TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT
KHOA SINH HỌC
TẠ KIỀU OANH
KHẢO SÁT HIỆU QUẢ
CỦA THANH TRÙNG LÊN MỘT SỐ
CHỈ TIÊU CHẤT LƯỢNG CỦA RƯỢU VANG
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC KHOÁ 29
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Đà Lạt/05/2009
TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT
KHOA SINH HỌC
***
KHẢO SÁT HIỆU QUẢ
CỦA THANH TRÙNG LÊN MỘT SỐ
CHỈ TIÊU CHẤT LƯỢNG CỦA RƯỢU VANG
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC KHOÁ 29
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Cán bộ hướng dẫn: GV. Đào Trọng Phương
Sinh viên thực hiện: Tạ Kiều Oanh
Đà Lạt/05/2009
LỜI CAM ĐOAN
oOo
Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Những kết quả và số liệu
trong khóa luận chưa được ai công bố dưới bất kỳ hình thức nào.
Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm trước nhà trường về sự cam đoan này.
Đà Lạt, ngày 03 tháng 06 năm 2009
Người cam kết
Tạ Kiều Oanh
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu, sự
chỉ bảo tận tình cùng những điều kiện tốt nhất từ quý thầy cô, gia đình, anh chị và các
bạn học. Tất cả, đã và đang là nguồn động viên, động lực to lớn cho tôi tự tin và vững
bước trên con đường học vấn đầy khó khăn. Sau đây, tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành
đến:
Ban Giám hiệu trường Đại học Đà Lạt và các phòng ban đã tạo điều kiện thuận
lợi cho tôi hoàn thành tốt chương trình học ở trường.
Quý thầy cô khoa Sinh học trường Đại học Đà Lạt đã dạy dỗ và truyền đạt
nhiều kiến thức quý báu cho tôi trong suốt bốn năm học vừa qua.
Thầy Đào Trọng Phương – Giảng viên trường Đại học Đà Lạt đã trực tiếp giảng
dạy, hướng dẫn và chỉ bảo tận tình giúp tôi hoàn thành luận văn này.
Quý thầy cô trong công ty Cổ phần rượu bia Đà Lạt (Beco Đà Lạt), quý cán bộ,
công nhân viên khoa xét nghiệm – trung tâm Y tế Dự phòng Lâm Đồng đã tạo điều
kiện cho tôi về cơ sở vật chất cũng như sự giúp đỡ tận tình trong suốt quá trình thực
hiện đề tài này.
Bố, mẹ và gia đình luôn ủng hộ, là chỗ dựa tinh thần và cùng tôi chia sẻ những
khó khăn, thách thức trên bước đường học vấn.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn các anh chị khóa trên và các bạn học đã nhiệt tình
giúp đỡ để tôi hoàn thành khóa luận này.
Một lần nữa, tôi xin chân thành cảm ơn!
Sinh viên: Tạ Kiều Oanh
MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn
MỞ ĐẦU
Phần 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về rượu vang .....................................................................1
1.2. Phân loại rượu vang ..........................................................................2
1.2.1. Phân loại theo độ ngọt
1.2.2. Phân loại theo quá trình lên men
2
1.2.3. Phân loại theo lượng CO
1.2.4. Phân loại theo màu
1.2.5. Phân loại theo nơi sản xuất
1.3. Một số thành phần trong rượu vang ...................................................4
1.3.1. Tanin
1.3.2. Acid hữu cơ
1.3.3. Ethanol
1.3.4. Hệ nấm men, nấm mốc
1.3.5. Đường
1.3.6. Vitamin
1.3.7. Muối khoáng
1.3.8. Chất thơm
1.4. Tiêu chuẩn Việt Nam đối với chất lượng rượu vang ..........................7
1.4.1. Các chỉ tiêu hóa học của rượu vang ........................................7
1.4.1.1. Methanol
1.4.1.2. Acid bay hơi
2
1.4.1.3. SO
1.4.1.4. Xianua
1.4.2. Các chỉ tiêu vi sinh vật của rượu vang ....................................9
1.4.2.1. Vi sinh vật hiếu khí
1.4.2.2. E. coli
1.4.2.3. Coliform
1.4.2.4. Clostridium perfringens
1.4.2.5. Staphylococcus aureus
1.4.2.6. Nấm men, nấm mốc
1.5. Tình hình sản xuất rượu vang trên thế giới
và ngành rượu vang ở Việt Nam ...................................................... 13
1.5.1. Thị trường rượu vang ............................................................ 13
1.5.2. Ngành rượu vang ở Việt Nam ............................................... 14
1.6. Sơ đồ quy trình sản xuất rượu vang ở công ty
cổ phần rượu bia Đà Lạt .................................................................. 15
Phần 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu ...................................................................... 16
2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................. 16
1.2.1. Thu lấy mẫu và bảo quản mẫu .............................................. 16
1.2.2. Đồng nhất mẫu và pha loãng mẫu ......................................... 16
1.2.3. Phương pháp phân tích các chỉ tiêu vi sinh vật ...................... 17
1.2.3.1. Kiểm tra tổng số vi khuẩn hiếu khí
1.2.3.2. Kiểm tra tổng số nấm men, nấm mốc
1.2.3.3. Kiểm tra Coliform
1.2.3.4. Kiểm tra E. coli
1.2.3.5. Kiểm tra tụ cầu khuẩn
1.2.3.6. Kiểm tra vi khuẩn kỵ khí
1.2.4. Phương pháp phân tích các chỉ tiêu hóa lý ............................ 22
1.2.4.1. Phương pháp xác định độ cồn
1.2.4.2. Phương pháp xác định hàm lượng acid tổng số
1.2.4.3. Phương pháp xác định hàm lượng acid bay hơi
1.2.4.4. Phương pháp xác định hàm lượng aldehyde
Phần 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Các chỉ tiêu vi sinh vật .................................................................... 26
3.2. Các chỉ tiêu hóa lý ........................................................................... 32
3.2.1. Nồng độ cồn ......................................................................... 32
3.2.2. Hàm lượng acid tổng số, acid bay hơi và aldehyde ............... 32
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
Khoá luận tốt nghiệp
MỞ ĐẦU
Trái cây tươi không những là sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, mà còn là
thực phẩm tươi phục vụ trực tiếp trong đời sống hàng ngày như cung cấp vitamin, acid
hữu cơ, muối khoáng ... cho con người. Nước ta có khí hậu nhiệt đới ẩm nên việc bảo
quản trái cây tươi là rất khó, dễ bị thối, hỏng sau khi thu hoạch và vận chuyển làm
giảm phẩm chất ban đầu của trái cây, do đó bên cạnh việc bảo quản trái cây tươi, việc
chế biến các loại trái cây cũng có ý nghĩa hết sức quan trọng nhằm nâng cao giá trị sử
dụng của các loại trái cây và phù hợp với nhu cầu, thị hiếu của người tiêu dùng, đồng
thời tạo ra ngành sản xuất mới góp phần tạo việc làm ổn định và tăng thu nhập cho
người sản xuất và đóng góp vào sự phát triển của nền kinh tế quốc dân.
Từ lâu chúng ta đã biết chế biến trái cây bằng nhiều phương pháp tạo ra các sản
phẩm khác nhau nhưng vẫn giữ được giá trị dinh dưỡng và cung cấp năng lượng cho
con người như: sản phẩm trái cây ướp đường, trái cây nấu chín, mứt trái cây sấy khô,
dịch trái cây lên men để tạo ra các sản phẩm rượu, đặc biệt là rượu vang trái cây. Mỗi
loại trái cây sau khi lên men đều có hương vị thơm ngon riêng biệt cho ta cảm giác
sảng khoái. Nước ta là xứ sở của các loại trái cây nhiệt đới như: nho, xoài, dứa, mít…
có thể nói đây là nguồn nguyên liệu đa dạng, phong phú cho việc nghiên cứu và chế
biến các loại rượu vang trái cây.
Việc gia nhập tổ chức thương mại thế giới WTO đã tạo ra cho Việt Nam nhiều
cơ hội phát triển các ngành công nghiệp, trong đó có công nghiệp sản xuất rượu bia.
Hiện nay trên thị trường Việt Nam xuất hiện nhiều loại rượu vang trái cây. Trước đây
phần lớn là sản xuất ở quy mô gia đình, ngày nay đã phát triển ở quy mô công nghiệp.
Một số nhà máy lớn đã sử dụng dịch quả mơ, dâu, táo... để sản xuất như: rượu vang
Thăng Long, vang Gia Lâm, vang Đà Lạt, vang nho Dalat Beco… Ngoài ra, một số địa
phương như Vĩnh Phú tận dụng nguồn quả tự nhiên như chuối, dứa, mận, mơ... sản
xuất vang đạt tiêu chuẩn chất lượng cao. Ở một số cơ sở nhỏ như công ty ong Hà Nội,
công ty ong Nam Hà ... đã có những sản phẩm rượu vang đặc trưng. Đặc biệt Đà Lạt
nổi tiếng với các loại vang trắng, vang đỏ đã tạo được uy tín thương hiệu và chỗ đứng
Tạ Kiều Oanh – CS_K29
Khoá luận tốt nghiệp trên thị trường trong và ngoài nước. Tuy nhiên, trong điều kiện kinh tế xã hội hiện nay,
ngành công nghiệp sản xuất rượu bia nước ta đang phải đối mặt với những khó khăn,
thách thức không nhỏ. Tình hình ngộ độc thực phẩm, ngộ độc rượu bia đang là vấn đề
nhức nhối được xã hội quan tâm và cũng là một trong những khó khăn lớn mà ngành
công nghiệp sản xuất rượu bia Việt Nam phải vượt qua.
Chỉ trong vài ngày đầu Xuân Kỷ Sửu 2009 (từ ngày 29 đến ngày mùng 3 Tết
Âm Lịch), nhiều địa bàn đóng trên thành phố Hà Nội đã tiếp nhận hàng trăm ca cấp
cứu, chiếm đa phần trong số này là những trường hợp cấp cứu do ngộ độc rượu, bia.
Đáng chú ý, có không ít trường hợp đã tử vong do không được cấp cứu kịp thời. Bệnh
viện đa khoa Xanh Pôn, trong 5 ngày (24/01 đến 28/01) có 21 ca điều trị, cấp cứu liên
quan đến ngộ độc bia, rượu. Theo thống kê của Trung tâm chống độc – Bệnh viện
Bạch Mai, ngoài số ca nhập viện như ngày bình thường thì vào dịp Tết, có thêm 15
bệnh nhân bị trúng độc, ngộ độc mà nguyên nhân là do sử dụng rượu, bia Tết. Số bệnh
nhân nhiễm độc do rượu, bia chiếm gần 50% tổng số bệnh nhân.
Tình trạng bùng phát của các cơ sở sản xuất rượu giả, rượu không đúng tiêu
chuẩn chất lượng đã làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến ngành công nghiệp sản xuất
rượu bia còn nhỏ bé và mới phát triển ở nước ta. Rượu giả, rượu nhái không chỉ làm
ảnh hưởng đến uy tín, thương hiệu của các nhà sản xuất rượu chân chính mà còn gây
ra những hậu quả vô cùng nghiêm trọng, đặc biệt là đến sức khoẻ của người tiêu dùng.
Ở nước ta hiện nay, rượu giả, rượu nhái ngày càng nhiều và tinh vi đến trình độ “giả
như thật”. Bất kể loại rượu dù là trong nước hay nhập khẩu, một khi được thị trường
ưa chuộng là lập tức bị làm giả.
Kết quả phân tích một số lọai rượu giả thu được, nồng độ các chất, đặc biệt
lượng methanol khá cao. Trung tâm Y tế dự phòng Cần Thơ thông báo kết quả kiểm
nghiệm cho biết hàm lượng methanol có trong các mẫu rượu (thu được từ các quán có
rượu gây chết người) cao hơn nhiều so với hàm lượng cho phép . Đặc biệt có nhiều
hiệu rượu có tiếng tại Việt Nam (thí dụ Safoco) bị phát hiện là có chứa nồng độ cồn
methanol rất cao (17.2%) . Như thế, chỉ với 25ml loại rượu này cũng đủ làm chết
người.
Tạ Kiều Oanh – CS_K29
Khoá luận tốt nghiệp
Một thử thách nữa với ngành công nghiệp rượu bia ở nước ta là tình trạng rượu
ngoại xuất hiện ở khắp nơi, chiếm lĩnh thị trường rượu bia Việt Nam. Hàng loạt sản
phẩm rượu vang nổi tiếng có mặt tại thị trường Việt Nam đã và đang trở thành một
trong những món đồ uống yêu thích của người tiêu dùng: rượu vang Pháp, vang Mỹ,
vang Argentina, rượu vang Italia...
Để có thể vượt qua được những khó khăn, thử thách nói trên nhằm đưa ngành
công nghiệp sản xuất rượu bia phát triển, rất nhiều biện pháp đã được đưa ra và áp
dụng. Trong các biện pháp đó, việc nghiên cứu một số chỉ tiêu chất lượng quan trọng
của rượu vang, hoàn thiện quy trình sản xuất nhằm nâng cao chất lượng rượu vang nội
có ý nghĩa quyết định. Xuất phát từ lý do trên, tôi thực hiện đề tài: “Khảo sát hiệu quả
của thanh trùng lên một số chỉ tiêu chất lượng của rượu vang”.
Mục tiêu cụ thể của đề tài là: so sánh và phân tích các chỉ tiêu vi sinh, hóa lý
của rượu vang trước và sau khi thanh trùng, trên cơ sở đó đánh giá tác động c ủa khâu
thanh trùng lên chất lượng của rượu vang thành phẩm.
Do tiến hành trong thời gian hạn hẹp và bước đầu làm quen với công tác nghiên
cứu nên khó tránh khỏi thiếu sót. Kính mong ý kiến đóng góp từ quý thầy, cô và các
bạn quan tâm.
Tạ Kiều Oanh – CS_K29
Tổng Quan Tài Liệu
Khoá luận tốt nghiệp
1.1. GIỚI THIỆU VỀ RƯỢU VANG
Rượu vang là sản phẩm đuợc ưa chuộng nhiều trên thế giới vì hầu hết trong tất
cả các buổi lễ hội, các buổi tiệc gia đình, nó là một trong những đồ uống không thể
thiếu được. Rượu vang trái cây đã trở thành thức uống truyền thống từ xa xưa của
người Âu - Mỹ. Hiện nay, người châu Á cũng đã làm quen với rượu vang trái cây
trong mỗi bữa ăn.
Rượu vang (theo tiếng Pháp là vin) là từ được dùng để chỉ loại rượu lên men từ
dịch ép trái cây (nho, dâu, thơm, táo, lê, mơ, mận…). Một đặc điểm của rượu vang là
không qua chưng cất nên có hương vị của trái cây tự nhiên, có độ cồn nhẹ, là loại nước
giải khát thơm ngon, giàu chất bổ dưỡng.
Nguyên liệu chính để sản xuất rượu vang được s ử dụng phổ biến nhất vẫn là
nho nên nhiều người quen gọi rượu vang là rượu chát hoặc rượu nho. Trong số các loài
nho trồng thuộc giống Vitis thì loài Vitis vinifera, L. ssp vinifera xuất xứ từ châu Âu là
loài quan trọng nhất , người ta đã biết tới trên 8000 loại giống khác nhau. Vùng trồng
nho nổi tiếng và lâu đời nhất là vùng Địa Trung Hải.
Rượu đã được con người sản xuất và sử dụng từ rất lâu, vào khoảng 6000 năm
trước công nguyên (TCN), trong đó, rượu vang xuất hiện vào khoảng 4500 năm TCN,
đầu tiên là ở các nước châu Âu và phổ biến nhất là ở Hy Lạp cổ đại. Ngày nay các
nước Italia, Pháp và Tây Ban Nha nằm trong số các nước hàng đầu về sản xuất rượu
vang trên thế giới. Ngoài ra, còn có một số nước khác sản xuất rượu vang nhiều như
Argentina, Nga và Mỹ.
Hiện nay, trên thế giới xuất hiện khá nhiều nhãn hiệu vang nổi tiếng với những
đặc điểm tạo sự riêng biệt cho các loại rượu như: rượu vang Pháp (Vang Alsace,
Médoc, Haut Médoc, Graves Barsac, Sauternes, St Emillion, Pomerol, Cérons,
Loupiac, Fronsac, Bourg,…), vang Mỹ (Vang California Burgundy,…), vang Ruca
Malen của Argentina, Santa Cristina của Italia...
1
Tạ Kiều Oanh – CS_K29
Tổng Quan Tài Liệu
Khoá luận tốt nghiệp
Cùng với sự phát triển đó, Việt Nam nói chung và Đà Lạt nói riêng cũng đang
cố gắng thuyết phục thị trường phong phú này với các loại vang mang phong cách của
riêng mình với một số công ty như rượu vang của công ty Beco Đà Lạt, công ty
Langbiang, công ty Vĩnh Tiễn,…
1.2. PHÂN LOẠI RƯỢU VANG
Rượu vang có thể được phân loại theo nhiều tiêu chí khác nhau: phân loại theo
, theo màu rượu, theo nơi sản xuất. độ ngọt, theo quá trình lên men, theo lượng CO2
1.2.1. Phân loại theo độ ngọt
- Vang khô (Dry wine): được lên men toàn bộ đường có trong trái cây, hàm
lượng đường còn sót lại tối đa là 9 g/l.
- Vang bán ngọt (Semi – dry wine): có hàm lượng đường khoảng 9 – 18 g/l.
- Vang ngọt (Sweet wine): có hàm lượng đường cao hơn 25 g/l.
1.2.2. Phân loại theo quá trình lên men
- Rượu vang tự nhiên (Natural wine): không bổ sung thêm ethanol.
- Rượu vang cao độ (Fortified wine): bổ sung thêm ethanol.
2
1.2.3. Phân loại theo lượng CO
- Rượu vang không có gas (Table wine).
- Rượu vang có gas (Sparkling wine): gồm 2 loại là:
o Rượu vang có gas tự nhiên (Champagne): hình thành trong quá trình lên
men rượu.
trong quá o Rượu vang có gas nhân tạo (Carbonate wine): bổ sung CO2
trình sản xuất.
2
Tạ Kiều Oanh – CS_K29
Tổng Quan Tài Liệu
Khoá luận tốt nghiệp
1.2.4. Phân loại theo màu
- Rượu vang trắng (White wine): lên men từ nước ép quả và không có xác quả, ví
dụ như: Chablis, Chardonnay, Pinot Blanc, Rhine wine, Riesling…
- Rượu vang hồng (Rose wine): Rose, Vonorosso…
- Rượu vang đỏ (Red wine): lên men từ nước ép và vỏ quả , ví dụ như: Barbera,
Cabernet Sauvignon, Claret, Carnelian, Gamay, George, Pinot Noir, Merlot,…
1.2.5. Phân loại theo nơi sản xuất
- Phân loại theo quốc gia: rượu vang Pháp, rượu vang Úc, rượu vang Tây Ban
Nha, rượu vang Ý . . .
- Phân loại theo vùng: Bordeaux, Burgandy, California, Chianti, Chablis. . .
Theo giới tiêu dùng thì rượu vang được phân làm bốn loại: rượu vang bàn, rượu
vang sủi tăm, rượu vang mạnh, rượu vang mùi. [20]
- Rượu vang bàn (Vin de Table), gồm 3 loại: vang đỏ, vang trắng và vang hồng
có hàm lượng cồn từ 9% - 14%, thường được dùng trong các bữa ăn gia đình.
Rượu vang bàn được sản xuất từ sự lên men của dịch trái nho.
- Rượu vang sủi tăm (Vin mousseux) – còn có tên khác là rượu Sâm – banh
(Champagne), có từ 8% - 12% hàm lượng cồn, thường dùng vào những dịp liên
, được hoan hoặc bữa ăn sang trọng. Rượu vang sủi tăm là do bổ sung thêm CO2
sản xuất từ các giống nho trồng ở vùng Champagnes thuộc nước Pháp.
- Rượu vang nặng (Vin Fortifie) - là loại rượu vang được pha thêm rượu mạnh
Brandy để tăng hàm lượng cồn, thường từ 17% - 22%. Rượu vang nặng thay
đổi nồng độ giữa loại ngọt và không ngọt. Loại không ngọt có nồng độ cồn cao
hơn thì dùng làm vang khai vị, còn loại ngọt thì dùng để tráng miệng.
- Rượu vang mùi (Vin aromatisé): rượu vang mùi là loại rượu có hàm lượng cồn
từ 15% - 20% và có thêm mùi thơm.
3
Tạ Kiều Oanh – CS_K29
Tổng Quan Tài Liệu
Khoá luận tốt nghiệp
Nước Pháp sử dụng một hệ thống để chỉ định nơi xuất xứ (hệ thống
appellation), phân ra bốn cấp độ chất lượng như sau: [22]
- Vin de Table (rượu vang bàn): không chỉ định xuất xứ.
- Vin de Pays (rượu vang địa phương): được phép chỉ định xuất xứ.
- Vin Délimité de Qualité Superieure (rượu vang được xác định chất lượng
cao), thường viết tắt là VDQS.
- Appellation d’Origine Contrôlée (nhãn hiệu xuất xứ được kiểm soát), thường
viết tắt là AOC: rượu vang được sản xuất và kiểm định theo những tiêu chuẩn
khắt khe nhất.
1.3. MỘT SỐ THÀNH PHẦN TRONG RƯỢU VANG
Giá trị và chất lượng của rượu vang được đánh giá theo hàm lượng các thành
phần có mặt trong rượu vang:
1.3.1. Tanin
Tanin là một loại polyphenol, có được từ hạt, vỏ và cuống nho. Đây là một
chất bảo quản tự nhiên có trong nho. Tanin có vị chát và là một phần chính của rượu.
Trong rượu vang trắng, thành phần tanin không quá 0.2g/l, còn vang đỏ là 1 – 2g/l.
[20]
Hàm lượng tanin trong rượu sẽ quyết định thời gian ủ rượu trong quá trình
bảo quản. Trong rượu mới, tanin sẽ lấn át mùi vị của các hợp chất khác, nhưng theo
thời gian, càng bảo quản lâu, tanin sẽ nhạt dần đến khi mức độ tanin đạt tới độ cân
bằng, rượu lúc đó là lý tưởng nhất để uống.
1.3.2. Acid hữu cơ
Trong tất cả các loại trái cây đều chứa ít nhiều một lượng acid hữu cơ vì nó là
một chất làm nên vị chua đặc trưng cho từng loại quả. Trong rượu vang chứa nhiều
4
Tạ Kiều Oanh – CS_K29
Tổng Quan Tài Liệu
Khoá luận tốt nghiệp
acid hữu cơ như acid Tartric, acid Malic, acid Oxalic,… Hàm lượng acid tổng số
trong rượu vang khoảng 4 – 7g/l. [6]
Một số loại vang có lượng acid cao thường được sản xuất ở xứ lạnh như phía
Bắc nước Pháp, nước Anh hay New Zealand. Rượu có lượng acid thấp thường thuộc
các nước có thời tiết ấm hơn như Úc.
1.3.3. Ethanol
Ethanol (Cồn) là sản phẩm của quá trình lên men đường tự nhiên trong nho.
Hàm lượng đường trong nho sẽ quyết định nồng độ cồn của rượu. Độ cồn của rượu vang có thể dao động trong khoảng 8 – 180, nhưng nồng độ cồn t rong rượu vang cũng không quá 150 vì nấm men trong rượu sẽ ngưng phát triển ở nồng độ cồn là 140. Những rượu có độ cồn vượt quá 150 thường là do bổ sung thêm ethanol. [4]
1.3.4. Hệ nấm và men
Nấm sợi Botrytis cynerea là một loại nấm mốc có lợi cho nho, sinh sống trên
vỏ nho chín. Nho bị nhiễm nấm này thường bị bạc màu vỏ và nhăn nheo. Loại nấm
này có tác dụng làm giảm lượng nước và tăng lượng đường trong nho nên rượu có độ
cồn cao. Nấm này thường xuất hiện ở những vùng có nhiều nước và sương mù như
Sauternes ở Bordeaux, vùng Neusiederlersee ở Úc. Rượu được làm từ loại nho này
có mùi rất thơm của trái cây, ngọt và sánh như rượu của vùng Sauternes. [20]
Hệ nấm men trong sản xuất rượu vang bao gồm:
- Nấm men tự nhiên (Wild Yeast): Candida colliculosa, Candida pulcherrima,
Hansennula anomala, Kloeckera apiculata.
- Nấm men vang (Wine Yeast): Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces
oviformis, Saccharomyces ellipsoideus, Saccharomyces uvarum.
5
Tạ Kiều Oanh – CS_K29
Tổng Quan Tài Liệu
Khoá luận tốt nghiệp
1.3.5. Đường
Thành phần không thể thiếu trong rượu vang là đường. Đường trong vang chủ
yếu là đường fructose, glucose và một ít đường galactose. Vang khô chứa ít hơn 4g/l.
Các đường pentose có mặt trong vang đã lên men gồm 0.05 – 0.13% arabinose, 0.02
– 0.04% rhamnose và xylose ở dạng vết. Nếu trong rượu vang thành phẩm có đường
saccharose thì đường này đã được pha thêm vào sau khi lên men. Vị của rượu phụ
thuộc vào sự cân đối giữa độ cồn và độ ngọt của rượu vang. Lượng cồn cao tương
ứng với lượng đường khử cao có thể gây cảm giác ngon hơn cho người uống. [6]
1.3.6. Vitamin
Rượu vang được đánh giá là loại rượu bổ dưỡng là do trong thành phần của
nó có rất nhiều loại vitamin: vitamin C, vitamin B, vitamin PP,... Thực tế thì quá
trình lên men rượu là một quá trình điều chỉnh lại thành phần vitamin và là kỹ thuật
để giữ lại vitamin trong trái cây. Sau quá trình lên men thì một số vitamin được giữ
lại, một số khác bị mất đi, đồng thời một số vitamin sẽ được bổ sung thêm.
1.3.7. Muối khoáng
Trong rượu vang chứa rất nhiều các loại muối vi lượng , là muối của các
nguyên tố: P, S, K, Na, Ca, Fe, Cu, Mn,… Thông thường, lượng tro trong rượu vang
thường dao động vào khoảng 1.5 – 3.0g/l, nhưng có tác dụng làm tăng hương vị của
rượu và tăng giá trị dinh dưỡng cho rượu, cung cấp vi lượng cho cơ thể.
1.3.8. Chất thơm
Chất thơm là tên dùng để gọi các thành phần dễ bay hơi trong rượu non.
Trong quá trình chín và bảo quản, chúng được chuyển hoá thành các chất tạo hương
vị cho vang, hàm lượng dao động trong khoảng 0.8 – 1.2g/l, một phần bắt nguồn từ
nho (chất thơm sơ cấp), một phần được tạo thành trong quá trình lên men (chất thơm
thứ cấp).
6
Tạ Kiều Oanh – CS_K29
Tổng Quan Tài Liệu
Khoá luận tốt nghiệp 1.4. TIÊU CHUẨN VIỆT NAM (TCVN) ĐỐI VỚI CHẤT LƯỢNG VANG
1.4.1. Các chỉ tiêu hoá học của rượu vang [1,9]
Tên chỉ tiêu
Mức
1. Hàm lượng ethanol (cồn) ở 200
C, % (V/V)
6 – 18
2. Hàm lượng methanol trong 1 lít ethanol 100 0
, g/l, không lớn hơn
3.0
3. Hàm lượng acid bay hơi, tính theo acid acetic, g/l, không lớn hơn
1.5
, mg/l, không lớn hơn
350
4. Hàm lượng SO 2
5. Xianua và các phức xianua +, mg/l, không lớn hơn
0.1
Theo tiêu chuẩn đã
6. Hàm lượng CO
được công bố của
2
nhà sản xuất
1.4.1.1. Methanol
Methanol (methyl alcohol: CH3OH) là một rượu có tính độc. Nó ức chế đến hệ
thần kinh trung ương (gồm não và tủy sống). Nếu uống vào, tùy liều lượng, sẽ gây
nhức đầu, ngây ngất , ói mửa, mù mắt (do gây hư hoại tế bào võng mạc và sợi thần
kinh thị giác), hôn mê, và tử vong. Một khi vào trong cơ thể sẽ được thải trừ ra rất
chậm. Biểu hiện triệu chứng không rõ ràng.
7
Tạ Kiều Oanh – CS_K29
Tổng Quan Tài Liệu
Khoá luận tốt nghiệp
Não của người chết vì uống rượu nhiễm methanol
Liều lượng của rượu ảnh hưởng đến sự tỉnh táo của con người thay đổi tùy từng
cá nhân. Theo tài liệu của Đại học Cambridge cho biết, chỉ với 10ml methanol (bằng
hai muỗng cà phê) có thể gây mù mắt, và 30ml gây tử vong. [21]
Ngoài tác động ức chế đến hệ thần kinh trung ương tương tự như rượu ethanol,
cồn methanol còn rất độc vì nó được phân hủy trong cơ thể (ở gan) do enzyme alcohol
dehydrogenase để cho ra formaldehyde (H 2CO: đây là “hóa chất ư ớp xác”). Chất này
), là chất độc hại chính (chất này là tác lại được oxy hóa cho ra acid formic (CH2O2
nhân chính trong nọc độc của ong và kiến). Acid formic gây tăng độ acid (acidosis)
trong máu, dẫn đến suy hô hấp và ngưng thở.
1.4.1.2. Acid bay hơi
Trong rượu vang, acid bay hơi gồm phần lớn acid acetic ở dạng tự do hoặc ở
dạng liên kết (trong muối). Để tránh rượu vang bị hỏng trong quá trình lưu thông hoặc
bảo quản, lượng acid bay hơi phải nhỏ hơn 0.98 g/l đối với rượu vang chất lượng cao,
1.0 g/l đối với rượu vang bàn, 1.2 – 1.5 g/l đối với vang trắng. [13]
8
Tạ Kiều Oanh – CS_K29
Tổng Quan Tài Liệu
Khoá luận tốt nghiệp
2
1.4.1.3. SO
2 (sulfur dioxit) tồn tại trong rượu vang ở dạng tự do và liên kết. Nó không
SO
chỉ có vai trò là chất chống oxy hoá, sát khuẩn, mà còn ảnh hưởng đến tính hoà tan của
các chất khác trong dung dịch cũng như tính chất cảm quan của rượu. Nhưng khi hàm
quá cao, nó có thể gây độc đối với người sử dụng. lượng SO2
1.4.1.4. Xianua
Xianua là một muối của acid xianhydric (HCN), có tính khử. Nó còn được gọi
O có trong không là chất độc mùi hạnh nhân vì khi muối tác dụng dần với CO 2 và H2
khí tạo ra khí HCN có mùi hạnh nhân đặc trưng. Xianua là chất cực độc, có thể nhiễm
vào cơ thể con người qua đường hô hấp, tiêu hoá hay qua da. Khi bị nhiễm độc nhẹ,
người bệnh cảm thấy nhức đầu, nôn mửa, tim đập mạnh. Khi bị nặng dẫn đến mất cảm
giác, ngạt thở, có thể đi đến ngừng hô hấp và tim ngừng đập. Nó là chất có thể tan
trong nước, ether và rượu với bất kì tỉ lệ nào.
1.4.2. Các chỉ tiêu vi sinh vật của rượu vang [1,9]
Tên chỉ tiêu
Giới hạn tối đa
1. Tổng số vi sinh vật hiếu khí, số khuẩn lạc trong 1 ml sản phẩm
102
2. E.Coli, số vi khuẩn trong 1 ml sản phẩm
0
3. Coliforms, số vi khuẩn trong 1 ml sản phẩm
10
4. Cl. Perfringens, số vi khuẩn trong 1 ml sản phẩm
0
5. S. aureus, số vi khuẩn trong 1 ml sản phẩm
0
6. Tổng số nấm men – nấm mốc, số khuẩn lạc trong 1 ml sản phẩm
10
1.4.2.1. Vi sinh vật hiếu khí
Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn sinh trưởng và phát triển trong điều kiện
có oxy phân tử, tức là cho khuẩn lạc trong môi trường nuôi dưỡng có oxy phân tử.
9
Tạ Kiều Oanh – CS_K29
Tổng Quan Tài Liệu
Khoá luận tốt nghiệp
Tổng số vi khuẩn hiếu khí hiện diện trong mẫu chỉ thị mức độ vệ sinh của mẫu.
Chỉ số này được xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc mọc trên môi trường
thạch dinh dưỡng từ một lượng mẫu xác định trên cơ sở xem một khuẩn lạc là sinh
khối phát triển từ một tế bào hiện diện trong mẫu.
Chỉ tiêu tổng số vi sinh vật hiếu khí được dùng để đánh giá chất lượng của mẫu
về vi sinh vật, nguy cơ hư hỏng, thời hạn bảo quản của sản phẩm, mức độ vệ sinh
trong quá trình chế biến, bảo quản sản phẩm.
1.4.2.2. E. coli
Ngành (phylum): Proteobacteria; Lớp (class): Gamma Proteobacteria; Bộ
(order): Enterobacterialse; Họ (family): Enterobacteriaceae; Chi (genus):
Escherichia; Loài (species): E. coli. [14]
Từ năm 1700 người ta đã phát hiện E. coli là một loài vi sinh vật gây bệnh (Niel
M.A. Tarr P.I, 1994). Năm 1885 nhà khoa học người Đức là Theodor Escherich đã
tách được loài vi sinh vật này từ phân trẻ em bị bệnh. Sau này vi khuẩn này được mang
tên ông. Năm 1971 người ta xếp chúng vào nhóm các vi sinh vật gây bệnh trong th ực
phẩm và là một vi sinh vật chỉ thị nhiễm trùng thực phẩm. [12]
E. coli là trực khuẩn ngắn, gram (-), không tạo bào tử, chịu được nhiệt, không bị hủy khi đun nóng 1000C trong 2 giờ, có thể kháng cồn, không bị phá hủy khi tiếp xúc
với cồn 50%, mà bị hủy bởi formone 5%, có khả năng phát triển ở nhiệt độ từ 30 tới 500C, nhiệt độ phát triển tối ưu của chúng là 370 C, phát triển ở pH tối thích là 4.4. E.
coli sống trong ruột già của người và động vật, có khả năng lên men nhiều loại đường,
sinh hơi, có khả năng khử nitrate thành nitrite. Khả năng gây bệnh rất đa dạng và nguy
hiểm. [12]
1.4.2.3. Coliforms
Coliforms là những trực khuẩn hình que, gram âm (-), không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kị khí tuỳ ý. Chúng có khả năng phát triển ở phổ nhiệt độ rất rộng từ -20C đến 500C, pH trong khoảng 4.4 đến 9.0. Coliforms hiện diện rộng rãi trong tự nhiên, ở ruột
10
Tạ Kiều Oanh – CS_K29
Tổng Quan Tài Liệu
Khoá luận tốt nghiệp người và động vật, có khả năng lên men lactose sinh acid và sinh hơi ở 370C trong 24
– 48 giờ. Khi số Coliforms trong rượu cao kéo theo khả năng hiện diện của các vi sinh
vật gây bệnh khác cũng cao. [12]
Coliforms chịu nhiệt là những Coliforms có khả năng lên men lactose trong 24 giờ khi ủ ở nhiệt độ 440C trong môi trường EC. Coliforms phân là Coliforms chịu nhiệt có khả năng sinh indole khi được ủ 24 giờ ở 45 .50 C trong canh Trypton. Coliforms
phân là một thành phần của hệ vi sinh vật đường ruột ở người và các động vật máu
nóng khác và được sử dụng để chỉ thị mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến, bảo
quản, vận chuyển thực phẩm, nước uống.
1.4.2.4. Clostridium perfringens
Giới: Bacteria; Ngành (phylum): Firmicutes; Lớp (class): Clostridia; Bộ
(order): Clostridiales; Họ (family): Clostridiaceae; Chi (genus): Clostridium; Loài
(species): C. perfringens. [14]
Clostridium là các vi khuẩn gram (+), hình que, kị khí bắt buộc, sinh bào tử,
không di động, có thể thủy giải saccharide và protein trong các hoạt động thu nhận
C làm chậm hoặc làm ngưng sự phát triển của vi khuẩn này. Ở năng lượng tạo ra các sản phẩm như acid acetic, butyric, rượu, tạo ra các mùi khó chịu trong sản phẩm. Clostridium có thể sinh trưởng ở nhiệt độ 550C, nhiệt độ tối ưu là 43 – 470C. Nhiệt độ 15 – 200
pH trên 9.0 và NaCl 5% sự sinh trưởng của Clostridium bị ức chế hoàn toàn.
Trong tự nhiên, Clostridium có mặt trong đất, một số loài trong nhóm này gây
bệnh cho người và động vật, một số loài khác gây hư hỏng thực phẩm, khử sulphite
thành sulphur tạo ra màu đen và gây mùi khó chịu.
1.4.2.5. Staphylococcus aureus
Giới (kingdom): Eubacteria; Ngành (phylum): Firmicutes; Lớp (class): Cocci;
Bộ (order): Bacillales; Họ (family): Staphylococcaceae; Chi (genus): Staphylococcus;
Loài (species): S. aureus. [22]
11
Tạ Kiều Oanh – CS_K29
Tổng Quan Tài Liệu
Khoá luận tốt nghiệp
Năm 1894, I. Denys là người đầu tiên nghiên cứu về Staphylococcus và các độc
tố của chúng trong thực phẩm. Năm 1914, Barber và sau đó 1930, GM. Dack tìm thấy
Staphylococcus trong sữa. Hiện nay, người ta đã tìm thấy tất cả 31 loài
Staphylococcus.
Staphylococcus là loại cầu khuẩn gram (+), các tế bào của chúng liên kết thành
hình chùm cho. Khi phát triển trong môi trường, Staphylococcus có khả năng tạo ra
sắc tố từ màu trắng đến vàng sậm, nhiệt độ 20 – 250C thích hợp nhất cho chúng tạo
C chúng vẫn sống được màu. Staphylococcus không di động, không tạo bào tử, nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển là 370C, chịu được sự khô hạn, hơi nóng (ở nhiệt độ 500
trong 30 phút), có khả năng sống ở nồng độ muối 9 – 10%. Staphylococcus phát triển
ở phổ pH rất rộng (pH từ 4.0 tới 9.8). Khoảng pH tối ưu của chúng là 6 – 7. [12]
Staphylococcus được phân bố khắp nơi nhưng chủ yếu được phân lập từ da và
màng nhầy của người và động vật máu nóng , có khả năng lên men và sinh acid từ
manitol, trehalose, sucrose. Staphylococcus có thể nhiễm vào nước và thực phẩm qua
con đường tiếp xúc với người thao tác trong quá trình chế biến thực phẩm. Sự hiện
diện với mật độ cao của Staphylococcus trong mẫu chỉ thị điều kiện vệ sinh và kiểm
soát nhiệt độ kém của quá trình chế biến.
1.4.2.6. Nấm men, nấm mốc
Nấm men và nấm mốc là nhóm vi sinh vật nhân thật, rất đa dạng, có vách tế bào
và lớp vỏ chitin, có nhân và các bào quan khác. Tất cả các loài nấm men, nấm mốc đều
thuộc nhóm vi sinh vật dị dưỡng. Chúng chỉ có khả năng nhận các chất dinh dưỡng ở
dạng hoà tan. Trong quá trình trao đổi chất xảy ra ở tế bào, chúng có khả năng chuyển
hoá các chất hoà tan thành các chất không hoà tan như lignocellulose,… Ngoài ra,
chúng còn có thể tạo ra các chất độc, các chất độc đó được gọi chung là độc tố vi nấm
(mycotoxins). Tiêu biểu có Asp. flavus, Asp. parasiticus, Asp. moninus, P. italicum, P.
digitatum, P. roquefortii, P. cammenbertii. [12]
12
Tạ Kiều Oanh – CS_K29
Tổng Quan Tài Liệu
Khoá luận tốt nghiệp
Trong rượu vang, sự hiện diện của nấm men, nấm mốc có thể làm đổi màu
rượu, gây cặn, phát sinh mùi vị lạ, thay đổi cấu trúc của rượu, một số có thể tạo độc tố
gây ngộ độc.
1.5. TÌNH HÌNH SẢN XUẤT RƯỢU VANG TRÊN THẾ GIỚI VÀ NGÀNH RƯỢU
VANG Ở VIỆT NAM
1.5.1. Thị trường rượu vang (theo số liệu thống kê năm 2001)
NƯỚC TIÊU THỤ NƯỚC TIÊU THỤ
Pháp 41.7% Úc 4.8%
Italia 17.2% Bồ Đào Nha 4.3%
Tây Ban Nha 9.2% Đức 4.3%
Dưới đây là bảng số liệu so sánh sức tiêu thụ rượu vang của một số quốc gia
trên thế giới năm 2003 và 2007 (theo số liệu thống kê năm 2009)
13
Tạ Kiều Oanh – CS_K29
Tổng Quan Tài Liệu
Khoá luận tốt nghiệp
1.5.2. Ngành rượu vang ở Việt Nam
Trước đây, ngành rượu vang ở Việt Nam còn non trẻ, các cơ sở sản xuất rượu
vang trong nước chưa nhiều và công nghệ chế biến không cao nên chưa chiếm được
thị trường trong nước và thế giới. Nhưng hiện nay, khi con người nhận thức được vai
trò và lợi ích củ a rượu vang trong cuộc sống thì đã có nhiều nhà máy sản xuất rượu
vang mọc lên với quy mô công nghiệp cùng kỹ thuật và trang thiết bị tân tiến hơn:
công ty Ladofoods (Lâm Đồng), Beco Đà Lạt, Vĩnh Tiến, vang Biên Hoà,… Việt Nam
có nhiều điều kiện thuận lợi để phát triển công nghệ sản xuất rượu vang.
Với 85 triệu dân, đây là thị trường đầy tiềm năng với sản phẩm rượu vang. Mặt
khác, do chính sách mở cửa và giao lưu văn hóa, người Việt Nam bước đầu làm quen
với văn hóa châu Âu trong đó có văn hóa ẩm thực, rượu vang. Ngành du lịch phát triển
cũng là một yếu tố thúc đẩy ngành công nghiệp sản xuất rượu vang. Trong xu thế tòan
cầu nền kinh tế thế giới, hàng hóa của Việt Nam trong đó có rượu vang có điều kiện
thâm nhập thị trường các nước và các nhãn hiệu rượu vang nổi tiếng thế giới vào Việt
Nam đòi hỏi rượu vang Việt Nam ngày càng phải nâng cao chất lượng.
Sự kiện hội nghị APEC tại Việt Nam sử dụng vang Đà Lạt để tiếp khách và
Cuộc thi rượu vang quốc tế tại Việt Nam 2007, chứng tỏ thương hiệu rượu vang Việt
Nam đã bắt đầu có chỗ đứng trên thị trường trong nước và thế giới.
Nhưng bên cạnh những thế mạnh đó, Việt Nam cũng có những khó khăn không
nhỏ để phát triển ngành công nghiệp sản xuất rượu vang. Chúng ta không có vùng
nguyên liệu chuyên canh và giống nho tốt để đáp ứng sản xuất rượu vang ở quy mô
công nghiệp, chúng ta cũng không có truyền thống trong ngành sản xuất vốn đòi hỏi
rất nhiều bí quyết để tạo ra sản phẩm có chất lượng cao này. Điều kiện khí hậu nhiệt
đới vốn không thuận lợi cho quá trình sản xuất rượu vang cũng là một bất lợi cho
ngành sản xuất rượu vang.
Mặc dù có thị trường giàu tiềm năng, nhưng người dân chưa có thói quen sử
dụng rượu vang như thức uống khai vị trong bữa ăn hàng ngày. Chúng ta cũng chưa có
chính sách về thuế đối với rượu vang sản xuất trong nước và rượu vang nhập khẩu để
14
Tạ Kiều Oanh – CS_K29
Tổng Quan Tài Liệu
Khoá luận tốt nghiệp thúc đẩy ngành sản xuất rượu vang trong nước. Tình trạng rượu giả tràn lan trên thị
trường gây khó khăn không nhỏ đối với rượu vang nội địa.
1.6. SƠ ĐỒ QUY TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU VANG Ở CÔNG TY CỔ PHẦN RƯỢU
BIA ĐÀ LẠT (BECO ĐÀ LẠT)
Nguyên liệu
Phân loại
Làm sạch Nước Hoá chất diệt khuẩn
Xay, nghiền
Trích ly
Thanh trùng
Làm lạnh
Men giống Lên men chính
10 – 20 ngày
18 – 220C
Len men phụ
15 – 180C
15 – 20 ngày
Xác men Tàng trữ
Lọc, phối chế
Đóng chai
Thành phẩm
15
Tạ Kiều Oanh – CS_K29
Khoá luận tốt nghiệp
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
- Đối tượng: Mẫu rượu vang được lấy ngay tại các tank ở giai đoạn trích ly
(rượu vang bán thành phẩm) và giai đoạn đóng chai (rượu vang thành phẩm)
của quá trình sản xuất rượu vang.
- Xuất xứ của mẫu: Công ty cổ phần rượu bia Đà Lạt (Dalat Beco).
- Tiêu chuẩn chọn mẫu: mẫu được lấy một cách ngẫu nhiên và đủ lớn để có thể
tiến hành thí nghiệm kiểm tra tất cả các chỉ tiêu vi sinh và chỉ tiêu hoá lý.
- Địa điểm tiến hành thí nghiệm: Phòng thí nghiệm Hoá Sinh – khoa Sinh học
– trường Đại học Đà Lạt và phòng thí nghiệm vi sinh – thực phẩm, phòng thí
nghiệm hoá lý – khoa xét nghiệm tổng hợp – Trung tâm Y tế dự phòng tỉnh
Lâm Đồng.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Thu lấy mẫu và bảo quản mẫu
Lượng mẫu thu lấy đảm bảo độ tin cậy, có tính đại diện và đủ số lượng cần thiết
cho thí nghiệm. Mẫu lấy phân tích phải đảm bảo không bị nhiễm vi sinh vật từ bên
ngoài trong quá trình lấy mẫu và vận chuyển mẫu, không có sự phát triển thêm của vi
sinh vật có sẵn trong mẫu, hoặc số lượng vi sinh vật tiêu hao trong mẫu không ả nh
hưởng nhiều đến kết quả thí nghiệm. Mẫu được phân tích trong vòng 6 giờ sau khi thu
mẫu để đảm bảo độ chính xác. [12]
Mẫu lấy về có thể bảo quản được trong vòng 2 ngày ở điều kiện thường. Nếu
không sử dụng ngay thì phải bảo quản trong tủ lạnh (0 – 50 C), bảo quản được trong
vòng 1.5 tuần. [2]
2.2.2. Đồng nhất và pha loãng mẫu
16
Tạ Kiều Oanh – CS_K29
Khoá luận tốt nghiệp
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
Để đảm bảo tính đồng đều của mẫu, sau khi lấy, mẫu được lắc đều trong 5 phút.
Trước khi phân tích các chỉ tiêu vi sinh vật, mẫu cần phải pha lõang bằng nước muối
sinh lý hoặc nước muối peptone có thành phần như bảng sau:
Thành phần Nước muối sinh lý Nước muối peptone
NaCl (g) 8.5 8.5
Peptone (g) - 1
Nước cất (ml) 1000 1000
Dịch pha loãng được phân phối vào ống nghiệm (9ml/ống) và trong bình tam
C trong 15'. giác (90ml/bình). Sau đó, hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210
Trộn lẫn 10ml mẫu vào 90ml dịch pha loãng ta được dung dịch mẫu có nồng độ -1. Lấy 1ml dung dịch mẫu ở nồng độ pha loãng 10 -1 trộn lẫn với 9.0ml pha loãng là 10 dịch pha loãng ta có dung dịch mẫu có nồng độ pha loãng là 10-2. Tiếp theo lấy 1ml dung dịch mẫu nồng độ pha loãng 10-2 cho vào 9.0ml dung dịch pha loãng nhận được mẫu có độ pha loãng là 10-3 . Với cách làm tương tự ta sẽ có mẫu với độ pha loãng
thích hợp. Thời gian pha loãng mẫu tới khi cấy không quá 20'.
2.2.3. Phương pháp phân tích các chỉ tiêu vi sinh vật
2.3.3.1. Kiểm tra tổng số vi khuẩn hiếu khí
Nguyên tắc: Trên cơ sở số lượng mẫu xác định và coi một khuẩn lạc là điểm
C trong 24 – xuất phát đầu tiên cho một vi sinh vật sống. Đếm số khuẩn lạc đã mọc trên môi trường thạch dinh dưỡng từ các nồng độ pha loãng sau khi nuôi cấy ở 30 – 370
48h. Tính số khuẩn lạc trong 1ml mẫu. Từ đó suy ra số lượng tế bào sống có trong
mẫu phân tích. Thực hiện theo kỹ thuật hộp đổ. [2]
Môi trường: Thạch dinh dưỡng.
Thực hiện: Cho vào mỗi đĩa petri 15ml môi trườn g thạch dinh dưỡng có nhiệt độ 44 - 460C. Dùng pipette cho vào các đĩa 1ml mẫu có độ pha loãng tương ứng, t rộn
đều bằng cách xoay đĩa petri nhẹ nhàng theo chiều kim đồng hồ và ngược chiều kim
17
Tạ Kiều Oanh – CS_K29
Khoá luận tốt nghiệp
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
C trong 24 – 48h. [2,3] đồng hồ. Khi môi trường đã đông hẳn, úp ngược đĩa petri, gói giấy báo và ủ ở nhiệt độ 29 – 310
Tính kết quả: Sau 24h, đọc kết quả sơ bộ. Sau 48h, đếm tất cả các khuẩn lạc có
trên các đĩa thạch đã nuôi cấy và lấy kết quả chính thức. Chọn các đĩa có số khuẩn lạc
từ 15 – 300 để tính giá trị trung bình của các nồng độ pha loãng rồi tính ra số lượng vi
=
A CFU ml
(
/
)
N + + ...
n Vf i
i
n Vf 1 1
khuẩn trong 1ml mẫu. Tính số vi khuẩn hiếu khí theo công thức: [10]
số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn trong 1ml mẫu. A
N tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn.
số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i. ni
V thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa.
độ pha loãng tương ứng. fi
2.3.3.2. Kiểm tra tổng số nấm men, nấm mốc
Nguyên tắc: Sử dụng kỹ thuật hộp đổ trên môi trường thạch sau khi ủ hiếu khí
28 ± 10 C. Sau thời gian từ 3 – 7 ngày, số lượng bào tử nấm men, nấm mốc trong 1ml
mẫu được tính theo số khuẩn lạc đếm được trên môi trường thạch theo các nồng độ
pha loãng khác nhau. [2]
Môi trường: Thạch Saboraud.
Nuôi cấy: Hút 1ml mẫu hoặc 1ml nồ ng độ pha loãng vào giữa đĩa petri, sau đó cho vào 15ml môi trường thạch dinh dưỡng (44 - 460C). Trộn đều bằng cách xoay đĩa
nhẹ nhàng theo cùng và ngược chiều kim đồng hồ. Để các đĩa thạch đông tự nhiên. Khi thạch đã đông, g ói giấy báo và để tủ ấm ở 27 – 290C hoặc nhiệt độ phòng thí
nghiệm trong 5 – 7 ngày. [2]
18
Tạ Kiều Oanh – CS_K29
Khoá luận tốt nghiệp
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
Tính kết quả: Sau 3 ngày, đọc kết quả sơ bộ, đếm tổng số khuẩn lạc mọc trên
môi trường đã nuôi cấy. Sau 5 – 7 ngày đếm kết quả chính thức. Chọn tất cả các đĩa có
=
N
×
d
C )
(
∑ + n 2
n 1
không quá 150 khóm nấm để tính kết quả. [2]
C∑ Tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa.
N Tổng số nấm men, nấm mốc trong 1ml mẫu.
Số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ 1, thứ 2. n1; n2
d Hệ số pha loãng
2.3.3.3. Kiểm tra Coliform
Nguyên tắc: Xác định bằng phương pháp MPN với nguyên tắc mẫu được pha
loãng thành một dãy thập phân (hai nồng độ kế tiếp nhau khác nhau 10 lần) (hệ 9 ống
nghiệm). Ghi nhận số ống nghiệm dương tính ở mỗi nồng độ pha loãng và dựa vào
bảng MPN để suy ra số lượng nhóm vi sinh vật tương ứng hiện diện trong 1ml mẫu
ban đầu. [2]
Môi trường sử dụng: Môi trường LSB và canh trường mật bò BGBL 2%.
Nuôi cấy: Hút 1ml mẫu cho vào 3 ống nghiệm khác nhau. Hút 10ml môi trường
LSB cho vào 3 ống đó. Thực hiện tương tự với các nồng độ pha loãng khác nhau, từ 3 đến 5 nồng độ pha loãng liên tiếp. Ủ ống nghiệm ở tủ ấm 370 C trong 48h. [2,3,13]
Tính kết quả: Sau 48h, ghi nhận số ống có sinh hơi (+). Nếu môi trường bị đục
mà không sinh hơi là âm tính (-). Dùng que cấy vòng chuyển dịch mẫu từ các ống LSB
(+) sang các ống có chứa canh BGBL (mỗi ống 1 khuyên cấy). Các ống được ủ ở nhiệt 0C trong 48h. Ghi nhận số ống có sinh hơi ứng với mỗi nồng độ pha loãng. Ở độ 30
mỗi nồng độ pha loãng của mẫu, dùng bảng MPN thích hợp để tính ra mật độ vi sinh
vật trong mẫu và biểu diễn dưới dạng trị số MPN/ml. [2,10,13]
19
Tạ Kiều Oanh – CS_K29
Khoá luận tốt nghiệp
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
2.3.3.4. Kiểm tra E. coli
Nguyên tắc: Định lượng E. coli bằng phương pháp MPN như nguyên tắc định
lượng Coliform.
Môi trường: Canh trường BGBL, thạch EMB, môi trường indole, thạch thường,
nước peptone, môi trường MR – VP, môi trường Simmon Citrate.
Kỹ thuật: Ria 1 khuyên cấy từ ống BGBL (+) sang môi trường thạch EMB và
để tủ ấm 370C trong 24h. Sau thời gian nói trên, c họn các khuẩn lạc điển hình của
C trong 24h. Nếu môi trường sinh hơi thì E. coli (khuẩn lạc hình tròn, mặt phẳng hoặc hơi lồi, có ánh kim) cấy vào môi trường thạch thường, tiếp tục nuôi cấy ở nhiệt độ 370
thực hiện phản ứng IMViC. [2,10,13]
1)
Phản ứng sinh indol: Cấy vi khuẩn từ môi trường thạch thường vào môi trường nước peptone, nuôi cấy ở nhiệt độ 370 C trong 24 – 48h. Cho 5 giọt thuốc thử
Kowac’s vào môi trường có vi khuẩn vừa cấy , để yên vài phút. Phản ứng (+)
khi có vòng nhẫn màu đỏ cánh sen trên môi trường.
2)
Phản ứng MR (Methyl Red): Cấy vi khuẩn từ môi trường thạch thường sang môi trường MR – VP. Đặt ở tủ ấm 370 C trong 24 – 48h. Lấy 5ml MR – VP có
vi khuẩn vào ống nghiệm khác để thực hiện phản ứng VP. Canh khuẩn MR –
VP còn lại : cho 5 giọt methyl đỏ 0.2% vào. Phản ứng (+) khi môi trường có
α
màu đỏ ngay sau khi cho thuốc thử.
Phản ứng VP (Voges – Proskauer): Cho 1.8 ml Naphthol 5% cùng 0.6ml 3)
KOH 40% vào canh khuẩn MR – VP. Phản ứng (+) khi có màu đỏ xuất hiện
trong vòng 5 – 10' sau khi cho thuốc thử vào. Một số loài cho phản ứng (+)
chậm nên phải hơ nóng nhẹ.
20
Tạ Kiều Oanh – CS_K29
Khoá luận tốt nghiệp
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
4) Phản ứng Citrate: Cấy chuyển vi khuẩn ngờ từ thạch thường vào môi trường
C trong 18 – 24h. Phản ứng (+) khi môi Simmon Citrate. Nuôi ở tủ ấm 37 0
trường chuyển sang màu xanh dương.
Tính kết quả: Xác định E. coli gây bệnh khi phát hiện vi khuẩn gram (-) bằng
phương pháp nhuộm gram với đặc tính sinh hoá như sau: [2,10]
Indol MR VP Citrate
E. coli type I + + - -
E. coli type II - + - -
2.3.3.5. Kiểm tra tụ cầu khuẩn
Nguyên tắc: Nuôi cấy mẫu thử trong môi trường TSTC, sau đó nuôi cấy trên
C trong 24 – 48h, nhận định sự có mặt môi trường Chapman trong đĩa petri. Nuôi ở 370
của Staphylococcus aureus theo các đặc điểm nuôi cấy, hình thái và các đặc tính sinh
hoá. [13]
Môi trường: Môi trường TSTC, Chapman, môi trường dextrose.
Các bước tiến hành: Hút 1ml dịch mẫu cấy vào môi trường TSTC, lắc nhẹ để
trộn đều mẫu. Nuôi ở tủ ấm 370 C trong 24h. Nếu thấy môi trường trong ống nghiệm bị
đổi màu thì cấy chuyền bằng cách ria cấy trên bề mặt môi trường Chapman. Khi đó,
St. aureus sẽ hình thành các khuẩn lạc tròn, lồi, bóng, đường kính 1 – 3mm. Sau 24h,
khuẩn lạc và môi trường xung quanh chúng có màu vàng sáng hoặc hơi sẫm. Sau 48h,
đường kính của khuẩn lạc tăng lên, màu của khuẩn lạc và môi trường xung quanh vàng
sẫm hơn.
Chọn vài khuẩn lạc đặc trưng làm tiêu bản, nhuộm gram (phụ lục 1), soi kính
hiển vi. Nếu thấy hình thái tế bào vi khuẩn điển hình hoặc nghi ngờ thì cấy chuyền vào 0C trong 24h để thử phản ứng coaglucaza. Sau 24h lấy môi trường dextrose. Nuôi ở 37
0.1ml dịch cấy trên chuyển vào ống nghiệm có sẵn 0.3 – 0.5ml huyết tương thỏ. Lắc để trộn đều mẫu và nuôi cấy ở 370C. Song song với mẫu thí nghiệm làm một ống
21
Tạ Kiều Oanh – CS_K29
Khoá luận tốt nghiệp
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
nghiệm đối chứng có 0.1ml canh thang vô khuẩn với cùng lượng 0.3 – 0.5ml huyết
tương thỏ.
Sau 2h, 4h, 6h, đọc kết quả. Nếu phản ứng (-) thì để những ống nghiệm trên ở
nhiệt độ phòng trong 24h và tiếp tục quan sát. Nếu St. aureus cho phản ứng (+) thì
huyết tương trong ống nghiệm phải được thử đông lại. [2]
Tính kết quả: Khi phát hiện các khuẩn lạc đặc trưng thì làm tiêu bản, n huộm
gram và soi kính hiển vi. Vi khuẩn St. aureus có hình cầu, xếp thành hình chùm nho,
thành đám hay cặp, gram (+), lên men đường mannitol, chuyển màu môi trường
Chapman từ đỏ sang vàng. [2]
2.3.3.6. Kiểm tra vi khuẩn kỵ khí
Nguyên tắc: Nuôi cấy 10ml mẫu thử hay dịch pha loãng trong ống môi trường dịch chọn lọc (nuôi cấy sâu), xử lý nhiệt độ ở 750C trong 10' sau khi cấy mẫu, làm lạnh ngay và đưa vào nuôi trong tủ ấm 37 0 C trong 24 – 72h. Nhận định sơ bộ sự có mặt của
Clostridium perfringens qua đặc điểm hình thái, tính sinh hoá. [2]
Môi trường: Môi trường Wilson – Blair cải tiến.
C trong 24 – 72h. [2] Các bước tiến hành: Hút 1ml mẫu hoặc dịch pha loãng vào 2 ống nghiệm có môi trường Wilson – Blair (đã đun tan chảy, để nguội 45 – 500C), lắc đều, sau đó đun cách thuỷ ở 800C trong 10'. Lấy mẫu ra và làm lạnh ngay dưới vòi nước (hay để trong tủ lạnh). Khi thạch đông, nuôi trong tủ ấm ở 370
Tính kết quả: Sau 24h, lấy ra đọc kết quả sơ bộ. Cl. perfringens tạo khuẩn lạc
tròn, màu đen, đường kính 1mm. Sau 72h, khuẩn lạc s ẽ lớn hơn (đường kính 4 –
6mm), có thể có vết nứt hay cột thạch có bọt khí (do sự sinh hơi). Nếu môi trường xuất
hiện nhiều khuẩn lạc tạp hoặc nghi ngờ thì thuần khiết giống và kiểm tra tiêu bản qua
kính hiển vi. Đồng thời, làm các phép thử tính di động, khả năng khử nitrate… [2]
2.2.4. Phương pháp phân tích các chỉ tiêu hóa lý
2.2.4.1. Phương pháp xác định độ cồn
22
Tạ Kiều Oanh – CS_K29
Khoá luận tốt nghiệp
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
Nguyên tắc: Mẫu sau khi qua chưng cất, được đo bằng cồn kế ở 20 0C. Hàm
C. [13] lượng ethanol trong 100ml mẫu chính là độ rượu của mẫu ở 200
Quy trình: Lấy 500ml mẫu rượu, cho vào bình cất với vài viên đá bọt. Lắp hệ
thống chưng cất hoàn chỉnh và chưng cất cho đến khi được 2/3 thể tích bình hứng
(200ml) thì ngưng cất. Định mức lượng cồn thu được tới 250ml, lắc đều. [13]
C. [13] Tính kết quả: Dùng alcoholmeter để đo độ cồn và nhiệt kế để đo nhiệt độ của dung dịch. Nếu nhiệt độ không ở 200C thì tra bảng hiệu chỉnh (tra bảng) để quy đổi về độ rượu ở 200
2.2.4.2. Phương pháp xác định hàm lượng acid tổng số
Nguyên tắc của phương pháp: trong rượu vang chứa rất nhiều loại acid hữu cơ
khác nhau được tạo thành trong quá trình lên men. Acid tổng số là tổng các acid được
tự do và liên kết không được chuẩn độ khi đưa pH của rượu vang về 7.0. H2CO3, SO2
tính trong acid tổng số. [5]
Lượng acid trong mẫu được chuẩn độ bằng NaOH với chỉ thị bromothymol blue.
Tiến hành thí nghiệm: dùng pipette hút 100ml rượu thử (không qua chưng cất)
vào bình tam giác. Cho vào 5 giọt bromothymol blue, chuẩn độ bằng NaOH 0.1N tới
khi dung dịch chuyển sang màu xanh, bền trong 30 giây. [13]
Nếu sự chuyển màu của mẫu khó quan sát, cần pha loãng mẫu 1.5 – 2 lần. Việc
pha loãng mẫu không gây ảnh hưởng đến kết quả chuẩn độ.
Tính kết quả: lượng acid tổng số trong mẫu được biểu thị bằng acid acetic (mg)
× ×
3 n
100 A
trong 100ml rượu quy về độ cồn 1000 theo công thức: [13]
3 Số mg acid acetic ứng với 1ml NaOH 0.1N.
n Thể tích NaOH 0.1N dùng để chuẩn độ (ml).
23
Tạ Kiều Oanh – CS_K29
Khoá luận tốt nghiệp
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
A Độ cồn của rượu
100 A
. Hệ số để chuyển rượu có độ cồn A thành rượu có độ cồn 1000
2.2.4.3. Phương pháp xác định hàm lượng acid bay hơi
Nguyên tắc của phương pháp: Acid bay hơi được tách ra bằng phương pháp
chưng cất lôi cuốn theo hơi nước. Dịch acid ngưng tụ được chuẩn độ bằng kiềm. Các
không được tính là acid bay hơi. [5] acid được tạo thành từ CO2 và SO2
Quy trình: Cho vào bình tam giác dung tích 250ml, lấy 100ml rượu cất được
0 cùng với 3 giọt thuốc thử PP (Phenol phtalein 1% trong rượu 60
). Chuẩn độ bằng
NaOH 0.1N tới khi dung dịch xuất hiện màu hồng nhạt, bền trong 30 giây. [13]
Tính kết quả: hàm lượng acid bay hơi trong mẫu (g/l) được tính th eo acid
=
×
X
0.006
V
1000 V 0
acetic. [13]
V Thể tích dung dịch NaOH 0.1N đã chuẩn độ (ml)
Thể tích mẫu đem đi chuẩn độ (ml) V0
1000 Hệ số quy về 1l.
0.006 Hệ số chuyển ra acid acetic (hệ số hiệu chỉnh dung dịch NaOH: F = 1)
1ml NaOH 0.1N tương ứng với 0.006g acid acetic
2.2.4.4. Phương pháp xác định hàm lượng aldehyde
Nguyên tắc: Aldehyde trong rượu được định phân bằng iod dựa vào nguyên tắc
cộng bisunfit nhóm aldehyde. Quá trình có 4 giai đoạn:
- Qxy hóa rượu trong môi trường acid loãng tạo aldehyde ở dạng tự do.
24
Tạ Kiều Oanh – CS_K29
Khoá luận tốt nghiệp
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
- Cộng nhóm bisunfit vào nhóm aldehyde (acetaldehyde) ở pH = 7.0.
- Chuẩn độ lượng bisunfit thừa bằng iod ở pH = 2.0.
- Định lượng aldehyde kết hợp bằng iod ở pH: 9.0 – 9.5. [5]
Quy trình: Cho vào bình tam giác 500ml thứ nhất (bình thí nghiệm) 50ml rượu
cất được, 250ml nước cất và 10ml dung dịch Natri metabisunfit, đậy kín, lắc đều, để
yên 15'. Tiếp tục cho vào hỗn hợp nói trên 10ml phosphate – EDTA (pH = 7.0), đậy
kín, lắc đều, để yên 15'. Tiếp tục cho vào 10ml dung dịch HCl 25% (pH ≤ 2.0) và 1ml
hồ tinh bột.
Cho từng giọt iod 0.1N vào tới khi dung dịch trong bình chuyển màu xanh tím.
Tiếp theo cho vào 10ml dung dịch Borat kiềm (pH: 9.0 – 9.5), dung dịch sẽ mất màu.
Dùng iod 0.01N chuẩn độ dung dịch cho tới khi dung dịch chuyển sang màu xanh tím,
bền trong 30 giây.
Cho vào bình tam giác 500ml thứ hai (bình kiểm tra) các thành phần như bình
thí nghiệm nhưng thay dung dịch rượu bằng ethanol không có aldehyde có độ cồn gần
bằng độ cồn của mẫu thử. Các bước tiến hành tương tự như bình thí nghiệm. [13]
Tính kết quả: Ghi lượng iod 0.01N đã chuẩn độ ở 2 bình. Lượng aldehyde tổng
=
×
×
X
0.22
)
( − V V 1 0
1000 100 × A
V
) tính theo acetaldehyde: [13] cộng (mg/l rượu 1000
Thể tích iod 0.01N đã chuẩn độ mẫu thử (ml). V1
0
V Thể tích iod 0.01N đã chuẩn độ mẫu trắng (ml).
V Thể tích mẫu thử đem thí nghiệm (ml)
C. A Độ rượu của mẫu thử ở 200
0 rượu.
100 Hệ số chuyển về 100 1000 Hệ số chuyển về 1l rượu.
25
Tạ Kiều Oanh – CS_K29
Khoá luận tốt nghiệp
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
1ml iod 0.01N tương ứng với 0.22mg acetaldehyde
26
Tạ Kiều Oanh – CS_K29
Khoá luận tốt nghiệp
Kết Quả Nghiên Cứu
3.1. CÁC CHỈ TIÊU VI SINH VẬT
Sự có mặt của vi sinh vật trong thực phẩm là dấu hiệu để nhận biết thực phẩm
bị ô nhiễm và giảm chất lượng. Chúng tôi tiến hành phân tích các chỉ tiêu vi sinh vật
trong các mẫu rượu vang, kết quả được trình bày ở bảng 1.
Bảng 1: Các chỉ tiêu vi sinh vật thu được sau 24 giờ nuôi cấy 2 mẫu rượu vang.
Mẫu TVKHK (CFU/ml) Coliform – E. coli S. aureus Cl. perfringens
2 5.7 x 10
Mẫu 1 - - -
2
Mẫu 2 <10 - - -
Từ số liệu bảng 1, chúng tôi nhận thấy tổng số vi khuẩn hiếu khí ở mẫu 1 nhiều
hơn mẫu 2 sau 24 giờ nuôi cấy, cũng tức là mẫu rượu bán thành phẩm có sự hiện diện
của nhiều vi khuẩn hiếu khí nhiều hơn. Bên cạnh đó, không phát hiện thấy xuất hiện
dấu hiệu của Coliforms, E. coli, cũng như S. aureus ở cả 2 mẫu rượu. Tuy nhiên, chỉ
nuôi cấy mẫu sau 24 giờ vẫn chưa thể khẳng định được trong mẫu có các vi sinh vật
trên hay không. Để kiểm tra kết quả nhận được, chúng tôi tiến hành xác định chỉ tiêu
vi sinh vật của 2 mẫu nói trên sau 48 giờ nuôi cấy. Kết quả thể hiện ở bảng 2.
Bảng 2: Các chỉ tiêu vi sinh vật thu được sau 48 giờ nuôi cấy 2 mẫu vang trên.
Mẫu TVKHK (CFU/ml) Coliform – E. coli S. aureus Cl. perfringens
2 6.4 x 10
Mẫu 1 - - -
2
Mẫu 2 <10 - - +
Số liệu trong bảng 2 cho thấy, ở mẫu 1 tổng số vi khuẩn hiếu khí tăng không
đáng kể sau 48 giờ nuôi cấy. Kết quả cho thấy rõ có sự tương ứng giữa chỉ tiêu vi sinh
vật ở các mẫu rượu vang sau 24 giờ và 48 giờ nuôi cấy. Tổng số vi khuẩn hiếu khí ở
mẫu 1 lớn hơn mẫu 2. Sau 48 giờ nuôi cấy, chúng tôi cũng không phát hiện thấy
Coliform, E. coli cũng như S. aureus. Như vậy ở cả mẫu rượu vang thành phẩm và bán
thành phẩm đều đạt tiêu chuẩn Việt Nam về chất lượng của rượu vang. Kết quả này
26
Tạ Kiều Oanh – CS_K29
Khoá luận tốt nghiệp
Kết Quả Nghiên Cứu
cũng chứng minh rằng trong quá trình chế biến và bảo quản rượu vang đảm bảo các
điều kiện về vệ sinh an toàn thực phẩm.
Tổng số vi khuẩn hiếu khí là một chỉ tiêu quan trọng đánh giá chất lượng sản
phẩm. Do mẫu 1 và 2 ở trên có tổng số vi khuẩn hiếu khí khá lớn, chúng tôi tiến hành
xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí ở cả mẫu 1 và 2. Kết quả biểu diễn ở bảng 3.
Bảng 3: Số khuẩn lạc của vi khuẩn hiếu khí trong 2 mẫu rượu vang.
KẾT QUẢ (số khuẩn lạc)
Sau 24h Sau 48h Mẫu Đĩa thí nghiệm
10
-1
10
-2
10
-3
10
-1
10
-2
10
-3
Đĩa 1 32 0 53 18 5 26 Mẫu 1 Đĩa 2 30 3 55 27 6 27
Đĩa 1 3 0 7 3 1 0 Mẫu 2 Đĩa 2 4 0 6 5 0 2
Hình 1. Khuẩn lạc vi khuẩn hiếu khí của mẫu 1 được nuôi cấy trên môi trường thạch dinh dưỡng. Khuẩn lạc có màu trắng, hình tròn.
27
Tạ Kiều Oanh – CS_K29
Khoá luận tốt nghiệp
Kết Quả Nghiên Cứu
Phù hợp với kết quả ở bảng 1 và 2, số khuẩn lạc vi khuẩn hiếu khí đều có ở cả
mẫu 1 và 2 với số lượng đáng kể, tuy nhiên số khuẩn lạc ở mẫu 1 nhiều hơn mẫu 2.
Chúng tôi cũng nhận thấy sau 48 giờ nuôi cấy, số khuẩn lạc của vi khuẩn hiếu
: 26 – 18,… khí đều cao hơn nhiều so với sau 24 giờ nuôi cấy, các số liệu tương ứng thể hiện điều đó là ở nồng độ pha loãng 10-1: 32 – 53, 30 – 55; ở nồng độ pha loãng 10-2
Từ đó, chúng tôi rút ra nhận xét là muốn đánh giá chính xác tổng số vi khuẩn hiếu khí,
cần phải tiến hành nuôi cấy sau 48 giờ.
Sau 24 và 48 giờ nuôi cấy trong điều kiện thích hợp, cả 2 mẫu rượu đều cho kết
quả âm tính đối với chỉ tiêu E. coli và Coliform. Đối với mẫu 1, môi trường nuôi cấy
bị đục nhưng không có hiện tượng sinh hơi tức là chưa có sự xuất hiện của Coliform,
mẫu 2 môi trường không bị đục và không sinh hơi. Như vậy, rượu bán thành phẩm và
rượu thành phẩm đều không có sự xuất hiện của vi khuẩn gây bệnh đường ruột.
Hình 2. Môi trường LSB (-) Hình 3. Môi trường BGBL (-)
Với vi khuẩn kị khí Cl. perfringens, sau 24 giờ nuôi cấy thì cả 2 mẫu đều không
thể hiện sự xuất hiện của vi khuẩn này, nhưng sau 48 giờ nuôi cấy thì mẫu 2 (mẫu
rượu thành phẩm) lại thấy xuất hiện sự tồn tại của Cl. perfringens. Thí nghiệm trên
mẫu rượu thành phẩm chưa pha loãng, sau 48 giờ nuôi cấy, thấy xuất hiện 7 khuẩn lạc của Cl. perfringens, ở nồng độ pha loãng 10 -1 có 4 khuẩn lạc và ở nồng độ pha loãng 10-2 có 3 khuẩn lạc. Điều này chứng tỏ quá trình khử trùng không tiêu diệt hết bào tử
của vi khuẩn Cl. perfringens hoặc do quá trình vận chuyển làm nhiễm vi khuẩn từ môi
28
Tạ Kiều Oanh – CS_K29
Khoá luận tốt nghiệp
Kết Quả Nghiên Cứu
trường ngoài vào. Như vậy, rượu thành phẩm không đạt chất lượng theo quy định về
chất lượng rượu vang của TCVN 7045:2002.
Hình 4. Khuẩn lạc của Clostridium perfringens của mẫu 2. Khuẩn lạc có hình tròn, màu đen
Cùng với việc phân tích các chỉ tiêu vi sinh vật nói trên, chúng tôi cũng tiến
hành xác định sự có mặt của nấm men và nấm mốc trong rượu vang. Kết quả trình bày
ở bảng 4.
Bảng 4: Tổng số nấm men, nấm mốc thu được sau 3 – 6 ngày nuôi cấy.
Mẫu Sau 3 ngày (CFU/ml) Sau 6 ngày (CFU/ml)
2 10.4 x 10
2 21.2 x 10
Mẫu 1
Mẫu 2 <10 <10
Sau 3 ngày nuôi cấy ở điều kiện thích hợp, số nấm men trong mẫu 2 ít hơn
trong mẫu 1 là do quá trình lên men tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển và hoạt
động của men vang. Sau 6 ngày nuôi cấy, tế bào nấm men nhân sinh khối mạnh, tổng
số nấm men vang tăng gần gấp đôi so với 3 ngày trước đó. So với mẫu 1, số nấm men
và nấm mốc ở mẫu 2 ít hơn nhiều (<10 CFU/ml). Vì rượu thành phẩm thông qua giai
đoạn khử trùng sản phẩm nên sự sinh trưởng và phát triển của nấm men, nấm mốc bị
ức chế bởi các chất khử trùng.
29
Tạ Kiều Oanh – CS_K29
Khoá luận tốt nghiệp
Kết Quả Nghiên Cứu
Để kiểm tra kết quả ở bảng 4, chúng tôi tiến hành xác định số khuẩn lạc của
nấm men và nấm mốc. Số liệu thu được biểu diễn trong bảng 5.
Bảng 5: Số khuẩn lạc của nấm men, nấm mốc sau 3 – 6 ngày nuôi cấy.
KẾT QUẢ (số khuẩn lạc)
Sau 3 ngày Sau 6 ngày Mẫu Đĩa thí nghiệm
10
-1
10
-2
10
-3
10
-2
10
-3
10
-1
Đĩa 1 77 42 20 105 85 58 Mẫu 1 Đĩa 2 60 50 18 89 78 54
Đĩa 1 3 0 0 10 3 1 Mẫu 2 Đĩa 2 4 1 0 15 4 0
Kết quả ở bảng 5 cho thấy sau 6 ngày nuôi cấy số khuẩn lạc nấm men, nấm mốc
đều nhỏ hơn nhiều sau 3 ngày nuôi cấy ở tất cả các nồng độ pha loãng, ở nồng độ pha loãng 10-1 là 77 – 105, 60 – 89; ở nồng độ pha loãng 10-2 là 42 – 85, 50 – 78;… Chúng
tôi cũng nhận thấy mẫu 2 có số khuẩn lạc nấm men, nấm mốc ít hơn rất nhiều so với số khuẩn lạc của mẫu 1 ở cùng một nồng độ pha loãng, ở nồng độ pha loãng 10-1 mẫu 1 có 77 khuẩn lạc trong khi mẫu 2 có 3 khuẩn lạc, ở nồng độ 10 -2 mẫu 1 có 42 khuẩn
lạc, mẫu 2 không có khuẩn lạc nào.
Hình 5. Khuẩn lạc nấm men vang trên môi trường thạch Saboraud
30
Tạ Kiều Oanh – CS_K29
Khoá luận tốt nghiệp
Kết Quả Nghiên Cứu
Quan sát thấy trên đĩa thạch xuất hiện 2 dạng khuẩn lạc khác nhau: một dạng có
khuẩn lạc có hình tròn, dạng thứ 2 có hình ba cạnh nhọn. Làm tiêu bản, nhuộm gram,
soi kính hiển vi để định danh nấm men (phụ lục 1), xác định được có 2 loài là
Saccharomyces oviformis (tạo khuẩn lạc nhọn) và Saccharomyces cerevisiae (tạo
khuẩn lạc tròn).
Hình 6. Saccharomyces oviformis quan sát dưới kính hiển vi quang học
Hình 7. Saccharomyces cerevisiae quan sát dưới kính hiển vi quang học
Cùng với các chỉ t iêu vi sinh vật, các chỉ tiêu hóa lý là các chỉ tiêu rất quan
trọng để đánh giá chất lượng rượu vang.
31
Tạ Kiều Oanh – CS_K29
Khoá luận tốt nghiệp
Kết Quả Nghiên Cứu
3.2. CÁC CHỈ TIÊU HÓA LÝ
3.2.1. Nồng độ cồn
Kết quả phân tích hàm lượng ethanol ở mẫu 1 và 2 thể hiện ở bảng 6.
Bảng 6: Nồng độ cồn trong rượu.
Quy đổi về độ rượu ở 200C
C Mẫu 1
0 13.8 0
Độ rượu ở nhiệt độ thực 140 ở 210 90 ở 230 C 8.4 Mẫu 2
Từ bảng trên, chúng tôi rút ra một số nhận xét sau. Nồng độ cồn ở mẫu 1 cao
hơn mẫu 2. Khi kết thúc quá trình lên men phụ, nồng độ cồn lý thuyết nằm trong
khoảng 12 – 15%. Độ cồn của mẫu rượu bán thành phẩm (mẫu 1) là 13.8 độ, tức là
đang ở giai đoạn cuối của quá trình lên men. Nồng độ cồn ở mẫu rượu thành phẩm chỉ
đạt 8.4 độ, mà ở độ cồn này, rượu khó bảo quản được lâu vì xảy ra hiện tượng chua
O2 (điều kiện hiếu khí)
rượu do quá trình lên men acid acetic theo phương trình phản ứng:
O 2CH3CH2OH 2CH3COOH + 2H2
Để ức chế quá trình lên men acetic người ta phải bổ sung thêm cồn vào trong
rượu trước khi đóng chai. Trên thực tế, nồng độ cồn được ghi trên nhãn chai rượu của
công ty Beco Đà Lạt là 12.5 độ, vì rượu này đã hiệu chỉnh để đạt độ cồn thích hợp.
3.2.2. Hàm lượng acid tổng số, acid bay hơi và aldehyde trong rượu
Trong các chỉ tiêu hóa lý của rượu, người ta quan tâm nhiều đến lượng acid và
đặc biệt là hàm lượng aldehyde vì đây chính là nguyên nhân số một gây ngộ độc rượu.
Kết quả phân tích các chỉ tiêu này trình bày ở bảng 7.
Bảng 7: Hàm lượng acid tổng số, acid bay hơi và aldehyde trong rượu.
Acid bay hơi Aldehyde Acid tổng cộng
(mg/100ml) (g/l) (mg/l)
291.52 0.18 95.65 Mẫu 1
535.36 0.92 20.95 Mẫu 2
32
Tạ Kiều Oanh – CS_K29
Khoá luận tốt nghiệp
Kết Quả Nghiên Cứu
Lượng acid tổng cộng và acid bay hơi của mẫu 2 nhiều hơn mẫu 1 tức là sau khi
lên men, hàm lượng các acid trong rượu đã tăng lên. Điều đó chứng tỏ khử trùng
không tiêu diệt hết các vi sinh vật sinh acid làm lượng acid của mẫu rượu thành phẩm
nhiều hơn hàm lượng acid của mẫu rượu bán thành phẩm. Lượng acid bay hơi càng
nhỏ, rượu vang càng bảo quản được lâu.
Các mẫu rượu được lấy ở các giai đoạn khác nhau, m ẫu 1 (vang bán thành
phẩm): lấy ngày 20/04/2009 ở tank X, giai đoạn đang lên men, chưa qua thanh trùng;
mẫu 2 (vang thành phẩm): lấy ngày 27/04/2009 ở tank XVIII, giai đoạn sau lên men,
đã qua thanh trùng.
* TVKHK: Tổng số vi khuẩn hiếu khí
33
Tạ Kiều Oanh – CS_K29
Khoá luận tốt nghiệp
Kết Luận và Đề Nghị
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
I. KẾT LUẬN
Qua các thí nghiệm, chúng tôi rút ra một số kết luận như sau:
1. Do kết quả của giai đoạn khử trùng, rượu vang thành phẩm đều đạt tiêu chuẩn
vi sinh vật và các chỉ tiêu hóa lý quan trọng.
2. Trong quá trình lên men, khi lượng đường còn lại trong dịch lên men là 7 Bx thì
tiến hành khử trùng là hiệu quả nhất. Tác nhân khử trùng tốt nhất là Na2SO3
C trong 10phút,… với liều lượng 70 – 120mg/l, hoặc có thể dùng SO2 với liều lượng từ 30 đến 120mg/l hay khử trùng bằng nhiệt: hấp ở 600
II. ĐỀ NGHỊ
1. Giai đoạn khử trùng là cần thiết và đóng vai trò quan trọng trong việc tạo thành
sản phẩm đạt chất lượng cao. Tuy nhiên, để sản phẩm đạt được chất lượng tốt
nhất nên kết hợp khử trùng với một số phương pháp xử lý khác: sử dụng nhiệt
độ, các tác nhân vật lý,…
2. Quá trình lên men sản xuất rượu vang trải qua nhiều giai đoạn khác nhau, vì
vậy cần có các nghiên cứu về hiệu quả của thanh trùng ở từng giai đoạn để sản
phẩm đạt chất lượng tốt nhất.
Tạ Kiều Oanh – CS_K29
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] Kiều Hữu Ảnh (1999), Vi sinh vật học công nghiệp, NXB Khoa học và Kỹ thuật.
[2] Bộ Y tế, Quy định về vệ sinh an toàn đối với bia hơi và rượu lên men độ cồn
thấp, số 3542.
[3] Công ty cổ phần rượu bia Đà Lạt, Hướng dẫn kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh.
[4] Trần Xuân Hiển (2007), Đánh giá chất lượng thực phẩm , Khoa Nông nghiệp &
TNTN.
[5] Phạm Thành Hổ (2005), Nhập môn Công nghệ Sinh học, NXB Giáo dục.
[6] Lê Thanh Mai, Nguyễn Thị Hiền, Phạm Thu Thuỷ, Nguyễn Thanh Hằng, Lê Thị
Lan Chi (2006), Các phương pháp phân tích ngành công nghệ lên men, NXB Khoa
học và kỹ thuật, Hà Nội.
[7] Lê Thị Mai (2005), Luận văn tốt nghiệp, Đại học Đà Lạt.
[8] Lương Đức Phẩm (1998), Công nghệ vi sinh vật học, NXB Nông nghiệp
[9] TCVN 7045:2002, Rượu vang – Quy định kỹ thuật.
[10] Trần Thị Thanh (2003), Công nghệ vi sinh, NXB Giáo dục.
[11] Trần Linh Thước (2008), Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực
phẩm và mĩ phẩm, NXB Giáo dục.
[12] Trung tâm Y tế dự phòng Lâm Đồng, Hướng dẫn kiểm nghiệm các chỉ tiêu vi
sinh và hoá lý của rượu vang.
[13] Đào Xuân Vinh (2008), Giáo trình các kỹ thuật kiểm nghiệm thực phẩm , Đại
học Đà Lạt.
Các website
[14] http://en.wikipedia.org
[15] http://namgioi.timnhanh.com
[16] http://www.medinet.hochiminhcity.gov.vn
[17] http://phacheruou.wordpress.com
[18] http://vi.wikipedia.org
[19] http://vietbao.vn/Suc-khoe
[20] http://www.vietnamnet.vn
[21] http://www.wineworld.vn
[22] http://www.wonderquest.com
Khoá luận tốt nghiệp
Phụ lục
PHỤ LỤC
1. Môi trường thạch dinh dưỡng
Cao thịt 5g Glucose 1g
Peptone 10g Agar 12 – 15g
NaCl 5g Nước cất 1000ml
. Đun sôi và khuấy đều cho tan. Phân phối vào ống nghiệm
C/15'. pH: 6.8 0.2± (15ml/ống). Hấp ướt ở 1210
2. Môi trường thạch Saboraud:
Glucose 20g Agar 10 – 15g
Peptone 10g Nước cất 1000ml
pH: 4.5 – 5.5. Phân phối vào ống nghiệm (15ml/ống). Khử trùng ở nhiệt độ
C/30'. 1100
3. Môi trường tăng sinh chọn lọc LSB (Lauryl Sulphate Broth)
Trypton 20g Lactose 5g
4
4
2.75g 2.75g K2HPO KH2PO
NaCl 5g Natri lauryl sulphate 0.1g
Nước cất 1000ml
pH: 6.8 0.2± . Trộn đều và khuấy cho tan. Phân phối vào ống nghiệm có chứa
C/15'. Môi trường LSB tổng hợp: 35.6g /l. ống Durham (10ml/ống). Hấp ở 1210
4. Canh trường mật bò BGBL 2% (Brilliant green 2% Bile Broth)
Peptone 10g Lactose 10g
Mật bò 20g Brilliant Green 0.0133g
Nước cất 1000ml
Hấp ở pH = 7.2. Phân phối vào ống nghiệm có ống Durham (5ml/ống).
C/20'. Môi trường tổng hợp: 40g/l. 1150
Tạ Kiều Oanh – CS_K29
Khoá luận tốt nghiệp
Phụ lục
5. Môi trường EMB (Eosin Methylrn Blue lactose agar)
Dipotassium 2g Peptone 10g
Lactose 5g Sucrose 5g
Eosin và Yellowish 0.4g Methyl blue 0.07g
Agar 13.5g Nước cất 1000ml
pH = 7.1. Phân phối vào ống nghiệm có ống Durham (20ml/ống) . Hấp khử
trùng ở 1210 C/15'. Môi trường tổng hợp: 36g/l.
6. Môi trường Indole
L-tryptophan 1g NaCl 1g
4
4
3.13g 0.27g K2HPO KH2PO
Nước cất 200ml
pH 7.2 0.2± . Hoà tan các thành phần. Phân phối vào ống nghiệm 13 x 100mm
C/15'. có nắp (1ml/ống). Nhiệt độ hấp là 1210
7. Môi trường MR – VP (Methyl Red Voges – Proskauer Broth)
4
Peptone 5g 5g KH2PO
D (+) Glucose 5g Nước cất 1000ml
pH 6.9 0.2± . Đun tan các thành phần. Phân phối vào ống nghiệm (5ml/ống).
Nhiệt độ hấp là 1210C/15'. Bảo quản 2 – 80 C cho tới khi sử dụng. Môi trường tổng
hợp: 17g/l.
8. Môi trường Simmon Citrate
4
4
1g 1g NH4H2PO K2HPO
3
NaCl 5g 2g Na2SO
4
MgSO 0.2g Bromothymol blue 0.08g
Agar 13g Nước cất 1000ml
pH 6.6 0.2± . Đun cho tan. Phân phối vào ống nghiệm (15ml/ống). Nhiệt độ hấp
C/15'. Môi trường tổng hợp: 22.3g/l. Đổ thạch nghiêng. 1210
Tạ Kiều Oanh – CS_K29
Khoá luận tốt nghiệp
Phụ lục
9. Môi trường nước peptone
Peptone 10g NaCl 10g
Nước cất 1000ml
pH 7.0 0.2± . Đun tan. Phân phối vào ống nghiệm (10ml/ống). Hấp 1210 C/15'.
10. Môi trường thạch thường
Peptone 10g Cao thịt 3g
Agar 12g NaCl 5g
Nước cất 1000ml
C/15'. pH 7.0 0.2± . Đun tan. Phân phối vào ống nghiệm (15ml/ống). Hấp 1210
11. Môi trường dextrose
Cao thịt 3g Peptone 10g
NaCl 5g 1000ml
C/15'. pH: 7.0 0.2± Nước cất . Đun tan. Phân phối vào ống nghiệm (10ml/ống). Hấp ở 1210
12. Môi trường TSTC (Staphylococcus Enrichment Broth)
Peptone từ thịt 8g Peptone từ casein 2g
Cao nấm men 1g Cao thịt 5g
Sodium pyruvate 10g Glycine 12g
Lithium chloride 5g Nước cất 1000ml
. Đun tan các thành phần. Phân phối vào ống nghiệm (10ml/ống).
C/15'. Môi trường tổng hợp: 55g/l. pH: 6.6 0.2± Nhiệt độ hấp 1210
13. Môi trường Chapman (Mannitol salt phenol – red agar)
Peptone 10g Cao thịt 1g
NaCl 75g D (-) Mannitol 10g
Đỏ phenol 0.025g Agar 12g
Nước cất 1000ml
Tạ Kiều Oanh – CS_K29
Khoá luận tốt nghiệp
Phụ lục
pH: 7.4 0.2±
. Đun tan các thành phần. Phân phối vào ống nghiệm (20ml/ống). Môi trường tổng hợp: 108g/l. Hấp để nguội ở 500C rồi cho 10ml dung dịch egg york vào. Hấp khử trùng ở 1210 C/15'. Đổ đĩa petri.
14. Môi trường Wilson – Blair cải tiến:
Cao thịt 5g Glucose 20g
Peptone 10g Agar 15g
NaCl 5g Nước cất 1000ml
pH: 7.7 0.2±
. Đun tan các thành phần. Phân phối vào ống nghiệm (20ml/ống). Thanh trùng ở 121 0C/15'. Trước khi sử dụng thì đem đun tan chảy rồi thêm vào 2ml
20% và 5 giọt phèn sắt amoni 5% (thao tác ở điều kiện vô trùng). dung dịch Na2SO3
15. Thuốc thử Methyl red
0.1g Methyl Red
300ml Ethanol 95%
500ml Nước cất
Hoà tan methyl red vào ethanol. Thêm nước cất vào cho đủ thể tích 500ml.
16. Thuốc thử Kowac’s
Paradimethyl aminobenzaldehyt 5g
75ml Cồn Amilic (hoặc izoamilic)
25ml HCl
Hoà Paradimethyl aminobenzaldehyt trong cồn Amilic, khi hoà tan cho dần
HCl vào. Nên đặt lọ dùng để pha thuốc thử trong 1 chậu nước lạnh. Trước khi cho acid
vào không được nút lọ thuốc thử bằng nút cao su vì một số loại cao su có thể hoà tan
trong cồn Amilic. Phải để thuốc thử trong chai nâu, đậy kín, bảo quản lạnh.
17. Dung dịch Crystal violet
Dung dịch A Dung dịch B
Crystal violet 20g Ammonium oxalate 8g
0
Ethanol 95 200ml Nước cất 800ml
Tạ Kiều Oanh – CS_K29
Khoá luận tốt nghiệp
Phụ lục
Trộn đều 2 dung dịch A và B lại với nhau, để yên 24h. Sau đó, đem lọc rồi để
vào chai nâu.
18. Dung dịch Lugol
Iod 20g
KI 100g
Nước cất 900ml
Hoà KI trong nước cất cho tan rồi thêm iod vào, định mức tới 1000ml.
19. Dung dịch Fuchsin
0
Fuchsin 1g
Ethanol 95 100ml
Nước cất 900ml
Hoà tan fuchsin trong ethanol. Sau đó thêm nước cất cho đủ 1000ml, lọc qua
giấy lọc, bảo quản trong chai nâu.
20. Cồn iod
0
100ml Ethanol 95
2 – 4ml Dung dịch iod 10%
21. Dung dịch acid acetic 5N
28.75ml Acid glacial acetic
71.25ml Nước cất
Đậy kín và bảo quản trong chai đen hoặc nâu.
22. Dung dịch αNaphthol
αNaphthol Acid acetic 5N
1g
200ml
Đậy kín và bảo quản trong chai đen hoặc nâu.
Tạ Kiều Oanh – CS_K29
Khoá luận tốt nghiệp
Phụ lục
23. Dung dịch Natri metabisunfit:
Hoà tan 15g Natri metabisunfit vào nước cất, cho thêm 70ml HCl đặc, thêm
nước cất cho đủ 1l.
24. Dung dịch phosphate – EDTA:
4
71.7g KH2PO
NaOH 42g
EDTA 4.5g
Hoà tan các chất trên, thêm nước cất cho đủ 1l.
25. Dung dịch Borat kiềm
) với 170g NaOH. Định mức nước cất tới 1l. Hoà 100g acid boric (H3BO3
Phụ lục 1: Phương pháp nhuộm gram.
Nhỏ mẫu thử lên lame kính, để khô, sau đó cố định bằng cồn và hơ nóng nhẹ.
Nhuộm bằng dung dịch crystal violet trong 1 – 2'.
Đổ hết thuốc nhuộm đi, nhỏ dung dịch lugol lên và để trong 1'. Rửa bằng nước,
nhúng vào cồn iod trong 30 – 40". Rửa bằng nước, nhuộm bổ sung bằng fuchsin loãng
trong 0.5 – 1'. Rửa, để khô và soi trên kính hiển vi.
Vi khuẩn gram (+) bắt màu tím, gram (-) bắt màu đỏ.
