i
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành đề tài nghiên cứu khoa học này, trƣớc hết tôi xin gửi đến
cô - TS nguyễn Nhƣ Ngọc, TS. Trần Thị Thu Lan lời cảm ơn sâu sắc, ngƣời đã
giúp đỡ tận tình hƣớng dẫn và theo dõi sát sao tôi trong quá trình hoàn thiện
nghiên cứu này.
Tôi cũng xin gửi đến nhà trƣờng, quý thầy, cô giáo trong viện Công nghệ
sinh học vàbộ môn Vi sinh - Hóa sinh lời cảm ơn chân thành nhất vì đã tạo cho
tôi có cơ hội đƣợc thực hiện đề tài, thể hiện sự sáng tạo của mình tại nơi mà tôi
yêu thích, để tôi có cơ hội áp dụng những kiến thức mà các thầy cô giáo đã
truyền đạt.
Thông qua quá trình thực hiện để tài, tôi đã học hỏi đƣợc nhiều điều và rút
ra cho mình nhiều kinh nghiệm quý báu để giúp ích cho công việc sau này của
bản thân. Vì kiến thức bản thân còn hạn chế, trong quá trình thực hiện, hoàn
thiện đề tài này không tránh khỏi những sai sót, kính mong nhận đƣợc những ý
kiến đóng góp từ các thầy, cô.
Sinh viên thực hiện
Lê Thị Huệ
ii
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................ i
MỤC LỤC ............................................................................................................. ii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ..................................................................... iv
DANH MỤC BẢNG ............................................................................................. v
DANH MỤC HÌNH ............................................................................................. vi
ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... 1
CHƢƠNG I.TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ........................................ 3
1.1.Tổng quan về polysacharide ............................................................................ 3
1.1.1. Cấu trúc polysaccharide .............................................................................. 3
1.1.2. Ứng dụng của polysaccharide ..................................................................... 6
1.1.3. Các enzyme phân giải polysaccharide ........................................................ 7
1.1.4. Vi sinh vật phân giải polysaccharide ........................................................ 12
CHƢƠNG II: MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
............................................................................................................................. 15
2.1. Mục tiêu ........................................................................................................ 15
2.2. Nội dung nghiên cứu. ................................................................................... 15
2.3. Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu. .......................................................... 15
2.3.1. Vật liệu ...................................................................................................... 15
2.3.2. Hóa chất ..................................................................................................... 15
2.3.3. Thiết bị, dụng cụ........................................................................................ 16
2.3.4. Môi trƣờng sử dụng trong nghiên cứu ...................................................... 17
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................. 17
2.4.1. Phƣơng pháp thu nhận mẫu ....................................................................... 17
2.4.2. Phân lập vi khuẩn thuần khiết ................................................................... 18
2.4.3. Tuyển chọn các chủng có khả năng phân giải polysaccharide mạnh. ...... 18
2.4.4. Phƣơng pháp xác định đặc tính sinh hóa của chủng tuyển chọn. ............. 25
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 29
3.1. Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải polysaccharide
............................................................................................................................. 29
3.2: Tuyển chọn các chủng có khả năng phân giải polysaccharide mạnh. ......... 30
iii
3.2.1. Tuyển chọn dựa vào định tính ................................................................... 30
3.2.2. Tuyển chọn dựa vào xác định hàm lƣợng đƣờng khử bằng phƣơng pháp
DNS ..................................................................................................................... 35
3.2.3.Tuyển chọn các chủng có hoạt độ của enzyme cellulase, amylase,
pectinase. ............................................................................................................. 39
3.3. Một số đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của hai chủng vi khuẩn TA và CM .... 39
3.3.1. Đặc điểm hình thái của khuẩn lạc ............................................................ 39
3.3.2. Kết quả nhuộm gram ................................................................................. 40
3.4. Xác định đặc tính sinh hóa .......................................................................... 41
3.4.1. Khả năng lên men các loại đƣờng ............................................................. 41
3.4.2 . Kết quả phản ứng MR và phản ứng VP ................................................... 43
3.4.3. Phản ứng catalase, khử nitrate, citrate, thử nghiệm tính di động. ............. 43
CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................... 47
4.1. Kết luận ........................................................................................................ 47
4.2.Kiến nghị ....................................................................................................... 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
iv
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
TT
Chữ viết tắt
Ký hiệu
1
Vi sinh vật
VSV
2
Microlit
µl
3
Lỗ thạch
LT
4
Optical density - mật độ quang
OD
5
Môi trƣờng cơ bản
MTCB
6
Môi trƣờng tối ƣu
MTTƢ
7
Môi trƣờng nuôi cấy
MTNC
8
35 – dinitrosalicylic
DNS
9
Cellobiohydrolase
CBH
10
Micromet
µm
11
Dalton
DA
12
Vòng /phút
v/p
13
Môi trƣờng thích hợp
MTTH
14
Cellobiohydrolase
CBH
15
Endo glucannase
EG
16
Carboxyl methylcellulose
CMC
17
B – glucanase
BG
18
Phản ứng
p/ứ
19
Aspergillus niger
A.nige
20
Kilodalton
KDa
21
Isoelectrics point
Ip
22
Microlit
µl
v
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1: Một số chất sử dụng trong nghiên cứu ............................................... 15
Bảng 2.2: Một số thuốc thử sử dụng trong nghiên cứu ....................................... 16
Bảng 2.3: Các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm ................................................ 16
Bảng 2.4: Danh sách môi trƣờng sử dụng và thành phần ................................... 17
Bảng 2.5: Trị số OD540 nm đo đƣợc ở các nồng độ đƣờng glucose khác nhau khi
phản ứng với thuốc thử DNS .............................................................................. 21
Bảng 2.6: Trị số OD575 nm đo đƣợc ở các nồng độ đƣờng monogalacturonan
khác nhau khi phản ứng với thuốc thử DNS ....................................................... 24
Bảng 3.1: Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn phân lập ........................ 29
Bảng 3.2. Đƣờng kính vòng phân giảicellulose của các chủng vi khuẩn ........... 31
Bảng 3.3: Đƣờng kính vòng phân giải tinh bột của các chủng vi khuẩn ........... 32
Bảng 3.4: Đƣờng kính vòng phân giải pectin của các chủng vi khuẩn............... 34
Bảng 3.5: Kết quảxác định khả năng phân giải CMC của các chủng vi khuẩn .. 36
Bảng 3.6: Kết quả xác định khả năng phân giải tinh bột của các chủng vi khuẩn
............................................................................................................................. 37
Bảng 3.7: Kết quả xác định khả năng phân giải pectin của các chủng VSV ...... 38
Bảng 3.8: Kết quả tuyển chọn các chủng có hoạt độ của enzyme cellulase,
amylase, pectinase. .............................................................................................. 39
Bảng 3.9: Đặc điểm hình thái khuẩn lạccủa hai chủng vi khuẩn CM và TA ..... 40
Bảng 3.10: Kết quả nhuộm gram các chủng vi khuẩn ........................................ 40
Bảng 3.11: Tổng kết các đặc tính sinh hóa của chủng TA và CM ..................... 41
Bảng 3.12: Phản ứng sinh hóa của vi khuẩn Bacillus subtilis. ........................... 46