Khoá luận tốt nghiệp: Tuyển chọn vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp các enzyme phân giải polysaccharide

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đề tài nghiên cứu khoa học này, trƣớc hết tôi xin gửi đến cô - TS nguyễn Nhƣ Ngọc, TS. Trần Thị Thu Lan lời cảm ơn sâu sắc, ngƣời đã giúp đỡ tận tình hƣớng dẫn và theo dõi sát sao tôi trong quá trình hoàn thiện nghiên cứu này.

Tôi cũng xin gửi đến nhà trƣờng, quý thầy, cô giáo trong viện Công nghệ sinh học vàbộ môn Vi sinh - Hóa sinh lời cảm ơn chân thành nhất vì đã tạo cho tôi có cơ hội đƣợc thực hiện đề tài, thể hiện sự sáng tạo của mình tại nơi mà tôi yêu thích, để tôi có cơ hội áp dụng những kiến thức mà các thầy cô giáo đã truyền đạt.

Thông qua quá trình thực hiện để tài, tôi đã học hỏi đƣợc nhiều điều và rút ra cho mình nhiều kinh nghiệm quý báu để giúp ích cho công việc sau này của bản thân. Vì kiến thức bản thân còn hạn chế, trong quá trình thực hiện, hoàn thiện đề tài này không tránh khỏi những sai sót, kính mong nhận đƣợc những ý kiến đóng góp từ các thầy, cô.

Sinh viên thực hiện

Lê Thị Huệ

i

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................ i

MỤC LỤC ............................................................................................................. ii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ..................................................................... iv

DANH MỤC BẢNG ............................................................................................. v

DANH MỤC HÌNH ............................................................................................. vi

ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... 1

CHƢƠNG I.TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ........................................ 3

1.1.Tổng quan về polysacharide ............................................................................ 3

1.1.1. Cấu trúc polysaccharide .............................................................................. 3

1.1.2. Ứng dụng của polysaccharide ..................................................................... 6

1.1.3. Các enzyme phân giải polysaccharide ........................................................ 7

1.1.4. Vi sinh vật phân giải polysaccharide ........................................................ 12

CHƢƠNG II: MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................................................................................. 15

2.1. Mục tiêu ........................................................................................................ 15

2.2. Nội dung nghiên cứu. ................................................................................... 15

2.3. Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu. .......................................................... 15

2.3.1. Vật liệu ...................................................................................................... 15

2.3.2. Hóa chất ..................................................................................................... 15

2.3.3. Thiết bị, dụng cụ........................................................................................ 16

2.3.4. Môi trƣờng sử dụng trong nghiên cứu ...................................................... 17

2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................. 17

2.4.1. Phƣơng pháp thu nhận mẫu ....................................................................... 17

2.4.2. Phân lập vi khuẩn thuần khiết ................................................................... 18

2.4.3. Tuyển chọn các chủng có khả năng phân giải polysaccharide mạnh. ...... 18

2.4.4. Phƣơng pháp xác định đặc tính sinh hóa của chủng tuyển chọn. ............. 25

CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 29

3.1. Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải polysaccharide ............................................................................................................................. 29

3.2: Tuyển chọn các chủng có khả năng phân giải polysaccharide mạnh. ......... 30 ii

3.2.1. Tuyển chọn dựa vào định tính ................................................................... 30

3.2.2. Tuyển chọn dựa vào xác định hàm lƣợng đƣờng khử bằng phƣơng pháp DNS ..................................................................................................................... 35

3.2.3.Tuyển chọn các chủng có hoạt độ của enzyme cellulase, amylase, pectinase. ............................................................................................................. 39

3.3. Một số đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của hai chủng vi khuẩn TA và CM .... 39

3.3.1. Đặc điểm hình thái của khuẩn lạc ............................................................ 39

3.3.2. Kết quả nhuộm gram ................................................................................. 40

3.4. Xác định đặc tính sinh hóa .......................................................................... 41

3.4.1. Khả năng lên men các loại đƣờng ............................................................. 41

3.4.2 . Kết quả phản ứng MR và phản ứng VP ................................................... 43

3.4.3. Phản ứng catalase, khử nitrate, citrate, thử nghiệm tính di động. ............. 43

CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................... 47

4.1. Kết luận ........................................................................................................ 47

4.2.Kiến nghị ....................................................................................................... 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

iii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

TT Chữ viết tắt Ký hiệu

1 Vi sinh vật VSV

2 Microlit µl

3 Lỗ thạch LT

4 Optical density - mật độ quang OD

5 Môi trƣờng cơ bản MTCB

6 Môi trƣờng tối ƣu MTTƢ

7 Môi trƣờng nuôi cấy MTNC

8 35 – dinitrosalicylic DNS

9 Cellobiohydrolase CBH

10 Micromet µm

11 Dalton DA

12 Vòng /phút v/p

13 Môi trƣờng thích hợp MTTH

14 Cellobiohydrolase CBH

15 Endo glucannase EG

16 Carboxyl methylcellulose CMC

17 B – glucanase BG

18 Phản ứng p/ứ

19 Aspergillus niger A.nige

20 Kilodalton KDa

21 Isoelectrics point Ip

22 Microlit µl

iv

DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Một số chất sử dụng trong nghiên cứu ............................................... 15 Bảng 2.2: Một số thuốc thử sử dụng trong nghiên cứu ....................................... 16 Bảng 2.3: Các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm ................................................ 16 Bảng 2.4: Danh sách môi trƣờng sử dụng và thành phần ................................... 17 Bảng 2.5: Trị số OD540 nm đo đƣợc ở các nồng độ đƣờng glucose khác nhau khi phản ứng với thuốc thử DNS .............................................................................. 21 Bảng 2.6: Trị số OD575 nm đo đƣợc ở các nồng độ đƣờng monogalacturonan khác nhau khi phản ứng với thuốc thử DNS ....................................................... 24 Bảng 3.1: Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn phân lập ........................ 29 Bảng 3.2. Đƣờng kính vòng phân giảicellulose của các chủng vi khuẩn ........... 31 Bảng 3.3: Đƣờng kính vòng phân giải tinh bột của các chủng vi khuẩn ........... 32 Bảng 3.4: Đƣờng kính vòng phân giải pectin của các chủng vi khuẩn............... 34 Bảng 3.5: Kết quảxác định khả năng phân giải CMC của các chủng vi khuẩn .. 36 Bảng 3.6: Kết quả xác định khả năng phân giải tinh bột của các chủng vi khuẩn ............................................................................................................................. 37 Bảng 3.7: Kết quả xác định khả năng phân giải pectin của các chủng VSV ...... 38 Bảng 3.8: Kết quả tuyển chọn các chủng có hoạt độ của enzyme cellulase, amylase, pectinase. .............................................................................................. 39 Bảng 3.9: Đặc điểm hình thái khuẩn lạccủa hai chủng vi khuẩn CM và TA ..... 40 Bảng 3.10: Kết quả nhuộm gram các chủng vi khuẩn ........................................ 40 Bảng 3.11: Tổng kết các đặc tính sinh hóa của chủng TA và CM ..................... 41 Bảng 3.12: Phản ứng sinh hóa của vi khuẩn Bacillus subtilis. ........................... 46

v

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cấu trúc amylose ................................................................................... 4 Hình 1.2: Hạt tinh bột trong lục lạp amylose ........................................................ 5 Hình 1.3: Cấu trúc amylopectin ............................................................................ 5 Hình 1.4: Cấu trúc cellulose .................................................................................. 6 Hình 1.5: Cấu trúc pectin ...................................................................................... 6 Hình 1.6: Sơ đồ hoạt động của các enzyme them gia thủy phân hoàn toàn cellulose. Mũi tên chỉ vị trí phân cắt của mỗi enzyme. ......................................... 8 Hình 1.7: Quá trình thủy phân tinh bột của enzyme amylase ............................ 10 Hình 1.8: Cơ chế tác động của pectinase vào phân tử pectin ............................. 11 Hình 2.1. Đồ thị đƣờng chuẩn glucose ................................................................ 21 Hình 2.2: Đồ thị đƣờng chuẩn glacturonic .......................................................... 24 Hình 3.1. Hình ảnh khuẩn lạc sau 1 ngày nuôi cấy của một số chủng phân lập đƣợc ..................................................................................................................... 30 Hình3.2: Hình ảnh vòng phân giải CMC của các chủng C1; C8; TA; H2, CM, L4 ......................................................................................................................... 31 Hình 3.4: Hình ảnh vòng phân giải pectin của các chủng có hoạt tính: H2, C8, CM, L4, TA. ........................................................................................................ 34 Hình 3.5: Hình ảnh thử enzyme cellulase với thuốc thử DNS............................ 36 Hình 3.6: Hình ảnh thử enzyme amylase với thuốc thử DNS ............................ 37 Hình 3.7: Hình ảnh thử enzyme pectinase với thuốc thử DNS ........................... 38 Hình 3.8: Khả năng phân giải các loại đƣờng của chủng CM ............................ 41 Hình 3.9:Khả năng phân giải các loại đƣờng của chủng TA .............................. 42 Hình 3.10:Kết quả phản ứng MR và phản ứng VP ............................................. 43 Hình 3.11: Kết quả phản ứng hoạt hóa catalase .................................................. 43 Hình 3.12: kết quả phản ứng khử nitrate ............................................................. 44 Hình 3.13: Kết quả phản ứng citrate ................................................................... 44 Hình 3.14: Kết quả thử nghiệm tính di động ...................................................... 45

vi

ĐẶT VẤN ĐỀ

Carbohydrate là nhóm phân tử sinh học có mặt nhiều nhất trên trái đất,chiếm khoảng 80-90 % khối lƣợng khô ở thực vật và là chất dồi dào nhất trong các hợp chất hữu cơ tự nhiên, đặc biệt là cellulose, tinh bột và pectin… Hàng năm thực vật và tảo có khả năng biến - đổi hơn 100 tỷtấn CO2 và H2Othành glucose và sản phẩm hữu cơ khác nhƣ đƣờng và tinh bột là thức ăn chủ yếu của con ngƣời.

Các hợp chất cacbonhydrate có ý nghĩa lớn đối với đời sống con ngƣời, tuy nhiên, với lƣợng sinh khối khổng lồ tạo ra hàng năm hiện nay trên trái đất chƣa thực sự đƣợc tận dụng một cách có hiệu quả để sản xuất ra các sản phẩm có giá trị cao hơn mà chủ yếu là quá trình phân hủy diễn ra dƣới sự tác động của hệ enzyme trong các vi sinh vật tồn tại trong tự nhiên. Vai trò của hệ enzyme phân hủy polysaccharide tự nhiên chủ yếu là góp phần vào việc khép kín chu trình cacbon trên trái đất. Hệ enzyme phân giải các hợp chất này là: cellulase, amylase, pectinase từ hệ VSV phong phú và đa dạng bao gồm cả vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm. Trong đó, vi khuẩn có vai trò đáng chú ý nhất trong quá trình phân giảicác hợp chất các bon do hệ enzyme từ vi khuẩn thƣờng có hoạt tính mạnh và phong phú.

Để tận dụng khối lƣợng lớn nguồn nguyên liệu từ sinh khối, các nhà khoa học đã nghiên cứu để sản xuất và tối ƣu hóa quá trình chuyển hóa các hợp chất polysaccharide. Một trong những hƣớng chuyển hóa các hợp chất này hiệu quả và thân thiện với môi trƣờng nhất đó là con đƣờng sinh học đƣợc thực hiện bởi hệ enzyme từ vi sinh vật.

Tuy nhiên, hiện nay hệ enzyme tham gia vào quá trình phân giải các hợp chất polysaccharide hiệu quả nhƣ: cellulase, amylase, pectinase đƣợc sử dụng trong các ngành công nghiệp ở Việt Nam chủ yếu đƣợc nhập khẩu từ nƣớc ngoài với giá thành cao.

Ngoài ra, với điều kiện Việt Nam là một nƣớc nông nghiệp nên nguồn nguyên liệu dùng để sản xuất enzyme là rất phong phú, vì thế việc nghiên cứu cải thiện và nâng cao hiệu suất quá trình sản xuất ra các enzyme từ VSV phân lập từ bản địa hiện nay đang là một đòi hỏi cấp thiết. Việc tuyển chọn các VSV có khả năng sinh tổng hợp ra hệ enzyme phân giải polysaccharide, đặc biệt là cellulsae, pectinase, amylase sẽ giúp tận dụng các nguồn gen quý hiếm có sẵn từ 1

tự nhiên mà còn góp phần bảo tồn nguồn gen, cải tạo các chủng VSV công nghiệp sử dụng.

Xuất phát từ thực tế đó, tôi tiến hành đề tài: “Tuyển chọn vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp các enzyme phân giải polysaccharide” với mong muốn tìm đƣợc một số chủng vi khuẩn có năng lực sinh hệ enzyme phân giải polysaccharide cao nhằm nâng cao hiệu quả của quá trình khai thác và sử dụng nguồn nguyên liệu này.

2

CHƢƠNG I

TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1.Tổng quan về polysacharide

Cacbonhydrate là hợp chất cấu tạo nên hầu hết các vật chất hữu cơ trong tự nhiên. Là hợp chất không những có vai trò quan trọng trong đời sống, nhƣ: cung cấp và dự trữ năng lƣợng,tạo cấu trúc, bảo vệ… mà còn đóng góp không nhỏ vào các ngành công nghiệp thực phẩm, công nghiệp đồ uống và các sản phẩm lên men…[19].

Các hợp chất cacbonhydrate rất đa dạng và phong phú, tùy vào cấu tạo đƣợc chia thành các loại: polysaccharide (chứa hơn 10 đơn phân tử, nhƣ: amylose, cellulose, pectin, agar, chitin…), oligosaccharide (chứa từ 2 đến 10 đơn phân, nhƣ: saccharose, maltose, rafinose…) và monosaccharide (là đơn phân tử, nhƣ: glucose, fructose, galactose, xylose…).

Hiện nay, lƣợng cacbonhydrate trên trái đất ngày càng lớn do sinh khối thực vật và phế phụ phẩm của các ngành nông nghiệp, lâm nghiệp…trong đó chiếm phần lớn là polysaccharide [20].

1.1.1. Cấu trúc polysaccharide

Polysaccharide đƣợc tạo thành từ các monosaccharide (> 10) liên kết với nhau bằng liên kết glucoside, còn rất ít nhóm – OH glucoside, không còn tính khử.Các monosaccharide trong polysaccharide có thể thuộc một hay nhiều loại khác nhau. Trong một số trƣờng hợp các gốc monosaccharide có chứa các nhóm khác nhau: acid sun furic, acid photphoric, acid axetic,... Các liên kết gluxit trong phân tử polysaccharide có thể là: anpha- gluxit hay beta- gluxit [11].

nhất (có và ít 2

Polysacchride còn gọi là glycan, tùy thành phần monose có trong polysaccharide ngƣời ta chia chúng ra làm: homopolysaccharide (chỉ chứa một loạimonosaccharide) loại heteropolysaccharide monosaccharide).

Tùy vào kích thƣớc và đặc điểm cấu trúc của phân tử chúng có thể tạo

dung dịch keo hoặc tan hoàn toàn trong nƣớc.

Polysaccharide đóng vai trò quan trọng trong đời sống động vật, thực vật. Ở thực vật, polysaccharide chiếm 80-90% trọng lƣợng khô, tham gia vào thành phần các mô nâng đỡ, ví dụ cellulose, hay tích trữ dƣới dạng thực phẩm dự trữ với lƣợng lớn, ví dụ tinh bột. [15].

3

Sự phân bố phổ biến và thƣờng gặp nhất của polysacchridetrong cuộc

sống chủ yếu là cellulose, tinh bột, pectin. 1.1.1.1. Tinh bột

Là polysaccharide dự trữ của thực vật, do quang hợp tạo thành. Trong củ và hạt có từ 40- 70% tinh bột, các thành phần khác của cây xanh có ít hơn và chiếm khoảng từ 4 đến 20%.

Tinh bột không hòa tan trong nƣớc, đun nóng thì hạt tinh bột phồng lên

rất nhanh tạo thành dung dịch keo gọi là hồ tinh bột.

Tinh bột có cấu tạo gồm hai phần: amylose và amylosepectin, ngoài ra còn có khoảng 2% phospho dƣới dạng ester. Tỷ lệ amylosepectin/amylose ở các đối tƣợng khác nhau là không giống nhau, tỷ lệ này ở gạo nếp là lớn hơn gạo tẻ [12].

*Amylose Chiếm đến 15-20% lƣợng tinh bột, do nhiều gốc α D- glucose liên kết với nhau thông qua C1-C4 tạo thành mạch thẳng không phân nhánh. Trong không gian nó cuộn lại thành hình xoắn ốc và đƣợc giữ bền vững nhờ các liên kết hydro. Theo một số liệu trong amylase còn có chứa các α D- glucopyranose dạng thuyền [19].

Hình 1.1: Cấu trúc amylose

Amylose bắt màu xanh với iodine, màu này mấy đi khi đun nóng, hiện màu trở lại khi nguội. Một đặc trƣng hóa lý khác cần chú ý là nó bị kết tủa bởi rƣợu butylic.

4

Hình 1.2: Hạt tinh bột trong lục lạp amylose

*Amylopectin

Cấu tạo do các phân tử α D- glucose liên kết với nhau, nhƣng có phân

nhánh. Chỗ phân nhánh là liên kết C1-C6 glucosidic [23].

Hình 1.3: Cấu trúc amylopectin

1.1.1.2. Cellulose

Đƣợc cấu tạo bởi những phân tử β D- glucose liên kết với nhau bằng liên

kết 1-4 glucosidic.

Chúng là thành phần chủ yếu của vách tế bào thực vật. Đối với ngƣời thì cellulose không có giá trị dinh dƣỡng vì cellulose không bị thủy phân trong ống tiêu hóa. Một số nghiên cứu cho thấy nó có vai trò trong điều hòa tiêu hóa. Động vật ăn có thủy phân đƣợc cellulose nhờ enzyme cellulase [20].

Cellulose không tan trong nƣớc, tan trong dung dịch Schweitzer. Khi đun

nóng với H2SO4, cellulose sẽ bị thủy phân thành các phân tử β D- glucose.

Cellulose có ở dạng hình sợi dài, nhiều sợi kết hợp song song với nhau thành chùm nhờ các liên kết hydro, mỗi chùm (micelle) chứa khoảng 60 phân tử cellulose. Giữa các chùm có những khoảng trống, khi hóa gỗ khoảng trống này chứa đầy lignin và tà xem lớp lignin này nhƣ một lớp cement. Lignin là chất trùng hợp của coniferylic alcohol [28].

5

Hình 1.4: Cấu trúc cellulose

Các gốc –OH của cellulose có thể tạo ester với acid ví dụ: tạo nitro

cellulose với HNO3, tạo acetyl cellulose với CH3COOH.

1.1.1.3. Pectin

Là loại polysaccharide có nhiều trong quả, củ và thân cây, thành phần chính là galacturonic acid có nhóm –COOH bị methyl hóa. Ngƣời ta sử dụng rộng rãi pectin trong sản xuất keo [24].

Hình 1.5: Cấu trúc pectin

1.1.2. Ứng dụng của polysaccharide

Chúng đƣợc sử dụng rộng rãi trong thực phẩm, ở các dạng tự nhiênvà biến tính nhƣ các chất tạo độ đặc hay tạo gel, chất làm bền nhũ tƣơng và các hệ phân tán. Ngoài ra chúng còn đƣợc dùng làm chất tạo màng, bảo vệ bề mặt các loại thực phẩm nhạy cảm khỏi những biến đổi không mong muốn, thành phần thêm vào trong các thực phẩm ăn kiêng... [8].

Sản phẩm của quá trình phân giải polysaccharide bằng enzyme không chỉ đƣợc ứng dụng trong y học mà còn đƣợc ứng dụng trong nhiều lĩnh vực công 6

nghiệp khác nhau (sản xuất cồn, sản xuất bia, chế biến thực phẩm gia súc…), trong nông nghiệp, trong hóa học… Do vậy, việc sử dụng enzyme phân giải polysaccharide có vai trò quan trọng trong đời sống hiện nay [8].

1.1.3. Các enzyme phân giải polysaccharide

Enzyme thủy phân polysaccharide đƣợc tìm thấy ở nhiều loại vi sinh vật, bao gồm vi khuẩn và nấm. Trong tự nhiên, sinh khối polysaccharide đƣợc phân hủy hoàn toàn bởi hỗn hợp các enzyme thủy phân từ vi sinh vật trong khu hệ đặc trƣng nhƣ ở ruột mối, dạ cỏ bò và một số môi trƣờng khắc nghiệt. Những khu hệ này có thể ƣa khí hoặc kỵ khí, chỉ bao gồm vi khuẩn hoặc chỉ bao gồm nấm hoặc có cả nấm và vi khuẩn [28].

Polysaccharide gồm ba thành phần phổ biến rộng trong tự nhiên: cellulose, tinh bột, pectin tƣơng ứng với ba nhóm enzyme phân giải riêng biệt là nhóm các enzyme cellulase, amylase, pectinase.

Hiện nay, việc sản xuất chế phẩm enzyme các loại đã và đang phát triển mạnh mẽ trên quy mô công nghiệp. Thực tế đã có hàng nghìn chế phẩm enzyme bán trên thị trƣờng thế giới, các chế phẩm này đã đƣợc khai thác và tinh chế có mức độ tinh khiết theo tiêu chuẩn công nghiệp và ứng dụng. Chế phẩm enzyme không chỉ đƣợc ứng dụng trong y học mà còn đƣợc ứng dụng trong nhiều lãnh vực công nghiệp khác nhau (sản xuất cồn, sản xuất bia, chế biến thực phẩm gia súc...), trong nông nghiệp, trong hóa học… "ý nghĩa của việc sử dụng enzyme trong các lãnh vực thực tế không kém so với ý nghĩa của việc sử dụng năng lƣợng nguyên tử". Theo thời gian, enzym công nghiệp ngày càng đƣợc ứng dụng vào nhiều lĩnh vực khác nhau, trong đó những enzym ứng dụng nhiều nhất là protease, cellulose, ligase, amylase,…và một số enzym đặc biệt khác đã thu đƣợc rất nhiều lợi nhuận từ ngành này [20]. 1.1.3.1. Cellulase

Là enzyme thuộc lớp glycosyl hydrolase (GHF), thủy phân các hợp chất polysaccharide và oligosaccharide đƣợc tìm thấy trong tự nhiên ( cellulose, tinh bột, chitin, xylan,..). Cellulase đƣợc chia thành ba nhóm lớn là exoglucanase hay cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91), endoglucanase (EC 3.2.1.4) và β-glucosidase (EC 3.2.1.21). Exoglucanase di chuyển dọc theo sợi cellulose và cắt cellulose thành cellobiose. Trong khi đó, endoglucanase thủy phân ngẫu nhiên liên kết β- 1,4- glucoside bên trong sợi cllulose còn β- glucosidasecó khả năng thủy phân cellobiose thành glucose cũng nhƣ cắt glucose ra khỏi cellooligosaccharide.

7

Những enzyme này hỗ trợ nhau trong quá trình thủy phân cellulose bằng cách tạo ra những vị trí tiếp cận cho nhau, loại bỏ vật cản và hạn chế ảnh hƣởng của các chất ức chế[28].

Hình 1.6: Sơ đồ hoạt động của các enzyme them gia thủy phân hoàn toàn

cellulose. Mũi tên chỉ vị trí phân cắt của mỗi enzyme.

Cellulase có cấu trúc gồm hai phần: vùng xúc tác (Catalytic domain _ CD) và một hoặc nhiều vùng liên kết với carbohydrate (Carbohydrate binding modules_CBMs) nối với nhau bởi đoạn peptide ngắn. Vùng CBM có nhiệm vụ neo bám vùng xúc tác với cơ chất, từ đó làm tăng hiệu quả thủy phân cho enzyme. Chúng có thể nằm ở đầu N hoặc đầu C của vùng CD [112]. CBM từ các enzyme khác nhau và nguồi sinh vật khác nhau đƣợc phân chia thành các họ dựa trên độ tƣơng đồng về trình tự amino acid và cấu trúc không gian ba chiều . Ở nấm hiếu khí, CBM luôn thuộc họ 1 với kích thƣớc nhỏ (khoảng 30 - 35 amino acid). Trong khi đó, CBM của cellulase vi khuẩn có kích thƣớc lớn khoảng 100 đến 150 amino acid, thƣờng thuộc họ 2 hoặc 3 [43]. Vùng xúc tác của cellulase có thể có hoạt tính endoglucanase hoặc exoglucanase(riêng β- glucosidae không có thành phần CBM [112]. Tùy thuộc hoạt tính xúc tác mà domain này có cấu hình lõi khác nhau. Trung tâm hoạt động của endoglucanase có dạng rãnh . Do đó, một chuỗi cellulose có thể đi vào trung tâm xúc tác ở vị trí ngẫu nhiên và các liên kết sẽ bị cắt dọc theo chuỗi cellulose. Ngƣợc lại, vùng hoạt động của exoglucanase cấu trúc theo dạng “đƣờng hầm”, tạo bởi một vòng dài các phân tử protein cuộn xung quanh vị trí xúc tác [19]. Kết quả là, cơ chấtchỉ có thể đƣợc đƣa vào từ một đầu của trung tâm xúc tác, sự thủy phân liên kết diễn ra bên trong “đƣờng hầm” và giải phóng sản phẩm cellobiose từ đầu còn lại.

8

Các cellulase đƣợc ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp nhƣ: công nghệ thực phẩm, công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc, công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ, sản xuất chất tẩy rửa, công nghiệp giấy và bột giấy, đặc biệt trong công nghệ xử lý rác thải sản xuất phân bón vi sinh.

1.1.3.2. Amylase

Là một hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật. Các enzyme này thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử trong nhóm polysaccharide với sự tham gia của nƣớc:

R.R’ + H-OH => RH + R’OH

Cơ chất tác dụng của amylase là tinh bột và glycogen. Amylase đƣợc chia thành hai nhóm:endoamylase (enzyme nội bào) và exoamylase (enzyme ngoại bào).Thủy phân tinh bột -> dextrin + một ít maltoza.Dextrin có khả năng họat hóa cao đặc trƣng cho tính chất của enzyme này.Phân tử có 1 - 6 nguyên tử C, tham gia vào sự hình thành ổn định cấu trúc bậc 3 của enzyme -> tính bền nhiệt của enzyme, α - amylase của sinh vật có những đặc tính rất đặc trƣng về cơ chế tác động, chuyển hóa tinh bột, khả năng chịu nhiệt.Thể hiện họat tính trong vùng axit yếu: Nấm mốc: pH=4,5 - 4,9, vi khuẩn: pH=5,9 - 6,1. pH<3 vô hoạt trừ enzyme của Asp.Niger pH=2,5-2,8.α - amylase của nấm mốc có khả năng dextrin hóa cao tạo ra một lƣợng lớn glucoza và maltoza. Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α - amylase từ các nguồn khác nhau cũng không đồng nhất. Trong dung dịch đệm pH = 4,7; α - amylase của Asp. Oryzae rất nhạy với tác động của nhiệt độ cao, thậm chí ở 400C trong 3 giờ hoạt lực dextrin hóa của nó chỉ còn 22 - 29%, hoạt lực đƣờng hóa còn 27 -85%. Ở 500C trong 2 giờ, α - amylase của nấm sợi này bị vô hoạt hoàn toàn [24].

9

Hình 1.7: Quá trình thủy phân tinh bột của enzyme amylase

Cơ chế tác dụng:Quá trình thủy phân tinh bột bởi (-amylase là quá trình đa giai đoạn): Giai đoạn dextrin hóa và giai đoạn đƣờng hóa. Giai đoạn dextrin hóa: Chỉ một số phân tử cơ chất bị thủy phân tạo thành một lƣợng lớn dextrin phân tử thấp ((-dextrin), độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh (các amylose và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh). Giai đoạn đƣờng hóa:Các dextrin phân tử thấp vừa đƣợc tạo thành bị thủy phân tiếp tục tạo các tetra-trimaltose không cho màu với iodine. Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi (-amylase cho tới disaccharide và monosaccharide. Dƣới tác dụng của (-amylase, amylose bị phân giải khá nhanh thành oligosaccharide gồm 6-7 gốc glucose. Sau đó các polyglucose này lại bị phân cắt tiếp tục nên các mạch polyglucose cứ ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose và maltose. Qua một thời gian tác dụng dài, sản phẩm thủy phân củaα- amylase chứa 13% glucose và 87% mantose.Tác dụng của α- amylase lên amylopectin cũng xay ra tƣơng tự, nhƣng vì α- amylase không phân cắt đƣợc liên kết α- 1,6 glucoside ở chỗ mạch nhánh trong phân tử amylopectin nên dù có chịu tác dụng lâu thì trong sản phẩm cuối cùng ngoài các đƣờng nói trên (72% maltose, 19% glucose) còn có dexstrin phân tử thấp và isomaltose(8%) .

Ứng dụng:Hiện nay, việc sản xuất chế phẩm enzyme các loại đã và đang phát triển mạnh mẽ trên quy mô công nghiệp. Thực tế đã có hàng nghìn chế phẩm enzyme bán trên thị trƣờng thế giới, các chế phẩm này đã đƣợc khai thác và tinh chế có mức độ tinh khiết theo tiêu chuẩn công nghiệp và ứng dụng. Chế phẩm enzyme không chỉ đƣợc ứng dụng trong y học mà còn đƣợc ứng dụng trong nhiều lãnh vực công nghiệp khác nhau (sản xuất cồn, sản xuất bia, chế

10

biến thực phẩm gia súc,...), trong nông nghiệp, trong hóa học…"ý nghĩa của việc sử dụng enzyme trong các lãnh vực thực tế không kém so với ý nghĩa của việc sử dụng năng lƣợng nguyên tử". Theo thời gian, enzym công nghiệp ngày càng đƣợc ứng dụng vào nhiều lĩnh vực khác nhau, trong đó những enzym ứng dụng nhiều nhất là protease, cellulose, ligase, amylase,…và một số enzym đặc biệt khác đã thu đƣợc rất nhiều lợi nhuận từ ngành này [22].

1.1.3.3. Pectinase

Enzym pectinase là enzyme xúc tác sự phân hủy các polymer pectin.Sản phẩm tạo thành: acid galacturonic, galactose, arabinose, metanol... Dựa vào đặc điểm của cơ chất và cơ chế phân cắt, enzym pectinase đƣợc chia thành 3 nhóm chính: Pectin methylesterase (PME), thủy phân liên kết α-1,4 glycoside trong các hợp chất pectin, pectin transeliminase, những enzyme thủy phân hoặc phân hủy liên kết α-1,4 glycoside trong các oligo-D-galacturonate [19].

Hình 1.8: Cơ chế tác động của pectinase vào phân tử pectin

Cơ chế hoạt động của enzym pectinase[23][50]: Nhóm 1: Pectin methylesterase (PME) (EC.3.1.1.11): Enzyme này xúc tác phản ứng thủy phân góc ester trong phân tử pectin tạo ra nhóm axit cacboxylic tự do và pectin trở nên tích điện âm, làm giảm mức độ ester hóa của cơ chất và giải phóng ra methanol. Chế phẩm PME thƣờng đƣợc ứng dụng trong sản xuất pectin để tạo ra sản phẩm với những mức độ ester hóa khác nhau. Ngoài ra, enzyme này còn đƣợc sử dụng để tách pectin ra khỏi nƣớc trái cây nhằm làm tăng độ trong cho sản phẩm. Nhóm 2: Thủy phân liên kết α-1,4 glycoside trong các hợp chất

11

trí đầu không khử của phân

pectin: Polygalacturonase (PG) gồm có ba enzyme: Endo PG (EC.3.2.1.15): thủy phân liên kết α-1,4 glycoside tại những vị trí ở giữa mạch của phân tử acid pectic hay pectinic, nhóm này có có tác động làm giảm rỏ rệt về độ nhớt. Exo PG (EC.3.2.1.67): thủy phân liên kết α-1,4 glycoside từ đầu không khử của phân tử acid petic hay acid petinic và tạo ra sản phẩm là D-galacturonate. Exo PG (EC.3.2.1.82): thủy phân liên kết α-1,4 glycoside từ đầu không khử của phân tử acid petic hay acid petinic và tạo ra sản phẩm là digalacturonate. Hai nhóm exo không làm giảm đáng kể độ nhớt. Polymethylgalacturonase (PGM) gồm hai enzyme: Endo PGM: thủy phân liên kết α-1,4 glycoside tại những vị trí ở giữa mạch phân tử pectin. Exo PGM: thủy phân liên kết α-1,4 glycoside từ đầu không khử của phân tử pectin và tạo ra sản phẩm là galacturonate. Nhóm 3: Pectin transeliminase: Những enzyme này xúc tác phản ứng phân giải liên kết α-1,4 glycoside trong các hợp chất pectin nhƣng không có sự tham gia của phân tử nƣớc. Tƣơng tự các nhóm enzyme thủy phân liên kết α-1,4glycoside trong các hợp chất pectin, các enzyme pectin transeliminase cũng đƣợc chia thành hai nhóm sau đây: Polygalacturonatelyase (PGL) gồm hai enzyme: Endo PGL (EC.4.2.2.2): xúc tác trên cơ chất là acid pectic hay acid pectinic, liên kết bị phân hủy nằm ở những vị trí giữa mạch của phân tử cơ chất. Exo PGL (EC.4.2.2.2): xúc tác trên cơ chất là acid pectic hay acid pectinic, liên kết bị phân hủy nằm ở vị tử cơ chất. Polymethylgalacturonatelyase (PMGL) gồm các enzyme: Endo PGML (EC.4.2.2.10): xúc tác trên cơ chất là pectin, liên kết bị phân hủy nằm ở vị trí giữa mạch của phân tử cơ chất. Exo PMGL: xúc tác trên cơ chất là pectin, liên kết bị phân hủy nằm ở vị trí đầu không khử của phân tử cơ chất. Nhóm 4: Những enzyme thủy phân hoặc phân hủy liên kết α-1,4 glycoside trong các oligo-D-galacturonate [50].

Ứng dụng pectinase: Trong lĩnh vực ứng dụng, pectinase đƣợc chia làm 2 nhóm chính là : pectinase acid và peatinase kiềm. Pectinase acid chủ yếu thu nhận từ nấm mốc, đƣợc dùng trong ly trích và chế biến các loại trái cây, rƣợu và tạo ra các sản phẩm đơn bào. Pectinase kiềm đƣợc ly trích chủ yếu từ vi khuẩn đƣợc dùng trong chế biến các loài cây có sợi, trong công nghiệp giấy, xử lí nƣớc thải, lên men trà, cà phê [45].

1.1.4. Vi sinh vật phân giải polysaccharide

12

Đã có nhiều nghiên cứu đƣợc tiến hành để phân lập dòng vi sinh vật sản

sinh enzyme phân giải polysaccharide và khả năng phân giải polysaccharide của

chúng. Các vi sinh vật phân giải polysaccharide chủ yếu đƣợc phân lập từ hệ

tiêu hóa động vật ăn cỏ nhƣ bò, cừu, dê [16] và côn trùng nhƣ bọ cánh cứng,

mối [17,18]. Ngoài ra chúng còn đƣợc tìm ra trong phân ủ, phân hữu cơ, đất,

bùn từ nƣớc thải [13].Từ đó phân lập đƣợc vi sinh vật phân giải nhƣ: nấm mốc,

nấm men, vi khuẩn, xạ khuẩn,nấm đốm, nấm mục,...Nhƣng phổ biến nhất và

đƣợc ứng dụng nhiều, hiệu quả trong đời sống là: nấm mốc, vi khuẩn và xạ

khuẩn.

1.4.1.1. Nấm mốc

Nấm là sinh vật có cơ chế sinh hóa độc đáo trong phân giải cơ chất tạo

những sản phẩm bậc hai đặc biệt, đây là nhóm đƣợc nghiên cứu nhiều nhất trong

lĩnh vực phân hủy polysaccharide[30]. Các polysacchride từ nấm thƣờng có hoạt

lực cao và dƣờng nhƣ không có các dạng vật lý phức tạp nhƣ enzyme này từ vi

khuẩn.

Nấm mốc khá phổ biến trong trong tự nhiên và có hiệu lực sản sinh

enzyme phân giải polysacchride bao gồm: Acremonium spp., Chaetomium spp.,

Phanerochaete chrysosporium, Fusarium solani, Talaromyces emersonii,

Trichoderma koningii, Fusarium oxysporium, Aspergillus niger, Aspergillus

terreus and Rhizopus oryzae có vai trò quan trọng trong quy trình phân hủy

polysaccharide ở nhiều môi trƣờng khác nhau [7,30].

1.4.1.2. Vi khuẩn

Vi khuẩn là những vi sinh vật đơn bào không có nhân điển hình, có đầy

đủ đặc điểm của một vi sinh vật nhƣ khả năng tự tổng hợp chất dinh dƣỡng để

sinh trƣởng và nhân lên. Trong tự nhiên vi khuẩn đƣợc sử dụng phân hủy xác

hữu cơ trong (động vật, thực vật) thành chất vô cơ. Và đƣợc nghiên cứu nhiều

trong lĩnh vực phân hủy polysaccharide nhƣ: Clostridium, Bacteroides

sucinogenes, Butyrivibrio fibrisolvens, Ruminococcus albus,

Methanobrevibacter ruminatium, Siphonobacter aquaeclarae,

Cellulosimicrobium funkei, Paracoccus sulfuroxidans, Ochrobactrum cytisi,

13

Ochorobactrum Haematophilum, Kaistia adipata, Desvosia riboflavia, Labrys

neptuniae,Ensifer adhaerens, Shinella zoogloeoides, Citrobacter freundii, and

Pseudomonas nitroreducens. Các loài này phần lớn thuộc nhóm vi sinh vật kị

khí, chúng đƣợc phân lập chủ yếu từ ruột của những loài động vật sử dụng gỗ

làm nguồn thức ăn [17,19,20].

Trong lòng đất ngƣời ta cũng phân lập đƣợc các dòng vi khuẩn Gram (+)

hiếu khí nhƣ Brevibacllus, Paenibacillus, Bacillus, và Geobacillus . Đối với các

dòng ƣa ấm, pH và nhiệt độ tối thích cho enzyme carbonmethyl cellulase của chúng hoạt động là 5,5 và 550C, còn đối với các dòng ƣa nhiệt là pH 5,0 và nhiệt độ 750C [21]. 1.4.1.3. Xạ khuẩn

Xạ khuẩn thuộc nhóm Procaryotes, có cấu tạo nhân đơn giản giống nhƣ vi

khuẩn. Tuy vậy, đa số tế bào xạ khuẩn lại có cấu tạo dạng sợi, phân nhánh phức

tạp và có nhiều màu sắc giống nhƣ nấm mốc. Chúng chiếm ƣu thế trong đất

phèn khô [23].Xạ khuẩn còn đƣợc biết đến nhiều bởi các sản phẩm chuyển hóa

bậc hai, nổi bật là các loại kháng sinh nhƣ streptomycin, gentamicin, rifamycin

và erythomycin.Ngoài ra, xạ khuẩn còn có vai trò quan trọng trong công nghiệp

dƣợc phẩm cũng nhƣ trong nông nghiệp.Chúng tham gia vào các quá trình phân

giải polysaccharide trong đất nhƣ xenluloza, tinh bột v.v.... góp phần khép kín

vòng tuần hoàn vật chất trong tự nhiên nhƣ:

Streptomyces là giống chủ đạo trong xạ khuẩn, đây cũng là vi sinh vật sản

sinh cellulase đƣợc quan tâm nghiên cứu. Một số loài đáng chú ý thuộc giống

này nhƣ Streptomyces reticuli, Streptomyces drozdowiczii, Streptomyces lividans

[24,25,26].

Thermoactimnomyces đƣợc tìm thấy trong trầm tích đại dƣơng,

Streptosporangium trong quặng apatit cũng là những loài có khả năng phân hủy

cellulose [27, 28, 29].

14

CHƢƠNG II: MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Mục tiêu

Phân lập, tuyển chọn đƣợc vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp các

enzyme phân giải polysaccharide mạnh.

Xác định đƣợc một số đặc điểm sinh lí, sinh hóa của các chủng vi khuẩn

đƣợc tuyển chọn.

2.2. Nội dung nghiên cứu.

Phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme phân giải

polysaccharide.

Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme phân

giải polysaccharide mạnh.

Xác định các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của chủng tuyển chọn.

2.3. Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu.

Mẫu đất từ núi luốt Trƣờng Đại Học Lâm Nghiệp Một số chủng vi khuẩn từ phòng thí nghiệm Công nghệ vi sinh hóa sinh –

2.3.1. Vật liệu Viện Công nghệ sinh học Lâm Nghiệp.

2.3.2. Hóa chất

Bảng 2.1: Một số chất sử dụng trong nghiên cứu

STT Tên hóa chất Công thức hóa học Nơi sản xuất

Trung Quốc 1 3,5- Dinitrosalicylic acid (DNS) C7H4N2O7

Việt Nam Agar 2

Carboxymethyl cellulose Trung Quốc 3 (-CH2-COOH)n

Trung Quốc Lugol 4 I3K

Trung Quốc 5 Ethanol 96% C2H5OH

NaCl Trung Quốc Natri clorua 6

Trung Quốc Yeast extract 7

Trung Quốc Pepton 8

15

Bảng 2.2: Một số thuốc thử sử dụng trong nghiên cứu

STT Thành phần Tên thuốc thử

1 DNS Khối lƣợng 10.6 g 19.8 g 1416 ml 306 g

7.6 ml Axit salicilic ( A XII 3 , 5 –C7H4N2O7) NaOH Nƣớc cất KNaC4H4O6.4H2O C6H5OH nóng chảy ở 50°C

2

3

4

Thuốc thử phản ứng MR Thuốc thử phản ứng VP Thuốc thử phản ứng Nitrat Na2S2O5 Đỏ Methyl Ethanol 95% Nƣớc cất 5% α naphtol) KOH 40% α- napthylamine sulfanilic acid loãng 10% Zn 8.3 g 0.1 g 300 ml 200 ml 0.1 g

2.3.3. Thiết bị, dụng cụ

Các thiết bị đƣợc sử dụng trong nghiên cứu là các máy móc, trang thiết bị

có ở phòng nghiệm của Bộ Môn Công nghệ Vi sinh – Hóa Sinh ,Viện Công

nghệ sinh học , Trƣờng Đại học Lâm Nghiệp.

Bảng 2.3: Các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm

Tên thiết bị Xuất xứ Tên thiết bị Xuất xứ

Trung quốc Cân phân tích Anh

Đức Trung quốc

Nồi hấp thanh trùng Tủ sấy Tử ấm Box cấy vi khuẩn Mỹ Đức Máy ly tâm lạnh Hàn quốc Máy lắc Đức Máy voxted Máy khuấy từ Máy đo pH Kính hiển vi Máy UV-VIS Tủ lạnh Lò vi sóng Đức Nhật Đức Hàn Quốc Nhật Mỹ

Dụng cụ:

Ống nghiệm, bình tam giác, bình scod, đĩa petri

Cốc đong, ống đong, ống fancol, ống effendorf,pipet malt, đầu côn, pipet

thủy tinh.

16

Que cấy ria, que cấy chấm điểm, que chang mẫu thủy tinh.

2.3.4. Môi trường sử dụng trong nghiên cứu

Bảng 2.4: Danh sách môi trường sử dụng và thành phần

STT Môi trƣờng Thành phần Mục đích sửu dụng

1 Môi trƣờng LB pH= 7 Môi trƣờng phân lập

2 Khối lƣợng (g/l) 10 5 5 20 1 5 10 0.018

Kiểm tra khả năng lên men đƣờng Môi trƣờng lên men các loại đƣờng pH=7,4 10

7

5 Pepton Cao nấm men NaCl Agar Cao thịt NaCl Pepton Phenol Red Đƣờng (mannitose, glucose, sucrose, saccarose, maltose, xylose, lactose) Pepton Glucose 3

5

4

Môi trƣờng MR- VP Broth pH= 6,8-7,0 Môi trƣờng nitrate broth pH= 7,2-7,4 Kiểm tra khả năng sinh nitratase

1 1 1,5 1

1

5 Môi trƣờng Citrate Xác định khả năng sử dụng citrat

KH2PO4 Pepton KNO3 Agar Ammonium dihydrogen phosphate Dipotassium hydrogen phosphate NaCl 5g Sodium citrate MgSO4 Bromothymol blue Agar

6 Xác định khả năng di động Môi trƣờng kiểm tra tính di động Agar Pepton Cao nấm men NaCl 5 2 0,2 0,08 15 5 10 5 5

2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.4.1. Phương pháp thu nhận mẫu

17

Phƣơng pháp lấy mẫu(đối với mẫu đất): dùng muỗng gạt nhẹ, bỏ phần đất

ở trên và tàn dƣ thực vật, lấy đất ở phần dƣới đến độ sâu 15-20 cm.

Lấy khoảng 100 g/mẫu cho vào túi nilông sạch. Ghi nhãn cho mẫu(tên

mẫu, thời gian, địa điểm lấy mẫu, tên ngƣời lấy mẫu…).

2.4.2. Phân lập vi khuẩn thuần khiết

Nguyên tắc: Tách rời các tế bào vi khuẩn; Nuôi cấy các tế bào trên trong

môi trƣờng dinh dƣỡng đặc trƣng để cho khuẩn lạc riêng rẽ, cách biệt nhau.

Quá trình phân lập vikhuẩn ở dạng thuần khiết: Với hầu hết các loại mẫu

nghiên cứu, quá trình phân lập vi khuẩn ở dạng thuần khiết gồm các bƣớc cơ

bản:

Tạo ra các khuẩn lạc riêng rẽ từ quần thểvi khuẩn ban đầu

Để phân lập đƣợc các chủng có khả năng sinh tổng hợp các enzyme phân

giải polysaccharide (tinh bột, cellulose, pectin) đề tài tiến hành phân lập trên

môi trƣờng có chứa các cơ chất tƣơng ứng: tinh bột 1%; CMC 0,5% và pectin

1% theo phƣơng pháp cấy chấm điểm trên đĩa thạch.

2.4.3. Tuyển chọn các chủng có khả năng phân giải polysaccharide mạnh.

2.4.3.1. Tuyển chọn dựa vào định tính hoạt tính enzym ngoại bào

Để tuyển chọn các chủng có khả năng sinh enzym phân giải

polysaccharide mạnh, đề tài tiến hành nuôi cấy các chủng trong môi trƣờng lỏng

có chứa cơ chất tƣơng ứng, ở điều kiện nhiệt độ và thời gian thích hợp.

Dịch canh trƣờng nuôi cấy đƣợc ly tâm để loại sinh khối và thu dịch

enzym thô. Xác định năng lực phân giải cơ chất của dịch enzym thô thu đƣợc

thông qua phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch đục lỗ. Các chủng đƣợc tuyển

chọn dựa vào đƣờng kính vòng phân giải cơ chất thể hiện trên đĩa thạch sau khi

nhuộm thuốc thử tƣơng ứng.

 Cellulase

Nguyên tắc: Enzyme cellulase phân giải CMC trong môi trƣờng, khi

nhuộm bằng Lugol, vòng hoạt tính sẽ chuyển từ màu của xanh tím sang không

màu, phần môi trƣờng còn lại còn CMC nên tác dụng với iot trong lugol và giữ

màu tím của phản ứng .

18

Tiến hành: Cấy các chủng vi khuẩn thuần khiết vào môi trƣờng LB lỏng

bổ sung 0,5% CMC, nuôi lắc ở 170 vòng/phút, nhiệt độ 37°C trong vòng 72 giờ.

Ly tâm dịch nuôi cấy, thu dịch nổi chứa các enzyme cellulase thô.

Đổ 70ml môi trƣờng chứa 0,5% CMC và 1,5% Agar vào các đĩa petri, tạo

lỗ thạch đƣờng kính 8mm.

Bổ sung100 µl dịch sau ly tâm tra vào các lỗ thạch. Giữ mẫu trong tủ lạnh

4°C trong vòng 2 giờ cho enzyme khuếch tán vào môi trƣờng.Sau đó ủ mẫu ở

37°C trong 24 giờ. Sau 24 giờ nhuộm mẫu với thuốc thử Lugol 1 % trong vòng

15 phút sau đó rửa sạch với dung dịch NaCl 1M .

Quan sát và đo đƣờng kính các vòng phân giải. Vòng CMC bị phân giải là

vùng không màu, bao quanh lỗ thạch.

 Amylase

Nguyên tắc: Enzyme amylase phân giải tinh bột trong môi trƣờng, khi

nhuộm bằng Lugol, vòng hoạt tính sẽ chuyển từ màu của xanh tím sang không

màu, phần môi trƣờng còn lại còn tinh bột nên tác dụng với iot trong lugol và

giữ màu tím của phản ứng.

Tiến hành: Cấy các chủng vi khuẩn thuần khiết vào môi trƣờng LB lỏng

bổ sung 1% tinh bột, nuôi lắc ở 170 vòng/phút, nhiệt độ 37°C trong vòng 72 giờ.

Ly tâm dịch nuôi cấy, thu dịch nổi chứa các enzyme amylase thô.

Đổ 70ml môi trƣờng chứa 1% tinh bột và 1,5% Agar vào các đĩa petri, tạo

lỗ thạch đƣờng kính 8mm.

Bổ sung100 µl dịch sau ly tâm tra vào các lỗ thạch.Giữ mẫu trong tủ lạnh

4°C trong vòng 2 giờ cho enzyme khuếch tán vào môi trƣờng. Sau đó ủ mẫu ở

37°C trong 24 giờ. Sau 24 giờ nhuộm mẫu với thuốc thử Lugol 1 % trong vòng

15 phút sau đó rửa sạch với dung dịch NaCl 1M .

Quan sát và đo đƣờng kính các vòng phân giải. Vòng tinh bột bị phân giải

là vùng không màu, bao quanh lỗ thạch.

 Pectinase

Nguyên tắc: Enzyme pectinase phân giải pectin trong môi trƣờng, khi nhuộm bằng Lugol, vòng hoạt tính sẽ chuyển từ màu của xanh tím sang không 19

màu, phần môi trƣờng còn lại còn pectin nên tác dụng với iot trong lugol và giữ màu tím của phản ứng .

Tiến hành: Cấy các chủng vi sinh vật thuần khiết vào môi trƣờng LB lỏng bổ sung 1% pectin, nuôi lắc ở 170 vòng/phút, nhiệt độ 37°C trong vòng 72 giờ. Ly tâm dịch nuôi cấy, thu dịch nổi chứa các enzyme pectinase thô.

Đổ 70ml môi trƣờng chứa 1% pectin và 1,5% agar vào các đĩa petri, tạo lỗ

thạch đƣờng kính 8mm.

Quan sát và đo đƣờng kính các vòng phân giải. Vòng pectin bị phân giải

Bổ sung100 µl dịch sau ly tâm tra vào các lỗ thạch. Giữ mẫu trong tủ lạnh 4°C trong vòng 2 giờ cho enzyme khuếch tán vào môi trƣờng.Sau đó ủ mẫu ở 37°C trong 24 giờ. Sau 24 giờ nhuộm mẫu với thuốc thử Lugol 1 % trong vòng 15 phút sau đó rửa sạch với dung dịch NaCl 1M . là vùng không màu, bao quanh lỗ thạch. 2.4.3.2. Tuyển chọn dựa vào xác định hoạt độ enzyme ngoại bào.

Đối với các enzym phân giải polysaccharide, việc xác định hoạt độ đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp của Miller G.L (1959) dựa vào phản ứng của đƣờng khử sinh ra sau phản ứng enzym – cơ chất với dung dịch DNS [22].

 Cellulase

Nguyên tắc: Phƣơng pháp dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đƣờng khử với thuốc thử axit dinitrosalicylic (DNS). Cƣờng độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đƣờng khử trong phạm vi nhất định. Dựa theo đồ thị đƣờng chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử DNS sẽ tính đƣợc hàm lƣợng đƣờng khử của mẫu nghiên cứu.

Dựng đường chuẩn glucose Pha dãy glucose chuẩn từ 0,2 – 1mg trong 1ml. Cho 1ml dung dịch

glucose chuẩn vào một ống nghiệm, thêm 3ml thuốc thử DNS. Đun sôi 5 phút.

Làm lạnh đến nhiệt độ phòng. Đo mật độ quang ở bƣớc sóng 540nm với đối

chứng là nƣớc, vẽ đƣờng chuẩn glucose với trục tung là mật độ quang, trục

hoành là nồng độ glucose.

20

Bảng 2.5: Trị số OD540 nm đo được ở các nồng độ đường glucose khác nhau khi phản ứng với thuốc thử DNS

1.8

1.628

1.6

1.411

y = 1.658x + 0.042 R² = 0.9858

1.4

m n 0 4 5 D O

1.109

1.2

1

0.721

0.8

0.6

0.315

0.4

0.2

0

0

0.2

0.4

0.6

1

1.2

0.8 Hàm lƣợng Glucose (mg/ml)

Nồng độ glucose (mg/l) 0.2 0.4 0.6 0.8 1 Trị số OD540(nm) 0.315 0.721 1.109 1.411 1.628

Hình 2.1. Đồ thị đường chuẩn glucose

Từ đồ thị trên, tính đƣợc nồng độ đƣờng khử trong mẫu từ giá trị mật độ quang

theo phƣơng trình sau: Phƣơng trình y= 0.148x – 0.003 (R2= 0.993)

Với y: Trị số đo OD ở bƣớc sóng 540nm

x: Nồng độ đƣờng khử có trong mẫu (mg/ml)

Xác định hoạt tính enzyme cellulase ngoại bào của các chủng vi khuẩn đã phân

lập:

Nuôi lắc vi khuẩn trong môi trƣờng LB lỏng có chứa 0,5% CMC ở 37°C

trong vòng 72 giờ. Hút từ 1ml dịch nuôi cấy đem ly tâm 6000v/p trong vòng 15

phút để loại bỏ sinh khối vi khuẩn, thu dịch enzyme thô.

Ủ0,5 ml enzyme thô; 0,5 ml 0,05 M đệm citratephosphate (pH 7,0) và 1,0

ml 0,2 % CMC (SigmaAldrich) trong 0,05 M đệm citrate-phosphate (pH 7,0), ở

21

nhiệt độ 370C trong 15 phút. Dừng phản ứng bằng cách bổ sung 1,5 ml thuốc

thử DNS. Đun sôi trong vòng 5 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng.

Đo mật độ quang OD ở bƣớc sóng 540nm với mẫu đối chứng có thành

phần nhƣ mẫu thí nghiệm nhƣng đã vô hoạt enzyme trƣớc khi tham gia phản

ứng cơ chất (bằng nhiệt độ). So sánh màu của mẫu so với đồ thị đƣờng chuẩn

của glucose tinh khiết với thuốc thử DNS từ đó tính ra đƣợc lƣợng đƣờng khử

đƣợc sinh ra của mẫu nghiên cứu.

Hoạt độ enzyme cellulose đƣợc xác định bằng công thức: C(U/ml)

Hoạt tính C=

Trong đó: X: Số mg glucose tính đƣợc từ đƣờng chuẩn

L: độ pha loãng mẫu enzyme

V: thể tích phản ứng (ml)

t: thời gian thủy phân

v: lƣợng enzyme phản ứng (ml)

 Amylase

Nguyên tắc: Phƣơng pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa

đƣờng khử với thuốc thử acid dinitrosalicylic (DNS). Cừơng độ màu của hỗn

hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đƣờng khử trong một phạm vi nhất định.

So màu tiến hành ở bƣớc sóng540nm. Dựa theo đồ thị đƣờng chuẩn của glucose

tinh khiết với thuốc thử DNS sẽ tính đƣợc hàm lƣợng đƣờng khử của mẫu

nghiên cứu. Enzymeamylase khi cho phản ứng với cơ chất tinh bột sẽ phân cắt

tinh bột thành các phân tử nhỏ hơn và một lƣợng đƣờng khử nhất định.Xác định

hàm lƣợng đƣờng khử có trong mẫu sau phản ứng enzyme so với đối chứng để

hoạt độenzyme.

Hoạt độ enzyme amylase đƣợc xác định bằng công thức: HĐE(U/ml)

HĐE=(C2 – C1) x n/ 0,18

HĐE: Là hoạt độ enzyme (là lƣợng enzyme cần thiết để giải phóng ra 1 µmol cơ đƣờng khử (glucoz) ở 37 0C trong 1ml dịch lên men trong 30 phút. (U/ml)

C2: Nồng độ đƣờng khử trong mẫu phân tích (mg/ml)

22

C1 : Nồng độ đƣờng khử trong mẫu đối chứng (mg/ml)

n : Hệ số pha loãng ( nếu có)

0,18: Khối lƣợng của 1 µmol glucoz (mg)

Xác định hoạt tính enzyme amylase ngoại bào của các chủng vi khuẩn đã

phân lập: Nuôi lắc vi sinh vật trong môi trƣờngLB lỏng có chứa 1% tinh bột ở

37°C trong vòng 72 giờ. Hút từ 1ml dịch nuôi cấy đem ly tâm 6000v/p trong

vòng 15 phút để loại bỏ sinh khối vi sinh vật, thu dịch enzyme thô.

Ủ 1ml dịch enzyme với 1ml cơ chất tinh bột 0,2% và 1ml NaCl 0,1% trong vòng 30 phút ở nhiệt độ 370C. Cho 2 ml dịch ủ thu đƣợc vào ống nghiệm,

thêm 1ml thuốc thử DNS. Đun sôi trong vòng 5 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ

phòng.

Đo mật độ quang OD ở bƣớc sóng 540nm với mẫu đối chứng có thành

phần nhƣ mẫu thí nghiệm nhƣng đã vô hoạt enzyme trƣớc khi tham gia phản

ứng cơ chất (bằng nhiệt độ). So sánh màu của mẫu so với đồ thị đƣờng chuẩn

của glucose tinh khiết với thuốc thử DNS từ đó tính ra đƣợc lƣợng đƣờng khử

đƣợc sinh ra của mẫu nghiên cứu.

 Pectinase

Định lượng đường khử bằng DNS

Nguyên tắc: Phƣơng pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa

đƣờng khử với thuốc thử acid dinitro salisilic. Cƣờng độ màu của phản ứng tỉ lệ

thuận với nồng độ đƣờng khử trong một phạm vi nhất định. Biết đƣợc mật độ

quang của dịch đƣờng khử nghiên cứu, dựa vào đồ thị chuẩn monogalacturonan

suy ra hàm lƣợng đƣờng khử của dịch nghiên cứu.

Cách tiến hành: Lập đƣờng chuẩn:pha các mẫu đƣờng monogalacturonan

có nồng độ xác định rồi cho 200 µl dịch phản ứng với 1ml thuốc thử DNS trong

thời gian 10 phút. Kết quả đƣợc đem đo mật độ quang ở bƣớc sóng 575nm . Từ

đó lập ra đƣợc đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa hàm lƣợng đƣờng

monogalacturonan trong mẫu với một độ quang OD.

23

Bảng 2.6: Trị số OD575 nm đo được ở các nồng độ đường monogalacturonan khác nhau khi phản ứng với thuốc thử DNS

Nồng độ monogalacturonan Trị số OD575 (nm) (mg/l)

0.9

0.854

0.8

0.78

y = 0.9198x - 0.069 R² = 0.9905

0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 0,08 0,096 0,197 0,257 0,39 0,458 0,587 0,67 0,78 0,854

m n 5 7 5

0.7

0.67

D O

0.6

0.587

0.5

0.458

0.4

0.39

0.3

0.257

0.2

0.197

0.1

0.096

0

0.08 0.2

0

0.4

0.6

0.8

1

1.2

Nồng độ Galacturonic (mg/ml)

Hình 2.2: Đồ thị đường chuẩn glacturonic

Từ đồ thị trên, có thể tính đƣợc nồng độ đƣờng khử trong mẫu từ giá trị mật độ quang theo phƣơng trình sau:

y = 0,919x – 0,069 (R² = 0,990) Trong đó: x: Hàm lƣợng đƣờng có trong mẫu ( mg/ml) y : Giá trịmật độ quang (OD)

Từ đồ thị trên, có thể tính đƣợc nồng độ đƣờng khử trong mẫu từ giá trị mật độ quang theo phƣơng trình sau:

Xác định hoạt độ Pectinase:Hoạt độ Pectinase đƣợc xác định với cơ chất pectin. Phản ứng enzyme đƣợc thực hiện với 180µm dung dịch pectin 1% (w/v) 24

và 20µl dung dịch enzyme (đƣợc pha loãng tới nồng độ thích hợp), ở 50°C trong 10 phút. Dừng phản ứng bằng 1 ml dung dịch DNS và đun sôi trong 10 phút. Tiếp đến, li tâm hỗn hợp dịch phản ứng ở 10.000 vòng/phút trong 1 phút (cho loại cặn nếu có). Đo độ hấp thụ ở bƣớc sóng 575 nm. Dựa vào đồ thị đƣờng chuẩn acid galacturonic với thuốc thử DNS để xác định hoạt độ enzyme. Một đơn vị hoạt độpectinase là lƣợng enzyme cần thiết để xúc tác chuyển hóa pectin tạo thành 1 µmol acid galacturonic trong thời gian 1 phút ở những điều kiện hoạt động thích hợp của enzyme (Motwani và cộng sự,2013; Khatri và cộng sự, 2015). Hoạt độ pectinase đƣợc xác định bằng công thức :

H= (U/ml)

Trong đó: X: hàm lƣợng đƣờng khử sau thủy phân (mg/ml)

f: hệ số pha loãng

1000 hệ số quy đổi

196: khối lƣợng phân tử pectin

t: thời gian thủy phân (10 phút)

2.4.4. Phương pháp xác định đặc tính sinh hóa của chủng tuyển chọn.

Nghiên cứu định tên chủng vi sinh vật theo các khóa phân loại của

Waksman, 1961; Krasilnikov, 1970; Gause, 1983; khóa phân loại vi sinh vật của

Bergey, 1989[23].

Để quan sát đặc điểm hình thái vi sinh vật, các chủng vi khuẩn đƣợc nuôi

trên môi trƣờng LB ở 32°C trong 7 ngày, làm tiêu bản quan sát vi khuẩn trên

kính hiển vi.

2.4.4.1.Phương pháp nhuộm gram

- Pha loãng dịch vikhuẩn nuôi lỏng theo dãy pha loãng

- Nhỏ giọt dịch pha loãng lên lam kính

- Hơ qua ngọn lửa đèn cồn, nhỏ 1 giọt dung dịch tím kết tinh trong 1

phút, rửa mẫu lại bằng nƣớc cất

- Nhuộm tiếp bằng dung dịch lugol trong 1 phút, rửa lại bằng nƣớc cất

25

- Tẩy cồn trong 30 giây

- Tiếp tục rửa lại bằng nƣớc cất

- Nhuộm bổ sung fuchisin trong 30 - 60 giây

- Rửa bằng nƣớc cất, hơ trên ngọn lửa đèn cồn và quan sát đặc điểm hình

thái vi sinh vật dƣới kính hiển vi

- Mô tả và chụp hình đặc điểm tế bào của chủng vi khuẩn

Kết quả quan sát mẫu vật dưới kính hiển vi

Gram dƣơng: xanh đen hay tím

Gram âm: đỏ vàng hay đỏ tía

2.4.4.2. Phản ứng catalase

Nguyên tắc: Phát hiện enzyme catalase chuyển hóa năng lƣợng theo

phƣơng thức hô hấp với oxy là chất nhận điện tử cuối cùng ở các vi khuẩn hiếu

khí và kỵ khí tùy ý.

Lấy một ít vi khuẩn vào que cấy và nhúng vào giọt H2O2.

Phản ứng (+): có bọt khí xuất hiện

Phản ứng (-): không có bọt khí xuất hiện

2.4.4.3. Kiểm tra khả năng lên men đường.

Mục đích: Thử nghiệm khả năng sử dụng các nguồn carbonhydrate củavi

khuẩn.

Nguyên tắc: Vi khuẩn sử dụng carbonhydratde=> tạo acid=> giảm pH môi

trƣờng.

Các loại carbonhydrat: Saccarose, Glucose, Lactose, Maltose, Mannitose,

Sucrose, Xylose.

Môi trường: Phenolred broth base bổ sung 0,5-1% đƣờngcần thử nghiệm

VSV sử dụng đƣợc nguồnđƣờng trong môi trƣờng sẽlàm giảm pH =>

thay đổimàu chất chỉ thị phenolred.

Phản ứng (+): môi trƣờngchuyển vàng

Phản ứng (-): môi trƣờng cómàu đỏ

26

2.4.4.4. Phản ứng Citrate

Nguyên tắc: Xác định khả năng vi khuẩn sửdụng nguồn citrat nhƣ là

nguồn cacbon duynhất. Sản phẩm chuyển hóa làm kiềm hóa môi trƣờng và thay

đổi màu của chỉ thị màu.

- Cấy vi khuẩn vào môi trƣờng Citrat simmons, ủ ở 370C trong 24h

- Phản ứng dƣơng tính: màu xanh nƣớc biển

- Phản ứng âm tính : môi trƣờng không đổi màu

2.4.4.5.Phản ứng MR (Methyl red)

Mục đích : xác định vi khuẩn sản xuất và duy trì các acid bền trong quá

trình lên men glucose.

Cơ sở sinh hóa:

Chất chỉ thị pH: methyl red

MR (+) – càng kéo dài thời gian nuôi cấy – môi trƣờng càng acid

MR (-) – càng kéo dài thời gian nuôi cấy – các chất cótính acid bị chuyển hóa – môi trƣờng dần trung tính.

Thời gian ủ 2 – 5 ngày ở 370C

Cấy vi khuẩn vào môi trƣờng (lặp lại 2 lần), đặt ống nuôi cấy ở 370C và kiểm tra sau 4 ngày. Nhỏ 2 giọt thuốc thử vào dịch nuôi cấy.

Phản ứng (+): môi trƣờng chuyển đỏ

Phản ứng (-): môi trƣờng có màu vàng

2.4.4.6. Phản ứng VP (Voges- Proskauer)

Nguyên tắc: phát hiện các vi khuẩn có hai loại enzym chuyển hóa 2,3

butanerliol thành acetoin khi có ôxy và chuyển hóa tiếp aceton thành diacetyl.

- Diacetyl kết hợp với guanidin trong pepton tạo phức diacetyl - guidin có

màu đỏ.

- Cấy vi khuẩn vào môi trƣờng MR - VP . Ủ 370C /48h .

27

- Nhỏ 6 giọt thuốc thử A (5 % α naphtol) và 2 giọt thuốc thử B(KOH

40%). Lắc nhẹ.

- Đọc kết quả sau 60 phút.

- Phản ứng (+): môi trƣờng có màu đỏ

- Phản ứng (-): môi trƣờng không màu

2.4.4.7. Phản ứng khử Nitrat

Nguyên tắc: Phát hiện enzyme nitratase xúc tác khử nitrat thành nitrit và

nitơ phân tử.

Một số vi khuẩn có khả năng khử NO3 thành NO2 và các hợp chất chứa

Nito khác nhƣ amoniae (NH3) và khí Nito (N2).

Phân môi trƣờng vào các ống nghiệm (4-5 ml/ống), khử trùng ở 1210 C

trong 15 - 20 phút .

Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá vào môi trƣờng (mỗi chủng cấy 2 ống), đặt ở

nhiệt độ thích hợp trong 3 ngày. Chọn 2 ống không cấy vi khuẩn để làm đối

chứng.Nhỏ 1 giọt dung dịch A và 1 giọt dung dịch B. Cho thêm 5 viên kẽm vào

ống thử.

- Phản ứng (-) : môi trƣờngcó màu đỏ

- Phản ứng (+): môi trƣờng không màu

2.4.4.8. Khả năng di động

Mục đích:Xác định khả năng di động củavi sinh vật.

Cở sở: Vi sinh vật di động nhờ tiêm mao.

Các tiến hành: Cấy đâm sâu vi khuẩn vào môi trƣờng thạch mềm (0,5%

agar).

Vi khuẩn di động sẽ làm môi trƣờng đục, mọc lan rộng quanh vết cấy.

Vi khuẩn không di động chỉ mọc theo vết cấy, môi trƣờng không bị đục.

28

CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải

polysaccharide

Từ 3 mẫu đất rừng tại Núi Luốt và bộ sƣu tập các chủng từ phòng thí nghiệm, Trƣờng đại học Lâm Nghiệp Việt Nam, Thị trấn Xuân Mai - Chƣơng Mỹ - Hà Nội, đề tài đã tiến hành phân lập vi khuẩntrên môi trƣờng LB agar.

Sau khi phân lập, tiến hành thuần khiết các chủng. Các khuẩn lạc khác nhau đƣợc cấy ria trên từng đĩa chứa môi trƣờng LB agar, nuôi ở 300C trong 24- 48 giờ, thu đƣợc các khuẩn lạc riêng rẽ.

Dựa trên quan sát hình thái, màu sắc và kích thƣớc khuẩn lạc bằng mắt thƣờng, có thể phân biệt đƣợc các chủng khác nhau. Đặc điểm khuẩn lạc đƣợc mô tả trong bảng 3.1.

Bảng 3.1: Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn phân lập

Đặc điểm hình thái khuẩn lạc

STT

Nguồn mẫu

Bề mặt Màu sắc

Mép

Ký hiệu chủng

Đƣờng kính(mm)

Hình dạng

Tròn

L5

Núi luốt

Trơn

Răng cƣa

1

0,5

L6

Núi luốt

Tròn

Trơn

2

1,5

Trắng đục Trắng đục

Bằng phẳng

L10 Núi luốt

Tròn

Nhăn

Trắng

Răng cƣa

3

1,2

A

PTN

Tròn

Nhăn

Răng cƣa

4

1

Trắng đục

L1

Núi luốt

1,2

Tròn

Nhăn

Trắng

Răng cƣa

5

G1

Núi luốt

Tròn

Nhăn

Răng cƣa

6

1

Trắng đục

H12

PTN

Tròn

Trơn

Trắng

7

0,9

Bằng phẳng

L7

Núi luốt

Tròn

Trơn

Trắng

Răng cƣa

0,7

B1

PTN

Tròn

Trơn

Răng cƣa

0,5

L4

Núi luốt

Tròn

Nhăn

Răng cƣa

0,5

8 9 10

H2

PTN

Tròn

Nhăn

Răng cƣa

11

0,5

Trắng Trắng đục Trắng đục

29

12

C8

PTN

Tròn

nhăn

2

Răng cƣa

13

TA

PTN

Tròn

Nhăn

0,5

Răng cƣa

14

CM

PTN

Tròn

trơn

1

15

C1

PTN

Tròn

6

Trơn, nhầy

Trắng đục Trắng đục Trắng đục Trắng đục

Bằng phẳng Bằng phẳng

L4

L5

L6

Hình 3.1. Hình ảnh khuẩn lạc sau 1 ngày nuôi cấy của một số chủng

phân lập được

3.2: Tuyển chọn các chủng có khả năng phân giải polysaccharide mạnh.

3.2.1. Tuyển chọn dựa vào định tính

Các chủng sau phân lập đƣợc tuyển chọn thông qua khả năng phân giải cơ

chất của enzyme ngoại bào bằng phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch.

3.2.1.1. Cellulase

Các chủng sau phân lập đƣợc nuôi trong môi trƣờng lỏng chứa cơ chất CMC 0,5%, ở 370C, lắc 170 vòng/phút, sau 48h, ly tâm ở 6000 vòng/phút trong

vòng 15 phút để loại bỏ sinh khối vi khuẩn, thu dịch enzyme thô.Dịch enzyme

thô thu đƣợc tiến hành phản ứng enzyme cơ chất theo mô tả (trong mục 2.4.3.1)

30

Bảng 3.2. Đường kính vòng phân giảicellulose của các chủng vi khuẩn

Tên chủng Đƣờng kính vòng phân giải trung bình (mm)

C8

C1

CM

H2

L4

ĐC

TA

STT 1 2 3 4 5 6 C1 C8 TA CM L4 H2 27,3±0,5 27,3±0,5 37±0 36,6±0,5 32,3±0,5 26,6±0,5

Hình3.2: Hình ảnh vòng phân giải CMC của các chủng C1; C8; TA; H2,

CM, L4

Từ kết quả thể hiện trong bảng 3.2 và hình 3.1, có thể thấy đƣợc rằng khả năng thủy phân CMC của các dòng vi khuẩn từ 15 dòng vi khuẩn phân lập từ đất núi Luốt, thu đƣợc 6 dòng có khả năng thủy phân CMC thể hiện qua vòng thủy phân không màu quanh khuẩn lạc trên môi trƣờng CMC agar khi nhuộm với

31

lugol. Vòng phân giải CMC lớn nhất là của dòng TA đƣờng kính vòng là 37mm và nhỏ nhất là dòng H2 với đƣờng kính vòng là 26,6mm.

Theo nghiên cứu của tác giả Võ Văn Phƣớc Quệ và Cao Ngọc Điệp

(2011), phân lập đƣợc 96 dòng vi khuẩn từ đất trồng lúa để kiểm tra khả năng

thủy phân CMC của các dòng vi khuẩn, có 59 dòng có khả năng thủy phân CMC

qua vòng thủy phân không màu quanh khuẩn lạc trên môi trƣờng CMC agar khi

nhuộm với lugol là (5-39mm). Theo kết quả trong đề tài của tôi so với kết quả

nghiên cứu của tác giả, nghiên cứu của tôi chokết quả tƣơng đồng về khả năng

thủy phân CMC của các dòng vi khẩn phân lập đƣợc từ đất (núi luốt Lâm

Nghiệp) với đƣờng kính vòng thủy phân CMC là 26,6- 37mm.Do đó, bƣớc đầu

thấy rằng, các dòng (C1, C8, TA, H2 CM, L4) thích hợp cho quá trình thủy phân

CMC. Các dòng này cũng đƣợng sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.

3.2.1.2.Amylase

Từchủng vi khuẩn kiểm tra khả năng phân giải CMC,đề tài tiếp tục tiến

hành thử hoạt tính phân giải tinh bột. Vi khuẩn đƣợc nuôi trong môi trƣờng lỏng chứa cơ chất tinh bột 1%, ở 370C, lắc 170 vòng/phút, sau 48h, ly tâm ở 6000

vòng/phút trong vòng 15 phút để loại bỏ sinh khối vi khuẩn, thu dịch enzyme

thô. Kiểm tra khả năng phân giải tinh bột trên cơ chất 1% tinh bột và 1,5% agar.

Bảng 3.3: Đường kính vòng phân giải tinh bột của các chủng vi khuẩn

STT Tên chủng Đƣờng kính vòng phân giải trung

bình(mm)

1 C8 10,6±0,5

2 TA 10,3±0,5

3 L4 11±0

4 CM 11,6±0,5

5 H2 9,6±0,5

32

CM

ĐC

TA

C8

L4

H2

ĐC

Hình3.3: Hình ảnh vòng phân giải tinh bột của các chủng có hoạt

tính:C8; TA; H2, CM, L4

Từ kết quả thể hiện trong bảng 3.3 và hình 3.2, có thể thấy đƣợc rằng khả năng thủy phân tinh bột từ chủng vi khuẩn kiểm tra khả năng phân giải CMC, thu đƣợc 5 chủng có khả năng thủy phân tinh bột thể hiện qua vòng thủy phân không màu quanh khuẩn lạc trên môi trƣờng tinh bột agar khi nhuộm với lugol. Vòng phân giải tinh bột lớn nhất là của dòng CMđƣờng kính vòng là 11,6mm và nhỏ nhất là dòng H2 với đƣờng kính vòng là 9,6mm.

Theo nghiên cứu của tác giả Nguyễn Hữu Hiệp và Nguyễn Thị Hải Lý

(2012). Sau 48 giờ ủ, vòng sáng xung quanh khuẩn lạc (hay còn gọi là vòng

halo) xuất hiện. Vòng sáng có thể nhận rõ hơn và đo đƣợc khi làm tràn mẫu với

dung dịch lugol. Tuy nhiên, đƣờng kính vòng sáng xung quanh khuẩn lạc giữa

các dòng vi khuẩn khác nhau tùy thuộc vào loài vi khuẩn và khả năng thủy phân

tinh bột (5- 20mm). Theo kết quả trong đề tài của tôi so với kết quả nghiên cứu

của tác giả, nghiên cứu của tôi cho kết quả tƣơng đồng về khả năng thủy phân

tinh bột của các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc từ đất (núi luốt Lâm Nghiệp), thu

đƣợc 5 chủng có khả năng thủy phân tinh bột (9,6-11,6 mm), thể hiện qua vòng

thủy phân không màu quanh khuẩn lạc trên môi trƣờng tinh bột agar khi nhuộm

với lugol.Sự hiện diện của vòng thủy phân tinh bột bao quanh khuẩn lạc có thể

sử dụng để đánh giá sơ bộ khả năng thủy phân tinh bột của các dòng vi khuẩn.

Vì vậy các chủng C8, CM, TA, H2, L4 đƣợc lựa chọn để thực hiện các

nghiên cứu tiếp theo.

33

3.2.1.3. Pectinase

Từ chủng vi khuẩn kiểm tra khả năng phân giải CMC và tinh bột mạnh

nhất,đề tài tiếp tục tiến hành thử hoạt tính phân giải pectin. Đƣợc nuôi trong môi trƣờng LB lỏng chứa cơ chất pectin 1%, nuôi ở 370C, lắc 170 vòng/phút, sau

48h, ly tâm ở 6000 vòng/phút trong vòng 15 phút để loại bỏ sinh khối vi sinh

vật, thu dịch enzyme thô. Kiểm tra khả năng phân giải pectin trên cơ chất 1%

pectin và 1,5% agar.

Bảng 3.4: Đường kính vòng phân giải pectin của các chủng vi khuẩn

STT Tên chủng Đƣờng kính vòng phân giải trung bình (mm)

C8 1 23±0

TA 2 23,3±0,5

CM 3 23,3±0,5

L4 4 22,3±0,5

CM

TA

H2 5 22,6±0,5

ĐC

ĐC

H2

L4

C8

Hình 3.4: Hình ảnh vòng phân giải pectin của các chủng có hoạt tính:

H2, C8, CM, L4, TA.

34

Từ kết quả thể hiện trong bảng 3.4 và hình 3.4, có thể thấy đƣợc rằng khả

năng thủy phân pectin từ chủng vi khuẩn kiểm tra khả năng phân giải CMC

vàtinh bột, thu đƣợc 5 chủng có khả năng thủy phân pectin thể hiện qua vòng

thủy phân không màu quanh khuẩn lạc trên môi trƣờng pectin agar khi nhuộm

với lugol. Vòng phân giải tinh bột lớn nhất là của dòng TA đƣờng kính vòng là

23,3mm và nhỏ nhất là dòng L4 với đƣờng kính vòng là 22,3mm.

Theo nghiên cứu của tác giả Nguyễn Hoàng Anh và cộng sự (2017), theo

kết quả kiểm tra khả năng thủy phân pectin của các dòng vi khuẩn từ 94 dòng vi

khuẩn phân lập đƣợc từ đất trồng ngô, có 46 chủng có khả năng sinh enzyme

pectinase ở mức độ khác nhau với vòng phân giải (16- 21mm) thể hiện qua vòng

thủy phân không màu quanh khuẩn lạc trên môi trƣờng pectin agar khi nhuộm

với lugol. Theo kết quả trong đề tài của tôi so với kết quả nghiên cứu của tác

giả, đề tài của tôi cho kết quả cao hơn về khả năng thủy phân pectin của các

dòng vi khuẩn phân lập đƣợc từ đất (núi luốt Lâm Nghiệp), thu đƣợc 5 chủng

(C8, H2, CM, TA, L4) có khả năng thủy phân pectin với vòng phân giải (22,3 –

23,3 mm), thể hiện qua vòng thủy phân không màu quanh khuẩn lạc trên môi

trƣờng pectin agar khi nhuộm với lugol.

Thông qua khả năng phân giải cơ chất của enzyme ngoại bào bằng

phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch đã tuyển chọn đƣợc 5 chủng là CM, TA,

H2, C8, L4 có khả năng sinh cellulase, amylase, pectinase để phân giải

polysaccharide.

3.2.2. Tuyển chọn dựa vào xác định hàm lượng đường khử bằng phương

pháp DNS

3.2.2.1. Cellulase

Từ giá trị OD đo đƣợc và phƣơng trình đƣờng chuẩn, xác định đƣợc hàm

lƣợng đƣờng khử tạo ra và hoạt độ cellulase. Kết quả xác định khả năng phân

giải CMC của các chủng đƣợc trình bày ở bảng 3.5.

35

Bảng 3.5: Kết quảxác định khả năng phân giải CMC của các chủng vi

khuẩn

STT Kí hiệu

chủng VSV Trị số OD540nm trung bình Hoạt độ cellulase (U/ml)

Lƣợng đƣờng khử tạo ra trong mẫu (mg/ml)

C1

C8

L4

H2

CM

TA

ĐC

1 2 3 4 5 6 TA C8 H2 L4 CM C1 Hệ số pha loãng của mẫu TN 0,902±0,06 10 0,848±0,1 10 0,921±0,06 10 0,782±0,03 10 0,923±0,07 10 0,689±0,02 10 6,114±0,06 5,75±0,1 6,243±0,06 5,304±0,03 6,256±0,07 4,675±0,02 16,304±0,06 15,33±0,1 16,648±0,06 14,144±0,03 16,682±0,07 12,46±0,02

Hình 3.5: Hình ảnh thử enzyme cellulase với thuốc thử DNS

Từ kết quả thu đƣợc cho thấy, xác định hoạt tính phân giải CMC của các

chủng ( TA, H2, CM, L4, C8, C1) bằng phƣơng pháp DNS, hoạt độ cellulase thu đƣợc cao nhất là chủng CM (16,682 U/ml), hoạt độ cellulase thấp nhất là chủng C1 (12,46 U/ml).

3.2.2.2. Amylase

Từ giá trịOD đo đƣợc và phƣơng trình đƣờng chuẩn, xác định đƣợc hàm

lƣợng đƣờng khử tạo ra và hoạt độamylase. Kết quả xác định khả năng phân giải

tinh bột đƣợc trình bày ở bảng 3.6.

36

Bảng 3.6: Kết quả xác định khả năng phân giải tinh bột của các chủng vi khuẩn

STT Kí hiệu

Trị số OD540nm trung bình Hệ số pha loãng của mẫu TN Hoạt độ amylase (U/ml)

chủng vi khuẩn Lƣợng đƣờng khử tạo ra trong mẫu (mg/ml)

1 CM 3,293±0,04 10 176,05±0,04 0,588±0,04

2 TA 3,522±0,04 10 188,7±0,04 0,626±0,04

3 C8 3,25±0,02 7 121,5±0,02 0,812±0,02

4 L4 3,12±0,07 10 171±0,07 0,560±0,07

5 H2 3,41±0,05 146,04±0,05

TA

H2

CM

L4

C8

ĐC

0,750±0,05 8

Hình 3.6: Hình ảnh thử enzyme amylase với thuốc thử DNS

Từ kết quả thu đƣợc cho thấy, xác định hoạt tính phân giải tinh bột của

các chủng ( TA, H2, CM, L4, C8) bằng phƣơng pháp DNS, hoạt độ amylase thu đƣợc cao nhất là chủng TA (188,7 U/ml), hoạt độ amylase thấp nhất là chủng C8 (121,5 U/ml).

Theo nghiên cứu của tác giả Parmar vàAjit Pandya (2012), khi phân lập

thu các chủng thuộc chi Bacillus từ đất (vùng Gujarat vidyapith, sadra, Ấn Độ)

và xác định hoạt tính phân giải tinh bột của chủng bằng phƣơng pháp DNS, hoạt

độ amylase thu đƣợcđạt trong khoảng 45-135,3U/ml (Parmar & Pandya,

2012).Theo kết quả trong đề tài của tôi so với kết quả nghiên cứu của tác giả cho 37

thấy, kết quả nghiên cứu đề tài của tôi cao hơn về khả năng thủy tinh bột bằng

DNS của các dòng vi khuẩn (TA, CM, C8, H2, L4) phân lập đƣợc từ đất (núi

luốt Lâm Nghiệp), sau 48h nuôi cấy hoạt độ amylase của chủng thu đƣợc đạt

trong khoảng 121,5 – 188,7U/ml.

3.2.2.3. Enzyme Pectinase

Từ giá trị OD đo đƣợc và phƣơng trình đƣờng chuẩn, xác định đƣợc hàm

lƣợng đƣờng khử tạo ra và hoạt độ pectinsae. Kết quả xác định khả năng phân

giải tinh bột đƣợc trình bày ở bảng 3.10.

Bảng 3.7: Kết quả xác định khả năng phân giải pectin của các chủng VSV

STT Kí hiệu

chủng VSV Trị số OD575nm trung bình Hoạt độ pectinase (U/ml)

Lƣợng đƣờng khử tạo ra(mg/ml)

1 CM Hệ số pha loãng của mẫu TN 10 38,46±0,009

2 TA 10 43,26±0,021

3 C8 10 37,04±0,04

4 L4 10 36,02±0,013

ĐC

CM

TA

C8

L4

H2

5 H2 10 35,51±0,007 0,624±0,009 7,54±0,009 0,648±0,021 8,48±0,021 0,599±0,04 7,26±0,04 0,580±0,013 7,06±0,013 0,571±0,007 6,96±0,007

Hình 3.7: Hình ảnh thử enzymepectinase với thuốc thử DNS

38

Từ kết quả thu đƣợc cho thấy, xác định hoạt tính phân giải pectin của các

chủng ( TA, H2, CM, L4, C8) bằng phƣơng pháp DNS, hoạt độ amylase thu đƣợc cao nhất là chủng TA (43,26 U/ml), hoạt độ amylase thấp nhất là chủng H2 (35,51 U/ml).

3.2.3.Tuyển chọn các chủng có hoạt độ của enzyme cellulase, amylase,

pectinase.

Bảng 3.8: Kết quả tuyển chọn các chủng có hoạt độ của enzyme cellulase, amylase, pectinase.

Hoạt độ enzyme(U/ml) SST Tên chủng Cellulase Amylase Pectinase

16,682 176,05 38,46 1 CM

16,304 188,7 43,26 2 TA

16,648 121,5 37,04 3 H2

15,33 171 36,02 4 C8

14,144 146,04 35,51 5 L4

Qua kết quả số liệu từ hình và bảng chúng ta có thể nhận thấy lƣợng đƣờng khử và hoạt độ khi thực hiện phản ứng enzyme cơ chất ở mỗi chủng vi khuẩn khác nhau. Cụ thể có những chủng thể hiện hoạt tính mạnh và có cả enzyme cellulase, enzyme amylase, enzyme pecticnase nhƣ CM, TA, C8, H2, L4.

Thông qua kết quả tuyển chọn dựa vào xác định hàm lƣợng đƣờng khử bằng phƣơng pháp DNS, đã chọn 2 chủng vi khuẩn có khả năng sinh enzyme cellulase, amylase, pectinase phân giải CMC, Tinh bột, Pectin cao để làm các phản ứng tiếp theo gồm: CM và TA với hoạt độ: CM (cellulase 16,682U/ml; amylase 176,05U/ml; pectinase 38,46U/ml), TA (cellulase 16,304U/ml; amylase 188,7U/ml; pectinase 43,26U/ml).

3.3. Một số đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của hai chủng vi khuẩn TA và CM 3.3.1. Đặc điểm hình thái của khuẩn lạc

Hai chủng vi khuẩn CM và TA có khả năng phân giải cellulose, tinh bột,

pectin mạnh và còn có một số đặc tính quý khác. Do đó, ta tiến hành tinh sạch,

giữ giống phụ vụ cho các nghiên cứu sau này.

39

Bảng 3.9: Đặc điểm hình thái khuẩn lạccủa hai chủng vi khuẩn CM và TA

CM TA

Tròn, trắng đục, bề mặt trơn, rìa bằng phẳng. Tròn, trắng đục, bề mặt nhăn, rìa răng cƣu không đều.

Đặc điểm Hình dạng khuẩn lạc

Hình ảnh khuẩn lạc

3.3.2. Kết quả nhuộm gram

Bảng 3.10: Kết quả nhuộm gram các chủng vi khuẩn

Gram Hình ảnh

Chủng Hình dạng Bắt màu

TA Tím Dƣơng Trực khuẩn

CM Tím Dƣơng Trực khuẩn

40

Vi khuẩn Gram dƣơng có thành tế bào đƣợc cấu tạo bởi peptidoglycan,

chất này có khả năng giữ phức hợp tím tinh thể - iot. Trong khi đó, lớp thành tế

bào peptidoglycan của các vi khuẩn Gram âm thì mỏng hơn và thƣờng có thêm

lớp màng lipopolysaccharide bên ngoài .

Sau khi nhuộm với phức hợp tím tinh thể iot, mẫu đƣợc xử lý tiếp với hỗn

hợp khử màu, làm mất nƣớc của các lớp peptidoglycan trong thành tế bào Gram

dƣơng, từ đó làm giảm khoảng trống giữa các phân tử và khiến thành tế bào bắt

giữ phức hợp tím tinh thể - iot bên trong tế bào.

Đối với vi khuẩn Gram âm, lớp peptidoglycan mỏng không thể giữ lại

phức hợp tim tinh thể lọt và tế bào Gram âm bị khử màu. Khi nhuộm lại bằng

Fuchsin thì tế bào Gram âm bắt màu hồng .

Từ bảng 3.10 ta thấy: 2 chủng vi khuẩn Gram dƣơng, đều có tế bào hình

que ngắn, đứng xếp đôi hoặc xếp đơn, có khả năng sinh bào tử.

3.4. Xác định đặc tính sinh hóa

3.4.1. Khả năng lên men các loại đường

Chủng TA và CM đƣợc kiểm tra khả năng lên men các loại đƣờng

glucose, lactose, saccharose, mannitose, maltose, xylose bằng cách quan sát sự

thay đổi màu của môi trƣờng:

Hình 3.8: Khả năng phân giải các loại đường của chủng CM

41

Hình 3.9:Khả năng phân giải các loại đường của chủng TA

Kết quả:

Chủng CM:

Môi trƣờng chuyển từ màu đỏ sang màu vàng và có bọt khí li ti

Giữ nguyên màu đỏ và không có bọt khí li ti + Mannitose + Glucose + Saccharose + Maltose + Xylose + Lactose

Chủng TA:

Môi trƣờng chuyển màu đỏ sang màu vàng, có bọt khí liti

Môi trƣờng giữ nguyên màu đỏ và không có bọt khí + Mannitose + Maltose + Saccharose + Lactose + Xylose + Glucose

Nhận xét: Quan sát màu sắc có thể thấy các ống nghiệm chứa các loại

đƣờng chuyển từ màu đỏ sang màu vàng, tức là phản ứng dƣơng tính. Còn các

ống nghiệm chứa môi trƣờng giữ nguyên màu đỏ là phản ứng âm tính.

Từ kết quả hình 3.8 cho thấy chủng CM có khả năng đồng hóa 3 loại

đƣờng .

42

Từ hình 3.9 cho thấy chủng TA có khả năng đồng hóa 4 loại đƣờng.

3.4.2 . Kết quả phản ứng MR và phản ứng VP

Chủng TA và CM đƣợc nuôi lắc trên môi trƣờng LB sau đó đƣợc cấy chuyển sang môi trƣờng MR - VP Broth. Thử phản ứng MR và VP, ta thu đƣợc kết quả dƣới đây:

Hình 3.10:Kết quả phản ứng MR và phản ứng VP

Nhận xét: Qua hình 3.6 cho thấy kết quả của phản ứng MR dịch nuôi cấy

chủng TA và CM đều chuyển màu vàng , cho kết quả âm tính (màu vàng ở pH 6.0).

Kết quả của phản ứng VP, dịch nuôi cấy cả 2 chủng đều chuyển màu đỏ là

phản ứng dƣơng tính. Ống đối chứng không bổ sung vi khuẩn nên có phản ứng

âm tính. Vì vậy có thể kết luận rằng chủng TA và CM có xảy ra phản ứng VP,

không xảy ra phản ứng MR.

3.4.3. Phản ứng catalase, khử nitrate, citrate, thử nghiệm tính di động.

Phản ứng catalase

Hình 3.11: Kết quả phản ứng hoạt hóa catalase

43

Kết quả: Chủng TA và CM : phản ứng dƣơng (+): có bọt khí xuất hiện.

Khử nitrate

Hình 3.12: kết quả phản ứng khử nitrate

Kết quả

Chủng CM chuyển sang màu hồng nhẹ phản ứng âm tính, vi khuẩn không

có khả năng khử nitrate.

Chủng TA khi cho Zn vào không chuyển màu phản ứng dƣơng tính, vi

khuẩn có khả năng khử nitrate.

Phản ứng Citrate

Hình 3.13: Kết quả phản ứng citrate

44

Kết quả: Chủng CM và TA môi trƣờng màu xanh nƣớc biển, phản ứng

dƣơng tính.

Thử nghiệm tính di động

Hình 3.14: Kết quả thử nghiệm tính di động

Kết quả: Chủng TA và chủng CM không có khả năng di động. Vi khuẩn

không di động sẽ phát triển quanh đƣờng cấy, môi trƣờng không bị đục.

Bảng 3.11: Tổng kết các đặc tính sinh hóa của chủng TA và CM

STT Phản ứng sinh hóa Kết quả

CM TA

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Catalase MR( methyl Red) VP ( Voges- Proskauer) Khử nitrate Citrate Khả năng di động Saccharose Glucose Lactose Maltose Mannitose Xylose + - + - + - + + - - + - + - + + + - + - + + + -

Qua bảng phản ứng sinh hóa của chủng TA và CM, thấy có nhiều đặc

điểm phù hợp với Bacillus subtilis (Theo Holt, 1992) (trích Lý Kim Hữu, 2005).

Dƣới dây là bảng một số phản ứng sinh hóa củaBacillus subtilis: 45

Bảng 3.12: Phản ứng sinh hóa của vi khuẩn Bacillus subtilis.

STT Phản ứng sinh hóa Kết quả

1 Catalase +

2 Sinh indol -

3 MR( methyl Red) +

4 VP ( Voges- Proskauer) +

5 Sử dụng citrate +

6 Khử nitrate +

7 Tan chảy gelatin +

8 Di động +

9 Phân giải tinh bột +

10 Arabinose +

11 Xylose +

12 Saccharose +

13 Manitol +

14 Glucose +

15 Lactose -

16 Maltose +

( Theo Holt, 1992) (trích Lý Kim Hữu, 2005)

Qua bảng 3.11 và 3.12, thấy chủng TA và chủng CM có nhiều đặc điểm

phù hợp với Bacillus subtilis và là chủng có khả năng sinh đa enzyme nên có

tiềm năng ứng dụng đa dạng.

Để có thể định danh chính xác loài vi khuẩn TA và CM cần có những

nghiên cứu bổ sung về các đặc tính sinh hóa khác theo hệ thống phân loại vi

khuẩn của Bergey và xác định bằng phƣơng pháp sinh học phân tử thông qua

phân tích trình tự gen.

46

CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. Kết luận

Qua quá trình thực hiện đề tài, tôi thu đƣợc kết quả nhƣ sau:

Đã phân lập đƣợc 15 chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme

phân giải polysaccharide.

Đã tuyển chọn đƣợc 5 chủng vi khuẩn có cả 3 hoạt tính cellulase,

amylase, pectinase phân giải polysaccharide (CM, TA, H2, C8, L4) thông qua

đó tuyển chọn đƣợc 2 chủng có cả 3 hoạt tính cellulase, amylase, pectinase phân

giải polysaccharide mạnh nhất (CM, TA). Với hoạt độ CM (cellulase

16,682U/ml; amylase 176,05U/ml; pectinase 38,46U/ml), và hoạt độ TA

(cellulase 16,304U/ml; amylase 188,7U/ml; pectinase 43,26U/ml).

Xác định đƣợc hình thái khuẩn lạc, đặc tính sinh lý sinh hóa của chủng

CM và TA.

4.2.Kiến nghị

- Qua nghiên cứu trên ta thấy polysaccharide có ứng dụng trong các ngành

(nông nghiệp, công nghiệp, y-dƣợc, … ), vì vậy có một số kiến nghị sau:

- Nghiên cứu hoàn thành phân lập vi khuẩn có khả năng sinh enzyme

phân giải polysaccharide.

- Nghiên cứu ứng dụng của enzyme cellulase, amylase, pectinase thu

đƣợc để tạo một số sản phẩm và đánh giá khả năng ứng dụng của chúng.

47

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng việt

1.Phạm Thị Ánh Hồng, Kỹ thuật sinh hóa, nhà xuất bản Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh,113 - 114, 2003. 2. Nguyễn Đức Lƣợng, Cao Cƣờng, Thí nghiệm công nghệ sinh học, tập 1- Thí nghiệm hóa sinh học, nhà xuất bản Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh, 128 - 129, 2003. 3.Lê Hồng Phú, Nghiên cứu sinh tổng hợp Enzyme Pectinase và Cellulase từ Aspergillus niger và ứng dụng để xử lý vỏ cà phê trong sản xuất phân hữu cơ, Luận văn thạc sĩ ngành sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự Nhiên thành phố Hồ Chí Minh, 2003. 4. Trung tâm CAI Đại học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh, Tài liệu những công trình đã thực hiện trên đối tượng vỏ cà phê, Tp.HCM, 2003. 5. Trung Tâm Kỹ Thuật Môi Trƣờng TP. HCM, 2006.Báo cáo tổng hợp “Quy hoạch môi trường tỉnh Đồng Tháp đến năm 2020”, pp 20 – 25. 6. Lê Hoàng Việt, 2000. Nguyên lý các quy trình xử lý nƣớc thải, Giáo trình Đại Học Cần Thơ, pp. 6 – 30. 7.Lê Thanh Mai, Nguyễn Thị Hiền, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Thanh Hằng và Lê Thị Lan Chi, 2009. Các phương pháp phân tích ngành Công nghệ lên men. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật. Hà Nội. 331 trang. 8.Nguyễn Đức Lƣợng, Cao Cƣờng, Nguyễn Ánh Tuyết, Lê Thị Thủy Tiên, Tạ Thu Hằng, Huỳnh Ngọc Anh, Nguyễn Thúy Hƣơng và Phan Thị Huyền, 2004. Công nghệ Enzyme.Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh.534 trang. 9. Nguyễn Minh Thủy, Nguyễn Văn Thành và Bùi Thị Thúy Ngân, 2011.Tuyển chọn các dòng nấm men được phân lập từ nước thốt nốt. Tạp chí khoa học Trƣờng Đại học Cần Thơ, Vol. 18b, trang 117–126.Nhà xuất bản Đại học Cần Thơ. ISSN 1859-2333. 10. Hồ Thị Hảo (2011), Nghiên cứu quá trình lên men axit lactic từ tinh bột hạt mít, Luận văn thạc sĩ, Khoa Công nghệ Thực phẩm và đồ uống, Đại học Đà Nẵng. 11. Dƣơng Thị Ngọc Hạnh, Nguyễn Minh Thủy (2014), Sử dụng enzyme - amylase trong thủy phân tinh bột từ gạo huyết rồng, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, tr. 61-67.

12. Nguyễn Minh Hiền, Nguyễn Thuý Hƣơng (2008), Nghiên cứu quá trình thu phân tinh bột hạt mít bằng enzyme Termamyl 120 và M 300 để lên men rượu chưng cất, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, số (11), 43-47. 13. Đỗ Trọng Hƣng, Vũ Thị Thuận, Nguyễn Hoàng Phi, Lƣơng Thị Nhƣ Hoa, Nguyễn Thùy Linh (2012), Xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân tinh bột thành nguyên liệu sản xuất Isomalto Oligosaccharides (IMO), Tạp chí Khoa học và Công nghệ, tr.39-48. 14. Nguyễn Thị Vân Linh (2011), Ảnh hưởng của loại enzyme, nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH đến quá trình thủy phân nếp than ứng dụng cho quá trình lên men, Luận văn tốt nghiệp cử nhân, Trƣờng Đại học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh. 15. Nguyen Minh Hien, Nguyen Thuy Huong (2008), "Effect of Saccharomyces cerevisiae strains on jackfruit seed fermentation", In The 1st conference on food science and technology Mekong delta, Viet Nam, p.159 – 163. 16. Lê Thị Bích Phƣơng và Nguyễn Minh Thủy (2014), Tối ưu hóa quá trình đường hóa tinh bột bắp nếp bằng enzyme glucoamylase, Tạp chí Khoa học Trƣờng Đại học Cần Thơ, số (1): 84-91002E.

Tài liệu tiếng anh 17. Gary J. Samuels, Trichoderma a guide to identification and biology. Unit States Deparment of Agriculture Agricultural Research service Systermatic Botany and Mycology Laboratory 304, B-011A Beltsville, MD 20705-2350, USA, 2004. 18. Okada G., The growth of Trichoderma viride on media containing cotton fibres, J. Biochem., trang 591 – 607, 1963. 19. Ruy D.D.Y.And Mandels M. – Cellulase, Biosynthesis and applications - Enzyme Microbiology Technology, 1980. 20.Haseltine C., M. Rolfsmeier and P. Blum, 1996. The glucose effect and regulation of α- amylase synthesis in the hyperthermophilic archaeon Sulfolobus solfataricus. J. Bacteriol. 178: 945-950. 21.Lin L.L., C.C. Chyau and W.H. Hsu, 1998. Production and properties of a rawstarch-degrading amylase from thermofilic and alkaliphilic Bacillus sp, TS-23.Biotech. Appl. Biochem. 28: 61-68.

accessed on

22. Sasmita, M. and N. Behera, 2008. Amylase activity of a starch degrading bacteria isolated from soil receiving kitchen wastes. African Journal of Biotechnol.7 (18): 3326-3331. 23. Sekar Sudharhsan, Sivaprakasam Senthilkumar and Karunasena Ranjith, 2007.Physical and nutritional factors affecting the production of amylase from species of Bacillus isolated from spoiled food waste. African Journal of Biotechnol. 6 (4): 430-435. 24. Smitt J.P., J. Rinzema, H. Tramper, M. Van and W. Knol, 1996. Solid state reesei QMQ414.Appl. fermentation of wheat bran by Trichoderma Microbial.Biotechnol. 46: 489-496. 25. Toye Ekunsaumi, 2008. Laboratory and assay of amylase by fungi and bacteria, www.bio link.org/sharing_day/fungalamylase.pdf (truy cập ngày 01/8/2008). 26.Aranda, A. and M. Delolmo, 2003. Response to acetaldehyde stress in the yeast Saccharomyces cerevisiae involves a strain-dependent regulation of several ALD genes and is mediated by the general stress response pathway. Yeast, 20: 747-759. 27.Awad, H.M., R. Diaz, R.A. Malek, N.Z. Othman,R.A. Aziz and H.A. El Enshasy, 2012. Efficient production process for food grade acetic acid by Acetobacteraceti in shake flask and in bioreactor Cultures. E-Journal of Chemistry,Volume 9 (2012), Issue 4, Pages 2275-2286. 28.Benito Á.G, 2005. Application of molecular techniques for identification and enumerationof acetic acid bacteria. http://www.uco.es/vinegarnetwork/tesis/tesis_Gonzalez.pdf, 01/01/2014. 29.Brock, T.D and M.T. Madigan (1991).Biology of microorganisms

th Edition). Englewood Cliffs, NJ: Prentice-Hall.

relevant cultures starter traits for

(6 30.Gullo, M. and P. Giudici, 2008. Acetic acid bacteria in traditional balsamic vinegar: Phenotypic selection. InternationalJournal of Food Microbiology, 125 (2008) 46–53. 31.Gullo, M., C. Caggia, L. Devero and P. Giudici, 2005. Characterization of acetic acid bacteria in traditional balsamic vinegar. Int. J. Food Microbiol., 106: 209-212.

Intracellular pH distribution

(Acetobacter aceti) from

32.Horiuchi, J. I., Kanno, T., & Kobayashi, M, 1999. New vinegar production from onions. Journal of bioscience andbioengineering,88(1), 107-109 33.Horiuchi, J. I., Kanno, T., & Kobayashi, M, 2000. Effective onion vinegar production by a two-step fermentation system. Journal of bioscience and bioengineering,90(3), 289-293bioscience and bioengineering,90(3), 289-293. 34.Kadere, T.T., T. Miamoto, R.K. Oniang`o, P.M. Kutima and S.M. Njoroge, 2008. Isolation and identification of genera Acetobacter and Gluconobacter in coconut toddy (mnazi). Afr. J. Biotechnol., 7: 2963-2971. 35.Sossou S.K., Ameyapoh Y, Karou SD, de Souza C, 2009.Study ofpineapple peelings processing into vinegar by biotechnology. Pak J. Biol. Sci.; 12(11): 859-65. 36.Valli, M., M. Sauer, P. Branduardi, N. Borth, D. Porro and D. Mattanovich, 2006. Improvement of lactic acid production in Saccharomyces cerevisiae by cell sorting for high intracellular pH. Applied Environ. Microbiol., 72: 5492- 5499. 37.Valli, M., M. Sauer, P. Branduardi, N. Borth, D. Porrot and D. Mattanovich, 2005. in Saccharomyces cerevisiae cell populations, analyzed by flow cytometry. Applied Environ. Microbiol., 71: 1515- 1521. 38.Zahoor, T., F. Siddique and U. Farooq, 2006.Isolation and characterization of indigenous sources. British vinegar culture FoodJournal, Vol. 108 Iss: 6, pp.429 – 439 39. Guo, Y., N. Zhu, S. Zhu and C. Deng. 2007. Molecular phylogenetic diversity of bacteria and its spatial distribution in composts. J. of Applied Microbiology 103, 1344-1354. 40. Ren, Z., T.E. Ward, B.E. Logan and J.M. Regan. 2007. Characterization of the cellulolytic and hydrogen-producing activities of six mesophilic Clostridium species. J. of Applied Microbiology 103, 2258-2266. 41. Ryckeboer, J., J. Mergaet, J. Gosemans, K. Deprins and J. Swings. 2003. Microbiological aspects of biowaste during composting in a monitored compost bin. J. of Applied Microbiology 94, 127-137. 41. Schwarz, W.H. 2001. The cellulosome and cellulose degradation by anaerobic bacteria. Applied Microbiology and Biotechnology 56, 634-649. 42. Strom, P.F. 1985. Identification of Thermophilic Bacteria in Solid-Wastes Composting.

43.Applied Environmental and Microbiology 50, 906-913. 44. Ueno, Y., D. Sasaki, H. Fukui, S. Harita, M. Ishii and Y. Igarashi. 2006. Changes in bacterial community during fermentative hydrogen and aicd production from organic waste by thermophilic anaerobic microflora. J. of Applied Microbiology 101, 331-343. 45. Vrints, M, S. Bertrand and J.M. Collend. 2007. A bacterial population study of commercialized wastewater inoculants. J. of Applied Microbiology 103, 2006-2015.

PHỤ LỤC

Phụ biểu1. Đƣờng kính vòng phân giải cellulose của các chủng vi khuẩn

STT Tên chủng

Đƣờng kính vòng phân giải trung bình (mm) Đƣờng kính vòng phân giải (mm) Lần 2 Lần 1

28 27 37 37 32 26 Lần 3 27 28 37 37 32 27 27,3±0,5 27,3±0,5 37±0 36,6±0,5 32,3±0,5 26,6±0,5 C1 C8 TA CM L4 H2 27 27 37 36 33 27

1 2 3 4 5 6

Phụ biểu 2. Đƣờng kính vòng phân giải tinh bột của các chủng vi khuẩn

Đƣờng kính (mm) STT Tên chủng

Lần 1 Lần 2 Lần 3 Đƣờng kính vòng phân giải trung bình (mm)

10,6±0,5 10,3±0,5 11±0 11,6±0,5 9,6±0,5 11 10 11 12 9 11 11 11 12 10 1 2 3 4 5 C8 TA L4 CM H2 10 10 11 11 10

Phụ biểu 3. Đƣờng kính vòng phân giải pectin của các chủng vi khuẩn

Đƣờng kính (mm) STT Tên chủng

Lần 1 Lần 2 Lần 3 Đƣờng kính vòng phân giải trung bình (mm)

23±0 23,3±0,5 23,3±0,5 22,3±0,5 22,6±0,5 23 24 23 23 23 23 23 24 22 22 1 2 3 4 5 C8 TA CM L4 H2 23 23 23 22 23

Phụ biểu 4. Kết quả đo hoạt độ cellulase của các chủng vi khuẩn

STT Kí hiệu Số lần Trị số trung bình Lƣợng đƣờng Hoạt độ Trị số OD540(nm)

pha loãng khử tạo ra amylase chủng Lần 1 Lần 2 Lần 3 OD540(nm)

mẫu trong mẫu VSV (U/ml)

(mg/ml)

0,279 0,267 0 0,27 ± 0,007 1 ĐC 0,266

0,925 0,954 10 0,902 ± 0,06 6,114± 0,06 16,304± 0,06 2 TA 0,827

0,931 0,879 10 0,848 ± 0,1 5,75± 0,1 15,33± 0,1 3 C8 0,734

0,928 0,978 10 0,921 ± 0,06 6,243± 0,06 16,648± 0,06 4 H2 0,858

0,768 0,759 10 0,782 ± 0,03 5,304± 0,03 14,144± 0,03 5 L4 0,819

0,903 1,005 10 0,923 ± 0,07 6,256± 0,07 16,682± 0,07 6 CM 0,862

0,715 0,681 10 0,689 ± 0,02 4,675± 0,02 12,46± 0,02 7 C1 0,673

Phụ biểu 5. Kết quả đo hoạt độ amylase của các chủng vi khuẩn

Trị số OD540nm

STT Hoạt độ amylase (U/ml) Trị số trung bình OD540(nm) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Kí hiệu chủng vi khuẩn Lƣợng đƣờng khử tạo ra trong mẫu (mg/ml)

Số lần pha loãng mẫu 0 0,248±0,03 1 ĐC 0,269 0,273 0,202

0,124±0,03 3,293±0,04 176,05±0,04 10 0,588±0,04 2 CM 0,538 0,604 0,623

3,522±0,04 188,7±0,04 10 0,626±0,04 3 TA 0,578 0,674 0,627

3,25±0,02 121,5±0,02 7 0,812±0,02 4 C8 0,840 0,794 0,802

3,12±0,07 171±0,07 10 0,560±0,07 5 L4 0,471 0,599 0,612

3,41±0,05 146,04±0,05 8 0,750±0,05 6 H2 0,781 0,692 0,779

Phụ biểu 6. Kết quả đo hoạt độ pectinase của các chủng vi khuẩn

Trị số OD575nm Trị số trung bình OD575 (nm)

STT

Kí hiệu chủng vi khuẩn Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lƣợng đƣờng khử tạo ra trong mẫu (mg/ml) Hoạt độ pectinase (U/ml)

0,259 0,278 0,302 0,279±0,02 ĐC Số lần pha loãng mẫu 0 1

7,54±0,009 38,46±0,009 0,614 0,628 0,632 10 0,624±0,009 CM 2

8,48±0,021 43,26±0,021 TA 0,633 0,673 0,638 10 0,648±0,021 3

7,26±0,04 37,04±0,04 C8 0,587 0,652 0,560 10 0,599±0,04 4

7,06±0,013 36,02±0,013 L4 0,594 0,581 0,567 10 0,580±0,013 5

6,96±0,007 35,51±0,007 H2 0,564 0,579 0,571 10 0,571±0,007 6