vietnam medical journal n02 - MAY - 2020
66
KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN THỦY PHÂN
PROTEIN ĐẬU XANH (Vignia radiata) THÀNH PEPTIDE
Phạm Văn Hiển1, Hồ Bá Ngọc Minh1, Đặng Trường Giang1,
Ngô Thị Tuyết Mai1, Hoàng Xuân Cường1, Vũ Bình Dương1.
TÓM TẮT20
Mục tiêu:
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá
trình thủy phân tạo peptid từ protein đậu xanh.
Phương pháp nghiên cứu:
Khảo sát các yếu tố ảnh
hưởng đến độ thủy phân và hiệu suất thủy phân: tác
nhân thủy phân, tỉ lệ tác nhân thủy phân/cơ chất, pH
môi trường thủy phân, nhiệt độ thủy phân, thời gian
thủy phân, tỉ lệ cơ chất/môi trường thủy phân. Kết
quả: Đã khảo sát và lựa chọn được các điều kiện cho
thủy phân gồm: Tác nhân thủy phân là enzyme
protamex (2000 IU Nelson), tỷ lệ enzyme/cơ chất là
1:50; pH môi trường thủy phân 6-7; nhiệt độ thủy
phân 35-370C; thời gian thủy phân là 6 giờ; tỷ lệ cơ
chất/môi trường thủy phân: 1/3. Kết luận: Với các
thông số khảo sát lựa chọn được, hiệu suất thủy phân
đạt 79,3% ± 8,2% và độ thủy phân đạt 76,4% ±
9,1%. Đây là bước trung gian quan trọng để từ đó
tinh chế các peptide nhỏ, chuyển dạng thành dạng bột
peptide bán thành phẩm.
Từ khóa:
Thủy phân, đậu xanh (Vigna radiata),
peptid, độ thủy phân.
SUMMARY
PREPARATION OF PEPTIDE HYDROLYSATE
FROM MUNGBEAN (VIGNA RADIATA) PROTEIN
Objects: to investigate the effect of in-process
parameters for preparation of peptide hydrolysate
from mungbean protein (Vigna radiata). Methods:
investigate the of in-process parameter for preparation
of peptide hydrolysate from mungbean protein
including: catalist, enzyme/substrate ratio for
hydrolysis process, hydrolytic pH, hydrolytic
temperature, duration of hydrolysis, ratio of hydrolytic
media/substrate. Results: had found the suibtable
parameters of in-process parameters for preparation
of peptide hydrolysate from mungbean protein
including using protamex (2000 Nelson IU) as a
catalyst in an enzyme/substrate ratio of 1:50, pH 6-7,
at 35-37◦C for 6 hours with a substrate/hydrolytic
media ratio of 1/3. Conclusions: to applicating of this
founding, the yield of hydrolysis of mungbean protein
was 79.3% ± 8.2%, and degree of hydrolysis was
76.4% ± 9.1%.
Keywords:
Hydrolysis, Vigna radiata, peptide
hydrolysate, degree of hydrolysis.
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Đậu xanh (Vignia radiata) là một loại ngũ cốc,
1Học viện Quân y
Chịu trách nhiệm chính: Phạm Văn Hiển
Email: phamvanhien181288@gmail.com
Ngày nhận bài: 16.3.2020
Ngày phản biện khoa học: 4.5.2020
Ngày duyệt bài: 12.5.2020
đồng thời cũng là một loại dược liệu được sử
dụng từ lâu đời trong dân gian. Ngoài giá trị về
mặt dinh dưỡng, đậu xanh có nhiều thành phần
có hoạt tính tốt cho sức khỏe con người như các
flavonoid, các saponin…[1]. Gần đây nhiều
nghiên cứu còn chỉ ra rằng các peptid nhỏ thu
nhận được từ các loài ngũ cốc thuộc họ Đậu
(Fabaceae) có hoạt tính chống oxy hóa qua con
đường tăng sinh tổng hợp và giảm thoái biến
collgen của da nên giúp da dẻo dai và chống
nhăn; tác dụng làm trắng da thông qua ức chế
quá trình tạo hắc tố melamin [2,3]. Nhằm tiếp
tục tìm kiếm nguồn nguyên liệu mới với tác dụng
sinh học tiềm năng trong chăm sóc và bảo vệ
da, chúng tôi đã thực hiện nghiên cứu khảo sát
các yếu tố ảnh hưởng đến thủy phân protein đậu
xanh thành các peptide nhỏ.
II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị. Protein từ
đậu xanh đạt TCCS được sản xuất tại trung tâm
Nghiên cứu Ứng dụng Sản xuất thuốc Học viện
Quân y. các enzyme thủy phân sử dụng trong
nghiên cứu này gồm alcalase, trypsin,
chymotripsin do Sigma Aldrich cung cấp,
protease (protamex), bromelain, papain do
Biogreen cung cấp. Một số các hóa chất, thuốc
thử thông dụng khác như HCl, NaOH, coomassie
brilliant blue G-250, ninhydrin… được cung cấp
bởi Xilong, Samchun. Các thiết bị đo lường, phân
tích, dụng cụ khác đạt tiêu chuẩn thí nghiệm.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp thủy phân [2]: Lấy chính xác
khoảng 8,0 g protein đậu xanh phân tán trong
môi trường thủy phân, để ổn định rồi thêm các
protease hoặc acid base với nồng độ thích hợp.
Tiến hành thủy phân trong điều kiện khảo sát.
Tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới hiệu
suất thủy phân gồm: Loại tác nhân thủy phân, pH
thủy phân, tỷ lệ tác nhân/cơ chất, tỷ lệ dung môi
thủy phân/cơ chất, thời gian thủy phân, nhiệt độ
thủy phân. Tiêu chí lựa chọn gồm: Hiệu suất thủy
phân được tính theo công thức:
Hiệu suất (%)
=
m1 – m2
x
100
m1
Trong đó
: m1 là khối lượng protein trước
thủy phân (g). m2 là khối lượng protein sau thủy
phân (g).
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 490 - THÁNG 5 - SỐ 2 - 2020
67
Độ thủy phân (DH): là % cắt khung peptid
theo Cappelletti và CS [1] tính theo công thức:
DH (%)
=
h
100
htot
Trong đó, h là số cầu peptid thủy phân được
(xác định theo phương pháp của Adler – Nissen
và CS) [4]. htot là đương lượng thủy phân ở điều
kiện thủy phân hoàn toàn protein thành các acid
amin; Được tính toán là tổng hàm lượng các
aminoacid trong 1 g protein. Được cố định là giá
trị 8 gam đương lượng/kg protein [5].
Trong nghiên cứu này, chúng tôi khảo sát các
yếu tố ảnh hưởng đến thủy phân peptide từ
protein đậy xanh gồm: tác nhân thủy phân, tỉ lệ
tác nhân/cơ chất, pH môi trường thủy phân,
nhiệt độ xúc tác, thời gian thủy phân, tỉ lệ cơ
chất/MT thủy phân.
III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Kết quả lựa chọn tác nhân thủy
phân. Tiến hành thủy phân các mẫu theo trong
các tác nhân khác nhau. Trong đó với tác là
enzyme, sử dụng tỷ lệ enzym cơ chất 1:100
(protamex), dung dịch HCl (pH=1-2), dung dịch
NaOH (pH 8-9) ở nhiệt độ 37oC, trong thời gian 4
giờ. Sau khi kết thúc thủy phần xác định độ thủy
phần và hiệu suất thủy phân. Kết quả được trình
bày trong bảng 1
Bảng 1: Kết quả khảo sát các tác nhân thủy phân khác nhau
TT
Tác nhân thủy phân
Độ thủy phân (%)
HS thủy phân (%)
1
Alcalase
35,5 ± 6,3
45,3 ± 4,6
2
Protamex
43,3 ± 5,4
57,7 ± 5,7
3
Bromelain
37,5 ± 4,5
45,7 ± 6,2
4
Papain
37,1 ± 6,5
44,6 ± 6,7
5
Trypsin
36,9 ± 5,9
49,7 ± 7,6
6
Trypsin + chymotrypsin (50:1)
43,5 ± 5,5
51,7 ± 7,8
7
Alcalase + protamex (1:1)
43,5 ± 5,3
54, 6 ± 4,3
8
Alcalose + bromelain (1:1)
37,6 ± 7,5
52,4 ± 4,7
9
Alcalase + papain (1:1)
36,5 ± 5,8
48,5 ± 4,5
10
Protamex + bromelain (1:10)
43,1 ± 6,6
45,5 ± 5,1
11
Protamex + papain (1:1)
42,6 ± 7,6
47,6 ± 7,2
12
Bromelain + papain (1:1)
41,5 ± 5,8
48,5 ± 4,4
13
MT acid HCl (pH 1-2)
23,4 ± 4,8
35,5 ± 5,9
14
MT kiềm NaOH (pH 8-9)
22,5 ± 5,9
32,5 ± 5,1
Kết quả từ bảng 1 cho thấy, sử dụng các
enzyme khác nhau thì cho hiệu suất thủy phân
và độ thủy phân khác nhau. Trong đó khi sử
dụng protamex cho hiệu suất thủy phân và độ
thủy phân cao nhất. Ngoài ra, khi sử dụng acid
và kiềm để thủy phân cho hiệu suất thủy phân
thấp hơn, đồng thời độ thủy phân cũng thấp hơn
so với sử dụng enzyme protamex. Do vậy, chúng
tôi lựa chọn protamex để tiếp tục khảo sát các
nghiên cứu tiếp theo.
3.2. Khảo sát lựa chọn tỉ lệ enzyme/cơ
chất. Tiến hành thủy phân protein đậu xanh với
protease với các tỉ lệ enzyme/cơ chất khác nhau
từ 1:25 – 1:200 trong điều kiện tương tự về
nhiệt độ, thời gian và pH. Kết quả được trình bày
trong bảng 2.
Bảng 2. Kết quả khảo sát tỉ lệ enzyme/
cơ chất
TT
Tỉ lệ enzyme/
cơ chất
Độ thủy
phân (%)
Hiệu suất thủy
phân(%)
1
1:25
62,3 ± 5,4
66,7 ± 5,7
2
1:50
61,9 ± 7,8
66,6 ± 6,5
3
1:100
43,3 ± 5,4
57,7 ± 5,7
4
1:150
37,3 ± 7,8
35,5 ± 4,3
5
1:200
31,3 ± 7,9
31,6 ± 4,5
Kết quả bảng 2 cho thấy: khi sử dụng tỉ lệ
enzyme tăng từ 1:200 đến 1:50 thì hiệu suất
thủy phân và độ thủy phân tăng lên, cao nhất ở
tỷ lệ 1:50. Tuy nhiên, nếu tiếp tục tăng tỷ lệ
enzyme lên 1:25 thì hiệu suất thủy phân và độ
thủy phân không thay đổi đáng kể. Vì vậy, chúng
tôi lựa chọn tỉ lệ enzyme/cơ chất là 1:50 để thủy
phân protein đậu xanh.
3.3. Khảo sát lựa chọn pH môi trường
thủy phân
Tiến hành thủy phân protein đậu xanh trong
môi trường pH khác nhau từ 2-10 với các điều
kiện tương tự về tỷ lệ enzyme/cơ chất, nhiệt độ,
thời gian. Sau khi kết thúc thủy phân xác định
hiệu suất thủy phân và độ thủy phân. Kết quả
được trình bày trong bảng 3.
Bảng 3. Kết quả khảo sát lựa chọn pH
thủy phân
TT
pH môi trường
thủy phân
Độ thủy
phân (%)
HS thủy
phân (%)
1
2-3
44,4 ± 6,8
47,5 ± 5,8
vietnam medical journal n02 - MAY - 2020
68
2
3-4
48,5 ± 5,8
51,3 ± 9,3
3
4-5
53,4 ± 4,7
55,3 ± 5,8
4
5-6
61,9 ± 7,8
66,6 ± 6,5
5
6-7
65,7 ± 7,1
72,6 ± 4,9
6
7-8
61,2 ± 5,4
68,8 ± 5,3
7
8-10
56,6 ± 6,5
63,5 ± 5,5
Kết quả bảng 3 cho thấy, khi môi trường thủy
phân có pH từ 2-7, tăng pH thủy phân thì hiệu
suất thủy phân và độ thủy phân tăng lên. Ngược
lại, với pH thủy phân từ 7-10, khi tăng pH thủy
phân thì hiệu suất thủy phân và độ thủy phân
giảm xuống. Kết quả thực nghiệm cũng cho thấy
pH từ 6-7 cho hiệu suất thủy phân và độ thủy
phân đạt giá trị cao nhất. Từ các kết quả nghiên
cứu trên, chúng tôi lựa chọn được pH thủy phân
thích hợp là 6-7.
3.4. Kết quả khảo sát lựa chọn nhiệt độ
thủy phân. Sau khi đã lựa chọn được loại tác
nhân thủy phân, tiến hành khảo sát ảnh hưởng của
nhiệt độ thủy phân tới hiệu suất thủy phân và độ
thủy phân. Khảo sát các khoảng nhiệt độ khác
nhau từ 25-50◦C. Kết quả được trình bày ở bảng 4.
Bảng 4. Kết quả khảo sát lựa chọn nhiệt
độ xúc tác thủy phân
TT
Nhiệt độ
thủy phân
Độ thủy
phân (%)
Hiệu suất thủy
phân (%)
1
25-28◦C
61,5 ± 5,5
67,7 ± 6,7
2
30-33◦C
65,7 ± 7,1
72,6 ± 4,9
3
35-37◦C
70,3 ± 7,7
75, 5 ± 4,5
4
40-43◦C
66,3 ± 4,4
71,2 ± 7,6
5
45-50◦C
61,2 ± 5,7
65,5 ± 6,5
Kết quả bảng 4 cho thấy, với khoảng nhiệt độ
dưới 37◦C, hiệu suất thủy phân và độ thủy phân
tăng lên khi tăng nhiệt độ. Tuy nhiên, với nhiệt
độ từ 370C trở lên, khi tăng nhiệt độ thì hiệu
suất thủy phân và độ thủy phân giảm xuống.
Điều này cho thấy enzyme protease có khoảng
nghiệt độ thuận lợi cho thủy phân protein đậu
xanh nằm trong khoảng 35-370C. Ngoài khoảng
nhiệt độ này có thể enzyme bị bất hoạt hoặc
không có hoạt độ tối ưu. Vì vậy, chúng tôi lựa
chọn nhiệt độ thủy phân là 35-370C.
3.5. Khảo sát lựa chọn thời gian thủy
phân. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian thủy
phân đến hiệu suất và độ thủy phân với các điều
kiện đã có nhưng trong các khoảng thời gian từ
2-24 giờ. Kết quả khảo sát được trình bày trong
bảng 5.
Bảng 5. Kết quả khảo sát lựa chọn thời
gian thủy phân
TT
Thời gian thủy
phân (giờ)
Độ thủy
phân(%)
Hiệu suất thủy
phân(%)
1
2
66,6 ± 8,6
72,2 ± 5,6
2
4
70,3 ± 7,7
75, 5 ± 4,5
3
6
74,4 ± 8,1
77,3 ± 6,5
4
8
74,6 ± 7,5
77,8 ± 7,3
5
10
74,5 ± 8,7
77,9 ± 7,1
6
12
74,5 ± 8,1
80,2 ± 6,4
7
18
73,9 ± 7,3
79,5 ± 7,3
8
24
73,5 ± 6,5
79,3 ± 6,6
Kết quả bảng 5 cho thấy, khi tăng thời gian
thủy phân thì hiệu suất thủy phân và độ thủy
phân có xu hướng tăng lên và đạt ổn định ở
khoảng 6 giờ. Nếu tiếp tục kéo dài thời gian thủy
phân thì không làm tăng độ thủy phân cũng như
hiệu suất thủy phân. Do đó, để tiết kiệm thời gian,
chúng tôi lựa chọn thời gian thủy phân là 6 giờ.
3.6. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỉ
lệ cơ chất/môi trường thủy phân
Trong nghiên cứu này, chúng tôi khảo sát ảnh
hưởng của tỉ lệ cơ chất/môi trường thủy phân tới
độ thủy phân và hiệu suất thủy phân. Tiến hành
thủy phân trong các tỉ lệ cơ chất/môi trường
thủy phân từ 1:1 đến 1:10 (g/ml). Kết quả xác
định độ thủy phân và hiệu suất thủy phân được
trình bày trong bảng 6.
Bảng 6. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của
tỉ lệ cơ chất/môi trường thủy phân
TT
Tỉ lệ cơ
chất/MT
thủy phân
Độ thủy
phân (%)
Hiệu suất
thủy phân
(%)
1
1:1
68,4 ± 7,6
73,3 ± 6,5
2
1:2
74,4 ± 8,1
77,3 ± 6,5
3
1:3
76,4 ± 9,1
79,3 ± 8,2
4
1:4
72,4 ± 8,1
72,3 ± 8,5
5
1:5
68,5 ± 6,5
68,4 ± 6,5
6
1:7,5
64,3 ± 5,9
64,2 ± 6,9
7
1:10
57,5 ± 7,6
56,6 ± 7,2
Kết quả bảng 6 cho thấy: với tỉ lệ cơ chất/MT
thủy phân là 1:3 thì hiệu suất thủy phân và độ
thủy phân đạt cao nhất. Từ kết quả này chúng
tôi lựa chọn tỉ lệ cơ chất/MT thủy phân là 1:3.
IV. KẾT LUẬN
Đã khảo sát và lựa chọn được các thông số
ảnh hưởng đến thủy phân protein đậu xanh
thành các peptide nhỏ, cụ thể: Tác nhân thủy
phân là enzyme protamex (2000 IU Nelson), tỷ
lệ enzyme/cơ chất là 1:50; pH môi trường thủy
phân 6-7; nhiệt độ thủy phân 35-370C; thời gian
thủy phân là 6 giờ; tỷ lệ môi trường thủy
phân/cơ chất: 3/1. Với các thông số khảo sát lựa
chọn được, hiệu suất thủy phân đạt 79,3% ±
8,2% và độ thủy phân đạt 76,4% ± 9,1%. Đây
là bước trung gian quan trọng để từ đó tinh chế
các peptide nhỏ, chuyển dạng thành dạng bột
bán thành phẩm bột peptide nguyên liệu.