Khóa luận tốt nghiệp: Phát hiện và đánh giá tính gây bệnh của Pepper yellow leaf curl Việt Nam virus

̣ ̣ ̣ ̣ HOC VIÊN NÔNG NGHIÊP VIÊT NAM

KHOA NÔNG HOC̣

Ệ Ậ Ố KHÓA LU N T T NGHI P

Ề Đ  TÀI

ệ ệ   t

ủ ệ    “Phát hi n và đánh giá tính gây b nh c a Pepper yellow leaf curl Vi Nam virus ”

ả ướ ế ườ Gi ng viên h ng d n ẫ : TS.Hà Vi t C ng

̀ ̃ ọ H  và tên : Ha Văn Dung

L pớ : BVTVB­K55

̣ ự ̉ ̣ Chuyên ngành : Bao vê th c vât

ộ Hà N i­2014

Ờ Ả Ơ L I C M  N

ữ ố ỗ ự ủ ả   Trong su t quá trình hoàn thành báo cáo này ngoài nh ng n  l c c a b n

ậ ượ ữ ự ừ thân, tôi đã nh n đ ỡ ế ứ ậ c nh ng s  giúp đ  h t s c t n tình và quý báu t ề ậ    nhi u t p

ể th  và cá nhân.

ướ ế ượ ử ờ ả ơ ắ Tr c h t tôi xin đ c g i l i c m  n chân thành và sâu s c nh t t ấ ớ   i

ế ườ ố ệ th y ầ TS. Hà Vi t C ng – Giám đ c trung tâm nghiên c uứ  b nh cây nhi ệ ớ   t đ i

ầ ọ ̣ ̣ ̣ ̣ – Tr ườ Hoc viên nông nghiêp Viêt Nam, Phó khoa Nông h c và Ths. Tr n Th ng ị

ứ ư ệ ố ệ ớ ự Nh  Hoa ­ Phó giám đ c trung tâm nghiên c u b nh cây nhi ế   t đ i đã tr c ti p

ướ ỉ ả ề ệ ể ẫ ậ ạ ọ h ng d n, t n tình ch  b o và t o m i đi u ki n đ  tôi hoàn thành báo cáo.

ử ờ ả ơ ấ ớ ộ Tôi xin g i l i c m  n chân thành nh t t ộ   i cán b  công nhân viên thu c

ứ ệ ệ ớ ̣ ̣ ̣ Trung tâm nghiên c u b nh cây nhi t đ i – Tr ̣   ườ Hoc viên nông nghiêp Viêt ng

ệ ự ậ ạ ỡ Nam, đã nhi ố t tình giúp đ  tôi trong su t quá trình tôi th c t p t i Trung tâm.

ả ơ ầ ồ ờ Đ ng th i tôi cũng xin chân thành c m  n các Th y giáo, Cô giáo trong

ư ầ ̣ ̣ ̣ ộ b  môn bênh cây cũng nh  các Th y cô trong khoa Nông hoc, ̣ Tr ườ Hoc viên ng

ệ ỉ ả ạ ỗ ố ờ ̣ ̣ nông nghiêp Viêt Nam đã nhi t tình d y d , ch  b o cho tôi trong su t th i gian

ọ ậ ạ ườ tôi h c t p t i tr ng.

ố ượ ả ơ ữ ườ Cu i cùng tôi xin đ c chân thành c m  n nh ng ng ạ   i thân, gia đình, b n

ỡ ộ ọ ậ ư ế bè đã h t lòng giúp đ , đ ng viên tôi trong quá trình h c t p cũng nh  hoàn thành

báo cáo này.

ộ ầ ữ ả ơ M t l n n a tôi xin chân thành c m  n!

ộ Hà N i, ngày 31 tháng 7 năm 2014

Sinh viên

̀ ̃ Ha Văn Dung

̣ ̣

MUC LUC

Ụ Ừ Ế Ắ DANH M C T  VI T T T

ừ ế ắ

Ký hi uệ

T  vi

t t

t

A. tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens

AS

Acetosyringone

ATP

Adenosine triphosphate

Bb

Base pair

CP

Capsid protein

CTAB

Cetryl Ammonium Bromide

ddNTP

Dideoxynucleoside  triphosphate

DNA

Deoxyribonucleic acid

Dntp

Deoxynucleoside triphosphate

dsDNA

Double strand DNA

E.coli

Escherichia coli

EDTA

Ethylene diamine tetra acetic acid

ICTV

International Committee on Taxonomy of Viruses

IR

Itergenic region

Kb

Kilo base

LB

Luria and Bertani

ORF

Open reading frame

PCR

Polymerase Chain Reaction

RCA

Rolling circle amplification

RE

Restriction enzyme

Rep

Replication protein

RNA

Ribonucleic acid

Rnase

Ribonuclease

SDS

Sodium Dodecyl Sulphate

SsDNA

Singe strand DNA

TAE

Tris – acetate – EDTA

Taq

Thermus aquatic

Vir

Virulence region

β

­ ME

Beta­ Mercaptoethanol

Ả Ụ DANH M C B NG

Ụ DANH M C HÌNH

TÓM T TẮ

ứ ậ ứ ế ủ ế   Trong nghiên c u này chúng tôi ti n hành nghiên c u t p trung ch  y u

ề v  begomovirus đó là Pepper yellow leaf curl Vietnam virus (PepYLCVNV) gây

ớ ệ b nh xoăn vàng lá trên ̀ t và ca chua.

ư ệ ặ ằ ọ Đánh giá đ c tr ng sinh h c b ng cách đánh giá tính gây b nh thông qua

̀ ế Agrobacterium tumerfaciens (Agroinoculation),  đông th i ̀ơ chúng tôi ti n hành

ớ ệ ề ấ ọ lây nhi m ễ PepYLCVNV thông qua môi gi i truy n b nh trung gian là b  ph n..

ồ ặ ả ứ ự ệ ồ ượ D a trên m i đ c hi u và m i chung, các ph n  ng PCR đã đ ự   c th c

́ ẫ ớ ệ ạ ộ ạ ề ề ệ hi n trên m t lo t các m u t thu t i mi n Băc và mi n Trung Vi ằ   t Nam nh m

́ ́ ̀ ̀ ̣ ự ệ ̣ ̉   phát hi n PepYLCV và begomovirrus khác. Lân đâu tiên phat hiên s  co măt cua

̀ ớ ̣ begomovirrus trên ́ t tai miên Băc.

ự ễ ế ấ ủ   Chúng tôi đã ti n hành xây d ng thành công c u trúc xâm nhi m c a

ư ặ PepYLCVNV, phân tích đ c tr ng phân t ử ủ ủ PepYLCVNV. c a c a

Ặ Ấ Ề Đ T V N Đ

ớ ệ Gi i thi u

ấ ớ ọ ấ Chi   Begomovirus   là   chi   l n   nh t   và   quan   tr ng   nh t   trong   h ọ

ả ề ố ượ ệ ớ ồ Geminiviridae c  v  s  l ng loài và b nh do chúng gây ra v i cây tr ng.

ượ ặ ừ ọ Begomovirus (đ c đ t tên t Bean golden mosaic virus) là tên g i chung ch ỉ

ạ ạ ầ ộ các virus thu c chi Begomovirus có phân virion (h t virus) d ng hình c u kép

ộ ợ ơ ướ ả (hình chùy) và b  gen DNA s i vòng đ n, kích th ề   c kho ng 2,7 kb, lan truy n

ề ữ ể ằ ấ ầ ồ ộ ọ trên đ ng ru ng b ng b  ph n (Bemisia tabaci) theo ki u b n v ng tu n hoàn.

ể ơ ồ ộ ử ặ ộ Begomovirus có th  có b  gen đ n (g m m t phân t DNA­A) ho c có

ử Ở ộ ố ạ ồ ộ b  gen kép (g m hai phân t DNA­A và DNA­B). ỉ ầ    m t s  lo i cây ch  c n

ử ứ ệ ể ở ộ ố ạ ấ phân t DNA­A đã gây tri u ch ng đi n hình, còn m t s  lo i c y khác thì

ử ứ ệ ệ ớ ả ầ c n có c  phân t DNA­A và DNA­B m i gây ra tri u ch ng b nh.

ứ ệ ề ệ ặ   ạ Begomovirus  gây b nh trên các lo i  cây  đ u có  các tri u ch ng   đ c

ư ể ố ạ ặ tr ng, đi n hình là: cu n lá (cong l i hình thìa); mép lá (đ c bi ệ ở t ế    lá non) bi n

ọ ớ ỷ ệ ậ ỏ ẹ ả ấ ễ ấ ớ vàng; lá nh  h p; cây nhi m s m còi c c v i t đ u qu  r t th p. Danh tính l

ể ượ ự ị ử ỉ virus ch  có th  đ c xác đ nh d a vào các phân tích phân t

ệ ượ ứ ạ ọ Vi t   Nam   đ ủ   c   ch ng   minh   là   trung   tâm   đa   d ng   quan   tr ng   c a

ố ượ ậ ự ặ begomovirus. M c dù v y s  l ậ ủ   ị ng begomovirus xác đ nh trên th c v t c a

ệ ỉ ồ ẫ ượ ậ ừ ề Vi t Nam v n còn ít ch  g m 19 loài đ c phân l p t nhi u loài cây, trong đó

ề có nhi u cây d i. ( ạ Green, Tsai et al., 2001), (Ha, 2007).

ọ ượ ệ ệ Trên cây h  cà, đã có 6 begomovirus đ c phát hi n gây b nh xoăn vàng

ạ ệ ệ ẫ ố lá cà chua t i Vi ư t Nam. Tuy nhiên hi n v n ch a có công b  nào cho th y s ấ ự

ặ ủ ớ ẫ ớ ạ ể có m t c a begomovirus trên ộ t. Năm 2012, m t lo t các m u ệ   t bi u hi n

ứ ệ ớ ượ ệ ớ ệ tri u ch ng b nh virus trên t đã đ ệ c TTNC B nh cây Nhi t đ i (Tr ườ   ng

ả ướ ậ ắ ộ ử ừ ộ ĐHNN Hà N i) thu th p kh p c  n c. Các phân tích phân t ẫ    m t m u t

ầ ậ ạ ẵ ẫ ị ậ virus phân l p đ u tiên t ừ ớ t thu th p t i Đà N ng (m u VNP93) đã xác đ nh

ượ ộ ớ ượ ặ đ c   m t loài begomovirus m i và virus này đ c đ t tên là Pepper yellow

leaf curl Vietnam virus (PepYLCVNV).

ứ ơ ộ ạ ấ Các nghiên c u s  b  t i TT NCBC NĐ cũng cho th y virus này cũng

ự ệ ầ ị ệ ả ầ ễ nhi m t nhiên c  trên cây cà chua b  b nh xoăn vang lá. Vi c l n đ u tiên phát

ượ ạ ự ộ ệ ệ hi n đ c m t begomovirus gây h i t nhiên trên ớ ở t Vi t Nam có ý nghĩa

ả ề ặ ự ễ ọ ọ ớ ư quan tr ng c  v  m t khoa h c và th c ti n vì cây cây t cũng nh  cây cà chua

ủ ồ ọ ệ là các cây tr ng quan tr ng c a Vi t Nam.

ư ặ ể ộ ớ ố Do PepYLCVNV là m t virus m i nên phân b  cũng nh  đ c đi m sinh

ặ ệ ủ ủ ư ượ ẫ ổ ứ ọ h c, đ c bi t là ph  ký ch  c a virus v n ch a đ c nghiên c u.

ự ễ ơ ở ự ự ế ọ ệ   D a trên c   s  khoa h c và th c ti n trên, chúng tôi ti n hành th c hi n

ệ ủ ệ ề đ  tài: “Phát hi n và đánh giá tính gây b nh c a Pepper yellow leaf curl

ệ Vi t Nam virus”

ầ ủ ề ụ M c tiêu và yêu c u c a đ  tài

ụ M c tiêu

ự ẫ ớ ậ   t và cà chua thu th p

Xác đ nh s  có m t c a PepLCVNV trên các m u  ề ị ắ ủ ệ ạ ặ ủ i mi n B c và đánh giá tính gây b nh c a virus. t

Yêu c uầ

ề ố ộ ố ể ồ ớ ệ ­ Đi u tra b nh cu n lá ớ ạ t t i m t s  đi m tr ng ộ   ộ t chính thu c Hà N i,

ư H ng Yên.

ệ ậ ẫ ớ ớ ứ ệ ể ố ­ Thu th p m u b nh trên t v i tri u ch ng cu n lá đi n hình

ồ ặ ẫ ớ ệ ệ ằ ­ Phát hi n PepYLCVNV b ng PCR dùng m i đ c hi u trên các m u t và

ậ ừ ướ ứ ậ cà chua thu th p trong nghiên c u này và thu th p t tr c.

ủ ệ ễ ằ ạ ­ Đánh giá tính gây b nh c a PepYLCVNV b ng lây nhi m nhân t o dùng

ậ ớ ộ ố ỉ ỹ k  thu t agroinoculation trên cà chua, ị t và m t s  cây ch  th

ủ ệ ễ ằ ạ ­ Đánh giá tính gây b nh c a PepYLCVNV b ng lây nhi m nhân t o dùng

ấ ọ vector b  ph n.

Ổ Ệ T NG QUAN TÀI LI U

̀ ủ ớ ọ ầ T m quan tr ng c a ̀ t va ca chua

̀ ̣ ̣ ̉ ̉ ̣ ̉ ̣ Cây ́ ơ t   la   môt   loai   qua   cua   cây   cây   thuôc   chi   Capsicum   cua   ho   Ca ̀

Ớ ượ ắ ồ (Solanaceae). ồ t có ngu n g c t ỹ ố ừ châu M , ngày nay nó đ ơ   c tr ng kh p n i

ế ớ ượ ử ụ ệ ố ̣ trên th  gi i và đ c s  d ng làm gia v ,ị  rau, và thu c. Hi n nay, n Đô là Ấ

́ươ ấ ớ ớ ế ớ ớ ả ỗ ơ ̉ n c san xu t ấ t l n nh t th  gi ệ ấ i v i kho ng 1 tri u t n m i năm, n i ch ỉ

ệ ớ ơ ̣ ấ riêng Chợ Guntur (l n nh t châu Á) có 1 tri u bao ớ Ở t. Viêt Nam, ̀ ́ ̣   t la môt

́ ̀ ́ ̀ ́ ̀ ̣ ươ ̃ ư ̣ gia vi th ̀ ng xuyên co măt trong cac b a ăn, ngoai ra ́ ́ ơ t con co rât nhiêu công

́ ̃ ̀ ư ư ư ư ̣ ̉ ̣ ̣ ̉ ̣ ́ dung nh : cai thiên hê tiêu hoa, giam cân, ch a bênh ung th , ng a tai biên

̀ ́ ̣ ́ ư . mach, tăng s c đê khang

ố ừ ồ ỹ ượ ườ Cà chua (S.lycopersicum) có ngu n g c t Nam M , nó đ c ng i Tây

ề ớ ộ ố Ban Nha lan truy n t i Pilippine, Đông Nam Á và toàn b  Châu Á, cu i cùng là

ườ ổ ế ấ ở ả ỳ Châu Âu. Cà chua là loài trái cây v n ph  bi n nh t Hoa K . Kho ng 150

ệ ấ ượ ế ớ ả ấ tri u t n cà chua đã đ c s n xu t ra trên Th  gi i trong năm 2009. Trung

ố ướ ế ả ấ ả ớ ộ Qu c là n ấ c s n xu t cà chua l n nh t, chi m kho ng m t ph n t ầ ư ả    s n

ượ ế ầ ỳ ự ế ộ l ng   toàn   c u,   ti p   theo   là   Hoa   K   và ế   Ấ   n   Đ .   Các   khu   v c   ch   bi n

ế ượ ấ ở ả ỹ ượ ả ấ t iạ  California chi m 90% l ng s n xu t M  và 35% l ng s n xu t th ế

̃ ̀ ̀ ư ơ ở ươ ̣ gi i (ớ Hartz, Miyao et al., 1997). Cung nh n ́ t, ́ ̣  c ta ca chua la môt gia vi

̀ ́ ́ ̃ ự ấ ướ ̃ ư ở ̣ ̀ ế   hay co trong môi b a ăn, b i ca chua la môt th c r t giàu : N c (chiêm 93 đ n

ố ứ 95 % ), giàu nguyên t ề    khoáng,và vitamine A, C, và E. Cà chua chín ch a nhi u

ủ ạ ấ ộ ắ ố s c t trong nhóm c a caroténoïdes, nh ư β­carotène cho m t ho t ch t ti n ề

́ ợ ̉ ́ vitamine A rât co l ́ ư i cho s c khoe.

ủ ể ặ Đ c đi m chung c a Begomovirus

ủ ố ượ ặ Trong b n chi c a h ọ Geminiviradae, chi Begomovirus (đ c đ t tên t ừ

ả ề ố ượ ấ ọ Bean golden mosaic virus) là chi quan tr ng nh t, c  v  s  l ng loài (198 loài

ệ ư vào năm 2010, website ICTV) cũng nh  các b nh mà chúng gây ra trên cây

ấ ả ồ ộ ỉ ọ tr ng. T t c  các begomovirus (tên g i ch  các virus thu c chi Begomovirus)

ư ề ề ạ ự ờ ọ ố ề đ u không truy n qua h t gi ng nh ng lan truy n ngoài t ấ    nhiên nh  b  ph n

ề ữ ầ ể (Bemisia tabaci) theo ki u b n v ng tu n hoàn ( Fauquet and Stanley, 2005).

ể ặ Đ c đi m hình thái

ủ ể ề ặ ấ Đ c đi m hình thái chung c a các Begomovirus đ u có c u trúc phân t ử

ươ ự ầ ặ ặ ồ ỗ (virion) t ng t nhau bao g m 2 hình c u 20 m t (icosahedron), m i m t là 1

ớ ố ơ ố ớ ặ ằ ề ỗ ị tam giác đ u v i s  đ n v  tam giác (T) trên m i m t b ng 1, n i v i nhau đ ể

ử ố ớ ệ ầ ạ t o ra phân t ầ    hình c u đa di n kép (gemini). Do n i v i nhau nên 2 hình c u

ẫ ớ ệ ể ầ ầ ỗ này không hoàn thi n d n t ỉ i trên m i hình c u ch  có 55 ti u ph n protein

ỏ ượ ỗ ơ ị ồ ế ắ ơ ị (protein v ) đ ể   c x p x p thành 11 đ n v  hình thái, m i đ n v  g m 5 ti u

ế ầ ả ộ ử ph n protein (pentameric capsomer). K t qu  là toàn b  phân t ể    có 110 ti u

ầ ị ơ ph n và 22 đ n v  hình thái ( Gafni and Yedidya, 2003), (Zhang, Cheng et al.,

2001).

ồ ả ủ Hình 2.1 Hình thái c a begomovirus (Ngu n  nh:

www.ncbi.nlm.nih.gov)

ủ ấ C u trúc genome c a Begomovirus

ự ậ ơ ợ ộ Begomovirus  là virus   th c v t có b  gen DNA s i vòng đ n có kích

ướ ả ặ ồ ộ th c kho ng 2,6­ 2,8 kb. Chúng ho c có b  gen kép (bipartite) g m 2 phân t ử

ặ ọ ộ ơ ươ DNA g i là DNA­A và DNA­B ho c có b  gen đ n (monopartite) t ng đ ươ   ng

DNA­A (Ha, 2007)

ử ủ ấ Hình 2.2. C u trúc phân t ồ    DNA­A, DNA­B c a begomovirus (Ngu n

ả nh: www.expasy.ch)

ủ ấ ử C u trúc c a phân t DNA­A

ủ ể ấ ộ ồ C u trúc c a m t DNA­A đi n hình g m 6 ORF (Open Reading Frame)

ượ ế ề ắ ượ ề ồ ồ đ c s p x p theo hai chi u ng ề   c nhau. Trên chi u kim  đ ng h  (chi u

ứ ỏ virus) có hai gen AV1 và AV2. Gen AV1(CP) mã hóa v  protein có ch c năng

ỏ ử ậ ạ chính là t o v  phân t virus, lan truy n ể   ề Begomovirus qua vector, v n chuy n

ỏ ế ữ ủ ể ậ ộ ộ b  gen virus vào và ra kh i nhân t bào ký ch  và v n chuy n b  gen gi a các

ế ả ứ ứ ứ ệ t ể    bào. Gen AV2 mã hóa Protein có ch c năng c m  ng tri u ch ng, di chuy n

ủ ề ượ ồ ệ ố h  th ng và tích lũy DNA c a virus. Trên chi u ng ề ợ   ồ c kim đ ng h  (chi u s i

ươ ồ ồ t ng đ ng virus) g m có 4 ORF: AC1, AC2, AC3, AC4. Trong đó, gen AC1

ố ộ ứ ắ mã hóa protein tái sinh (Rep protein) có ch c năng chính là c t­ n i b  gen virus

ươ ủ ề ủ ể ớ trong quá trình tái sinh và t ng tác v i protein c a ký ch  đi u khi n chu k ỳ

ế t ạ    bào. Gen AC2 (TrAP­ Transcriptional Activator Protein) mã hóa Protein ho t

ủ ủ ứ ứ ế ả ứ hóa phiên mã có ch c năng  c ch  ph n  ng phòng th  c a cây. Gen AC3 mã

ườ ứ hóa   protein   tăng   c ng   tái   sinh   (REn­   Replication   Enhancer)   có   ch c   năng

ươ ủ ề ỳ ế ể ớ t ng tác v i prote ký ch  đi u khi n chu k  t bào. Gen AC4 mã hóa protein

ứ ớ ủ ứ ứ ể ệ ế ổ có ch c năng liên quan t ạ   i ph  ký ch , phát tri n tri u ch ng,  c ch  ho t

ủ ế ộ đ ng câm gen c a t bào ký ch  ( ủ Ha, 2007).

ử ủ ấ Hình 2.3. C u trúc phân t DNA­A c a Begomovirus

(http://wcrc.confex.com)

ủ ấ ử C u trúc c a phân t DNA­B.

ủ ượ ắ DNA­B c a các ỉ ứ Begomovirus kép ch  ch a 2 ORF và cũng đ ế   c s p x p

ề ượ ứ ề ồ ồ theo 2 chi u ng ề   c nhau. Trên chi u kim đ ng h  ch a gen BV1, trên chi u

ượ ồ ng ồ ứ c kim đ ng h  ch a gen BC1.

ộ BV1 là m t protein con thoi: (NSP­ Nuclear shuttle protein) ứ  có ch c năng

ể ậ ộ ỏ ế chính là v n chuy n b  gen virus vào, ra kh i nhân t ậ  bào, tuy v y nó không

ủ ứ ễ ế ệ ậ liên quan đ n vi c nh p nhân c a virus trong lúc xâm nhi m, ch c năng này

ượ ể ở đ c ki m soát b i CP.

ứ ộ BC1 là m t protein v nậ  chuy nể  : (MP­ Movement protein) có ch c năng

ữ ể ộ ế ậ v n chuy n b  gen virus gi a các t ủ  bào ký ch .

ử

ấ Hình 2.4: C u trúc phân t

DNA­B c a

ủ Begomovirus (Ha, Coombs et al.,

2008).

ể ặ ủ Đ c đi m c a vùng IR

ữ ằ Vùng IR (Intergenic region) là vùng liên gen không mã hóa, n m gi a 2

ượ ề ả vùng gen mã hóa ng c chi u nhau, có c  trên DNA­A và DNA­B. Vùng này có

ỗ ặ ứ ố ồ ồ ả   ch a ngu n g c tái sinh (ori­  origin of  replication)  g m các chu i  l p  đ o

ầ ế ậ ế ế ắ ấ (iteron) c n thi ự t cho s  nh n bi t và g n k t protein Rep và 1 c u trúc thân­

ứ ọ ố ỗ ở ấ ả thòng l ng (stem­loop) có ch a chu i TAATATTAC gi ng nhau t c  các t

7  – C8  c a chu i này là n i protein Rep c t và n i b  gen

ị ố ộ ủ ắ ỗ ơ begomovirus. V  trí T

Begomovirus trong quá trình tái sinh.

ỗ ả ố ớ ủ ứ ộ ả   Đ i v i begomovirus có b  gen kép có ch a 1 chu i b o th  cao (kho ng

ữ ử ọ 150 nucleotide) gi a 2 phân t g i là vùng chung CR (Common Region). Vùng

ủ ọ ỗ ở CR có vai trò quan tr ng trong quá trình tái sinh c a DNA­B b i chu i ori­

ớ ố ằ ồ ố ỏ ủ ngu n g c tái sinh n m trên vùng này. Tuy nhiên, v i s  gen ít i c a mình,

ể ự ế ự ủ ậ ế DNA­B không th  t tái sinh trong t ầ  bào ký ch  mà c n có s  nh n bi t và

ố ủ ượ ắ c t­ n i c a protein Rep đ c mã hóa trên DNA­A ( Ha, 2008)

ạ Phân lo i các Begomovirus

ượ ế ớ Begomovirus đ c chia làm hai nhóm chính là nhóm Tân th  gi i (New

ế ớ ự ồ ỹ ự world) bao g m Châu M  và nhóm C u th  gi i (Old world) là khu v c Đông

ầ ồ bán c u bao g m châu Âu, châu Phi, châu Á ( Padidam, Stanley et al., 1999),

(Rybicki, 1994)

ế ớ ủ ế ớ ượ Các begomovirus c a hai nhóm tân th  gi ự i và c u th  gi i đ c phân

ệ ở ặ ấ ả ể ộ ở ụ bi t nhau b i đ c đi m b  gen. T t c  các begomovirus c m Tân th  gi ế ớ   i

ộ ở ụ ế ớ ề đ u có b  gen kép, trong khi đó các begomovirus ự  c m C u th  gi i có c  b ả ộ

ơ ấ ả ế ớ ự gen đ n và kép, thêm vào đó t t c  các ủ ụ begomovirus c a c m C u th  gi i có

ồ ạ ở ộ thêm m t gen AV2 trên DNA­A, gen này không t n t i ủ ụ    các virus c a c m

ế ớ ở ụ Tân th  gi i  (Rybicki et al., 1994; Stanley et al., 2005). Begomovirus c m Tân

ế ớ ỗ ở ầ ỏ ở th  gi i có chu i PWRsmaGT đ u N trong v  protein (CP) mã hóa b i gen

ủ ụ ự ỗ AV1, chu i này không có m t ặ ở begomovirus c a c m C u th  gi ế ớ Harrison i (

and Robinson, 2005)

ể ừ ự ấ ọ ằ Rybicki (1994) d  đoán r ng b  ph n di chuy n t Châu Á sang châu M ỹ

ể ổ ế ớ có th  đã mang t ủ ụ  tiên virus c a c m Tân th  gi ấ   i mà chúng ta quan sát th y

ộ ướ ế ngày nay. Các virus này sau đó ti n hóa theo m t h ớ ng khác v i các virus ở

ế ớ ự ụ c m C u th  gi i.

ủ Tái sinh c a Begomovirus

ế ơ Begomovirus tái sinh theo c  ch  vòng lăn (rolling circular mechanism).

ể ượ ế ơ ượ ự ệ C  ch  vòng lăn có th  đ c chia làm 2 pha và đ c th c hi n trong nhân t ế

bào ký ch  (ủ Gutierrez, Ramirez­Parra et al., 2004), (Picó, Díez et al., 1996). Pha

ặ ợ ợ ơ ộ ử ổ t ng h p s i DNA vòng đ n (b  gen có m t trong phân t ợ    virus) thành s i

ộ ượ ể ế ư ậ ợ DNA vòng kép khi b  gen virus đ c chuy n vào nhân t bào. Nh  v y s i kép

ộ ợ ươ ộ ợ ư ẫ ồ ẽ ồ s  g m m t s i virus và m t s i t ng đ ng virus. Pha này v n ch a đ ượ   c

ể ơ ế hi u rõ. (2) Pha tái sinh theo c  ch  vòng lăn: Protein Rep (sau khi đ ượ ổ   c t ng

ạ ờ ậ ệ ỗ ả ẽ ắ ợ ợ h p) s  c t s i virus t i chu i b o toàn TATATTAC. Nh  v t li u cũng nh ư

ủ ế ượ ổ ụ ợ enzyme DNA polymearase c a t ợ  bào, s i virus đ ợ   c t ng h p liên t c trên s i

ươ ồ ạ ế ụ ắ ợ ớ ượ ổ t ng đ ng virus. Protein Rep l i ti p t c c t s i virus m i đ c t ng h p t ợ ạ   i

ớ ượ ổ ộ ợ ừ ỗ ơ chu i TATATTAC (cũng v a m i đ c t ng h p) thành m t s i virus hoàn

ướ ạ ợ ơ ẽ ố ạ ẳ ầ ỉ ch nh d ủ   i d ng s i đ n m ch th ng. Protein Rep sau đó s  n i 2 đ u c a

ợ ơ ể ạ ạ ẳ ạ ộ ỉ m ch th ng đ  t o ra b  gen virus s i đ n m ch vòng hoàn ch nh.

ứ ệ ệ Tri u ch ng b nh do Begomovirus

ấ ủ ế ả ự ậ Do virus ph i d a hoàn toàn vào v t ch t c a t bào ả   ký chủ đ  sinh s n, ể

ả ấ ủ ầ ơ nên ở cây non và ph n non c a cây là n i virus sinh s n r t m nh. ạ Ở các cây,

ế ẽ ậ ỗ ạ ư ừ ầ ẳ ậ t bào già c i, quá trình này s  ch  m l ề   i hay h u nh  ng ng h n. Vì v y đi u

ạ ả ư ệ ệ ộ ủ ộ ườ ki n ngo i c nh nh : nhi ấ t đ  quá cao, quá th p, đ  pH c a môi tr ng, ánh

ưỡ ả ưở ế ể ế ộ sáng, ch  đ  dinh d ng, chăm sóc cũng có  nh h ệ   ng đ n quá trình bi u hi n

ứ ủ ệ ệ ườ tri u   ch ng   c a   b nh   do   các   begomovirus.   Tuy   nhiên,   thông   th ệ   ng   tri u

ủ ứ ệ ễ ể ấ ầ ầ ệ ch ng xu t hi n sau 2­4 tu n nhi m b nh và phát tri n đ y đ  trong vòng 2

ấ ượ ộ ề ậ tháng (Pico et al., 1996). M t ch t đ ả   ọ c nhi u nhà khoa h c xác nh n có b n

ể ấ ượ ả ủ ch t protein tan là interferon có th  đã đ c s n sinh ra ở ế  t bào ký ch  khi

ộ ấ ớ ồ ệ ậ ả ầ ộ virus xâm nh p. V i n ng đ  th p kho ng m t ph n tri u gram đã có kh ả

ả ủ ữ ứ ế ệ năng  c ch  sinh s n c a virus. Chính vì nh ng lý do trên b nh virus không gây

ượ ỷ ệ ườ ỷ ệ ự đ ạ c tác h i hu  di t ngay mà th ng gây thoái hoá. S  hu  di ỉ ả t ch  x y ra

ệ ề ườ ậ ợ ả khi đi u ki n môi tr ệ ng và cây b nh thu n l i cho virus sinh s n và lây

ủ ư ệ ễ ậ ị nhi m, nh  trong các tr n d ch c a b nh lúa vàng l ụ ở ướ  n i ữ c ta nh ng năm

̃ ̀ ̣ 1960. (Nguyên Thi Ha Uyên, 2012)

ứ ệ ớ ố ướ ề ấ Tri u ch ng s m nh t là lá cong xu ng d i vào phía bên trong. V  sau,

ỏ ẹ ế ạ ừ ữ lá không có hình d ng, nh  h p, bi n vàng t mép và chót lá lan vào gi a gân;

ế ạ ố lá cu n cong lên phía trên thành hình thuy n ề ; lá non bi n vàng m nh, giòn

ề ể ặ ắ ố ọ ọ ỏ ẹ . Cu ng lá có th  xo n v n. Cây lùn còi c c, m c nhi u cành và nh  h p

ỏ ố ễ ớ ườ ắ nhánh nh , đ t thân ng n. Cây nhi m s m th ị ụ   ả ng không ra qu  do hoa b  r ng

ệ ườ ờ ế ụ ệ ấ (Picó, Díez et al., 1996). B nh th ng xu t hi n vào các v  có th i ti t nóng

ư nh  hè thu và xuân hè.

ứ ệ ớ Hình 2.5. Tri u ch ng do Begomovirus gây ra trên t và cà chua

(httpwww.avrdc.org)

̀ ̀ ̣ Môi gi ́ ơ i truyên bênh va s  l ự an truy nề

ấ ả ề ự ấ T t   c   các   begomovirus   lan   truy n   ngoài   t ờ ọ   nhiên   nh   b   ph n   (B.

ữ ề ể ̣ Bemisa ầ tabaci) theo ki u b n v ng tu n hoàn (persistant­ circulant). Bo phân  ́

́ ́ ̣ ̣ ̣ ̀ ̀ tabaci   Gennadius   (1989)   thuôc   ho   rây   phân   (Aleyrodidae),   bô   canh   đêu

(Homotera).

́ ́ ́ ́ ́ ượ ̣ ̣ Cho  đên nay trên thê gi ́ ̀ ơ i co hai loai bo phân  đ ̀   c công nhân  đo la:

̀ ượ Bemisia  tabaci  va  ̀Bemisia argentifolii,  loai  ̀ Bemisia argentifolii  đ ́ c tim thây

́ ́ ̀ ở ự ̣ ̣ ̀ nhiêu ́  Hoa ky, Nhât, Phap, Colombia, Israel, Ai Câp, Trung Quôc, … S  khac

̀ ́ ̀ ́ ̃ ư ̉ ơ ̣ ̣ ̣ ̀ nhau gi a hai loai bo phân nay la B. ́ argentifolii ăn tap, măn đe h n, gây rôi loan

̀ ́ ̣ đôc tô cho cây trông.

́ ̀ ̀ ̀ ự ̣ ̣ Theo Navot va công s  (1991), bo phân ̣   Bemisia  tabaci  hoan thanh môt

̀ ́ ̀ ̀ ́ ̀ ơ ở ợ ̉ ̣ ̉ ̀ vong đ i khoang 20 – 30 ngay điêu kiên thich h p. Trung binh co khoang 11 –

̀ ̀ ́ ́ ́ ́ ư ư ̣ ̉ ̣ ̣ ̀ 15 l a/năm. Bo phân phat triên manh trong điêu kiên khô va nong, m a nhiêu

́ ́ ̀ ̀ ́ ́ ́ ̀ ươ ̉ ̣ ̣ ̣ ̉ lam giam mât đô bo phân, chung th ̀ ̉   ng chich hut va bay vao buôi sang, buôi

̀ ́ ́ ̀ ̀ ́ ́ ́ ́ ̀ ̣ ơ ̉ ̣ ̉ chiêu mat. Đê tranh anh sang măt tr i bo phân nup vao măt d ́ ̀ ́ ̣ ươ i cua la, điêu nay

̀ ́ ̀ ́ ́ ơ ợ ở ̉ ̣ ̣ ́ phu h p v i phân bô chu yêu ́ ́ ̣ ơ ̣ ơ  khi hâu nhiêt đ i va cân nhiêt đ i.

ứ ư ứ ằ Ch a có b ng ch ng ch ng minh begomovirus nhân lên trong c  th  b ơ ể ọ

ể ấ ấ ạ ẫ ọ ọ ị ph n. B  ph n dùng vòi ch c vào mô m ch d n đ  hút d ch cây t ừ ạ    m ch

ượ ớ ề ấ ộ phloem. Virus đ c hút qua vòi, t i di u, th m qua màng ru t vào xoang c ơ

́ ể ạ ớ ướ ọ ố ố ướ ̣ ̣ th , đ t t ế i tuy n n c b t và cu i cùng vào  ng n ́ c bot. Chung  hut dich

̀ ́ ̀ ́ ơ ̉ ̉ ̉ ̀ cây trong khoang 15 – 30 phut va tiêm ân trong c  thê chung  la 8­24 gi ̀ ̀ ơ   ơ  (th i

̀ ́ ́ ́ ̀ ̀ ̉ ̣ ̣ ̉ ̣ gian đê virus nâng cao nông đô trong bo phân) la chung co kha năng truyên bênh,

́ ́ ́ ̀ ̀ ́ ̀ ơ ̉ ̉ ̀ ơ   khoang th i gian đê chung truyên ngăn nhât la 15 phut (EPPO/CABI, 1996). Th i

̀ ̀ ́ ́ ́ ơ ̉ ̣ ̣ ̉ ̀ ̀ ơ   gian chich hut cua bo phân dai h n th i gian truyên dich virus sang cây khoe va

̀ ́ ́ ̀ ̀ ơ ở ̉ ̣ ̣ ̣ ̀ th i gian tiêm ân la 21 gi ̀ ơ . Bo phân hut dich cây giai đoan sâu non va ngay sau

́ ̃ ́ ̀ ́ ́ ̀ ưở ̉ ̣ ̣ khi hoa tr ̀   ng thanh chung co thê truyên nhiêm bênh virus theo hê thông va

́ ́ ́ ̀ ́ ̀ ̀ ơ ở ̣ ̉ ̣ ̣ không truyên lai cho đ i sau. Co thê phat hiên thây virus ́    bât ki giai đoan phat

́ ̀ ́ ư ̉ ̉ ̣ ̣ triên naocua bo phân t ̀ ư  giai đoan tr ng ( Ghanim and Czosnek, 2000). Triêụ

̃ ́ ̀ ́ ư ̣ ̣ ch ng xuât hiên trên cây con khi bi xâm nhiêm t ̀ ̀ ư  2 – 5 tuân. Virus không truyên

́ ư ̣ ́ qua ch ng bo phân.

ọ ấ Bemisia tabaci Hình 2.6. B  ph n

ệ ạ ế Thi t h i kinh t do Begomovirus gây ra

ề ệ ồ ượ ọ Nhi u   b nh   nghiêm   tr ng   trên   cây   tr ng   đã   đ ị c   xác   đ nh   là   do

ư ệ ệ ọ ộ ệ   begomovirus  gây ra nh  b nh b nh xoăn vàng lá (ng n) cà chua, m t b nh

ượ ể ệ ắ ấ đ c xem là b nh virus nguy hi m nh t trên cà chua kh p th  gi ế ớ Moriones i (

ệ ể ươ ự ệ and Navas­Castillo, 2000).Các b nh nguy hi m t ng t ắ   ả  là b nh kh m lá s n,

ố ệ ạ ớ ấ ệ b nh cu n lá bông ( Briddon, 2003). Trong đó gây thi ệ   t h i l n nh t là b nh

ọ xoăn vàng lá ng n cà chua.

ệ ệ ạ ớ ả ề ấ B nh xoăn vàng lá cà chua gây thi ấ   t h i l n c  v  năng su t và ch t

ượ ệ ở ệ ấ ọ l ng. B nh đã tr ắ    thành b nh virus quan tr ng nh t trên cây cà chua kh p

ớ ệ ệ ớ ậ ế Th  Gi ặ i, đ c bi t vùng nhi t đ i và c n nhi ệ ớ Picó, Díez et al., 1996). t đ i (

Phòng ch ngố

́ ́ ́ ̀ ̀ ́ ̃ ư ượ ư ̣ ̀ ̀ Cho đên nay vân ch a co loai thuôc hoa hoc nao phong tr  đ ́ ự c tr c tiêp

ừ ủ ế ự ̣ bênh do virus gây ra. Phòng tr begomovirus ch  y u d a vào 2 chi n l ế ư cợ

ệ ạ ố chính là phòng ch ng vector và t o cây kháng b nh.

́ ố Phòng ch ng vector ́  : (Kheyr­Pour, Bendahmane et al., 1991)  cho biêt, trên thê

́ ́ ́ ́ ́ ̀ ̀ ̉ ̉ ̉ ̣ ̣ gi ́ ơ i co khoang 500 loai cây la ky chu cua bo phân, chung co măt quanh năm trên

́ ̀ ́ ̀ ̀ ̀ ̀ ư ̣ ̣ ̣ ̣ ́   đông ruông. Đây la nguyên nhân khiên cho viêc phong tr  bo phân găp nhiêu kho

̃ ́ ́ ́ ư ̣ ̣ khăn. (Murugan and Uthamasamy, 2001) nghiên c u đăt bây dinh bo phân theo

̀ ̃ ́ ́ ́ ở ̣ ̣ ̣ ̣ doi măt đô bo phân trên canh đông bông ́  Coimbatace (Ân Đô) cho thây: t ̀ ư

́ ́ ́ ́ ượ ư ươ ̣ ̣ ̣ ́ thang 9 đên thang 3 năm sau l ng m a thâp, nhiêt đô cao, c ́ ̀ ng đô anh sang

̀ ́ ́ ̀ ́ ơ ̉ ở ̣ ̣ ̣ ̣ ̉ ́ ơ l n v i âm đô trung binh tao điêu kiên cho bo phân sinh sôi nay n  nhanh chong

́ ́ ́ ̀ ́ ư ̣ ̣ ̣ ̣ ̣ ̣ nên mât đô bo phân cao, t ̀ ́ ư  thang 5 đên thang 8 m a nhiêu nên mât đô bo phân

́ ́ ́ ́ ́ ̉ ̉ ̣ ̣ ̣ ̉ ̀ ư ̣   thâp, đinh cao cua mât đô bo phân khoang thang 11 đên thang 1 năm sau. T  đăc

́ ừ ọ ấ ượ ề ỹ ụ ề ệ ̉ ậ điêm đo, nhi u k  thu t phòng tr  b  ph n đ c áp d ng tùy đi u ki n:

ấ ố ọ + Dùng gi ng kháng b  ph n.

ọ ố + Dùng thu c hóa h c.

ồ ướ + Tr ng cây trong nhà l i, nhà kính.

ề ặ ẫ ấ ẫ ặ ả ạ ỉ ụ   + Dùng b y h p d n màu vàng ho c b  m t ph n x  (ch  áp d ng

ề ệ ệ ả ướ có hi u qu  trong đi u ki n nhà l i) .

ạ ố ể ượ ạ ­ T o gi ng kháng virus: Tính kháng begomovirus có th  đ c t o ra nh ờ

ế ơ ừ ừ ệ 2 c  ch : Tính kháng t cây và tính kháng t tác nhân gây b nh (PRD).

́ ̃ ́ ̀ ̀ ̀ ̃ ư ́ ơ ̣ ̣ ̣ ̣   Nh ng năm gân đây, cung v i tiên bô khoa hoc ki thuât cac nha khoa hoc

̃ ́ ́ ́ ̃ ́ ́ ̣ ự ̉ ợ ̣ ̉ đa tao ra cac giông ́ ̉   ơ t co kha năng chông lai s  xâm nhiêm, tai tô h p cua

̀ ́ ́ ̀ ́ ư ̉ ́   virus trong tê bao cây. Trung tâm nghiên c u va phat triên rau châu A

̀ ̃ ́ ́ ́ ̃ ư ́ ơ ̣ ̣ (AVRDC) đa lai tao ra nh ng dong ́ ́ ́ ơ t co tinh khang rât cao v i bo phân

́ ̃ ư ̣ Bemisia  tabaci cung nh  khang bênh do begomovirus gây ra. Ở ươ  n ́ c ta

́ ́ ́ ́ ́ ự ̣ ̣ ́ ư đang co d  an thi nghiêm nghiên c u tinh khang bênh virus (begomovirus)

́ ́ ́ ̀ ̀ ́ ̉ cu 34 giông ́ ơ t co nguôn gôc t ̀ ư  AVRDC (trung tâm rau mau thê gi ́ ̣   ơ i) tai

̀ ́ ́ ́ ̀ ̀ ̃ ươ ̃ ư ̉ ̉ Đông Thap b ́ c đâu đa cho nh ng kêt qua rât kha quan, đây đêu là các

ể ố ừ gi ng kháng chuy n gen dùng gen kháng t cây.

ộ ố ạ M t s  begomovirus h i cà chua

̀ ̣ ́ Hiên nay co t ́ ơ ơ i h n 50 begomovirus phân lâp t ̀ ́ ̣ ư  ca chua (co t ̀ ư  tomato ở

̀ ́ ượ ̃ đâu tên virus) đa đ ́ c công bô trên thê gi ơ Fauquet, Briddon et al., 2008). Trên ́ i (

́ ̀ ̀ ́ ̀ ́ ́ ư ̣ ̣ ̉ ́   cây ca chua, cac begomovirus  tao triêu ch ng giông nhau, điêm hinh la cuôn la

̀ ́ ́ ́ ́ ̀ ̣ ở ̣ ̣ ̉ ̣ ̉ ̀ (cong lai hinh thia); mep la (đăc biêt ́  la non) biên vang; la nho hep; cây nhiêm

́ ́ ́ ́ ̀ ́ ơ ̣ ̉ ̣ ̣ ̉ ̣ ̉ ̉ ́ ́ ơ s m coi coc v i ty lê đâu qua rât thâp. Danh tinh virus gây bênh chi co thê biêt

̀ ́ ́ ượ ự ử đ c d a vao cac phân tich phân t (Moriones & Navas­Castillo, 2000).

̀ ̀ ượ ̣ ̣ ̣ ̣ ̣ ́ Tai Viêt Nam, bênh xoăn vang la đ ́   c xem la bênh virus quan trong nhât

́ ̀ ̀ ̀ ̃ ́ ́ ơ ̉ ươ ̣ ̣ ̣ trên ca chua v i ti lê nhiêm bênh trên cac ruông trông ca chua th ́ ̀   ng rât cao, co

́ ̀ ượ ̃ ư ̣ ̣ khi t ̃ ́ ơ i 100%. Bênh đa đ ́ c phat hiên thây trên ca chua t ̀ ̣   ư  nh ng năm 80. Môt

́ ̃ ́ ̀ ́ ́ ư ượ ̣ ̉ ̣ ̃ sô nghiên c u vê tao huyêt thanh chuân đoan, lây nhiêm nhân tao đa đ ự   c th c

̃ ̃ ̀ ̀ ự ự ̀ ơ ư ư ̣ ̉ ̉ ́ hiên trong th i gian nay nh ng ban chât th c s  cua virus vân ch a ro. Gân đây

̀ ́ ́ ́ ́ ́ ́ ự ử ượ ̣ d a vao cac phân tich phân t ̀ , co it nhât  3 loai begomovirus đ c phat hiên gây

̀ ́ ̀ ̀ ̀ ở ́ ư ̣ ̣ ra bênh xoăn vang la ca chua ́ ̣    Viêt Nam. Loai th  nhât la Tomato leaf curl Viêt

̀ ̀ ượ ̣ ̣ ̣ Nam virus (ToLCVNV) đ c phân phâp t ̀ ̣ ư  cây ca chua bi bênh xoăn vang ngon

́ ̀ ̀ ̀ ̀ ở ́ ư miên Băc vao năm 2001 (Green et al., 2001), Loai  th  hai la Tomato yellow

̀ ượ ở ̣ ̉ leaf   curl   Kanchanaburi   virus   (TYLCKaV),   đ c   phân   lâp   đâu   tiên tinh

́ ̀ ượ ̣ ̀ Kanchanaburi  (Thai Lan) vao năm 2002 (Green et al., 2002) va đ ́ c phat hiên

̀ ̀ ́ ̃ ở ̣ ̉ ̣ trên cây ca chua ̃  Viêt Nam vao năm 2005 (ma sô Genbank cua mâu Viêt Nam

̀ ̀ ̃ ̀ ̣ ̣ ̣ la DQ169054, ­55). Năm 2007, t ̀ ư  môt mâu ca chua bi bênh xoăn vang ngon thu

̀ ̃ ̀ ̀ ́ ư ́ ơ ̣ ̣ ̣ ̣ ̃ thâp tai Ha Nôi, cung v i ToLCVV, môt loai begomovirus th  ba cung đa đ ượ   c

̀ ̀ ̀ ượ ̣ ̣ ̣ phân lâp.  Loai nay  đ c   đăt tên la Tomato yellow leaf  curl Viêt Nam  virus

́ ́ ̀ ượ ̣ (ToYLCKaV) (Ha et al., 2008). Trong sô 3 virus trên co 2 virus đ c phân lâp

̀ ̀ ̃ ́ ̀ ở ̣ ́ trên   mâu   ca   chua   gây   bênh   xoăn   vang   la ̀   miên   Băc   la   ToLCVNV   va ̀

TYLCVNV.

M t s ộ ố begomovirus hai ̣ ớ t

́ ́ ̀ ̉ ̣   Theo (Green and Kim, 1991)  co khoang 35 loai virus khac nhau gây hai

́ ́ ̀ ̃ ́ ̀ ̀ ́ ượ ̣ trên ́ ơ ở t ̀  cac vung trông trên thê gi ́ ơ i đa đ ̣   c phat hiên thi co 12 loai gây hai

̀ ́ ̀ ́ ́ ̀ ́ ươ trên ́ ơ ở t ́  Châu A Thai Binh D ng. Cho đên năm 2001 thi co đên 65 loai virus

́ ̃ ̀ ́ ́ ượ ̃ ư ̣ ̣ Begomovirus khac nhau đa đ ́ c phat hiên trong đo co nh ng loai thuôc chi

(AVRDC, 2001).

́ ́ ́ ư ́ ư ̉ ̣ Theo kêt qua nghiên c u  cua ( ̉ Green and Kim, 1991), triêu ch ng cuôn la ́

̀ ở ̣ ̀ Chilli Leaf Curl ́ ̀ ơ t trông ́  Banthra lan truyên qua bo phân Bemissia tabaci la do

Virus (ChiLCV) gây ra.

́ ̀ ̀ ượ ́ ơ ơ ̀ ́ ơ ̣ ̣ ́ Sô l ng cac loai virus m i gây hai trên ́ t ngot va ̀ t cay ngay cang đ ượ   c

̃ ́ ́ ơ ̣ ̣ ̣ ́ phat hiên ̀ .  Đa co h n 9 loai virus thuôc chi begomovirus  gây hai trên cac cây

̀ ̀ ̀ ở ́ trông khac ́  Trung Quôc va Đai Loan

ạ ễ ề ắ ọ ị ́ Ở ươ  n c ta, t ệ   i mi n B c, Nguy n Th  Thu Ng c (2009) đã phát hi n

ượ ự ụ ể ặ ủ Tomato yellow leaf curl virus đ c s  có m t c a begomovirus c  th  là 2 virus

ớ (TYLCVNV) và  Tomato leaf curl Vietnam virus  (ToLCVV) trên t. Tuy nhiên

ệ ạ ở ệ ạ ư ề ề ị hi n t i Vi t Nam l ầ   ứ i ch a có nhi u nghiên c u v  xác đ nh thành ph n

ạ ớ ạ ớ ệ b nh virus h i t nói chung và Begomovirus h i t nói riêng.

ớ ứ ệ ế ồ ố Trên t tri u ch ng do begomovirus gây ra g m có: bi n vàng, cu n lá,

ứ ả ạ ệ kh m lá,...Tri u ch ng c a ế   ủ Pepper leaf curl virus gây ra: gây h i là non, lá bi n

ị ố ạ d ng, b  cu n mép.

ằ ẩ ậ ỹ K  thu t ch n đoán b ng PCR

ớ ấ ủ ộ ọ ệ : PCR là m t trong các phát minh quan tr ng nh t c a th  k ế ỷ Gi i thi u

ọ ử ư ả ỹ 20 trong sinh h c phân t ậ ơ . PCR là k  thu t đ n gi n nh ng đ ượ ử ụ   c s  d ng

ứ ế ầ ế ườ ặ ệ trong h u h t các nghiên c u CNSH (Hà Vi t C ng, 2010), đ c bi t là trong

ự ệ ẩ ẩ ậ ỹ lĩnh v c ch n đoán b nh virus. Ngoài các k  thu t ch n đoán thông th ườ   ng

ể ắ ậ ẩ ỹ ị ỉ ằ b ng m t, ch  th , kháng nguyên­ kháng th  thì PCR là k  thu t ch n đoán cho

ự ế ả ả ấ ữ ệ ế k t qu  chính xác và hi u qu  nh t. Trên th c t ệ    nh ng loài tác nhân gây b nh

ọ ẽ ứ ữ ệ ươ ự trong cùng 1 chi hay 1 h  s  gây ra nh ng tri u ch ng t ng t nhau, khó phân

ệ ệ ồ ặ ế ệ ượ bi t. PCR giúp phân bi ờ t chính xác đ n loài nh  vào m i đ c hi u, đ c thi ế   t

ủ ủ ả ế k  trên vùng b o th  c a gen.

ả ứ ề ồ ợ ỳ ố   ổ Nguyên lý: PCR là ph n  ng sinh t ng h p DNA, g m nhi u chu k  n i

ỳ ồ ế ỗ ướ ti p nhau, m i chu k  g m 3 b c:

0C) trong kho ngả

ả ứ ế ỗ ợ ệ ộ Bi n tính: H n h p ph n  ng đ ượ ặ ở c d t nhi t đ  cao (92­94

ắ ờ Ở ệ ộ ạ ợ th i gian ng n (20­60 giây). nhi t đ  này, khuôn DNA d ng s i kép tách

ợ ơ thành s i đ n.

ả ứ ắ ỗ ồ ợ ượ ặ ở ệ ộ ắ ờ ồ G n m i: H n h p ph n  ng đ c đ t nhi t đ  g n m i trong th i gian

ắ ệ ộ ắ ồ ượ ể ặ ng n (35 giây). Nhi t đ  g n m i đ ồ   ộ c tính toán tùy thu c đ c đi m m i,

0C,

ườ ả ở ệ ộ ồ ượ ắ ợ th ng trong kho ng 40­60 nhi t đ  này m i đ c g n vào s i khuôn ở

ệ ặ ị v  trí đ c hi u.

ả ứ ẩ ả ỗ ợ ổ ợ ượ ớ T ng h p s n ph m PCR: h n h p ph n  ng đ c tăng t i nhi ệ ộ ố ư   i  u t đ  t

ả ứ ổ ợ ỗ ộ ị ệ cho ph n  ng t ng h p chu i, tùy thu c DNA polymerase ch u nhi t.

ậ ỹ K  thu t RCA (Rolling circle amplication)

ầ ộ ươ ả ậ ớ ỹ G n đây, m t ph ng pháp nhân b n DNA m i dùng k  thu t RCA

ượ ử ụ ể ộ (Rolling Circle Amplification) đã đ ạ   c s  d ng đ  nhân các b  gen DNA d ng

ủ ự ậ ạ ẩ ỹ m ch vòng. K  thu t RCA dùng enzyme DNA polymerase c a th c khu n th ể

ể ạ ạ ấ ộ Φ29, m t enzyme có ho t tính chuy n m ch (strand­displacement) r t cao, và

ồ ử ạ ể m i hexamer đ  nhân các phân t ạ    DNA m ch vòng thành các multimer m ch

ề ẳ ả ẩ ồ ộ ế th ng (g m nhi u b  gen virus liên ti p) (Hình 2.10) S n ph m RCA s  đ ẽ ượ   c

ắ ớ ạ ợ ượ ắ ằ c t b ng enzyme c t gi i h n thích h p và đ c dòng hóa trong các vector

ườ ụ ệ ậ ấ ỹ dòng hóa thông th ng. Đây là k  thu t hi n đang r t thông d ng trong nghiên

ể ả ệ ạ ộ ứ c u các virus có b  gen DNA m ch vòng k  c  các begomovirus và v  tinh

((Inoue­Nagata, Albuquerque et al., 2004), (Haible, Kober et al., 2006), (Knierim

Hình 2.7. Cơ chế tái bản các phân tử DNA mạch vòng bằng kỹ thuật RCA (Rolling

Circle Amplification) dùng hexamer và Φ29 polymerase DNA

and Maiss, 2007)).

(Fujii, Kitaoka et al., 2006)

ậ ỹ ượ ứ ể ế ế ấ K  thu t RCA đã đ ụ c  ng d ng đ  thi ễ   t k  các c u trúc xâm nhi m

ả ạ ượ ắ ơ ẩ ủ c a begomovirus.S n ph m RCA d ng multimers đ ằ c c t đ n b ng enzyme

ớ ạ ề ệ ợ ệ ể ể ạ ề ắ c t gi i h n thích h p trong đi u ki n không tri ả   t đ  đ  t o ra nhi u s n

ề ẩ ộ ộ ộ ph m monomer (1 b  gen), dimer (2 b  gen) và multimer (nhi u b  gen). Ch ỉ

ả ượ ế ỏ ố ẩ các s n ph m dimer đ c tinh chi t kh i gel agarose và n i vào vector nh ị

ủ ễ ễ ả ằ ơ ấ nguy n.B ng cách đ n gi n này, các c u trúc xâm nhi m c a begomovirus có

ể ượ ạ th  đ c t o ra khá nhanh chóng. ( Inoue­Nagata, Albuquerque et al., 2004),

(Knierim and Maiss, 2007), (Ferreira, Lemos et al., 2008), (Wu, Lai et al., 2008),

(Wu, Lai et al., 2008), (Wyant, Gotthardt et al., 2011).

̃ ̣ Ki thuât Agroinoculation

ễ ể ậ ấ ỹ ế K   thu t   chuy n   c u   trúc   xâm   nhi m   vào   t ẩ   ờ   bào   cây   nh   vi   khu n

ượ ậ ọ ỹ A.tumerfaciens đ ể   c g i là agroinoculation.Agroinoculation là k  thu t chuy n

ễ ế ẩ A. tumerfaciens. ấ c u trúc xâm nhi m vào t ờ  bào cây nh  vi khu n

ẩ ấ ượ ử ̣ Agrobacterium tumerfaciens là vi khu n đ t, gram (­), đ c s  dung nh ư

́ ̀ ́ ̀ ̀ ́ ự ự ̉ ̣ ̣ A. cac vector t nhiên đê mang cac gen ngoai lai vao mô va tê bao th c vât.

́ ́ ̀ ộ ́ ư ́ ơ ̉ ̣ tumerfaciens  co ch a m t plasmid l n kich th ́ ươ c khoang 200 kb goi la Ti­

̀ ̀ ̣ ́ plasmid (Tumor inducing plasmid) chinh la tác nhân truyên bênh cho cây. Khi

́ ́ ̃ ́ ̀ ươ ̣ ̉ ̣ ̣ cây bi nhiêm  ̃ A. tumefaciens qua cac vêt th ́ ng, biêu hiên bênh ro nhât la cac

̀ ̀ ́ ́ ̃ ̃ ̀ ượ ở ự ́ khôi u đ c hinh thanh ́ ̀    ngay chô lây nhiêm. S  hinh thanh khôi u sau đo co

́ ̀ ̀ ́ ̉ ̣ ̉ ̣ ̣ ̉ ̉ ̉ ̀ ́ ự thê tiêp tuc ma không cân thiêt phai co s  hiên diên cua vi khuân. Kha năng nay

̃ ́ ượ ộ ̉ ̣ ̉ co đ c do A. tumefaciens đa chuyên m t đoan DNA cua Ti­plasmid (T­DNA)

́ ́ ́ ̃ ́ ̀ ự ưở ̣ ̣ ̉ ̣ ̣ ̣ xâm nhâp vao hê gen cua cây bi bênh, dân đên s  rôi loan cac chât sinh tr ng

́ ̣ ̣ nôi sinh, tao ra khôi u.

ễ ậ ỏ ộ ồ ỹ ấ K  thu t agroinoculation đòi h i 1 c u trúc xâm nhi m bao g m b  gen

ệ ặ ượ ế ế ứ ố ở virus (ho c v  tinh) đ c thi ồ t k  ch a 2 ngu n g c tái sinh ( ori) ầ  2 đ u và

ượ ữ ờ ả ủ ắ ấ ờ ị ị đ c g n vào v  trí gi a b  trái và b  ph i c a 1 vector nh  nguyên. C u trúc

ẽ ượ ế ế ễ xâm nhi m s  đ ạ c bi n n p vào t bào vi khu n ẩ A. tumerfaciens.   Khi lây

ế ớ ế ủ ễ nhi m, t ẩ ẽ ế  bào vi khu n s  ti p xúc v i t ứ    bào cây ký ch  và các protein ch c

ữ ờ ể ẽ ằ ằ ầ ộ năng (n m trên Ti­plasmid) s  chuy n toàn b  ph n DNA n m gi a b  trái và

ả ủ ấ ễ ế ủ ổ ợ ờ b  ph i c a c u trúc xâm nhi m vào nhân t ầ    bào cây ký ch  và t ng h p ph n

ộ ế ủ ế ứ ể DNA này vào b  gen t bào cây ký ch . Trong t bào ch a gen chuy n,  gen

ẽ ượ ủ ẽ ắ ộ ể ệ Rep c a virus s  đ c bi u hi n thành protein Rep. Protein Rep s  c t b  gen

ế ạ ị ố ạ ệ ặ ỗ ỏ ộ virus kh i b  gen t bào cây t i v  trí đ c hi u trên chu i ori và n i l i thành

ẽ ự ứ ệ ẹ ẹ ộ ộ b  gen virus nguyên v n. B  gen virus nguyên v n này s  th c hi n ch c năng

ệ ọ sinh h c và gây b nh.

ố

ủ

ễ

Hình 2.8. Kh i u do A.tumerfaciens gây ra

Hình 2.9. Quá trình lây nhi m c a Ti

Plasmid trong A.tumerfaciens vào cây

A: Agrobacterium tumefaciens. B: Agrobacterium genome. C: Ti

Plasmid  : a: T­DNA , b: Vir genes , c: Replication origin , d: Opines

catabolism genes. D: Plant cell. E: Mitochondria. F: Chloroplast. G: Nucleus

ậ ỹ ấ Có 3 k  thu t agroinoculation chính là: (i) th m chân không (lá cây đ cượ

ẩ ị ượ ử ể nhúng trong dung d ch vi khu n, đ c x  lý chân không đ  hút khí trong gian

ẩ ẽ ễ ậ ổ bào; vi khu n s  d  dàng xâm nh p vào trong mô qua khí kh ng khi áp su t tr ấ ở

ạ ườ ẩ ướ ự ế ị l i bình th ng); (ii) tiêm tr c ti p ự ế vi khu n vào mô; và (iii) t i tr c ti p d ch

ẩ ấ vi khu n vào đ t

Ậ ƯƠ Ệ V T LI U VÀ PH Ứ   NG PHÁP NGHIÊN C U

ượ ư ́ Đôi t ́ ng nghiên c u

Virus: Pepper yellow leaf curl virus (PepYLCV)

ớ t, cà chua Cây:

̀ ơ ự ứ ị ̣ Đ a đi m ̀ ể  nghiên c u va th i gian th c hiên

̣ ̉ Đia điêm nghiên c ú ư

ề ẫ ộ ồ ộ ượ ệ ạ ự ồ ­ Đi u tra, thu m u đ ng ru ng đ ng ru ng đ c th c hi n t ồ   i Khu tr ng

ứ ư ộ rau Lĩnh Nam (Thanh Trì – Hà N i), Văn Đ c (Văn Giang – H ng Yên),

ỳ ụ Qu nh Ph  (Thái Bình)

ệ ượ ệ ạ ự ứ ­ Thí nghi m trong phòng đ c th c hi n t ệ   i Trung tâm nghiên c u b nh

ệ ớ ườ ạ ọ ệ ộ cây nhi t đ i ­ Tr ng Đ i h c Nông nghi p Hà N i.

ờ ự ̣ Th i gian th c hiên

ừ T  tháng ế 1/2014 đ n tháng 7/2014

ậ ệ ứ V t li u nghiên c u

Cây thí nghi m: ệ

́ ̉ ̣ Bang 3.1. Cây thi nghiêm

ể ặ STT Cây Gi ngố ố ồ Ngu n g c Đ c đi m

ẩ

1 Cà chua AVRDC AVTO108 0 ễ   Chu n nhi m (không ch a ứ gen kháng)

ễ ẩ 2 Cà chua HT7 Chu n nhi m BM DT­ Gi ngố

ễ ẩ 3 tỚ Chu n nhi m ể Hi m Lai F1 Đ aị   ngươ ph

ố

4 AVRDC ả   Thu c lá c nh (Nicotiana  benthamiana) Cây mô hình  cho virus th cự   v tậ

ố ị 5 Thu c lá (N. tabacum) AVRDC Cây ch  thỉ cv.  Samsum

ố ị 6 Thu c lá (N. tabacum) cv. Xanthi AVRDC Cây ch  thỉ

ố ị 7 Thu c lá (N. tabacum) cv. K326 Cây ch  thỉ Vi nệ   NCTL

ố ị 8 AVRDC Cây ch  thỉ Thu c lào (N. glutinosa)

ị 9 Cây d iạ Cây ch  thỉ

Hoa ngũ s cắ   (Ageratum  conyzoides)

ễ ẩ 10 Cà bát Chu n nhi m Đ aị   ngươ ph

ễ ẩ 11 Cà pháo Chu n nhi m Đ aị   ngươ ph

̣ Thu thâp mâũ

̀ ́ ̃ ́ ̀ ́ ư ượ ̣ ̉ ̣ ̉ Mâu  bênh co triêu ch ng điên hinh đ c thu thâp t ̀ ̣ ư  cac đia điêm điêu tra

̀ ượ ̉ ̉ ̉ ̣ ̉ ̉ ́ (bang 3.3), sau đo đ c bao quan khô băng hat Silicagel đê kiêm tra virus.

̀ ́ ả ơ B ng 3. 2. Các m u ẫ ́ t, ca tim ậ  thu th p (2013)

ị ể ự ứ ệ Ký hi uệ Tri u ch ng Đ a đi m, khu v c thu m uẫ Đ iố   ngượ t

́ ́ ả VNP 4 FAVRI t́Ơ ̀ Kh m vang, cuôn la

̀ ́ VNP 93 Đà N ngẵ Xoăn vang la t́Ơ

̃ ́ ̀ ́ ̉ VNP 96 Tuy Loan­ Đa Năng ́ Cuôn la, kham t́Ơ

̀ VNP 120 ́ Thai Binh Kh mả t́Ơ

́ ̣ ̉ ̣ ̉ VNP 179 Cam lô­ Quang Tri ́ Cuôn la, kham t́Ơ

̀ ươ VNP 192 ̀ Cam Đ ng­ Lao Cai Kh mả t́Ơ

̀ VNP 217 ̀ ơ Co Noi­ S n La Kh mả t́Ơ

́ ̉ VNP 234 ́ Cô Phuc­ Yên Bai Kh mả t́Ơ

̀ ơ VNP 246 Chiêng Sinh­ S n La Xoăn lá t́Ơ

̀ ́ ơ ̉ VNP 251 Chiêng Sinh­ S n La ́ Cuôn la, kham t́Ơ

́ ươ ̉ VNP 291 ̃ Vinh T ́ ̃ ̀ ng­ Vinh Phuc ̀ Kh m ả vang, la nho t́Ơ

́ ̀ ̀ ́ ơ ̣ VNP 300 Soc S n­ Ha Nôi Xoăn vang la t́Ơ

́ ́ ̉ VNP 306 Yên Thê­ Băc Giang Kham vang̀ t́Ơ

̀ ̉ VNP 313 Châu Thanh­ An Giang Kham vang̀ t́Ơ

̀ ̃ ̉ ̉ ̉ VNP 453 Vinh Bao­ Hai Phong Kham vang̀ t́Ơ

̀ ́ ̀ ́ ̣ VNP 456 Quynh Phu­ Thai Binh Sang gân t́Ơ

́ ́ ̀ ́ ̀ ư ̣ VNP 459 Quynh phu­ Thai Binh Sang gân t ̀  cuông t́Ơ

̀ ̀ VNP 535 Hoa An­ Cao Băng Kham̉ t́Ơ

́ ợ ơ ̣ VNP 558 ́ Ch  M i­ Băc Kan ả Kh m nh ăn t́Ơ

́ ̀ ̃ VNP 626 Tuy Loan­ Đa Năng Kh m ả t́Ơ

́ ̀ ̃ ả VNP 632 Tuy Loan­ Đa Năng Kh m vàng t́Ơ

̀ ả ̣ ̉ VNP 634 Điên Ban­ Quang Nam Kh m vang̀ t́Ơ

̀ ́ ̀ ̣ ̉ VNP 649 Phu Cat­ Binh Đinh Kham vang̀ t́Ơ

́ ̀ ̀ VNP 683 ́ Thai Binh­ Đông Thap Kh mả t́Ơ

̀ ả VNP 706 Châu Thanh­ An Giang Kh m vàng t́Ơ

́ ́ VNP 716 Yên Thê­ Băc Giang Kh m ả t́Ơ

̀ ̀ ơ ̉ VNP 785 Binh Thuy­ Cân Th Kh m ả t́Ơ

́ ̀ ươ ̉ ̉ t́Ơ VNP 961 An D ng­ Hai Phong̀ Kham, biên vang

̃ ̀ ́ ̀ ́ t́Ơ ́ Cao Lanh­ Đông Thap La vang, gân sang VNP  1500

́ ̀ ̀ ́ ́ Thai Binh­ Đông Thap Ca tim̀ ́ ̀ Vang la VNP  1501

̀ ́ ệ ẫ ớ ộ ố ồ ượ Các m u gây b nh virus trên ca tim, t và m t s  cây tr ng khác đ c chúng

ậ ử ụ ủ ế ậ ứ ứ tôi thu th p s  d ng cho nghiên c u này,ch  y u t p trung nghiên c u m t s ộ ố

ẫ ọ ớ ề ệ m u begomovirus quan tr ng trên ́ t,cà tim thu đ ượ ạ c t i mi n Trung Vi t Nam

ủ ữ ứ ư ệ ặ ớ v i nh ng tri u ch ng đ c tr ng c a begomovirus..

ễ ủ ấ Dòng vi khu n Agrobacterium tumefaciens  mang c u trúc xâm nhi m c a

ẩ PepYLCVNV

ả ộ ộ PepYLCVNV là m t begomovirus có b  gen kép (có c  DNA­A và DNA­

ủ ả ủ ễ ấ ầ ượ B). C u trúc xâm nhi m c a c  2 thành ph n genome c a virus đã đ c xây

ự ậ ự ể ẵ ượ d ng s n trên vector chuy n gen th c v t là pCAMBIA2300 và đã đ ế   c bi n

ế ủ ẩ A. ạ n p   vào   t bào A.   tumefaciens  ch ng   LBA4404.   Hai   dòng   vi   khu n

ủ ễ ấ tumefaciens mang c u trúc xâm nhi m c a PepYLCVNV là:

ủ ủ ễ ễ ấ ấ ­ AT­5­4­11: mang c u trúc xâm nhi m c a DNA­A ­ AT­5­8­1: mang c u trúc xâm nhi m c a DNA­B

oC. Ba

ẩ ả ượ ả ả ở C  hai dòng vi khu n trên đ c b o qu n trong glycerol 15% ­80

ọ ọ ễ ẩ ấ kháng sinh ch n l c các dòng vi khu n mang c u trúc xâm nhi m là:

ẩ ộ ằ ­ Rifampicin: gen kháng n m trên b  genome vi khu n

ỗ ợ ằ

­ Streptomycin: Gen kháng n m trên plasmid h  tr  (Ti plasmid pAL4404)

ẵ ế ẩ có s n trong t bào vi khu n

ằ

­ Kanamycin: Gen kháng n m trên plasmid pCAMBIA2300.

M i ồ PCR

ặ ệ ủ Begomovirus là BegoA­ReV1 & ồ C p m i chung phát hi n DNA­A c a

Bego­AFor1 (Ha Viet Cuong et al., 2006).

BegoA­ReV1: 5’­ ATHCCMDCHATCKTBCTiTGCAATCC*­3’

BegoA­For1  : 5’­ TGYGARGGiCCiTGYAARGTYCARTC* ­3’

*  Y (C / T), R (G / A), H (A / C / T), M (A / C), B (C / G / T), D (A / G /

T), K (G / T) và i = inosine.

ồ ặ ệ ượ ử ụ ặ + Các c p m i đ c hi u đ c s  d ng:

ả ồ ặ ệ B ng 3. 3. Các m i đ c hi u

No Primer Sequence Aim

S nả   ph mẩ   (kb)

1 VNP93­A­F1 CATGCTAGTAATCCAG TGTATGC ~1.3

Detection  DNA­A of  PepYLCVNV 2 VNP93­A­R1 ATCTGCCAACGACGCA TATGC

3 VNP93­B­F1 GTGATTCATGTTATAC GCCTTCG ~1.3

Detection  DNA­B of  PepYLCVNV 4 VNP93­B­R1 TCAATCGCTCTGCCTT CTCTC

5 BegoAReV1 ATHCCMDCHATCKTBC TiTGCAATCC*

~1.2 Detection  DNA­B of  Begomovirus 6 BegoAFor1 TGYGARGGiCCiTGYAA RGTYCARTC*

ậ ệ ứ V t li u nghiên c u

ấ Ch t  kháng sinh

ượ ử ụ ứ ồ Các   kháng   sinh   đ c   s d ng   trong   nghiên   c u   g m:   Rifampicin,

ượ kanamycin, streptomycin, tetracylin. Các kháng sinh đ ẩ c chu n b  d ị ướ ạ   i d ng

ư ị ố dung d ch g c nh  sau:

­  Rifampicin 34 μg/μl: hòa 0,034 g trong 1 ml Methanol

ướ ấ ầ ­  Kanamycin 100 μg/μl: hòa 0,1 g trong 1 ml n c c t hai l n

ướ ấ ầ ­  Streptomycin 50 μg/μl: hòa 0,05 g trong 1 ml n c c t hai l n

­  Tetracylin 12,5 μg/μl: hòa 0,012 g trong 1 ml ethanol 70 %

oC, trong đó rifampicin

ượ ả Các kháng sinh đ c b o qu n ả ở ủ ạ  t l nh sâu – 20

và

ượ ọ ạ ấ kanamycin đ ằ c b c kín b ng gi y b c.

ẩ ử ụ ứ ủ Các ch ng vi khu n s  d ng trong nghiên c u

ả ế ủ ẩ Ch ng vi khu n A. tumefaciens kh  bi n

ủ ượ ử ụ ủ Ch ng vi khu n ẩ A.tumefaciens  đ c s  d ng là LBA4404. Ch ng này

ứ ằ ộ ch a   Ti   plasmid   pAL4404.   Gen   kháng   Rifampicin   n m   trên   b   genome   vi

Hình 3.1.Hình thái vi khuẩn A.tumefaciens

ẩ ằ khu n còn gen kháng streptomycin n m trên Ti plasmid pAL4404.

ả ế ủ ẩ Ch ng vi khu n E.coli  kh  bi n

ủ ẩ ượ ử ụ ủ ủ Ch ng vi khu n E.coli đ c s  d ng là ch ng XL1­Blue. Ch ng này

ủ ứ ẩ ộ ằ ch a gen kháng Tetracylin n m trên b  gen c a vi khu n

ệ ấ ị Hóa ch t, dung d ch đ m

̀ ́ ́ ́ ́ ̀ ́ ́ ́ ́ ̣ ̉ ̣ ̣ Cac hoa chât thông dung va hoa chât đê pha dung dich đêm, chât nên, cac khang

́ ử ̉ ̣ ́ huyêt thanh cua cac virus th  nghiêm..

ệ ệ Đ m đi n di agarose (1X TAE): 10 mM Tris­acetate, 0.5 mM EDTA (pH  7.8).

ệ Đ m     CTAB:     2%   CTAB   (hexadecyltrimethylammonium   bromide),  2%   PVP

(polyvinylpyrrolidone), 100 mM Tris­HCl pH 8.0 và 25 mM EDTA

ệ Đ m TE, pH8: 10 mM Tris­Cl and 1 mM EDTA

β Beta­mercaptoethanol ( ­ME)

ệ ế Đ m chi t Chloroform:isoamyl alcohol (24:1)

ệ ố ồ C n tuy t đ i

Agarose

ươ ạ Kit th ng m i

ứ ẵ ả ứ ệ Kít PCR: GoTaq Green (hãng Promega) ch a s n đ m ph n  ng, Taq

polymerase, dNTPs

Môi tr ngườ

ườ ỏ a. Môi tr ng LB l ng :

Bacto®­tryptone (10g/L), Bacto®­yeast extract (5g/L)và NaCl (5g/L).

́ ̀ ̀ ́ ́ ̀ ượ ượ ử ̀ Cac thanh phân đ c hoa trong n ́ ̀ ươ c cât va môi tr ̀ ươ ng đ c hâp kh  trung

oC trong 20 phut́. Các kháng sinh cho vào môi tr

ườ 121ở ả   ấ ng đang  m kho ng

ướ ử ụ 55oC tr c khi s  d ng.

ườ ầ ố ườ ư ỏ b. Môi tr ng LB agar: Thành ph n gi ng môi tr ứ   ng LB l ng nh ng ch a

̀ ̀ ̀ ́ ượ ́ 15g agar/L. Cac thanh phân đ c hoa trong n ́ ̀ ươ c cât va môi tr ̀ ươ ng đ ượ   c

oC trong 20 phut. Đê môi tr

oC

̀ ́ ́ ở ươ ̉ ̣ ̉ ử hâp kh  trung 121 ̀ ng nguôi khoang 55

́ ̀ ̃ ́ ́ ̀ ượ ̀ rôi rot vao đia petri đ ̀ ươ ng kinh 9 cm. Các kháng sinh cân thiêt đ ̉  c bô

̀ ̃ ươ sung tr ́ ́ ươ c khi  rot môi tr ̀ ng vao đia petri.

ế ị ủ ế Các thi t b  ch  y u

Máy PCR

ế ị ệ Thi t b  đi n di

́ ̣ ̉ May đoc ban ELISA

ồ Bu ng c y ấ vô trùng

ồ ấ N i h p

T   mủ ấ

ủ ấ ắ T   m có l c

̣ ử Cân điên t

̉ ̣ Tu đinh ôn

̣ ̣ Dung cu nghiên c ú ư

́ ự ̣ Pipet t đông 1 côn: 10­20 μm, 100 μm, 200 μm, 100­1000 μm …

̀ ự ̣ ́ Pipet t đông 8 đâu côn.

́ ̃ ự Tui PE đ ng mâu.

́ Ông đong 10­1000 ml.

̀ ̉ ̣ Binh thuy tinh loai 50­1000 ml.

́ ̃ ́ ̣ ̉ ̣ Phêu loc, vai loc, giây thâm.

́ ́ ự ự ̣ ̉ Hôp nh a co năp đ ng ban ELISA.

ươ Ph ng pháp nghiên c ú ư

́ ươ ồ ộ ề Ph ng phap đi u tra đ ng ru ng

̀ ̀ ́ ươ ̉ ̣ ̣ ̣ ̣ ̉ Ph ng phap điêu tra ty lê bênh virus hai cây ca chua, ́ ơ ở t ́  ruông san xuât:

́ ́ ̀ ̀ ́ ươ ́ ư ̣ ̣ ̣ ̣ Ap dung ph ng phap nghiên c u, điêu tra va phat hiên bênh hai theo

́ ươ ̣ ự ̣ ự ̉ ̉ ̣ ̉ ̣ ́ ư ng phap nghiên c u bao vê th c vât “Ph ̣ ” cua Viên bao vê th c vât (2003).

ồ ỗ ớ ề ạ ố ỗ ộ ̣ ̣ ể M i đi m tr ng ệ t đi u tra 3 ru ng đ i di n cho m i gi ng. Đai diên

̀ ́ ̀ ́ ưở ươ ̣ ̉ ̉ cho giai đoan sinh tr ng va phat triên cua cây. Điêu tra theo ph ng phap 5

̀ ̃ ́ ́ ́ ́ ́ ̀ ơ ́ ơ ̉ ̉ ̣ ́   điêm cheo goc ( cach b  2 met) môi điêm điêu tra 50 ­100 cây đoi v i ruông co

́ ́ ́ ́ ̀ ́ ́ ơ ́ ơ ̣ ̣ ̣ ̉ diên tich l n, điêu tra 100% sô cây đoi v i ruông co diên tich nho.

̀ ́ ̀ ́ ̀ ̃ ̀ ̣ ̣ ̣ ̣ ̉ ̣ ̣ Theo doi đinh ky 10 ngay môt lân , thu thâp sô liêu va tinh ti lê bênh.Quan

̀ ́ ̀ ̃ ự ́ ư ̉ ̣ ̉ ̣ ̣ ̉ ̉ ̣ sat va mô ta đăc điêm cây nhiêm bênh. D a trên triêu ch ng điên hinh cua bênh

́ ̀ ́ ư ̣ ̉ ̣ ̣ PepYLCVNV trên đông ruông tinh ti lê bênh theo công th c:

TLB (%) =    x100

̉ ̣ ̣ Trong đo: ́ TLB: ti lê bênh (%)

́ ̣ ̣ A: sô cây bi bênh

̀ ̉ ́ B: tông sô cây điêu tra

́ ́ ̃ ́ ̀ ̀ ̀ ́ ươ ̣ ̣ ̣ ̉ Ph ng phap điêu tra diên biên mât đô bo phân: Tiên hanh điêu tra theo 5 điêm

́ ́ ̀ ́ ̃ ̀ ́ ̀ ́ ̃ ưở ̉ ̣ ̣ cheo goc, môi điêm cô đinh 5 cây, trên môi cây đêm toan bô âu trung va tr ng

̀ thanh.

́ ́ ̃ ươ ̣ ̣ Ph ng phap thu thâp mâu la bênh:

́ ̀ ượ ưở ạ ỗ ồ ớ ̣ Đ c tiên hanh theo giai đoan sinh tr ng, t ể i m i đi m tr ng t, thu 3

ẫ ượ ố ệ ệ ể ẫ ố ớ ờ ứ m u/gi ng v i tri u ch ng đi n hình. Các m u đ ị   c s  li u hóa (th i gian, đ a

ứ ể ệ ạ ưở ượ ử đi m, tri u ch ng, giai đo n sinh tr ng) và đ ằ c x  lý khô b ng silicagel t ự

ị ể ả ả ỉ ch  th  đ  b o qu n lâu dài.

́ ̣ ̀ Thi nghiêm trong nha l ́ ươ i

ệ ấ Phân c p b nh

ử ụ ứ ể ệ ấ S  d ng thang phân c p sau đ  đánh giá tri u ch ng

ả ệ ấ B ng 3. 4. Thang phân c p b nh

ả ệ ứ C pấ Mô t tri u ch ng M c đứ ộ

ườ ứ ệ ấ 1 Cây bình th ệ ng , không xu t hi n tri u ch ng gì Cây kh eỏ

ứ ẹ ệ ấ ả ơ ẹ 2 ặ ắ ầ Lá vàng r t nh  , kh m, ho c b t đ u có tri u ch ng h i quăn R t nhấ

ứ ẹ ệ ả ặ 3 Lá vàng nh , kh m ho c có tri u ch ng quăn Nhẹ

ừ 4 Lá vàng và quăn l iạ ả V a ph i

ữ ộ ồ ộ ị 5 Lá vàng d  d i, cong và  lá b  ph ng d p N ngặ

ế ạ ỏ 6 ọ Lá bi n d ng, lá nh , cây còi c c ấ ặ R t n ng

ươ ể ằ Ph ng pháp ki m tra virus b ng PCR

ế ổ Chi t DNA t ng s ư  ố   t ́ ̀    mô la

ố ừ ượ ế ươ ổ DNA t ng s  t mô lá đ c chi t theo 2 ph ng pháp:

ươ ế ằ ng pháp chi t nhanh nhanh b ng NaOH +  Ph (Wang, Qi et al., 1993,

Wang, Cardiff et al., 1994)

ệ ế ả ẫ Cho kho ng 50 mg mô lá m u b nh vào tube 1,5 mL, cho ti p 500 µl

ự ụ ị dung   d ch   NaOH   0,5   M   vào   tube   1,5mL,   dùng   chày   nh a   chuyên   d ng   đ ể

ễ ệ ề ẫ ấ ị nghi n nhuy n m u lá. L y 100 µl dung d ch đ m Tris 0,1 M, pH = 8 vào tube

ề ề ẫ ấ ị ứ   1,5mL, sau khi nghi n m u xong l y 2 µl d ch nghi n cho vào tube 1,5mL ch a

ệ ị ị ượ dung d ch đ m Tris 0,1M, pH = 8. D ch hòa loãng này đ ể ạ c dùng đ  ch y PCR.

ươ ế ệ ằ ị ng   pháp   chi t   DNA   b ng   dung   d ch   đ m   CTAB     ( +  Ph Cetryl

ư Ammonium Bromide ) theo mô t ả ủ Doyle, 1987) nh  sau: c a (

β β ́ ươ ở ̉ ̣ B c 1: U đêm CTAB +  ­ME (100 µl  ­ME + 10 ml CTAB) 65oC trong 30

phut.́

́ ́ ̀ ̃ ̀ ươ ̉ ̉ ̣ ̣ B c 2: Cho mâu bênh cân chuân đoan vao tube 1,5 mL theo ti lê 0,1g/1 ml đêm

CTAB +  ­MEβ

́ β ̃ ́ ̀ ̀ ươ ̉ ̣ B c 3: Cho vao tube 500 µl CTAB +  ­ME. Nghiên nho mâu, lăc nhe.

oC, trong khang 5 phut.́

́ ̀ ươ ̉ ̣ ̉ B c 4: U trong điêu kiên 60 ­ 65

́ ươ ́ B c 5: Ly tâm 7 phut.

́ ́ ươ ̣ ̉ ̉ B c 6: Lây dich trên tua (khoang 400 µl)

́ ́ ươ ươ ươ ̣ ̉ ̣ ́ B c 7: Chiêt môt thê tich t ng đ ng (400 µl) dung dich Chlorofom : isoamyl

alcohol (24:1).

́ ươ ́ B c 8: Ly tâm trong 5 phut.

́ ́ ươ ̣ ̉ ̉ ̉ ̉ ̣ ̉ B c 9: Lây dich trên tua (khoang 300 µl), đê trong tu lanh ­20 oC trong khoang

́ ́ ́ it nhât 2 phut.

́ ̀ ́ ươ ́ ơ ̉ ̣ B c 10: Chiêt lân 2 v i 300 µl Chlorofom : isoamyl alcohol (24:1). Đê lanh 5

phut.́

́ ươ ́ B c 11: Ly tâm trong 5 phut.

̀ ́ ́ ươ ̣ ̉ ̉ B c 12: Lây dich trên tua (khoang 200 µl) cho vao tube 1,5 mL.

́ ́ ươ ươ ươ ̉ ̣ ̉ ̉ ̣ B c 13: Bô sung môt thê tich t ng đ ng  (khoang 200 µl) isopropanol lanh.

oC trong 20 phut ́

̉ ở ̣ ̣ Đê nhiêt đo ­20

̀ ́ ́ ươ ́ B c 14: Lăc đêu, ly tâm trong 15 phut.

́ ́ ́ ̣ ̉ ̣ ̉ ̣ ̉ ̣ Loai bo dich trên tua, gi ̃ ư ̣  lai căn. Spin trong 15 phut đê hut hêt dich trong tube ra.

́ ̀ ươ ử ̣ ̉ ́ ơ B c 16: R a căn DNA 2 lân v i etanol 70% (khoang 700 µl).

̀ ́ ̀ ươ ̣ ́ B c 17: Lam khô căn băng không khi.

́ ́ ́ ̀ ươ ́ ơ ̣ ̣ ̉ B c 18: Hoa căn DNA v i 20 – 25 µl TE, bung nhe đê DNA tan hêt, gi ̃ ư  tube ở

oC.

̀ ̣ điêu kiên ­20

ả ứ ệ ả ẩ Ph n  ng PCR (Polymerase Chain Reaction) và đi n di s n ph m PCR

ả ứ Chu trình ph n  ng PC R

ả ứ ỗ ả ẩ ủ B ng 3.5. Thành ph n c a m i ph n  ng PCR

ể Thành ph nầ Th  tích (µl)

H2O 8.9

GoTaq Master mix (2x) 10

ồ M i F (20 µM) 0.3

ồ M i R (20 µlM) 0.3

DNA 0.5

ể ổ T ng th  tích 20

ả ứ ự ệ Quy trình th c hi n ph n  ng PCR

94oC 4 phút x 1

94oC 35 giây

54oC 35 giây                  x 35

72oC 35 giây

72oC 4 phút x 1

ả ứ ủ ể Chu trình ph n  ng ử ụ    Multiplex – PCR ki m tra DNA c a begomovirus, s  d ng

̣ ̣ ặ c p m i ồ đăc hiêu VNP93­A­F1/B­F1 và VNP93­A­F1/B­F1:

̀ ́ ̀ ̀ ̀ ̉ ư ̀ ơ ̣ ̣ ̉  ử Multiplex   –   PCR   :   la   phan   ng   s   dung   đông   th i   nhiêu   căp   môi   đê

́ ̀ ́ ̀ ̉ ư ươ ̣ ̣ ̣ khuêch đai nhiêu đoan DNA trong cung môt phan  ng PCR. Ph ̀ ́ ng phap nay

̀ ̀ ̀ ́ ̀ ̀ ượ ử ượ ̣ ̣ đ ̀ c th  nghiêm thanh công vao năm 1988 va đ c ap dung va nhiêu công trinh

̀ ̀ ́ ́ ̃ ́ ư ư ̉ ̃ nghiên c u. Cho đên nay, vân ch a ro nguyên tăc chung hay thanh phân chuân

̃ ́ ́ ́ ̀ ́ ̣ ư ̉ ư ́ ơ ư ̣ ̀ nao cho viêc tôi  u hoa phan  ng multiplex – PCR. Do vây,  ng v i môi điêu

̀ ́ ̀ ̀ ́ ̉ ư ́ ơ ợ ̣ ̉ ̉ ̣ ́ kiên phan  ng, cân phai điêu chinh cho phu h p v i muc đich mong muôn.

ể Thành ph nầ Th  tích (µl)

H2O 8.3

GoTaq Master mix (2x) 10

ồ M i VNP93­A­F1 (20 µM) 0.3

ồ M i VNP93­B­F1 (20 µM) 0.3

ồ M i VNP93­A­R1 (20 µM) 0.3

ồ M i VNP93­B­R1 (20 µM) 0.3

DNA 0.5

ể ổ T ng th  tích 20

̣ ̉ ̉ Điên di san phâm PCR.

ả ượ ệ ượ ẩ ẩ S n ph m PCR đ c đi n di trên gel agarose 1 % đ ệ   ị ằ c chu n b  b ng đ m

ứ TAE và ch a 0.5 mg/mL ethidium bromide.

ượ ạ ế ị ệ ớ ệ Gel đ c ch y trên thi t b  đi n di là Mini­Sub Cell (Biorad) v i đ m TAE ở

ế ệ đi n th  100V trong 30 ­ 40 phút.

ả ượ ể ướ ử ượ ụ ạ ằ B n gel đ c ki m tra d i ánh sáng t ạ  ngo i và đ c ch p l i b ng máy

ụ ụ ả ỹ ậ ố ặ ch p chuyên d ng ho c máy  nh k  thu t s .

ế ả ệ Tinh chi ẩ t s n ph m đi n di

ử ụ ế ủ ộ S  d ng b  kit tinh chi t c a BioNeer ­ Accuprep Gel Purification Kit.

ướ ế ự ướ ẫ ủ ả ấ Các b c tinh chi ệ t th c hi n theo h ng d n c a nhà s n xu t.

ự ễ ấ Xây d ng c u trúc xâm nhi m

ằ ở M  vector pCAMBIA2300 b ng BamHI

DNA plasmid 10μL

BamHI (10u/ μL) 2μL

10X  React 3 2 μL

ấ H2O h p vô trùng 6μL

0C trong m t gi

ộ ờ ệ ế ừ Ủ ở 37 sau đó đi n di và tinh chi t DNA plasmid t gel

ằ agarose b ng kit Accuprep gel purification kit (Bioneer)

ượ ở Dephosphoryl hóa vector pCAMBIA­2300sau khi  đ ằ   c m  vòng b ng

BamHI

ắ ằ pCAMBIA (c t b ng BamHI, purified) 30 μL

10X Alkaline Phosphatase buffer (Roche) 4 μL

Alkaline Phosphatase (Roche) 6 μL

0C   trong   m t   gi

ộ ờ ạ ằ Sau   đó ủ ở 37 và   tinh   s ch   b ng   kit   Purelink   PCR

purification kit (Invitrogen)

ố N i   vector   pCAMBIA   (dephosphorylated,   purified)   and   Dimeric   (gel

purified)

pCAMBIA­2300 3μL

Dimer 13 μL

T4 ligation buffer 2 μL

T4 ligase (5U/ μL) 2 μL

oC trong 2h và đ

Sau đó ủ ở 22 4ể ở oC qua đêm

ả ế ẩ ị ủ Chu n b  E.coli ch ng X1 Blue kh  bi n

̀ ả ế ượ ế ẩ ị ̣ T  bào E.coli X1Blue kh  bi n đ c chu n b  theo Inoue va công s  ( ự 1990).

ướ ấ ẩ ườ ể ỏ B c 1: Nuôi c y vi khu n trong 5 ml môi tr ng LB l ng, đ  qua đêm

oC trong t

ở ệ ộ ủ ấ nhi t đ  37 ắ  nuôi c y có l c (250 rpm).

ướ ể ị ườ B c 2: Chuy n 2 ml d ch vi khu n ẩ ở ướ  b c 1 sang 50 ml môi tr ng LB

0

ự ọ ị ứ ở Ủ ủ ấ ỏ l ng đ ng trong l đ nh m c 500 ml. trong t ắ  nuôi c y có l c (250 rpm / 37

ớ ậ ộ ạ C) cho t i khi m t đ  quang OD600 đ t 0,5 ­ 1,0.

ướ ạ ả ẩ ằ ể B c 3: Làm l nh vi khu n b ng đ  bình trong đá kho ng 5 phút. Cho

ớ ố ứ ẩ ộ ộ ị toàn b  dung d ch ch a vi khu n ly tâm v i t c đ  3000 g trong vòng 5 phút ở

40C.

ạ ỏ ị ế ị ướ ủ ủ ặ   B c 4: Lo i b  d ch trên t a (dùng pipes hút h t d ch trên t a). Hoà c n

ẩ ớ ượ ướ ̣ ̉ vi khu n v i 80 ml dung dich TB đã đ ạ c làm l nh tr c trong đá, bô xung

̀ ́ ố ứ ị ̣ ̣ thêm DMSO cho đên khi đat nông đô 7%. Sau đó phân ph i c  0,1 ml d ch vi

ẩ ạ ượ ướ khu n thì cho vào 1 tube Eppendorf  lo i 1,5 ml đ ạ c làm l nh tr c trong đá.

0C.

ẩ ả ả ủ ạ ả ế Hoá đông vi khu n kh  bi n và b o qu n trong t l nh sâu – 80

ế ế ả ế ằ ẩ Bi n n p c u trúc xâm nhi m vào t bào vi khu n E.coli kh  bi n b ng

ố ạ ấ ươ ph ng pháp s c nhi ễ ệ t

oC ) cho lên khay đá

ở ủ ứ ấ ầ Đ u tiên l y tube ch a XL1–Blue compentent cell (  t ­80

ể ấ ụ ể v n đ  tan đông trong 20 – 30 phút (đ  trong box c y).

oC, chu n b  4 đĩa LB đ c.

ủ ầ ặ ệ ộ ẩ ặ ị ắ Cho máy l c vào trong t m và đ t nhi t đ  37

ẩ ặ ướ Cho 150 μL vi khu n dã đông vào tube 1.5 ml đã đ t trên đá tr c đó. Cho 10

ẩ ủ ứ ẩ ả ố μL s n ph m n i vào tube ch a vi khu n, ấ  trên đá ít nh t 30 phút.

oC trong 1 phút r i đ  trên đá l nh 5 phút, spin nh . ẹ

ố ồ ể ạ S c nhi ệ ở t 42

oC

ắ ỗ Thêm 600 μL SOC vào m i tube, nuôi l c 1 gi ờ ở 37

ạ ỏ ị ủ ể ạ ấ ẩ ị Ly tâm 3­5 phút, lo i b  d ch trên t a đ  l i 100 μL. C y d ch vi khu n trên đĩa

LB agar + Kanamycin  + Tetracylin .

oC trong t

ủ ẩ ạ ể ọ Nuôi qua đêm 37ở ố  binder, ki m tra s  khu n l c m c.

ẩ ạ ả ứ ọ ể ườ Ph n  ng PCR ki m tra các khu n l c m c trên môi tr ọ ọ ng ch n l c

ấ ừ ẩ ạ ọ ườ ứ ỏ Nuôi c y t ng khu n l c m c trong 3 ml môi tr ng LB l ng (ch a hai

oC, l c 250 vòng/ phút qua đêm. Ly tâm d ch vi khu n sau

ạ ở ắ ẩ ị lo i kháng sinh) 37

ử ặ ầ ằ ướ ướ ẩ đó r a c n vi khu n hai l n b ng n c vô trùng. Hút 50 μL n c vô trùng và

oC ít nh t 30 phút. L y tube ra th  vào

ể ặ ẩ ủ ấ ấ ả hòa tan c n vi khu n và đ  trong t ­20

ướ ề ả ẩ ạ ị n c sôi 10 phút, đ o đ u tube và đem d ch vi khu n đi ch y PCR.

ế Tinh chi t plasmid

ượ ế ừ ế ẩ ậ ỹ ế DNA plasmid đ c chi t t t vi khu n theo k  thu t chi t plasmid

(miniprep) c a (ủ Sambrook, Fritsch et al., 1989).

ướ ấ ấ ẩ ị ườ B c 1: L y 1,5 ml d ch vi khu n nuôi c y trong môi tr ứ   ỏ ng LB l ng ch a

ạ ỗ kháng sinh cho vào m i tube Eppendorf lo i 1,5 ml.

ướ ở ể ắ ể ặ ẩ B c 2: Ly tâm 3 phút máy ly tâm đ  bàn đ  l ng c n vi khu n. Lo i b ạ ỏ

ể ặ ị d ch trong đ  nguyên c n trong tube.

ặ ạ ướ ướ ế ẩ ị B c 3. Cho ti p 1,5 ml d ch vi khu n vào tube và l p l i b c 2.

ạ ỏ ị ể ắ ướ ể ặ ẩ ặ   B c 4: Ly tâm 3 phút đ  l ng c n vi khu n, lo i b  d ch trong đ  nguyên c n

ế ị ủ ể ả trong tube. Dùng pipes hút h t d ch trên t a. Đ  tube trên đá kho ng 3 phút.

ướ ượ ể ạ ế B c 5: Cho 100 ị μl dung d ch I đã đ c đ  l nh trên đá vào tube. Cho ti p 2 μl

ể ẩ ố ị RNAse A (dung d ch g c 10 mg/mL). Votex đ  hòa tan vi khu n.

ướ ể ầ ị B c 6: Cho 200 ị ế ủ   μl dung d ch II vào tube (c n ki m tra xem SDS có b  k t t a

ể ế ầ ấ ị không n u có c n làm  m dung d ch đ  hoà tan SDS). Ở ướ  b ầ   c này không c n

ả ể ộ ượ ể ị tr n tube và ph i đ  tube trên đá và không đ c đ  d ch tan quá 2 phút vì

ễ ị ế ở ồ ộ ề ướ ướ ỷ plasmid d  b  bi n tính n ng đ  ki m cao. B c này là b c phá hu  vách

ế ả ấ ầ ở ị t bào gi i phóng DNA genomvà DNA plasmid nên d ch tan tr  nên r t nh y.

ướ ể ạ ị ướ B c 7: Cho 150 μl dung d ch III đãđ  l nh tr ộ ề   c trên đá vào tube, tr nđ u

ề ầ ắ ướ ộ ằ b ng l c tube nhi u l n. Đây là b c trung hoà, toàn b  protein và DNA genom

ướ ớ ẽ ị ế ủ ướ (vì có kích th c l n) s  b  k t t a còn DNA plasmid (vì có kích th ỏ   c nh )

ể ẫ ả ị nên v n hoà tan trong dung d ch.Đ  tube trên đá kho ng 3 phút.

ướ ị ể   ể ế ủ B c 8: Ly tâm dung d ch 5 phútđ  k t t a prtein và DNA genomic. Chuy n

ủ ả ứ ộ ớ ị d ch trên t a (kho ng 400 μl) có ch a DNA plasmid sang m t tube m i, lo i b ạ ỏ

ặ tube cũ và c n bên trong tube.

ướ ể ộ ươ ươ B c 9: Cho m t th  tích t ng đ ả ng (kho ng 400 μl) isopropanol vào tube.

ộ ề ề ể ằ ả ầ ở ệ ộ ả Tr nđ u   b ng   đ o   tube   nhi u   l n.Đ   tube nhi tđ   phòng   kho ng   5

ướ ế ủ ẽ phút.Trong b c nàyisopropanol s  làm k t t a DNA plasmid.

ể ế ủ ạ ỏ ị ướ B c 10: Ly tâm 5 phútđ  k t t a DNA plasmid. Lo i b  d ch trong gi ữ ạ    l i

ể ắ ấ ả ị ặ c n DNA plasmid. Ly tâm nhanh đ  l ng t ố   t c  d ch bám trên thành tube xu ng

ướ ế ị d i và dùng pipes hút h t d ch

ướ ạ ỏ ồ ồ B c 11: Cho 500 ể ử ặ μl c n 70 % vào tube đ  r a c n, lo i b  c n (trong b ướ   c

ử ồ ề ầ ố ể ạ ỏ ế ồ ỏ này r a c n càng nhi u l n càng t t). Đ  lo i b  h t c n ra kh i tube, thì sau

ổ ế ồ ể ắ ả ấ ả ồ ắ khi đ  h t c n ra ly tâm ng n kho ng vài giây đ  l ng t t c  c n bám trên

ố ướ ế ồ thành tube xu ng d i và dùng pipes hút h t c n.

ướ ể ặ ả B c 12: Đ  khô c n DNA trong không khí kho ng 30 phút.

ướ ặ ớ ặ ệ B c 13: Hoà c n DNA plasmid v i 50 μl dd H2O vô trùng ho c đ m TE (pH =

ị ờ ể ượ ả ứ ặ 8). D ch DNA bây gi có th  đ ả   c dùng cho các ph n  ng enzyme ho c b o

0C.

ả ở qu n ­20

ả ế ẩ ị ẩ Chu n b  vi khu n A. tumefaciens kh  bi n (competent cells)

ế ả ế ượ ẩ ị ̣ T  bào A. tumefaciens kh  bi n đ c chu n b  theo ̀ Inoue va công s  ( ự 1990).

ướ ấ ẩ ườ ể ỏ B c 1: Nuôi c y vi khu n trong 5 ml môi tr ng LB l ng, đ  qua đêm

oC trong t

ở ệ ộ ủ ấ nhi t đ  28 ắ  nuôi c y có l c (250 rpm).

ướ ể ị ườ B c 2: Chuy n 2 ml d ch vi khu n ẩ ở ướ  b c 1 sang 50 ml môi tr ng LB

ự ọ ị ứ ở Ủ ủ ấ ỏ l ng đ ng trong l đ nh m c 500 ml. trong t ắ  nuôi c y có l c (250 rpm /

ớ ậ ộ ạ 28oC) cho t i khi m t đ  quang OD600 đ t 0,5 ­ 1,0.

ướ ạ ằ ả ẩ ể B c 3: Làm l nh vi khu n b ng đ  bình trong đá kho ng 5 phút. Cho

ớ ố ứ ẩ ộ ộ ị toàn b  dung d ch ch a vi khu n ly tâm v i t c đ  3000 g trong vòng 5 phút ở

4oC.

ạ ỏ ị ế ị ướ ủ ủ ặ   B c 4: Lo i b  d ch trên t a (dùng pipes hút h t d ch trên t a). Hoà c n

2  20 mM đã đ

ẩ ớ ị ượ ướ vi khu n v i 1 ml dung d ch CaCl ạ c làm l nh tr c trong đá.

ố ứ ạ ị ẩ Sau đó phân ph i c  0,1 ml d ch vi khu n thì cho vào 1 tube Eppendorf lo i 1,5

ượ ướ ả ế ả ẩ ml đ ạ c làm l nh tr ả   c trong đá. Hoá đông vi khu n kh  bi n và b o qu n

oC.

ủ ạ trong t l nh sâu – 80

ạ ấ ế ễ ế ả ế ẩ Bi n n p c u trúc xâm nhi m vào t bào vi khu n A. tumefaciens kh  bi n

ừ ượ ễ ấ ế ế Các c u trúc xâm nhi m v a đ c thi ế ế ượ t k  đ ạ c bi n n p vào t bào vi

ẩ ươ ả ế khu n kh  bi n theo ph ng pháp đông tan ( Hofgen and Willmitzer, 1988).

ệ ề ệ ướ ượ ư Trong đi u ki n phòng thí nghi m, b c đông tan đ ệ c th c hi n v i t ớ ủ ạ    l nh

ằ ơ ỏ ướ ụ ể sâu ­80 oC thay vì b ng nit l ng. Các b c c  th  là:

oC. Đ  vi khu n tan đông

ấ ế ướ ừ ủ ạ ể ẩ B c 1: L y t bào A. tumefaciens t l nh ­80 t

trong đá.

ỗ ấ ướ ấ ị ế ẩ ủ B c 2: L y 10 μl d ch DNA c a m i c u trúc cho vào tube t bào vi khu n và

ề ộ tr n đ u.

oC trong vòng

ể ỗ ướ ẩ ợ ị ủ ạ B c 3: Đ  h n h p d ch vi khu n và DNA vào t l nh sâu – 80

15 phút.

oC trong vòng 5

ể ỗ ướ ẩ ợ ị ệ B c 4: Đ  h n h p d ch vi khu n và DNA vào block nhi t 37

phút.

ướ ẩ ượ ứ ệ ị B c 5: Cho d ch vi khu n đã đ ố c transfomation vào  ng nghi m ch a 1 ml

oC trong 1 gi

ườ ỏ ủ ố ủ ấ ắ ở môi tr ng LB l ng, ệ   ng nghi m trong t m có l c 28 .ờ

ướ ể ẩ ị B c 6: Chuy n d ch vi khu n vào tube 1,5 ml.

ạ ặ ướ ủ ấ ầ ị ế   B c 7: Ly tâm trong 3 phút, l y ph n d ch trên t a, lo i c n, sau đó cho ti p

ườ ỏ 100 μl  môi tr ng LB l ng.

ướ ượ ấ ườ ị B c 8: D ch vi khu n ẩ ở ướ  b c 8 đ c c y trên đĩa môi tr ng LB ­ agar có 3

ạ lo i kháng sinh (Streptomicin 200 μg/mL, rifampicin 34 μg/mL và kanamycin

100 μg/mL).

oC trong vòng 2 ngày. Ki m tra s  hình thành

ướ ự ể B c 9: Các đĩa petri đ ượ ủ ở c 28

ẩ ạ khu n l c

ướ ọ ượ ử ấ ộ B c 10: Dùng tăm nh n đã đ ấ c h p kh  trùng l y m t ít vi khu n ẩ ở ỗ    m i

ẩ ạ ồ ứ ệ ả ườ ố khu n l c r i th  vào trong  ng nghi m ch a 4 mL môi tr ứ   ỏ ng LB l ng ch a

ở 3 kháng sinh trên.

oC).

ướ ệ ờ ủ ấ ắ ố B c 11: Các  ng nghi m đ ượ ủ c 24 gi trong t m có l c (200 rpm / 28

ướ ể ể ặ ưở ủ ườ B c 12: Ki m tra đ c đi m sinh tr ẩ ng c a vi khu n trong môi tr ng LB

ặ ủ ấ ự ể ễ ẩ ằ ỏ l ng và ki m tra s  có m t c a c u trúc xâm nhi m trong vi khu n b ng PCR

ế sau khi chi t DNA plasmid

ị ự ố ệ ằ ử ụ ề ầ Xác đ nh trình t gen và x  lý s  li u b ng các ph n m m chuyên d ng

ả ứ ượ ử ố Ph n  ng sequence đ c chúng tôi g i sang Macrogen (Hàn Qu c) đ ể

ế ả ự ử ụ ẫ ẩ ả ồ ộ ớ ti n hành gi i trình t các m u.S  d ng 5µl s n ph m c ng v i 5µl m i.

ả ả ế ự ượ ằ K t qu  gi i trình t gen đ ầ   c phân tích trên máy tính b ng các ph n

ề ươ m m: Ch ng trình BLAST ( NCBI ), BioEdit 7.0.9, DNAstar 7.1 (Lasergene),

Vecter NTI Advance 11.5 (Invitrogene), ClustalX 2.0 và Mega 4.0., Sequencing

ớ ự ủ ạ ớ Analysis 5.2, Seqscape 2.5 và so sánh v i trình t c a đo n DNA v i trình t ự

chu n.ẩ

ẩ ạ ả ứ ọ ể ườ Ph n  ng PCR ki m tra các khu n l c m c trên môi tr ọ ọ ng ch n l c

ấ ừ ẩ ạ ọ ườ ứ ỏ Nuôi c y t ng khu n l c m c trong 3 ml môi tr ng LB l ng (ch a hai

oC, l c 250 vòng/ phút qua đêm. Ly tâm d ch vi khu n sau

ạ ở ắ ẩ ị lo i kháng sinh) 37

ử ặ ầ ằ ướ ướ ẩ đó r a c n vi khu n hai l n b ng n c vô trùng. Hút 50 μL n c vô trùng và

oC ít nh t 30 phút. L y tube ra th  vào

ể ẩ ặ ủ ấ ấ ả hòa tan c n vi khu n và đ  trong t ­20

ướ ề ả ẩ ạ ị n c sôi 10 phút, đ o đ u tube và đem d ch vi khu n đi ch y PCR.

ạ ử ụ ễ ậ ỹ Lây nhi m nhân t o s  d ng k  thu t agroinoculation

ử ụ ự ế ậ ẩ ỹ ị S  d ng k  thu t tiêm tr c ti p d ch vi khu n vào cây (Kheyr­Pour,

ướ ự ệ Bendahmane et al., 1991, Navot, Pichersky et al., 1991). Các b c th c hi n nh ư

sau:

ấ ạ ễ ẩ ấ C y l i 2 dòng vi khu n mang c u trúc xâm nhi m trên đĩa môi tr ườ   ng

ứ LB agar ch a 3 kháng sinh streptomicin 200 μg/mL, rifampicin 34  μg/mL và

ề Ủ ấ ở kanamycin 100 μg/mL (c y ria 1 chi u). đĩa 28°C trong 2 ngày.

ề ẩ ấ ấ ườ C y truy n vi khu n sang nuôi c y trên 250 ml môi tr ứ   ỏ ng LB l ng ch a

3 kháng sinh (streptomicin 200  μg/mL, rifampicin 34  μg/mL và kanamycin 100

ủ ắ ấ ả ả μg/mL) trong t nuôi c y có l c (250 rpm / 28°C/ ẩ ở 1 ngày). Đ m b o vi khu n

ưở ạ ằ ở pha sinh tr ng m nh (pha log) b ng đo OD 600 nm (=0.6)

ẩ ẩ ặ ớ ồ ị Ly tâm d ch vi khu n (3000 G/ 5 phút ) r i hòa c n vi khu n v i 5 ml

đêm MgCl2 10 mM.

ố ớ ử ụ ơ ế ạ S  d ng b m xylanh Hamilton P600 n i v i 1 xylanh y t lo i 1 mL đ ể

ỗ ị ế ẩ ồ ị tiêm d ch vi khu n vào ch i và 3 nách lá ti p theo. M i v  trí tiêm 10 µl. Trong

ẩ ẽ ượ ứ ễ ỗ ợ ể ộ các công th c lây nhi m h n h p, hai dòng vi khu n s  đ ớ c tr n v i th  tích

ươ ươ t ng đ ng.

ề ệ ệ ộ ễ ẩ ẩ ị Đi u ki n nhi ị t đ  trong quá trình chu n b  d ch vi khu n lây nhi m, lây

oC.

ễ ễ ả nhi m và trong vòng 2 ngày sau lây nhi m ph i duy trì <30

ở ạ ậ ượ ả ễ Cây lây nhi m là cây con giai đo n 3­4 lá th t, đ ả c b o qu n trong

ệ ề ấ ọ ượ ộ ờ đi u   ki n   cách   ly   b   ph n   và   đ c   chăm   sóc   trong   toàn   b   th i   gian   thí

nghi m.ệ

ừ ỉ Ch  tiêu đánhh giá t ng cây:

ứ ệ ể ầ ệ + Tri u ch ng bi u hi n sau lây 1, 2, 3, 4 tu n.

ể ầ ệ + Ki m tra PCR phát hi n virus sau lây 4 tu n.

ễ ệ ả ượ ự ệ B ng 3.6. Thí nghi m lây nhi m đ ứ ớ c th c hi n v i các công th c

STT CÔNG TH CỨ Đ IỐ   NGƯỢ T

ứ ấ CT1 Cà chua ủ ễ ẩ Tiêm   dòng   vi   khu n   có   ch a   c u   trúc xâm nhi m c a VNP93­5­4 (DNA­A)

ứ ấ

ủ ễ CT2 Cà chua

ẩ   Tiêm   dòng   vi   khu n   có   ch a   c u   trúc   xâm nhi m c a VNP93­5­4 (DNA­A) và VNP93­5­8 (DNA­B)

ứ ấ CT3 tớ ủ ễ ẩ Tiêm   dòng   vi   khu n   có   ch a   c u   trúc xâm nhi m c a VNP93­5­4 (DNA­A)

ứ ấ

ủ ễ CT4 tớ

ẩ   Tiêm   dòng   vi   khu n   có   ch a   c u   trúc   xâm nhi m c a VNP93­5­4 (DNA­A) và VNP93­5­8 (DNA­B)

ứ ấ ̉ ̣ CT5 Cây chi thi ủ ễ ẩ Tiêm   dòng   vi   khu n   có   ch a   c u   trúc xâm nhi m c a VNP93­5­4 (DNA­A)

ứ ấ

ủ ễ ̉ ̣ CT6 Cây chi thi

ẩ   Tiêm   dòng   vi   khu n   có   ch a   c u   trúc xâm nhi m c a VNP93­5­4 (DNA­A) và   VNP93­5­8 (DNA­B)

ứ ố CT7 Cây đ i ch ng không tiêm ̀ ̉ ̣ t,ớ   Cà chua,  va cây chi thi

Đánh giá tính gây b nhệ

ứ ự ệ ị ệ ố ướ D a vào tri u ch ng cây b  b nh có lá cong xu ng d i vào phía bên trong. V ề

ỏ ẹ ế ừ ạ sau, lá không có hình d ng, nh  h p, bi n vàng t ữ    mép và chóp lá lan vào gi a

ề ế ạ ố gân; lá cu n cong lên phía trên thành hình thuy n; lá non bi n vàng m nh, giòn

ỏ ẹ ề ể ắ ặ ố ọ ọ và nh  h p. Cu ng lá có th  xo n v n. Cây lùn còi c c, m c nhi u cành nhánh

ỏ ố ắ nh , đ t thân ng n.

ệ ự ặ ủ ả ứ ự ể D a vào ph n  ng PCR đ  phát hi n s  có m t c a virus

ả ứ ượ ớ ổ ự ể ệ Các ph n  ng PCR đ c th c hi n trong tube 0.5 mL v i t ng th  tích

ả ứ ệ ị ph n  ng 15 ứ μL ch a 1.5 μL dung d ch đ m PCR X10 (Roche); 0.3 μL dNTPs

ạ ỗ ệ ạ ỗ (10mM m i lo i A, T, G, C, Roche); 0.3 ồ ặ μL m i lo i m i đ c hi u xuôi dòng

ượ ề ươ ị ở ồ ộ và ng c dòng (đ u đ ẩ c chu n b n ng đ  20 μM); 0,2 μL Taq polymerase

ặ (Roche) và 0,5 μL khuôn DNA (DNA plasmid ho c DNA chi ế ừ t t cây).

ả ứ ượ ự ệ Ph n  ng PCR đ c th c hi n trên máy PCR PTC­100 (MJ Research

0C trong 4 phút; ti p theo là 35

ở ầ ế ề ệ ớ ở ế Inc.) v i đi u ki n sau: kh i đ u bi n tính 94

0C trong 35 giây, g n m i

0C trong 35 giây và

ế ở ồ ở ắ chu trình PCR (bi n tính 94 52

0C trong 1 phút). Ph n  ng đ

0C.

ợ ợ ở ả ứ ượ ế ớ ở ổ t ng h p s i 72 c k t thúc v i 5 phút 72

ả ượ ệ ươ ẩ ẩ S n ph m PCR đ c đi n di trên gel agarose 1% đ ệ   ị ằ c chu n b  b ng đ m

ứ ượ ạ TAE X 0.5 và ch a 0.5 mg/mL ethidium bromide. Gel đ c ch y trên thi ế ị  t b

ớ ệ ệ ở ệ ế đi n di là Mini­Sub Cell (Biorad) v i đ m TAE 0.5X đi n th  100 V trong 25

ả ượ ể ướ ử ượ ­ 30 phút. B n gel đ c ki m tra d i ánh sáng t ạ  ngo i và đ ằ   c chup b ng

ả ớ phim Polaroid v i máy  nh Polaroid Gel Cam (UK).

ọ ấ ễ ạ Lây nhi m nhân t o dùng b  ph n

ọ ượ ấ ọ ồ ấ ạ B  ph n s ch đ c nuôi trên cây bông trong l ng nuôi b  ph n cách ly

ễ ấ ượ ự ệ ấ ọ ưở ế ệ qua ít nh t 5 th  h . Lây nhi m đ c th c hi n dùng b  ph n tr ng thành

ả ủ theo mô t c a  Pico et al (1998).

ệ ẩ ồ ị Chu n b  cây ngu n b nh

ồ ố ặ   ầ  là cà chua gi ng m n c m (AVTO1080 ho c ẫ ả ệ Cây ngu n b nh ban đ u

ặ ồ ượ ễ ằ HT7 ho c H ng Lan T20) đã đ c lây nhi m b ng agroinoculation.

ệ ặ ẫ ố ả là cà chua   gi ng m n c m (AVTO1080 ho c HT7 ồ Cây ngu n b nh

ặ ồ ượ ấ ừ ễ ọ ệ ấ ồ ho c H ng Lan T20) đ ằ c lây nhi m b ng b  ph n t cây ngu n b nh c p 1.

ệ ượ ấ ằ ọ ồ Cây ngu n b nh đ c thay m i ễ ầ ầ  b ng lây nhi m b  ph n. Duy trì ớ 3 tu n/l n

ệ ồ ở ạ ệ ể ưở ố 20 cây ngu n b nh ứ  tr ng thái tri u ch ng đi n hình, sinh tr ng t t. T t c ấ ả

ệ ượ ấ ọ ồ cây ngu n b nh đ ồ c duy trì trong l ng nuôi b  ph n.

ệ ẩ ị Chu n b  cây thí nghi m

ệ ạ ượ ử ừ ệ ặ ố H t cây thí nghi m đ c x  lý thu c tr  b nh (Daconil ho c Mancozeb).

ạ ượ ầ ướ ấ ẩ ử Sau khi x  lý, h t đ ả c cho n y m m tr ạ   c trong đĩa petri có lót gi y  m. H t

ầ ượ ể ạ ự ứ ễ ậ ồ ả n y m m đ c tr ng vào ch u nh a ch a giá th  s ch. Cây lây nhi m là cây

ở ậ ạ ượ ữ ề con giai đo n 3­4lá th t. Cây luôn đ c gi ệ  trong đi u ki n cách ly trong

ộ ờ ệ toàn b  th i gian thí nghi m.

ễ ấ ọ ằ Lây nhi m b ng b  ph n

ệ ượ ế ạ ừ ụ ằ ồ Các cây thí nghi m đ c ch p b ng l ng cách ly (ch  t o t chai coca

ự ạ nh a lo i 1L).

ấ ọ ưở ồ ồ ọ B  ph n tr ấ   ệ ng thành nuôi trên cây ngu n b nh trong l ng cách ly b  ph n

ượ ể ệ ả ấ ấ ọ ọ đ c chuy n sang cây thí nghi m. Th  10 b  ph n /cây và cho b  ph n chích

ờ hút trong th i gian 2 ngày.

ễ ấ ả ệ ượ ử ừ ằ Sau khi lây nhi m, t t c  cây thí nghi m đ ố c x  lý b ng thu c tr  côn trùng

chích hút.

ễ ượ ừ ể ề ệ ố ị Cây lây nhi m đ c đ  trong đi u ki n cách ly, phun thu c tr  côn trùng đ nh

ầ ỳ k  7 ngày/l n.

ừ ệ ỉ Ch  tiêu đánh giá cho t ng cây thí nghi m:

ấ ố ố ọ ả ướ + S  b  ph n s ng trên cây sau khi th  1 ngày và 2 ngày (tr ử   c khi x  lý

thu c).ố

ứ ệ ể ệ ầ ầ ầ ầ + Tri u ch ng bi u hi n sau 1 tu n, 2 tu n, 3 tu n và 4 tu n.

ả ứ ả ấ ả ệ + Ph n  ng PCR (cho c  DNA­A và DNA­B) trên t t c  cây thí nghi m.

ẫ ằ ả ứ ể Ki m tra các m u b ng ph n  ng ELISA

̃ ̃ ́ ̀ ̃ ư ự ở ̣ ̣ ̣ ̣ ̣ ̣ ̀ Viêc ap dung nh ng thanh t u khoa hoc ki thuât hiên đai đa tr  nên cân

̀ ́ ́ ̀ ́ ̃ ư ̣ ̣ ̉ ̣ ̉ ̣   thiêt va h u hiêu trong viêc chuân đoan cac bênh nguy hiêm trên cây trông. Môt

́ ́ ́ ́ ́ ̃ ư ươ ượ ̣ ̉ ̣ ̉ trong nh ng ph ng phap hiêu qua, chinh xac đ ́   c ap dung phô biên trên thê

̀ ́ ươ gi ́ ̀ ơ i la ph ng phap Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Ngay nay,

̀ ́ ượ ử ươ ̣ ̉ ̣ nhiêu dang khac nhau cua ELISA đang đ c s  dung th ̀ ̀ ng xuyên. Trong điêu

́ ́ ́ ̃ ươ ̣ ̣ ̣ ̣ ̣ ̉ kiên Viêt Nam hiên nay, ph ng phap ELISA đăc biêt co y nghia trong chuân

́ ̣ ̣ ̣ ̀ đoan bênh hai cây trông do vi sinh vât gây ra.

́ ́ ́ ơ ̣ ̉ ̣ Năm 1969, khi Arrameas liên kêt môt khang thê IgG v i môt Enzyme va ̀

̀ ́ ́ ̀ ̀ ́ ́ ư ̀ ư ̉ ̣ ̣ ̃ ch ng minh răng, khang thê liên kêt Enzyme nay v a duy tri tinh đăc hiêu miên

̀ ́ ́ ̀ ̉ ư ̣ ̉ ̣ ̣ ̉ dich cua khang thê v a duy tri tinh hoat đông cua Enzyme.

̀ ̀ ̀ ́ ư ươ ̣ Năm 1977, Clarck va Adams lân đâu tiên  ng dung ph ́ ng phap ELISA

́ ́ ̃ ự ̉ ̉ ̣ ̣ đê chuân đoan cac cây nhiêm bênh virus th c vât.

ườ ự ế ợ ữ ể ể Thông th ậ   ng s  k t h p gi a kháng nguyên kháng th  không th  nh n

ế ượ ằ ắ ườ ỹ ợ ụ ấ bi c b ng m t th t đ ậ ng, k  thu t ELISA đã l ặ i d ng các đ c tính h p ph ụ

ự ể ắ ủ ể ặ t nhiên c a protein lên polyetylen đ  g n kháng nguyên ho c kháng th  lên giá

ể ươ ặ ứ ồ r i cho kháng nguyên ho c kháng th  t ạ   ấ ng  ng có đánh d u enzyme vào t o

ế ợ ạ ỏ ả ứ ấ ấ ỗ   ph n  ng. Sau khi lo i b  ch t đánh d u không k t h p, cho thêm vào h n

ấ ệ ủ ạ ờ ả ị d ch ch t đ m màu. Nh  ho t tính xúc tác c a enzyme làm gi i phóng ôxy

ử ủ ệ ể ấ ổ nguyên t (O) t H ỗ   ừ 2O2  đ  ôxy hóa ch t hi n màu làm thay đ i màu c a h n

ả ứ ư ậ ậ ầ ồ ỹ ị d ch. Nh  v y k  thu t ELISA g m 3 thành ph n tham gia ph n  ng: kháng

ệ ể ấ ướ nguyên, kháng th  và ch t hi n màu qua hai b c:

ả ứ ễ ọ ớ ị ể ự ế ợ + Ph n  ng mi n d ch h c: S  k t h p kháng nguyên v i kháng th .

ả ứ ủ ể ạ ọ ờ ả +   Ph n   ng   hóa   h c:  Nh   ho t   tính   c a   enzyme  đ   gi i   phóng   ôxy

ử ử ấ ỉ ị nguyên t (O) và chính ôxy nguyên t ấ    này (O) đã ôxy hóa ch t ch  th  màu. Ch t

ệ ủ ứ ổ ồ ờ ỉ ị ự ệ ch  th  thay đ i màu đã ch ng minh s  hi n di n c a enzyme và đ ng th i có

ữ ể ự ế ợ s  k t h p gi a kháng nguyên và kháng th .

́ ́ ̃ ươ ́ ượ ư ̣ ̣ ̣ Hiên nay, co hai ph ng phap ELISA đang đ c  ng dung rông dai la ̀

́ ̀ ươ ươ ph ng phap Double Antibody Sandwich (DAS – ELISA), ph ́ ̣   ng phap nay goi

́ ́ ́ ̀ ươ ự ươ ́ ư ̣ ̀ la ph ng phap ELISA tr c tiêp. Ph ng phap th  hai la Indirect ELISA goi la ̀

́ ́ ́ ươ ượ ơ ả ủ ể ế ph ng phap ELISA gian tiêp. Nh c đi m c  b n c a ELISA gián ti p là

ướ ố ị ấ ỳ ệ ặ b c c  đ nh kháng nguyên không có tính đ c hi u nên b t k  protein nào cũng

ớ ề ặ ậ ườ ộ ấ ể ợ ắ g n v i b  m t đĩa, vì v y tr ả ạ   ồ ng h p kháng th  (có n ng đ  th p) ph i c nh

ế ớ ề ặ ủ ế ắ ớ tranh v i các protein khác trong huy t thanh khi g n k t v i b  m t c a đĩa.

́ ̀ ́ ế ượ ạ ượ ể ư c nh c đi m trên. Trong nghiên c u nay chung DAS ELISA đã h n ch  đ

́ ử ươ ̣ tôi s  dung ph ng phap DAS – ELISA.

́ ̃ ươ ượ ử ươ ̣ ̣ ̣ ̣ Ph ng phap DAS – ELISA đ c s  dung d ́ i dang ki thuât ELISA kep

́ ́ ̀ ̀ ượ ̉ ̉ kep khang thê. DAS – ELISA đ c Clarck va Adams mô ta vao năm 1977, DAS

́ ̃ ́ ̀ ̉ ư ̀ ư ự ử ̣ ̉ ̣ ̣ ́   – ELISA tr c tiêp s  dung khang thê đăc hiêu virus đê v a bây virus v a phat

̃ ̃ ́ ́ ượ ́ ơ ợ ̣ ̉ ̣ ̣ ̣ hiên virus đa bây đ ̃ c (khang thê liên kêt men se tâp h p đăc hiêu v i virus

̃ ́ ́ ượ đ c bây). Co cac b ́ ươ c sau:

ươ ự ự ể ế ệ ằ Ph ng pháp ki m tra virus b ng ELISA tr c ti p d a theo tài li u mô

ệ ướ t ả ủ Green, 1991) và Vũ Tri u Mân (2003), có các b c a ( c sau:

ố ị ệ ặ ả Ủ ể  kháng th ) B c 1ướ : C  đ nh IgG đ c hi u virus vào b n Elisa (

ớ ỷ ệ ị ị Hòa tan IgG vào dung d ch Coating buffer v i t l 1µl/ 1ml dung d ch Coating

buffer.

ị ở ủ ế ả ỗ Cho 100 µl dung d ch IgG hòa tan ậ    trên vào m i gi ng c a b n Elisa và đ y

ắ ạ n p l i.

ả ờ ấ ấ ạ Gói b n Elisa trong t khăn gi y có th m n ướ ể ữ ẩ c đ  gi m, gói kín l i trong túi

oC trong 4 gi

ờ ộ nilon và ủ ở 37 ho c ặ ủ ở oC qua m t đêm. 4

ủ ử ả ướ ử ả ạ ả Sau khi , đem b n ELISA đi r a (tr ể ạ   c khi r a v y m nh b n ELISA đ  lo i

ả ầ ằ ế ướ ở h t n c ệ  trong b n ELISA) 3 l n b ng đ m PBS   –   T (Phosphate buffer

ỗ ầ ử ả ỗ ầ ề ả   saline­Tween), m i l n cách nhau 3  –  4 phút. M i l n r a b n ELISA đ u v y

ể ạ ế ệ ế ạ ỏ ượ m nh đ  lo i h t đ m PBS – T ra kh i các gi ng và úp ng ấ   c trên khăn th m,

ể ử ế ớ ế ỏ ệ ớ sau đó m i ti n hành nh  đ m PBS – T m i vào đ  r a ti p.

ố ị ạ ẫ ả ị ị B c 2ướ : T o dung d ch m u và C  đ nh d ch cây vào b n Elisa

ố ứ ễ ắ ả ẫ ặ ố   Dùng kéo c t   nhuy n kho ng 0.1g m u lá cho vào c i s  (ho c  ng

ề ễ ậ ị ơ ỏ eppendorf) nghi n th t nhuy n trong dung d ch nit l ng, thêm vào 1000 µl

ẫ ượ ị ị ế ỗ dung d ch 1X PBS­T. D ch m u đ ế c cho vào m i gi ng là 100 µl/gi ng.

ả ờ ấ ấ ọ ạ Gói b n Elisa trong t khăn gi y có th m n ướ ể ữ ẩ c đ  gi m, và b c kín l i trong

oC trong 4 gi

ờ ộ túi nilon. Sau đó ủ ở 37 ho c ặ ủ ở oC qua m t đêm. 4

ủ ả ượ ế ụ ử ằ ử ệ Sau khi , b n Elisa đ ị c ti p t c r a b ng dung d ch đ m r a 1X PBS­T nh ư

ở ướ  b c 1.

ố ị ế ả B c 3ướ : C  đ nh IgG liên k t enzyme vào b n Elisa

ế ế Hòa tan IgG liên k t Biotin và Avidin liên k t alkaline phosphatase trong dung

ớ ỷ ệ ị d ch 1X PBS­T v i t l : 1µl IgG­Biotin /1µl avidin­alkaline phosphatase/1ml

PBS –T.

ủ ả ớ ượ ừ ế ị ế Cho dung d ch v a hòa tan vào các gi ng c a b n Elisa v i l ng 100 µl/gi ng.

ả ờ ấ ấ ạ Gói b n Elisa trong t khăn gi y có th m n ướ ể ữ ẩ c đ  gi m, gói kín l i trong túi

oC trong 4 gi

ế ụ ủ ở ờ ử ả ộ nilon, ti p t c 37 ho c ặ ủ ở oC qua m t đêm và r a b n Elisa 4

ử ệ ị ằ b ng dung d ch đ m r a 1X PBS­T nh ư ở ướ  b c 1.

ố ị ế ả B ấ ề c 4ướ : C  đ nh ch t n n và đánh giá k t qu

ệ ề ấ ớ ị Hòa   tan   ch t   n n   (Phosphate   substrate)   v i   dung   d ch   đ m   Diethanolamine

ươ ứ ( Subtrate buffer) theo t ỷ ệ  l 1mg/ 1ml (t ng  ng : 4 viên Phosphatase subtrate

ủ ả ế ị ị ỗ + 20 ml dung d ch S. buffer). Cho vào m i gi ng c a b n Elisa 100 µl dung d ch

ừ v a hoà tan.

Ủ ả ở ệ ộ ả ằ ế ọ b n Elisa nhi ọ   t đ  phòng sau 20 phút, sau đó đ c k t qu  b ng máy đ c

Elisa ở ướ  b c sóng 405 nm.

ả ằ ắ ườ ị ố ế Sau đó đánh giá k t qu  b ng m t th ng và đo tr  s  ELISA (OD) ở

ướ b c sóng 405 nm.

ươ ọ ị ượ ế : (Giá tr  Blank data đ c đ c qua ẫ +  M u d ớ ệ ng tính v i b nh n u

ị ố ủ ế ỗ ị ở ế ứ ố máy c a m i gi ng) – (2 ×  tr  s  trung bình giá tr gi ng đ i ch ng âm + đ ộ

ẩ ệ l ch chu n) ≥ 0,1

ớ ệ ẫ ọ ị ượ ế : (Giá tr  Blank data đ c đ c qua máy +  M u âm tính v i b nh n u

ị ố ế ỗ ị ở ế ứ ố ủ c a m i gi ng) – ( 2 × tr  s  trung bình giá tr ộ ệ    gi ng đ i ch ng âm + đ  l ch

ẩ chu n) < 0,1

́ ̉ ̉ ̣ ̀ KÊT QUA VA THAO LUÂN

ệ ủ Đánh giá tính gây b nh c a PepYLCVNV b ng lây nhi m nhân t o dùng

̃ ấ ̣ ằ ử ụ  c u trúc xâm nhi m ạ ễ ễ  VNP93 ki thuât agroinoculation s  d ng

ớ ữ ề ệ ồ ọ Cà chua và ệ   t là nh ng cây tr ng quan tr ng trong n n nông nghi p hi n

̀ ̀ ủ ướ ̣ ̣ nay c a n c ta. Trong đo,́ cây ́ ơ ượ t đ ̉  c coi la môt trong năm loai cây trông chu

́ ́ ̀ ̀ ươ ̣ ̣ ̉ ̣ ̣ ̉ ự l c trong ch ng trinh chon tao giông rau cua Bô nông nghiêp va phat triên nông

ệ ệ ậ ̣ thôn trong giai đoan 2006 – 2010. Vì v y vi c phát hi n virus PepYLCVNV gây

̀ ư ự ễ ̀ ạ h i trên ca chua va cây ́ ứ   ơ ấ t r t có ý nghĩa trong th c ti n cũng nh  nghiên c u

ớ ượ ọ ệ ạ ệ khoa h c. Đây là loài virus m i đ c phát hi n t i Vi t Nam nên trên th  gi ế ớ   i

ư ở ệ ư ư ệ ề cũng nh Vi t Nam ch a có nhi u tài li u cũng nh  công trình nghiên c u v ứ ề

loài virus PepYLCVNV này.

ứ ụ ủ ầ ươ ễ M c tiêu c a ph n nghiên c u này là tìm ra ph ng pháp lây nhi m nhân

ờ ạ t o PepYLCVNV nh  vi khu n ẩ Agrobacterium tumerfaciens (Agroinoculation)

ự ệ ả ươ ễ ả ấ có hi u qu  nh t. D a trên ph ệ   ệ ng pháp lây nhi m hi u qu , tính gây b nh

ọ ủ ể ượ ể ặ ễ ừ ủ c a virus, đ c đi m sinh h c c a virus có th  đ c đánh giá d  dàng, t đó

ừ ư ệ ệ ạ ả đ a ra các bi n pháp phòng tr  loài virus này đ t hi u qu  cao.

ử ụ ươ ự ế ẩ Chúng tôi s  d ng ph ng pháp tiêm tr c ti p vi khu n vào mô cây

ể ự ễ ệ ậ (Kheyr­Pour, Bendahmane et al., 1991)   đ  th c hi n kĩ thu t lây nhi m này.

̀ ươ ứ ự ế ẩ ấ ị Đây la ph ng pháp tiêm tr c ti p dung d ch vi khu n ch a các c u trúc xâm

ủ ủ ễ ồ ở nhi m c a PepYLCVNV vào mô lá và ch i nách c a cây, cây ạ  giai đo n 3­4 lá

th t. ậ

ẩ ị ủ ồ ễ ẩ ấ Chu n b  ngu n vi khu n A. tumerfaciens mang c u trúc xâm nhi m c a

PepYLCVNV

ạ ấ ủ ế ễ ế ả ế Bi n n p c u trúc xâm nhi m c a DNA­B vào t bào kh  bi n A. Tumerfaciens

ủ ễ ấ ầ ả ủ   C u   trúc   xâm   nhi m   c a   c   thành   ph n,   DNA­A   và   DNA­B,   c a

ượ ự ự ậ PepYLCVNV đã đ c xây d ng t ừ ướ  tr ể c trên vector chuy n gen th c v t là

ễ ấ ả ượ ế ế pCAMBIA2300. C  2 c u trúc xâm nhi m này đã đ ạ c bi n n p vào t bào vi

ẩ ừ ả ả ồ khu n A. tumefaciens t 2013. Tuy nhiên, trong quá trình b o qu n, ngu n AT­

ẫ ậ VNP93­5­8­1 (DNA­B) có l n AT­VNP93­5­4­11 (DNA­A). Do v y, chúng tôi

ớ ằ ẩ ẩ ị ế ấ đã chu n b  dòng vi khu n m i b ng cách ễ   ạ ạ  c u trúc xâm nhi m bi n n p l i

ế ả ế ủ c a DNA­A và DNA­B vào t bào A. tumerfaciens kh  bi n.

ủ ễ ấ Dòng plasmid mang c u trúc xâm nhi m c a DNA­A (VNP93­5­4) và

ượ ế ế ả ế DNA­B (VNP93­5­8) đ ạ c bi n n p vào t bào kh  bi n A. tumefaciens theo

ươ ư ả ậ ệ ầ ươ ph ng pháp đông – tan nh  mô t trong ph n v t li u và ph ng pháp. Vi

ạ ẩ ượ ấ ẽ ừ ễ ả ấ ế khu n bi n n p đ c c y tr i riêng r  t ng c u trúc xâm nhi m trên 2 đĩa môi

ườ ứ tr ng LB agar ch a 3 kháng sinh (rifampycin, kanamycin và streptomycin) ủ ở

ẩ ạ ề ể ặ 28oC. Quan sat sau 2 ngày ủ ấ ố ượ  th y s  l ng khu n l c nhi u, có đ c đi m hình

ẩ ạ ố ỗ ọ thái gi ng A.tumerfaciens. Chúng tôi ch n m i đĩa 5 khu n l c đem nuôi trong

ườ ứ ỏ môi tr ng LB l ng ch  3 kháng sinh (rifampycin, kanamycin và streptomycin).

0C. D ch vi ị

ẩ ở ề ệ ắ Vi khu n nuôi qua đêm đi u ki n l c 20 rmp và nhi ệ ộ ướ t đ  d i 28

ượ ớ ồ ̣ ̣ ẩ khu n đ ể c ki m tra ặ Multiplex – PCR  v i các c p m i đăc hiêu VNP93­A­

ươ ể F1/B­F1 và VNP93­A­F1/B­F1. Chu trình và ph ng pháp ki m tra Multiplex –

ầ ươ PCR đã trình bày trên ph n ph ng pháp.

ả ể ế ả K t qu  ki m tra PCR ( B ng 4.1 ấ  và Hình 4.1) cho th y trong 10 dòng vì

ượ ể ấ ẩ ấ ẩ khu n đ ễ   c ki m tra PCR th y có 5 dòng vi khu n mang c u trúc xâm nhi m

ủ ễ ẩ ấ ủ c a DNA­A và 5 dòng vi khu n mang c u trúc xâm nhi m c a DNA­B.

ẩ ượ ạ ừ ấ ế Vì 5 dòng vi khu n đ c bi n n p t c u trúc VNP93­5­4 và 5 dòng vi

ượ ạ ừ ấ ế ượ ộ ẫ ẩ khu n đ c bi n n p t c u trúc VNP93­5­8 nên chúng đ c tr n l n 5 dòng

ủ ừ ẩ ượ ệ ấ vi khu n c a t ng c u trúc vào nhau và đ c ký hi u là AT­VNP93­5­4 và

oC trong glycerol 15% và

ượ ả ở ả c b o qu n ­80 AT­VNP93­5­8. Hai dòng này đ

ượ ứ ế đ c dùng cho các nghiên c u ti p theo.

ế ả ả ẩ ấ ủ   B ng 4.1: K t qu  PCR 10 dòng vi khu n mang c u trúc xâm nhiêm c a

PepYLCVNV

PCR

STT DNA

DNA­A DNA­B ạ Dòng  A.Tumefacie ế ns bi n n p

AT­VNP93­5­4­1 1 + – DNA­A

AT­VNP93­5­4­2 2 + – DNA­A

AT­VNP93­5­4­3 3 + – DNA­A

AT­VNP93­5­4­4 4 + – DNA­A

AT­VNP93­5­4­5 5 + – DNA­A

AT­VNP93­5­8­1 6 – + DNA­B

AT­VNP93­5­8­2 7 – + DNA­B

AT­VNP93­5­8­3 8 – + DNA­B

AT­VNP93­5­8­4 9 – + DNA­B

AT­VNP93­5­8­5 10 – + DNA­B

ể ượ ế ạ Hình 4.1. Ki m tra PCR các dòng A.Tumefaciens đ ớ   c bi n n p v i

ủ ễ ấ c u trúc xâm nhi m DNA­A và DNA­B c a PepYLCVNV

MVNP93­5­4­1 VNP93­5­4­2 VNP93­5­4­3 VNP93­5­4­4 VNP93­5­4­5 VNP93­5­8­1 VNP93­5­8­2  VNP93­5­8­3 VNP93­5­ 8­4 VNP93­5­8­5 (ladder 100bp)

ụ ồ ủ ễ ẩ ấ Ph c h i các dòng vi khu n A. tumefaciens mang 2 c u trúc xâm nhi m c a

PepYLCVNV

ễ ặ ẩ ấ ấ ủ   L y c p dòng vi khu n AT­VNP93­5­4 (mang c u trúc xâm nhi m c a

ủ ễ ấ ả ả   DNA­A) và AT­VNP93­5­4 (mang c u trúc xâm nhi m c a DNA­B) b o qu n

oC đ  làm ngu n lây nhi m. Hai dòng này sau khi ph c h i đ

ở ồ ượ ụ ễ ể ồ ­80 ả   c b o

oC cho các nghiên c u lây

ạ ắ ả ướ ấ ở ề ệ ứ qu n ng n h n trong n c c t vô trùng đi u ki n 4

ự ậ ễ nhi m trong quá trình th c t p.

ẩ ượ ấ ườ Hai dòng vi khu n trên đ ắ c c y zic z c trên môi tr ng LB – agar có b ổ

ạ sung  thêm  ba lo i  kháng sinh  Streptomycin, Rifamycin,  Kanamycin.  Nuôi vi

0C và đánh giá k t qu  sau 2 ­ 3 ngày.

ệ ề ẩ ế ả khu n trong đi u ki n nhi ệ ộ ướ t đ  d i 28

ắ ầ ứ ế ẩ ọ Sau 2 ngày thì vi khu n b t đ u m c, đ n ngày th  3 nhìn chung các

ẩ ấ ườ ẩ ạ ề ọ dòng vi khu n nuôi c y trên môi tr ng LB – agar, có khu n l c m c đ u và

ẩ ạ ướ ề ặ ẩ ạ ữ ắ ẵ ẹ đ p, khu n l c hình tròn, màu tr ng s a, rìa nh n, b  m t khu n l c t (Hình

ả ẩ ạ ư ặ ố ổ nh 4.2). Khu n l c đ c tr ng cho dòng vi khu n ẩ Agrobacterium. T ng s  2/2

ẩ ượ ụ ồ ả dòng vi khu n đã đ c ph c h i (B ng 4.2).

ả ụ ồ ế ả ẩ ấ B ng 4.2. K t qu  ph c h i 2 dòng vi khu n mang c u trúc xâm

ủ nhiêm c a PepYLCVNV

ố

STT

DNA

Dòng vi khu nẩ

ọ   ẩ ạ S  khu n l c m c trên LB­ agar

DNA­A

1

AT­VNP93­5­4­11

~200

DNA­B

2

AT­VNP93­5­8­1

~150

ẩ ạ ả ườ Hình 4.2. Hình  nh khu n l c trên môi tr ng LB–Agar sau 3 ngày nuôi

câý

ố ườ ỏ Nhân sinh kh i  dòng vi khu n ẩ A.Tumerfaciens trong môi tr ng LB­ l ng

ặ ẩ ọ Ch n c p dòng vi khu n VNP93­5­4 và VNP­5­8 nuôi nhân sinh kh i đố ể

ụ ồ ễ ế ti n hành lây nhi m. Sau khi đã ph c h i các dòng vi khu n ẩ A.tumerfacins ch aứ

ẩ ạ ượ ễ ườ ấ c u trúc xâm nhi m, các khu n l c đ ắ c đem nuôi l c trong môi tr ng LB –

ứ ạ ớ ụ   ỏ l ng có ch a 3 lo i kháng sinh (Streptomycin, Rifamycin, Kanamycin), v i m c

ễ ẩ ẩ ố đích nhân sinh kh i các dòng vi khu n cho lây nhi m. Vi khu n nuôi qua đêm ở

0C. Kêt qua cho thây t

́ ́ ệ ắ ề ấ ả ̉ đi u ki n l c 250 rmp và nhi ệ ộ ướ t đ  d i 28 t c  các

ẩ ạ ể ố ườ ọ ị ề khu n l c đ u phát tri n t t trong môi tr ỏ ng LB – l ng, các l dung d ch vi

ẩ ụ ả ẩ khu n có v n đ c ( Hình  nh 4.2).

ứ ấ ẩ ễ   Hình 4.2: Dòng vi khu n A.tumerfaciens ch a c u trúc xâm nhi m

PepYLCVNV nuôi trong LB – l ngỏ

ằ ế ệ ươ K t qu  đánh giá tính gây b nh c a ủ PepYLCVNV b ng ph ng pháp

ả Agroinoculation

ứ ễ ấ ủ   Các   dòng   vi   khu n  ẩ A.tumerfaciens  có   ch a   c u   trúc   xâm   nhi m   c a

ứ ẽ ộ ượ PepYLCVNV ch a b  gen (DNA­A và DNA­B ) riêng r , đã đ c nuôi trong

ườ ẩ ỏ ượ ắ ỏ môi tr ị ng LB – l ng. D ch vi khu n thu đ c sau khi nuôi l ng, l c đ ượ   c

2 cùng

ấ ặ ệ ẩ ặ ẩ ằ mang đi li tâm l y c n vi khu n và hòa tan c n vi khu n b ng đ m MgCl

ể ủ ự ẩ ớ v i 1 µl/ml acetonringone 0.1M giúp kích thích s  phát tri n c a vi khu n trong

ế ủ ẩ ị ượ ử ụ ễ ể ằ t bào ký ch . Sau đó d ch vi khu n đ c s  d ng đ  lây nhi m b ng cách

́ ́ ự ế ở ệ ̣ ̣ tiêm tr c ti p vào mô lá khi cây ̀    giai đoan co 3­4 la thât. Cây thí nghi m là ca

̀ ̀ ́ ́ ả ẫ ̉ ̉ ố chua m n c m gi ng Hông Lan T20, ́ ̣   ơ t Hiêm Lai F1­207, va cac giông chi thi:

ố ố thu c lào (N. glutinosa), ố thu c lá ( N. tabacum) cv. K326, thu c lá ( N. tabacum)

ả ố cv. Samsum, thu c lá c nh ( Nicotiana benthamiana), hoa ngũ s c (ắ Ageratum

conyzoides).

ử ụ ệ ươ Trên cùng 1 cây thí nghi m, chúng tôi đã s  d ng 2 ph ể ư   ng pháp đ  đ a

ẩ ươ ễ ượ vi khu n vào trong cây. Các ph ng pháp lây nhi m đ c trình bày ở ả    b ng

4.2.3.

ả ươ ạ ử ụ ễ B ng 4.3. Các ph ng pháp lây nhi m nhân t o s  d ng A.

tumerfaciens (Agroinoculation)

STT Tên ph ngươ Mô t ả ươ  ph ng pháp

pháp

ự ế ươ ễ ượ 1 Tiêm tr c ti p Là ph ng pháp lây nhi m khi cây đ c 3­4 lá

ẩ ẩ ượ ự ế ị d ch khu n vào ̀ mâm, ị d ch vi khu n đ c tiêm tr c ti p nách

ằ ế ạ nách lá lá b ng  xi lanh y t lo i 1 mL nh .ỏ

ươ ễ ượ 2 Là ph ng pháp lây nhi m khi cây đ c 3­4 lá

ự ế ế ạ Tiêm tr c ti p mâm̀ , dùng xy lanh y t lo i 1 mL nhỏ nh ngư

ẩ ẩ ơ ị ị d ch  khu n vào tháo kim và b m d ch vi khu n vào m t d ặ ướ   i

ể ể ẩ ậ mô lá ủ c a lá đ  vi khu n có th  xâm nh p vào mô

qua khí kh ng.ổ

ứ ệ ồ Các công th c thí nghi m bao g m:

ễ ỉ ộ 1. Ch  lây nhi m m t mình dòng VNP93­A

ễ ỗ ẩ VNP93­A và VNP93­B ợ 2. Lây nhi m h n h p 2 dòng vi khu n:

́ acetosyrigone 10 mM ́ư 3. Đôi ch ng: tiêm

ứ ự ộ ỗ ượ ự ế ệ M t công th c th c hi n trên 5 cây, m i cây đ c tiêm tr c ti p 3 mũi

ạ ừ ọ ế ố ượ ơ ế ớ t i 3 nách lá tính t ng n xu ng, ti p theo đ c b m 3 v t trên 3 lá khác v i ba

ượ lá đã đ c tiêm vào nách.

oC –

ể Vì nhi ệ ộ ố t đ  t i thích cho vi khu n ẩ A. tumefeciens chuy n gien là 28

oC

ệ ượ ề ể 30oC nên cây thí nghi m đ c chuy n vào phòng đi u hòa nhi ệ ộ ở t đ 28

ướ ể ạ ệ ệ ạ ố tr ễ c, sau và trong su t quá trình lây nhi m nhân t o đ  t o đi u ki n cho vi

ậ ợ ẩ ạ ộ khu n ho t đ ng thu n l i.

ệ ượ ể ươ ề ả ả Sau đó cây thí nghi m đ ̀ c chuy n ra nha l ́ i và đ  đ m b o cho cây

ọ ớ ề ấ ả ệ ấ ạ s ch b  ph n (môi gi i truy n Begomovirus) t t c  cây thí nghi m đ ượ ử   c x  lý

̀ ̀ ố ừ ệ ́ ơ ̣ ̣ ằ b ng thu c tr côn trùng chích hút v i mât đô phun 2 tuân/lân. Thí nghi m lây

ễ ượ ọ ở nhi m agroinoculation đ c minh h a Hình 4.6.

ươ ự ế ẩ ị Hình4.3. Ph ng pháp tiêm tr c ti p d ch vi khu n vào mô lá

ễ ằ ủ ệ Tính gây b nh c a DNA­A (lây nhi m b ng agroinoculation)

ả ộ ộ PepYLCVNV là m t begomovirus có b  gen kép (có c  DNA­A và DNA­

́ ề ơ ộ ượ ứ B).  Tuy nhiên,  nhi u begomovirus co b  gien đ n đã đ c ch ng minh là có

ầ ự ặ ủ ể ạ ứ ệ ể ẳ   th  t o ra tri u ch ng đi n hình mà không c n s  có m t c a DNA­B ch ng

ư ố ớ ạ h n nh  đ i v i TYLCSV (Kheyr­Pour et al., 1991) và Tobacco yellow leaf curl

́ ̀ ̣ ̣ ́ Yunnan virus  (TYLCYNV) (Xie  et al., 2006) trên ca chua. Măt khac, môt sô

́ ̃ ́ ́ ̀ ́ ư ̣ ̣ ̉ ̃ ̉  nghiên c u tai TTBCND (Chi, 2013) đa kêt luân chi cân DNA­A cung co co thê

̀ ̣ gây bênh trên ca chua.

́ ̀ ́ ́ ̀ ́ ̀ ́ ̣ ̣ ̣ ̣ ́ ư   Chinh vi vây, chung tôi tiên hanh lăp lai cac thi nghiêm nhăm nghiên c u

̀ ́ ́ ́ ủ ở ̣ ̉ ̉ chinh xac tinh gây bênh cua chi DNA­A c a  PepYLCVNV trên ca chua b i vi ̀

̃ ̀ ́ ̀ ̀ ̀ ượ ở ̉ ̣ ̣ ̣ DNA­A cua virus nay đa đ c phat hiên trên ruông trông ca chua gân ruông

̀ ́ ̀ ̃ ́ ̃ ̃ ơ ̣ ̀ trông ́ ́ ư   ơ t đa, n i đa phat hiên ra virus nay.  Ngoai ra, chung tôi cung nghiên c u

́ ̀ ́ ́ ̀ ̣ ̣ tinh gây bênh nay trên cây ́ ̀ ơ t, thuôc la va trên cây ho ̣ ageratum (môt loai cây ky ́

́ ́ ự ̉ ̣ ̉ ̀ ́ ơ chu phu phô biên đôi v i begomovirus ngoai t nhiên).

̀ ễ : Lây nhi m trên dong̀ ̀  ca chua Hông Lan (T20). ́ Chung tôi Thí nghi m 1ệ

̀ ̃ ̀ ́ ̀ ̃ ́ ư ượ ̣ ̣ ̣ tiên hanh lăp lai 4 lân, triêu ch ng môi lân lây đ ̀ c theo doi sau 1, 2, 3, 4 tuân

̀ ự ễ ộ ̉ ̣ sau khi lây. Sau m t tháng lây nhi m, trong ca 4 lân th c hiên lây không có cây

ể ể ễ ẩ ứ ễ ệ ệ ể ệ ả nào bi u hi n tri u ch ng nhi m b nh. Đ  ki m tra kh  năng nhi m  n (cây

ứ ư ệ ễ ễ ể ệ nhi m virus nh ng không bi u hi n tri u ch ng), sau 50 ngày lây nhi m chúng

ể ể ự ủ ế ặ tôi ti n hành PCR đ  ki m tra s  có m t  DNA­A c a PepYLCVNV trên các

ồ ặ ử ụ ệ cây lây s  d ng m i đ c hi u VNP93­A­F1/R1.

ễ ệ ỉ B ng ả 4.4. Tính gây b nh c a PepYLCV khi lây nhi m ch  DNA­A giônǵ

ủ ̀ ̀ ca chua Hông Lan (T20)

́ ́ ̣ Sô cây PCR ươ ng/ d ố STT S  cây lây ̀ Ngay lây nhiêm̃ ́ Sô cây co triêu ch nǵư ́ ̉ sô cây kiêm tra

1 8/3/2014 15 0 3/5

2 12/4/2014 15 0 5/5

3 24/4/2014 12 0 2/5

4 10/5/2014 12 0 4/5

ệ ồ   ủ Hình 4.4. PCR phát hi n DNA­A c a PepYLCVNV trên cà chua H ng

ả ươ ứ ừ Lan (T20). T  trái qua ph i t ng  ng.

́ ̀ ́ ́ ̀ ́ ́ ̉ ̣ ̣ ̣ Kêt qua cho thây răng qua 4 lân thi nghiêm chung tôi không nhân thây triêu

̀ ́ ̃ ̀ ̃ ́ ́ ư ự ̉ ́   ch ng trên cac cây lây nhiêm tuy nhiên khi kiêm tra băng PCR thi vân thây s  co

̃ ́ ́ ̉ ượ ́ ư ̣ ̉ ̣ ̉ ̉ ̉ măt cua virus ch ng to đ ́ c tinh hiêu qua cua câu truc xâm nhiêm=> câu hoi vi ̀

sao.

́ ệ ế ễ :  Lây nhi m trên ơ : Chung tôi ti n hành thí nghi m này t́ Thí nghi m 2ệ

́ ̀ ̃ ̀ ̀ ̃ ̉ ̉ ̣ ̣ trên giông ́ ́ ơ t mân cam Hiêm Lai F1­207. Tiên hanh lăp lai 3 lân, theo doi tuân 1,

̀ ạ ầ ̉ 2, 3, 4 sau lây. Quan sát t i tu n 4 sau khi tiêm cho th y, ấ ca 3 lân tiêm không co ́

̀ ễ ầ ̣ ̣ ́ ư cây nao biêu hiên triêu ch ng, sau 4 tu n lây nhi m, ế chúng tôi ti n hành PCR

ủ ự ặ ử ụ   ể ể đ  ki m tra s  có m t   DNA­A c a PepYLCVNV trên các cây lây s  d ng

ồ ặ ệ ̉ m i đ c hi u VNP93­A­F1/R1 (Bang 5, hình 4.5).

ả ễ ệ ỉ

ủ ́ơ ̉ B ng 4.5. Tính gây b nh c a PepYLCV khi lây nhi m ch  DNA­A giônǵ t Hiêm Lai F1­207

́ ́ ̣ Sô cây PCR ươ ng/ d ố STT S  cây lây ̀ Ngay lây nhiêm̃ ́ Sô cây co triêu ch nǵư ́ ̉ sô cây kiêm tra

1 12/4/2014 15 0

2 24/4/2014 12 0

3 10/5/2014 12 0

ươ ả ứ ứ ố ả ứ Ghi chú: Ph n  ng PCR d ng (+); Ph n  ng PCR âm (­); ĐC: Đ i ch ng

ủ ệ ớ Hình 4.5. PCR phát hi n DNA­A c a PepYLCVNV trên ể t Hi m Lai

ả ươ ứ ừ F1­207. T  trái qua ph i t ng  ng.

ễ ệ ỉ : Lây nhi n trên cây ch  th : ế   ị  Trong thí nghi m này chúng tôi ti n Thí nghi m 3ệ

ễ ố ố hành lây nhi n trên 3 gi ng thu c lá (N. benthamaiana, N. tabacum cv. Samsun,

́ ̀ ́ ̀ ̉ N.   tabacum   cv.   K326),   thuôc   lao   N.Glutinosa   va   hoa   ngu   săc   (Ageratum

̀ ́ ̀ ̃ ́ ư ượ ̣ ̣ ̣ conyzoides). Tiên hanh lăp lai 3 lân, triêu ch ng đ ̀ c theo doi sau 1, 2, 3, 4 tuân

̃ ́ ̀ ̀ ̀ ̀ ơ ượ ̉ ̣ sau lây đông th i cac cây lây nhiêm đ c kiêm tra lai băng PCR sau 4 tuân lây

̃ ́ ̀ ̉ ượ ở ̉ nhiêm. Kêt qua đ ̀ c trinh bay bang 4.6 và hình 4.6

ả ệ ủ ễ ̉

̉ ̣ B ng 4.6. Tính gây b nh c a PepYLCV khi lây nhi m chi DNA­A trên cây chi thi.

̃ ̀ ̀ Lân lây ̀ Lân lây ́ư Lân lây nhiên th  3

nhiêñ nhiêñ

th  1́ư th  2́ư Cây

Triêụ PCR Triêụ PCR Triêụ PCR

ch nǵư (+) ch nǵư (+) ch nǵư (+)

Nicotiana 0/6 6/6 0/6 3/6 0/6 4/6 benthamiana

N. tabacum cv. K326 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6

N. tabacum cv. 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 Samsun

N. glutinosa 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6

Ageratum conyzoides 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6

ươ ả ứ ứ ố ả ứ Ghi chú: Ph n  ng PCR d ng (+); Ph n  ng PCR âm (­); ĐC: Đ i ch ng

ệ ủ Hình 4.6. PCR phát hi n DNA­A c a PepYLCVNV trên cây Nicotiana

ễ ầ benthamiana (lây nhi m l n 1)

M Cây 1 Cây 2 Cây 3 Cây 4 Cây 5 Cây 6(ladder 1kb)

́ ̉ Kêt qua: ????

́ ̣ Kêt luân chung:

̃ ́ ̀ ̀ ử ̣ Qua 3 thi nghiêm lây nhiêm phân t DNA­A trên ́ ơ t, ca chua va cây chi ̉

́ ̃ ́ ́ ̣ ̣ ̣ ́ ư thi, chung tôi không nhân thây triêu ch ng trên cac cây lây nhiêm tuy nhiên khi

̀ ́ ́ ̀ ́ ̃ ̀ ́ ự ́ ư ̉ ̣ ̉ ̉ ̣ kiêm tra băng PCR thi vân thây s  co măt cua virus. Điêu đo ch ng to tinh hiêu

́ ́ ̀ ̃ ́ ử ̉ ̉ ̉ ̣ qua cua câu truc xâm nhiêm. Gia thuyêt, môt minh phân t ̉   DNA­A không thê

́ ́ ̃ ́ ̀ ̀ ượ ử ̣ ̣ ̉ gây bênh đ c măc du vân co qua trinh tai sinh cua phân t DNA­A trong cây,

̀ ̀ ̀ ́ ́ ̀ ́ ự ́ ơ ử ̉ ̣ ̉ ̉ co thê đôi v i virus nay thi cân s  co măt cua ca 2 phân t DNA­A va DNA­B

̀ ̀ ́ ̀ ́ ̀ ́ ́ ̀ ́ ́ ơ ượ ́ ư ̉ ̣ m i co thê hinh thanh đ ́ ́   c triêu ch ng. Chinh vi thê ma chung tôi tiên hanh thi

́ ́ ́ ̀ ́ ̣ ̣ ̉ nghiêm tiêp theo liên quan đên tinh gây bênh cua PepYLCVV băng cach lây

̀ ̃ ̀ ̀ ơ nhiêm đông th i DNA­A va DNA­B.

ủ ả ễ ệ ằ Tính gây b nh c a c  DNA­A & DNA­B (lây nhi m b ng agroinoculation)

́ ́ ư ử ̉ ̣ ́ Giông nh  kiêm tra tinh gây bênh trên phân t ́  DNA­A, chung tôi tiên

̀ ́ ̀ ́ ́ ơ ̉ ̣ ̉ ̉ ̣ hanh kiêm tra tinh gây bênh cua ca DNA­A va DNA­B v i 3 thi nghiêm 1, 2, 3

̀ ượ ̉ ̣ ̉ ̉ ̀ lân l ̀ t trên cây ca chua, cây ̀ ́ ́ ơ   t va cây chi thi, chi khac khi kiêm tra PCR ngoai

́ ̀ ử ̣ ̣ ̣ ̣ ̀ ử   s   dung   môi   đăc   hiêu  VNP93­A­F1/A­R1,  chung   tôi  còn   s   dung  thêm   môi

VNP93­B­F1/B­R1.

̀ ̀ ̀ ́ ̀ ễ : Lây nhi m trên dong ca chua Hông Lan (T20). Tiên hanh Thí nghi m 1ệ

̀ ̀ ̃ ̀ ̃ ́ ư ượ ̣ ̣ ̣ lăp lai 4 lân, triêu ch ng môi lân lây đ c theo doi sau 1, 2, 3, 4 tuân sau khi lây

̀ ̃ ̀ ̀ ơ ượ ̉ ̣ ́ lây đông th i cac cây lây nhiêm ầ sau 4 tu n lây đ ́   c kiêm tra lai băng PCR. Kêt

̀ ̉ ượ ở ̉ qua đ ̀ c trinh bay bang 4.7 và hình 4.7.

ủ ễ ệ ̉ ̉ B ng ả 4.7. Tính gây b nh c a PepYLCV khi lây nhi m cua ca DNA­A và

̀ ́ ̀ DNA­B trên giông ca chua Hông Lan (T20)

́ ươ Sô cây PCR d ng/ ́

́ ̉ ố sô cây kiêm tra STT S  cây lây ̀ Ngay lây nhiêm̃ ́ Sô cây co triêụ   ch nǵư DNA­A DNA­B

1 8/3/2014 15 0

2 12/4/2014 15 0

3 24/4/2014 12 0

4 10/5/2014 12 0

ươ ả ứ ứ ố ả ứ Ghi chú: Ph n  ng PCR d ng (+); Ph n  ng PCR âm (­); ĐC: Đ i ch ng

ệ Hình 4.7. PCR phát hi n DNA­A và DNA­B c a PepYLCVNV trên cà chua

ừ ồ H ng Lan (T20) . T  trái qua ph i t ủ ả ươ ứ ng  ng.

́ ̃ ̉ ̉ ễ : Lây nhi m trên ơ Lây trên giông t: ́ ́ ơ t mân cam Hiêm Lai Thí nghi m 2ệ

́ ̀ ̃ ̀ ̀ ̀ ̀ ơ ̣ ̣ F1­207. Tiên hanh lăp lai 3 lân, theo doi tuân 1, 2, 3, 4 sau lây ́ lây đông th i cac

̃ ̀ ượ ̉ ̣ cây lây nhiêm đ c kiêm tra lai băng PCR ̀  sau 4 tuân lây nhiêm ́ ̃ . Kêt qua đ ̉ ượ   c

̀ ̀ ở ̉ trinh bay bang 5.

ả ủ ễ ệ ̉ ̉

́ B ng 4.8. Tính gây b nh c a PepYLCV khi lây nhi m cua ca DNA­A và   ́ơ ̉ DNA­B trên giông t Hiêm Lai F1­207

́ ươ Sô cây PCR d ng/ ́

́ ̉ ố sô cây kiêm tra STT S  cây lây ̀ Ngay lây nhiêm̃ ́ Sô cây co triêụ   ch nǵư DNA­A DNA­B

1 12/4/2014 15 0

2 24/4/2014 12 0

3 10/5/2014 12 0

ả ứ ươ Ghi chú: PCR (+): Ph n  ng PCR d ng.

ủ ớ Hình 4.8. PCR phát hi n DNA­A và DNA­B c a PepYLCVNV trên ể t Hi m

ả ươ ứ ệ ừ Lai F1­207 . T  trái qua ph i t ng  ng.

ễ ố ố : Lây nhi m trên cây 3 gi ng thu c lá (N. benthamaiana, N. Thí nghi m 3ệ

́ ̀ ̀ tabacum cv. Samsun, N. tabacum cv. K326), thuôc lao N.Glutinosa va hoa ngu ̉

̀ ̀ ́ ́ ư ượ ̣ ̣ ̣ ́ săc (Ageratum conyzoides). Tiên hanh lăp lai 3 lân, triêu ch ng đ ̃   c theo doi

̀ ̀ ễ ầ ế sau 1, 2, 3, 4 tuân sau lây đông th i ̀ơ sau 4 tu n lây nhi m, chúng tôi ti n hành

ể ể ủ ự ặ PCR đ  ki m tra s  có m t  DNA­A và DNA­B c a PepYLCVNV trên các cây

́ ử ụ ̉ ượ ặ ồ lây s  d ng c p m i VNP93­A­F1/R1, VNP93­B­F1/R1. Kêt qua đ ̀ ̀ c trinh bay

ở ̉ bang 4.9, hình 4.9

ả ủ ễ ệ ̉ ̉

̉ ̣ B ng 4.9. Tính gây b nh c a PepYLCV khi lây nhi m cua ca DNA­A và   DNA­B trên cây chi thi.

̀

̃

́ư Lân lây nhiên th  3

Lâǹ

Lâǹ

lây

lây

nhiêñ

nhiêñ

Cây

th  1́ư

th  2́ư

Triêụ

PCR

Triêụ

PCR

Triêụ

PCR

ch nǵư

(+)

ch nǵư

(+)

ch nǵư

(+)

DNA

DNA­

DNA­

DNA

DNA

DNA­

­A

B

A

­B

­A

B

Nicotiana

benthamian

0/6

0/6

0/6

0/6

0/6

0/6

0/6

0/6

0/6

a

N. tabacum

0/6

0/6

0/6

0/6

0/6

0/6

0/6

0/6

0/6

cv. K326

N. tabacum

0/6

0/6

0/6

0/6

0/6

0/6

0/6

0/6

0/6

cv. Samsun

N. glutinosa

0/6

0/6

0/6

0/6

0/6

0/6

0/6

0/6

0/6

Ageratum

0/6

0/6

0/6

0/6

0/6

0/6

0/6

0/6

0/6

conyzoides

ươ ả ứ ứ ố ả ứ Ghi chú: Ph n  ng PCR d ng (+); Ph n  ng PCR âm (­); ĐC: Đ i ch ng

ủ ệ ỉ Hình 4.9. PCR phát hi n DNA­A và DNA­B c a PepYLCVNV trên các cây ch

ả ươ ứ ừ ị th  . T  trái qua ph i t ng  ng.

ễ ể ế ả ợ ợ K t qu  lây nhi m trên cũng g i ý là agroinoculation có th  phù h p đ ể

ư ể ệ ợ đánh giá tính gây b nh nh ng không phù h p đ  đánh giá tính kháng khi t ỷ ệ   l

ễ ầ ắ ộ nhi m cao là yêu c u b t bu c.

ế ậ K t lu n

́ ́ ́ ́ ử ̣ ̣ ̉ ̉ ư ậ Nh  v y, t ̀ ư  2 thi nghiêm đanh gia tinh gây bênh cua chi phân t DNA­A

̀ ́ ́ ̀ ́ ̀ ử ̉ ̉ ̣ ̣ va cua ca phân t ́    DNA­A va DNA­B. Chung tôi nhân thây răng, viêc đanh gia

́ ̀ ư ̣ ̣ ̣ ̉ tinh gây bênh trên ́ ơ t băng agroinoculation ch a đem lai hiêu qua do không quan

́ ́ ̀ ̀ ̀ ́ ́ ư ́ ư ̣ ̉ ̉ sat thây triêu ch ng nh ng khi chung tôi tiên hanh kiêm tra PCR thi đêu phan

́ ư ̉ ự ́ ư ̉ ̉ ̉ ̣ ̃ ́ ng (+) ch ng to s  tai sinh cua virus vân xay ra. Nguyên nhân cua viêc không

̀ ̀ ́ ́ ư ̣ ̉ hinh thanh triêu ch ng co thê do:

́ ̀ ́ ươ ợ ̣ ́ 1. Thi nghiêm tiên hanh trong môi tr ̀ ng không thich h p.

́ ́ ́ ̉ ̣ 2. Giông cây co kha năng khang bênh.

̃ ́ ́ ́ ̃ ̉ ơ ươ ̉ 3. Clone co thê v  khung dân đên không t ng tac nên cây không biêu

̀ ̃ ́ ́ ư ̣ ̣ ̣ hiên triêu ch ng măc du trong cây virus vân tai sinh.

ệ ủ ễ ằ ạ Đánh giá tính gây b nh c a PepYLCVNV b ng lây nhi m nhân t o dùng

ọ ấ b  ph n

̀ ́ ̃ ượ ở ̀ ́ ơ ̣ ̣ Do PeYLCVV đ c phat hiên đâu tiên ̀  cây ca chua va ̀ t tai Đa Năng,

́ ̀ ̀ ̀ ́ ̀ ̀ ơ ̣ ̣ ́ đông th i gân đây chung tôi phat hiên thây virus nay trên ruông ̀ ́ ́ ̣   ơ t va ca tim tai

̀ ́ ỏ ặ ệ ệ ồ ừ ̣ ̣ Đông Thap. Vây môt câu h i đ t ra là li u ngu n b nh PepYLCVNV t ̀    trên ca

̀ ượ ơ ượ ệ ̣ chua có lây sang đ c cây ́ t hay không và ng c lai, va li u PepYLCVNV có

̀ ờ ọ ề ấ ơ lan truy n nh  b  ph n nh  các begomovirus khác.

ử ữ ụ ế ệ ả ớ V i nh ng m c đích đó, chúng tôi đã ti n hành thí nghi m th  kh  năng

̀ ́ ̀ ủ ề ơ ằ ớ lan truy n c a PepYLCVNV trên cây ́ t va ca tim  b ng côn trùng môi gi i là

̀ ́ ệ ồ ọ b  ph n ( ấ B. tabaci) trên hai ngu n b nh khác nhau trên cây ca tim và cây ́ ơ t, sau

ấ ả ệ ượ ử ừ ằ ố khi lây 2 ngày t t c  cây thí nghi m đ c x  lý b ng thu c tr  côn trùng chích

ả ứ ế ể ằ ẫ hút và 20 ngày sau lây ti n hành thu m u lá đem ki m tra b ng ph n  ng PCR.

̀ ́ ̀ ử ụ ệ ệ ồ Ngu n b nh chúng tôi s  d ng trong thí nghi m là cây ca tim va cây ́ ễ   ơ t nhi m

ượ ạ ướ ả ằ ễ PepYLCVNV, đ c ch y PCR tr c khi lây nhi m, đ  đ m b o r ng cây cà ể ả

́ ́ơ ễ ế ắ ắ ả ồ ượ tim và cây t dây ngu n ch c ch n nhi m PepYLCVNV. K t qu  thu đ c th ể

ệ ở ả hi n b ng 4. 10 va 4.̀ 11.

̀ ́

ả ệ

ớ

ồ

ế

ạ

Hình 4.10. K t qu  đi n di ch y PCR trên ca tim v i m i VNP93­A­F1/R1, VNP93­B­F1/R1

́ M  VNP1500  VNP1501 đôi ch ng âm  VNP1500­1  VNP1500­2

́ư  VNP1500­3   VNP1500

ế

ạ

ồ

́ ơ ớ t v i m i VNP93­A­F1/R1,

ả ệ Hình 4.11. K t qu  đi n di ch y PCR trên  VNP93­B­F1/R1

M  VNP1500  VNP1500  VNP1500   VNP1500

̀ ́ ̀ ̀ ̃ ̣ Lây nhiêm PepYLCVNV băng cây ca tim nguôn bênh

́ ́ ả ế ả ễ ằ ̣

ồ ̣ B ng 4.10. K t qu  lây nhi m PepYLCV b ng bo phân trên cây cà tim ngu n bênh

PCR

STT S  câyố lây Cây thí  nghiêṃ Tri uệ   ch ngứ   sau lây T  lỷ ệ  b nhệ   (%) DNA­ A DNA­ B S  câyố có  tri uệ   ch ngứ

1 10 10 100 + + ̀ Ca chua T20 (4  Xoăn vang̀ ngoṇ

̉ 2 Ca tim̀ ́ 10 10 Kham vang̀ 100 + +

́Ơ ̉ ̉ 3 10 10 100 Kham nhăn + + t (hiêm lai F1)

ươ ả ứ ố ng (+); Ph n  ng PCR âm (­); ĐC: Đ i

ả ứ Ghi chú: Ph n  ng PCR d ch ngứ

̀ ̃ ̣ Lây nhiêm PepYLCVNV băng cây ́ ̀ ơ t nguôn bênh

ế ọ ấ ễ ả ằ B ng ả t́ ơ

4.11. K t qu  lây nhi m PepYLCV b ng b  ph n trên cây  ệ ồ ngu n b nh

STT PCR

S  câyố lây DNA­ DNA­ Cây  thí  nghiệ S  câyố có  tri uệ T  lỷ ệ  b nhệ   (%) Tri uệ   ch ngứ   sau lây

A

B m ch ngứ (4  tuân)̀

̣ 1 ̀ Xoăn vang ngon + ­ ̀ Ca chua T20 10 10 100

̣ 2 Ca tim̀ ́ 10 0 0 ­ ­ ́ Không co triêu ch nǵư

́Ơ ̉ ̉ 3 10 10 100 Kham nhăn + ­ t (hiêm lai F1)

ả ứ ươ ả ứ ng (+) ; Ph n  ng PCR âm (­) ; ĐC : Đ i ố

Ghi chú : Ph n  ng PCR d ch ngứ

́ ̀ ́ ́ ́ ̣ ̣

̀ ̃ ̉ ́ ơ ở t

̀ ́ ́ ́ ư ượ ̉ ̣ ̣

̀ ́ ̀ ̀ ̣ ̣ Thanh Binh­Đông Thap (triêu ch ng

́ ̃ ̀ ̀ ̉ ̉ ̣ ̉

̀ ́ ̀ ́ ơ ư ̣ ̣ ́ ơ Nh  vây, qua 2 thi nghiêm trên chung tôi nhân thây răng đôi v i  ̀ ́ ́  Cao Lanh­Đông Thap co kha năng lây nhiêm trên ca  ́ ơ c lai đôi v i  ́ ́ ư ̀ ̀ ́ ơ t va ca chua.  ̀ ượ c tai Đông  t thu đ

̀ ươ ́ ́ ̀ ư ̣ ̃ virus trên cây  chua nh ng không co kha năng gây bênh trên ca tim, ng ở begomovirus gây bênh trên ca tim  ̀ ̀ kham vang điên hinh) lai hoan toan co thê lây nhiêm sang  D ng nh , 2 begomovirus gây bênh trên ca tim va  ̀ Thap la 2 loai khac nhau.

ố ớ ủ ủ ậ Đánh giá tính kháng c a PepYLCVNV trên t p đoàn gi ng t c a AVRDC

ấ ệ ự Đánh giá d a vào c p b nh

ộ ể ứ ứ ệ ệ ọ M c đ  bi u hi n tri u ch ng cũng là tiêu chí quan tr ng đánh giá tính

́ ố ệ ự ầ ́ kháng. Chúng tôi đánh giá d a trên s  li u đanh gia đ ượ ừ c t ề  2 l n đi u tra ngày

ả ượ ế ở ả 6/5 và 11/6 năm 2014. K t qu  đ c trình bày B ng 4.10 và Hình 4.13.

ấ ệ ủ ố ả ơ B ng 4.12. C p b nh xoăn vàng lá c a các gi ng ́ t  AVRDC

Ngày 21/5/2014

Ngày  6/5/20 14

STT

Gi nố g

n

n

S  câyố   ị ệ b  b nh

C pấ   b nhệ   (TB)

C pấ   b nhệ   (SE)

S  câyố bị  b nhệ

C pấ   b nhệ   (TB)

C pấ   b nhệ   (SE)

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

ề ổ ố : trung bình; SE (standard eror) : sai số

ượ Chú thích: n : t ng s  cây đi u tra; TB chu nẩ  ; (­) không tính đ c SE, S : nhi mễ  ; R : kháng

̣ ́ Nhân xet: ????

ế ế ấ ủ ễ Thi t k  c u trúc xâm nhi m c a PepYLVNV

ươ M cụ      đích và ph ng pháp

̀ ̀ ễ ằ ̣ ̉ Viêc   lây   nhi m  b ng   Agroinoculation   trên   ca   chua, ́ ̣  ơ t,   va  cây   chi   thi

̀ ́ ̉ ư ư ́ ư ̉ ̣ ̣ ̉ không biêu hiên triêu ch ng nh ng kiêm tra PCR  đêu mang phan  ng PCR

̀ ́ ̀ ́ ươ ́ ơ ử ̣ d ́ ng (+). Cung v i đo chung tôi s  dung cây ca tim, ́ ̀ ơ t nguôn mang t ̀ ̀ ư    Đa

̃ ̀ ̀ ́ ̀ ́ ̀ ́ ̀ ̣ ̣ ̉ ̣ Năng vê đem lây cho ́ ơ t, ca chua, ca tim  băng bo phân đêu xuât hiên biêu hiên

́ ̃ ́ ́ ̃ ́ ̃ ̉ ơ ̣ ̉ ̉ ̣ ̀ bênh. Điêu đo dân t ́ ơ i giai thuyêt: clone co thê v  khung dân đên không biêu hiên

̃ ́ ́ ̀ ́ ̀ ượ ́ ư ̣ ̣ ̣ đ ́ c triêu ch ng măc du trong cây virus vân tai sinh. Chinh vi vây chung tôi tiên

̃ ́ ́ ́ ́ ̀ ́ ́ ự ̣ ̉ ̉ ̣ hanh xây d ng lai câu truc xân nhiêm đê đanh gia chinh xac kha năng gây bênh,

ư ̣ ̣ ̉ đăc tr ng sinh hoc cua virus nay.̀

ứ ứ ụ ụ ủ ầ ỹ ậ M c tiêu c a ph n nghiên c u này là  ng d ng k  thu t RCA (Rolling

ự ủ ể ậ ấ ễ circle amplification) đ  phân l p và xây d ng c u trúc xâm nhi m c a các phân

ử ụ ụ ệ ư ể ệ ặ t DNA­A và DNA­B đ  ph c v  vi c đánh giá tính gây b nh, đ c tr ng sinh

ư ẽ ể ả ễ ấ ự ộ ộ ọ h c cũng nh  s  dùng c u trúc xâm nhi m này đ  gi i trình t toàn b  b  gen

ư ể ặ ử ủ virus đ  đánh giá đ c tr ng phân t c a virus này.

ễ ấ ộ ồ ượ C u trúc xâm nhi m bao g m b  gen virus DNA­A,DNA­B đ c thi ế   t

ụ ụ ệ ủ ứ ể ộ ỉ ế k  ch a 2 stem­loop đ  ph c v  vi c tái sinh b  gen hoàn ch nh c a virus và

ượ ữ ờ ả ủ ằ ố ờ ị ị đ c n i vào 1 v  trí n m gi a b  trái và b  ph i c a 1 vector nh  nguyên. Sau

ượ ọ ọ ấ ủ ể ể đó đ c chuy n vào E.coli đ   nhân dòng là ch n l c c u trúc c a DNA­A và

ẽ ượ ễ ế ế ế ấ DNA­B và ti p theo đó c u trúc xâm nhi m s  đ ạ c bi n n p vào t bào vi

ể ế ử ụ ệ ỹ ậ   khu n ẩ A. Tumerfaciens đ  ti n hành đánh giá tính gây b nh s  d ng k  thu t

Agroinoculation.

ứ ộ ế Trong nghiên c u này, chúng  tôi ti n hành nhân b  gen DNA virus d ướ   i

ằ ẩ ả ỹ ượ ậ ạ d ng   các   multimer   b ng   k   thu t   RCA.   S n   ph m   RCA   sau   đó   đ ắ   c   c t

ệ ể ằ ắ ớ ạ ủ ể ạ ử không tri t đ  b ng enzyme c t gi i h n đ  thu d ng dimer c a phân t DNA.

ử ướ ượ ố ị Các phân t dimer này, có kích th c ~ 5,4 kb, đ c n i vào vector nh  nguyên

ể ố ổ ợ ẩ E.coli pCAMBIA­2300. Cu i cùng chuy n vector tái t h p này vào vi khu n

A. Tumerfacien. và vi ẩ khu n

ơ ồ ướ ự ễ ấ Hình 4.12. S  đ  các b ủ   c xây d ng c u trúc xâm nhi m c a

ử ụ ậ ỹ PepYLCVNV s  d ng k  thu t RCA

ả ắ ướ ự ễ ấ B ng 4. 12. Tóm t t các b c xây d ng c u trúc xâm nhi m

ướ B ị Quá trình chu n bẩ ẩ   c chu n bị

ạ ế

ể ạ ị ồ ặ Bi n   n p   pCAMBIA2300   vào   E.coli   XL1­Blue   sau   đó   ằ   ồ i  b ng minipreps   thu  ngu n  pCAMBIA2300  (ki m  tra  l ệ m i đ c hi u vector)

ằ ở Chu n bẩ vector  pCAMBIA2300 M  vòng vector b ng BamHI Desphosphoryl

ằ ạ pCAMBIA2300 b ng Alkaline photphase và tinh s ch

ử ụ ả ứ Ph n  ng RCA ả ứ Ph n   ng   RCA   s   d ng   exo­hexamer   primer   và   Phi   29 polymerase

ắ ằ ộ ướ ệ ẩ ẩ ả C t không hoàn toàn s n ph m RCA b ng enzyme BamHI ả sau đó đi n di,thôi gel thu s n ph m kích th c 5,4kb Thu dimer c aủ   b  gen PepYLCVNV

ố ượ ớ ở c v i vector pCAMBIA đã m  vòng và

ễ N i dimer thu đ dephosphoryl hóa

ấ C u trúc xâm ủ   nhi m c a PepYLCVNV ế ạ Bi n n p vào E.coli XL1­Blue

ọ ủ ễ ấ

Ch n dòng mang c u trúc xâm nhi m c a DNA­A, DNA­ B

ạ ế ấ

ự ể ể ế   ễ Bi n n p c u trúc xâm nhi m vào Agrobacterium đ  ti n ặ   ả   đ   đánh   giá   đ c hành   Agroinoculation   và   gi i   trình   t

ư ử tr ng phân t

ẩ ị Chu n b  vector pCAMBIA2300

ượ ử ụ ể ễ ấ ị Vector nh  nguyên đ c s  d ng đ  làm c u trúc xâm nhi m là vector

ượ ạ ệ ở pCAMBIA2300 đ c t o ra b i vi n CAMBIA.pCAMBIA­2300 là vector cho

ự ậ ể ượ ử ụ ố ệ chuy n gen th c v t và đ c s  d ng t t trong thí nghi m agroinoculation.

ơ ồ                     Hình 4.13. S  đ  vector pCAMBIA2300

oC đ

ạ ượ ả ở ủ ả ượ Vector pCAMBIA2300 d ng khô đ c b o qu n t ­80 c hòa

ớ ướ ử ụ ủ ế ạ ươ loãng v i n c và bi n n p vào E.coli ch ng XL1­Blue s  d ng ph ng pháp

ệ ượ ả ấ ườ ớ ố s c nhi t và đ c c y tr i trên môi tr ng LB v i tetracyline và kanamycine

ễ ấ ể ọ ọ đ  ch c l c các dòng mang c u trúc xâm nhi m.

oC thì có 200 khu n l c đ n m c trên môi tr

ủ ở ẩ ạ ơ ọ ườ Sau khi 18h 37 ng LB

ữ ủ ư ể ề ặ ắ ề ặ   ớ ặ v i đ c đi m đ c tr ng c a E.coli ( màu tr ng s a, có vi n bao quanh, b  m t

tr n).ơ

ẩ ạ ơ ượ ộ ố ệ ể ắ ố M t s  khu n l c đ n đ ỗ   c chuy n qua nuôi l c trong  ng nghi m, m i

ố ệ ườ ứ ỏ ng nghi m có 5ml môi tr ng LB l ng ch a tetracyline và kanamycine, nuôi

ẽ ượ ế ằ ắ l c 200 rpm. Sau đó plasmid s  đ c tinh chi t b ng Purelink quick plasmid

ộ ượ ỏ ả ẽ ượ ẩ miniprep kit (Invitrogen), m t l ng nh  s n ph m minipreps s  đ ể c ki m tra

ử ụ ủ ặ ặ ồ ồ   ệ ằ b ng   PCR   s   d ng   c p   m i   đ c   hi u   c a   vector   pCAMBIA2300   là   m i

pCAMseqF1 và pCAMseqR.

ả ứ ượ ở ầ ự ệ ề ệ ế ớ Ph n  ng PCR đ c th c hi n v i đi u ki n sau: kh i đ u bi n tính ở

0C trong 40 giây,

ế ế ở 940C trong 4 phút; ti p theo là 35 chu trình PCR (bi n tính 94

0C trong 35 giây và t ng h p s i

0C trong 1 phút 30 giây).

ồ ở ợ ở ợ ổ ắ g n m i 50 72

0C.Sau đó đi n di ki m tra s n ph m, ẩ

ượ ế ớ ở ệ ể ả ả ứ Ph n  ng đ c k t thúc v i 5 phút 72

ướ ả ứ ẩ ỏ ệ ẩ kích th c s n ph m PCR ~ 1,4kb, ch ng t đã thành công trong vi c chu n b ị

ủ ễ ể ấ vector pCAMBIA2300 đ  làm c u trúc xâm nhi m c a PepYLCVNV.

ử ụ ể ệ ẩ ả Hình 4.14.Đi n di s n ph m PCR ki m tra plasmid s  d ng

ồ ặ c p m i pCAMseqF1/R

ầ ượ ượ M: Ladder 1kb, 1­2­3­4 l n l t plasmid đ c tinh chi ế ừ t t ấ    3 clone b t

ế ạ ỳ k  sau khi bi n n p vector pCAMBIA2300

ượ ế ẽ ượ ể Vector pCAMBIA2300 sau khi đ c tinh chi t và ki m tra s  đ c m ở

ằ ằ vòng b ng enzyme Bam HI sau đó desphosphoryl hóa b ng alkaline phosphase

ượ ạ ằ và đ c tinh s ch b ng Purelink PCR purification kit (Invitrogen) (Hình 4.15)

ở ệ ả ẩ ằ   Hình 4.15. Đi n di s n ph m khi m  vòng pCAMBIA 2300 b ng

BamHI

ả ứ ộ ộ ể Ph n  ng RCA đ  nhân dòng toàn b  b  gen PepYLCVNV

ẫ ượ ể ọ M u VNP1500 thu đ ượ ạ c t i TTBCNĐ­ĐHNNHN đ c ch n đ  nhân

ả ứ ộ ộ ủ ằ ẫ ẫ   dòng toàn b  b  gen c a PepYLCVNV b ng ph n  ng RCA.M u này là m u

́ ̀ ượ ượ ̉ ̣ ̣ ́ ơ t, giông Hiêm Lai F1­207, đ ̃ c gieo tai trung tâm trông châu 27/2 đa đ c lây

̃ ́ ́ ̀ ́ ư ̣ ̣ ̣ ̀ nhiêm băng bo phân t ̀ ư  5 cây ́ ơ t bi bênh xoăn vang la do Đ c Anh – CNSH54 thu

́ ̀ ̃ ̃ ̀ ̃ ư ̣ ̣ ̉ ̉ thâp tai Cao lanh­Đông Thap. 5 cây ́ ̉  ơ t đa kiêm tra PCR đêu nhiêm nh ng chi

́ ̀ ́ ̉ ư ươ ́ ơ ̣ ̣ ̣ ́ phan  ng PCR d ̉  ng v i môi đăc hiêu PepYLV DNA­A. Điêu đo đăt ra 2 gia

thuyêt:́

̉ ́ 4. Chi co DNA­A

̉ 5. DNA­B cua virus khać

ử ụ ế ươ ế ả ứ Chúng tôi ti n hành ph n  ng RCA s  d ng 2 ph ng pháp chi t DNA:

̀ ́ ́ ươ ươ ử ̣ ̣ ̣ Ph ng pháp CTAB va ph ằ   ng phap chiêt DNA s  dung kit chuyên dung nh m

ả ả ẩ ằ ử tăng kh  năng thành công khi x  lý s n ph m RCA b ng Bam HI

ả ả ử ớ ệ ẩ ươ ng pháp

ả ế B ng 4.13. Hi u qu  x  lý s n ph m RCA v i các ph  chi t khác nhau

ắ

ươ ế STT M uẫ Ph ng pháp chi t

ằ C t hoàn toàn ẩ ả s n ph m RCA b ng BamHI

1 VNP1500 CTAB ~3kb,2kb

AccuPrep GMO(Plant) Genomic DNA 2 VNP1500 ~3kb,2kb Extraction Kit (Bioneer)

́ ́ ́ ử ụ ươ ử ̣ ̣ Chung tôi nhân thât s  d ng ph ng pháp chiêt s  dung Kit Temphiliph

́ ớ ươ ế ̣ ̉ ̣ ơ hiêu qua tôt h n so v i ph ng pháp chi ế   t CTAB. Chính vì vây, chúng tôi quy t

ọ ươ ế ể ằ ị đ nh ch n ph ng pháp chi ả   t DNA b ng Kit Temphilip đ  làm khuôn cho ph n

ứ ẫ ượ ẫ ơ ọ ượ ̣ ng RCA.M u đ c ch n là m u ́ t thu tai TTBCNĐ­ĐHNNHN đ c lây

́ ̀ ̃ ̀ ́ ư ̃ ư ̣ ̣ ̉ ̉ nhiêm băng bo phân t ̀ ư  5 cây ́ ́ ơ ơ t v i nh ng triêu ch ng điên hinh cua PepYLCV

ượ ể ạ ằ ử ụ ả ứ ặ ớ ồ đã đ c ki m tra l i b ng ph n  ng PCR s  d ng c p m i m i thi ế ế   t k  là

Hình 4.16. PCR kiểm tra mẫu VNP1500 chiết bằng CTAB, Kit Tephiliph

ồ ặ ệ ệ m i đ c hi u phát hi n PepYLCV là VNP93­A­F1/R1 và VNP93­B­F1/R1

ừ ẫ ơ ẽ ượ DNA   t m u ́ t   VNP1500   s   đ ả ứ   c   dùng   làm   khuôn   cho   ph n   ng

ả ứ ủ ẽ ộ ộ RCA.Ph n  ng RCA s  nhân toàn b  b  gen c a các begomovirus theo c  ch ơ ế

ươ ự ủ ự vòng   lăn   t ng   t quá   trình   tái   sinh   c a   virus   ngoài   t ạ     nhiên   thành   d ng

ờ ồ multimer nh  enzyme Phi 29 polymerase và m i exo­random hexamer.

ả ứ ư ệ ề ẩ ả T iố  ắ      u hóa đi u ki n cho ph n  ng c t không hoàn toàn s n ph m RCA

ả ứ ử ự ệ ẩ ả ằ   Sau khi th c hi n ph n  ng RCA,chúng tôi x  lý s n ph m RCA b ng

ắ ằ ể ằ ắ ắ ả ứ   cách c t hoàn toàn b ng enzyme Bam HI 10 u/µl đ  ch c ch n r ng ph n  ng

ượ ộ ẩ ủ ả ứ ủ ắ RCA đã nhân đ c b  gen c a virus.Thành ph n c a ph n  ng c t tri ệ ể ả   t đ  s n

ả ẩ ẩ ồ ph m RCA bao g m 1 µl s n ph m RCA,1 µl Bam HI 10 u/µl,1µl 10 X React3, 7

oC trong 1h.

́ ướ µl n c cât invitro sau đó đ ượ ủ ở c 37

ử ẩ ả ắ ằ ẫ Hình 4.17. X  lý s n ph m RCA m u VNP1500 b ng cách c t  hoàn toàn

ớ v i enzyme BamHI 10 u/µl

VNP1500VNP1500  Marker (ladder: 1kb)

ệ ử ủ ụ ẩ ả ượ M c đích chính c a vi c x  lý s n ph m RCA là thu đ c dimer, và đ ể

ượ ắ ớ ả ứ ệ ế ờ ổ thu đ c dimer chúng tôi ti n hành ph n  ng c t v i vi c thay đ i th i gian,

ộ ệ ộ ệ ế ạ ồ n ng đ  enzyme và nhi ớ   ộ t đ .Chúng tôi ti n hành m t lo t các thí nghi m v i

ệ ắ ố ệ ắ ề ể ề ị ấ các đi u ki n c t khác nhau đ  xác đ nh đi u ki n c t t ằ t nh t nh m  thu đ ượ   c

ẩ ướ ả s n ph m có kích th c ~ 5,4 kb (dimer).

ả ả ứ ố ư ệ ắ B ng 4. 14. T i  u hóa đi u ki n cho ph n  ng c t không hoàn toàn

ủ ề ẩ ả s n ph m RCA c a PepYLCV

ấ ả CT ạ B t ho t ắ ẩ S n ph m c t

N ngồ   độ  enzyme tệ   Nhi ộ ắ   đ  c t (oC) Th iơ   gian c tắ   (phút)

1 10 u/µl 37 80oC/20’ 5 ơ ắ   ạ Monomer và đo n ng n h n 3kb

2 0.5 u/µl 37 80oC/20’ Trimer, dimer, monomer 3

3 0.2 u/µl 37 80oC/20’ Trimer, dimer, monomer 3

4 0.1 u/µl 37 25 80oC/20’ Trimer, dimer, monomer

5 0.05u/µl 37 15 80oC/20’ Không c tắ

ử ả ắ ẫ ằ ẩ Hình 4.18. X  lý s n ph m RCA m u VNP1500 b ng cách c t không

ớ hoàn toàn v i enzyme BamHI 0.2 u/µl.

MarkerVNP1500VNP1500 (ladder: 1kb)

ư ậ ọ ượ ử ụ ộ ồ ố Nh  v y chúng tôi đã ch n đ c n ng đ  enzyme s  d ng t t nh t đ ấ ể

ẩ ả ở ồ ệ ộ ố ư ắ c t không hoàn toàn s n ph m RCA n ng đ t đ  t i  u cho ộ 0.2 u/µl, nhi

oC trong kho ng 3 phút đ  thu đ

ả ứ ắ ể ả ượ ph n  ng c t là 37 ệ   c dimer (5kb) cho vi c

ế ế ấ ủ thi ễ t k  c u trúc xâm nhi m c a begomovirus.

ạ ấ ế ễ .Bi n n p c u trúc xâm nhi m vào E.coli

ố ư ệ ắ ề ể ả ẩ Sau khi t i  u hóa đi u ki n c t không hoàn toàn s n ph m RCA đ  thu

ượ ượ đ c dimer genome PepYLCV, băng 5kb đ ượ ắ ừ c c t t gel agarose và đ c tinh

ế ằ ẩ ả ượ chi t b ng Accuprep Gel purification kit (Bioneer).S n ph m dimer đ ố   c n i

ượ ằ ở ớ v i   vector   pCAMBIA2300   đã   đ c   m   vòng   b ng   Bam   HI   và   đ ượ   c

ể ằ ấ desphosphoryl hóa b ng enzyme T4 Ligase (Fermentas) đ  hình thành c u trúc

ố ẽ ượ ễ ả ẩ ủ ế ạ xâm nhi m.Sau đó s n ph m n i s  đ c bi n n p vào E.coli ch ng XL1­Blue

ả ế kh  bi n.

̀ ́ ế ạ ượ Trong qua trinh bi n n p chúng tôi thu đ c 20 clone. Sau đó chúng tôi

ủ ế ệ ể ượ ố ti n hành ki m tra li u đã có dimer genome c a virus đ c n i vào trong vector

ư ươ ể ể ớ ặ ả ứ hay ch a. Có 2 ph ồ   ng pháp đ  ki m tra đó là: Ph n  ng PCR v i c p m i

ồ ả ứ ể ả ặ ặ đ c hi u ệ VNP93­A­F1/R1 (m i A) ẩ   ắ ho c là ph n  ng c t ki m tra s n ph m

ắ ố ử ụ n i s  d ng enzyme c t BamHI.

ẩ ạ ơ ẽ ượ ấ ả ắ ỏ T t c  khu n l c đ n s  đ ộ   c nuôi l c 200 rpm trong 5ml LB l ng c ng

ế ằ ươ ớ v i kanamycine và tetracycline.Sau đó tinh chi t plasmid b ng ph ng pháp

ượ miniprep  (Sambrook, Fritsch et al., 1989).Sau khi thu đ c plasmid chúng tôi

ắ ằ ể ế ể ả ằ ắ   ti n hành ki m tra c  20 clones b ng cách c t b ng enzyme Bam HI đ  ch c

Hình 4.19. Kết quả biến nạp cấu trúc xâm nhiễm PepYLCV vào E.coli.

Hình 4.20. Điện di sản phẩm cắt các clone bằng BamHI

ắ ằ ẩ ả ố ch n r ng có s n ph m n i trong vector pCAMBIA2300.

ượ ả ẩ ố ỉ Trong 20 clones thu đ c, ch  có 3 clone mang s n ph m n i là dimer

ể ế ồ ủ c a virus g m: clone 5­1, clone 5­5 và clone 5­20. Chúng tôi ti n hành ki m tra

ạ ằ ử ụ ả ứ ặ l i b ng ph n  ng PCR 3 clones này s  d ng c p m i ồ VNP93­A­F1/R1 (m iồ

A).

ể ệ Hình 4.21. Đi n di ki m tra PCR

ế ả ấ ươ K t qu  cho th y có 2 clone 5­1 và clone 5­4 là d ớ ng v i m i ồ  VNP93­

̀ ́ ́ ̀ A­F1/R1 còn clone 5­8 thì không, . Điêu đo cho thây 2 clones 5­1 va 5­5 mang

̀ ử ủ ả dimer phân t DNA­A c a virus PepYLCVNV, con clone 5­20 có 2 kh  năng: là

ử ủ ử ̉ ủ dimer c a phân t ể  DNA­A, cũng có th  là dimer c a phân t DNA­B (cua 1 loài

ử ế ọ virus khac)́ . Chúng tôi ch n 2 clone 5­1 và clone 5­20 g i đ n Macrogen­Korea

ự ằ ị ể ả đ  gi i trình t nh m đ nh danh chính xác loài begomovirus này.

ả ự ộ ủ ẫ Gi i trình t b  gen c a m u VNP1500

ề ế ế ả ầ ằ ậ Sau khi có k t qu  chúng tôi ti n hành biên t p b ng ph n m m Seqman

ể ạ ỏ ữ ự ữ ễ ấ ự (DNAstar 7.1­Lasergen) đ  lo i b  nh ng trình t nhi u x u và nh ng trình t

ả ả ế ớ ể ệ ở ả trùng v i vector. K t qu  gi i trình t ự ượ  đ c th  hi n b ng 4.15.

ế ự ấ 2 dòng plasmid mang c u trúc xâm

B ngả  4.15.  K t qu  gi ả ả ễ i trình t ủ ẫ nhi m c a virus m u VNP1500

Kích th Mã gi i trình M i gi i trình Dòng plasmid ST T ả tự ồ ả tự

pCambia SeqF pCambia SeqR

1 2 3 4 5 6 7 8 163DZAB045 VNP1500­1 (A) 163DZAB046 VNP1500­1 (A) 163DZAB047 VNP1500­1 (A) VNP93­A­F 163DZAB048 VNP1500­1 (A) VNP93­A­R 163DZAB049 VNP1500­1 (A) VNP93­A­F1 163DZAB050 VNP1500­1 (A) VNP93­A­R1 pCambia SeqF 163DZAB051 VNP1500­20  pCambia SeqR 163DZAB052 VNP1500­20 ạ   ướ c đo n ọ ượ   đ c đ c (nucleotide) 572 148 976 920 871 Nhi uễ 722 680

ằ ắ ầ ậ ượ ề Sau khi l p ráp b ng ph n m m Seqman, chúng tôi nh n đ c trình t ự

ử ư phân t DNA­A và DNA­B nh  sau:

>VNP1500­1, 1697 nts

ATCTATTTCTATGATTCGGTTCAAATTAATAAATATTGAATTTTA

TTATATCCGAAAGATGAGCATCAATTGTGCCCTCAAGTACATTGTACA

ATACATGTCTAATTGCCCTAATAACGTTGTTGATACTAATAACTCCTA

AATGGTCTAAATACTTTATACATTGGTATCTAAATACTCTTAAGAAAC

GCGAGGTCTGAGGACGTAAACGAGTCCAGATTTGGCAGATTAGATAG

CATTGGTGTAGTCCCAACGCTTTCCTCAGGTTGTAGTTGAACTGGATCT

GCACTGTGATCATGTCGTGGTTCATCATGAATGGTCTCTCGCGGTGGT

GGGTTATGTTGAAATAGAGGGGATTGTTGACCGTCCAGATATACACGC

CATTCTCTGCCTGAGCTGCAGTGATGCGTTCCCCTGTGCGTGAATCCAT

GGTTGTGGCAACCTAGAGCGACGAAGTACGAACAACCACAAGGGAGA

TCAATTCTTCTCCTTCTATTGGTCTTCTTGGCGATTCGGTGTTGCACCTT

GATTGGTACCTGAGTAGAGTGGGCCTTGGAGGGTGACGAAGATTGCA

TTTTTTAAAGCCCAATGTTTAAGTGCGGTGTTCTTTTCCTCTTCCAAGA

ACTCTTTATAGCTGGAATGTGGTCCTGGATTGCAGAGGAAGATAGTGG

GAATCCCGCCTTTAATTTGAACTGGTTTCCCGTACTTGGTGTTGCTTTG

CCAGTCTCTTTGGGCCCCCATGAACTCTTTAAAGTGCTTTAGATAATGC

GGATCGACGTCATCAATGACGTTATACCAAGCAGCATTATTGAACACT

TTAGGACTTAAGTCTAAATGCCCACATAAGTAGTTATGTGGGCCCAAT

GACCTGGCCCACATTGTCTTCCCTGTACGACTATCGCCCTCTAACACA

ATGCTTATCGGTCTTAATGGCCGCGCAGCGGCACTAACAACGTTTCCG

GCAACCCATTCATCAAGTTCCTCGGGGACTTGGTCAAAAGAAGAAGA

CAAGAAAGGACAAACAAAAACCTCTAAAGGAGGTGCAAAAATCCTAT

CTAAATTACTATGTAAATTATGAAACTGTAAAACAAAATCTTTGGGGG

CCTTCTCCTTTAATATATTGAGGGCCTCTGCTTGACCTGAATTGATTGC

CTCGGCATATGCGTCGTTGGCAGATCGGCAACCTCCTCTAGCTGATCT

GCCATCGATCTGGAAAACTCCATGATCAAGCACGTCTCCGTCTTTCTC

CATGTATGCTTTAACATCTGACGAGCTCTTAGCTCCCTGAATGTTCGG

ATGGAAATGTGCTGACCTGGTTGGGGATCTGAGGTCGAAGAACCTTTG

ATTTTTGCATTGGAATTTACCTTCGAATTGGATGAGGACATGCAAGTG

AGGAGTCCCATCTTCGTGCAATTCCCTGCAAATCCTGATAAACAGTTT

ATTTGTTGGTGTTTCTATGGCTTGAATTTGGGAAAGTGCCTCTTCTTTG

GTGAGAGAGCAGTGTGGGTATGTGAGGAAATAGTTTTTAGCATTTATT

CTGAATTTGCTTGGGGGAGCCATTGACCGGTCAATCGGTGTCTCTCAA

CTTGGGCTATGTAATTGGTGTCTGGGGTCTTATTTATATGGAGACCCTA

AATGGCAATATTGTAATTTCTTAAAGAAATTTAAATTCCAAAAGCGGC

CATCCGTATAATATT

>VNP1500­20, 1396 nts

ACCGGATGGCCGCGATTTTTTTTTTACGTGGTCCCCGCACGCGTTTCTG ACATTTGTGTCCATTCGATCAATCCCACCCATTGAAACTGAACACGTG TTACCATCTTAAGTCAGGGATGTTTCCACGTCTGTTTTCTATATATTGG TCCTATTCATCTCCTCTCTCATTTGTAAATAAAAATGAGAGTTCCAATC CGGAGGAATTCAGGCGTCAATTCTGATCGTCGTCCTTCCAATGGGTCA ATCCACCGGTGGAACTACCCATATTCCAACTATTTTGGGAGGAGGATT GGCAACCGTGTATACGGCATGCCATTCGGAAACCAACAAGTGCAACG ACGTGAGTTTAAGCAAACTCAACGTCTTACCAAGTCTGCTGAGCAGGT TTCATGTAGGAGGAAGTCTATGAAGACGGTTGAGGAAATACACGATG GCACTGACTACTTGCTGTGCAGTAACATGTCTAAGGTGTCGTATATTA GCTACCCGCCTCTATCCGGCACTGAATATGGTAGTAGAGCTGAGTCCT ATATCAAAGTCTTGGGAGTCACTGTATCTGGGTCTGCTGTGCTGAAGC AGACGGGCATGCGTGAAGCAGATGGGTCTCAAGGAATTCATGGGATA TTTACTACAGTACTTGTTCGTGACAAGAGACCATGTCAGTTCTCTGCC GTGGATCCGATCATCCCATTTGCGGAGCTGTTTGGACAAGAGAAGAG AGCATGCTCCTCATTACGTGTTAGAGATTCTTATAAGAATCGATTTAG TGTTGTCTACCAGAAGAAGCATGTAGTAAATAGTGCTCTATCAACACA TGTATTTAGGTATAATTTTAATGTGAAATTCTCTAGATTTCCTTTCTGG GTGTCTTTCAAAGACACCTCCAACGCAGAGCCTACTGGGCGATATTCT AATGTGTCGAAGAACGCATTGGTTGTGTACTATGTTTGGCTATGTGAT TCAAATGTAACAGCCGAAGTGCACGTGCAATATGATTTGAACTACATT GGATAAATAAAATCATATTTTTTTTACATTCGAGGAGACATTACTCCC CTCCATACATAGCTCAACAGTTTTTTTAATAATATTAATTACATCGTCA TTTACTTTGTTGCTACCTGCAACAACTTCCGACGCCGAAGGGCCTGGA TCTAGGGTTCCATCTTGCAGCCGATGTAAATGTCTATATGGGTGCTCCT CTATGTCGTTGTTCTCCACTGTGCTGGCTGAAGCCCAAGTATGCCCCTG TGGAATGGCATTTGTAGTGTATCTGGAAGACTGTGACCTCATGTGTGT TAGGGCTTGTACTGGTTTTCTTGATACAGTTGATTGAGGCACATGCCA GAAATCTATGTGGTTCATGTTATACGCCTTTGATAGTATTTCAATCTTA

ả ả ế ự ư ượ ầ ử ủ K t qu  gi i trình t ch a thu đ ủ c đ y đ  phân t ẫ    DNA­A c a m u

ử ủ ế ẫ ả virus VNP1500. Phân t DNA­A c a m u virus còn thi u kh ng 1000 nts (Hình

ố ớ ướ ả ự ư ẫ A). Đ i v i plasmid VNP1500­20, tr c khi gi i trình t , chúng tôi v n ch a rõ

ủ ệ ặ ộ ượ ự li u đây là DNA­A hay là DNA­B (c a m t loài khác) m c dù đã đ c d  đoán

ầ ạ ự ượ ủ ỉ ồ là DNA­B (ph n ...) .  Đo n trình t virus thu đ c c a plasmid này  ch  g m 2

ạ ừ ủ ị đo n là 722 và 680 nts (tính t ắ ằ  2 phía c a v  trí c t b ng enzyme BamHI).

ạ ự ủ Hình 4.22. Các đo n trình t c a dòng plasmid VNP1500 – 1 (DNA­A)

ượ ắ ằ ầ đ ề c l p ráp b ng ph n m m SeqMan (DNASTAR)

ự ị ự ẵ Xác đ nh danh tính virus d a trên trình t s n có

ế Tìm ki m Blast

ự ượ ủ ạ ồ Các trình t thu đ c, bao g m đo n dài 1697 nts c a plasmid VNP1500­

ủ ạ ượ ử ụ ể ị 1 và đo n dài 1396 nts c a plasmid VNP1500­20, đã đ c s  d ng đ  xác đ nh

ự ế ế ề ầ ế danh tính virus dùng ph n m m tìm ki m tr c tuy n Blast. Tìm ki m này cũng

ủ ấ ả ờ ị ồ đ ng th i xác đ nh b n ch t là DNA­A hay DNA­B c a plasmid VNP1500­20.

ế ế ả ượ ở ả K t qu  tìm ki m đ c trình bày B ng 4.16 .

ủ ự ế ế ế ả ẫ ấ  K t qu  tìm ki m tr c tuy n cho th y DNA­A c a m u virus VNP1500

ứ ồ ấ ớ ủ ấ   ầ g n gũi nh t v i DNA­A c a Pepper leaf curl (Malaysia) virus (m c đ ng nh t

ự trình t là 88 %).

ự ế ế ế ả ạ ấ ự K t qu  tìm ki m tr c tuy n cho th y đo n trình t ủ  virus c a plasmid

ấ ớ ủ ầ VNP1500­20 là DNA­B và g n gũi nh t v i DNA­B c a Tomato yellow leaf

ứ ồ ấ ự ớ curl Kanchanaburi virus v i m c đ ng nh t trình t ả  89% (b ng 4.16).

ứ ấ ồ ủ ể ế Các m c đ ng nh t trình t ự ở trên ậ   khá th pấ   và ch a đ  đ  k t lu n ư

danh tính virus.

ế ả ế ả B ng 4.16. K t qu  tìm ki m virus g n gũi nh t trên Ngân hàng gen

Virus gần gũi nhất trên Ngân hàng gen*

Plasmid giải trình tự

Tên virus (nguồn gốc), loại phân tử của bộ gen

Mã Ngân hàng gen

Phần trăm đoạn so sánh (%)

Mức đồng nhất trình tự (%0

Pepper leaf curl Malaysia virus (Malaysia), DNA-A

AF414287

100

88

Erectites yellow mosaic virus (Việt Nam), DNA-A

DQ641698

97

89

VNP1500-1 (DNA-A)

Pepper leaf curl virus (Thái Lan), DNA-A

AF134484

100

97

KF446664

93

89

Tomato yellow leaf curl Kanchanaburi virus (Thái Lan, isolate E4), DNA-B

VNP1500-20

KF446672

93

89

Tomato yellow leaf curl Kanchanaburi virus (Thái Lan, isolate P4), DNA-B

93

89

KF446670

Tomato yellow leaf curl Kanchanaburi virus (Thái Lan, isolate P3), DNA-B

ự ầ ượ ủ ấ ẫ (Genbank) dùng trình t thu đ c c a m u virus VNP1500

ự ế ề ế ầ ầ ấ

ạ ỉ * Ch  trình bày 3 virus g n gũi nh t dung ph n m m tìm ki m tr c tuy n  BLAST t i NCBI

ự ớ So sánh trình t v i PepYLCVNV

ả ứ ủ ẫ ươ Do DNA­A c a m u virus VNP1500 luôn có ph n  ng PCR d ng tính

ệ ủ ồ ặ ủ ẫ ộ ớ v i m i đ c hi u c a PepYLCVNV. B  gen c a virus này v n ch a đ ư ượ ử   c g i

ế ự ủ trên Ngân hàng gen nên chúng tôi đã ti n hành so sánh trình t ẫ  c a m u virus

ớ ự ủ VNP1500 v i PepYLCVNV (VNP93). Trình t ầ  c a các virus g n gũi trên Ngân

ư ượ ử ụ hàng gen nh : PepLCV, TYLCKaV và ErYV cũng đ c s  d ng trong phân

ế ượ ở ả ả tích. K t qu  so sánh đ c trình bày b ng 4.17.

ế ả ấ ả ử ủ K t qu  so sánh cho th y c  2 phân t ẫ    DNA­A và DNA­B c a m u

ề ấ ồ ự ấ ố ớ ứ VNP1500   đ u   có   m c   đ ng   nh t   trình   t r t   cao   (>90%)   đ i   v i   virus

ủ ẫ ặ ỉ PeYLCVNV (m u VNP93). M c dù danh tính chính xác c a virus ch  có th ể

ượ ị ự ộ ộ ư ứ ấ ồ đ ự c xác đ nh d a trên trình t toàn b  b  gen nh ng m c đ ng nh t cao ở

ấ ẫ trên cho th y m u VNP1500 chính là PepYLCVNV.

ế ả ấ ố ở ỉ K t qu  này cho th y PepLCVNV có phân b  khá r ng ộ , ít nh tấ các t nh

ề ề ướ mi n Trung và mi n nam n c ta.

ả ự ạ ẫ B ng 4.17. So sánh đo n trình t ớ   c c a m u virus VNP1500 v i

Mức đồng nhất trình tự (%)*

Loại phân tử genome

Virus so sánh

VNP1500-1

VNP1500-20

ượ ủ ấ thu đ ầ PepYLCVNV (VNP93) và các g n gũi nh t trên Ngân hàng gen

PepYLCVNV (VNP93, Việt nam, DNA-A)

90.9

PepLCV (AF414287, Malaysia, DNA-A)

87.8

DNA-A

PepLCV (AF134484, Thái Lan, DNA-A)

86.3

EYMV (DQ641698, Việt Nam, DNA-A)

86.9

TYLCKaV (AF511529, Thai Lan, DNA-A)

71.7

PepYLCVNV (VNP93, Việt nam, DNA-B)

92.5

DNA-B

TYLCKaV (AF511528, Thái Lan, DNA-B)

86.6

ỉ ượ ủ ự ạ ẫ ủ thu đ c c a m u VNP1500 (1697 nts c a plasmid

* Ch  tính trên đo n trình t ủ VNP1500­1 và 1396 nts c a plasmid VNP1500­20)

́ ơ ̣ ạ ề ắ ̉ ̉ ̣ ̣ ̣ ́ Kêt qua kiêm tra môt sô loai virus gây hai trên ́ t thu thâp t i mi n B c và

ề ̣ mi n Trung giai đoan 2012­2013

̀ ̀ ́ ể ư ạ ̣ ̣ ̣ ̉ ̀ ̀  cac đia điêm điêu tra giai đo n

̀ ươ Ki m tra virus gây hai thu thâp ngoai đông t ́ ng phap ELISA 2012­2013 băng ph

̀ ́ ̣ ̣ ̣ Nhăm xac đinh nguyên nhân gây bênh do virus gây hai trên ́ ́ ơ t , chung tôi

̀ ́ ̀ ̃ ́ ́ ư ượ ̣ ̣ ̣ ̉ tiên hanh thu thâp mâu bênh co triêu ch ng điên hinh đ c thu thâp t ̀ ́ ̣   ̣ ư  cac đia

̀ ̃ ̀ ̀ ̀ ượ ̉ ̣ ̉ ̉ điêm điêu tra. Mâu bênh thu đ ể ể   c lam khô va bao quan băng silicagel. Đ  ki m

ứ ệ ẫ ượ ế ể ằ tra các m u có tri u ch ng thu đ ả   c, chúng tôi ti n hành ki m tra b ng ph n

̀ ́ ́ ứ ử ự ế ̣ ng ELISA tr c ti p (DAS – ELISA). Nguôn khang huyêt thanh s  dung la ̀

́ ́ khang huyêt thanh Chilli Veinal mottle Virus  (ChiVMV), đây là  potyvirus  phổ

́ ế ệ ́ ư ẫ ̉ ̣ ̣ bi n trên ́ ơ ạ t t i Vi ́ t Nam. Tông sô 28 m u co triêu ch ng virus thu thâp đ ượ   c

́ ̀ ̀ ̀ ̀ ́ ượ ̣ ̉ ̃ trong qua trinh điêu tra ngoai đông ruông đa đ ́ c kiêm tra ELISA, trong đo cac

́ ́ ́ ́ ́ ́ ượ ươ ́ ơ ̣ ̣ ̣ ̃ mâu đ ̀ c kêt luân la d ng tinh khi co tri sô ELISA l n gâp đôi tri sô ELISA

́ ́ ́ ̀ ̉ ượ ̣ ở ̉ ̉ ̉ ̉ cua đôi chung âm (cây khoe). Kêt qua đ c thê hiên bang 4.1, hinh 4.1.1.

ả ả ế ấ K t qu  b ng 4.1 và hình 4.32 và hình 4.33 cho th y:

ả ể ễ ế ẫ ấ ị ế   K t qu  ki m tra cho th y có 12/28 m u b  nhi m ChiVMV (chi m

́ ̀ ́ ́ ơ ề ơ ̉ ̣ 54.55%). Đi u đó, cho thây chung ChiVMV la virus quan trong đôi v i cây ́ ̣   t tai

̣ Viêt Nam.

ả ẫ ơ ượ ́ t thu đ c

ả ể ệ ế ạ B ng 4.18. K t qu  ki m tra ELISA các m u  ạ t Nam giai đo n 2012­2013 i Vi t

STT ChiVMV

Ký hi uệ ể ị Đ a đi m Tri uệ   ch ngứ OD KL

1 VNP96 0.874 + ̃ ố Cu n lá,  kh mả ́ Tuy Loan­ ̀ Đa Năng

2 ̀ ̉ VNP120 Kham ́ Thai Binh 2.717 +

– 3 VNP179 0.156 ̉ ̣ ố Cu n lá, kh mả Cam Lô­̣ Quang Tri

–

4 VNP192 Kham̉ 0.162

Cam  ̀ươ Đ ng­ ̀ Lao Cai

5 VNP217 Kh mả 0.244 + ơ ̀ ̀ Co Noi­ S n La

̉ 6 VNP237 0.146 – Cu n ố lá,kh mả Cô Phuc­́ Yên Baí

7 VNP251 0.923 + Cu n ố lá,kh mả ̀ Chiêng  Sinh­S n ơ La

̉

8 VNP291 1.642 +

Kham  ́ ̀ vang, la  nhỏ ̃ Vinh  ̀ươ T ng­ ́ ̃ Vinh Phuc

̀ 9 VNP300 0.150 – ̣ Xoăn vang  lá ́ ơ Soc S n­ ̀ Ha Nôi

10 ả VNP306 Kh m vàng 0.180 – ́ Yên Thê­́ Băc Giang

11 ả VNP313 Kh m vàng 0.161 –

Châu  ̀ Thanh­An  Giang

̃ ̉ 2.174 12 ả VNP453 Kh m vàng + ̉ Vinh Bao­ Hai Phong̀

0.144 13 VNP535 Kh mả – ̀ Hoa An­ Cao Băng̀

– 14 ả VNP558 Kh m vàng 0.158 ̣ Ch  M i­́ ợ ơ ́ Băc Kan

– 15 VNP626 Kham̉ 0.151 ̃ ́ Tuy Loan­ ̀ Đa Năng

16 ả VNP632 Kh m vàng 0.623 + ̃ ́ Tuy Loan­ ̀ Đa Năng

̣ 17 ả VNP634 Kh m vàng 0.673 + ̉ Điên Ban­̀ Quang Nam

18 ả VNP649 Kh m vàng 1.058 + ̀ ̣ ́ ̀ Phu Cat­ Binh Đinh

19 ̀ VNP683 Kham̉ 2.160 +

Thanh  ̀ Binh­Đông  Thaṕ

20 ̉ VNP706 Kham vang̀ 1.844 +

Châu  ̀ Thanh­An  Giang

21 VNP716 Kham̉ >3 + ́ Yên Thê­́ Băc Giang

– ̉ 22 VNP785 Kham̉ 0.145 ơ ̀ Binh Thuy­ ̀ Cân Th

– ố 23 0.162 Không bi ̣ bênḥ TTBCNĐ­  ĐHNNHN

– 24 0.160 ứ   Đ i ch ng (–)  ứ ố Đ i ch ng  (–) Không bi ̣ bênḥ TTBCNĐ­  ĐHNNHN

ứ – 25 0.172 ố Đ i ch ng  (–) Không bi ̣ bênḥ TTBCNĐ­  ĐHNNHN

ứ   ố Đ i ch ng (+) 26 >3 + TTBCNĐ­  ĐHNNHN Kh m ả vàng, la ́ nhỏ

ứ

ố Đ i ch ng  (+) 27 >3 + TTBCNĐ­  ĐHNNHN Kh m ả vàng, la ́ nhỏ

ứ

ố Đ i ch ng  (+) 28 >3 + TTBCNĐ­  ĐHNNHN Kh m ả vàng, la ́ nhỏ

12 ố ẫ S  m u +

ỷ ệ ẫ T  l m u + 54.55%

ọ

ướ

ậ ộ Ghi chú: OD: M t đ  quang h c đo b

c sóng 405 nm;

̃

ế ậ

ệ

ễ

̣

KL: K t lu n; ( ­) : Cây không nhi m b nh; (+): Cây nhiêm bênh

ị ố

ị ở ế

ộ ệ

ứ

ố

ẩ

2 ×  tr  s  trung bình giá tr

gi ng đ i ch ng âm + đ  l ch chu n=0.178

ệ ế ả Hình 4.22. K t qu  ELISA phát hi n ChiVMV

̀ ́ ể ư ạ ̣ ̣ ̣ ̉ Ki m tra virus gây hai thu thâp ngoai đông t ̀ ̀  cac đia điêm điêu tra giai đo n

̉ ư 2012­2013 băng p̀ ̀ ́ han  ng PCR

ứ ề ệ ế ả ấ ẫ ấ ớ ̉ ể   K t qu  kiêm tra ELISA cho th y, nhi u m u v i tri u ch ng r t đi n

ộ ệ ư ế ả ạ ố ạ hình nh  kh m vàng toàn b  di n tích lá, cu n lá, bi n d ng lá… l i không

ươ ế ẫ ớ ờ d ng v i virus ChiVMV. Chính vì th  chúng tôi nghi ng  các m u trên có th ể

̃ ́ ễ ậ ớ ̣ ̣ nhi m begomovirus. Vì v y, chúng tôi chon môt sô mâu âm v i virus ChiVMV,

̃ ́ ̀ ́ ơ ờ ượ ̣ ̣ ̉ ̉ ̃ cung v i môt sô mâu nghi ng  nhi m ễ begomovirus đa thu thâp đ c đê kiêm tra

PCR.

ấ ả ề ẫ ượ ế ố ằ ổ T t c  các m u đ u đ c chi t DNA t ng s  b ng CTAB và phan  nǵ ̉ ư

́ ̀ ử ụ ̉ ượ ̣ PCR s  d ng căp môi chung BegoA – For1/BegoA – Rev1. Kêt qua đ ̀ c trinh

̀ ̀ ̉ bay trong bang (4.2) va hình 4.1.2.

̃ ̃ ́ ́ ả ể ế ấ ̉ ̣ ̃ K t qu  ki m tra cho th y, trong 12 mâu kiêm tra đa phat hiên thây 8 mâu

̀ ̃ ́ ̉ ư ươ ́ ư ̣ ̉ ̣ ́ phan  ng PCR d ng (+), t c la cây nhiêm bênh, chiêm ty lê 66,67%.

́ ̃ ́ ̀ ̉ ư ươ ́ ơ ̣ ́ Cac mâu co phan  ng d ng v i căp môi chung BegoA – For1/BegoA –

̀ ́ ơ ướ ả ệ ẩ ̣ ̉ Rev1 tao cac băng đ n trên ban gel, trung kích th c s n ph m băng đi n di

́ ứ ẫ ố ố ươ ả ứ ư ̣ mong mu n là ~1.2 kb, m u đ i ch ng d ̉  ng có ph n  ng. Nh  vây, kêt qua

́ ́ ̃ ̣ ự ́ơ ̉ ̣ ̉ kiêm tra đa xac nhân s  co măt cua ̃ ̉ begomovirus trong 12 mâu t kiêm tra.

ả ả ể ế ặ B ng 4. 19. K t qu  ki m tra các m u

́ ẫ ơ ằ ồ   ử ụ t b ng PCR s  d ng c p m i ̀ BegoA – For1 va BegoA – Rev1

̉ ể ị STT M uẫ Đ a đi m ́ Kêt qua PCR Triêụ   ch nǵư

VNP4 FAVRI + 1 ố Cu n lá,  kh mả

̉ Cam Lô –̣ Quang ả VNP179 Kh m vang̀ + 2

Trị

ng̀ươ VNP192 Kh mả – 3 Cam đ ̀ – Lao Cai

̉ VNP234 Kham̉ – 4 Cô Phuc –́ Yên Baí

VNP246 Xoăn lá + 5 ̀ Chiêng Sinh ơ – S n La

̉ VNP300 Kham vang̀ – 6 ̣ ́ ơ Soc S n – ̀ Ha Nôi

VNP306 Kh m ả 7 + ́ Yên Thê –́   Băc Giang

́ VNP456 Sang gân 8 – ̀ ̀ ̣  Quynh Phu ́ – Thai Binh

̀ư VNP459 9 – ̀ ́ Sang gân t cuônǵ ̀ ̣  Quynh Phu ́ – Thai Binh

̀ VNP535 Kham̉ 10 – Hoa An – Cao Băng̀

̉ VNP558 Kham nhăn 11 – ̣ Ch  M i –́ ợ ơ   ́ Băc Kan

̉ 12 – VNP961 ̉ Kham, biên ́ vang̀ ươ ng – An d Hai Phong̀

́ ̃ ́ ̃ ươ ử ̉ Sô mâu d ng/tông sô mâu th 8/12

̉ ̣ Ty lê(%) 66,67

̃ ̃ ́ Ghi chu: (+) Cây nhiêm virus,  (–) Cây không nhiêm virus

ứ ủ ệ ạ Hình 4.23. Tri u ch ng c a Begomovirus gây h i trên ớ ạ t t i Đà Năng̃

ẫ ớ ằ ặ ể Hình 4.24. Ki m tra PCR các m u ặ t b ng c p m i ồ ồ c p m i BegoA –

̀ For1 va BegoA – Rev1

MarkerH2O VNP4VNP179 VNP192VNP234 VNP246VNP300 VNP306VNP456 VNP459VNP538 VNP558VNP9611

(ladder: 1kb)

̃ ́ ́ ́ ̀ ̀ ư ở ̉ ̣ ̣ T  kêt qua trên, chung tôi nhân thây 2 mâu bênh ́ ́ ̉ ư    miên Băc phan  ng

́ ̀ ươ ̣ ̣ PCR d ̀ ̀ ̀ ư ư begomovirus ch a t ng xuât hiên tai miên ng: VNP246 va VNP306. Vi

́ ́ ́ ̀ ́ ̃ ̀ ữ ầ ̉ Băc, do đo chung tôi tiên hanh kiêm tra PCR ́   trên 2 mâu nay thêm 1 l n n a. Kêt

̀ ̀ ̀ ̉ ̉ qua trinh bay bang (4.3) va hình 4.1.3.

ả ả ể ế ử ụ ằ ặ B ng 4. 20. K t qu  ki m tra ồ   ẫ ơ   b ng PCR s  d ng c p m i t́

2 m u  ̀ BegoA – For1 va BegoA – Rev1

̉ ể ị STT M uẫ Đ a đi m Triêụ   ch nǵư ́ Kêt qua PCR

1 VNP246 Xoăn lá – ̀ Chiêng Sinh ơ – S n La

2 VNP306 Kh m ả + ́ Yên Thê –́   Băc Giang

̃ ́ ́ ̃ ươ ử ̉ Sô mâu d ng/tông sô mâu th 1/2

̉ ̣ 50

̃ ́ Ty lê(%) ̃ Ghi chu: (+) Cây nhiêm virus,  (–) Cây không nhiêm virus .

ẫ ớ ể ở ề ắ ằ ặ Hình 4.24. Ki m tra PCR 2 m u ồ    mi n B c b ng c p m i

t thu  ̀ ồ ặ c p m i BegoA – For1 va BegoA – Rev1

MarkerH2OVNP4VNP179 (ladder: 1kb)

Ậ Ế Ề Ị K T LU N VÀ Đ  NGH

ế ậ K t lu n

ụ ễ ấ ồ Đã ph c h i 2 dòng vi khu n ủ   ẩ A. tumerfaciens  mang c u trúc xâm nhi m c a

PepYLCVNV là AT­VNP93­5­4­11 và AT­VNP93­5­8­1.

̀ ̀ ễ ằ ố Đã lây nhi m PepYLCVNV b ng agroinoculation trên các gi ng: ca chua Hông

̀ ́ ̉ ̉ ̣ Lan (T20), ́ ơ t Hiêm Lai F1­207, va cac cây chi thi.

̀ ễ ằ ọ ố Đã lây nhi m PepYLCVNV b ng b  ph n ấ (B. tabaci) trên các gi ng: ca chua

̀ ́ ̀ ́ ́ ̉ ̉ Hông Lan (T20), ca tim GS505, ́ ́ ơ t Hiêm lai F1­207. Kêt qua cho thây giông thí

́ ơ ỷ ệ ứ ệ ệ ề ệ ệ ể ễ ệ nghi m đ u bi u hi n tri u ch ng b nh v i t l 100% nhi m b nh khi lây

ễ ấ ằ ọ nhi m b ng b  ph n.

ủ ự ễ ấ ằ ỹ ậ   Xây d ng thành công c u trúc xâm nhi m c a PepYLCVNV b ng k  thu t

RCA (rolling circle amplification).

ả ự ộ ộ ủ ồ Đã gi i trình t ẫ   ầ  toàn b  b  gen g m 2 thành ph n DNA­A và DNA­B c a m u

́ ̀ ớ ạ ẫ ệ virus gây b nh trên cây t thu t i Đông Thap (m u VNP1500).

́ ́ ̃ ̀ ́ ơ ̉ ̣ ̉ Đa kiêm tra PCR v i căp môi chung đê phat hiên ̃ ̣ begomovirus trên cac mâu ́ơ   t

́ ̀ ́ ́ ́ ̀ ̀ ̣ ̣ ̣ ̉ thu thâp tai miên Băc va miên Nam Viêt Nam. Kêt qua cho thây co 2/12 (16.7%)

̃ ̀ ̀ ́ ơ ̣ ̣ ̃ mâu ́ t   thu   tai   miên   Băc   va   6/12   (50%)   mâu ́ ̃ ̀ ơ t   thu   tai   miên   Trung   nhiêm

begomovirus.

ế ị Ki n ngh

ế ụ ố ư ươ ạ ử ụ ễ

1. Ti p t c t

i  u hóa ph ẩ   ng pháp lây nhi m nhân t o s  d ng vi khu n

ố ớ Agrobacterium   tumerfaciens   (Agroinoculation)   đ i   v i   PepYLCVNV

ằ ượ ệ nh m đánh giá đ ủ c tính gây b nh c a PepYLCVNV.

ử ụ ễ ấ ớ ế ế ể

2. S  d ng c u trúc xâm nhi m   PepYLCVNV m i thi

t k  đ  đánh giá

ệ ủ tính gây b nh c a PepYLCVNV.

ệ ệ ớ ằ ỹ ủ 3. Đánh giá tính gây b nh c a begomovirus gây b nh trên ậ   t b ng k  thu t

Agroinoculation.

́ ủ ệ ̣ ạ 4. Tiêp tuc đánh gia đa d ng c a begomovirus trên ớ ạ t t i Vi t Nam.

̀ ́ ̀ ̀ ̀ ́ ̣ ̉

5. Lân đâu tiên phat hiên virus begomovirus trên

́ ơ ở t miên Băc nên cân kiêm

tra lai.̣

Ệ TÀI LI U THAM KH ẢO

Ệ Ế Ệ TÀI LI U TI NG VI T

ế ườ ệ ệ ọ t C ng (2010), Công ngh  sinh h c trong b nh cây. 1. Hà Vi

ế ườ ự ậ

2. Hà Vi

ạ   t C ng (2012), Virus th c v t, Phytoplasma và Viroid . NXB Đ i

ệ ọ h c Nông nghi p.

ệ ự ệ ạ ẩ Ch n đoán nhanh b nh h i th c v t,

3. Vũ Tri u Mân (2003),

ậ NXB Nông

Nghi p.ệ

ệ ươ ề ủ ệ

4. Vũ Tri u Mân – Lê L

ng T  ch  biên (2001). Giáo trình B nh cây Nông

ệ ệ Nghi p. NXB Nông Nghi p.

ươ ề ệ ẩ ạ ồ B nh vi khu n và virus h i cây tr ng.

5. Lê L

ệ ng T , Vũ Tri u Mân (1999),

NXB Giáo d cụ , Hà N i.ộ

ễ ệ ả ị ủ   ị 6. Nguy n Th  Hà Uyên (2012). Xác đ nh  và đánh giá kh  năng gây b nh c a

ộ ố ằ ươ ễ m t s  begomovirus  trên cây cà chua b ng ph ng pháp lây nhi m nhân

ẩ ạ t o dùng vi khu n Agrobacterium tumerfaciens

̀ ́ ̣ TAI LIÊU TIÊNG ANH.

1. (1990).   "High   efficiency   transformation   of<   i>   Escherichia   coli   with

plasmids." Gene 96(1): 23­28.

2. Briddon (2003). "Cotton leaf curl disease, a multicomponent begomovirus

complex." Molecular Plant Pathology 4(6): 427­434.

3. Doyle (1987). "A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh

leaf tissue." Phytochem bull 19: 11­15.

4. Fauquet   and   Stanley   (2005).   "Revising   the   way   we   conceive   and   name

viruses below the species level: a review of geminivirus taxonomy calls for

new standardized isolate descriptors."  Archives of virology  150(10): 2151­

2179.

5. Fauquet, et al. (2008). "Geminivirus strain demarcation and nomenclature."

Archives of virology 153(4): 783­821.

6. Ferreira,   et   al.   (2008).   "One­step   cloning   approach   for   construction   of

agroinfectious begomovirus clones."  Journal of virological methods  147(2):

351­354.

7. Fujii,  et al.  (2006).  "Error­prone  rolling  circle  amplification: the  simplest

random mutagenesis protocol." Nature protocols 1(5): 2493­2497.

8. Gafni and Yedidya (2003). "Tomato yellow leaf curl virus, the intracellular

dynamics of a plant DNA virus." Molecular plant pathology 4(1): 9­15.

9. Ghanim   and   Czosnek   (2000).   "Tomato   yellow   leaf   curl   geminivirus

(TYLCV­Is)   is   transmitted   among   whiteflies   (Bemisia   tabaci)   in   a   sex­

related manner." Journal of Virology 74(10): 4738­4745.

10.Green   (1991).  Characteristics   and   control   of   viruses   infecting   peppers:   a

literature review, Asian Vegetable Research and Development Center.

11. Green   and   Kim   (1991).  Characteristics   and   control   of   viruses   infecting

peppers:   a   literature   review,   Asian   Vegetable   Research   and   Development

Center.

12.Green,   et   al.   (2001).   "Molecular   characterization   of   begomoviruses

associated with leafcurl diseases of tomato in Bangladesh, Laos, Malaysia,

Myanmar, and Vietnam." Plant Disease 85(12): 1286­1286.

13.Gutierrez,   et   al.   (2004).   "Geminivirus   DNA   replication   and   cell   cycle

interactions." Veterinary microbiology 98(2): 111­119.

14. Ha (2007). "Detection and identification of potyviruses and geminiviruses in

Vietnam."

15.Ha (2008). "Molecular characterization of begomoviruses and DNA satellites

from Vietnam: additional evidence that the New World geminiviruses were

present in the Old World prior to continental separation." Journal of General

Virology 89(1): 312­326.

16.Ha, et al. (2008). "Molecular characterization of begomoviruses and DNA

satellites   from   Vietnam:   additional   evidence   that   the   New   World

geminiviruses were present in the Old World prior to continental separation."

Journal of General Virology 89(1): 312­326.

17. Haible,   D.,   et   al.   (2006).   "Rolling   circle   amplification   revolutionizes

diagnosis and genomics of geminiviruses."  Journal of virological methods

135(1): 9­16.

18. Harrison and Robinson (2005). "Another quarter century of great progress in

understanding the biological properties of plant viruses."  Annals of applied

biology 146(1): 15­37.

19.Hartz, T., et al. (1997). Processing tomato production in California, UCANR

Publications.

20.Hofgen   and   Willmitzer   (1988).   "Storage   of   competent   cells   for

Agrobacterium transformation." Nucleic Acids Research 16(20): 9877­9877.

21. Inoue­Nagata,   et   al.   (2004).   "A   simple   method   for   cloning   the   complete

φ begomovirus   genome   using   the   bacteriophage   29   DNA   polymerase."

Journal of virological methods 116(2): 209­211.

22.Kheyr­Pour, et al. (1991). "Tomato yellow leaf curl virus from sardinia is a

whitefly­transmitted   monoparatite   geminivirus."  Nucleic   Acids   Research

19(24): 6763­6769.

23.Knierim   and   Maiss   (2007).   "Application   of   Phi29   DNA   polymerase   in

identification and full­length clone inoculation of tomato yellow leaf curl

Thailand virus and tobacco leaf curl Thailand virus."  Archives of virology

152(5): 941­954.

24.Moriones   and   Navas­Castillo   (2000).   "Tomato   yellow   leaf   curl   virus,   an

emerging   virus   complex   causing   epidemics   worldwide."  Virus   Research

71(1): 123­134.

25.Murugan and Uthamasamy (2001). "Dispersal behaviour of cotton whitefly

Bemisia tabaci  (Genn.) under  cotton based gardenland agro ecosystem of

Coimbatore,   Tamil   Nadu."  MADRAS   AGRICULTURAL   JOURNAL

88(1/3): 1­6.

26.Navot,   N.,   et   al.   (1991).   "Tomato   yellow   leaf   curl   virus:   a   whitefly­

transmitted geminivirus with a single genomic component." Virology 185(1):

151­161.

27. Padidam,   et   al.   (1999).   "Possible   emergence   of   new   geminiviruses   by

frequent recombination." Virology 265(2): 218­225.

28.Picó, et al. (1996). "Viral diseases causing the greatest economic losses to the

tomato crop. II. The Tomato yellow  leaf  curl virus—A  review."  Scientia

Horticulturae 67(3): 151­196.

29.Picó, B., et al. (1996). "Viral diseases causing the greatest economic losses to

the tomato crop. II. The Tomato yellow leaf curl virus—a review." Scientia

Horticulturae 67(3): 151­196.

30.Rybicki   (1994).   "A   phylogenetic   and   evolutionary   justification   for   three

genera of Geminiviridae." Archives of Virology 139(1­2): 49­77.

31. Sambrook,   et   al.   (1989).   "Extraction   and   purification   of   plasmid   DNA."

Molecular cloning: a laboratory manual 1: 1.21­21.52.

32.Wang, et al. (1993). "A simple method of preparing plant samples for PCR."

Nucleic Acids Res 21(17): 4153­4154.

33.Wang, T. C., et al. (1994). "Mammary hyperplasia and carcinoma in MMTV­

cyclin D1 transgenic mice."

34.Wu, et al. (2008). "A simplified method of constructing infectious clones of

begomovirus employing limited restriction enzyme digestion of products of

rolling circle amplification." Journal of virological methods 147(2): 355­359.

35.Wyant, et al. (2011). "The genomes of four novel begomoviruses and a new

Sida   micrantha   mosaic   virus   strain   from   Bolivian   weeds."  Archives   of

virology 156(2): 347­352.

36.Zhang,   et   al.   (2001).   "Movement   proteins   (BC1   and   BV1)   of   Abutilon

mosaic geminivirus are cotransported in and between cells of sink but not of

source leaves as detected by green fluorescent protein tagging."  Virology

290(2): 249­260.

CÁC TRANG WEB

1. http://www.avrdc.org

2. http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html

3. http://wcrc.confex.com

4. http://www.informaworld.com

5. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/