Khóa luận tốt nghiệp Đại học: Phân lập, tuyển chọn vi nấm phân hủy xenlulo dưới tán rừng Thông tại Đại Lải Vĩnh Phúc

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM --------------------

SẦM VĂN ĐÔNG

PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN VI NẤM PHÂN HỦY XENLULO DƯỚI

TÁN RỪNG THÔNG TẠI ĐẠI LẢI, VĨNH PHÚC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy

Chuyên nghành : Quản lý tài nguyên rừng

Khoa : Lâm nghiệp

Khóa học : 2015 - 2019

Thái Nguyên, năm 2019

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM --------------------

SẦM VĂN ĐÔNG

PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN VI NẤM PHÂN HỦY XENLULO DƯỚI

TÁN RỪNG THÔNG TẠI ĐẠI LẢI, VĨNH PHÚC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy

Chuyên nghành : Quản lý tài nguyên rừng

Lớp : K46 - QLTNR

Khoa : Lâm nghiệp

Khóa học : 2015 - 2019

Giảng viên hướng dẫn: TS. Vũ Văn Định

ThS. Phạm Thu Hà

Thái Nguyên, năm 2019

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là đề tài nghiên cứu của riêng tôi, những số liệu

và kết quả trong khóa luận tốt nghiệp này là hoàn toàn trung thực, chưa hề

được sử dụng để bảo vệ một học vị nào.

Mọi sự giúp đỡ cho việc hoàn thành luận văn đều đã được cảm ơn. Các

thông tin, tài liệu trình bày trong luận văn này đã được chỉ rõ nguồn gốc.

Thái nguyên, tháng 5 năm 2019

Xác nhận của GVHD Người viết cam đoan

Đồng ý cho bảo vệ kết quả

trước hội đồng khoa học

Sầm Văn Đông

ii

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận này trước tiên tôi xin chân thành cảm ơn Ban

giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Lâm nghiệp, cảm ơn các thầy cô

giáo đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt quá trình học

tập và rèn luyện tại trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.

Tôi đặc biệt xin chân thành cảm ơn sự hướng dẫn tận tình, sự quan tâm

sâu sắc của thầy giáo TS. Vũ Văn Định, cô giáo ThS. Phạm Thu Hà đã

giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập để tôi hoàn thành khóa luận tố t

nghiệp này.

Cuối cùng tôi xin bày tỏ sự biết ơn tới gia đình, bạn bè và những người

thân đã quan tâm giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực tập.

Trong quá trình nghiên cứu do có những chủ quan và khách quan nên

khóa luận không tránh khỏi những thiếu xót và hạn chế. Tôi rất mong nhận

được sự đóng góp ý kiến của các thầy cô giáo và các sinh viên để tôi hoàn

thành khóa luận được tốt hơn.

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, tháng 5 năm 2019

Sinh viên

Sầm Văn Đông

iii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Một số VSV sản xuất cellulase ......................................................... 9

Bảng 4.1. Kết quả điều tra tầng cây cao rừng Thông khu vực Đại Lải, Vĩnh

Phúc ............................................................................................... 27

Bảng 4.2.Thành phần lớp cây bụi, thảm tươi khu vực Đại Lải Vĩnh Phúc .... 28

Bảng 4.3. Thành phần và khối lượng vật liệu cháy dưới rừng Thông ở Đại

Lải, Vĩnh Phúc .............................................................................. 29

Bảng 4.4: Các mẫu đất được thu thập tại các OTC ở Đại Lải ........................ 30

Bảng 4.5: Số chủng nấm phân lập được từ các mẫu đất ................................. 31

Bảng 4.6. Đặc điểm hình thái một số chủng Vi nấm phân lập được .............. 33

Bảng 4.7: Mức độ phân giải xenlulo của các chủng nấm ............................... 34

Bảng 4.8. Kết quả độ giảm khối lượng VLC .................................................. 37

iv

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1. Cơ chế tác dụng của xenlulo tới cellulose. ....................................... 6

Hình 3.1: Tủ đổ môi trường ............................................................................ 23

Hình 3.2: Kính hiển vi và Tủ định ôn ............................................................. 26

Hình 4.1. Vật liệu cháy trong rừng Thông tại Đại Lải .................................... 29

Hình 4.2: Một số chủng vi nấm phân lập được tại khu vực nghiên cứu ......... 32

Hình 4.3: Tỷ lệ các Vi nấm phân giải môi trường CMC. ............................... 35

Hình 4.4: Khả năng phân giải môi trường CMC của các chủng Vi nấm ........ 36

Hình 4.5: Một số chủng Nấm phân giải mạnh CMC ..................................... 36

Hình 4.6: Khả năng phân giải môi trường CMC của 1 số chủng Vi nấm. ..... 37

Hình 4.7: Chủng Vi nấm SSN 9 ...................................................................... 38

Hình 4.8: Chủng Vi nấm HN18 ...................................................................... 38

v

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... ii

DANH MỤC CÁC BẢNG............................................................................... iii

DANH MỤC CÁC HÌNH ................................................................................ iv

MỤC LỤC ......................................................................................................... v

PHẦN I. MỞ ĐẦU .......................................................................................... 1

1.1. Đặt vấn đề................................................................................................... 1

1.2. Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................... 2

1.3. Ý nghĩa của đề tài ....................................................................................... 3

1.3.1. Ý nghĩa khoa học .................................................................................... 3

1.3.2. Ý nghĩa trong học tập, thực tiễn .............................................................. 3

PHẦN 2. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU ....................................................... 4

2.1. Cơ sở khoa học ........................................................................................... 4 2.1.1. Tổng quan về Emzym celluase ............................................................... 4

2.1.2.Khả năng phân hủy các chất tự nhiên của vi sinh vật. ............................. 8

2.1.3. Nấm phân giải xenlulo ............................................................................ 9

2.2. Tổng quan về tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước ........................ 13

2.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới về vi sinh vật phân giải xenlulo .... 13 2.2.2. Nghiên cứu ở Việt Nam về vi sinh vật phân giải xenlulo ..................... 15

2.3. Tổng quan về khu vực nghiên cứu ........................................................... 18

PHẦN 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU ................................................................................................................ 19

3.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu .......................................... 19 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................ 19

3.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ......................................................... 19

3.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 19

3.2.1. Điều tra một số đặc điểm cấu trúc rừng Thông nơi tiến hành thu mẫu 19

3.2.2. Phân lập các chủng vi nấm có khả năng phân hủy xenlulo. ................. 19 3.2.3. Tuyển chọn các chủng vi nấm có khả năng phân hủy xenlulo. ............ 19

vi

3.2.4. Mô tả đặc điểm một số chủng vi nấm có khả năng phân hủy xenlulo cao 20 3.3. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 20

3.3.1. Điều tra một số đặc điểm cấu trúc rừng Thông nơi tiến hành thu mẫu 20

3.3.2 Phân lập các chủng vi nấm có khả năng phân hủy xenlulo ................... 20

3.3.3. Tuyển chọn các chủng vi nấm có khả năng phân hủy xenlulo ............. 23

PHẦN 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................... 27

4.1. Điều tra một số đặc điểm cấu trúc rừng Thông nơi tiến hành thu mẫu ... 27

4.1.1. Kết quả điều tra tầng cây cao ................................................................ 27

4.1.2. Kết quả nghiên cứu độ che phủ của tầng cây bụi, thảm tươi dưới tán rừng Thông tại khu vựcnghiên cứu. ................................................................ 27

4.1.3. Thành phần vật liệu cháy dưới tán rừng Thông ở khu vực ................... 28

4.2. Phân lập các chủng vi nấm từ mẫu đất ..................................................... 30

4.2.1. Kết quảthu thập mẫu ............................................................................. 30 4.2.2 Phân lập chủng nấm từ các mẫu đất thu được ....................................... 31

4.3. Kết quả tuyển chọn chủng vi nấm có khả năng phân giải xenlulo .......... 34

4.3.1 Kết quả xác định hoạt tính phân giải xenlulo của các chủng nấm ......... 34

4.3.2. Kết quả thí nghiệm đối với vật liệu cháy .............................................. 37

PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................... 39

5.1 Kết luận ..................................................................................................... 39

5.2. Kiến nghị .................................................................................................. 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 41

PHỤ LỤC

1

PHẦN I

MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề

Trong những năm gần đây, hiện tượng sa mạc hóa và cháy rừng ngày

càng tăng rõ rệt. Một trong những nguyên nhân cháy rừng đó là do biến đổi

khí hậu như rét đậm, rét hại làm gia tăng nhanh cành khô, lá rụng nằm trên

mặt đất dưới tán rừng lớn, mặt khácdo khô hạn kéo dài dẫn đến gia tăng

nhanh vật liệu cháy. Sử dụng vi sinh vật phân giải xenlulo có sẵn trong đất có

khả năng phân giải cành khô lá rụng trên mặt đất dưới tán rừng, làm giảm

nguy cơ cháy rừng và tăng độ phì cho đất.Vi sinh vật phân giải xenlulo có

nhiều loại khác nhau như vi khuẩn, xạ khuẩn, các loại nấm lớn và vi nấm.

Trên trái đất đa phần các vi nấm đều không thể nhìn thấy được bằng

mắt thường, chúng sống phần lớn ở trong đất, chất mùn xác sinh vật chết,

cộng sinh hoặc ký sinh trên cơ thể động thực vật và nấm khác. Vi nấm đóng

một vai trò quan trọng trong hệ sinh thái, chúng phân hủy các chất hữu cơ và

trong chu trình chuyển hóa, trao đổi vật chất. Nấm, vi nấm được ứng dụng

rộng rãi trong đời sống và sản xuất, nhiều loài vi nấm phân hủy xenlulo mạnh

như: Aspergilluschaetomium, Aspergillusfumigatus, Aspergillusflavus,

Curvularia, Fusarium, Memoniella, Phomo, Thielavia và Trichoderma…

chúng có tác dụng phân giải các chất hữu cơ dưới lớp thảm mục làm tăng các

chất hữu cơ, mùn khoáng trong đất có tác động tích cực đến thảm thực vật

rừng. Ngoài ra một số loài nấm có khả năng hạn chế một số loại bệnh trên cây

trồng, kích thích sinh trưởng cho cây tiêu biểu Trichoderma reesei,

Trichoderma viride. Nấm và vi khuẩn là những sinh vật phân hủy chính có

vai trọng đối với hệ sinh thái cạn trên toàn thế giới. Dựa theo tỉ lệ giữa số nấm

và số loài thực vật ở trong cùng một môi trường người ta ước tính giới Nấm

có khoảng 1,5 triệu loài. Khoảng 100.000 đã được nhà khoa học phát hiện và

2

miêu tả, tuy nhiên kích cỡ thực sự của tính đa dạng của giới nấm vẫn còn

nhiều bí ẩn.

Mỗi chất hữu cơ đều bị một nhóm vi sinh vật tương ứng phân huỷ một

phần hay toàn bộ, các sản phẩm phân huỷ này lại được các loài khác phân huỷ

tiếp, cứ như thế đến tận các chất vô cơ. Như vậy, vật chất luôn luôn được tuần

hoàn bởi hai loại quá trình đối lập nhau: sự tổng hợp chất hữu cơ từ chất vô

cơ, và phân huỷ chất hữu cơ thành chất vô cơ. Các quá trình phân huỷ này chủ

yếu do vi sinh vật thực hiện (nấm chiếm 50%) ở bất kỳ đâu có sự hiện diện

của chúng: trong đất, trong nước, trong cơ thể các sinh vật khác.

Có rất nhiều loại vi nấm khác nhau, mức độ và khả năng phân hủy

xenlulo cũng khác nhau, mỗi loại vi nấm đều có lợi ích và tác hại riêng của

mình, vi nấm rất phong phú nên việc nghiên cứu các loại vi nấm này là rất

quan trọng, việc tìm ra các vi nấm này sẽ giúp quá trình phân hủy xenlulo

trong tự nhiên diễn ra nhanh hơn góp phần phân hủy các chất thảm mục, tạo

chất dinh dưỡng cho cây rừng cũng như làm giảm thiểu một phần khả năng

cháy rừng.

Để nhận biết, phân lập và tuyển chọn được các loại vi nấm phân hủy

xenlulo cao dưới tán rừng thông nhằm phục vụ công tác nghiên cứu phát

triển những lợi ích của các loại vi nấm này tôi thực hiện đề tài: “Phân lập,

tuyển chọn vi nấm phân hủy xenlulo dưới tán rừng Thông tại Đại Lải

Vĩnh Phúc”.

Trên cơ sở phân tích các mẫu, số liệu thu được tiến hành nhận biết và

tuyển chọn được một số chủng vi nấm có khả năng phân hủy xenlulo dưới tán

rừng Thông.

1.2. Mục tiêu nghiên cứu

- Phân lập, tuyển chọn được một số chủng vi nấm có khả năng phân

giải xenlulo dưới tán rừng Thông.

3

- Khảo sát một số đặc tính sinh học để phục vụ nuôi cấy vi nấm có hiệu

lực cao tạo ra các chế phẩm sinh học phân hủy nhanh xenlulo dưới rừng thông

1.3. Ý nghĩa của đề tài

1.3.1. Ý nghĩa khoa học

- Là cơ sở khoa học để tạo chế phẩm sinh học từ một số chủng vi nấm

nhằm phân hủy nhanh xenlulo dưới tán rừng Thông.

1.3.2. Ý nghĩa trong học tập, thực tiễn

- Góp phần xây dựng cơ sở khoa học tạo ra các chế phẩm sinh học từ

các chủng vi sinh vật phân hủy nhanh xenlulo làm giảm nguy cơ cháy rừng

cho các diện tích rừng thông ở Đại Lải nói riêng và Việt Nam nói chung.

- Giúp sinh viên làm quen với công tác nghiên cứu khoa học và tăng

các kỹ năng thực hành trong phòng thí nghiệm và ngoài hiện trường.

- Giúp chúng ta hiểu thêm được tầm quan trọng của vi nấm nói riêng

cũng như vi sinh vật nói chung.

- Trang bị cho sinh viên những kiến thức thực tế, những kinh nghiệm

và ý thức làm việc trước khi ra trường, là cơ sở để sinh viên thực hiện tốt

khóa luận tốt nghiệp.

4

PHẦN 2

TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU

2.1. Cơ sở khoa học

Vi nấm phân giải xenlulo để sản xuất chế phẩm ứng dụng có hiệu quả

cao đối với một số loại cây trồng trong lĩnh vực nông lâm nghiệp, giúp cây

trồng sinh trưởng và phát triển tốt, hiệu quả về mặt kinh tế và bảo vệ được

môi trường sinh thái và tăng hàm lượng dinh dưỡng (N, P, K). Sử dụng chế

phẩm sinh học phân hủy Xenlulo, giúp quá trình phân giải xenlulo diễn ra

nhanh hơn. Do vậy đề tài thực hiệnrất cần thiết có ý nghĩa cả về lý luận và

thực tiễn.

2.1.1. Tổng quan về Emzym celluase

Xenlulo là hợp chất cao phân tử được trùng hợp (polyme hóa) từ các

gốc β-Dglucose bằng cầu nối β-1,4-glycosid nhờ vào khả năng tự dưỡng dưới

ánh sáng của thực vật. Vì vậy, xenlulo là hợp chất phổ biến nhất trong tự

nhiên. Xenlulo có cấu trúc mạch thẳng dạng sợi rất bền, khó bị phân hủy.

Xenlulo là chất hữu cơ khó phân hủy. Người và hầu hết động vật không

có khả năng phân hủy cellulose. Do đó, khi thực vật chết hoặc con người thải

các sản phẩm hữu cơ có nguồn gốc thực vật đã để lại trong môi trường lượng

lớn rác thải hữu cơ. Tuy nhiên nhiều chủng vi sinh vật bao gồm nấm, vi khuẩn

và xạ khuẩn có khả năng phân hủy xenlulo thành các sản phẩm dễ phân hủy

nhờ enzyme cellulase (Trịnh Đình khả và cộng sự, 2007) [ 9]

Cellulase là phức hệ enzyme thủy phân xenlulo tạo thành các phân tử

đường β-glucose. Theo nghiên cứu của một số tác giả, xenlulo bị phân hủy

dưới tác dụng hiệp đồng của phức hệ cellulase bao gồm ba enzyme là Exo-β-

(1,4)-glucanase hay enzyme C1, Endo-β-glucanase hay endocellulase còn gọi

là enzyme CMC–ase hay Cx và β-(1,4)-glucosidase hay cellobioase:

Exo-1,4-gluconase giải phóng cellobiose hoặc glucose từ đầu không

khử của cellulose, tác dụng yếu lên CMC nhưng tác dụng mạnh lên xenlulo và

5

định hình hoặc xenlulo đã bị phân giải một phần. Tác dụng lên xenlulo kết

tinh không rõ ràng nhưng khi có một endoglucanase thì có tác dụng hiệp đồng

rõ rệt, enzyme tác dụng mạnh lên cellodextrin. Enzyme này hoạt động mạnh ở

vùng vô định hình nhưng lại hoạt động yếu ở vùng kết tinh của cellulose.

β-1,4-glucosidase thủy phân cellobiose và các cellodextrin khác hòa tan

trong nước sinh ra, chúng có hoạt tính cao trên cellobiase, còn cellodextrin thì

hoạt tinh thấp và giảm khi chiều dài của chuỗi tăng lên.

2.1.1.1 Phân loại cellulase

Cellulase là phức hệ enzyme có tác dụng thủy phân xenlulo thông qua

việc thủy phân liên kết β-1,4-glycoside tạo thành các phân tử đường β-

glucose.

Dựa vào đặc điểm của cơ chất và cơ chế phân cắt, enzyme cellulase

được chia thành ba loại: - 1,4-  -D-glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) -

1,4-  -D-glucan 4-glucanohydrolase (EC 3.2.1.4) -  -D-glucoside

glucohydrolase (EC 3.2.1.21) Các enzyme này được tìm thấy trong vi khuẩn

sống trong dạ dày cỏ bò và mối và trong một số nấm như Trichoderma,

Aspergillus…

Endo-1,4-glucanase (hay CMC-ase, Cx, EC 3.2.1.4) thủy phân liên kết ß-

1,4-glucoside và tác động vào chuỗi xenlulo một cách tùy tiện, sản phẩm của

quá trình thủy phân là cellobiose và glucose. Do thủy phân CMC hoặc xenlulo

theo kiểu tùy tiện nên endo-1,4-glucanase làm giảm nhanh chiều dài chuỗi

xenlulo và tăng chậm các nhóm khử, enzyme tác dụng mạnh lên cellodextrin.

Enzyme này hoạt động mạnh ở vùng vô định hình nhưng lại hoạt động yếu ở

vùng kết tinh của cellulose.

Exo-1,4-gluconase (hay cellobiohydrolase, C1 EC 3.2.1.91) giải phóng

cellobiose hoặc glucose từ đầu không khử của cellulose, tác dụng yếu lên

CMC nhưng tác dụng mạnh lên xenlulo vô định hình hoặc xenlulo đã bị phân

6

giải một phần. Tác dụng lên xenlulo kết tinh không rõ nhưng khi có mặt

endoglucanase thì có tác dụng hiệp đồng rõ rệt.

ß-1,4-glucosidase (hay cellobiase, EC 3.2.1.21) thủy phân cellobiose và

các cellodextrin khác hòa tan trong nước sinh ra, chúng có hoạt tính cao trên

cellobiase, còn cellodextrin thì hoạt tính thấp và giảm khi chiều dài của chuỗi

tăng lên. Chức năng của ß-glucosidase có lẽ là điều chỉnh sự tích lũy các chất

cảm ứng của cellulase.

2.1.1.2. Cơ chế tác dụng của enzyme cellulase

Cellulase là một hệ enzyme phức tạp xúc tác sự thủy phân xenlulo thành

cellobiose và cuối cùng thành glucose.

Sự phân giải xenlulo dưới tác dụng của hệ enzyme cellulase xảy ra theo

3 giai đoạn chủ yếu sau:

Trong giai đoạn thứ nhất, dưới tác dụng của tác nhân C1, xenlulo bị thủy

phân thành xenlulo hòa tan. Trong giai đoạn thứ hai, xenlulo hòa tan sẽ bị

thủy phân dưới tác dụng xúc tác của hệ enzyme Cx tạo thành đường

cellobiose.

Ở giai đoạn cuối cùng, dưới tác dụng của enzyme ß-1,4-glucosidase (hay

cellobiase, EC 3.2.1.21), cellobiose bị thủy phân thành glucose.

Hình 2.1. Cơ chế tác dụng của xenlulo tới cellulose.

7

Các loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulase trong điều kiện tự nhiên thường bị ảnh hưởng bởi tác động nhiều mặt của các yếu tố ngoại cảnh nên có loài phát triển rất mạnh, có loài phát triển yếu. Chính vì thế, việc phân hủy xenlulo trong tự nhiên được tiến hành không đồng bộ, xảy ra rất chậm. 2.1.1.3. Ứng dụng của emzym cellulose

Hiện nay, enzyme cellulase được ứng dụng mạnh mẽ trong các ngành công nghiệp khác nhau như: công nghiệp thực phẩm, công nghiệp sản xuất bia rượu, công nghiệp chế biến thức ăn gia súc, công nghiệp dệt, sản xuất bột giặt, sản xuất giấy, trong nông nghiệp ...

Trong công nghiệp sản xuất bột giấy và giấy, bổ sung các loại enzyme trong khâu nghiền bột, tẩy trắng và xeo giấy có vai trò rất quan trọng. Nguyên liệu ban đầu chứa hàm lượng cao các chất khó tan là lignin và một phần hemicellulose, nên trong quá trình nghiền để tách riêng các sợi gỗ thành bột mịn gặp nhiều khó khăn.

Trong công nghiệp xử lý rác thải và sản xuất chế phẩm vi sinh. Rác thải là nguồn chính gây nên ô nhiễm môi trường dẫn tới mất cân bằng sinh thái và phá hủy môi trường sống, đe dọa tới sức khỏe và cuộc sống con người. Thành phần hữu cơ chính trong rác thải là cellulose, nên việc sử dụng công nghệ vi sinh trong xử lý rác thải cải thiện môi trường rất có hiệu quả. Enzyme này có khả năng thủy phân chất thải chứa cellulose, chuyển hoá các hợp chất kiểu lignoxenlulo và xenlulo trong rác thải tạo nên nguồn năng lượng thông qua các sản phẩm đường, ethanol, khí sinh học hay các các sản phẩm giàu năng lượng khác.

Trong công đoạn nghiền bột giấy, bổ sung endoglucanase sẽ làm thay đổi nhẹ cấu hình của sợi cellulose, tăng khả năng nghiền và tiết kiệm khoảng 20% năng lượng cho quá trình nghiền cơ học. Trước khi nghiền hóa học, gỗ được xử lý với endoglucanase và hỗn hợp các enzyme hemicellulase, pectinase sẽ làm tăng khả năng khuếch tán hóa chất vào phía trong gỗ và hiệu quả khử lignin. Trong công nghệ tái chế giấy, các loại giấy thải cần được tẩy mực trước khi sản xuất các loại giấy in, giấy viết. Endoglucanase và

8

hemicellulase đã được dùng để tẩy trắng mực in trên giấy. Enzyme cellulase được bổ sung vào nhiều giai đoạn khác nhau trong quá trình sản xuất giấy.

Trong công nghiệp dệt, người ta sử dụng enzyme cellulase để giữ màu vải sáng, bền và không bị sờn cũ. Đối với vải jean, cellulase được dùng để làm mềm vải jean và tạo ra các vệt “stone washed”. Trước đây các vệt “stone washed” được làm thủ công bằng cách dùng đá bọt chà lên vải jean, làm mất lớp kiềm trên bề mặt vải và tạo ra những sợi chỉ trắng. Hiện nay người ta sử dụng enzyme cellulase trong giai đoạn giặt vải jean thay cho việc sử dụng đá bọt. Enzyme cellulase chỉ phân hủy theo các vết kiềm trên vải jean đã nhuộm màu để tạo ra các vệt “stone washed”. Các vệt “stone washed” được tạo ra bằng phương pháp này bền hơn bằng cách dùng đá bọt. Ngoài ra, người ta có thể tăng độ đậm nhạt của các vệt này bằng cách tăng hay giảm hàm lượng cellulase sử dụng trong giai đoạn giặt.

Ngoài việc bổ sung trực tiếp vi sinh vật vào bể ủ để xử lý rác thải thì việc tạo ra các chế phẩm vi sinh có chứa các vi sinh vật sinh ra cellulase đã được nghiên cứu và sản xuất. 2.1.2.Khả năng phân hủy các chất tự nhiên của vi sinh vật.

Các chất hữu cơ sơ cấp - do thực vật tổng hợp từ CO2 liên tục hàng triệu năm nay, và các chất hữu cơ thứ cấp bắt nguồn từ đó, luôn luôn được phân huỷ song song và gần như cân bằng với sự tạo ra chúng, nên không bị tích tụ trên trái đất. Chỉ một phần nhỏ của sinh khối thực vật còn được giữ lại dưới dạng các hợp chất cacbon có tính khử mạnh như dầu mỏ, khí mỏ và than đá, trong điều kiện kị khí. Còn trong điều kiện có không khí thì mọi chất được các cơ thể sống tổng hợp nên đều có khả năng bị phân huỷ nhờ vi sinh vật.

Mỗi chất hữu cơ đều bị một nhóm vi sinh vật tương ứng phân huỷ một phần hay toàn bộ, các sản phẩm phân huỷ này lại được các loài khác phân huỷ tiếp, cứ như thế đến tận các chất vô cơ. Như vậy vật chất luôn luôn được tuần hoàn bởi hai loại quá trình đối lập nhau: sự tổng hợp chất hữu cơ từ chất vô cơ, và phân huỷ chất hữu cơ thành chất vô cơ. Các quá trình phân huỷ này chủ yếu do vi sinh vật thực hiện, ở bất kỳ đâu có sự hiện diện của chúng: trong đất, trong nước, trong cơ thể các sinh vật khác. Riêng trong đất, sự phân huỷ

9

chất hữu cơ rơi vào đó do nhiều nhóm vi sinh vật và nhiều động vật nhỏ tham gia, tạo thành các mạng lưới dinh dưỡng.

Vi sinh vật phân huỷ các chất hữu cơ tự nhiên để thu nhận vật chất (nguồn cacbon, nguồn nitơ…) và năng lượng, cho sinh trưởng của chúng. Trải qua quá trình tiến hoá nhiều tỷ năm, chúng đã hoàn thiện được nhiều con đường phân huỷ đối với nhiều loại chất khác nhau.Vi sinh vật phân giải xenlulo có khả năng phân giải cành khô lá rụng trên mặt đất dưới tán rừng, làm giảm nguy cơ cháy rừng, tăng độ phì cho đất. Kết quả là ngày nay, không có một chất tự nhiên hữu cơ nào không bị vi sinh vật phân huỷ tạo nên một chu trình tuần hoàn khép kín. 2.1.3. Nấm phân giải xenlulo

Một số VSV đã được các nhà khoa học nghiên cứu nhiều về khả năng

phân giải xenlulo được thể hiện bảng 2.1 .

Bảng 2.1. Một số VSV sản xuất cellulase

Nấm sợi Xạ khuẩn Vi khuẩn

Aspergillus niger A.oryzae A.terreus A.syndovii A. flavus Fusarium culmorum Fusarium oxysporum Mucor pusilus Pen. notatum Penicillium spp Trichoderma lignorum Trichoderma reesei Trichoderma viride Trichoderma konongi Preudomonas Fluorescens B.megaterium B.mensenteroides Clostridium sp. Acetobacter xylinum Vi khuẩn dạ cỏ Ruminoccus albus Ruminobacter parum Bacteroides Amylophillus sp. Clos.butiricum Clos.locheheadil Cellulosemonas Actinomyces aureus Act.cellulose Act.diastaticus Act. roseus Act.griseus Act.melamocylas Act.coelicolor Act.candidus Act.chromogenes Act. hygroscopicus Act.griseofulvin Act.ochroleucus Act.thermofulcus Act.xanthostrums Thermonospora curvata

10

Xenlulo là một polime hữu cơ phổ biến nhất, tương ứng khoảng

1,5x1012 tấn trên tổng số sinh khối thực vật được sản xuất ra hàng năm thông

qua quang hợp đặc biệt đặc biệt là ở những vùng nhiệt đới và chúng được coi

là nguồn vật liệu vô tận cho các nghành sản xuất khác nhau như công nghiệp

chế biến giấy,công nghiệp chế biến thực phẩm, nhiên liệu sinh học cũng như

ứng dụng trong lĩnh vực Nông-Lâm nghiệp. Hệ VSV có khả năng phân hủy

xenlulo bao gồm nấm,vi khuẩn và xạ khuẩn Giới Nấm (tên khoa học: Fungi)

bao gồm những sinh vật nhân chuẩn dị dưỡng có thành tế

bào bằng kitin (chitin). Phần lớn nấm phát triển dưới dạng các sợi đa

bào được gọi là sợi nấm (hyphae) tạo nên hệ sợi (mycelium), một số nấm

khác lại phát triển dưới dạng đơn bào. Quá trình sinh sản (hữu tính hoặc vô

tính) của nấm thường qua bào tử, được tạo ra trên những cấu trúc đặc biệt

hay quả thể.Một số loài lại mất khả năng tạo nên những cấu trúc sinh sản đặc

biệt và nhân lên qua hình thức sinh sản sinh dưỡng.

Vậy những loài nấm nào là Vi nấm (Microfungi)? Đó là tất cả các nấm

không có mũ nấm (quả thể, fruit-body) có thể thấy rõ bằng mắt thường.Người

ta gọi những nấm có mũ nấm là các nấm bậc cao. Tuy nhiên khi nuôi cấy sợi

nấm của các nấm bậc cao để nghiên cứu hoặc để sản xuất sinh khối thì chúng

cũng được coi như vi nấm và là đối tượng nghiên cứu của ngành vi sinh vật

(giống như các loài vi nấm khác). Để nghiên cứu vi nấm bắt buộc phải quan

sát dưới kính hiển vi và phải nuôi cấy trong các điều kiện vô khuẩn. Căn cứ

vào hình thái người ta chia vi nấm thành hai nhóm khác nhau: nhóm Nấm

men (Yeast) và nhóm Nấm sợi (Filamentous fungi). Chúng chỉ khác nhau về

hình thái chứ không phải là những taxon phân loại riêng biệt.Nhiều nấm men

cũng có dạng sợi và rất khó phân biệt với nấm sợi.

Các loài nấm mốc có khả năng sinh nhiều xenlulo thuộc các giống

Allernaria, Trichoderma, Myrothecium, Aspergillus, Penicillium...Chúng

được tách ra từ đất xung quanh vùng rễ cây, từ các mẫu thực vật, từ than bùn

11

và các nguồn tự nhiên khác có quá trình phân hủy cellulose. Ngoài ra các

chủng nấm lớn thuộc lớp Basidomycetes cũng được đánh giá có khả năng sinh

xenlulo mạnh.

Có rất nhiều loài nấm phân giải xenlulo mạnh trong đó nấm có hoạt

tính phân giải xenlulo đáng chú ý Trichoderma bao gồm hầu hết các loại sống

hoại sinh trong đất, những đại diện tiêu biểu Trichoderma reesei,

Trichoderma viride chúng phân hủy tàn dư thực vật trong đất góp phần

chuyển hóa lượng hữu cơ khổng lỗ thành các chất dễ tiêu có lợi cho thực vật

và tạo lớp mùn cho đất. Một số loài nấm khác cũng có hoạt tính phân giải

xenlulo khá cao là Aspergillus niger, A.oryzae, Fusarium solani,

Penicillium pinophinum và Sclerotium rolfsii. Các loài nấm khác nhau thì

khả năng phân giải xenlulo mạnh yếu khác nhau. Để cho quá trình phân

hủy xenlulo diễn ra nhanh hơn người ta thường bổ sung thêm các chất dễ

đồng hóa như glucoza, xenlobioza vào môi trường nuôi cấy có thể làm

cho pH của môi trường giảm nhanh chóng và do đó hoạt tính xenlulaza

của các chủng nấm Trichoderma giảm.

Thường các loài nấm phân giải xenlulo ở độ ẩm cao và nhiệt độ: 20-

300C, pH trong khoảng 3,5-3,6. Các loài nấm ưa nhiệt sinh trưởng và phân

giải nhanh nhưng có hoạt tính xenlulo trong dịch nuôi cấy lại thấp.

Nấm không có khả năng ăn các chất dinh dưỡng nhưng lại tiết ra

enzym vào môi trường xung quanh để phân hủy các phân tử phức tạp thành

các chất hòa tan để nấm có thể hấp thu được. Nhiều nấm sống hoại sinh, có

nghĩa là chúng dinh dưỡng trên phần còn lại của chất hữu cơ đã chết. Số khác

là những sinh vật ký sinh và kiếm thức ăn trực tiếp từ các cơ thể sống trong

các mô của vật chủ sống, nấm ký sinh tùy ý có khả năng sống hoại sinh và

thường gây chất các vật chủ của chúng và gồm nhiều nấm bệnh quan trọng

của thực vật.

12

Vi nấm đóng vai trò rất quan trọng trong hệ sinh thái, chúng phân hủy

các vật chất hữu cơ và không thể thiếu được trong chu trình chuyển hóa và

trao đổi vật chất. Một số loài nấm có thể nhận thấy được khi ở dạng quả thể

như nấm lớn và nấm mốc. Nấm được ứng dụng rất rộng rãi trong đời sống lẫn

sản xuất. Nhiều loài được sử dụng trong công nghệ thực phẩm, sử dụng làm

thức ăn hoặc trong quá trình lên men. Nấm còn được dùng để sản xuất chất

kháng sinh, hoóc môn trong y học và nhiều loại enzym.Tuy vậy, nhiều loại

nấm lại có chứa các chất hoạt động sinh học được gọi là mycotoxin,

như ancaloit và polyketit-là những chất độc đối với động vật lẫn con người.

Một số loại nấm được sử dụng để kích thích hoặc dùng trong các nghi lễ

truyền thống với vai trò tác động lên trí tuệ và hành vi của con người. Vài loại

nấm có thể gây ra các chứng bệnh cho con người và động vật, cũng như bệnh

dịch cho cây trồng, mùa màng và có thể gây tác động lớn lên an ninh lương

thực và kinh tế.

Tất cả những sinh vật nhỏ như vi nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn tạo thành thế

giới vi sinh vật vô cùng phong phú, chúng phân bố ở khắp mọi nơi trên hành

tinh chúng ta. Chúng tham gia vào các quá trình chuyển hoá vật chất, khép

kín các vòng tuần hoàn vật chất trong thiên nhiên, làm cho sự cân bằng vật

chất được ổn định và từ đó bảo vệ sự cân bằng sinh thái. Người ta có thể sử

dụng nhiều nhóm vi sinh vật vào mục đích bảo vệ môi trường. Ví dụ như

nhóm vi sinh vật phân huỷ chất hữu cơ trong rác thải, nhóm vi sinh vật phân

huỷ các chất độc hại thành chất không độc. Trong công nghệ xử lý chất thải

bằng phương pháp sinh học có sử dụng rất nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau.

Vi sinh vật còn được ứng dụng trong nhiều ngành sản xuất như chế tạo phân

bón sinh học, thuốc bảo vệ thực vật sinh học ... nhằm mục đích thay thế các

chất hoá học độc hại với môi trường. Sự phân bố rộng rãi của vi sinh vật trong

các môi trường tự nhiên đóng vai trò quyết định vào khả năng tự làm sạch

môi trường đó, cùng với những yếu tố lý học, hoá học và sinh học khác. Vi

13

sinh vật đóng vai trò quan trọng trong việc làm nên khả năng chịu tải của môi

trường, đó chính là khả năng tự làm sạch môi trường, giữ cho môi trường tự

nhiên không bị ô nhiễm.

2.2. Tổng quan về tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

2.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới về vi sinh vật phân giải xenlulo

Nghiên cứu và ứng dụng của xenlulo bắt đầu từ năm 1950. Cuối thế kỉ

XIX đã có rất nhiều tác giả nghiên cứu về khả năng tổng hợp xenlulo từ VSV,

một số nghiên cứu xenlulo từ nấm của một số tác giả như Trichoderma reseii

(Ogaw, và cộng sự 1991) [18], Schizophillum commune (wilick & Seligy

1985) [21]. Năm 2000 Mazadza và cộng sự [17], đã nghiên cứu khả năng tổng

hợp xenlulo từ các loại nấm có tính đặc hiệu cao bao gồm: phức hệ 3 ezim

endoglucanase, cellobihydrolase và β-glucosidase thủy phân hoàn toàn

xenlulose.

Do xenlulo có nhiều ứng dụng cho nên có rất nhiều nghiên cứu về

xenlulo như: nghiên cứu về các tính chất hóa lí của chúng như xác định khố

lượng phân tử của Macarron cộng sự, (1993) [14], Henrikasson và cộng sự

(1999) [11], xác định nhiệt độ tối ưu của Isabel và cộng sự (1992) [12]

Theo Sivakumaran (2014) [20], phân lập được 21 chủng từ các nguồn

vật liệu khác nhau như mùn cưa, lá rụng…. Trong đó lựa chọn loài nấm có

khả năng phân giải xenlulo bằng phương pháp giấy lọc và phương pháp dùng

thuốc thử DNS.Kết quả cho thấy Helminthosporium sp. và Cladosporium sp.

là hai loài có khả năng phân giải mạnh nhất sau đó là Trichoderma sp và

Aspergillus sp. Trong một nghiên cứu khác trên rơm rạ, thu được 25 loài khác

nhau thuộc ngành Ascomycetes và Basidiomycetes, trong đó loài

Trichoderma harzianum có khả năng phân giải xenlulo tốt nhất .

Nấm phân giải xenlulo mạnh như các loài Aspergilluschaetomium,

Aspergillusfumigatus, Aspergillusflavus, Curvularia, Fusarium, Memoniella,

Phomo, Thielavia và Trichoderma. Những chủng này đã được nghiên cứu

14

rộng rãi để sản xuất các enzyme ngoại bào có khả năng phân giải xenlulo đó

là endoglucanases, exoglucanases và cellobiase là những chất có thể chuyển

đổi xenlulo thành gluco (Maheshwari DK, Gohade S và Jahan H (1990) [15].

Theo nghiên cứu của Makeshkumar và P.U. Mahalingam (2011) [16], 6

loại nấm bệnh có khả năng phân giải xenlulo (Fusarium sp.,

Aspergillusfumigatus, Cladosporium sp., Aspergillusflavus, Pyricularia sp. và

Nigrospora sp.) đã được phân lập và thử nghiệm các chủng nấm phân giải

xenlulo chiếu qua tia UV kết quả cho thấy nấm Fusarium phát triển tốt nhất

và có quá trình phân giải xenlulo hiệu quả nhất. Do đó nghiên cứu đã đề xuất

sử dụng dòng nấm đột biến này để ủ chất thải hữu cơ khác nhau. Bên cạnh đó

một số nhóm nấm khác như Trichoderma koningii, Sporotrichum

thermophila, Myceliophthora thermophila cũng được nghiên cứu cho thấy có

khả năng phân giải xenlulo tốt Reddy.BR, Narasimha G và Babu GVAK

(1998) [19].

Lamot, Voets (1978) [13] đã dùng 7 chủng vi sinh vật phân giải

xenluloza để phân hủy xenlophan như: Aspergillus.sp, Penicillium.sp, 2 loài

Chaetomium, 1 loài Sclerotium rolfsii, 2 loài xạ khuẩn Streptomyces. Tác giả

nhận thấy nếu để riêng rẽ từng loại vi sinh vật tác dụng thì sự phân giải hầu

như không diễn ra, còn khi dùng hỗn hợp các chủng nói trên thì sự phận giả

xenlophan bị phân hủy. Sau khi dùng 7 chủng trong thời gian 100 ngày 85%

xenlophan bị phân hủy sản phẩm cuối cùng được dùng làm phân bón bao

gồm: 30% protein, 60% đường hòa tan, 10% các gốc còn lại.

Tại New Delhi- Ấn Độ Gaur và Bhardwaj (1987) [10] đã phân lập và

tuyển chọn được rất nhiều chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy xenluloza.

Sau đó tác giả đã sử dụng chủng nấm Trichurus spiralis, Trichoderma viride,

Paecilomyces fusisporus, Aspergillus. sp để đưa vào đống ủ (rơm rạ, lá khô)

kết quả cho thấy: hàm lượng C hữu cơ giảm từ 48% xuống 25% trong vòng 1

tháng đầu tiên của quá trình ủ và chỉ trong vòng 8-10 tuần rơm rạ đã phân hủy

15

hoàn toàn thành một loại phân hữu cơ có chất lượng tốt. Trong phân chứa

khoáng 1,7%N và tỷ lệ C/N là 12:3.

Ở Trung Quốc có nhiều nghiên cứu về việc phân lập và ứng dụng chúng

trong việc phân giải xenlulo. Wen-Jing Lu và cộng sự (2005) [22] đã phân lập

được 5 chủng vi khuẩn ưa ẩm phân giải xenluloza cao từ phế thải rau quả và

thân lá hoa thuộc giống Bacillus, Halobacillus, Aeromicrobium,

Brevibacterium. Bổ sung 1% sinh khối các chủng vi sinh vật này để ủ phế phụ

phẩm rau quả và thân lá hoa đã làm tăng quá trình phân hủy sinh học các

nguyên liệu lên 23,64% so với đống ủ không bổ sung thêm vi sinh vật, do đó

rút ngắn thời gian ủ và tăng chất lượng của phân ủ.

2.2.2. Nghiên cứu ở Việt Nam về vi sinh vật phân giải xenlulo

Trong những năm gần đây Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu về VSV

phân hủy xenlulose và xenlulazeĐặng Minh Hằng (1999) [2]. Hoàng Quốc

Khánh và cộng sự (2003) [3].Trịnh Đình Khá và cộng sự (2007) [9]. Những

nghiên cứu này chủ yếu đề cập vấn đề phân lập các chủng VSV và đánh giá

ảnh hưởng một số yếu tố môi trường đến khả năng sinh tổng hợp xenlulose

như: tuyển chọn, nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường lên khả

năng sinh tổng hợp xenlulose và tinh sạch, đánh giá tính chất hóa lý của

xenlulose từ chủng penicillium sp. DTQ-HK1 Trịnh Đình Khá và cộng sự

(2007) [9]

Hoàng Quốc Khánh và cộng sự(2003)Tuyển chọn và nghiên cứu ảnh

hưởng của các yếu tố môi trường lên khả năng sinh tổng hợp xenlulose của

chủng penicilium SP DTQ-HK1[3]. Nghiên cứu từ các mẫu rác thải, đất, rơm,

mục, giấy ăn và rác thải nhà máy giấy đã phân lập được 49 chủng VSV trong

đó có 36 chủng có hoạt tính xenlulase. Ba chủng nấm sợi RM1.1, RM1.5, và

HK1 có khả năng phân hủy xenlulose mạnh nhất đã được tuyển chọn để xác

định tên loài. So sánh trình tự 28s rRNA chủng RM1.1 có độ tương đồng

100% so với Aspergillus fumigatus ATCC 16907. Chủng RM1.5 và HK1 lần

16

lượt có độ tương đồng so với 1 số đại diện củ chi Emericella (99,8%) và chi

Penicillium (99,6%). Trình tự 28s RNA của các chủng này đã được đăng kí

trong Genbak với mã số EFO12766 (Aspergillus fumigatus DTQR-M1.1).

EFO25927 (Emericella sp DTQ-RM1.5) và EFO87978 (Penecilium sp TDQ-

HK1). Chủng penicilium sp TDQ-HK1 sinh tổng hợp xenlulose mạnh nhất

(1,58 U/ml) sau 120h lên men chìm ở pH tối ưu 5,5 nhiệt độ tối ưu 30°C, nuôi

lắc 200 vòng/phút trong môi trường CPy với nồng cơ chất cảm ứng bột giấy

tối ưu 0,5%. Nguồn nitrogen và cacrbon làm tăng khả năng sinh tổng hợp

xenlulose của chủng TDQ-HK1 là bột đậu tương và rơm.

Trịnh Đình Khá và cộng sự (2007) [9] “Nghiên cứu phân lập tuyển

chọn một số chủng VSV có khả năng phân hủy xenluose từ rong giấy tại Hòn

Chồng- Nha Trang” để tuyển chọn các chủng VSV có khả năng sinh

xenlulase thủy phân xenlulose, họ tiến hành phân lập VSV từ các mẫu rong

giấy đã mục thu tại bãi biển Hòn Chồng- Nha Trang, sử dụng môi trường

thạch thường để phân lập vi khuẩn, môi trường capek để phân lập nấm mốc

và môi trường ISP4 để phân lập xạ khuẩn, sơ tuyển VSV bằng phương pháp

đặt thỏi thạch trên môi trường CMC và xác định hoạt tính xenlulose bằng

cách đo vòng thủy phân trên CMC. Kết quả phân lập được 16 chủng VSV có

khả năng phân giải xenlulose, trong đó 14 VSV hoạt tính xenlulose cao bao

gồm: 7 chủng vi khuẩn, 4 chủng nấm mốc, và 4 chủng xạ khuẩn. Với 4 chủng

VSV có vòng thủy phân xenlulose mạnh nhất là: VK4, N3, N4, và XK4; 2

chủng nấm sợi N3 và N4 là hai chủng phân lập được từ rong giấy đã ủ mục tại

bãi biển Hòn Chông- Nha Trang là những chủng VSV tổng hợp xenlulose

mạnh nhất.

Theo Nguyễn Thị Thúy Nga (2010) [6]. Từ 30 mẫu đất thu thập từ đất

trống đồi núi trọc đã phân lập được 25 chủng vi sinh vật có khả năng phân

giải xenlulo, trong đó có 10 chủng vi sinh vật có khả nănng phân giải xenlulo

mạnh, có đường kính vòng phân giải >15 mm. Có 5 chủng có khả năng phân

17

giải xenlulo mạnh gồm chủng ĐT2, ĐV2 XN1, PV1 và ĐT1 có đường kính

vòng phân giải lớn hơn 20mm. Từ các chủng có hiệu lực mạnh đã chọn được

2 chủng ĐT2 và ĐV2 có hiệu lực phân giải xenlulo rất mạnh với đường kính

vòng phân giải ≥ 25mm. Đây là những kết quả ban đầu có cơ sở để ứng dụng

2 chủng này làm phân bón vi sinh hỗn hợp để phân giải cành khô lá rụng trên

mặt đất dưới tán rừng, làm giải nguy cơ cháy rừng và tăng độ phì cho đất. Đã

phân lập,xác định tên khoa học và tuyển chọn được 4 chủng vi sinh vật có ích

thuộc các loài: Pseudomonas fluorescens và Bacillus subtilis (vi khuẩn nội

sinh sinh tổng hợp IAA), đối kháng nấm gây bệnh và Burkholderia

cenocepacia và Azotobacter beijerinskii (vi khuẩn phân giải phốt phát, cố

định nitơ).

Trần Thị Ngọc Sơn và cộng sự (2010) [8]. Kết quả đã phân lập được 40

chủng nấm Trichoderma sp từ các mẫu đất đại diện cho hệ thống canh tác lúa

2 vụ, lúa 3 vụ, lúa mía ở Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) bao gồm Cần

Thơ, Hậu Giang, Kiên Giang và An Giang từ vụ đông xuân 2008-2009 để

nghiên cứu khả năng phân hủy rơm rạ. Các tác giả đã chọn được 9 chủng nấm

có chỉ số phân hủy xenlulo cao thông qua sự phát triển đường kính tăng

trưởng của nấm sau hai ngày ủ ở điều kiện 280C và đã tuyển chọn được 3

chủng nấm Trichoderma sp có chỉ số phân hủy xenlulo (K3, V1, HG2) để sản

xuất 2 chế phẩm phân hủy rơm bao gồm dạng chế phẩmTrichoderma sp hòa

tan trong nước và dạng chế phẩm Trichoderma sp không hòa tan trong nước.

Hiệu quả xử lý rơm ra của 2 dạng chế phẩm này. Sau 4 tuần xử lý rơm rạ tươi

bằng chế phẩm chế phẩm Trichoderma sp dạng bột đã làm giảm tỷ số C/N

xuống chỉ còn 17,93 và dạng bột không hòa tan C/N chỉ còn 20,53 so với rơm

rạ tươi có C/N là rất cao là 75,5 đến 78,25. Đồng thời tăng N, P2O5, K2O tổng

số so với trước khi xử lý từ 67,8% N tổng số; 79,7% P2O5 tổng số và 68,2%

K2O tổng số (chế phẩm dạng bột hòa tan) và N, P2O5, K2O tổng số lần lượt

18

tăng 71,6%; 109,6% và 72,7% (chế phẩm dạng bột không hòa tan) so với N,

P2O5, K2O tổng số trong rơm rạ trước khi ủ.

Lưu Hồng Mẫn và cộng sự (2006) [4] ứng dụng chế phẩm sinh học

Trichoderma để sản xuất phân hữu cơ vi sinh phục vụ cho thâm canh lúa ở

Đồng bằng Sông Cửu Long kết quả cho thấy sau 5 tuần xử lý chế phẩm sinh

học tỷ lệ C/N giảm nhanh từ 36,95 xuống còn 16,97%.

2.3. Tổng quan về khu vực nghiên cứu

Đại Lải nằm ở phía đông bắc của thị xã Phúc Yên cách thủ đô Hà Nội

khoảng 40 km với diện tích tự nhiên là 1.500ha, diện tích mặt nước 525 ha

nằm gần chân dãy núi Tam Đảo thuộc xã Ngọc Thanh và xã Cao Minh với

trung tâm là hồ Đại Lải

Đại Lải nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, nhiệt độ bình quân

năm là 23 °C, có nét đặc trưng nóng ẩm, mưa nhiều về mùa hè, hanh khô và

lạnh kéo dài về mùa đông. Khí hậu tương đối thuận lợi cho phát triển nông

nghiệp đa dạng.

Nhiệt độ không khí có các đặc trưng sau:

Cực đại trung bình năm là 20,5 °C

Cực đại tuyệt đối 41,6 °C

Cực tiểu tuyệt đối 3,1 °C

Độ ẩm không khí tương đối trung bình năm là 83%, độ ẩm cực tiểu tuyệt

đối là 16%.

Hướng gió chủ đạo về mùa đông là Đông – Bắc, về mùa hè là Đông –

Nam, vận tốc gió trung bình năm là 2,4 m/s. Vận tốc gió cực đại có thể xảy ra

theo chu kỳ thời gian 5 năm là 25 m/s; 10 năm là 32 m/s, 20 năm là 32 m

19

PHẦN 3

ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu

3.1.1. Đối tượng nghiên cứu

- Đề tài chỉ tập trung phân lập, tuyển chọn một số chủng vi nấm có khả

năng phân giải xenlulo cao dưới tán rừng Thông mã vĩ, Thông nhựa trên địa

bàn Đại Lải- Vĩnh Phúc

3.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu

- Địa điểm nghiên cứu: + Tiến hành điều tra và thu mẫu tại Đại Lải, Vĩnh Phúc

+ Phân lập tuyển chọn vi nấm được tiến hành tại phòng thí nghiệm của

Trung tâm Nghiên cứu Bảo vệ rừng - Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam

(Phường Đức Thắng, quận Bắc Từ Liêm, Hà Nội).

- Thời gian nghiên cứu:

+ Đề tài được tiến hành từ tháng 1/1/2019 đến tháng 30/5/2019.

3.2. Nội dung nghiên cứu

3.2.1. Điều tra một số đặc điểm cấu trúc rừng Thông nơi tiến hành thu mẫu

3.2.2. Phân lập các chủng vi nấm có khả năng phân hủy xenlulo.

- Tiến hành thu mẫu.

- Phân lập chủng vi nấm từ các mẫu đã thu thập được.

3.2.3. Tuyển chọn các chủng vi nấm có khả năng phân hủy xenlulo.

- Xác định hoạt tính phân giải xenlulo của các chủng

- Thí nghiệm các chủng rất mạnh với vật liệu cháy (trong bình thí

nghiệm).

20

3.2.4. Mô tả đặc điểm một số chủng vi nấm có khả năng phân hủy xenlulo cao

3.3. Phương pháp nghiên cứu

3.3.1. Điều tra một số đặc điểm cấu trúc rừng Thông nơi tiến hành thu mẫu

Tại Đại Lải – Vĩnh Phúc tiến hành lập ô tiêu chuẩn (OTC) điển hình,

hình chữ nhật có diện tích 500 m2 (25x20) cho 2 loài Thông chủ yếu có điện tích

lớn (Thông mã vĩ, Thông nhựa) đại diện về cấp tuổi và thực bì mỗi loài thông lập

3 OTC (mỗi vị trí chân, sườn và đỉnh lập 1 OTC). Để xác định được khối lượng,

thành phần và đặc điểm của vật liệu cháy theo từng độ tuổi loài cây.

Tại Đại Lải – Vĩnh Phúc: 6 OTC/loài x 2 loài thông (Thông nhựa,

Thông mã vĩ) x 1 độ tuổi trên 20 = 12 OTC.

Trong mỗi OTC tiến hành thống kê tổng số cây, điều tra các chỉ tiêu

bao gồm:

- Đường kính 1,3m (D1.3) được đo bằng thước kẹp kính/thước dây

- Chiều cao vút ngọn (Hvn) được đo bằng sào có khắc vạch đến dm

- Độ tàn che được xác định bằng phương pháp cho điểm

- Xác định thành phần cây bụi thảm tươi

- Điều tra tầng cây cao, nghiên cứu một số chỉ tiêu cơ bản: Mật độ,

chiều cao, đường kính thân cây, đường kính tán lá, độ tàn che ở các giai đoạn

khác nhau.

- Đối với tầng cây bụi, thảm tươi và cây tái sinh, xác định thành phần

loài chủ yếu, chiều cao trung bình, độ che phủ….

- Các đặc điểm vật liệu cháy được nghiên cứu bao gồm: Khối lượng,

phân bố và thành phần theo 2 loại thảm tươi, thảm khô.

3.3.2 Phân lập các chủng vi nấm có khả năng phân hủy xenlulo

3.3.2.1 Phương phápthu mẫu

- Phương pháp thu mẫu

Tại địa điểm nghiên cứu đã khảo sát (Đại Lải – Vĩnh Phúc) tiến

hành lập ô tiêu chuẩn (OTC) điển hình, hình chữ nhật có diện tích 500 m 2

21

(25x20) trong mỗi OTC lập 5 ô dạng bản 1 m2 (1mx1m) 4 ô dạng bản ở 4

góc của OTC và 1 ở giữa để xác định khối lượng, thành phần và đặc điểm

của vật liệu cháy.

Sau đó mỗi ô dạng bản đặt đại diện 01 khung 1 m2 (1mx1m) có căng

lưới để thu vật liệu rơi rụng có đường kính nhỏ hơn 1 cm ở các thời điểm

khác nhau, 1 tháng thu số liệu 1 lần, thời gian theo dõi trong vòng 12 tháng

cho 2 loài thông chủ yếu có điện tích lớn tại Việt Nam (Thông mã vĩ, Thông

nhựa) ở độ tuổi (<10, và 10-20), mỗi loài thông lập 3 OTC (mỗi vị trí chân,

sườn và đỉnh lập 1 OTC) để xác định được khối lượng, thành phần và đặc

điểm của vật liệu cháy theo từng độ tuổi loài cây trong từng OTC.

Thu thập các mẫu đất khác nhau tại các ô tiêu chuẩn khác nhau trên địa

bàn Đại Lải - Vĩnh Phúc. Các mẫu được để riêng trong các túi khác nhau,

mang về phòng thí nghiệm tiến hành phân lập.

3.3.1.2 Phương pháp phân lập các chủng nấm từ mẫu đất

- Môi trường PDA để phân lập và nuôi cấy nấm phân hủy xenlulo:

+200g khoai tây

+20g D-glucose

+1000ml nước

+18g Agar

Khoai tây rửa sạch để cả vỏ, cắt thành khúc có kích thước 1x1x1 cm,

cho vào đun cùng 1000ml nước, đun sôi trong 30 phút. Lọc lấy nước trong,

cho thêm nước để đủ 1000 ml. Sau đó cho D- Glucose,Agar vào khuấy tan,

cho vào 6 bình tam giác loại 250ml nút bông và giấy bạc ở miệng bình, hấp

khử trùng ở 1210C trong 20 phút.

Phương pháp cụ thể: Cân 10 g mẫu (đất/thảm mục), sau đó cho vào

bình tam giác chứa 90 ml nước muối sinh lý đã được khử trùng. Lắc trên máy

lắc trong thời gian 30 phút, để lắng, ta được dung dịch mẫu pha loãng 10-1 lần.

Dùng pipetman hút 1ml dịch huyền phù ở độ pha loãng 10-1 đưa vào ống

22

nghiệm chứa 9 ml nước cất vô trùng. Trộn đều ta dịch pha loãng 10-2 lần. Hút

1ml dịch huyền phù ở độ pha loãng 10-2 đưa vào ống nghiệm chứa 9 ml nước

cất vô trùng, trộn đều ta dịch pha loãng 10-3 lần. Tiếp tục làm như trên cho

đến khi nồng độ pha loãng đến 10-6 lần. Lấy 0,1 ml dịch ở các nồng độ 10-4 -

10-6 nhỏ và trang đều trên đĩa petri chứa môi trường PDA. Để trong tủ ấm ở

nhiệt độ 280C trong 24 -48 giờ sao cho có thể thấy rõ các khuẩn lạc riêng biệt.

Các khuẩn lạc có màu sắc, hình dạng khác nhau được tách riêng, làm thuần và

giữ trong ống nghiệm.

Theo dõi sự xuất hiện của các vi nấm đếm số lượng vi nấm có trong đĩa

Petri. Dùng que cấy tách từng chủng vi nấm khác nhau ra các đĩa Petri có

chứa môi trường PDA (mỗi đĩa một chủng vi nấm), mỗi chủng vi nấm cấy

trên 2 đĩa thạch, ghi rõ ký hiệu. Bước đầu nhận diện các chủng vi nấm khác

nhau dựa trên đặc điểm hình thái, màu sắc, kích thước khuẩn lạc. Theo dõi sự

phát triển của vi nấm, đánh giá khả năng sinh trưởng, mô tả đặc điểm từng

chủng vi nấm.

Tiến hành cấy tách vi nấm sang hộp lồng mới để theo dõi

- Khử trùng đầu que cấy vòng, làm nguội trong không khí khoảng 15s.

Tay trái hé mở nắp hộp thạch, đặt đầu que cấy vào đoạn có nấm cắt 1 đoạn

thạch nhỏ chứa nấm để cấy sang hộp lồng mới, tiến hành cấy trên 3 điểm ở

hộp lồng mới để theo dõi. Đậy nắp hộp dùng băng dính quấn quanh hộp thạch

mới, khử trùng que cấy trước khi cắm vào giá các thao tác phải nhanh tay và

làm trên ngọn lửa đèn cồn đặt trong tủ cấy, đảm bảo khử trùng. Các nấm sau

khi cấy xong phải ghi rõ tên chủng để tránh bị nhầm lẫn

23

Hình 3.1: Tủ đổ môi trường

3.3.3. Tuyển chọn các chủng vi nấm có khả năng phân hủy xenlulo

3.3.3.1 phương pháp xác định phân giải hoạt tính xenlulo của các chủng

+ Môi trường CMC đặc để xác định hoạt tính phân hủy xellulo 1g

CMC; 18g Agar, nước luộc lá thông 1000 ml

+ Dung dịch nước muối sinh lý: 0,85g NaCl; Nước 1000 ml

Phương pháp tuyển chọn bằng cách xác định hoạt tính CMC-aza

(Williams, 1983) Sinh khối các chủng vi nấm vật sau khi nuôi cấy 48 giờ

được li tâm, gạn bỏ phần cặn lắng và nhỏ 1ml vào các lỗ thạch đã được chuẩn

bị sẵn trên các đĩa petri chứa môi trường CMC đặc. Giữ đĩa thạch trong tủ ấm

24 giờ, sau đó lấy ra và tráng bề mặt thạch bằng dung dịch lugol, cấy dịch vi

khuẩn đã pha loãng trên môi trường dinh dưỡng đặc trưng (1,5-2% thạch hay

còn gọi là aga) nuôi dưỡng trong điều kiện thích hợp cho mọc các khuẩn lạc

tách biệt nhau cấy tách từ khuẩn lạc mọc tách biệt sang ống môi trường dinh

dưỡng thạch nghiêng để thu nhận chủng vi khuẩn thuần khiết cân, đong chính

24

xác từng thành phần môi trườnghòa tan các chất vào nước, đun và khấy cho

tan làm trong môi trường, kiểm tra thể tích và pH, rót môi trường vào dụng cụ

(ống nghiệm, hộp petri, bình tam giác). Làm nút bông, bao gói bằng giấy hoặc

báokhử trùng ở nồi hấp áp lực hơi nước (0,8- 1,0 atm/30 phút) tùy loại môi

trường chế môi trường ra thạch đĩa (để nguội môi trường trong bình tam giác

khoảng 40-50°C và đổ ra petri) và nghiêng thạch trong ống nghiệm. Tiến

hành cấy các chủng nấm lên các đĩa petri (10mm) chứa môi trường này, tiến

hành cấy trên 2 đĩa để quan sát. Hoạt tính sinh học được xác định bằng kích

thước vòng phân hủy (vòng tròn trong suốt bao quanh lỗ thạch chính là hiệu

số giữa đường kính vòng tròn trong suốt (D) và đường kính lỗ thạch (d).

+ Đánh giá khả năng phân hủy xenlulo của vi nấm

Phương pháp đánh giá khả năng phân hủy xenlulo của vi nấm. Đánh giá

khả năng phân hủy xenlulo của vi nấm bằng phương pháp nuôi cấy trên cùng

đĩa Petri giữa các vi nấm đã được phân lập. Cấy vi nấm sau khi phân lập vào

giữa đĩa thạch CMC. Hiệu lực được xác định dựa vào đường kính của vùng

ức chế (D) được tính bằng mm. Dùng thước đo để xác định vòng phân giải

của nấm.

Căn cứ vào trị số D, xác định được khả năng phân hủy xenlulo của vi

nấm. Chủng nào có trị số D càng lớn thì chủng đó càng có khả năng phân hủy

xenlulo mạnh, và ngược lại trị số D càng nhỏ thì khả năng phân hủy xenlulo

càng yếu.

Khả năng phân hủy xenlulo của vi nấm được tính theo 5 cấp như sau:

D> 70: Hiệu lực ức chế rất mạnh (Rm)

70 ≥ D> 50: Hiệu lực ức chế mạnh (M)

50 ≥ D> 20: Hiệu lực ức chế trung bình (Tb)

20 ≥ D> 10: Hiệu lực ức chế yếu (Y)

D ≤ 1 Không có hiệu lực (O)

25

3.3.3.2 Thí nghiệm các chủng rất mạnh đối với vật liệu cháy (trong bình thí

nghiệm)

Từ một số chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy xenlulo tiếp tục thí

nghiệm với vật liệu cháy trong phòng thí nghiệm sau đó nhân sinh khối riêng

rẽ trên môi trường lỏng phù hợp để tiến hành thí nghiệm xác định khả năng

giảm trọng lượng cơ chất xenlulo tự nhiên. Mỗi chủng xạ khuẩn được thí

nghiệm với 3 bình được lặp lại 3 lần và 1 công thức đối chứng.

Phương pháp tiến hành:

- Bước 1: Vật liệu cháy cắt nhỏ và điều chỉnh độ ẩm đạt 50 -60%. Mẫu

vật liệu sau khi sấy khô kiệt có độ ẩm coi như bằng không. Để tạo độ ẩm

mong muốn phải thêm một lượng nước vào mẫu vật liệu đã khô kiệt. Lượng

nước thêm vào được tính theo công thức sau:

Mn = Wct.Pm/100 (trong đó: Mn - lượng nước cần thêm vào (g);

Wct - độ ẩm tuyệt đối cần tạo (%);

Pm- trọng lượng vật cháy đã sấy khô kiệt.

Cân 5g vật liệu cháy cho vào bình tam giác 500ml.

- Bước 2: bổ sung vào mỗi bình 10ml dịch nuôi cấy lắc vi sinh vật, bình

đối chứng bổ sung nước cất.

- Bước 3: Theo dõi bình ở điều kiện nhiệt độ phòng trong vòng 60

ngày. Sau đó rửa sạch, loại bỏ tạp chất hòa tan và sấy khô phần còn lại chưa

phân hủy.

Tỷ lệ giảm trọng lượng của mẫu thí nghiệm so với mẫu đối chứng

được tính theo công thức:

X% = (mo-mt)/mo.100

Trong đó: - X: là % độ giảm trọng lượng của mẫu thí nghiệm

- mt trọng lượng khô còn lại của mẫu thí nghiệm

- mo trọng lượng khô còn lại của mẫu đối chứng

26

Hình 3.2: Kính hiển vi và Tủ định ôn

27

PHẦN 4

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

4.1. Điều tra một số đặc điểm cấu trúc rừng Thông nơi tiến hành thu mẫu

4.1.1. Kết quả điều tra tầng cây cao

Rừng Thông tại Đại Lải – Vĩnh Phúc đã được trồng từ khá lâu, theo

điều tra thì 2 loài Thông được trồng phổ biến ở đây là Thông nhựa và Thông

mã vĩ.

Kết quả điều tra tầng cây cao được tổng hợp tại bảng 4.1:

Bảng 4.1. Kết quả điều tra tầng cây cao rừng Thông

khu vực Đại Lải, Vĩnh Phúc

N (cây/ha) Độ tàn che(%) TB Hvn (m) TB HDC (m) TB D1.3(cm) TB DT (m)

840 0,46 7,1 5,4 15,4 2,8

760 0,52 8.7 6.6 18,9 3

Đối tượng nghiên cứu Thông nhựa16 tuổi Thông mã vĩ 24 tuổi

Thông nhựa đã trồng được 16 năm với mật độ cao 840 cây/ha, chiều

cao vút ngọn đạt 7,1m, đường kính 1.3m đạt 15,5cm, đường kính tán đạt

2,8m; Thông mã vĩ trồng được 24 năm với mật độ thấp hơn 760 cây/ha, chiều

cao vút ngọn đạt 8,7m, đường kính 1.3m đạt 18,9cm, đường kính tán đạt

3m...Thổ nhưỡng và khí hậu ở đâu rất thuận lợi cho cây Thông sinh trưởng và

phát triển nên các chỉ tiêu sinh trưởng của cây là tương đối tốt.

4.1.2. Kết quả nghiên cứu độ che phủ của tầng cây bụi, thảm tươi dưới tán

rừng Thông tại khu vựcnghiên cứu.

Bằng phương pháp quan sát giá và cho điểm về mức độ che phủ mặt

đất của tầng cây bụi thảm tươi thấy rằng độ che phủ trung bình của tầng cây

28

bụi thảm tươi ở các rừng Thông khác nhau là không giống nhau. Kết quả độ

che phủ của tầng cây bụi lớp thảm tươi dưới tán rừng Thông ở Đại Lải được

thể hiện ở bảng 4.2.

Bảng 4.2.Thành phần lớp cây bụi, thảm tươi khu vực Đại Lải Vĩnh Phúc

Độ che phủ Đối tượng trung bình Loài cây chủ yếu nghiên cứu (%)

Cây thông tái sinh, cây tế, cây guột, cây

sim, cây mua, cây sầm, cây mẫu đơn Thông nhựa 80 rừng, cây sẻ ba, cây cỏ lào, cây ba xoi, 16 tuổi cây lấu, cây cách, cây hương bài, cây

bọt ếch, cây thành ngạnh,cây thao kén.

Cây thông tái sinh, cây tế, cây guột, cây

sim, cây mua, cây sầm, cây mẫu đơn Thông mã vĩ 85 rừng, cây sẻ ba, cây cỏ lào, cây ba xoi, 24 tuổi cây lấu, cây cách, cây hương bài, cây

bọt ếch, cây thành ngạnh,cây thao kén.

Kết quả bảng 4.2 cho thấy thành phần sinh của lớp thực vật dưới tán

rừng thông ở khu vực Đại Lải rất đa dạng và phong phú với nhiều loài thực

vật đặc trưng dưới tán rừng Thông như: cây Thông tái sinh, cây tế, guột, sim,

mua, sầm, mẫu đơn rừng………

4.1.3. Thành phần vật liệu cháy dưới tán rừng Thông ở khu vực

Vật liệu cháy dưới tán rừng Thông bao gồm thảm tươi và thảm khô.

Thảm tươi bao gồm các loại cây bụi, cỏ còn tươi, cây tái sinh. Thảm khô gồm:

Lớp cành khô lá rụng, cỏ khô. Kết quả về khối lượng vật liệu cháy được trình

bày qua bảng 4.3:

29

Bảng 4.3. Thành phần và khối lượng vật liệu cháy dưới rừng Thông

ở Đại Lải, Vĩnh Phúc

Thành Độ dày Khối lượng Đối tượng Ghi Stt phần vật trung bình trung bình nghiên cứu chú liệu cháy (cm) (tấn/ha)

Tổng 9,2 22

1 Thảm mục 2.4 7.1 Thông nhựa

16 tuổi Thảm khô 6.8 14.9

Tổng 9,8 28,1

2 Thảm mục 2.7 10.7 Thông mã vĩ

Qua số liệu bảng 4.3 cho thấy khối lượng vật liệu cháy (VLC) ở các địa

24 tuổi Thảm khô 7.1 17.4

điểm khác nhau là khác nhau, VLC ở rừng Thông nhựa 16 tuổi có độ dày

trung bình là 9,2cm với khối lượng trung bình là 22 tấn/ha, rừng Thông mã vĩ

24 tuổi VLC có độ dày trung bình là 9,8cm với khối lượng trung bình là 28,1

tấn/ha.

Hình 4.1. Vật liệu cháy trong rừng Thông tại Đại Lải

30

4.2. Phân lập các chủng vi nấm từ mẫu đất

4.2.1. Kết quảthu thập mẫu

Kết quả thu thập mẫu đất thu thập tại các OTC trong rừng Thông ở Đại

Lải được tổng hợp tại bảng 4.4:

Bảng 4.4: Các mẫu đất được thu thập tại các OTC ở Đại Lải

Đất rừng OTC

OTC1

OTC2 Thông nhựa

OTC3

OTC4

OTC5 Thông mã vĩ

OTC6

OTC7

OTC8 Thông nhựa

OTC9

OTC10

OTC11 Thông mã vĩ

OTC12 STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Kí hiệu mẫu DL1 DL2 DL3 DL4 DL5 DL6 DL7 DL8 DL9 DL10 DL11 DL12 DL13 DL14 DL15 DL16 DL17 DL18 DL19 DL20 DL21 DL22 DL23 DL24

Trên mỗi OTC, tiến hành lấy 2 mẫu đất tại các vị trí khác nhau ở chiều

sâu 30 cm. Với 12 OTC, thu được 24 mẫu đất tiến hành phân lập tuyển chọn

vi nấm phân giải xenlulo.

31

4.2.2 Phân lập chủng nấm từ các mẫu đất thu được

Kết quả phân lập chủng nấm từ các mẫu đất thu được tại rừng Thông

Đại Lải được tổng hợp tại bảng 4.5:

Bảng 4.5: Số chủng nấm phân lập được từ các mẫu đất

STT Ký hiệu chủng Ô TIÊU CHUẨN

1 LSN 3.2 DL1

2 LSN 3.3 DL1

3 LSN 3.5 DL1

4 LSN13.1 DL2

5 LSN12.5 DL2

6 SSN 9 DL3

7 LSN 7.1 DL7

8 LSN 7.3 DL7

9 LSN 6.2 DL6

10 LSN 6.1 DL6

11 LSN 8.2 DL10

12 THN 4.1 DL11

13 THN 5.1 DL 11

14 HN 18 DL9

15 SSN 5.1 DL8

16 HBN 2.2 DL12

17 HBN 1.2 DL12

18 HBN 1.4 DL12

19 LSN 13.5 DL14

20 HBN 1.3 DL18

21 HBN 2.2 DL20

22 IPN 3 DL 21

23 LSN 9.4 DL22

32

Với 24 mẫu đất thu thập được trên 12 OTC khu vực nghiên cứu, tiến

hành phân lập được 23 mẫu Vi nấm. Từ bảng số liệu 4.2 cho thấy với mỗi

mấu đất thu được ở địa điểm OTC khác nhau, số lượng vi nấm phân lập được

cũng khác nhau.

Với 2 mẫu đất DL1 và DL12 tiến hành phân lập đều thu 3 chủng Vi

nấm điển hình, khác nhau.

Một số mẫu đất khi tiến hành phân lập chỉ thu được các chủng vi

khuẩn, xạ khuẩn.

Mẫu đất DL2, DL6, DL7, DL11 cũng thu được 2 chủng vi nấm.

LSN 12.5 SSN9 IPN3

LSN 13.1 SSN 5.1 LSN 3.5

Hình 4.2: Một số chủng vi nấm phân lập được tại khu vực nghiên cứu

Các chủng vi nấm sẽ được nuôi cấy, làm thuần. Quan sát đặc điểm hình

thái của các chủng Vi nấm.

33

Bảng 4.6. Đặc điểm hình thái một số chủng Vi nấm phân lập được

STT Ký hiệu chủng Cây chủ Đặc điểm

Nấm màu trắng, phát triển nhanh, HN 18 Thông mã vĩ 1 hình thành các bông.

LSN 8.2 Thông mã vĩ Nấm sợi màu xanh đen. 2

Nấm sợi viền trắng, sau một thời LSN 3.2 Thông nhựa 3 gian chuyển hồng.

Nấm trắng, phát triển nhanh, sợi LSN 13.5 Thông nhựa 4 bông xen kẽ

HBN 2.2 Thông mã vĩ Nấm sợi màu nâu nhạt. 5

Nấm sợi màu xám nhạt, vòng IPN 3 Thông mã vĩ 6 phóng xạ.

Nấm có màu trắng xám, nấm mọc SSN9 Thông nhựa 7 phát triển thưa đều ra hai bên.

Màu xám mịn, viền ngoài màu

SSN 5.1 Thông mã vĩ vàng cam nấm mọc không theo 8

một chiều cụ thể.

Nấm màu trắng bông, xù nhẹ, nấm

9 LSN 3.5 Thông nhựa mọc nhanh, các sợi lan đều ra các

bên.

Nấm mọc phân tán, màu hồng nhạt, 10 THN 3.1 Thông mã vĩ phóng xạ.

Kết quả bảng 4.6 cho thấy các chủng nấm được phân lập khá phong

phú với các loại đặc điểm, màu sắc khác nhau như xanh, vàng, xám, đen,

vòng phóng xạ…. Đây là cơ sở để ta tiếp tục tuyển chọn những chủng nấm có

khả năng phân giải xenlulo.

34

4.3. Kết quả tuyển chọn chủng vi nấm có khả năng phân giải xenlulo

Sau khi tiến hành phân lập được 21 chủng vi nấm từ khu vực nghiên

cứu, tiến hành thí nghiệm đánh giá khả năng phân giải môi trường CMC, trên

cơ sở đó đánh giá khả năng phân giải xenlulo của các chủng Vi nấm.

4.3.1 Kết quả xác định hoạt tính phân giải xenlulo của các chủng nấm

Kết quả xác định hoạt tính phân giải xenlulo của các chủng nấm được

tổng hợp tại bảng 4.7:

Bảng 4.7: Mức độ phân giải xenlulo của các chủng nấm

STT Đánh giá Ký hiệu chủng

LSN 3.2 LSN 3.3 LSN 3.5 LSN13.1 LSN12.5 SSN 9 LSN 7.1 LSN 7.3 LSN 6.2 LSN 6.1 LSN 8.2 THN 5.1 THN 4.1 HN 18 SSN 5.1 HBN 2.2 HBN 1.2 HBN 1.4 LSN 13.5 HBN 1.3 HBN 2.2 IPN 3 LSN 9.4 Đường kính vòng phân giải tính theo thời gian (mm) 8 ngày 44 21.5 35 0 0 28 14.5 6,5 0 40.5 48.5 19 43,5 55.5 0 15 12 25 17.5 25.5 52.5 18 0 12 ngày 65 34 45.5 0 0 40 18.5 9,5 0 54 62.5 31 65 62 0 16 14.5 35 26 36 60 19 0 4 ngày 26.5 14 28 0 0 18.5 11.5 0,9 0 31.5 39 9.5 30.5 34 0 10.5 10 18 11 15 41.5 16 0 ++++ ++ +++ - - +++ ++ + - +++ ++++ ++ ++++ ++++ - ++ ++ +++ ++ +++ ++++ ++ - 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

35

Chú thích:

- Không có khả năng phân giải xenlulo

+ Phân giải xenlulo yếu

++ Phân giải xenlulo trung binh

+++ Phân giải xenluo mạnh

++++ Phân giải xenlulo rất mạnh

Qua bảng số liệu 4.7 nhận thấy với 23 chủng Vi nấm thí nghiệm có 18

chủng Vi nấm có khả năng phân giải môi trường CMC.

Có 5 chủng Vi nấm phân giải môi trường CMC rất mạnh là: LSN

3.2;LSN 8.2; THN 4.1; HBN 2.2; HN 18 đều có đường kính vòng phân giải

CMC trên 60 mm.

Có 5 chủng Vi nấm phân giải mạnh môi trường CMC với đường kính vòng

phân giải lớn hơn 35 mm là:LSN 3.5; SSN 9; LSN 6.1; HBN 1.4; HBN 1.3.

Có 7 chủng Vi nấm có khả năng phân giải CMC trung bình là: LSN

3.3; LSN 7.1; THN 5.1; HBN 2.1; HBN 1.2; LSN 13.5; IPN 3.

Có 1 chủng Vi nấm phân giải CMC yếu là: LSN 7.3.

Có 5 chủng Vi nấm không phân giải môi trường CMC là: LSN 13.1;

Phân giải rất mạnh

Phân giải mạnh

Phân giải trung bình

Phân giải yêu

Không phân giải

LSN 12.5; LSN 6.2; SSN5.1; LSN9.4.

Hình 4.3: Tỷ lệ các Vi nấm phân giải môi trường CMC.

36

Từ kết quả trên ta thấy trên cùng mẫu đất và môi trường nhưng khả

năng phân giải môi trường CMC của các chủng nấm là khác nhau không đồng

nhất, có chủng có khả năng phân giải rất mạnh nhưng cũng có chủng phân

giải yếu, dưới đây là biểu đồ minh họa chung cho khả năng phân giải xenlulo

của các chủng nấm đã được phân lập.

60

50

40

4 ngày

30

8 ngày

12 ngày

20

10

0

(mm) 70

5

1

1

5

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

1 4

3 N P

I

9 N S S

8 1 N H

2 3 N S L

3 3 N S L

5 3 N S L

1 7 N S L

3 7 N S L

2 6 N S L

1 6 N S L

2 8 N S L

4 9 N S L

5 N S S

1 5 N H T

3 1 N S L

2 1 N S L

2 2 N B H

2 1 N B H

4 1 N B H

3 1 N B H

2 2 N B H

N H T

3 1 N S L

(mm)

Hình 4.4: Khả năng phân giải môi trường CMC của các chủng Vi nấm

LSN 3.2 LSN 8.2 HN18

THN 3.1 HBN 2.2

Hình 4.5: Một số chủng Nấm phân giải mạnh CMC

37

Phân giải rất mạnh Phân giải rất mạnh Phân giải mạnh

Phân giải trung bình Phân giải yếu Không phân giải

Hình 4.6: Khả năng phân giải môi trường CMC của 1 số chủng Vi nấm.

4.3.2. Kết quả thí nghiệm đối với vật liệu cháy

Sau khi tiến hành thí nghiệm đánh giá khả năng phân giải môi trường

CMC, đã tuyển chọn được 5 chủng Vi nấm có khả năng phân giải môi trường

mạnh nhất: LSN 3.2; LSN 8.2; THN 4.1; HBN 2.2; HN 18.

Sử dụng 5 chủng Vi nấm tiến hành thí nghiệm chậu vại, đánh giá khả

năng phân giải xenlulo trong chậu vại.

Kết quả độ giảm khối lượng VLC sau khi tiến hành thí nghiệm được

trình bày ở bảng 4.8:

Bảng 4.8. Kết quả độ giảm khối lượng VLC

M

X (%)

Mo

10.000 10.000 10.000 10.000 10.000

8.170 8.350 7.500 9.000 7.800

18.3 16.5 25 10 22

Chủng Vi nấm LSN 3.2 LSN 8.2 HN 18 THN 3.1 HBN 2.2

38

Kết quả bảng 4.8 cho thấy các chủng Vi nấm khác nhau cho kết quả

giảm khối lượng vật liệu cháy là khác nhau, trong đó chủng HN 18cho kết

quả giảm nhiều khối lượng VLC nhất là 25%, tiếp theo là chủng HBN

2.2giảm 22% khối lượng VLC,thấp nhất là chủng giảm 16,5% khối lượng

VLC.

Hình 4.7: Chủng Vi nấm SSN 9

Hình 4.8: Chủng Vi nấm HN18

39

PHẦN 5

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

5.1 Kết luận

Sau khi hoàn thành nghiên cứu đề tài: “Phân lập, tuyển chọn vi nấm

phân hủy xenlulo dưới tán rừng Thông tại Đại Lải Vĩnh Phúc” tôi có một

số kết luận như sau:

Đại Lải – Vĩnh Phúc có điều kiện thổ nhưỡng và khí hậu ở đâu rất

thuận lợi cho cây Thông sinh trưởng và phát triển nên các chỉ tiêu sinh trưởng

của cây là tương đối tốt.

Thành phần sinh của lớp thực vật dưới tán rừng Thông ở khu vực Đại

Lải rất đa dạng và phong phú với nhiều loài thực vật đặc trưng dưới tán rừng

Thông như: cây Thông tái sinh, tế, guột, sim, mua, sầm, mẫu đơn

rừng………có mức độ che phủ cao từ 80-85%.

Khối lượng VLC ở rừng Thông Đại Lải là tương đối lớn, VLC ở rừng

Thông nhựa 16 tuổi có độ dày trung bình là 9,2cm với khối lượng trung bình

là 22 tấn/ha, rừng Thông mã vĩ 24 tuổi VLC có độ dày trung bình là 9,8cm

với khối lượng trung bình là 28,1 tấn/ha.

Kết quả phân lập: với 24 mẫu đất thu thập được trên 12 OTC khu vực

nghiên cứu, tiến hành phân lập được 23 mẫu Vi nấm, các chủng nấm được

phân lập khá phong phú với các loại đặc điểm, màu sắc khác nhau như xanh,

vàng, xám, đen, vòng phóng xạ….

Trong số 23 chủng Vi nấm thí nghiệm có 18 chủng Vi nấm có khả năng

phân giải môi trường CMC:

Có 5 chủng Vi nấm phân giải môi trường CMC rất mạnh là: LSN 3.2;

LSN 8.2; THN 4.1; HBN 2.2; HN 18 đều có đường kính vòng phân giải CMC

trên 60 mm.

Có 5 chủng Vi nấm phân giải mạnh môi trường CMC với đường kính vòng

phân giải lớn hơn 35 mm là:LSN 3.5; SSN 9; LSN 6.1; HBN 1.4; HBN 1.3.

40

Có 7 chủng Vi nấm có khả năng phân giải CMC trung bình là: LSN

3.3; LSN 7.1; THN 5.1; HBN 2.1; HBN 1.2; LSN 13.5; IPN 3.

Có 1 chủng Vi nấm phân giải CMC yếu là: LSN 7.3.

Có 5 chủng Vi nấm không phân giải môi trường CMC là: LSN 13.1;

LSN 12.5; LSN 6.2; SSN5.1; LSN9.4.

Các chủng Vi nấm khác nhau cho kết quả giảm khối lượng vật liệu

cháy là khác nhau, trong đó chủng HN 18 cho kết quả giảm nhiều khối lượng

VLC nhất là 25%, thấp nhất là chủng giảm 16,5% khối lượng VLC

5.2. Kiến nghị

Cần thực hiện nghiên cứu ở nhiều địa điểm khác nhau để kiểm tra xem

vị trí địa lý có ảnh hưởng đến kết quả phân lập nấm hay không

Tiến hành nghiên cứu vào các mùa khác nhau trong năm để xác định

các chủng nấm khác nhau ở các thời điểm trong năm

Những kết quả nghiên cứu của đề tài bước đầu cho thấy tiềm năng phân

giải xenlulo của các chủng nấm đối với vật liệu cháy là rất khả thi. Cần tiếp

tục nghiên cứu nhiều lần để tạo ra các chế phẩm sinh vật phân giải xenlulo

ứng dụng trong công tác phòng cháy chữa cháy rừng

41

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

1. Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn quyết định số 4110 QĐ/BNN-

KHCN ngày 31 tháng 12 năm 2007 về việc quy phạm phòng cháy, chữa

cháy rừng thông.

2. Đặng Minh Hằng,(1999), Nghiên cứu một số giải pháp kỹ thuật lâm sinh

làm cơ sở đề xuất biện pháp nâng cao sản lượng rừng tràm (Melaleuca

cajuputi powell) trên vùng Tứ giác Long Xuyên, Luận án PTS Khoa học

Nông Nghiệp, Hà Nội.

3. Hoàng Quốc Khánh và cộng sự 2003 (Quyền Đình Thi, Nguyễn Sỹ Lê

Thanh, Đại học Thái Nguyên Viện Công Nghệ sinh học) Tuyển chọn và

nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường lên khả năng sinh tổng

hợp xenlulose của chủng penicilium SP DTQ-HK1.

4. Lưu Hồng Mẫn (2010), Ứng dụng chế phẩm sinh học để sản xuất phân

rơm rạ hữu cơ tại chỗ và cải thiện độ phì của đất canh tác lúa, Hội thảo,

Ứng dụng các biện pháp sinh học trong lĩnh vực trồng trọt theo hướng

phát triển nông nghiệp bền vững, An Giang.

5. Lưu Hồng Mẫn, Vũ Tiến Khang, Nguyễn Ngọc Hà (2006), “Ứng dụng

chế phẩm sinh học để sản xuất phân hữu cơ vi sinh Phục vụ thâm canh lúa

ở Đồng Bằng Sông Cửu Long”. Tạp chí Nông nghiệp & PTNT số 84 kỳ 2

tháng 5 năm 2006.

6. Nguyễn Thị Thúy Nga và cộng sự (2015). “Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn

phân giải xenlulo sản xuất phân hữu cơ sinh học”. Tạp chí Khoa học Lâm

nghiệp, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam số 3/2015.

7. Nguyễn Thị Thúy Nga (2010). “Phân lập, tuyển chọn vi sinh vật có khả

năng phân giải xenlulo hiệu lực cao, phù hợp với điều kiện đất bạc màu và

đặc điểm sinh học của chúng để sản xuất phân vi sinh cho cây lâm

42

nghiệp”. Tạp chí khoa học lâm nghiệp, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt

Nam số 4/2010.

8. Trần Thị Ngọc Sơn, Lưu Hồng Mẫn, Vũ Tiến Khang, Nguyễn Ngọc Hà,

Nguyễn Thị Ngọc Hân, Trần Thị Anh Thư và Nguyễn Ngọc Nam (2010),

Đánh giá hiệu quả xử lý rơm rạ của nấm Trichoderma sp bản địa ở Đồng

bằng Sông Cửu Long.

9. Trịnh Đình Khá và cộng sự, 2007 “Nghiên cứu phân lập tuyển chọn một

số chủng VSV có khả năng phân hủy xenluose từ rong giấy tại Hòn

Chồng- Nha Trang”

TÀI LIỆU TIẾNG ANH

10. Bashir Ahmad, Sahar Nigar, S. Sadaf Ali Shah, Shumaila Bashir, Javid

Ali, Saeeda Yousaf an Javid Abbas Bangash (2013), “Isolation and

Identification of Xenlulo Degrading Bacteria from Municipal Waste and

their Scereening for potenital Antimicrobitial Activity”, World applied

sciences Journal 27 (11): 1420-1426, 2013

11. Herikasson., 1999. “Plot designs for the analysis of species interactions in

mixed stands, Common. For. Rev. 74, 322–332.Volume 2, Issue 8 January

2014: 458

12. Isaber, Kalpana Samant, and Avinash Sahu (2012), “Isolation of

Cellulose-Degrading Bacteria and Determination of Their Cellulolytic

Potential”, Hindawi Publishing Corporation International Journal of

Microbiology Volume 2012, Article ID 578925, 5 pages Yugal Kishore.

13. Lamot E.L and Voets J.P. (1978), “Microbial bio - degradation of

cellophane”, Zeitschrift fur allgemeine.18, pp.183-188.

14. Macarron, (1993), “Microbial bio - degradation of cellophane”, Zeitschrift

fur allgemeine.18, pp.183-188.

15. Maheshwari DK, Gohade S and Jahan H (1990), “Production of Cellulase

by a new isolate of Trichoderma pseudokoningii”,J. Indian Bot. Soc.,

43

69:63-66.

16. Makeshkumar.,PU Mahasimgam(2011), "Growth and cellulase production

by Trichoderma", In Symposium on Enzymatic Hydrolysis of Cellulose,

ed. Bailey M., Enari T. & Linko M, pp. 81-110, Finland Technical

Research Centre.

17. Mazadza (2000), “Evaluation of cellulose degrading efficiency of some

fungi and bacteria and their biofilms”. J.Natn.Sci.Foundation Sri Lanka

2013 41(2):155-163.

18. Ogaw, (1991), “Awful Splendour – A History of Fire in Canada”,

University of British Columbia Press, Vancouver, BC.

19. Reddy.BR., Narashimha G., Babu GVAK.(1998), “Cellulase Production

Potentials of the Microbial Profle of Some Sugarcane Bagasse Dumping

Sites in Ilorin”, Nigeria Print ISSN 2067-3205; Electronic 2067-3264, Not

Sci Biol, 2013, 5(4):445-449.

20. Sivakumaran Sivaramanan (2014), “Isolation of Cellulolytic Fungi and

their Degradation on".

21. Wilick,Segili(1985), “Bush fie in Australia”, Canberra, pp.142-359

22. Wen-Jing Lu, Hong-Tao Wang, Shi-Jian Yang, Zhi-Chao Wang, Yong-

Feng Nie (2005), “Isolation and characterization of mesophilic cullulose-

degrading bacteria from flower stalks-vegetable waste co-composting

system”, Journal of General and Applied Microbiology. 51, pp. 353-360

PHỤ LỤC

HÌNH ẢNH TRONG QUÁ TRÌNH LÀM THÍ NGHIỆM