẫn giữ được khả năng sống mà không bị biến đổi về di truyền. 5. Bảo quản trong glycerine (10%) và giữ trong tủ lạnh sâu (-600C hay - 800C): đây là phương pháp rất thích hợp nhưng cần mua được loại ống nhựa chịu nhiệt (khi khử trùng). Câu hỏi ôn tập chương 4 1. Các kiểu dinh dưỡng của vi sinh vật? 2. Các cơ chất dinh dưỡng cần thiết cho hoạt động sống của vi sinh vật? 3. Cơ chế và tác dụng của các yếu tố bên ngoài lên sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật? 4. Các pha sinh trưởng của vi sinh vật, điểm khác biệt của phương pháp nuôi cấy tĩnh và nuôi cấy liên tục? 5. Ý nghĩa của việc nghiên cứu đường cong sinh trưởng, hiện tượng sinh trưởng kép?
102 Chương 5 Trao đổi chất ở vi sinh vật I. Các con đường phân giải hexose 1. Con đường Embden - Meyerhof - Parnas (EMP hay đường phân) 1.1 Cơ chế (hình 5.1) Glucose (1) Glucose - 6 P (2) Fructose - 6P ATP (3) ADP Fructose - 1,6 DP (5) (4) (AlPG) Glyceraldehyd - 3P Dioxy acetone – P (DAP) H3PO4 NAD (6) NADH2 a. 1,3 diphosphoglyceric (a. 1,3DPG) ADP (7) ATP a.3 P - Glyceric (A3PG) (8) a.2P- Glyceric (A2PG) (9) Phosphoenolpyruvic (PEP) (10) ADP A TP Trong điều kiện có hoặc không có O2, glucose đều được chuyển a. Pyruvic thành pyruvate qua 10 phản ứng, trong đó 3 phản ứng 1, 3 và 10 là phản ứng một chiều, còn cácìnhả5.1:ng khác là phản ứng thuận nghịch. Trừ chất H ph n ứ Con đường EMP
103 đầu và chất cuối, tất cả các chất trung gian trong chu trình đều ở dạng phosphoryl hóa. Gốc phosphoryl mang 3 chức năng là giúp cho chất trung gian mang điện tích âm cao không thể thoát ra ngoài, là vị trí gắn enzyme và là vị trí cung cấp liên kết cao năng. Phương trình chung: Glucose 2 pyruvate + 2ATP + 2 NADH2 ATP được tạo thành từ 2 phản ứng 7 và 10. Sự tạo thành ATP ở 2 phản ứng trên gọi là phosphoryl hóa ở mức độ cơ chất vì phosphate cao năng trước đó là một phần của phân tử chất trao đổi (1,3 di - P - glycerate và PEP), khi có mặt của ADP thì chất trao đổi sẽ chuyển gốc P cho ADP tạo thành ATP. Có thể chia con đường EMP thành 4 giai đoạn: 1. Hoạt hóa glucose tạo fructose - 1,6 diphosphate (có thể xẩy ra ở nhiều monosaccharide khác). 2. Bẻ đôi phân tử fructose - 1,6 diphosphate tạo AlPG và DAP. 3. Ôxy hóa AlPG thành A2PG. 4. Chuyển hóa A2PG tạo acid pyruvic (hình 5.1). 1.2. Ý nghĩa của con đường EMP - Quá trình đường phân cung cấp cho tế bào 6 trong số 12 tiền chất dùng để tổng hợp các đơn vị kiến trúc: glucose - 6-P, fructose - 6-P, 3-P- glyceraldehyd, 3P - glycerate, PEP, pyruvate. - Cung cấp năng lượng cho hoạt động sống của tế bào tuy hiệu suất không cao (khoảng 10%), nhưng đây là con đường nguyên thủy nhất gặp ở hầu hết sinh vật. 2. Con đường pentosophosphate ôxy hoá (PP, HMP) Do một đột biến nào đó (thiếu enzyme) mà một số vi sinh vật có thể chuyển hóa glucose thành pyruvate theo con đường PP (hình 5.2). Từ glucose qua quá trình decarboxyl hóa tạo ribuloso - 5P và CO2. Các phản ứng tiếp theo là sự chuyển hóa giữa pentoso- 5P và hexoso - 6P. Ý nghĩa của chu trình: Xét về mặt năng lượng, từ 1 phân tử glucose khi phân giải tạo 35 ATP nhưng qua con đường này tạo riboso - 5P tham gia vào quá trình sinh tổng hợp acid nucleic, tạo các loại đường C4, C7... tham gia vào quá trình sinh tổng hợp acid amin. Con đường này tạo NADPH2 cần thiết cho các phản ứng sinh tổng hợp trong tế bào. Đây là con đường phân giải đường thường gặp ở vi khuẩn thuộc giống Pseudomonas.
104 Phương trình tổng quát: Glucose + 6O2 6CO2 + 6H2O + 35ATP Glucose Glucose Ribulose Glucose Frutose Xilulose Fructos Ribose Erytrose Xilulose Xilulose Erytros Ribose Fructos Fructos Xilulose Hình 5.2 Con đường pentosophosphate 3. Con đường KDPG (2keto - 3deoxy - 6Pgluconate) Phương trình tổng quát như sau: Glucose 2 Pyruvate + ATP + NADH2 + NADPH2 Con đường KDPG giúp cho nhiều vi khuẩn sử dụng gluconate và chỉ gặp ở một số vi khuẩn. Ở E. coli và nhiều loài của Clostridium chuyển hóa glucose qua con đường EMP nhưng phân giải gluconate qua con đường KDPG. Qua các con đường phân giải glucose, pyruvate được tạo thành. Nếu trong điều kiện hiếu khí các vi sinh vật sẽ ôxy hoá pyruvate tạo CO2 và nước. Nếu điều kiện kị khí các vi sinh vật sẽ tiến hành quá trình lên men hoặc hô hấp kị khí (hình 5.3).
105 Glucose Glucose -6- hh 6 - phosphoglucono-18-lactose 6 - phosphogluconate 2-keto-3 deoxy-6-phosphogluconate pyruvate Glyceraldehyd 1,3 Phosphoenol-pyruvate 2-phosphoglycerate 3-phosphoglycerat Hình 5.3 Con đường KDPG 4. Ôxy hoá pyruvate Pyruvate chiếm vị trí trung tâm trong trao đổi chất trung gian và là tiền chất của nhiều sản phẩm. Nhiều vi sinh vật ôxy hóa pyruvate thành acetyl - CoA chủ yếu qua 3 phản ứng sau (hình 5.4):
106 Pyruvate +CoA+NAD+ Acetyl - CoA + NADH2 + CO2 (1) Pyruvate + CoA + 2Fd Acetyl - CoA + 2FdH + CO2 (2) Pyruvate + CoA + NAD+ Acetyl - CoA + formate (3) (Formate - Fd - ferredoxin) Pyruvate- carboxylase Vòng tiasolium Pyruvate của thiamin pyrophosphate Enzyme Acid lipoic Dihydrolipoid- transacetylase Enzyme Dihydrolipoid - dehydrogenas Enzyme Enzyme Acid dihydrolipoic Acid acetyl-lipoic Hình 5.4 Quá trình ôxy hóa pyruvate Phản ứng (1) do phức hệ pyruvate - dehydrogenase (PDH) xúc tác. PDH gặp ở hầu hết vi sinh vật hiếu khí (không gặp ở vi khuẩn kị khí bắt buộc). PDH gồm 3 enzyme, ngoài CoA và NAD+ còn cần TPP (thiamine - pyrophosphate) và acid lipoic. Phản ứng (2) xúc tác bởi pyruvate - Fd - oxidoreductase, enzyme này gặp nhiều ở vi khuẩn kị khí như Clostridium. Phản ứng (3) do pyruvate - formate - liase xúc tác, enzyme này gặp nhiều ở vi khuẩn kị khí tiết acid formic (thuộc họ Enterobacteriaceae) và vi khuẩn quang năng.
107 II. Chu trình tricarboxylic (Krebs) Trong quá trình ôxy hóa hoàn toàn, pyruvate sẽ được ôxy hoá triệt để thông qua chu trình Krebs (chu trình acid tricarboxylic = ATC). Cơ chế được trình bày ở hình 5.5. Hình 5.5 Chu trình Krebs (theo Lehninger) Trong chuỗi phản ứng vòng của chu trình ATC, acid pyruvic bị phân huỷ triệt để tạo CO2, coezyme dạng khử và các hợp chất trung gian. Các coezyme thông qua chuỗi hô hấp vận chuyển H và electron đến cho O2 phân tử tạo nước đồng thời giải phóng năng lượng ATP.
108 Ý nghĩa của chu trình: Ngoài chức năng ôxy hóa tận cùng, chu trình ATC còn cung cấp cho tế bào 3 tiền chất là oxalacetate (tổng hợp aspactate), α - ketoglutarate và succinyl - CoA (tổng hợp nhân hem). Về năng lượng, chu trình cung cấp 1ATP ở mức độ phosphoryl hóa cơ chất nhưng sản sinh NADH2 để đi vào chuỗi vận chuyển electron tạo ATP. Trong điều kiện kị khí chu trình TCA không có chức năng sinh năng lượng nhưng cũng phải cung cấp cho tế bào 3 tiền chất trên. Tế bào phải sử dụng phần lớn pyruvate để lên men thu năng lượng, còn phần nhỏ chuyển thành acetyl - CoA nhờ pyruvate - ferredoxin - oxidoreductase. Phần lớn các vi sinh vật hiếu khí ôxy hóa chất dinh dưỡng hữu cơ thành CO2 và H2O (vì carbon trong phân tử CO2 đạt mức độ ôxy hóa cao nhất nên người ta gọi là quá trình ôxy hóa hoàn toàn). Một số vi sinh vật có khả năng ôxy hóa cơ chất trong điều kiện hiếu khí nhưng lại sinh ra các sản phẩm chưa được ôxy hóa hoàn toàn (ketoacid, acid gluconic, acid malic, acid fumaric...). Nhiều quá trình ôxy hóa không hoàn toàn có ý nghĩa quan trọng trong công nghiệp lên men vì chúng sản sinh ra nhiều sản phẩm có giá trị. III. Chuỗi hô hấp (respiratory chain) và phosphororyl hóa ôxy hóa (oxidative phosphorylation) Khác với vi khuẩn kị khí, vi khuẩn hiếu khí có thể tổng hợp ATP mạnh mẽ hơn nhiều nhờ có chuỗi hô hấp và ATP - synthetase. Hai hệ thống này nằm ở màng tế bào Prokaryota hoặc màng trong ti thể của tế bào Eukaryota. Năng lượng thoát ra được chuyển thành ATP, một phần nhỏ giải phóng ra ở dạng nhiệt. Các thành phần của chuỗi nằm trong lớp lipid kép, gồm nhiều enzyme vận chuyển electron và hydro, các coenzyme và nhóm thêm, các dehydrogenase và hệ thống vận chuyển. Các thành phần quan trọng nhất tham gia vào ôxy hóa hydro là : - Flavoprotein là các enzyme chứa nhóm thêm là FMN hoặc FAD - vận chuyển hydro. - Protein Fe-S vận chuyển electron, chứa nguyên tử Fe, vừa liên kết với S của cysteine vừa liên kết với S của H2S. Cysteine là một phần của chuỗi polypeptide, có thể coi trung tâm Fe - S là nhóm thêm của chuỗi polypeptide. Các protein Fe - S cũng tham gia vào sự cố định N, khử sulphite, khử nitrite, quang hợp... - Quinol: nằm ở màng trong của ti thể, ở vi khuẩn G- là ubiquinol (CoQ), vi khuẩn G+ là naphtoquinol và ở lục lạp là plastoquinol. Quinol, đặc biệt là CoQ có đặc tính ưa lipid do đó lắp vào lớp lipid kép của màng, vận chuyển hydro hoặc enzyme.
109 - Cytochrome: vận chuyển electron, không vận chuyển hydrogen. Cytochrome nhận electron từ quinol, trong quá trình vận chuyển một số lượng H+ tương đương với số lượng electron bị tách vào môi trường (hình 5.6). Cyt Cyt Cyt Cyt Hình 5.6 Sơ đồ chuỗi hô hấp Trong quá trình vận chuyển 2[H] từ NADH2 đến O2 có 3 bước chuyền electron liên quan đến tạo thành ATP và được biểu thị bằng hệ số P/O (mol ATP/mol nguyên tử O). Hệ số P/O = 3 khi 2[H] được chuyền qua NAD+ và P/O = 2 khi 2[H] từ succinate qua FAD đến O2. Do đó 1mol glucose khi phân giải qua chu trình EMP và TCA với tất cả [H] tách ra được chuyển vào chuỗi hô hấp để tạo thành nước sẽ tạo 38 ATP. Sự tính toán trên đúng với ti thể và một số vi khuẩn. Tuy nhiên, ở một số vi khuẩn do chỉ có 2 vị trí phosphoryl hóa nên sự hô hấp hiếu khí glucose chỉ cho 26 ATP (như ở E. coli không có NAD, Proteus vulgaris không có cytochrome C). Cơ chế phosphoryl hoá ôxy hoá (sự tạo thành ATP trong chuỗi hô hấp) được giải thích theo thuyết hoá thẩm thấu của Mitchell (1979). Theo thuyết này, màng tế bào vi khuẩn và màng trong ti thể không thấm các ion kể cả H+ và OH- và kém dẫn điện. Sự sắp xếp các protein của màng (các thành phần vận chuyển electron, permease, ATP - sinthetase...) khiến màng mang tính chất không đối xứng. Sự định hướng không gian của các phân tử enzyme dẫn đến trao đổi chất có đặc tính vectơ. Chuỗi hô hấp bao gồm một dãy các chất vận chuyển hidro và electron sắp xếp luân phiên trong màng. Do sự ôxy hoá cơ chất mà phía trong màng có sự tiêu thụ H+ và phía màng ngoài giải phóng H+. Trong sự ôxy hoá NADH2, 6H+ đã
110 được vận chuyển ra phía ngoài qua 3 núm. Việc vận chuyển proton do hô hấp làm xuất hiện một gradien điện hoá giữa 2 phía của màng. Thế proton này sẽ là động lực của sự phosphoryl hoá nghĩa là sự tạo thành ATP. Quá trình được xúc tác bởi ATP - sinthetase, enzyme này chuyển năng lượng phát ra từ dòng electron thành liên kết esterphosphate cao năng của ATP. ATP - sinthetase gặp ở các màng tham gia vào sự chuyển hoá năng lượng là màng ti thể, lục lạp và màng tế bào vi khuẩn. Có lẽ, dòng H+ từ ngoài đã đi qua rãnh của ATP - sinthetase trở vào bên trong ti thể hoặc vi khuẩn, năng lượng thoát ra được dùng cho phản ứng phosphoryl hoá tạo ATP. IV. Sự vận chuyển chất dinh dưỡng vào tế bào Để tồn tại, sinh trưởng và phát triển, tế bào vi sinh vật phải thường xuyên trao đổi vật chất và năng lượng với môi trường bên ngoài. Một mặt chúng nhận các chất dinh dưỡng cần thiết từ môi trường, mặt khác chúng thải ra các sản phẩm trao đổi chất. Giữa môi trường xung quanh và môi trường bên trong tế bào tồn tại một hàng rào thẩm thấu, hàng rào này chính là màng tế bào chất. Tế bào nhận và thải các chất một cách chọn lọc. Sự xâm nhập của nước và các chất hòa tan qua màng tế bào là một quá trình động học; tế bào sống không bao giờ ở trạng thái cần bằng với các chất của môi trường chung quanh. Sự vận chuyển các chất qua màng tế bào vi sinh vật tuân theo một trong hai cơ chế: khuếch tán đơn giản (hay còn gọi là vận chuyển thụ động hay vận chuyển xuôi dòng) và vận chuyển chủ động (vận chuyển ngược dòng). Theo cơ chế khuếch tán thụ động các phân tử đi qua màng nhờ sự chênh lệch nồng độ (trong trường hợp các chất không điện phân) hay chênh lệch điện thế (trong trường hợp các ion) ở hai phía của màng. Hàng loạt nghiên cứu đã khẳng định, trừ nước ra rất ít hợp chất có thể được vận chuyển qua màng theo cơ chế nói trên. Trái lại, đa số các chất hòa tan qua màng do cơ chế vận chuyển đặc biệt. Những phân tử vận chuyển sắp xếp trong màng liên kết với các phân tử chất hòa tan và chuyển chúng vào bề mặt bên trong của màng, từ đây các phân tử chất hòa tan được chuyển vào tế bào chất. Kiểu khuếch tán này được gọi là khuếch tán xúc tiến. Các phân tử protein vận chuyển (carrier protein) nói trên gọi là protein thấm – permease. Sự vận chuyển các chất nhờ permease có thể là thụ động (không cần năng lượng của tế bào) hoặc chủ động (cần năng lượng). Theo cơ chế vận chuyển thụ động, chất hòa tan liên kết thuận nghịch vào một vị trí đặc biệt trên phân tử permease nằm ở bên trong màng (có thể ở các lỗ của màng). Phức hợp “chất hòa tan - permease” được vận chuyển theo hai phía của
111 màng nhờ sự chênh lệch nồng độ ở một chất nào đó, nghĩa là sự vận chuyển diễn ra theo kiểu “xuôi dòng”. Sự vận chuyển thụ động nhờ permease đã được chứng minh ở một số vi sinh vật. Tuy nhiên, vi sinh vật có khả năng tích lũy một số chất với nồng độ cao hơn nhiều so với nồng độ bên ngoài. Chẳng hạn, nồng độ K+ bên trong một số tế bào vi sinh vật có thể lớn hơn nồng độ bên ngoài hàng ngàn lần. Để đảm bảo độ trung hòa điện, tế bào cũng đồng thời thải ra bên ngoài các ion H+ hoặc Na+. Thêm vào đó, người ta đã phát hiện thấy ở các màng vi khuẩn có hoạt tính của ATP - ase là enzyme có liên quan đến việc vận chuyển các chất. Rõ ràng, trong tế bào vi sinh vật ngoài cơ chế vận chuyển thụ động còn tồn tại cơ chế vận chuyển chủ động nhờ permease. Sự vận chuyển này được tiến hành ngược với gradien nồng độ nghĩa là theo kiểu “ngược dòng”, năng lượng tiêu thụ có thể do ATP cung cấp. Cho tới nay người ta đã phân lập được hàng loạt protein vận chuyển trong các loài vi sinh vật. Giống như enzyme, chúng có tính đặc hiệu cơ chất khác nhau. Một số có tính đặc hiệu gần như tuyệt đối. Chẳng hạn, permease của galactose ở E.coli chỉ vận chuyển galactose. Các permease của các đường và acid amin khác thể hiện tính đặc hiệu yếu hơn đối với các chất hòa tan. Điều đáng chú ý là trong vi khuẩn sự vận chuyển chủ động của hầu hết các loại đường phụ thuộc vào quá trình phosphoryl hóa và hệ thống enzyme phosphotransferase. Hệ thống này bao gồm hai enzyme EI, EII và một protein vận chuyển bền nhiệt (Hpr: heat stable carried protein) có khối lượng phân tử thấp. Các thành phần protein của hệ thống này đã được thuần khiết và phản ứng diễn ra theo hai bước. Trước hết EI chuyển phosphate từ phosphoenolpyruvate (PEP) đến Hpr: Hpr + PEP Hpr - P + Pyruvate Sau đó EII chuyển phosphate từ Hpr - P đến C6 của đường đơn. EI là chung cho nhiều loại đường nhưng EII lại đặc trưng cho mỗi loại đường. Nghĩa là một đột biến nào đó ảnh hưởng đến việc tổng hợp EI sẽ dẫn đến mất khả năng vận chuyển nhiều loại đường. Trái lại với đột biến như thế đối với EII chỉ ảnh hưởng đến sự vận chuyển của một loại đường (hình 5.7).
112 Trong Màng Ngoài Glucose- 6P EII Glucose Hpr PEP pyruvic Hpr-P EII glucose Hình 5.7 Sơ đồ vận chuyển đường qua màng tế bào vi sinh vật V. Trao đổi chất và năng lượng 1. Các nguồn năng lượng ở vi sinh vật Tùy theo bản chất của nguồn năng lượng sơ cấp, có hai con đường cơ bản để cung cấp cho vi sinh vật: con đường quang dưỡng và hóa dưỡng. Trong cả hai trường hợp, sự thu nhận năng lượng của tế bào được liên hệ với sự vận chuyển electron qua màng, do đó tạo ra một gradient electron proton từ phần này đối với phần kia của màng tế bào chất. Chính gradien nồng độ ion là nguồn gốc của lực bơm proton (sự khác biệt điện tích) có thể được dùng vào những mục đích khác nhau như vận chuyển tích cực, sản xuất các chất giàu năng lượng, chuyển động v.v.. . Trong thế giới vi sinh vật có sự khác biệt rất lớn về khả năng sử dụng các nguồn năng lượng. Một số vi khuẩn hiếu khí cũng giống như động vật có khả năng tổng hợp ATP cho mình từ đường bị phân giải theo con đường đường phân (glycolyse) và chu trình Krebs nhờ chuỗi hô hấp trên màng tế bào chất (tương tự như chuỗi hô hấp ở màng trong của ty thể). Còn những vi sinh vật kị khí lại thu năng lượng cho hoạt động sống của mình nhờ quá trình lên men của các loại đường hoặc nhờ một loại chuỗi vận chuyển electron trong đó có sử dụng các hợp chất không phải là ôxy phân tử làm chất nhận electron cuối cùng trong chuỗi vận chuyển. Ở đây, chuỗi vận chuyển cũng khu trú trên màng tế bào chất tương tự như chuỗi vận chuyển nằm trong các ty thể. Đối với các cơ thể quang dưỡng thì lại khác, chúng có thể thu nhận năng lượng của ánh sáng.
113 Đứng về quan điểm năng lượng sinh học, thì ty thể, lục lạp và tế bào vi khuẩn có nhiều nét tương đồng. Tất cả các vi khuẩn có trên màng tế bào chất một hệ enzyme ATP - synthetase tương tự như ATP - synthetase của các ty thể và lục lạp. Phức hợp protein vận chuyển qua màng đảm bảo biến đổi dòng proton thành năng lượng trong mối liên kết phosphate ở dạng ATP. 1.1.Các cơ thể quang dưỡng (phototroph) và quang tổng hợp (photosynthesis) Hình thái của cơ thể quang dưỡng và quang tổng hợp giữa vi khuẩn, tảo, thực vật có sự khác biệt rõ ràng. Mặt khác, cấu tạo các cơ quan quang hợp, sắc tố quang tổng hợp, cũng khác biệt (xem chương II). Đối với thực vật, chất cho electron là H2O và quá trình quang hợp giải phóng ôxy phân tử. Đối với vi khuẩn quang hợp không thải ôxy và chất cho electron là những hợp chất vô cơ (như H2S, S) hoặc hợp chất hữu cơ (isopropanol) (xem thêm chương VII). 1.2. Các cơ thể hóa dưỡng và ôxy hóa sinh học Phần lớn vi khuẩn không có cơ quan và sắc tố quang hợp. Chúng lấy năng lượng hữu ích cho các quá trình tổng hợp của tế bào nhờ giải phóng năng lượng trong các phản ứng hóa học. Sự trao đổi chất của các cơ thể hoá dưỡng nói chung bao gồm 3 giai đoạn: - Phân cắt các đại phân tử ở ngoài tế bào. - Phân giải các phân tử bé để tạo ra các chất trao đổi trung gian (pyruvate, acetyl - CoA) và tạo năng lượng hữu ích (ATP). - Phân giải triệt để các chất trao đổi trung gian thành CO2 và H2O với việc tạo ra lượng lớn ATP. Đó là những phản ứng ôxy hóa cơ chất hữu cơ và vô cơ. Quá trình ôxy hóa một cơ chất A có thể xem là một chuỗi phản ứng mà trong đó cơ chất A mất đi các eletron của mình. Cơ chất A gọi là chất cho electron sẽ biến thành một sản phẩm được ôxy hóa. Tương tự, một hợp chất B khác gọi là chất nhận electron sẽ biến thành sản phẩm khử. Trong phần lớn trường hợp, một hợp chất A là một chất hữu cơ có thể xem là chất được hydro hóa, như vậy thì quá trình ôxy hóa về thực chất là một quá trình khử hydro (dehydrogenation), trong khi đó quá trình khử là quá trình hydro hóa (hydrogenation), tổ hợp hai quá trình này là quá trình ôxy hóa khử (oxidoreduction). Quá trình ôxy hoá:
114 - 2H+ AH2 (chất cho hydro) A (sản phẩm ôxy hoá) + Năng lượng - 2e Quá trình khử: + 2H+ B (chất nhận hydro) BH2 (sản phẩm khử) + 2e Kết quả: AH2 + B A + BH2 + Năng lượng Trong chuỗi phản ứng, việc vận chuyển hydro hay electron từ cơ chất sang chất nhận được thực hiện nhờ hàng loạt enzyme, các enzyme này tạo thành chuỗi vận chuyển điện tử. Các chất xúc tác thích ứng cao với quá trình ôxy hoá cơ chất là những dehydrogenase. Những enzyme này đặc trưng cho một loại cơ chất và tổ hợp với các coenzyme mà nó đóng vai trò là chất nhận hydro từ cơ chất. Đó là các dẫn xuất của flavin (FMN, FAD) hoặc của pyridine (NAD, NADP) và nhiều hợp chất khác. Ở các cơ thể hiếu khí, sự vận chuyển các electron giữa coenzyme của dehydrogenase và ôxy phân tử được thực hiện nhờ các hợp chất trung gian của cytochrome. 2. Các kiểu hô hấp Thông thường khi chất nhận electron cuối cùng là ôxy phân tử thì gọi là quá trình hô hấp hiếu khí và vi sinh vật thuộc dạng này gọi là vi sinh vật hiếu khí (aerobes). Khi chất nhận electron cuối cùng là một cơ chất khác không phải là ôxy tự do, thì người ta gọi là quá trình lên men hoặc có thể là quá trình hô hấp kị khí và vi sinh vật thực hiện các quá trình này gọi là các cơ thể kỵ khí (anaerobes). Trong số các cơ thể kỵ khí, chất nhận electron có thể là chất hữu cơ hoặc chất vô cơ. Nếu chất nhận electron là chất hữu cơ người ta gọi là lên men, nếu chất nhận là electron là chất vô cơ người ta gọi là hô hấp kỵ khí (anaerobic respiration). Hô hấp của một cơ thể hiếu khí là một quá trình vận chuyển electron và proton qua màng với ôxy phân tử làm chất nhận electron cuối cùng, còn “hô hấp kỵ khí” dùng để chỉ một quá trình vận chuyển qua màng của các electron và proton đến chất nhận electron cuối cùng là một chất khác ôxy phân tử, như nitrate trong trường hợp hô hấp nitrate (nitrate respiration), fumarate như hô hấp fumarate (fumarate respiration ) v.v...
115 Rất nhiều vi sinh vật có nhiều chuỗi vận chuyển electron có thể cùng hoạt động, hoặc được hoạt động trong những điều kiện nuôi cấy nhất định. Ví dụ như ở E. coli, vi khuẩn đường ruột này có chuỗi vận chuyển electron với ôxy phân tử là chất nhận electron cuối cùng (chuỗi hoạt động như cơ thể hiếu khí ) và chuỗi “hô hấp nitrate” hoạt động kỵ khí trong môi trường nitrate, một chuỗi “hô hấp fumarate”, hoạt động kỵ khí trên môi trường chứa cơ chất hữu cơ mà vi khuẩn này có thể lên men. Hô hấp được đặc trưng trước hết là nơi khu trú của chuỗi vận chuyển electron ở màng tế bào chất đối với các cơ thể nhân sơ và ở màng trong của ty thể đối với các cơ thể nhân chuẩn. Hô hấp còn đặc trưng ở bản chất của chất nhận electron cuối cùng là ôxy phân tử. Sự ôxy hoá cơ chất và đồng thời sự khử của ôxy được thực hiện nhờ một chuỗi phản ứng enzyme, trong đó có sự tham gia của dehydrogenase và các coenzyme liên kết với nó. Cơ chế thường thấy ở hô hấp là con đường của các cytochrome gián tiếp. Ngày nay người ta hoàn toàn biết rõ thành phần và cơ chế hoạt động của các cytochrome này trong tế bào nhân chuẩn và trong một số cơ thể nhân sơ. Bên cạnh quá trình phosphoryl ôxy hoá cơ chất, còn tồn tại những con đường khác, đặc biệt là con đường ôxy hoá trực tiếp nhờ các enzyme vận chuyển các electron từ cơ chất đến ôxy với sự tạo thành H2O2 . FADH2 + O2 FAD- oxydase FAD + H2O2 Hợp chất này rất độc và cần phải được phân giải nhờ catalase, peroxydase hoặc superoxyd dismutase tránh cho tế bào khỏi bị chết. H2O2 H2O + 1/2 O2 catalase + - H2O2 + 2H + 2e 2H2O peroxydase Những con đường này tạo rất ít hoặc không tạo năng lượng hữu ích. Một vi khuẩn không có enzyme trên, nhưng con đường phân giải trên buộc chúng phải sống kỵ khí bắt buộc, bởi vì ôxy phân tử là tác nhân gây độc với chúng. Có một số vi khuẩn chịu được hiếu khí như Streptococcus, chúng không có catalase, nhưng có các enzyme flavin (NAD - oxydase và NAD - peroxydase) cho phép chúng thực hiện sự cân bằng trong hô hấp ở màng tế bào chất. Tuỳ thuộc vào số lượng và lượng các enzyme có thể phân giải H2O2 mà quyết định tính hiếu khí hay kỵ khí ở các vi khuẩn. Lên men để chỉ sự có mặt của chuỗi vận chuyển electron nằm trong tế bào chất, không có sự tự động đi qua của dòng electron hoặc proton ở phần bên này và phần bên kia của màng tế bào (một dòng vận chuyển thứ
116 cấp được thiết lập nếu cần thiết, nhờ năng lượng của ATP). Về phương diện trao đổi năng lượng, đây cũng là một quá trình ôxy hóa khử, nhưng chất nhận electron cuối cùng là các hợp chất hữu cơ, chứ không phải là các phân tử ôxy. Quá trình này cũng giải phóng năng lượng nhưng ít hơn nhiều so với quá trình hô hấp. Các hợp chất cho electron (AH2) và chất nhận electron (B) đều là các hợp chất hữu cơ. Việc vận chuyển electron được thực hiện nhờ NAD. Ở đây có sự khác biệt rõ rệt so với hô hấp về bản chất của chất vận chuyển electron về sản phẩm cuối cùng... Cơ chế vận chuyển electron trong quá trình lên men được tóm tắt như sau: NAD+ AH2 BH2 A NADH2 B 3. Nghiên cứu sự trao đổi năng lượng Sự khác biệt về các phản ứng ôxy hóa khử ở các nhóm vi sinh vật khác nhau là một tiêu chuẩn dùng để định loại chúng, một số nhà nghiên cứu đề xuất những phương pháp và môi trường có thể định loại nhanh chóng và đơn giản các nhóm vi sinh vật. 3.1 Nghiên cứu kiểu hô hấp Để xác định kiểu hô hấp của một loại vi khuẩn, trong phòng thí nghiệm người ta sử dụng môi trường VF (nước thịt - gan) đã chế đặc và đưa vào ống nghiệm, rồi cấy giống vào sâu, dựa vào khả năng phát triển trong các ống nghiệm ta biết được đó là loại hô hấp gì. 3.2 Dùng phản ứng oxydase Phản ứng này cho phép sự có mặt của chuỗi hô hấp đang hoạt động với cytochrome C ở màng nhờ TMPD (tetra - methyl - paraphenylene - diamine). Phản ứng này đặc biệt hiệu quả đối với vi khuẩn G-, phản ứng dương tính với các vi khuẩn hiếu khí bắt buộc (trừ Pseudomonas maltophyla và Acinatobacter), phản ứng âm tính đối với các vi khuẩn kị khí không bắt buộc trừ các Vibrio và Aeromonas. Đặc biệt đối với các vi khuẩn đường ruột là có phản ứng âm tính mặc dù vi khuẩn này có chuỗi hô hấp với các cytochrome. 3.3 Thử catalase Enzyme catalase thường có ở các vi khuẩn G-, trừ các giống Streptococcus và Lactobacilus. Khi có mặt H2O2, một vài giọt huyền phù vi khuẩn có catalase dương sẽ làm sủi bọt giải phóng ôxy phân tử. Nếu: