Khả năng lên men chìm và tác dụng của dịch chiết sinh khối nấm Thượng hoàng (Phelinus linteus) phân lập tại Lâm Đồng, Việt Nam lên một số dòng tế bào người

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:9

Thêm vào BST

Báo xấu

4
lượt xem 1
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Trong nghiên cứu này, chủng nấm được đặt tên PLUS được phân lập từ vùng Lâm Đồng và được phân loại là Phellinus linteus dựa vào trình tự rARN vùng ITS. Chủng nấm này được tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy để thu sinh khối dạng sợi.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Khả năng lên men chìm và tác dụng của dịch chiết sinh khối nấm Thượng hoàng (Phelinus linteus) phân lập tại Lâm Đồng, Việt Nam lên một số dòng tế bào người

TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 509 - THÁNG 12 - SỐ CHUYÊN ĐỀ - 2021 3. Capling, L., et al., Validity of Dietary European Journal of Clinical Nutrition, 2020. Assessment in Athletes: A Systematic 74(11): p. 1498-1513. Review. Nutrients, 2017. 9(12): p. 1313. 8. Larson-Meyer, D.E., K. Woolf, and L. 4. Tardy, A.L., et al., Vitamins and Minerals Burke, Assessment of Nutrient Status in for Energy, Fatigue and Cognition: A Athletes and the Need for Supplementation. Narrative Review of the Biochemical and Int J Sport Nutr Exerc Metab, 2018. 28(2): p. Clinical Evidence. Nutrients, 2020. 12(1). 139-158. 5. Lukaski, H.C., Vitamin and mineral status: 9. Kawashima, I., et al., Comparison of vitamin effects on physical performance. Nutrition, D sufficiency between indoor and outdoor 2004. 20(7-8): p. 632-44. elite male collegiate athletes. Nagoya J Med 6. Beck, K.L., et al., Micronutrients and athletic Sci, 2021. 83(2): p. 219-226. performance: A review. Food Chem Toxicol, 10. Teixeira, P., et al., Prevalence of vitamin D 2021. 158: p. 112618. deficiency amongst soccer athletes and effects 7. Amrein, K., et al., Vitamin D deficiency 2.0: of 8 weeks supplementation. J Sports Med an update on the current status worldwide. Phys Fitness, 2019. 59(4): p. 693-699. KHẢ NĂNG LÊN MEN CHÌM VÀ TÁC DỤNG CỦA DỊCH CHIẾT SINH KHỐI NẤM THƯỢNG HOÀNG (Phelinus linteus) PHÂN LẬP TẠI LÂM ĐỒNG, VIỆT NAM LÊN MỘT SỐ DÒNG TẾ BÀO NGƯỜI Phạm Đức Minh2, Hoàng Vân Thanh3, Hoàng Phú Hiệp3, Hoa Thị Minh Tú1, Nguyễn Hữu Trí2, Lê Thị Hoàng Yến5, Nguyễn Thị Minh Huyền1 TÓM TẮT 20 có nhiều công dụng tốt cho sức khỏe của con Nấm Thượng hoàng (Phellinus linteus) đã người. Tuy nhiên, quả thể của nấm ở Việt Nam được biết đến trên thế giới là loại nấm dược liệu rất hiếm và giá khá cao vì việc trồng nấm này ở nước ta có nhiều hạn chế. Do đó, trồng nấm dưới 1 Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa dạng sinh khối trong môi trường lên men lỏng học và Công nghệ Việt Nam; cũng là một lựa chọn được quan tâm. Trong 2 Học viện Quân y, Bệnh viện Quân y 103; nghiên cứu này, chủng nấm được đặt tên PLUS 3 Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên; được phân lập từ vùng Lâm Đồng và được phân 4 Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh; loại là Phellinus linteus dựa vào trình tự rARN 5 Viện Vi sinh vật và công nghệ sinh học, Đại học vùng ITS. Chủng nấm này được tối ưu hóa điều Quốc gia Hà Nội; kiện nuôi cấy để thu sinh khối dạng sợi. Sinh Chịu trách nhiệm chính: Nguyễn Thị Minh Huyền khối nấm thu sau khi lên men được sấy khô và Email: ntminhhuyen@ibt.ac.vn chiết với nước nóng và cồn, sau đó các dịch chiết Ngày nhận bài: 23.11.2021 được đánh giá khả năng ảnh hưởng đến dòng tế Ngày phản biện khoa học: 27.11.2021 bào ung thư vú BT474 bằng KIT MTS. Kết quả Ngày duyệt bài: 30.11.2021 137
HỘI NGHỊ KHOA HỌC LẦN THỨ XXIV CỦA HỘI HÓA SINH Y HỌC HÀ NỘI VÀ CÁC TỈNH PHÍA BẮC cho thấy cả hai dịch chiết của Phellinus linteus Keywords: Isolation, medicinal mushroom, đều có khả năng kìm hãm sự phát triển của submerged fermentation, biomass, Phellinus BT474. Dịch chiết nước nóng có sự kìm hãm linteus BT474 cao hơn dịch chiết cồn. Cả 2 loại dịch chiết này đều không ảnh hưởng đến dòng tế bào I. ĐẶT VẤN ĐỀ phôi thận thường của người (HEK293). Nấm Thượng hoàng (TH) có tên khoa học Từ khóa: Phân lập, nấm dược liệu, lên men là Phellinus linteus, họ Hymenochaetaceae, chìm, sinh khối, Phellinus linteus. chi Phellinus. Nấm có màu vàng, đường kính 6-12 cm, dày khoảng 2-10 cm, hình bán SUMMARY nguyệt, dạng nhẵn, tròn và hình dạng rất đa SUBMERGE FERMENTATION dạng. Bề mặt có màu sậm, lông ngắn và dần ABILITY AND EFFECT OF mất đi khi trưởng thành, khi đó nấm ngả EXTRACTION OF PHELLINUS sang màu đen hoặc vàng sậm, bề ngang và LINTEUS BIOMASS WHICH bề dọc khác biệt hẳn. Mặt chính giữa thường ISOLATED IN LAM DONG, VIETNAM có màu vàng sáng, mặt dưới màu sẫm. Thỉnh ON HUMAN CELL LINES thoảng nấm có hình dạng không miếng và Phellinus linteus has been worldwide known bào tử có màu vàng nhạt. Đây là loài nấm as a medicinal mushroom with many usefull hóa gỗ, thường mọc ở những vùng rừng sâu, activity for human health. However, its fruit núi cao hiểm trở, hay các khu rừng nguyên body still rare in Vietnam and is very expensive, sinh nên tuổi nấm có khi lên tới hàng chục because it is difficult for cultivated in artificial năm. Chúng đã được sử dụng phổ biến tại medium. Therefore, biomass production by Hàn Quốc, Trung Quốc, Nhật Bản. Tổng sản liquid fermentation is still being a good way for lượng của các loài Phellinus trên thế giới obtaining this mushroom’s production in khoảng 30 tấn/năm, chủ yếu từ tự nhiên. Việt Vietnam. In this study, one mushroom naming Nam là nước có khá nhiều loài Phellinus, tuy PLUS was isolated from Lam Dong. Based on nhiên cũng bị khai thác cạn kiệt, tận thu và morphology observation and rARN sequence khó gặp nếu không đi sâu vào các vùng rừng analysis of the ITS region PLUS was identified nguyên sinh. Tác dụng của nấm này đối với as Phellinus linteus. Biomass of this fungus sức khỏe của con người đã được nghiên cứu obtained from an optimized liquid medium was khá nhiều. Các loại nấm này đang được các used for hot waterand ethanol extraction. These nhà khoa học thế giới quan tâm vì đặc tính extractions were used for testing ability to affect chống khối u của nó [1]. Các nghiên cứu chỉ to human breast cancer cell line (BT474) activity ra rằng nó còn có tác dụng tốt đối với điều trị by using MTS KIT. The results showed that both các bệnh như đái tháo đường, nhiễm khuẩn, of two extractions inhibit activity of BT474 cell bệnh tim, cao huyết áp và có tính kháng line. However, the hot water extraction showed viêm loét [2]. Hiện nay, đã có một số nghiên higher activity than the ethanol extraction. Both cứu tại Việt Nam tìm đặc điểm sinh trưởng of these extractions showed no effective to the của nấm [3] hay nghiên cứu về các loài cùng normal human embryonic kidney (HEK293) cell chi Phellinus như Phellinus baumi [4] nhằm line. mục đích như trên. Trong nghiên cứu này, đã phân lập và định danh được nấm Thượng 138
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 509 - THÁNG 12 - SỐ CHUYÊN ĐỀ - 2021 hoàng tại vùng Lâm Đồng, Việt Nam và một Nhân giống nấm trong môi trường số nghiên cứu sơ bộ về đặc tính sinh trưởng thạch và lỏng: Giống nấm được nhân và bảo cũng như tác dụng của dịch chiết sinh khối quản ở môi trường PDA. Trước các thí nấm lên dòng tế bào ung thư vú BT474 và tế nghiệm, làm mới bằng cách cấy nấm trên đĩa bào thường HEK293 đã được thực hiện. PDA, ủ ở 28°C. Cắt nhỏ sợi nấm và chuyển sang môi trường lỏng trong bình tam giác II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 250ml với 50 ml môi trường, và cấy giống Vật liệu theo tỉ lệ 10%. Các điều kiện gồm: nhiệt độ Chủng nấm TH được thu tại vùng 28oC, tốc độ lắc 150 vòng/phút, thời gian Madagui, huyện Đạ Huoai, tỉnh Lâm Đồng; nuôi lắc 12 ngày để thu sinh khối. Các hóa chất đạt chuẩn vi sinh và sinh học Tách chiết và tinh sạch DNA từ nấm phân tử; Môi trường thạch khoai tây (PDA- Thượng Hoàng: Sinh khối nấm được thu Potato Dextrose Agar): 200 g khoai tây, đun bằng cách ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 lấy nước trong 20 phút, glucose 20 g/l; Yeast phút trong ống 2ml và nghiền mịn với Ni tơ extract 1 g/l; Agar 15 g/l khử trùng ở 121oC lỏng. Bổ sung 800 µl đệm TE + 1% triton X- trong 15 phút. Môi trường lỏng được chuẩn 100, trộn đều. Thêm 15 µl lysozyme 100 bị dựa trên tham khảo của Lee et al mg/ml, ủ ở 37°C trong 1h. Thêm 60µl SDS [5].Thành phần môi trường gồm: glucose 40 10% và 15µl proteinaise K (20mg/ml), trộn g/l; cao nấm men 20 g/l; K2HPO4 0,46 g/l; đều, ủ ở 56°C trong 30 phút. Tiếp tục thêm KH2PO4 1,00 g/l; MgSO4.7 H2O 0,5 g/l; 100µl CTAB/NaCl và 100µl NaCl 5M, trộn FeCl2 0,01 g/l; MnCl2.4H2O 0.036 g/l; ZnCl2 đều, ủ ở 65°C trong 10 phút. Bổ sung 800µl 0.03 g/l; CuSO4.7H2O 0,005 g/l; hấp khử hỗn hợp Cloroform/isoamylalcohol (24:1) trùng ở 121°C trong thời gian 15-20 phút. đảo nhẹ nhàng, ly tâm 10 phút ở 12000 Phương pháp nghiên cứu vòng/phút. Hút dịch nổi sang ống mới. Lặp Phân lập nấm Thượng hoàng Phellinus lại bước này 2 lần. Bổ sung 800µl sp.: Tai nấm TH được thu nhận tại thị trấn isopropanol, đảo ống và ủ ở -20°C trong Madagui, huyện Đạ Huoai, tỉnh Lâm Đồng. 1giờ. Ly tâm với tốc độ 12000 vòng/phút Tai nấm phát triển tốt, không bị sâu mọt đục trong 15 phút ở 4oC. Rửa tủa 2 lần bằng khoét. Mẫu được xử lý theo cách sau: Dùng 500µl ethanol 70%, ly tâm thu cặn, và để bông thấm cồn 70o lau bề mặt quả thể nấm khô. Hòa tan lại DNA trong 100µl nước khử để loại bỏ bào tử và các bụi bẩn trên quả thể, ion (DDW), bổ sung 200 µl lysis buffer và cắt sạch chân nấm. Sau đó, dùng bông thấm tiếp tục tinh sạch lại với kit Thermo cồn 70o lau bề mặt quả thể nấm. Khử trùng Scientific GeneJET DNA purification. DNA dao cấy trên ngọn lửa đèn cồn. Dùng lưỡi được elute trong 100µl DDW. Bảo quản dao rạch nhẹ mặt dưới quả thể nấm tách quả trong tủ -20oC. Nồng độ DNA được xác định thể làm hai. Tiến hành lấy dao cấy lấy mẫu với máy đo nanodrop. mô bên trong và cấy lên môi trường PDA PCR và giải trình tự DNA: Hỗn hợp trong đĩa petri có kích thước 90 x 15 mm. phản ứng PCR gồm có: 1x PCR buffer 22,5 Sau đó, mang đĩa giống để vào phòng tối, µl, 10 pmol primer 0,5 µl mỗi loại (ITS1: nhiệt độ phòng từ 25oC – 32oC. Quan sát sợi TCC GTA GGT GAA CCT GCG G; ITS4: nấm mọc sau đó. TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC), DNA 139
HỘI NGHỊ KHOA HỌC LẦN THỨ XXIV CỦA HỘI HÓA SINH Y HỌC HÀ NỘI VÀ CÁC TỈNH PHÍA BẮC khuôn 0,5 µl, nước khử ion vừa đủ 25 µl (EZ mg/ml, 0,3 mg/ml, 0,6 mg/ml, 1,2 mg/ml PCR mix, Phusa Biochem). Chu trình nhiệt: trên tổng 10 µl vào mỗi giếng và tiếp tục 1, 95oC 3 phút; 2, 95oC 30 giây; 3, 58oC 30 theo dõi sau khi ủ 24h, 48h. Ảnh hưởng của giây; và 4, 72oC 30 giây; lặp lại các bước 2 dịch chiết đến các tế bào được đánh giá bằng đến 4 từ 30 đến 35 chu kỳ; 5, 72oC 5 phút. cách quan sát trên kính hiển vi quang học và Sản phẩm PCR được phân tách bằng điện di theo phương pháp MTS sử dụng Kit trên 1% agarose gel, 100V, 30 phút và kiểm CellTiter 96® AQueous One Solution Cell tra kết quả với UV visualizer. Sau đó được Proliferation Assay (MTS) của hãng giải trình tự tại Phòng thí nghiệm Trọng Promega. Mỗi mẫu thí nghiệm được lặp lại 2 điểm công nghệ gene, Viện Công nghệ sinh lần. học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Kết quả được phân tích sử dụng III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN phần mềm BioEdit và Blast tool trên NCBI. 1. Thu thập và phân lập và định danh Chiết bột sinh khối nấm Thượng nấm Thượng hoàng hoàng: a, Chiết cồn: Ngâm 10 g bột sinh Nấm TH được tìm thấy tại một hốc cây khối trong 300 ml cồn (2~3 ngày), thu dịch mục ở vùng Madagui, huyện Đạ Huoai, tỉnh bằng cách lọc với giấy lọc 3M. Dịch sau khi Lâm Đồng (hình 1a). Tai nấm có kích thước lọc được cô đặc với máy cô quay chân không lớn, bề mặt xen lẫn màu đen và vàng. Vùng đến khi khối lượng không thay đổi. Xác định màu đen có bề mặt nhẵn, mịn. Vùng màu khối lượng bình trước và sau khi cô, và hòa vàng có bề mặt mịn như nhung, cấu tạo xốp lại các chất còn trong bình cô quay với 2ml DMSO. Hàm lượng các chất được tính theo hơn. Sợi nấm phát triển trên bề mặt thạch mg/ml. b, Chiết nước nóng: Ngâm 10g bột PDA có màu vàng đậm, bề mặt mịn như sinh khối trong 200-300 ml nước cất nóng nhung. Sợi tơ khỏe, tốc độ lan tơ đầy đĩa ~90oC trong 2-3 giờ (h). Thu dịch và cô đặc trong khoảng 7 đến 10 ngày (hình 1b). Trong tương tự như chiết với cồn và hòa lại trong 2 môi trường lỏng, sợi nấm mọc theo khối tròn ml nước. Cách tính hàm lượng các chất trong hoặc dài, các sợi tơ lan tỏa xung quanh khối dịch chiết tương tự như với chiết cồn cầu đó (hình 1c). Nhiệt độ thích hợp để sợi (mg/ml). nấm phát triển trên môi trường thạch là 28oC. Thí nghiệm trên tế bào BT474 và Trình tự gene tại vùng ITS được khuếch đại HEK293: Tế bào sau khi hoạt hóa và cấy với phản ứng PCR dùng mồi đặc trưng ITS1 chuyển một số lần để đạt độ ổn định trước thí và ITS4 [6]. Vùng gene khuếch đại là một nghiệm. Tế bào được duy trì trong môi băng to, rõ nét, có kích thước khoảng hơn trường DMEM low glucose bổ sung 10 % 800bp (hình 1d). Sản phẩm PCR được giải FBS, 1% Pen/strep trong tủ ấm 37oC, 5% trình tự theo phương pháp Sanger. Trình tự CO2. Đếm tế bào sử dụng Trypan blue và PCR được blast trên NCBI cho thấy nấm thu chia ra đĩa 96 giếng ở nồng độ 104 tế bào/giếng/100 µl, ủ qua đêm. Bổ sung dịch thập được có trình tự tương đồng với chiết nước nóng của nấm ở các nồng độ Phellinus linteus strain DGUM25004 (99% 0,425 mg/ml, 0,85 mg/ml, 1,7 mg/ml, 3,4 tương đồng, 100% cover) với gene bank mg/ml; dịch chiết cồn ở các nồng độ: 0,15 accession: AF080458.1. 140
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 509 - THÁNG 12 - SỐ CHUYÊN ĐỀ - 2021 a. b. c. d. Hình 1: Thu thập và phân lập nấm Thượng hoàng. a. Ảnh nấm tại hiện trường. b. Sợi nấm mọc trên đĩa thạch PDA. c. Sợi nấm phát triển trong môi trường lỏng. d. Sản phẩm PCR của ADN tổng số với mồi ITS1 và ITS4 2. Ảnh hưởng của dịch chiết sinh khối nấm Thượng hoàng lên các dòng tế bào ung thư vú BT474 và tế bào thường phôi thận người (HEK293). 2.1. Ảnh hưởng của dịch chiết cồn của sinh khối nấm lên tế bào BT474 0,15 mg /ml 0,3 mg /ml 0,6 mg /ml 1,2 mg /ml 24h 48h Hình 2: Tế bào BT474 sau 24h và 48h ủ với dịch chiết cồn của sinh khối nấm TH. Sau 24h ủ với dịch chiết cồn, hàm lượng với 0,1% và 0,2 % DMSO (tương ứng với dịch chiết tăng lên thì tế bào cũng phát triển nồng độ DMSO có trong 0,6 mg/ml và 1,2 kém hơn, thưa hơn, đặc biệt ở nồng độ cao mg/ml dịch chiết), các tế bào vẫn sống bình nhất (1,2 mg/ml) tế bào đã có dấu hiệu chết, thường, khỏe, vách tế bào lan tỏa và bám vào tế bào trở nên tròn hơn, không thấy còn chân đáy đĩa nuôi, không có dấu hiệu bị chết (kết bám và bề mặt phồng lên nhiều hơn (hình 2). quả không thể hiện trong hình 2). Như vậy, Sau 48h, ở các nồng độ thấp không thấy có DMSO có trong đối chứng hay trong mẫu ảnh hưởng nhiều. Ở nồng độ 0,6 mg/ml tế không ảnh hưởng đến sự sống của tế bào ở bào thưa thớt hơn rất nhiều và ở nồng độ 1,2 các nồng độ ủ là 0,1% và 0,2%. Sau khi ủ mg/ml thì tế bào đã chết, các cấu trúc tế bào với MTS (hình 3), sau 24h tế bào BT474 đã không còn, nhiều vùng tế bào tan rã thành giảm dần sự sống khi nồng độ dịch chiết các mảnh vụn nhỏ (hình 2). Ở các thí nghiệm tăng. Ở nồng độ 0 mg/ml hay không bổ sung đối chứng gồm tế bào không xử lý gì hoặc ủ dịch chiết cồn của nấm, tế bào có sức sống 141
HỘI NGHỊ KHOA HỌC LẦN THỨ XXIV CỦA HỘI HÓA SINH Y HỌC HÀ NỘI VÀ CÁC TỈNH PHÍA BẮC cao nhất. Ở nồng độ 1,2 mg/ml, tế bào cho đối với trường hợp 24h. Điều này có thể là thấy sức sống thấp nhất. Hay nói cách khác do sau 48h có một số chất ảnh hưởng đến kết là dịch chiết cồn của sinh khối nấm ức chế sự quả đọc phổ hấp thụ ở 490 nm do đó kết quả phát triển của tế bào ung thư vú BT474. Tuy không ổn định. Ở trường hợp đối chứng kết nhiên, sau 48h kết quả không ổn định như quả không thay đổi đáng kể. Hình 3: Kết quả MTS của tế bào BT474 sau 24h và 48h ủ với dịch chiết cồn của sinh khối nấm TH. DC1: tế bào ủ với 0,2 % DMSO; DC2: tế bào ủ với 0,1% DMSO; các con số là nồng độ dịch chiết (mg/ml) 2.2. Ảnh hưởng của dịch chiết nước nóng của sinh khối nấm lên tế bào BT474 0,425 mg /ml 0,85 mg /ml 1,7 mg /ml 3,4 mg /ml 24h 48h Hình 4: Tế bào BT474 sau 24h và 48h ủ với dịch chiết nước nóng của sinh khối nấm TH. Trong trường hợp tế bào BT474 ủ với Kết quả MTS (hình 5) sau 24h cho thấy tế dịch chiết nước nóng của sinh khối nấm bào giảm dần sự sống khi nồng độ của dịch (hình 4), sau 24h, ở nồng độ thấp nhất là chiết nước nóng của bột sinh khối nấm 0,425 mg/ml, tế bào vẫn có chân bám vào bề Thượng hoàng tăng dần. Tuy nhiên, cũng mặt đĩa nuôi cấy, ở các nồng độ cao hơn giống như trường hợp dịch chiết cồn, sau không còn nhìn rõ từng tế bào. Sau 48h, 48h thì kết quả MTS không ổn định. Các thí ngay cả ở nồng độ thấp nhất cũng không nghiệm khẳng định cần được làm thêm để có thấy rõ chân tế bào bám vào đáy đĩa nuôi. kết quả tốt hơn. 142
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 509 - THÁNG 12 - SỐ CHUYÊN ĐỀ - 2021 Hình 5: Kết quả MTS của tế bào BT474 sau 24h và 48h ủ với dịch chiết nước nóng của sinh khối nấm TH. DC: tế bào ủ với 10 µl nước cất; Các con số là nồng độ dịch chiết (mg/ml). 2.3. Ảnh hưởng của dịch chiết cồn của sinh khối nấm lên tế bào HEK293 Với dòng tế bào thường, tế bào HEK293 khi được ủ với các nồng độ khác nhau của dịch chiết cồn của sinh khối nấm có hình ảnh như sau: 0,15 mg /ml 0,3 mg /ml 0,6 mg /ml 1,2 mg /ml 24h 48 h Hình 6: Tế bào HEK293 sau 24h và 48h ủ với dịch chiết cồn của sinh khối nấm TH Sau 24h ủ với dịch chiết cồn, tế bào chiết cồn của sinh khối nấm, các tế bào vẫn HEK293 vẫn phát triển bình thường ở tất cả phát triển tốt hơn ở trường hợp bổ sung dịch các nồng độ dịch chiết trong thí nghiệm, chiết so với trường hợp không ủ dịch chiết. chân tế bào vẫn tỏa ra, bám vào bề mặt đáy DMSO có trong đối chứng hay trong mẫu đĩa nuôi cấy, không bị co tròn lại, có thể không ảnh hưởng đến sự sống của tế bào ở quan sát được rõ ràng. Sau 48h ủ, ngay cả ở các nồng độ ủ là 0,1% và 0,2%, nồng độ nồng độ cao nhất là 1,2 mg/ml dịch chiết, tế 0,2% DMSO tương đương lượng DMSO có bào HEK293 vẫn phát triển bình thường, trong 1,2 mg/ml dịch chiết. Như vậy, dịch không thấy dấu hiệu tế bào chết (hình 6). Kết chiết sinh khối nấm trong cồn đã có tác dụng quả MTS (hình 7) cũng cho thấy tế bào phát tốt lên dòng tế bào thường HEK293, không triển tốt hơn ở các nồng độ dịch chiết khác ức chế tế bào mà lại kích thích tế bào phát nhau so với không bổ sung dịch chiết (nồng triển. độ 0 mg/ml). Tương tự sau 48h ủ với dịch 143
HỘI NGHỊ KHOA HỌC LẦN THỨ XXIV CỦA HỘI HÓA SINH Y HỌC HÀ NỘI VÀ CÁC TỈNH PHÍA BẮC Hình 7: Kết quả MTS của tế bào HEK293 sau 24h và 48h ủ với dịch chiết cồn của sinh khối nấm TH. DC1: tế bào ủ với 0,2 % DMSO; DC2: tế bào ủ với 0,1 % DMSO; các con số là nồng độ dịch chiết (mg/ml) 2.4. Ảnh hưởng của dịch chiết nước nóng của sinh khối nấm lên tế bào HEK293 0,425 mg /ml 0,85 mg /ml 1,7 mg /ml 3,4 mg /ml 24 h 48 h Hình 8: Tế bào HEK293 sau 24h và 48h ủ với dịch chiết nước nóng của sinh khối nấm TH Trong hình 8 ta thấy, tế bào HEK293 ủ với dịch chiết nước nóng của nấm vẫn phát triển bình thường. Có một số thành phần chưa tan hoàn toàn ở nồng độ cao nhất của dịch chiết nước nóng (3,4 mg/ml) do đó ảnh hưởng đến hình ảnh (các đám hạt tròn nhỏ che mất hình ảnh tế bào). Tuy nhiên, vẫn quan sát được rõ ràng hình ảnh chân tế bào bám vào đáy đĩa nuôi, cho thấy tế bào không bị ảnh hưởng bởi việc bổ sung dịch chiết nước nóng của nấm Thượng hoàng. Hình 9: Kết quả MTS của tế bào HEK293 sau 24h và 48h ủ với dịch chiết nước nóng của sinh khối nấm TH. DC: tế bào ủ với 10 µl nước cất; Các con số là nồng độ dịch chiết (mg/ml) 144
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 509 - THÁNG 12 - SỐ CHUYÊN ĐỀ - 2021 Ở hình 9, kết quả ủ với MTS, sau khi ủ Việt Nam. Nấm thu thập được có trình tự với dịch chiết nước nóng của nấm thì độ hấp tương đồng với Phellinus linteus strain phụ của tế bào ở cả 2 thời điểm đo đều tăng DGUM25004 (99% tương đồng, 100% lên so với không ủ. Điều này cho thấy dịch cover) với gene bank accession: chiết sinh khối nấm ngâm nước nóng đã có AF080458.1. Nấm có thể phát triển tốt trong đáp ứng tốt đến tế bào HEK, kích thích tế điều kiện môi trường thạch bán rắn và môi bào phát triển tăng sinh. Tuy nhiên, ở nồng trường lỏng. Sinh khối nấm chiết cồn và độ dịch chiết cao hơn thì sức sống của tế bào chiết nước nóng có tác dụng ức chế tăng sinh giảm dần. Sức sống của tế bào cao nhất ở tế bào ung thư vú BT474. Đối với dòng tế nồng độ dịch chiết 0,425 mg/ml và thấp nhất bào thường HEK293, dịch chiết cồn và nước ở nồng độ dịch chiết là 3,4 mg/ml. Như vậy, nóng của sinh khối nấm kích thích tế bào nồng độ nghiên cứu để sử dụng nấm rất quan phát triển so với không bổ sung dịch chiết. trọng để suy ra liều lượng bổ sung nào hàng Liều lượng sử dụng để phát huy tốt nhất tác ngày có thể giúp nâng cao sức khỏe con dụng của dịch chiết cần phải được nghiên người, hay có thể không tốt nếu dùng liều cứu kỹ hơn. cao dịch chiết vì chúng có thể trở nên ức chế tế bào. Theo Sensuke [1], 10 dòng tế bào ung TÀI LIỆU THAM KHẢO thư gồm có PC-3, DU-145, LNCaP, T24, 1. Sensuke Konnoa et al, 2015, Potent ACHN, A549, MCF-7, AGS, HepG2, U87 Anticancer Effects of Bioactive Mushroom đều bị ức chế bởi dịch chiết của Phellinus Extracts (Phellinus linteus) on a Variety of linteus (PL-ES và PL-I-ES). Kết quả cho Human Cancer Cells, J Clin Med Res., 7 thấy tiềm năng kháng khối u của dịch chiết (2),76-82.2. Kim HM et al, 2010, Evaluation nấm này. Với kết quả của Jun [7], dịch chiết of antidiabetic activity of polysaccharide nấm TH cùng với lá tre và nấm Chaga cũng isolated from Phellinus linteus in non-obese biểu hiện hoạt tính kháng khối u thông qua diabetic mouse, Int Immnunopharmacol, 10 sự kích thích đáp ứng miễn dịch nguyên (1), 72-78. thủy. Như vậy kết quả ức chế sự phát triển tế 3. Phạm Quang Thu, 2016, Đặc điểm sinh học bào ung thư vú BT474 của dịch chiết sinh của nấm thượng hoàng (Phellinus linteus) khối nấm của chúng tôi đáng tin cậy. Ngoài trong nuôi cấy thuần khiết, Tạp chí Khoa ra, theo Jung-ok, 2008 [8] dịch chiết cồn học lâm nghiệp, 1, 4231 - 4237. (PLE) có hàm lượng tổng flavonoid và 4. Trần Thị Lụa, Vũ Văn Hạnh, 2017, Nghiên phenolic cao hơn dịch chiết nước nóng cứu điều kiện nhân sinh khối nấm thượng (PLW) của nấm TH; các hoạt tính ức chế hoàng vàng (Phellinus baumi), Tạp chí Khoa tyrosinase hay elastase PLE cũng cao và PLE học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam, 8 thích hợp để sử dụng như thực phẩm chức (81), 106-108. năng hoặc nguyên liệu cho mỹ phẩm. 5. June Woo Lee et al, 2008, Submerged Culture of Phellinus linteus for Mass V. KẾT LUẬN Production of Polysaccharides, The Korean Đã phân lập và định danh được nấm Society of Mycology – Mycobiology, 36 (3), Thượng hoàng thu thập tại vùng Lâm Đồng, 178-182. 145