vietnam medical journal n01 - MAY - 2019
122
tôi thấp hơn kết quả của Lâm Tiến Tùng [1]
nhóm ROPI có tỉ lệ bệnh nhân ngứa là 16,67%,
nhóm BUPI là 13,33%, có thể do trong nghiên
cứu tác giả sử dụng thêm morphin trong hỗn
hợp gây tê tủy sống cho bệnh nhân.
- Các tác dụng không mong muốn khác:
Trong và sau phẫu thuật, chúng tôi không gặp
bệnh nhân nào đau lưng, đau đầu, run, tê bì
chân, dị ứng thuốc tê, ngộ độc thuốc tê…
V. KẾT LUẬN
Gây tê tủy sống với các liều thuốc tê ropivacain
5mg, 6mg và 7mg phối hợp với fentanyl đều
không ảnh hưởng đến tuần hoàn, hô hấp của
bệnh nhân, tỷ lệ tác dụng không mong muốn
thấp và không có sự khác biệt có ý nghĩa thống
kê giữa ba nhóm. Tỷ lệ gặp các tác dụng không
mong muốn của ba nhóm ROPI 7, ROPI 6 và
ROPI 5 tương ứng là: Tụt huyết áp (10% so với
6,6% và 0%); nôn, buồn nôn (3,3% so với 3,3%
và 0%); ngứa (13,3% so với 13,3% và 6,7%).
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Lâm Tiến Tùng (2016). So sánh hiệu quả vô
cảm và các tác dụng không mong muốn khi gây tê
tủy sống bằng liều thấp của bupivacain với
ropivacain ở nguồi cao tuổi, Luận văn thạc sỹ y
học, Đại học y Hà Nội.
2. F. A. Dar, M. B. Mushtaq and U. M. Khan
(2015). Hyperbaric spinal ropivacaine in lower
limb and hip surgery: A comparison with
hyperbaric bupivacaine. J Anaesthesiol Clin
Pharmacol, 31 (4), 466-470
3. E. Erturk, C. Tutuncu, A. Eroglu et al (2010).
Clinical comparison of 12 mg ropivacaine and 8 mg
bupivacaine, both with 20 microg fentanyl, in spinal
anaesthesia for major orthopaedic surgery in
geriatric patients. Med Princ Pract, 19 (2), 142-147.
4. Y. Y. Lee, W. D. Ngan Kee, K. Muchhal và cộng
sự (2005). Randomized double-blind comparison of
ropivacaine-fentanyl and bupivacaine-fentanyl for
spinal anaesthesia for urological surgery. Acta
Anaesthesiol Scand, 49(10), 1477-1482.
5. D. A. McNamee, A. M. McClelland, S. Scott et
al (2002). Spinal anaesthesia: comparison of
plain ropivacaine 5 mg ml(-1) with bupivacaine 5
mg ml(-1) for major orthopaedic surgery. Br J
Anaesth, 89 (5), 702-706
HOÀN CHỈNH QUY TRÌNH KỸ THUẬT ARMS-PCR KẾT HỢP ĐIỆN DI TỰ ĐỘNG
ĐỂ XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH GEN MTHFR Ở BỆNH NHÂN TIỀN SẢN GIẬT
Nguyễn Thị Trang*, Vũ Tố Giang*
TÓM TẮT33
Theo ước tính của WHO và Uniceft, mỗi năm có
khoảng 585.000 phụ nữ tử vong khi sinh liên quan đến
thai nghén và sinh đẻ, trong đó 90% các ca tử vong
này xảy ra ở các nước đang phát triển. Đứng thứ hai
trong số những nguyên nhân gây tử vong, tiền sản giật
(TSG) là một tình trạng bệnh lý phức tạp thường xảy ra
ở nửa sau của thai kỳ. Đối tượng nghiên cứu gồm 50
mẫu ADN của bệnh nhân tiền sản giật và 50 mẫu ADN
của thai phụ bình thường được sử dụng để hoàn chỉnh
quy trình và xác định đa hình gen C677T và đa hình
A1298C gen MTHFR. Sử dụng kỹ thuật ARMS-PCR để
xác định các đa hình gen. Nghiên cứu thu được tỉ lệ
phát hiện đa hình MTHFR C677T ở nhóm bệnh nhân là
54% và đa hình MTHFR A1298C là 60%.
Từ khóa:
MTHFR, tiền sản giật, đa hình, ARMS-PCR
SUMMARY
COMPLETE THE ARMS-PCR TECHNICAL
PROTOCOL FOR USE TO DETERMINE
MTHFRGEN POLYMORPHISM IN PATIENTS
*Trường Đại học Y Hà Nội
Chịu trách nhiệm chính: Nguyn Thị Trang
Email: trangnguyen@hmu.edu.vn
Ngày nhận bài: 2.3.2019
Ngày phản biện khoa học: 16.4.2019
Ngày duyệt bài: 23.4.2019
WITH PRE-ECLAMPSIA
According to WHO and UNICEF estimates, about
585,000 women die of childbirth in a pregnancy and
childbirth each year, of which 90% of these deaths
occur in developing countries. Second among the
causes of death, pre-eclampsia (TSG) is a complex
medical condition that usually occurs in the second
half of a pregnancy. Subjects of the study include 50
DNA samples of pre-eclampsia patients and 50 DNA
samples of normal pregnant women used to complete
the process and identify polymorphism of C677T gene
and A1298C MTHFR gene polymorphism. Use ARMS-
PCR technique to identify gene polymorphisms. The
study obtained the rate of detection of MTHFR C677T
polymorphism in patients group of 54% and MTHFR
A1298C polymorphism was 60%.
Keywords
: MTHFR, pre-eclampsia, polymorphism,
ARMS-PCR.
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Theo ước tính của WHO và Uniceft, mỗi năm
có khoảng 585.000 phụ nữ tử vong khi sinh liên
quan đến thai nghén và sinh đẻ, trong đó 90%
các ca tử vong này xảy ra ở các nước đang phát
triển [1]. Theo thống kê của WHO, các nguyên
nhân chính gây tử vong là băng huyết (41%),
tiền sản giật (21,3%), nhim khuẩn (18,8%)[1].
Đứng thứ hai trong số những nguyên nhân gây
tử vong, tiền sản giật (TSG) là một tình trạng
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 478 - THÁNG 5 - SỐ 1 - 2019
123
bệnh lý phức tạp thường xảy ra ở nửa sau của
thai kỳ (theo quy định là sau tuần thứ 20 của
quá trình mang thai).
Tỷ lệ mắc tiền sản giật thay đổi tùy theo từng
khu vực trên thế giới. Theo nghiên cứu của Sibai
(1995), ở Hoa Kỳ, tỉ lệ mắc bệnh trong số các
thai phụ là 5-6% [2]. Tại Việt Nam, nghiên cứu
của Trần Thị Khảm (2008) là 3,2% [3]. Những
biến chứng nguy hiểm mà TSG gây ra cho thai
phụ là chảy máu, rau bong non, suy gan suy
thận, sản giật, phù phổi cấp và những biến
chứng gây ra cho thai nhi như thai kém phát
triển trong tử cung, đẻ non, thai chết lưu…
Những năm gần đây, với sự phát triển của
sinh học phân tử, các nhà khoa học đã kiểm tra
hơn 70 gen sinh học đại diện cho các quá trình
sinh lý khác nhau nhằm tìm ra mối liên hệ giữa
biến đổi gen và bệnh tiền sản giật. Trong đó,
biến đổi gen MTHFR liên quan đến nồng độ
homocysteine máu, đặc biệt là nồng độ folate
huyết thanh được nhiều tác giả lựa chọn nghiên
cứu. Tuy nhiên, trên những chủng tộc người
khác nhau, các nhà khoa học thu được các kết
quả trái chiều [4].
Việc xác định các đột biến gen liên quan đến
tiền sản giật sẽ giúp phát hiện sớm nguy cơ tiến
triển bệnh và đưa ra hướng điều trị thích hợp.
Ngoài vấn đề xác định các đa hình/đột biến gen
MTHFR liên quan đến tiền sản giật, thì việc phát
triển một kỹ thuật sinh học phân tử trong y học
là rất cần thiết. Kỹ thuật điện di tự hiện mới
được đưa vào sử dụng ở Việt Nam và chưa có
công bố nào về ứng dụng kỹ thuật này trong xác
định các đa hình/đột biến gen. Mục tiêu của
nghiên cứu gồm:
1.
Hoàn thiện kỹ thuật ARMS-PCR kết hợp
điện di tự động để xác định đa hình gen MTHFR
ở bệnh nhân tiền sản giật.
2.
Mô tả một số đa hình gen MTHFR (C677T
và A1298C) ở bệnh nhân tiền sản giật.
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đi tưng nghiên cu
- Nhóm bệnh gồm bệnh nhân được xác định
tiền sản giật tại bệnh viện Phụ Sản Hà Nội và
nhóm chứng gồm thai phụ bình thường.
- Nghiên cứu được thực hiện tại Trung tâm Tư
vấn Di truyền, Bệnh viện Đại học Y Hà Nội trong
thời gian từtừ tháng 7/2016 đến tháng 2/2019.
2.2.1. Tiêu chuẩn chọn đi tưng nghiên cu
- Huyết áp ≥ 140/90mm Hg sau tuần 20 của
thai kỳ.
- Protein niệu ≥ 300 mg/24 giờ hoặc Protein /
Creatinin niệu ≥ 0,3.
2.2.2. Tiêu chuẩn loại trừ: Những thai phụ
có tình trạng bệnh lý sau không được chọn làm
đối tượng nghiên cứu:
- Bị tăng huyết áp, bệnh tim mạch, bệnh ung
thư, mắc các bệnhnội tiết tự min có hệ thống
khi đang mang thai.
- Bị nhim trùng đặc biệt, nhim trùng thần
kinh, có tiền sử chấn thương sọ não, các bệnh
thoái hóa hệ thần kinh, u não.
- Có các bất thường ở thai, Rh-
- Có các thói quen xấu (thuốc lá, rượu, ma túy).
- Thai phụ không đồng ý tham gia nghiên cứu.
2.2.3. Cỡ mu nghiên cu: 50 mẫu ADN
của bệnh nhân tiền sản giật và 50 mẫu ADN của
thai phụ bình thường được sử dụng để hoàn
chỉnh quy trình và xác định đa hình gen C677T
và đa hình A1298C gen MTHFR.
2.3.Phương pháp nghiên cu: Mẫu máu
ngoại vi của 20 bệnh nhân TSG được tách chiết
ADN bằng kit ADN-express (Lytech, Nga), sau đó
sử dụng kit ARMS (Lytech, Nga) để nhân gen
PCR theo mồi đặc hiệu và tiến hành điện di tự
động để xác định kiểu gen của từng bệnh nhân.
Bảng 1. Trình tự cặp mồi của các đa hình C677T (Ala222Val)và A1298C (Glu429Ala)
gen MTHFR.
Gen
Trình tự mồi
Chiều dài
(µM)
Kích thước sản
phẩm (bp)
C677T
677-Common F:
5’-CCAGCCACTCACTGTTTTAGTTCAGGC-3’
677-C:
5’-TTGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGCGC-3’
677-T:
5’-TTGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGCGT-3’
0,4
0,4
0,4
407
407
407
A1298C
1298-Common F:
5’-GAAGAAGTTTGCATGCTTGTGGTTG-3’
1298-A: 5’-GAGGAGCTGACCAGTGATGA-3’
1298-C: 5’-GAGGAGCTGACCAGTGATGC-3’
0,5
0,5
0,5
593
593
593
2.4. Xử lý s liệu: Sau khi nhân gen PCR tiến hành điện di trên máy điện di tự động Qsep100TM.
Các số liệu được xử lý bằng phần mềm SPSS16.0
vietnam medical journal n01 - MAY - 2019
124
2.5. Đạo đc trong nghiên cu
- Nghiên cứu được tiến hành sau khi được phép
của hội đồng đạo đức trường đại học Y Hà Nội.
- Cam kết tiến hành nghiên cứu với tinh thần
trung thực, số liệu nghiên cứu chưa từng được
công bố dưới bất kỳ hình thức nào.
III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Hoàn thiệnkỹ thuật ARMS-PCR kết hp
điện di tự động để xác định đa hình gen MTHFR
3.1. Tách chiết AND: 100 mẫu nghiên cứu
được tách ADN bằng phương pháp ADN-express,
tuy nhiên chúng tôi giảm thể tích máu và dung
dịch tách ADN so với protocol hướng dẫn của
hãng. Cụ thể, lượng máu ngoại vilà 200µl và
dung dịch tách AND là 200µl, thay vì 550µl máu
ngoại vi và 550 µl dung dịch tách AND như trong
protocol. Tiến hành kiểm tra độ tinh sạch đạt
chuẩn thu được kết quả sau:
Bảng 2. Kết quả đo nồng độ tinh sạch ADN theo phương pháp ADN-express
Mu
Nồng độ ADN (ng/µl)
Độ tinh sạch
Nhóm bệnh: Trung bình
352,7
1,83
Thấp nhất
106,3
1,75
Cao nhất
419,8
1,94
Nhóm chng: Trung bình
385,9
1,9
Thấp nhất
213,4
1,78
Cao nhất
516,4
1,95
Nhận xét:
Lượng ADN thu được từ các mẫu tương đối cao và ổn định.
3.2. Tỷ lệ xuất hiện kiểu gen C677T và A1298C
Bảng 3. Tỉ lệ xuất hiện các kiểu gen C677T và A1298C
C677T
CT
TT
C
T
Nhóm bệnh(n=50)
18
(36,0)
9
(18,0)
32(64,0%)
18
(36,0 %)
Nhóm chng(n=50)
23
(46,0)
0
(0,0%)
27
(54,0)
23
(46,0)
P
0,0084
0,0001
0,004
0,0002
OR (95%CI)
0,66 (0.30
– 1.47)
23,12 (1.31
– 409.15)
0,33 (0.29
– 0.99)
1,88
(1.01 – 3.50)
A1298C
AC
CC
A
C
Nhóm bệnh (n=50)
26
(52,0%)
4
(8,0%)
33
(66,0%)
17
(34,0)
Nhóm chng
11
(22%)
0
45
5
P
0,003
0,0016
0,0001
0,0005
OR
3,84 (1.61
– 9.16)
9,77 (0.51
– 186.53)
0,24 (0.11
– 0.51)
4,17 (1.97
– 8.83)
Nhận xét:
Xét nghiệm gen C677T ở nhóm
bệnh nhân, có 23 bệnh nhân có kiểu gen đồng
hợp CC, chiếm tỉ lệ 46%, 18 bệnh nhân có kiểu
gen dị hợp đột biến CT (36%) và 9 bệnh nhân có
kiểu gen đồng hợp đột biến TT (18%). Như vậy
số bệnh nhân mang gen đột biến là 27, chiếm
54%. Trong khi đó ở nhóm chứng, 27 người
(54%) có kiểu gen đồng hợp CC và 23 (46%)
người có kiểu gen dị hợp đột biến CT, không
phát hiện đối tượng mang đồng hợp TT trong
nhóm nghiên cứu.
Xét nghiệm gen A1298C ở nhóm bệnh nhân,
có 30 bệnh nhân (60%) mang gen đột biến,
trong đó 26 bệnh nhân có kiểu gen dị hợp đột
biến AC (52%) và 4 bệnh nhân có kiểu gen đồng
hợp đột biến CC (8%)có 20 bệnh nhân có kiểu
gen đồng hợp AA , chiếm tỉ lệ 40%, Trong khi đó
ở nhóm chứng, 39 người (78%) có kiểu gen
đồng hợp CC và 11 người có kiểu gen dị hợp đột
biến AA (22%), không phát hiện đối tượng mang
đồng hợp AC trong nhóm nghiên cứu.
IV. BÀN LUẬN
Nghiên cứu này sử dụng kỹ thuật ARMS-PCR
kết hợp điện di tự động để xác định đa hình gen
MTHFR ở bệnh nhân tiền sản giật. Chúng tôi
nhận thấy kỹ thuật này đơn giản, tiết kiệm thời
gian, giảm giá thành, cho hình ảnh rõ ràng,
chính xác.
4.1. Mô tả đa hình MTHFR C677T ở bệnh
nhân tiền sản giật. Phân tích kết quả điện di
sau khi tiến hành ARMS-PCR trên 50 mẫu ADN
của 50 bệnh nhân tiền sản giật, nhận thấy tỷ lệ
xuất hiện đa hình khá cao ở nhóm này với 27
trường hợp (54%), cụ thể có 9 trường hợp mang
kiểu gen đồng hợp tử đột biến, chiếm 18%, 18
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 478 - THÁNG 5 - SỐ 1 - 2019
125
trường hợp mang alen đột biến, chiếm 36%, số
cá thể không mang đột biến là 23, chiếm 46%.
Nghiên cứu của chúng tôi tiến hành mô tả đa
hình gen MTHFR C677T ở bệnh nhân tiền sản giật
tại Việt Nam. Cho đến nay, đây là nghiên cứu đầu
tiên ở nước ta về vấn đề này. Do đó, chưa có kết
quả nào của các tác giả trong nước để so sánh.
Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về đa
hình gen MTHFR C677T ở đối tượng bệnh nhân
tiền sản giật nhưng thu được kết quả khác nhau
tùy từng nghiên cứu. Chedraui và cộng sự (2014)
[5] kết luận có mối liên quan giữa đa hình gen
C677T gen MTHFR với tiền sản giật. Wu X và
cộng sự (2015) thực hiện nghiên cứu trên 7398
bệnh nhân tiền sản giật và 11230 thai phụ bình
thường, kết quả đã chứng minh đa hình C677T
gen MTHFR có liên quan đến tiền sản giật [6].
Kết quả thu được đã không nhận thấy sự
khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa đa hình
C677T gen MTHFR ở nhóm bệnh và nhóm
chứng. Cụ thể tần số của kiểu gen CC ở 3 nhóm
lần lượt là 58,6%, 64,1% và 57,1% và đồng hợp
tử biến đổi TT (9,0%, 5,1% và 5,4%). Không có
sự khác biệt đáng kể về tần số allen của T
(25,2%, 20,5% và 24,1% đối với cả 3 nhóm). Từ
đó, họ kết luận sự đa hình của MTHFR C677T
không có vai trò chính trong sự phát triển của
chứng tiền sản giật hoặc rau bong non ở người
Phần Lan [7].
Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy tỷ lệ xuất
hiện đa hình C677T gen MTHFR ở nhóm bệnh
nhân tiền sản giật khá cao. Tuy nhiên, đây là
nghiên cứu thiên về hoàn chỉnh quy trình kỹ
thuật, thực hiện với cỡ mẫu bé. Vậy nên kết quả
này chưa thể khẳng định được mối liên quan
giữa đa hình gen C677T gen MTHFR với tiền sản
giật trên đối tượng người Việt Nam.
4.2. Mô tả đa hình MTHFR A1298C ở
bệnh nhân tiền sản giật.
Khi phân tích đa hình A1298C gen MTHFR ở
20 bệnh nhân tiền sản giật, nhận thấy tỷ lệ xuất
hiện đột biến ở nhóm bệnh nhân này cũng khá
cao, cụ thể có 4 trường hợp mang kiểu gen đồng
hợp tử đột biến, chiếm 8%, 26 trường hợp mang
dị hợp alen đột biến, chiếm 52%, còn lại 20
(40%) trường hợp không bị đột biến.
Các nghiên cứu trên thế giới: Klai và cộng sự
(2011) nghiên cứu trên 203 bệnh nhân tiền sản
giật, kết quả cho thấy có mối liên quan giữa đa
hình gen A1298C gen MTHFR với sự gia tăng
nồng độ homosystein trong huyết thanh [8]. Tuy
nhiên, rất nhiều nghiên cứu khác chỉ ra rằng, đa
hình gen A1298C gen MTHFR không có mối liên
quan trực tiếp đến tiền sản giật như nghiên cứa
của Wu X và cộng sự (2015) [6]. Mặc dù vậy,
các tác giả trên vẫn đề nghị nên tiến hành
nghiên cứu xác định đa hình gen A1298C ở bệnh
nhân có tiền sử tiền sản giật, góp phần phát hiện
mối liên quan của đa hình này với các yếu tố gây
tiền sản giật.
V. KẾT LUẬN
Hoàn thiện thành công kỹ thuật ARMS-PCR
kết hợp điện di tự động để xác định đa hình gen
MTHFR ở bệnh nhân tiền sản giật.
Về đa hìnhMTHFR C677T có 27 bệnh nhân
(54%) mang gen, trong đó 18 trường hợp (36%)
mang dị hợp tử và 9 trường hợp (18%) mang
đồng hợp đột biến. Tỉ lệ này ở nhóm chứng là
46%, không tìm thấy đối tượng mang gen đồng
hợp. Về đa hình MTHFR A1298C, có 30 bệnh
nhân (60%) mang gen, 26 trường hợp (52%)
mang dị hợp tử và 4 trường hợp (8%) mang
đồng hợp đột biến. Chỉ có 11 trường hợp (22%)
tại nhóm chứng phát hiện đột biến gen thể dị
hợp, không phát hiện đồng hợp đột biến.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Unicef. Tỷ lệ tử vong mẹ đang giảm tại các nước
có thu nhập trung bình nhưng phụ nữ tại các nước
có thu nhập thấp vẫn đang bị tử vong trong thời
kỳ mang thai và trong khi sinh con. [online].
Available at:https:// www.unicef.org/ vietnam/vi/
media_7456.html [Accessed 15 August 2016].
2. Sibai B.M and Mohamed (1995). Pre eclampsia
and eclampsia. Gynecology and Obs (Sciarra) 1995
(3), 1-14.
3. Trần Thị Khảm (2008). Nghiên cứu một số chỉ
số hóa sinh và huyết học ở sản phụ tiền sản giật
tại Bệnh viện phụ sản Trung ương từ 7/2006 đến
6/2008, Luận văn tốt nghiệp bác sỹ chuyên khoa
II, Trường Đại học Y Hà Nội.
4. Williams, P. J., & Pipkin, F. B. (2011). The
genetics of pre-eclampsia and other hypertensive
disorders of pregnancy. Best practice & research
Clinical obstetrics & gynaecology, 25(4), 405-417.
5. Chedraui, P., Salazar-Pousada, D., Villao, A.,
et al (2014). Polymorphisms of the
methylenetetrahydrofolate reductase gene (C677T
and A1298C) in nulliparous women complicated
with preeclampsia. Gynecological Endocrinology,
30(5), 392-396.
6. Wu, X., Yang, K., Tang, X., et al (2015). Folate
metabolism gene polymorphisms MTHFR C677T
and A1298C and risk for preeclampsia: a meta-
analysis. Journal of assisted reproduction and
genetics, 32(5), 797-805.
7. Jääskeläinen, E., Keski-Nisula, L., Toivonen,
S., et al (2006). MTHFR C677T polymorphism is
not associated with placental abruption or
preeclampsia in Finnish women. Hypertension in
pregnancy, 25(2), 73-80.
8. Klai, S., Fekih-Mrissa, N., El Housaini, S., et al
(2011). Association of MTHFR A1298C
polymorphism (but not of MTHFR C677T) with
elevated homocysteine levels and placental
vasculopathies. Blood Coagulation & Fibrinolysis,
22(5), 374-378.