Luận án Tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu tác dụng và cơ chế hạ glucose máu của dịch ép thân cây chuối tiêu (Musa x paradisiacal L.) trên thực nghiệm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ ĐÔNG

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG VÀ CƠ CHẾ HẠ GLUCOSE MÁU CỦA DỊCH ÉP THÂN CÂY CHUỐI TIÊU (MUSA X PARADISIACA L.) TRÊN THỰC NGHIỆM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI, NĂM 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THNGUYNGUYÊNNỄN THỊ ĐÔNGỊ ĐÔNG

NGUYỄN THỊ ĐÔNG

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG VÀ CƠ CHẾ HẠ GLUCOSE MÁU CỦA DỊCH ÉP THÂN CÂY CHUỐI TIÊU (MUSA X PARADISIACA L.) TRÊN THỰC NGHIỆM LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: HÓA SINH DƯỢC MÃ SỐ: 62720408 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Phùng Thanh Hương GS.TS. Nguyễn Hải Nam

HÀ NỘI, NĂM 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi.

Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng

được ai công bố trong bất kỳ một công trình nào khác.

Tác giả luận án

Nguyễn Thị Đông

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập và hoà n thà nh luận án, tôi đã nhận được sự hướ ng dẫn, giú p đỡ quý bá u của cá c nhà Khoa học, các thầy cô giáo, cá c anh chi ̣, cá c em, cá c bạn bè đồng nghiệp và gia đình.

Vớ i lò ng kính trọng và biết ơn sâu sắ c nhất tôi xin được bà y tỏ lòng biết ơn chân thà nh tớ i PGS. TS. Phùng Thanh Hương, GS.TS. Nguyễn

Hải Nam, hai người Thầy tâm huyết, tận tình luôn sát cánh bên tôi quan

tâm giúp đỡ cũng như động viên tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên

cứu và hòan thành luận án này.

Lời cảm ơn tiếp theo, tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giá m hiê ̣u

trường Trường Đại học Dược Hà Nội, Trường Cao đẳng Dược Trung

ương Hải Dương, đã tạo điều kiện cho tôi được học tập và nghiên cứu.

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thày giáo, cô giáo, anh chị em kỹ

thuật viên Bộ môn Hóa sinh, Bộ môn Dược lực, Phò ng Sau đại học Trường

Đại Học Dược Hà Nội, Bộ môn Hóa dược Trường Cao đẳng Dược Trung ương Hải Dương, đã tạo mọi điều kiê ̣n thuận lợi giú p đỡ tôi trong quá trình học tập và hoà n thà nh luận án.

Trong quá trình làm thực nghiệm tại Khoa Sinh hóa và Huyết học,

Khoa Giải phẫu bệnh- Bệnh viện Đa khoa tỉnh Hải Dương. Viện Hóa sinh

biển- Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam, Khoa Hóa sinh và Vi sinh, Đại

học Hóa học và Công nghệ Praha, Cộng hòa Czech. Tôi đã nhận được sự

giúp đỡ về điều kiện về trang thiết bị, hóa chất và kỹ thuật giúp tôi hoàn

thành luận án. Xin được bày tỏ lòng biết ơn tới các chuyên gia,các Bác sĩ,

Dược sĩ, các anh chị em kỹ thuật viên tại các cơ quan trên.

Xin gử i lời cả m ơn tớ i bạn bè , cá c em sinh viên Trường Đại học

Dược Hà Nội, các anh chi ̣ em đồng nghiệp Trường Cao đẳng Dược Trung

ương Hải Dương, luôn động viên và giú p đỡ tôi trong thời gian qua.

Lời cảm ơn cuối cùng tôi muốn giành tặng cho những người thân

trong gia đình đã luôn ở bên cạnh động viên, giú p đỡ và giành mọi thời

gian để tôi học tập là m viê ̣c và hoà n thà nh luận án này.

NCS. Nguyễn Thị Đông

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1

1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG ............................................. 3

1.1.1. Định nghĩa, dịch tễ, phân loại đái tháo đường ................................................... 3

1.1.1.1. Định nghĩa .......................................................................................... 3

1.1.1.2. Dịch tễ ................................................................................................. 3

1.1.1.3. Phân loại đái tháo đường .................................................................... 3

1.1.1.4. Tiêu chuẩn chẩn đoán ......................................................................... 4 1.1.2. Cơ chế bệnh sinh ..................................................................................................... 5

1.1.2.1. Bệnh sinh của đái tháo đường typ 1 ................................................... 5

1.1.2.2. Bệnh sinh của đái tháo đường typ 2 ................................................... 7

1.2. CÁC CƠ CHẾ GÂY HẠ GLUCOSE MÁU .................................................. 10

1.2.1. Tăng cường số lượng insulin nội sinh ............................................................... 10

1.2.1.1. Tăng cường số lượng insulin thông qua ức chế kênh KATP, tăng

nồng độ calci nội bào ................................................................................................ 10

1.2.1.2. Tăng cường số lượng insulin thông qua các incretin ....................... 12

1.2.1.3. Tăng cường số lượng insulin thông qua ức chế DPP-4 .................... 12

1.2.2. Tăng cường nhạy cảm của mô đích với insulin ................................................ 14

1.2.2.1. Tăng cường nhạy cảm của mô đích với insulin thông qua hoạt hóa

AMPK ....................................................................................................................... 14

1.2.2.2. Tăng cường nhạy cảm của mô đích với insulin thông qua receptor

PPAR ....................................................................................................................... 15

1.2.2.3. Tăng cường nhạy cảm của mô đích với insulin thông qua quá

trình truyền tín hiệu của insulin ................................................................................ 16

1.2.3. Tác dụng điều hòa, chuyển hóa tương tự như insulin .................................... 17

1.2.3.1. Tác dụng tương tự insulin thông qua các enzym .............................. 18

1.2.3.2. Tác dụng tương tự insulin thông qua hoạt hóa GLUT4 ................... 19

1.2.4. Ức chế tiêu hóa carbohydrat ................................................................................ 19

1.2.5. Các cơ chế khác gây hạ glucose máu ................................................................. 20

1.3. CÁC MÔ HÌNH THỰC NGHIỆM TRONG NGHIÊN CỨU THUỐC

ĐIỀU TRỊ ĐÁI THÁO ĐƯỜNG ........................................................................... 21

1.3.1. Các mô hình thực nghiệm in vivo ....................................................................... 21

1.3.1.1. Mô hình gây bệnh ĐTĐ typ 1 ........................................................... 21

1.3.1.2. Mô hình gây bệnh ĐTĐ typ 2 ........................................................... 22

1.3.2. Các mô hình thực nghiệm in vitro ...................................................................... 24

1.3.2.1. Đánh giá tác động lên hoạt tính của các enzym tiêu hóa và chuyển

hóa glucid .................................................................................................................. 24

1.3.2.2. Đánh giá khả năng bài tiết insulin của tế bào β đảo tụy ................... 25

1.3.2.3. Đánh giá mức độ nhạy cảm của mô đích với insulin ....................... 25

1.4. CÂY CHUỐI TIÊU ......................................................................................... 26

1.4.1. Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật .................................................................. 26

1.4.1.1. Vị trí phân loại .................................................................................. 26

1.4.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố .......................................................... 27

1.4.2. Bộ phận dùng ......................................................................................................... 27

1.4.3. Các nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng dược lý của cây

chuối tiêu (Musa x paradisiaca L.) ................................................................................ 27

1.4.3.1. Nghiên cứu về thành phần hoá học .................................................. 28

1.4.3.2. Nghiên cứu về tác dụng dược lý ....................................................... 29

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 32

2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU......................................................................... 32

2.1.1. Dược liệu nghiên cứu ........................................................................................... 32

2.1.2. Động vật thí nghiệm .............................................................................................. 32

2.1.3. Các dòng tế bào cho nghiên cứu in vitro ............................................................ 33

2.2. DỤNG CỤ, HÓA CHẤT NGHIÊN CỨU ...................................................... 33

2.2.1. Thiết bị, dụng cụ .................................................................................................... 33

2.2.2. Thuốc và hóa chất nghiên cứu ............................................................................ 34

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................. 35

2.3.1. Phương pháp điều chế mẫu nghiên cứu ............................................................ 38

2.3.1.1. Điều chế cắn toàn phần ..................................................................... 38

2.3.1.2. Điều chế cắn phân đoạn .................................................................... 38

2.3.1.3. Phương pháp pha mẫu thử ................................................................ 38

2.3.2. Phương pháp đánh giá tác dụng hạ glucose máu thực nghiệm trên chuột . 39

2.3.2.1.Trên chuột nhắt trắng tăng glucose máu thực nghiệm bởi STZ liều

150 mg/kg ................................................................................................................. 39

2.3.2.2. Trên chuột cống trắng ĐTĐ typ 2 thực nghiệm ............................... 40

2.3.2.3. Trên khả năng dung nạp glucose của chuột cống trắng ĐTĐ typ 2

thực nghiệm .............................................................................................................. 43

2.3.3. Các kỹ thuật định lượng hóa sinh trong thực nghiệm in vivo ........................ 44

2.3.3.1. Định lượng glucose máu ................................................................... 44

2.3.3.2. Định lượng insulin huyết thanh ........................................................ 45

2.3.3.3. Định lượng cholesterol toàn phần huyết thanh ................................. 46

2.3.3.4. Định lượng triglycerid huyết thanh .................................................. 47

2.3.4. Kỹ thuật xét nghiệm mô bệnh học ....................................................................... 47

2.3.5. Phương pháp xác định hoạt độ enzym G6Pase gan (EC 3.1.3.9) .................. 48

2.3.6. Phương pháp đánh giá khả năng ức chế các enzym in vitro .......................... 49

2.3.6.1. Đánh giá khả năng ức chế enzym α-amylase (EC 3.2.1.1) .............. 49

2.3.6.2. Đánh giá khả năng ức chế enzym α-glucosidase (EC 3.2.1.20) ....... 51

2.3.6.3. Đánh giá khả năng ức chế protein tyrosin phosphatase 1B

(PTP1B - EC 3.1.3.48) .............................................................................................. 52

2.3.7. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng trên sự phosphoryl hóa AMPK và

IRS-1 .................................................................................................................................. 53

2.3.8. Phương pháp đánh giá khả năng ức chế sự biệt hóa của tế bào mô mỡ

3T3-L1 ................................................................................................................................ 56

2.3.9. Các phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học của cắn toàn phần

thân cây chuối tiêu ........................................................................................................... 57

2.3.9.1. Định tính các nhóm chất hóa học ..................................................... 57

2.3.9.2. Phân lập chất ..................................................................................... 57

2.3.9.3. Xác định cấu trúc .............................................................................. 57

2.3.10. Xử lý số liệu .......................................................................................................... 58

CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................................... 59

3.1. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG HẠ GLUCOSE MÁU TRÊN

ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM .............................................................................. 59

3.1.1. Kết quả tác dụng hạ glucose máu của cắn toàn phần ..................................... 59

3.1.1.1. Tác dụng của cắn toàn phần trên glucose máu của chuột tiêm STZ

liều 150mg/kg ........................................................................................................... 59

3.1.1.2. Tác dụng của cắn toàn phần trên glucose máu của chuột ĐTĐ typ

2 ................................................................................................................................ 60

3.1.1.3. Tác dụng của cắn toàn phần trên khả năng dung nạp glucose của

chuột ĐTĐ typ 2 ....................................................................................................... 62

3.1.2. Kết quả tác dụng của cắn phân đoạn ................................................................. 64

3.1.2.1. Tác dụng của cắn phân đoạn trên glucose máu của chuột tiêm

STZ liều 150mg/kg ................................................................................................... 64

3.1.2.2. Tác dụng của cắn phân đoạn trên chuột ĐTĐ typ 2 ......................... 66

3.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CẮN

TOÀN PHẦN THÂN CÂY CHUỐI TIÊU ............................................................... 68

3.2.1. Kết quả định tính các nhóm chất ........................................................................ 68

3.2.2. Kết quả phân lập các hợp chất trong phân đoạn ethylacetat .......................... 69

3.2.2.1. Nhận dạng hợp chất 1 (FE1C) .......................................................... 69

3.2.2.2. Nhận dạng hợp chất 2 (FE6B) .......................................................... 71

3.2.2.3. Nhận dạng hợp chất 3 (FE10A) ........................................................ 72

3.2.2.4. Nhận dạng các chất 4 (FE12A) ........................................................ 73

3.2.3. Kết quả phân lập các hợp chất trong phân đoạn n-butanol ............................ 75

3.2.3.1. Nhận dạng hợp chất 5 (FB2A) ......................................................... 76

3.3.3.2. Nhận dạng hợp chất 6 (FB2B) .......................................................... 78

3.3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CƠ CHẾ HẠ GLUCOSE MÁU CỦA CẮN

TOÀN PHẦN THÂN CÂY CHUỐI TIÊU ........................................................... 79

3.3.1. Kết quả trên các mô hình thực nghiệm in vivo ................................................. 79

3.3.1.1. Nồng độ insulin huyết thanh ............................................................. 79

3.3.1.2. Tình trạng mô tụy nội tiết và tế bào β của chuột ĐTĐ typ 2 ........... 84

3.3.1.3. Nồng độ lipid huyết thanh ................................................................ 85

3.3.1.4. Kết quả trên hoạt độ enzym G6Pase gan ......................................... 86

3.3.2. Kết quả trên các mô hình thực nghiệm in vitro ................................... 89

3.3.2.1. Tác dụng ức chế enzym α-amylase .................................................. 89

3.3.2.2. Tác dụng ức chế enzym α-glucosidase ............................................. 90

3.3.2.3. Tác dụng ức chế enzym PTP1B ....................................................... 92

3.3.2.4. Tác dụng ức chế sự phosphoryl hóa IRS-1(Ser 307) trên dòng tế

bào cơ vân chuột nhắt C2C12 ..................................................................................... 93

3.3.2.5. Tác dụng hoạt hoá AMPK trên dòng tế bào cơ vân nguyên phát

chuột nhắt C2C12 ....................................................................................................... 95

3.3.2.6. Tác dụng trên sự biệt hóa tế bào 3T3-L1 ......................................... 98

CHƯƠNG IV. BÀN LUẬN .................................................................................... 99

4.1.1. Lựa chọn liều thử nghiệm .................................................................................... 99

4.1.2. Tác dụng của cắn toàn phần .............................................................................. 100

4.1.2.2.Trên chuột tiêm STZ liều 150 mg/kg .............................................. 100

4.1.2.2. Trên chuột cống ĐTĐ typ 2 ............................................................ 102

4.1.2.3. Trên khả năng dung nạp glucose của chuột cống ĐTĐ typ 2 ........ 104

4.1.3. Tác dụng của cắn phân đoạn ............................................................................. 105

4.2. VỀ VIỆC PHÂN LẬP CHẤT TRONG PHÂN ĐOẠN CÓ TÁC DỤNG

HẠ GLUCOSE MÁU CHIẾM ƯU THẾ ............................................................ 106

4.3. VỀ CƠ CHẾ TÁC DỤNG HẠ GLUCOSE MÁU CỦA THÂN CÂY

CHUỐI TIÊU ........................................................................................................ 111

4.3.1. Cơ chế hạ glucose máu ở mức độ cơ thể .......................................................... 112

4.3.1.1. Về tác dụng trên nồng độ insulin huyết thanh ................................ 112

4.3.1.2. Về tác dụng tăng dung nạp glucose trong test dung nạp glucose

bằng đường uống .................................................................................................... 114

4.3.1.3. Về tác dụng trên nồng độ lipid huyết thanh ................................... 114

4.3.2. Cơ chế hạ glucose máu ở mức độ tế bào, phân tử .......................................... 116

4.3.2.1. Về tác dụng trên mô tụy nội tiết và tế bào β của chuột ĐTĐ typ 2 116

4.3.2.2. Về tác dụng trên sự biệt hóa tế bào mỡ 3T3-L1 ............................. 118

4.3.2.3. Về khả năng ức chế enzym tiêu hóa glucid .................................... 119

4.3.2.4. Về tác dụng ức chế PTP1B ............................................................. 122

4.3.2.5. Về tác dụng ức phosphoryl hóa IRS-1(Ser 307) ............................ 124

4.3.2.6. Về tác dụng hoạt hóa AMPK .......................................................... 126

4.2.2.7. Về tác dụng ức chế G6Pase gan ..................................................... 127

4.4. BÀN LUẬN CHUNG ..................................................................................... 129

KẾT LUẬN ............................................................................................................ 135

1. Tác dụng hạ glucose máu của cắn toàn phần thân cây chuối tiêu .................. 135

2. Cơ chế hạ glucose máu của thân cây chuối tiêu .................................................. 135

2.1. Trên chuyển hoá..................................................................................................... 135

2.2. Trên sự nhạy cảm của mô đích với insulin ....................................................... 136

2.3. Trên chuyển hoá và tăng nhạy cảm của tế bào mô đích với insulin ............ 136

ĐỀ XUẤT .............................................................................................................. 136

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN

LUẬN ÁN

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

TÊN ĐẦY ĐỦ

VIẾT TẮT ACC Ac-CoA ADA

AICAR Akt AMPK ARB Cho TP CXCL DAG Db/db DMEM

Acetyl-coA carboxylase Acetyl-CoA Hiệp hội đái tháo đường Mỹ (American Diabetes Association) Aminoimidazol-4-carboxamid Ribosid The serine/threonine kinase Adenosine monophosphate activated protein kinase Angiotensin receptor blocker Cholesterol toàn phần Chemokine ligand Diacylglycerol Diabetes Môi trường nuôi cấy tế bào (Dulbecco’s modified eagle medium) Dimethyl sulfoxid Dipeptidyl peptidase-4 Đái tháo đường Electro chemiluminessance Immuno Assay

DMSO DPP-4 ĐTĐ ECLIA F1,6BPase Fructose-1,6-biphosphatase FBS FDA

Huyết thanh bào thai bê (Fetal bovine serum) Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (Food and drug administration) Acid béo tự do (Free fatty acid) Glucose6phosphatase Glucose dehydrogenase Glucose-dependent insulinotropic polypeptid Glucokinase Glucagon-like peptide 1 Glucagonlike pepdid-1 Hệ vận chuyển glucose (Glucose-transporter) Ghrelin o-acyltransferase Glucose oxidase Glycogen phosphorylase G protein-coupled receptors

FFA G6Pase GDH GIP GK GLP-1 GLP-1 GLUT GOAT GOD GP GPR

TÊN ĐẦY ĐỦ

VIẾT TẮT GSH GSK-3 HbA1C HDACs HEPES HLA

HMGB1 HOMA HS IC50 IKK IL IRS JNK LC-CoA LDL NaCMC NF-κB NOD NPPH OB/OB p-AMPK

PĐ PI3 PI3K PPAR PTP1B SGLT STZ SUR TG TP WHO

Glutathione Glycogen synthase kinase-3 Hemoglobin A1C Histone deacetylase 4-(2- hydroxyethyl)-1-piperazineethane sulfonic acid Kháng nguyên liên kết tế bào lympho (Human Leukocyte Antigen) High-mobility-group 1 Homeostasis model assessment Huyết thanh ngựa (Horse Serum) Nồng độ ức chế 50% Inhibitory κB kinase Interleukin Insulin receptor substrate Jun N-terminal kinase Long chair-CoA Low densyti lipoprotein Sodium carboxy methyl cellulose Nuclear factor κB nonobese diabetic 2,2-diphenyl -1-picrylhydrazyl Obese Adenosine monophosphate activated protein kinase trong đó phân tử threonin172 đã được phosphoryl hóa Phân đoạn Phosphatidylinositol 3 Phosphatidylinositol 3-kinase Peroxisome proliferator-activated receptors protein-tyrosine phosphatase 1B Na+/glucose cotransporter Streptozocin Sulfunylurea receptor Triglycerid Toàn phần Tổ chức y tế thế giới (World Heath Organization)

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

TRANG 4

TT 1

2 41

3 49

4 51

5 53

6 59

7 61

8 62

9 65

NỘI DUNG Bả ng 1.1. Tiêu chuẩn chẩn đoá n ĐTĐ và tiền ĐTĐ của WHO và ADA Bảng 2.1. Thành phần dinh dưỡng trong khẩu phần ăn của chuột thí nghiệm Bảng 2.2 Thành phần phản ứng đánh giá tác dụng ức chế enzym α-amylase Bảng 2.3. Thành phần phản ứng đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase Bảng 2.4. Thành phần phản ứng đánh giá tác dụng ức chế PTP1B Bảng 3.1. Nồng độ glucose máu chuột tăng glucose máu thực nghiệm bằng STZ (150 mg/kg) sau 15 ngày uống mẫu thử Bảng 3.2. Nồng độ glucose máu của chuột cống ĐTĐ typ 2 sau 15 ngày uống mẫu thử Bảng 3.3. Nồng độ glucose máu của các lô chuột ĐTĐ typ 2 thực nghiệm sau khi uống dung dịch glucose Bảng 3.4. Nồng độ glucose máu của các lô chuột tăng glucose máu bằng STZ (150mg/kg) sau 15 ngày uống các hỗn dịch cắn phân đoạn

10 Bảng 3.5. Nồng độ glucose máu của chuột cống ĐTĐ typ 2 67

sau 15 ngày uống hỗn dịch cắn phân đoạn

11 Bảng 3.6. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất 70

FE1C và chất tham khảo

12 Bảng 3.7. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất 71

FE6B và chất tham khảo

13 Bảng 3.8. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất 72

FE10A và chất tham khảo

14 Bảng 3.9. Dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR của hợp chất 74

FB12A và chất tham khảo

15 Bảng 3.10. Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất 77

FB2A và tài liệu tham khảo

16 Bảng 3.11. Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất 78

FB2B và tài liệu tham khảo

11 Bảng 3.12. Nồng độ insulin huyết thanh của các lô chuột tiêm 80

STZ 150 mg/kg sau 15 ngày uống mẫu thử

18 Bảng 3.13. Ảnh hưởng của chế độ ăn giàu chất béo kết hợp STZ 81

TT

NỘI DUNG

TRANG

(50 mg/kg) trên một số chỉ số sinh học của chuột cống trắng 19 Bảng 3.14. Chức năng tế bào β và chỉ số kháng insulin của 82

các lô chuột cống béo phì tiêm STZ liều 50 mg/kg

20 Bảng 3.15. Nồng độ insulin huyết thanh của chuột cống ĐTĐ 83

typ 2 sau 15 ngày uống mẫu thử

21 Bảng 3.16. Nồng độ triglycerid và cholesterol toàn phần huyết 85

thanh của chuột ĐTĐ typ 2 sau 15 ngày uống mẫu thử

87 22 Bảng 3.17. Hoạt độ G6Pase gan của các lô chuột tiêm STZ

150 mg/kg sau 15 ngày uống mẫu thử

23 Bảng 3.18. Hoạt độ enzym G6Pase gan của chuột ĐTĐ typ 2 88

sau 15 ngày uống hỗn dịch cắn toàn phần

24 Bảng 3.19. Kết quả tác dụng ức chế enzym α- amylase in vitro 89

của cắn toàn phần thân cây chuối tiêu

25 Bảng 3.20. Khả năng ức chế enzym α-amylase của các chất 90

phân lập từ thân cây chuối tiêu

26 Bảng 3.21. IC50 của các chất có tác dụng ức chế α-amylase 27 Bảng 3.22. Kết quả tác dụng ức chế enzym α- glucosidase in 90 91

vitro của cắn toàn phần thân cây chuối tiêu

28 Bảng 3.23. Khả năng ức chế enzym α-glucosidase của các 91

chất phân lập từ thân cây chuối tiêu

92 29 Bảng 3.24. IC50 của các chất có tác dụng ức chế α-

glucosidase

30 Bảng 3.25. Kết quả tác dụng ức chế PTP1B in vitro của cắn 92

toàn phần

31 Bảng 3.26. Khả năng ức chế PTP1B của của các chất phân 93

lập từ thân cây chuối tiêu

93 32 Bảng 3.27. IC50 của các chất có tác dụng ức chế PTP1B

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

NỘI DUNG

TT 1 Hình 1.1. Sự phá hủy của tế bào β trong cơ chế bệnh sinh của TRANG 6

ĐTĐ typ 1

2 Hình 1.2. Con đường truyền tín hiệu của insulin trong chuyển hóa 7

glucose

9 11 13 14 3 Hình 1.3. Acid béo tự do với sự kháng insulin 4 Hình 1.4. Cơ chế tác dụng của các thuốc nhóm sulfunylure 5 Hình 1.5. Cơ chế tác dụng của các thuốc ức chế DPP4 6 Hình 1.6. Cơ chế tác dụng giảm kháng insulin thông qua hoạt hoá AMPK

7 Hình 1.7. Cơ chế truyề n tín hiê ̣u của PPAR 8 Hình 1.8. Liên quan giữa insulin và GLUT4 9 Hình 1.9. Cây chuối tiêu chụp ở xã Giang Sơn, huyện Gia Bình, 15 19 27

tỉnh Bắc Ninh (Musa x paradisiaca L.)*

10 Hình 2.1. Thân cây chuối tiêu thu hoạch tại xã Giang Sơn, huyện 32

Gia Bình, tỉnh Bắc Ninh*

11 Hình 2.2. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 12 Hình 2.3. Sơ đồ chiết các phân đoạn dịch chiết từ thân cây chuối 37 38

tiêu

13 Hình 2.4. Sơ đồ quy trình định lượng insulin huyết thanh 14 Hình 2.5. Sơ đồ quy trình thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của 46 54

mẫu thử trên sự phosphoryl hoá của IRS-1 và AMPK

15 Hình 3.1. So sánh mức hạ glucose máu của các lô chuột thí 60

nghiệm tiêm STZ (150 mg/kg) sau 15 ngày uống mẫu thử

61 16 Hình 3.2. Mức hạ glucose máu của các lô chuột ĐTĐ typ 2 sau 15

ngày uống mẫu thử

63 17 Hình 3.3. Sự thay đổi nồng độ glucose máu của chuột ĐTĐ typ 2

thực nghiệm trong test dung nạp glucose

18 Hình 3.4. Sự tồn lưu glucose trong máu của chuột cống ĐTĐ typ 2 thực nghiệm trong test dung nạp glucose đường uống sau 120 phút

19 Hình 3.5. Mức hạ glucose máu của các lô chuột tiêm STZ 150 66

mg/kg sau 15 ngày uống hỗn dịch cắn các phân đoạn

20 Hình 3.6. Mức hạ glucose máu của các lô chuột ĐTĐ typ 2 sau 68

15 ngày uống hỗn dịch cắn phân đoạn

21 Hình 3.7. Cấu trúc hóa học của hợp chất FE1C 71

NỘI DUNG

TT 22 Hình 3.8. Cấu trúc hóa học của hợp chất FE6B 23 Hình 3.9. Cấu trúc hóa học của hợp chất FE10A 24 Hình 3.10. Cấu trúc hóa học của hợp chất FE12A 25 Hình 3.11. Cấu trúc hóa học của hợp chất FB2A 26 Hình 3.12. Cấu trúc hóa học của hợp chất FB2B 27 Hình 3.13. Mô bệnh học tụy của các lô chuột ĐTĐ typ 2 sau 15 TRANG 72 73 75 78 79 84

ngày uống mẫu thử (nhuộm HE x 400 lần)

86 28 Hình 3.14. Phần trăm hạ cholesterol và triglyceride của các lô

chuột thí nghiệm trước và sau khi uống mẫu thử

29 Hình 3.15. Phần trăm ức chế hoạt độ enzym G6Pase của các lô chuột tăng glucose máu bởi STZ liều 150mg /kgsau 15 ngày uống mẫu thử

89 30 Hình 3.16. Phần trăm ức chế hoạt độ enzym G6Pase của các lô

chuột ĐTĐ typ 2 sau 15 ngày uống mẫu thử

31 Hình 3.17. Tác dụng của cắn toàn phần ở các nồng độ khác nhau 94

trên lượng IRS-1 phosphoryl hóa ở Ser307

32 Hình 3.18. So sánh lượng p-IRS-1 (Ser307) giữa các lô ủ với cắn 94

toàn phần ở các nồng độ khác nhau

33 Hình 3.19. Ảnh hưởng của cycloeucalenon (H1) và daucosterol (H2) ở các nồng độ khác nhau trên lượng IRS-1 phosphoryl hóa ở Ser307

96 34 Hình 3.20. So sánh lượng p-IRS-1 (Ser307) giữa các lô ủ với cycloeucalenon (H1) và daucosterol (H2) ở các nồng độ khác nhau 35 Hình 3.21. Tác dụng của cắn toàn phần ở các nồng độ khác nhau

trên lượng AMPKα phosphoryl hóa ở Thr172

36 Hình 3.22. So sánh lượng p-AMPKα (Thr172) giữa các lô ủ với 96

cắn toàn phần ở các nồng độ khác nhau

37 Hình 3.23. Tác dụng của cycloeucalenon (H1) và daucosterol 97

(H2) trên lượng AMPK phosphoryl hóa ở Thr172

38 Hình 3.24: So sánh lượng p-AMPKα (Thr172) giữa các lô ủ với cycloeucalenon (H1) và daucosterol (H2) ở các nồng độ khác nhau

39 Hình 3.25. So sánh mức độ tổng hợp triglycerid của tế bào mô mỡ 98

3T3-L1

40 Hình 4.1. Các cơ chế tác dụng hạ glucose máu đã được phát hiện 131

của thân cây chuối tiêu

ĐẶT VẤN ĐỀ

Đái tháo đường (ĐTĐ) là một bệnh nội tiết đặc trưng bởi tình trạng tăng

glucose máu kèm theo nhiều biểu hiện rối loạn chuyển hóa. Hậu quả của sự tăng

glucose máu là những biến chứng nghiêm trọng, có thể đe dọa đến tính mạng

của người bệnh. Theo nghiên cứu của Hiệp hội Đái tháo đường quốc tế, năm

2015 số lượng bệnh nhân mắc bệnh là 415 triệu người, chiếm 8,8% dân số thế

giới và vẫn tiếp tục gia tăng mạnh, ước tính đến năm 2040 sẽ có khoảng 642

triệu người mắc bệnh ĐTĐ [67]. Sự gia tăng đột biến về tỷ lệ người mắc bệnh

ĐTĐ hiện nay đang là một gánh nặng cho ngành y tế. Chi phí để quản lý, chăm

sóc và điều trị bệnh rất tốn kém. Theo công bố của tổ chức Y tế thế giới (WHO),

chi phí trực tiếp mỗi năm cho bệnh nhân ĐTĐ ước tính khoảng 673 tỷ đô la Mỹ,

chiếm khoảng 16,2% ngân sách chăm sóc sức khoẻ của toàn thế giới [181].

Trong những năm qua, số các nghiên cứ u về đái tháo đườ ng đã tăng lên

nhanh chó ng. Kết quả là sự ra đờ i củ a các thuố c mớ i và các ứ ng du ̣ng trong điều

tri ̣, cho phép thầy thuố c cũng như bê ̣nh nhân có nhiều sự lựa cho ̣n hơn. Các

thuố c điều tri ̣ ĐTĐ đang đươ ̣c sử du ̣ng cho thấy những hiê ̣u quả nhất đi ̣nh [19],

[181]. Tuy nhiên, hiê ̣u quả lâu dài trong viê ̣c ngăn ngừ a các biến chứ ng củ a ĐTĐ thông qua kiểm soát glucose máu vẫn còn hạn chế, đồ ng thờ i những phản ứ ng bất lơ ̣i khi sử du ̣ng thuố c vẫn là một vấn đề đáng lưu ý [110]. Do đó , mô ̣t trong những mố i quan tâm hàng đầu củ a các nhà khoa ho ̣c hiê ̣n nay là viê ̣c tìm ra những thuố c mớ i điều tri ̣ ĐTĐ dựa trên sự khám phá các đích tác du ̣ng mớ i, nhằ m nâng cao hiê ̣u quả điều tri ̣ đái tháo đườ ng, đồ ng thờ i giảm đươ ̣c những

phản ứ ng bất lơ ̣i. Kế thừa nền y học cổ truyền của dân tộc để từ đó nghiên cứu,

sản xuất ra các loại thuốc có nguồn gốc từ thảo dược thiên nhiên hiệu quả và an

toàn đang là hướng lựa chọn hợp lý để giải quyết vấn đề này. Từ hướng nghiên

cứu đó, đã có nhiều loại thảo dược được nghiên cứu và chứng minh tác dụng hạ

glucose máu như: Dây đau xương, Chè xanh, Thổ phục linh... [7], [8],[13].

Cây Chuối tiêu (Musa x paradisiaca L.) được biết đến như một loại thực

phẩm và cũng là một vị thuốc. Theo y học cổ truyền, quả chuối tiêu xanh chữa

tiêu chảy, kiết lỵ. Chuối tiêu chín có tác dụng nhuận tràng, chữa táo bón, vỏ quả

chuối tiêu chữa lỵ, nhựa quả chuối tiêu xanh chữa hắc lào, lá chuối tiêu non giã

nát cầm máu vết thương, làm dịu vết bỏng...[3]. Nhiều bộ phận dùng của cây

chuối tiêu như quả, lá rễ...đã được nghiên cứu và chứng minh tác dụng hạ

glucose máu [89], [150], [151]. Theo kinh nghiệm dân gian của đồng bào dân

tộc thiểu số phía bắc Việt Nam và một số quốc gia trên thế giới, phần thân chuối

ép lấy nước uống để điều trị ĐTĐ có hiệu quả làm hạ glucose máu [103], [153].

Tuy nhiên, cho đến thời điểm này chưa có tài liệu khoa học nào của Việt Nam

nghiên cứu về tác dụng sinh học của thân cây chuối tiêu. Hiện nay, trên thế giới

có một vài nghiên cứu về tác dụng hạ glucose máu của thân cây chuối tiêu

[89],[163]. Các nghiên cứu chỉ mới ở mức độ sàng lọc, kết quả chưa thống nhất,

chưa có một nghiên cứu có hệ thống nào đánh giá được tác dụng và cơ chế tác

dụng hạ glucose máu của dược liệu này. Để có những bằng chứng khoa học về

tác dụng và cơ chế tác dụng của thân cây chuối tiêu hướng tới ứng dụng trong

điều trị ĐTĐ, luận án tiến hành đề tài “Nghiên cứu tác dụng và cơ chế hạ

glucose máu của dịch ép thân cây chuối tiêu (Musa x paradisiacal L.) trên

thực nghiệm” với 2 mục tiêu:

1. Đánh giá tác dụng hạ glucose máu của cắn toàn phần từ dịch ép thân

cây chuối tiêu trên chuột thực nghiệm.

2. Nghiên cứu cơ chế hạ glucose máu của cắn toàn phần và một số chất

phân lập từ dịch ép thân cây chuối tiêu.

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG

1.1.1. Định nghĩa, dịch tễ, phân loại đái tháo đường

1.1.1.1. Định nghĩa

Theo Hiê ̣p hô ̣i Đái tháo đườ ng Hoa Kỳ, bê ̣nh đái tháo đườ ng là mô ̣t tâ ̣p hơ ̣p những rố i loa ̣n chuyển hó a ma ̣n tính đă ̣c trưng bở i sự tăng glucose máu do suy giảm sản xuất insulin và/ hoă ̣c do giảm đáp ứ ng vớ i insulin ta ̣i các mô. Sự tăng glucose máu ma ̣n tính trong bê ̣nh đái tháo đườ ng có liên quan mâ ̣t thiết vớ i những tổ n thương lâu dài, rố i loa ̣n và suy giảm chứ c năng củ a nhiều cơ quan khác nhau, đă ̣c biê ̣t là mắt, thâ ̣n, thần kinh, tim và ma ̣ch máu [19]. 1.1.1.2. Dịch tễ

Đái tháo đườ ng là bê ̣nh thườ ng gă ̣p nhất trong các bê ̣nh nô ̣i tiết, là mô ̣t trong 3 bê ̣nh có tố c đô ̣ phát triển nhanh nhất trên thế giớ i (ung thư, tim ma ̣ch và ĐTĐ). Trong những năm cuố i thế kỷ 20, đầu thế kỷ 21, ĐTĐ là bê ̣nh không lây phát triển nhanh nhất [19]. Theo thống kê của Hiệp hội Đái tháo đường quốc tế, năm 2015 số người mắc bệnh ĐTĐ ở các khu vực điển hình như sau: Bắc Mỹ 44,3 triệu người, Châu Âu 58,9 triệu người, Đông Bắc Phi 35,4 triệu người, Nam Mỹ 29,6 triệu người, Đông Nam Á 78,3 triệu người và phía Tây Thái Bình Dương 153 triệu người. Dự tính đến năm 2040, số người mắc bệnh ĐTĐ tại các vùng này càng gia tăng nhanh chóng với số lượng ước tính: Bắc Mỹ 60,5 triệu người, Châu Âu 71,1 triệu người, Đông Bắc Phi 72,1 triệu người, Nam Mỹ 48,8 triệu người, Đông Nam Á 140,2 triệu người và phía Tây Thái Bình Dương 214,8 triệu người [67]. Mă ̣c dù có sự gia tăng cả về ĐTĐ typ 1 và typ 2 nhưng tố c đô ̣ phát triển củ a ĐTĐ typ 2 tăng ma ̣nh do sự gia tăng tỷ lê ̣ béo phì và lố i số ng ít hoa ̣t đô ̣ng thể lực ở các nướ c phát triển, cứ 10 ngườ i mắc ĐTĐ thì có 9 ngườ i mắc ĐTĐ typ 2.

Ở Viê ̣t Nam, năm 2015, số ngườ i trong đô ̣ tuổ i từ 20 đến 79 tuổi mắc ĐTĐ vào khoảng 3,5 triệu, chiếm 6,0 % dân số trong đô ̣ tuổ i này [67]. Đặc biệt tỷ lệ mắc ĐTĐ ở nhó m đố i tươ ̣ng có yếu tố nguy cơ, tuổ i từ 30 đến 64 chiếm tỷ lê ̣ là cao nhất. Tần suất các yếu tố nguy cơ như BMI (Body mass index) cao, vò ng eo rô ̣ng, ít vâ ̣n đô ̣ng thể lực, gia đình có ngườ i thuô ̣c các thế hê ̣ câ ̣n kề mắc ĐTĐ cao rõ rê ̣t ở khu vực đồ ng bằng, đô thi ̣ so vớ i miền nú i và trung du [1]. 1.1.1.3. Phân loại đái tháo đường

Theo phân loa ̣i củ a Hiê ̣p hô ̣i Đái tháo đườ ng Hoa Kỳ (ADA) năm 2017, ĐTĐ

đươ ̣c chia thành ĐTĐ typ 1, ĐTĐ typ 2, ĐTĐ thứ phát, ĐTĐ thai kỳ [19].

- Đá i thá o đườ ng typ 1: Chiếm 5-10% trong số những ngườ i mắc ĐTĐ với đặc điểm tế bào β đảo tu ̣y bi ̣ phá hủ y gây thiếu hu ̣t insulin tuyê ̣t đố i. Nguyên nhân củ a sự phá hủ y này có thể là do tự miễn di ̣ch.

- Đá i thá o đườ ng typ 2: ĐTĐ typ 2 chiếm khoảng 90% số ngườ i mắc ĐTĐ. Đó là mô ̣t tâ ̣p hơ ̣p những rố i loa ̣n chuyển hó a do nhiều nguyên nhân khác nhau, nhưng đều có chung đă ̣c điểm: có sự đề kháng insulin ở mô đích và tiếp theo là sự suy giảm tiết insulin ở tuyến tu ̣y.

- Đá i thá o đườ ng thứ phá t: ĐTĐ có thể là hê ̣ quả củ a những bê ̣nh lý khác như: các khuyết tâ ̣t di truyền củ a tế bào β, giảm hoa ̣t tính củ a insulin do khiếm khuyết gen, các bê ̣nh lý tu ̣y ngoa ̣i tiết (u tu ̣y, chấn thương, cắt bỏ tu ̣y…), các bê ̣nh nô ̣i tiết khác (u tủ y thươ ̣ng thâ ̣n, u tiết glucagon, u tiết somatostatin, hô ̣i chứ ng Cushing…), do dù ng thuố c hoă ̣c hó a chất, do nhiễm trù ng và mô ̣t số hô ̣i chứ ng về gen khác…

- Đá i thá o đườ ng thai kỳ: Đái tháo đường ở phu ̣ nữ mang thai thườ ng khở i phát từ tuần lễ thứ 24 củ a thai kỳ, đôi khi sớ m hơn. Nguyên nhân là sự tăng nhu cầu insulin khi thai phát triển do nhu cầu cung cấp năng lươ ̣ng củ a ngườ i me ̣. Đồ ng thờ i trong quá trình mang thai, sự thay đổ i nồ ng đô ̣ estrogen và progesteron làm thay đổ i chứ c năng tế bào đảo tu ̣y, gây hiê ̣n tươ ̣ng rố i loa ̣n dung na ̣p glucose tiềm tàng. Hơn nữa, trong giai đoa ̣n này, cơ thể ngườ i me ̣ cũng sản xuất ra các nô ̣i tiết tố khác như các lactogen ở nhau thai có tác du ̣ng kháng insulin và tăng thoái hóa lipid. 1.1.1.4. Tiêu chuẩ n chẩ n đoá n

Hiê ̣p hô ̣i Đái tháo đườ ng Hoa Kỳ (ADA) và Tổ chứ c Y tế thế giớ i (WHO) đã đưa ra các tiêu chuẩn chẩn đoán ĐTĐ đươ ̣c áp du ̣ng rô ̣ng rãi. Tiêu chuẩn chẩn đoán ĐTĐ củ a 2 tổ chứ c này đươ ̣c tó m tắ t trong bảng 1.1 [19],[181].

Bả ng 1.1. Tiêu chuẩn chẩn đoá n ĐTĐ và tiền ĐTĐ củ a WHO và ADA

WHO (2016)

Chẩ n đoá n FPG (mmol/L) G2h (mmol/L) ADA (2017) FPG (mmol/L) G2h (mmol/L)

tháo ≥ 7,0 ≥ 11,1 ≥ 7,0 ≥ 11,1 HbA1c (%) ≥ 6,5

HbA1c (%) ≥ 6,5 loa ̣n dung na ̣p < 7,0 ≥ 7,8 và < 11,1 ≥ 5,6 và < 7 ≥ 7,8 và < 11,1

6,1 - 6,9 < 7,8 5,6 - 6,9 < 7,8 Đái đườ ng Rố i glucose Rối loạn glucose lú c đó i

FPG: fasting plasma glucose – glucose huyết tương lú c đó i G2h: Glucose huyết tương 2h sau khi uống 75g glucose (test dung nạp glucose)

Như vậy, theo WHO và ADA đều đưa ra các tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh đái tháo đường là glucose huyết tương lúc đói ≥ 7,0 mmol/L hoặc glucose huyết tương 2h sau khi uố ng 75g glucose ≥ 11,1mmol/L hoặc HbA1c ≥ 6,5%.

Tuy nhiên, khi đưa ra tiêu chuẩn để chẩn đoán tiền ĐTĐ thì tiêu chuẩn củ a ADA (5,6 mmol/L) thấp hơn tiêu chuẩn củ a WHO (6,1 mmol/L). Điều này có tác đô ̣ng đáng kể đến sự can thiê ̣p vào tiến triển củ a ĐTĐ, cũng như giúp có các biê ̣n pháp phò ng rối loạn glucose vì tỷ lê ̣ những ngườ i bi ̣ tiền ĐTĐ (rố i loa ̣n glucose hoă ̣c suy giảm glucose máu) chuyển thành ĐTĐ trong vò ng 5 năm rất cao. 1.1.2. Cơ chế bệnh sinh 1.1.2.1. Bệnh sinh của đái tháo đường typ 1

Đái tháo đường typ 1 là tình trạng thiếu hụt insulin tuyệt đối do tế bào β của đảo tụy bị tổn thương, thường khởi phát ở tuổi trẻ. Cho tới nay chưa tìm ra nguyên nhân chính, chỉ biết đây là một bệnh tự miễn.Về cơ chế bệnh sinh có nhiều bằng chứng cho thấy bệnh bệnh sinh của ĐTĐ typ 1 là sự kết hợp giữa ba yếu tố di truyền, miễn dịch và môi trường. Hậu quả cuối cùng của quá trình này là tế bào β bị phá hủy, biểu hiện lâm sàng là ĐTĐ phụ thuộc insulin [52].

Cơ chế bệnh sinh của ĐTĐ typ 1 trước hết phải kể đến di truyền có liên quan chặt chẽ với yếu tố kháng nguyên bạch cầu người (human leucocyte antigen- HLA). HLA là những phân tử nằm trên bề mặt các tế bào trình diện kháng nguyên. Nguy cơ mắc bệnh ĐTĐ sẽ tăng lên đối với những cá thể mang kháng nguyên HLA như: HLA- DR3, HLA- DR4, HLA- DW3, HLA- DW4, HLA- B8, HLA- B15 [68]. Các nghiên cứu sàng lọc về di truyền học đã chỉ ra ít nhất 15 vị trí gen khác liên quan đến bệnh ĐTĐ typ 1, trong đó, có 2 gen liên quan tới cơ chế hoạt hóa lympho T. Đó là gen mã hóa kháng nguyên lympho T gây độc tế bào (CTLA-4), thuộc nhiễm sắc thể số 2 và gen mã hóa lymphoid tyrosine phosphatase (PTPN22), được biểu thị đặc hiệu ở tế bào lympho T [58].

Yếu tố thứ hai phải kể đến trong cơ chế bệnh sinh của ĐTĐ typ 1 là sự tác động của môi trường: Virus, chế độ ăn, các chất độc, stress, yếu tố địa lý. Các yếu tố này thúc đẩy quá trình khởi động quá trình tự miễn. Khi tiến hành gây nhiễm với virus Coxsacki ở động vật thí nghiệm cho thấy tế bào β bị nhiễm virus và xuất hiện ĐTĐ typ 1 ở những động vật này [52].

MHC +TCR

Hoạt hóa

Độc tế bào

Tế bào β

Sự gia tăng kháng nguyên CD4+

Virus

Hình 1.1. Sự phá hủy của tế bào β trong cơ chế bệnh sinh của ĐTĐ typ 1 [52].

Tiếp theo, các tế bào β của đảo tụy bị phá hủy theo cơ chế tự miễn dịch.

Về cơ chế bệnh sinh có nhiều bằng chứng cho thấy bệnh có liên quan đến hai

loại là miễn dịch dịch thể và miễn dịch qua trung gian tế bào. Các yếu tố khởi

phát của môi trường sẽ tấn công những cá thể có yếu tố di truyền nhạy cảm đối

với ĐTĐ typ 1. Chỉ một tổn thương rất nhỏ của tế bào β cũng làm giải phóng ra

kháng nguyên, kích thích cơ thể sinh tự kháng thể gây hoạt hóa phản ứng viêm

tiểu đảo tự miễn (hình 1.1). Hiện tượng thâm nhiễm đảo tụy ở các cá thể nhạy

cảm về di truyền với bệnh bắt đầu xảy ra ở tế bào β, từ đó sẽ tiếp tục dẫn đến quá

trình phá hủy của toàn bộ tiểu đảo tụy. Tế bào β có thể bị phá hủy bởi 2 cơ chế.

- Các lympho T hiệu ứng giải phóng các hạt chứa perforin vào tế bào đích. Cơ chế này cần có sự liên kết giữa receptor của lympho T đặc hiệu với tự kháng nguyên và phức hợp hòa hợp tổ chức của tế bào đích.

- Cơ chế làm chết tế bào β theo chương trình (apoptosis) thông qua Fas (CD95) và FasL (CD95L). Cơ chế này không cần sự liên kết giữa receptor của tế bào T với phức hợp hòa hợp tổ chức [68].

Sau khi “khởi động”, một loạt phản ứng miễn dịch sẽ diễn ra: các tiểu đảo tụy bị thâm nhiễm bởi các tế bào đơn nhân, các đại thực bào và tế bào lympho T độc (quá trình thâm nhiễm này được gọi là viêm tiểu đảo tụy). Ở giai đoạn này, trong huyết thanh người bệnh xuất hiện nhiều kháng thể kháng tiểu đảo tụy, đây gọi là giai đoạn tiền ĐTĐ typ 1. Tế bào β bị tổn thương làm cho quá trình sản

xuất insulin giảm dần, cho đến khi nồng độ insulin không đủ để duy trì nồng độ glucose máu ở mức bình thường, khi các triệu chứng lâm sàng xuất hiện thì hầu hết các tế bào β của tiểu đảo Langerhan đã bị phá hủy, khả năng bài tiết insulin của tế bào β còn lại ít và cạn kiệt dần, bệnh ĐTĐ thật sự sẽ xuất hiện [176]. 1.1.2.2. Bệnh sinh của đái tháo đường typ 2

Đái tháo đường typ 2 là bệnh rối loạn chuyển hóa với đặc điểm là tăng

glucose máu mạn tính và sự đề kháng insulin ở mô đích [1], [47].

Cơ chế bệnh sinh của ĐTĐ typ 2 khá phức tạp, là hậu quả của sự tương tác giữa những rối loạn liên quan đến di truyền và yếu tố môi trường dẫn đến sự xuất hiện các cơ chế gây bệnh. Cơ chế diễn biến của bệnh đái tháo đường typ 2 bao gồm: kháng insulin tại mô đích, tiếp theo là hiện tượng bù và sự suy kiệt của tế bào β [1], [47].

- Hiện tượng kháng insulin Kháng insulin là tình trạng giảm hoặc mất tính nhạy cảm của mô đích với insulin. Kháng insulin xuất hiện từ giai đoạn tiền ĐTĐ typ 2, là cơ chế bệnh sinh chủ yếu và quan trọng nhất trong bệnh sinh của ĐTĐ typ 2 [139].

Có nhiều cơ chế gây kháng insulin. Kháng insulin có thể do bất thường tại các vị trí trước, sau và ngay tại receptor insulin ở mô đích. Giảm số lượng receptor insulin là yếu tố bất thường tại receptor hoặc có kháng thể kháng receptor insulin là yếu tố ức chế trước receptor [139]..

Ở mức độ phân tử, kháng insulin chủ yếu do bất thường trong con đường

truyền tín hiệu của insulin (hình 1.2)

Hình 1.2. Con đường truyền tín hiệu của insulin trong chuyển hóa glucose

[139]

Insulin thực hiê ̣n quá trình truyền tín hiệu nhờ gắn vớ i receptor nằ m ở màng tế bào. Những receptor này có ở hầu hết các tế bào trong cơ thể ngườ i và đô ̣ng vâ ̣t có vú bao gồ m cả những tế bào đích đă ̣c trưng củ a insulin như tế bào gan, cơ, tế bào mô mỡ và những loa ̣i tế bào khác như tế bào máu, tế bào thần kinh… Receptor củ a insulin (IR) là mô ̣t glycoprotein xuyên màng có phân tử lươ ̣ng lớ n, cấu ta ̣o gồ m 2 tiểu đơn vi ̣ α và 2 tiểu đơn vi ̣ β, nố i vớ i nhau bở i các cầu disulfid, có da ̣ng β-α-α-β. Trong đó các tiểu phân α nằ m ở mă ̣t ngoài tế bào, chứ a phần gắn vớ i insulin, các tiểu phân β nằ m xuyên màng. Sự gắn insulin vào receptor ở màng tế bào làm hoa ̣t hó a mô ̣t chuỗi tín hiê ̣u dướ i da ̣ng dò ng thác với 2 con đường truyền tin. Trong đó, con đường qua trung gian Insulin receptor substrate (IRS) cụ thể là qua IRS-1. IRS-1, IP3 và Akt có vai trò quan trọng trong điều hòa nhiều chuyển hóa của tế bào (hình 1.2). Đầu tiên là sự khở i đô ̣ng hoa ̣t tính tyrosinkinase củ a 2 tiểu đơn vi ̣ β củ a IR, dẫn tớ i mô ̣t chuỗi phosphoryl hó a liên tiếp ở các tiểu đơn vi ̣ β và các cơ chất đă ̣c hiê ̣u là IRS-1, IP3, Akt. Ta ̣i những tế bào đích củ a insulin như tế bào cơ, xương và tế bào mô mỡ, con đườ ng qua IP3 tới Akt dẫn tớ i sự chuyển vi ̣ glucose transporter 4 (GLUT4) từ nô ̣i bào ra màng bào tương, ta ̣o điều kiê ̣n cho sự vâ ̣n chuyển glucose vào trong tế bào, từ đó dẫn tới các chuỗi phản ứng chuyển hóa theo hướng làm giảm glucose máu [61]. Trên con đường truyền tín hiệu của insulin trong tế bào có nhiều yếu tố tham gia hoặc ảnh hưởng đến quá trình này như IRS-1, IP3, Akt,… chính vì vậy sự bất thường trong con đường truyền tín hiệu này sẽ gây kháng insulin [139].

Cơ chế kháng insulin do bất thường trong con đường truyền tín hiệu của insulin được giải thích như sau: do giảm hoạt tính tyrosin kinase của vùng sau receptor insulin làm cho insulin khi gắn vào receptor không phát huy được tác dụng sinh học. Vì vậy không kích thích được sự vận chuyển glucose vào tế bào [92]. Bất hoạt IR có thể do tăng hoạt tính của các enzym khử phosphoryl tại tyrosin của các protein trong con đường truyền tín hiệu nội bào của insulin. Một số enzym đã được nghiên cứu như các protein tyrosinphosphatase (PTP) trong đó chủ yếu là PTP1B [169]. Sự gia tăng phosphoryl hóa các phân tử serin hoặc threonin không những làm giảm khả năng hoạt hóa IP3 mà còn làm giảm quá trình phosphoryl hóa tyrosin tại của insulin receptor, tăng thoái hóa IRS-1 do đó làm giảm nhạy cảm với insulin [139]. Bất hoạt IP3 thông qua ức chế tiểu đơn vị điều hòa ngược p85 nằm trên IP3K. Sự biểu hiện quá mức dạng hoạt động p100

trên PI3K hoặc kích thích quá mức Akt đều ức chế p85 làm giảm tác dụng sinh học của insulin [177].

Nguyên nhân chính làm gia tăng sự biểu hiện của các yếu tố gây kháng insulin là thừa cân, béo phì. Theo Venables, khoảng 80% bệnh nhân ĐTĐ typ 2 liên quan đến béo phì và lối sống ít vận động [171]. Theo báo cáo của trung tâm kiểm soát và phòng bệnh Hoa Kỳ, khoảng 55% bệnh nhân ĐTĐ đồng thời mắc béo phì, 85% bệnh nhân ĐTĐ bị thừa cân [19]. Một trong các nguyên nhân gây béo phì là do chế độ ăn nhiều chất béo và ít vận động. Ở những bệnh nhân béo phì, nồng độ acid béo tự do (FFA) tăng cao cạnh tranh với glucose trong chuyển hóa tại cơ vân, gia tăng FFA gây rối loạn sử dụng glucose ở ngoại vi [145].

Ở bệnh nhân béo phì, sử dụng năng lượng từ acid béo tự do (FFA) tăng do đó tạo thành acyl-CoA chuỗi dài (LCFA-CoA) trong bào tương (hình 1.3) [145].

Hình 1.3. Acid béo tự do với sự kháng insulin [145] Khi được vận chuyển vào trong ty thể, LCFA-CoA được β-oxy hóa một phần tạo thành gốc tự do oxy hóa (ROS - reactive oxygen species), hoạt hoá JKK gây kháng insulin [145].

Nồng độ LCFA-CoA tăng trong bào tương làm tăng diacylglycerol (DAG). Cả DAG và LCFA-CoA hoạt hoá PKC, JKK. Cả PKC và JKK làm tăng phosphoryl hóa serin của IRS-1 gây kháng insulin [145].

Mặt khác, nồng độ LCFA-CoA tăng làm tăng nồng độ ceramid do đó ức chế sự phosphoryl hóa Akt/PKB, gây ức chế sự di chuyển GLUT4 ra màng tế bào, giảm thu nạp và sử dụng glucose trong tế bào và làm tăng nồng độ glucose máu [145].

- Hiện tượng bù và sự suy kiệt tiếp theo của tế bào β

Ở giai đoạn đầu của ĐTĐ typ 2, có sự tăng tiết insulin nhằm bù lại sự giảm nhạy cảm của insulin đối với các mô đích, duy trì tình trạng ổn định của glucose máu. Sự làm việc quá mức của tế bào β sau một thời gian sẽ gây suy kiệt. Bên cạnh đó, các yếu tố nguy cơ còn có tác động trực tiếp đến tế bào β.

Nồng độ FFA và glucose trong máu tăng làm tăng chuyển hóa tại ty thể, tăng các gốc tự do gây gia tăng tình trạng viêm (hình 1.3). Mặt khác, tăng tổng hợp insulin ở tế bào β gây ra hiện tượng stress lưới nội chất. Cả hai nguyên nhân này đều dẫn đến sự chết theo chương trình của tế bào β. Ở giai đoạn này, sự sản xuất và bài tiết insulin ở tụy giảm đi kèm theo hiện tượng kháng insulin sẵn có gây ra tình trạng mất kiểm soát nồng độ glucose máu kéo theo nhiều biến chứng [145]. 1.2. CÁC CƠ CHẾ GÂY HẠ GLUCOSE MÁU

Giá trị nồng độ glucose ở thời điểm 2 giờ sau ăn <7,8 mmol/L là bình thường, từ 7,7- 11,0 mmol/L là rối loạn dung nạp glucose và >11,0 mmol/L là đái tháo đường. Sự tăng nhanh glucose trong máu sau ăn tạo ra các đáp ứng của mô và góp phần vào việc hình thành biến chứng của đái tháo đường [181]. Tăng glucose máu mạn tính là đặc trưng cơ bản của bệnh ĐTĐ, gây ra các biến chứng nguy hiểm [67]. Vì vậy hầu hết các thuốc điều trị bệnh ĐTĐ đều nhằm mục đích làm hạ glucose máu với các cơ chế khác nhau. Nhìn chung, cơ chế hạ glucose máu rất phong phú, mỗi thuốc có thể tác động theo một hoặc nhiều cơ chế khác nhau. Dưới đây là một số cơ chế làm hạ glucose máu đã được áp dụng trong điều trị hoặc trong các nghiên cứu thực nghiệm. 1.2.1. Tăng cường số lượng insulin nội sinh Insulin là một hormon quan trọng được tiết ra từ tế bào β tuyến tụy với vai trò sinh học là hạ glucose máu, qua đó giúp cơ thể kiểm soát và sử dụng glucose một cách hiệu quả. Bên cạnh sử dụng insulin ngoại sinh, vốn chỉ được chỉ định trong ĐTĐ typ 1 và ĐTĐ typ 2 khi bệnh nhân không đáp ứng hoặc đáp ứng kém với các loại thuốc điều trị ĐTĐ bằng đường uống khác [19], có nhiều giải pháp khác nhằm tăng cường số lượng insulin nội sinh. Tác động của thuốc trên tụy chủ yếu bao gồm tác dụng kích thích tiểu đảo tụy sản xuất insulin hoặc bảo vệ và phục hồi tế bào β đã bị tổn thương do sự tấn công của các cytokin hoặc các tác nhân bệnh sinh khác [77], [129]. 1.2.1.1. Tăng cường số lượng insulin thông qua ức chế kênh KATP, tăng nồng độ calci nội bào

Đây là cơ chế tăng tiết insulin của các thuốc điều trị ĐTĐ phổ biến hiện nay.

Sulfonylurea gắn vào thụ thể bề mặt của màng tế bào β (ở tụy) và ức chế kênh K+ nhạy cảm với ATP ngăn không cho K+ thoát ra, làm màng tế bào β bị khử cực. Sự khử cực màng tế bào gây mở kênh calci phụ thuộc điện thế, calci ngoài tế bào vào trong tế bào, lượng calci được tăng lên trong bào tương sẽ kích thích giải phóng insulin từ các hạt tiết của tế bào β (hình 1.4) [77].

Hình 1.4. Cơ chế tác dụng của các thuốc nhóm sulfunylure [77]

Thuốc được sử dụng để điều trị đái tháo đường tác dụng theo cơ chế này điển hình là các sulfunylure. Ngoài ra, có 3 hoạt chất thuộc nhó m meglitinid cũng đã được đưa vào sử dụng là repaglinid, glimepirid và nateglinid [19]. Bên cạnh đó, một số dược liệu cũng được chứng minh tác dụng tăng sản xuất insulin theo cơ chế này. Nghiên cứu chứng minh tác dụng kích thích tế bào β sản xuất insulin trên dược liệu được các nhà khoa học nghiên cứu chủ yếu thông qua định lượng insulin huyết thanh sau khi dùng thuốc/chế phẩm thử hoặc qua thực nghiệm in vitro trên đảo tụy cô lập và tế bào β đơn dòng. Các dòng tế bào hay được sử dụng nhất là β-TC-6, BRIN-BD11, RIN-5F, HIT-T15 của chuột [24], [129], [167]. Ví dụ như trong thí nghiệm in vitro với dịch chiết methanol của cây cáp gai đen (Capparis zeylanica ) trên dòng tế bào MIN6-β, kết quả cho thấy nồng độ insulin tăng do tăng nồng độ Ca2+ nội bào [24]. Ranjbari (2016) khi nghiên cứu cây tầm ma (Urtica dioicand) cho thấy dịch chiết nước từ dược liệu này tăng tiết insulin trên tế bào RIN-5 F của chuột [129]. Trong nghiên cứu của Thomas về dịch chiết nước của cây dây cóc (Tinospora crispain) thể hiện tác dụng tăng tiết insulin trên tế bào HIT-T15 và BRIN-BD11 [167].

Ngoài cơ chế tăng cường sản xuất insulin thông qua ức chế kênh KATP, tăng nồng độ calci nội bào, một tác động quan trọng khác đối với sự tăng sản xuất insulin là tác động bảo vệ tế bào β trước các tác nhân gây hoại tử tế bào

hoặc các yếu tố gây chết theo chương trình (apoptosis) của tế bào β cũng đang được các nhà khoa học nghiên cứu [49],[156]. Chemokine CXC là các thụ thể của protein G, có trên màng tế bào, cùng với các cytokine tạo ra các phản ứng viêm. Có bảy ligan chemokine CXC đã được phát hiện ở động vật có vú. Trong đó mức độ lưu hành CXCL10 (phối tử của CXCR3) cao ở những bệnh nhân ĐTĐ typ 1. Ức chế CXCL10 / CXCR3 là một chiến lược tiềm năng để điều trị ĐTĐ typ 1. Một thuốc mới có tên là pCAGGS-CXCL10 đang được thử nghiệm với cơ chế trung hòa CXCL 10, tăng sinh tế bào β, cải thiện tình trạng bị phá hủy của tế bào β trên chuột ĐTĐ typ 1 [49]. 1.2.1.2. Tăng cường số lượng insulin thông qua các incretin

Những kỹ thuâ ̣t xét nghiệm miễn dịch đã chứng tỏ tác động của glucose tại tụy không phải là yếu tố duy nhất gây tăng tiết insulin. Nghiên cứu của Nauck cho thấy đáp ứng tăng tiết insulin với glucose đường uống vượt xa so với glucose đưa vào bằng đường tiêm tĩnh mạch, hiện tượng này gọi là hiệu ứng incretin. Một số hormon nguồn gốc từ ruột đã được chứng minh là có thể gây ra hiệu ứng incretin, gọi chung là các hormon incretin. Trong số đó, quan trọng nhất là glucagon-like peptid -1(GLP-1). Đây là hormon có tác dụng tăng sản xuất insulin. Tác dụng của hormon này trên sự chuyển hóa glucose đã được chứng minh qua nhiều thử nghiệm [108].

GLP-1 gây tăng tiết insulin qua cơ chế hoạt hóa GLP-1R ở tế bào β đảo tụy dẫn tới sự tăng AMP vòng và hoạt hóa PKA làm đóng kênh K+, tăng tiết insulin [122]. Các thuốc là những chất chủ vận của GLP-1 đã được phê duyệt trong điều trị hiện nay là: exenatid, liraglutid, albiglutide, dulaglutid [19]. Ngoài ra taspoglutid có cấu trúc tương tự GLP-1 đang được nghiên cứu và thử nghiệm [48]. Bên cạnh các chất trực tiếp tác động lên receptor GLP-1R, hướng tiếp cận thứ hai là tăng cường số lượng GLP-1 nội sinh. Một chất có tên là PTU-cellulose là chất chủ vận của receptor TAS2R38 được thử nghiệm trên chuột, kết quả cho thấy tăng tiết insulin thông qua tăng nồng độ GLP-1 [122]. Hiệu ứng tăng tiết GLP-1 còn phụ thuộc một receptor khác là GPR119 thuộc nhóm A trong các receptor liên kết với protein G. Kích hoạt GPR119 làm tăng GLP-1 ở ruột, tăng tiết insulin ở tụy và hạ glucose máu [34]. 76 dẫn chất khác nhau là chất chủ vận trên GPR119 đã được công bố và đang tiến hành thử nghiệm lâm sàng pha I và II [134]. 1.2.1.3. Tăng cường số lượng insulin thông qua ức chế DPP-4

Trong cơ thể, GLP-1 dễ dàng bị bất hoạt bởi sự phân cắt của DPP-4 (hình 1.5). Do đó tăng tác dụng của GLP-1 bằng cách ức chế DPP-4 theo cơ chế ức chế cạnh tranh là cơ chế tác dụng của 1 số thuốc đã được phê duyệt điều trị ĐTĐ hiện nay là sitagliptin, saxagliptin, linagliptin, alogliptin [19].

Hình 1.5. Cơ chế tác dụng của các thuốc ức chế DPP4 [175]

Ngoài các cơ chế làm tăng cường số lượng insulin đã nêu ở trên, các nhà

khoa học còn nghiên cứu sự tăng tiết insulin thông qua các cơ chế khác như:

- Ức chế ghrelin (peptid điều hòa sự tiết hormon) [162]. Một số dẫn chất quinazolinon đang được thử nghiệm với khả năng đối vận với receptor của ghrelin, từ đó tăng nồng độ insulin nội sinh, làm giảm glucose máu [137].

- Tăng tiết insulin do kích thích củ a glucose (GSIS) thông qua receptor củ a acid béo. Fasiglifam (chất chủ vận của GPR40) đang được nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng pha III với cơ chế này. TAK-875 là một chất chủ vận mới của GPR40 cũng đã được các nghiên cứu về khả năng tăng tiết insulin phụ thuộc nồng độ glucose [160]. Một nghiên cứu khác cũng chỉ ra rằng hoạt hóa receptor ephinA cũng tăng cường số lượng của insulin phụ thuộc nồng độ glucose. CYN154806 là chất chủ vận của ephrin A với tác dụng giảm nồng độ glucose máu, tăng dung nạp glucose, tăng tiết insulin ở chuột ĐTĐ typ 2 [66].

1.2.2. Tăng cường nhạy cảm của mô đích với insulin

Khi tế bào của mô đích không đáp ứng với insulin trong chuyển hóa glucose. Do đó, tế bào không sử dụng được glucose làm cho nồng độ glucose trong máu tăng lên. Các nghiên cứu đã ghi nhận nhiều thuốc có tác dụng làm tăng nhạy cảm của tế bào mô đích với insulin thể hiện qua sự giảm glucose máu, giảm nồng độ insulin huyết thanh lúc đói và giảm các chỉ số lipid máu [100], [157]. 1.2.2.1. Tăng cường nhạy cảm của mô đích với insulin thông qua hoạt hóa AMPK

AMP-Activated protein kinase (AMPK) là mô ̣t enzym serin/threonin protein kinase có mă ̣t rất phổ biến trong cơ thể. AMPK đươ ̣c go ̣i là “máy đo nhiên liê ̣u”, nó có khả năng cảm biến tra ̣ng thái năng lươ ̣ng ở cả tế bào biê ̣t lâ ̣p và toàn bô ̣ cơ thể. Khi đươ ̣c hoa ̣t hó a, AMPK sẽ khở i đô ̣ng quá trình di ̣ hó a ta ̣o ra ATP đồ ng thờ i ứ c chế quá trình đồ ng hó a sử du ̣ng ATP. Có 3 enzym là LKB1, CaMKK và TAK1 có khả năng hoa ̣t hó a AMPK nhờ khả năng xú c tác kinase ngươ ̣c dò ng, gây phosphoryl hó a AMPK. Ngoài tác dụng trên chuyển hoá như tăng hấp thu glucose, tăng tổng hợp glycogen và giảm tổng hợp lipid, AMPK còn hoạt hoá IRS-1 trong chuỗi truyền tín hiệu của insulin, làm giảm kháng insulin (hình 1.6) [100]. AMPK tham gia vào nhiều quá trình chuyển hó a trong cơ thể (hình 1.6). Sự hoa ̣t hó a AMPK có thể gây tăng gia nhâ ̣p glucose vào cơ, giảm tân ta ̣o glucose ở gan, tăng oxy hó a acid béo ở gan và cơ, giảm tổ ng hơ ̣p acid béo ở gan và mô mỡ, tăng hoa ̣t đô ̣ng củ a ty thể, hoa ̣t hó a AMPK ở gan gây ha ̣ glucose máu [43], [100].

Hình 1.6. Cơ chế tác dụng giảm kháng insulin thông qua hoạt hóa AMPK [100]

Nhó m biguanid, mà đa ̣i diê ̣n là metformin đã được sử dụng điều tri ̣ đái tháo đườ ng theo cơ chế gây hoa ̣t hó a AMPK [100]. Bên cạnh thuốc kinh điển là metformin, các hợp chất phân lập từ dược liệu cũng đã được chứng minh cơ chế giảm kháng insulin thông qua hoạt hóa AMPK ví dụ như quecertin và berberin [43]. 1.2.2.2. Tăng cường nhạy cảm của mô đích với insulin thông qua receptor PPAR

Chất béo

Màng tế bào

Aid béo tự do

Nhân tế bào

Một trong những cơ chế bệnh sinh của ĐTĐ typ 2 là sự đột biến hoặc thay đổi biểu hiện gen của receptor PPAR (peroxisome proliferator-activated receptor). PPAR là những receptor ở màng nhân tế bào, khi gắn vớ i các ligand đă ̣c hiê ̣u, PPAR ta ̣o thành dimer vớ i receptor X retinoid (RXR), phứ c hơ ̣p này sẽ gắn vớ i ADN làm điều hòa quá trình phiên mã và dịch mã của một số protein quan trọng trong quá trình biệt hóa tế bào cũng như chuyển hóa glucose và lipid. PPAR có hai loại PPARα và PPAR (hình 1.7) [123].

Hình 1.7. Cơ chế truyền tín hiê ̣u củ a PPAR [123]

Nghiên cứu liên quan đến thuốc điều trị ĐTĐ tác dụng theo cơ chế hoạt hoá PPAR tập trung với PPAR bởi vì một trong những đáp ứng sinh học quan trọng nhất liên quan đến receptor PPAR là kích thích biệt hóa tế bào mỡ, kích thích các enzym và protein vận chuyển của tế bào mỡ như lipoprotein lipase, protein vâ ̣n chuyển acid béo để thu nạp acid béo. PPAR-γ phân bố nhiều nhất ở mô mỡ và ruô ̣t già. Ligand nô ̣i sinh đă ̣c hiê ̣u vớ i PPAR-γ là mô ̣t số loa ̣i chất béo như prostaglandin, leukotrien [123]. Khi PPAR gắn vào ligan có tác dụng làm giảm nồng độ acid béo tự do trong huyết tương, tức là gián tiếp cải thiện nguyên

nhân gây kháng insulin ở mô đích. Bên cạnh đó, còn làm tăng nhạy cảm với insulin thông qua sự thay đổi các hormon đặc hiệu do tế bào mỡ sản xuất (adipokin). Hoa ̣t hó a PPAR- gây kích thích sự tạo thành adiponectin, một hormon có tác dụng làm tăng oxi hóa acid béo, tăng đáp ứng với insulin và giảm sự tạo thành mảng vữa xơ, đồ ng thờ i làm giảm các cytokin cản trở hoạt động của insulin như TNF-, resistin, IL6. Tổng hợp của tất cả các tác dụng nói trên là làm tăng đáng kể tác dụng của insulin tại mô đích [123].

Các thiazolidinedion là nhó m chất chủ vâ ̣n cho ̣n lo ̣c trên receptor PPAR thông qua hoa ̣t hó a PPAR-, thiazolidindion (TZD) làm tăng nha ̣y cảm vớ i insulin ở mô đích. Hiện nay, do nhiều tác dụng không mong muốn của các thiazolidindion, nhóm thuốc này đã không còn được sử dụng. Các nhà khoa học đang tiếp tục mở rộng tìm kiếm các chất chủ vận khác trên receptor PPAR với 17 chất chủ vận trên receptor PPAR có tác dụng giảm kháng insulin [25]. 1.2.2.3. Tăng cường nhạy cảm của mô đích với insulin thông qua quá trình truyền tín hiệu của insulin

Tăng cường nhạy cảm của mô đích với insulin thông qua quá trình truyền tín hiệu của insulin ở tế bào đích với đặc trưng là sự phosphoryl hóa Tyr hậu receptor. Thực tế, hiện tượng kháng insulin trong bệnh ĐTĐ typ 2 cũng có nguyên nhân quan trọng là sự giảm phosphoryl hóa Tyr, tăng phosphoryl hóa Ser hoặc Thr của insulin receptor. Nhiều thuốc đã được chứng minh tác dụng ức chế phosphoryl hóa Ser của insulin receptor, do đó trực tiếp tác động vào nguyên nhân gây kháng insulin như exendin-4, rosiglitazon, pioglitazon. Các thuốc khác như neprhilin, anephril đang trong giai đoạn nghiên cứu thử nghiệm [92]. Nghiên cứu về dược liệu tác dụng theo cơ chế này của Sridha (2007) cho thấy dịch chiết quả Mướp đắng (Momordica charantia L.) có tác dụng khôi phục khả năng phosphoryl hóa Tyr của insulin receptor trên chuột cống béo phì ĐTĐ typ 2 [157].

Tăng cường nhạy cảm của mô đích với insulin thông qua con đường truyền tín hiệu nội bào của insulin còn bị ảnh hưởng bởi số lượng và ái lực gắn hormon của receptor ở tế bào đích. Các nghiên cứu chủ yếu được thực hiện trên đối tượng là dược liệu. Lá cây dâu (Folium Mori) được nghiên cứu với sự giảm glucose máu, tăng dung nạp glucose, giảm kháng insulin, giảm cholesterol, triglycerid toàn phần đi kèm với sự tăng biểu hiện mRNA và protein của IRS-1, PI3K P85α [30].

Quá trình truyền tín hiệu của insulin ở tế bào đích gây ra chuỗi phosphoryl

hóa IR, IRS-1,2, hoạt hóa IP3 kinase và protein PDK1, Akt, dẫn tới phosphoryl

hóa và gây bất hoạt GSK-3αβ. Hiện nay, người ta đã tìm ra nhiều vai trò quan

trọng của GSK-3 trong điều hòa hoạt động tế bào, đặc biệt là trong quá trình truyền tín hiệu của insulin. GSK-3 gây ra sự phosphoryl hóa gốc Ser307 và Ser332

của IRS-1, làm ức chế sự phosphoryl hóa tyrosin và làm giảm đi sự truyền tín hiệu

của insulin. Do đó, bất hoạt GSK-3 làm tăng nhạy cảm của mô đích với insulin

[59]. 7-hydroxy-benzimidazol là một hoạt chất có tác dụng theo cơ chế này [147].

Tương tự như vậy muối lithium cũng là một trong những chất có tác dụng ức chế

GSK-3 [31]. Theo một nghiên cứu tổng quan của Pandey (2016) cho thấy nhiều

chất ức chế GSK-3 hiện nay đang được nghiên cứu thử nghiệm [119].

Quá trình phosphoryl hóa Tyr là thuận nghịch, chiều nghịch được xúc tác

bởi protein tyrosin phosphatase (PTP). Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng nồng độ

cao PTP-1B nội bào làm giảm sự phosphoryl hóa IR và IRS-1. Do đó, ức chế

PTP-1B tăng nhạy cảm của mô đích với insulin [169]. Theo một nghiên cứu tổng

quan, đã có 44 chất có tác dụng ức chế PTP1B [96]. Rễ cây Chóc máu nam được

nghiên cứu tại Việt Nam cũng được chứng minh có tác dụng ức chế PTP1B [11].

Nghiên cứu của Nguyen P.H (2015) về chất selariscinin được phân lập từ cây

trường sinh thảo (Selaginella tamariscina) cũng cho thấy tác dụng ức chế

PTP1B [109].

Một yếu tố gây kháng insulin cũng được đề cập tới là histone deacetylase

(HDAC) (các enzym xúc tác cho quá trình khử eacetyl nhóm -N-acetyl lysine

amino acid ở phần đuôi của histon) [143]. HDAC không chỉ ức chế IRS-1 trong

chuỗi truyền tín hiệu của insulin mà còn gắn vào promoter của gen mã hóa tổng

hợp GLUT4, làm giảm quá trình tổng hợp GLUT4, giảm thu nạp glucose.

Vorinostat, trichostatin A và acid valproic là các chất có tác dụng giảm chế ức

chế HDAC trên chuột ĐTĐ typ 2 [60], [83],

1.2.3. Tác dụng điều hòa, chuyển hóa tương tự như insulin

Insulin là hormon có vai trò đặc biệt quan trọng trong điều hòa glucose

máu. Khi glucose máu tăng cao, insulin tăng cường sự thu nhận glucose từ máu

vào tế bào cơ và mô mỡ thông qua kích thích GLUT4. Ngoài ra, insulin còn

tham gia vào quá trình điều hòa các enzym chủ chốt trong quá trình tổng hợp và

thoái hóa glucose [64]. Nghiên cứu cho thấy một số thuốc, hoạt chất và dược

liệu cũng có cơ chế tác động tương tự như insulin [64],[70].

1.2.3.1. Tác dụng tương tự insulin thông qua các enzym

Trước hết phải kể đến cơ chế ức chế các enzym trong quá trình tạo glucose fructo1,6 biphosphatase (G6Pase),

nội sinh như glucose-6-phosphatase (F1,6BPase) và glycogen phosphorylase (GP).

Glucose-6-phosphatase (G6Pase) là mô ̣t phứ c hê ̣ enzym xú c tác phản ứ ng phân cắt glucose-6-phosphat (G6P) thành glucose và gố c phosphat vô cơ, đây là khâu cuố i cù ng trong cả hai quá trình thoái hó a glycogen và tân ta ̣o glucose. Ức chế G6Pase cũng là một trong các đích của thuốc điều trị ĐTĐ đang được quan tâm [155],[185]. Metformin là thuốc điều trị ĐTĐ typ 2 kinh điển được sử dụng rộng rãi nhất hiện nay. Ngoài cơ chế làm tăng nhạy cảm của mô đích với insulin thông qua AMPK, metformin còn ức chế G6Pase làm giảm tổng hợp glucose tại gan. Tác dụng này của metformin là do ức chế biểu hiện gen của G6Pase và hòan toàn độc lập với con đường truyền tín hiệu của insulin. Một hợp chất khác là eugenol khi sử dụng cho chuột ĐTĐ typ 2 cũng có giảm glucose máu và giảm hoạt độ enzym G6pase gan [159].

Mô ̣t enzym chủ chố t khác trong con đườ ng tân ta ̣o glucose là fructo1,6 biphosphatase (F1,6BPase). F1,6BPase xú c tác chuyển F1,6BP thành F6P trong con đườ ng tân ta ̣o glucose do đó ức chế F1,6Bpase gây hạ glucose máu [124]. CS-917 là một hoạt chất được phát triển bởi Metabasis với tác dụng ức chế F1,6BPase đang đươ ̣c đưa vào thử nghiê ̣m lâm sàng [186]. Trong nghiên cứu của Srinivasan, uegenol không chỉ có tác dụng ức chế G6Pase mà còn có cả tác dụng ức chế F1,6BPase trên chuột ĐTĐ typ 2 [159].

Ngoài cơ chế hạ glucose máu thông qua ức chế hai enzym tân tạo glucose là G6Pase và F1,6Bpase, sự ức chế glycogen phosphorylase (GP), (một enzym chủ chố t trong quá trình thoái hó a glycogen cũng glucose máu. Đây cũng là một đích triển vọng trong điều trị ĐTĐ thực nghiệm được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm [44], [63].

Cơ chế gây hạ glucose máu bởi hoạt hóa các enzym trong quá trình thoái hóa glucose như glucokinase/hexokinase (GK), phosphofructokinase-1 (PFK-1) cũng được nghiên cứu [6], [21]. Bên cạnh sự hoạt hóa các enzym trong quá trình thoái hóa glucose gây hạ glucose máu. Với tác dụng hoạt hóa enzym glycogen synthase, dịch chiết ethanol lá cây cà ri (Murraya koenigii) khi sử dụng cho chuột ĐTĐ thực nghiệm gây bởi STZ, cho thấy sự khôi phục lượng glycogen gan, tăng hoạt độ glycogen synthase và giảm hoạt độ GP [21]. Kết quả nghiên cứu trên cây hương nhu tía (Ocimum sanctum L) ở mô hình ĐTĐ thực nghiệm

bởi alloxan cho thấy có sự giảm glucose máu, kèm theo tăng nồng độ glycogen trong gan [82]. 1.2.3.2. Tác dụng tương tự insulin thông qua hoạt hóa GLUT4

GLUT4 bình thường được dự trữ trong các hạt. Khi insulin gắn với receptor, các hạt chuyển ra bề mặt tế bào, hòa lẫn vào màng, làm tăng số lượng GLUT4 ở màng tế bào để vận chuyển glucose vào trong tế bào. Khi lượng insulin giảm, GLUT4 được tách khỏi màng tế bào nhờ cơ chế thực bào, hình thành các hạt nhỏ, sau đó hòa vào nhau thành các hạt endosome lớn hơn. Các hạt endosome này chứa nhiều GLUT4 tiếp tục được phân chia thành các hạt nhỏ, sẵn sàng vận chuyển ra màng tế bào khi nồng độ insulin tăng lên (hình 1.8) [182].

Hình 1.8. Liên quan giữa insulin và GLUT4 [182]

Hạ glucose máu thông qua cơ chế kích thích GLUT4 đã được chứng minh trong một số nghiên cứu [42], [70]. Nghiên cứu về tác dụng của lá cây sung ngọt (Ficus carica L) trên chuột béo phì ĐTĐ typ 2 thực nghiệm, cho thấy có sự giảm nồng độ glucose máu kèm theo tăng biểu hiện gen GLUT4 [70]. Nghiên cứu mới đây của Dehghan (2016) về một chế phẩm có tên là Saffron được sản xuất từ nhụy hoa cây nghệ tây (Autumn Crocus) cho thấy tác dụng hoạt hoá và tăng biểu hiện gen của GLUT4 trên cả in vivo và in vitro [42]. 1.2.4. Ức chế tiêu hóa carbohydrat Sự tăng nhanh glucose máu sau bữa ăn góp phần vào sự hình thành các biến chứng của ĐTĐ. Các nghiên cứu với mục đích hạn chế tăng glucose máu sau ăn thường tập trung vào các enzym tham gia vào quá trình tiêu hóa glucid [80].

Enzym đã được biết đến từ lâu là α-glucosidase xú c tác phản ứ ng thủ y phân maltose thành D-glucose, làm tăng nồng độ glucose máu sau ăn. Nhó m thuố c tác dụng theo cơ chế ức chế α-glucosidase, hạn chế tăng glucose máu sau ăn như acarbose, miglitol và voglibose đã được sử dụng rộng rãi trong điều trị ĐTĐ [19],[80].

Ngoài các cơ chế gây hạ glucose máu nói trên, một số nghiên cứu đã

Tăng nồng độ glucose máu sau ăn do thủy phân liên kết α của các polysaccharid, tinh bột và glycogen còn phụ thuộc vào vai trò quan trọng của enzym α-amylase. Nghiên cứu ức chế enzym α-amylase, hạn chế tăng glucose máu sau ăn như dịch chiết lá chè xanh (Camellia sinensis L.), chàm mèo (Strobilanthes cusia N.) ức chế α-amylase giúp làm giảm glucose máu sau ăn [38],[76]. 1.2.5. Các cơ chế khác gây hạ glucose máu chứng minh nồng độ glucose máu còn bị ảnh hưởng bởi các yếu tố khác. 90% glucose được tái hấp thu bởi hệ vận chuyển protein SGLT2 ở ống lượn gần. Do vậy, ức chế SGLT2 sẽ làm giảm glucose máu [125]. Các thuốc dapagliflozin, canagliflozin, empagliflozin tác dụng theo cơ chế này đã được phê duyệt sử dụng trong điều trị [19]. Một số chất đang trong giai đoạn nghiên cứu lâm sàng như sergliflozin, remogliflozin, ASP-1941, BI-10.773 và BI-44.847 [125], [178].

Sự tái hấp thu glucose tại ống thận còn được điều hoà bởi receptor của yếu tố tăng trưởng β (Transforming growth factor-β/TGF-β receptor), một yếu tố gây xơ hóa thận từ đó dẫn đến giảm sức lọc của cầu thận gây tăng glucose máu. Do đó ức chế TGF-β sẽ làm tăng sức lọc của cầu thận giảm glucose máu sau ăn [50], [85]. Nghiên cứu của Kim và cộng sự với hyperosid và quercitin có trong dịch chiết ethanol cây Osteomeles schwerinae, cho thấy 2 chất này có tác dụng hạ glucose máu đi kèm với ức chế sự biểu hiện gen của TGF-β [85].

Ha ̣n chế sự tăng glucose máu sau bữa ăn có còn liên quan đến amylin, một hormon peptid đươ ̣c bài tiết từ tế bào β đảo tụy đồ ng thờ i vớ i insulin sau khi ăn, có tác dụng làm giảm tiết glucagon. Các nghiên cứu đã chứng minh có sự lắng đọng và kết tu ̣ amylin trong bệnh ĐTĐ typ 2 [93]. Pramlintid là một chất tổng hợp hóa học với ưu điểm không bi ̣ kết tu ̣ như amylin và có những đă ̣c tính dươ ̣c đô ̣ng ho ̣c và dươ ̣c lực ho ̣c tương tự như amylin nô ̣i sinh đã đươ ̣c phê duyê ̣t để điều tri ̣ đái tháo đườ ng typ 1 và đái tháo đườ ng typ 2 [19].

Các nghiên cứu đã chứng minh béo phì có liên quan chặt chẽ với bệnh sinh của ĐTĐ typ 2. Béo phì liên quan đến leptin, một hormon do các tế bào mô mỡ bài tiết ra, nhiê ̣m vu ̣ truyền tín hiê ̣u củ a gen ob cho não nhận biết cảm giác no,

dẫn tới ngừ ng đưa thứ c ăn vào cơ thể. Trên tu ̣y, leptin làm tăng nha ̣y cảm củ a insulin và giảm triglycerid, cholesterol toàn phần. Sử dụng leptin điều trị cho chuột ĐTĐ typ 2 béo phì làm giảm nồng độ glucose máu [35], [165]. 1.3. CÁC MÔ HÌNH THỰC NGHIỆM TRONG NGHIÊN CỨU THUỐC ĐIỀU TRỊ ĐÁI THÁO ĐƯỜNG 1.3.1. Các mô hình thực nghiệm in vivo 1.3.1.1. Mô hình gây bệnh ĐTĐ typ 1

ĐTĐ typ 1 là do tổn thương thường do tự miễn tế bào β đảo tụy. Do vậy, các mô hình ĐTĐ typ 1 cũng được phát triển dựa trên nguyên tắc gây suy giảm về cấu trúc và hoặc chức năng của đảo tụy. Có nhiều phương pháp khác nhau để gây ĐTĐ typ 1 thực nghiệm trên động vật, từ đơn giản đến phức tạp. Dưới đây là một số phương pháp được sử dụng phổ biến trong các nghiên cứu dược lý thực nghiệm.

- Đái tháo đường typ 1 do di truyền Gây bệnh ĐTĐ typ 1 theo phương pháp lai tạo và chọn giống bằng cách chuyển gen hoặc gây đột biến gen. Trên mô hình này, các nhà khoa học đã tìm ra nhiều loại gen liên quan đến sự phá hủy tế bào β như: Idd1, Idd5, Idd 9... trên chuột NOD; Ins2 trên chuột Akita hay Iddm1 trên chuột BB [97]. Mô hình này còn có những hạn chế nhất định như quy trình gây bệnh phức tạp và khả năng thành công giữa các cá thể là không ổn định phụ thuộc vào đáp ứng miễn dịch của từng cá thể. Mặt khác, thời gian gây bệnh kéo dài 18-20 tuần, chi phí tốn kém. Hiện nay, chưa thấy có các giống chuột ĐTĐ typ 1 do di truyền tại Việt Nam.

- Đái tháo đường typ 1 do cắt bỏ tuyến tụy Mô hình gây ĐTĐ typ 1 bằng cách cắt bỏ tuyến tụy là một phương pháp kinh điển gây ĐTĐ typ 1 ở một số loài động vật với các triệu chứng tương tự như ĐTĐ typ 1 ở người. Mức độ trầm trọng của bệnh phụ thuộc vào mức độ phá hủy tụy (một phần hay hòan toàn). Điểm hạn chế của mô hình này là sự tái sinh của tuyến tụy còn lại. Do đó mô hình này chỉ thích hợp cho các nghiên cứu về cơ chế thích nghi của tế bào β tuyến tụy. Cắt bỏ một phần tuyến tụy là yêu cầu kỹ thuật cao, phải sử dụng thuốc mê và kháng sinh phòng nhiễm khuẩn, có thể gây ảnh hưởng đến kết quả nghiên cứu. Sau khi cắt bỏ phần lớn tụy, động vật ít đáp ứng với các tác động nhằm hạ glucose máu. Hơn nữa, trong quá trình làm thí nghiệm cần phải thường xuyên bổ xung các enzym tụy ngoại tiết khác cho động vật thực nghiệm [75].

- Đái tháo đường typ 1 do hóa chất

Hiện nay, mô hình gây bệnh ĐTĐ týp 1 thường được tạo ra bằng một số tác nhân phá hủy tế bào β tuyến tụy trong đó có streptozptocin (STZ) hoặc alloxan đã thực hiện trên các loài động vật như chó, mèo, thỏ và các động vật thuộc bộ gặm nhấm [32], [75].

+ Sử dụng alloxan liều cao (120-150 mg/kg) Alloxan, một hợp chất pyrimidin triceton có cấu trúc tương tự glucose, tích lũy gây độc trực tiếp và chọn lọc trên tế bào β của tuyến tụy. Alloxan phá hủy tế bào β gây ra tình trạng ĐTĐ phụ thuộc insulin. Alloxan cũng có tác dụng ức chế glucokinase do đó ức chế bài tiết insulin. Động vật được gây ĐTĐ bằng alloxan có những biểu hiện lâm sàng giống biểu hiện ĐTĐ ĐTĐ typ 1 trên người [28]. Liều dùng để gây ĐTĐ trên động vật thực nghiệm tùy thuộc vào từng nghiên cứu [26], [28]. Ưu điểm của mô hình này là dễ thực hiện, gây được mức glucose máu tăng cao ổn định trong một thời gian ngắn sau khi tiêm alloxan nhưng nhược điểm là tế bào gan, thận và các cơ quan khác cũng bị ảnh hưởng bởi sự oxy hóa của alloxan [26].

+ Streptozocin (STZ) liều cao (150-200 mg/kg) Giữa thập niên 60 của thế kỷ trước, các nhà khoa học đã phát hiện ra độc tính chọn lọc của STZ trên các tế bào β đảo tụy, gợi ý cho sử dụng STZ để gây ĐTĐ typ 1. STZ có khả năng gây tăng glucose máu ổn định hơn alloxan, đồng thời ít gây ra nhiễm toan ceton và ít gây chết động vật nghiên cứu hơn alloxan. Hiện nay, STZ được dùng thay thế dần alloxan trong các nghiên cứu ĐTĐ thực nghiệm trên động vật. Liều STZ gây ĐTĐ typ 1 trên động vật thực nghiệm thay đổi tùy từng nghiên cứu và tùy từng loài [32], [75]. - Đái tháo đường typ 1 do nhiễm virus Trên cơ sở sự liên quan của một số loại virus với bệnh sinh ĐTĐ typ 1, có thể gây ĐTĐ typ 1 thực nghiệm với virus coxsacki hoặc một số virus khác như: quai bị, rubella, rota, parvo, herpes, entero viêm gan B, C. Sau đó xác định nồng độ interleukin 10 (IL-10) và theo dõi quá trình tự phá hủy của tế bào tại các mạch bạch huyết [114]. Mô hình này chưa được áp dụng tại Việt Nam. 1.3.1.2. Mô hình gây bệnh ĐTĐ typ 2

ĐTĐ typ 2 là sự rối loạn phức tạp liên quan đến các yếu tố di truyền, dịch tễ học, chuyển hóa và môi trường. Mô hình gây bệnh ĐTĐ typ 2 thường được các nghiên cứu áp dụng dựa trên yếu tố di truyền, chế độ dinh dưỡng và hóa chất với mục đích làm tăng glucose máu và kháng insulin ở mô ngoại vi [32], [75].

- ĐTĐ typ 2 do đột biến gen

Gen leptin trên chuột béo phì (ob/ob) và chuột ĐTĐ (db/db) đóng vai trò

điều chỉnh lượng thức ăn, tiêu hao năng lượng và duy trì chuyển hóa năng lượng.

Những chuột thiếu hụt gen leptin và receptor của nó, có thể dẫn đến béo phì và

kháng insulin [165]. Mô hình gây bệnh ĐTĐ typ 2 bằng đột biến gen leptin được

thực hiện trên các chủng chuột: C57BL/6, Zucker, Sprague Dawley...[86], [165].

Mặt khác, các nhà khoa học, cũng đã tìm ra được 1 số loại gen nhạy cảm với

ĐTĐ typ 2 như Tbc1d, Pctp, Abcg1, Nmur2, Nob3, Zfp69. Sự đột biến các gen

nhạy cảm trên dẫn đến khởi phát ĐTĐ typ 2 [86], [165]. Ngoài ra, đột biến gen

gây ức chế biểu hiện gen GLUT2 và GLUT4 cũng dẫn đến xuất hiện sự kháng

insulin và tăng glucose máu [86].

Mô hình ĐTĐ typ 2 di truyền có béo phì hoặc không béo phì có bệnh sinh

gần giống với bệnh sinh ĐTĐ typ 2 ở người. Trong mô hình này các chủng

chuột di truyền đã được chọn lựa và phát triển bệnh ĐTĐ typ 2 một cách tự

nhiên. Tuy nhiên, mô hình này đòi hỏi điều kiện kỹ thuật lai tạo phức tạp, kinh

phí tốn kém nên cũng chưa được thực hiện tại Việt Nam.

- Gây ĐTĐ typ 2 bằng cách sử dụng hóa chất

+ Sử dụng STZ liều thấp

Thông qua lựa chọn liều STZ, có thể gây được những biểu hiện tương tự

ĐTĐ typ 2. Các liều STZ thường được sử dụng là liều thấp (35-65mg/kg tiêm

màng bụng) [37], . Ưu điểm của mô hình sử dụng STZ liều thấp để gây ĐTĐ typ

2 là sự tăng glucose máu ổn định. Hạn chế lớn nhất là thiếu những bằng chứng

rõ ràng về tình trạng kháng insulin. Hiện nay, các nhà khoa học hạn chế sử dụng

đơn độc liều STZ để gây mô hình ĐTĐ typ 2 cho động vật mà thường kết hợp

STZ với nicotinamid hoặc với chế độ ăn giàu chất béo [33],[168].

+ Kết hợp STZ và nicotinamid: Nicotinamid là một chất chống oxi hóa

bảo vệ tế bào bằng cách trung hòa các gốc tự do được sinh ra bởi STZ và hạn

chế tổn thương tế bào β đảo tụy. Do đó, sự kết hợp sử dụng STZ với nicotinamid

cũng được sử dụng để gây bệnh ĐTĐ typ 2. Liều thường sử dụng trong mô hình

này từ 60 - 240 mg/kg nicotinamid tùy từng nghiên cứu. Sự kết hợp này cùng

với chế độ ăn giàu chất béo cũng được sử dụng để gây bệnh ĐTĐ typ 2 trên

chủng chuột C57BL/6J [168]. Ưu điểm của mô hình này là sự tăng glucose máu

ổn định, và, mô hình gây bệnh đơn giản, có thể thực hiện được tại Việt Nam.

+ Kết hợp STZ liều thấp và chế độ ăn giàu chất béo là phương pháp được

sử dụng phổ biến trong các nghiên cứu để gây ĐTĐ thể béo phì ở loài gặm nhấm

như chuột cống chủng Wistar, C57BL/6J, KK-ay và Sprague Dawley [54],

[173]. Nguyên tắc tiến hành bao gồm cho chuột ăn thức ăn giàu chất béo (thành

phần chất béo trong thức ăn chiếm khoảng 40-60% tổng lượng calo) trong thời

gian dài (1-2 tháng) để gây kháng insulin và gây tổn thương tế bào β đảo tụy

[173]. Chuột gây béo phì bằng phương pháp này có nhiều đặc điểm giống với

béo phì trên người như tăng nồng độ leptin, tăng kháng insulin, giảm biểu hiện

của adiponectin và resistin [35]. Để rút ngắn thời gian gây mô hình, có thể kết

hợp chế độ ăn giàu chất béo với một hóa chất gây phá hủy tế bào β đảo tụy với

liều thấp, trong đó STZ liều thấp thường được sử dụng phổ biến [54], [173]. Tại

Việt Nam, một số tác giả đã áp dụng mô hình gây ĐTĐ typ 2 cho chuột thực

nghiệm bằng chế độ ăn giàu chất béo kết hợp với tiêm STZ liều thấp [6],[11].

1.3.2. Các mô hình thực nghiệm in vitro

Các mô hình in vitro đánh giá ảnh hưởng cụ thể của thuốc ở mức độ tế

bào, phân tử giúp tìm hiểu sâu hơn về cơ chế tác dụng của thuốc. Các mô hình

nghiên cứu in vitro cũng rất hữu ích trong nghiên cứu sàng lọc ban đầu khi cần

sàng lọc một số lượng lớn các mẫu.

1.3.2.1. Đánh giá tác động lên hoạt tính của các enzym tiêu hóa và chuyển

hóa glucid

- Enzym tiêu hóa glucid

Các enzym tham gia tiêu hóa glucid liên quan đến nồng độ glucose máu

sau ăn thường được nghiên cứu in vitro là: α-glucosidase (EC 3.2.1.20), α-

amylase (EC 3.2.1.1) và β-galactosidase (EC 3.2.1.23) [80]. Phương pháp nghiên

cứu ức chế enzym tiêu hóa glucid nghiên cứu thuốc điều trị ĐTĐ typ 2 là

phương pháp đơn giản, dễ thực hiện.

- Enzym chuyển hóa hóa glucid

Mô hình thực nghiệm in vitro liên quan đến tổng hợp glucose thường

được các nghiên cứu thực hiện với các enzym: glucose 6-

phosphatase (EC 3.1.3.9) và Fructose-1,6-biphosphatase (EC 3.1.3.11). Enzym

liên quan đến quá trình thoái hóa glucose là enzym hexokinase (EC 2.7.1.1 và

EC 2.7.1.2) [40], [57].

Các mô hình đánh giá tác dụng in vitro của thuốc/chế phẩm thử trên các

enzym chuyển hóa glucid có ưu điểm là tốn ít thời gian, không đòi hỏi kỹ thuật

phức tạp, có thể áp dụng sàng lọc một lượng mẫu lớn trong thời gian ngắn, chi

phí thấp.

1.3.2.2. Đánh giá khả năng bài tiết insulin của tế bào β đảo tụy Nghiên cứu ảnh hưởng của thuốc trên khả năng tiết insulin của tuyến tụy có thể tiến hành trên đảo tụy cô lập hoặc tế bào β đảo tụy. Mô hình này hiện đã được bổ sung và hoàn chỉnh để có thể thu được đảo tụy một cách đầy đủ nhất về mặt hình thái cũng như chức năng. Để thu được đảo tụy tinh khiết, một số tác giả đã sử dụng phá vỡ tụy ngoại tiết bằng collagenase kết hợp với phương pháp tách đảo tụy ra khỏi các tạp khác nhờ vào sự khác nhau về tỉ trọng của Kelly [81].

Đánh giá ảnh hưởng của thuốc/chế phẩm thử trên khả năng chết theo chương trình hoặc sự sinh sản, thay đổi kích thước tế bào β của chuột cũng đã được các nhà khoa học áp dụng trong một số nghiên cứu [120],[167]. Chức năng của tế bào β được thông qua đánh giá nồng độ insulin và mức độ biểu hiện gen của một số protein đặc hiệu [120].

1.3.2.3. Đánh giá mức độ nhạy cảm của mô đích với insulin

Các dòng tế bào nguyên phát được nuôi cấy, biệt hóa thành tế bào trưởng

thành trong môi trường thích hợp. Sau đó các tế bào được ủ với mẫu thử ở nồng

độ khác nhau trong các điều kiện về môi trường, nhiệt độ, chất xúc tác, chất ức

chế…cho phù hợp với từng mô hình thực nghiệm cụ thể. Đánh giá sự nhạy cảm

của mô đích với insulin thông qua mức độ mức độ biểu hiện gen tổng hợp các

protein có vai trò quan trọng trong hoạt động của insulin như IRS-1, Akt, GSK3,

AMPK, PPAR, GLUT4 thông qua số lượng các protein được tạo thành sau thí

nghiệm [70], [183], so sánh với lô chứng không ủ mẫu thử từ đó có kết luận về

tác dụng của mẫu thử.

Tế bào cơ xương đóng vai trò quan trọng trong chuyển hoá glucose, tạo

năng lượng cho hầu hết các hoạt động của cơ thể hoặc dự trữ dưới dạng

glycogen [183]. Mô hình thực nghiệm in vitro trên tế bào cơ xương được nhiều

nghiên cứu sử dụng để đánh giá mức độ nhạy cảm của tế bào đích với insulin

[140]. Dòng tế bào C2C12 và L6 là những dòng tế bào cơ xương chuột có khả

năng tồn tại tốt hơn các tế bào khác trong các điều kiện khác nhau. Các tế bào dễ

sinh trưởng trong điều kiện nồng độ huyết thanh cao và có biểu hiện lặn trong

điều kiện nồng độ huyết thanh thấp. Hai dòng tế bào này là một công cụ rất hữu

ích để nghiên cứu về sự trao đổi chất trong cơ thể, đặc biệt là glucose [140].

Bên cạnh tế bào cơ xương, các tế bào mô mỡ thường được sử dụng trong

nghiên cứu in vitro để đánh giá tác dụng giảm kháng insulin của mô đích ví dụ

như là tế bào 3T3-L1 và tế bào Schwann. 3T3-L1 là một dòng tế bào có nguồn

gốc từ chuột. Khi biệt hoá tế bào này, có khả năng tổng hợp và dự trữ triglycerid.

Những tế bào này cũng rất nhạy cảm với kích thích tố, thuốc, hormon và insulin

[55],[72].

Dòng tế bào Schwann là các tế bào mô mỡ (IM S32 và IFRS1) đệm bao

quanh tế bào thần kinh. Các tế bào này có thể tồn tại trong ống nghiệm trong

điều kiện thiếu chất dinh dưỡng từ 2 đến 3 tuần và có thể sống trong môi trường

thử nghiệm in vitro từ 6 tuần đến 6 tháng [98].

Ưu điểm của các mô hình in vitro trên bế bào là thời gian thử nghiệm

ngắn hơn rất nhiều so với mô hình in vivo và đánh giá được tác dụng ở mức độ tế

bào, phân tử. Nhưng nhược điểm là quy trình kỹ thuật phức tạp mà không phải

phòng thí nghiệm nào cũng có thể thực hiện được.

Bên cạnh các nghiên cứu trên dòng tế bào, một số nghiên cứu có thể đánh

giá cơ chế tác dụng của thuốc trong ĐTĐ typ 2 thông qua tác động in vitro lên

các enzym có vai trò quan trọng trong hoạt động của insulin như PTP1B (EC

3.1.3.48) [109], GSK-3α (EC 2.7.11.26) [147]. Tác động ức chế các enzym này

sẽ góp phần làm tăng hoạt động của insulin ở mô đích. Các nghiên cứu in vitro

được thực hiện đã giúp tìm ra được nhiều chất có nguồn gốc từ dược liệu có tác dụng ức chế PTP1B [51], [109], [146].

1.4. CÂY CHUỐI TIÊU 1.4.1. Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật 1.4.1.1. Vị trí phân loại

Theo các tài liệu Thực vật hiện có tại trường Đại học Dược Hà Nội bao

gồm: Cây cỏ Việt Nam- Phạm Hoành Hộ, Từ điển thực vật thông dụng- Võ Văn

Chi , Flora of China Vol 4, Flora Reipubliace Popularis Sinicae – Tomus 16(2)

và phân loại Thực vật; Từ điển cây thuốc Việt Nam, cây chuối tiêu thuộc chi

Musa, một chi nằm trong họ Chuối (Musaceae). Vị trí của cây chuối tiêu trong

hệ thống phân loại thực vật được được tóm tắt như sau:

Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)

Lớp Hành ( Liliopsida)

Phân lớp Hành (Lilidae)

Bộ Gừng (Zingiberales)

Họ Chuối (Musaceae)

Chi Musa X

Loài paradisiaca

1.4.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố Chuối tiêu thuộc loại cây thảo, rễ ngắn, thân giả cao từ 2,5m đến 4,0m, thân thật là phần nằm dưới mặt đất gọi là củ chuối. Lá có bẹ, cuống lá hình tròn có khuyết rãnh, lá to, dài, mặt trên màu xanh đậm, mặt dưới xanh nhạt. Cán hoa xuyên từ thân, hoa mọc thành bông buồng, có lá bắc màu đỏ, bầu dưới 3 ngăn. Quả nằm trên buồng, buồng có từ 6-10 nải, mỗi nải khoảng 12-20 quả. Quả thuộc loại đơn tính, quả nhỏ, dài, khi chín có màu vàng, mùi thơm, vị ngọt [3]. Chuối tiêu được trồng khắp nơi ở Việt Nam và ở các nước vùng nhiệt đới Châu Á, Châu Âu, Châu Mỹ.

Hình 1.9. Cây chuối tiêu chụp ở xã Giang Sơn, huyện Gia Bình, tỉnh

Bắc Ninh (Musa x paradisiaca L.)* * Thời gian chụp: tháng 4 năm 2014

1.4.2. Bộ phận dùng

Quả chín, quả xanh, vỏ quả, nụ hoa, lá, thân rễ, thân giả. Trong nghiên

cứu này luận án sử dụng thân giả cây chuối tiêu sau khi đã thu hoạch quả. 1.4.3. Các nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng dược lý của cây chuối tiêu (Musa x paradisiaca L.)

1.4.3.1. Nghiên cứu về thành phần hoá học

Thành phần hóa học của các bộ phận khác nhau của cây chuối tiêu (quả, vỏ quả, hoa, lá, thân) bao gồm: tanin, saponin, glycosid, alcaloid, , flavonoid, polyphenol, sterol, glycosid, terpenoid, quinon [15], [69], [116].

Năm 2013, Adeolu và cộng sự đã ghi nhận bẹ hoa cây chuối tiêu có chứa nhiều chất khác nhau: các chất khoáng (Ca, K, Mg, p, Fe, Na); Vitamin A, B1, B2, B3, C; các hợp chất có hoạt tính sinh học như alcaloid, tanin, flavonoid, phenol, saponin [15].

Bộ phận dùng là vỏ quả của cây chuối tiêu đã được Silva và các cộng sự nghiên cứu và xác định được các hợp chất cycloeucalenone, 31- norcyclolaudenone, 24-methylene-cicloartanol, β-sitosterol và stigmasterol [149].

Để nghiên cứu thành phần hóa học trong lá của cây chuối tiêu, Osmund và cộng sự (2014) đã chiết xuất bằng ethanol và cho thấy trong lá có chứa vitamin A, C, E. Ngoài ra: alcaloid, flavonoid, protein, carbon hydrat, tanin, saponin, chất béo, steroid, terpenoid, glycosid cũng được tìm thấy trong dịch chiết này [116].

Không chỉ nghiên cứu về thành phần hóa học của các bộ phận dùng khác nhau của cây chuối tiêu, các nhà khoa học còn tiến hành phân lập hoạt chất và xác định cấu trúc. Một báo cáo tổng quan từ các nghiên cứu về thành phần hóa học của quả chuối tiêu cho thấy trong nước ép của quả chuối tiêu có chứa acid amin, các hợp chất indol, tanin, tinh bột, chất sắt, đường khử, vitamin C, vitamin B, albuminoid, chất béo, muối khoáng. Các chất đã được phân lập từ quả của cây chuối tiêu bao gồm: sitoindosid-I, sitoindosid-II, sitoindosid-III, sitoindosid-IV và sitosterol gentiobiosid, sitosterol myo-inosityl-β-D-glucosid [69].

Bộ phận dùng là thân của cây chuối tiêu cũng đã được các nhà Khoa học

trên thế giới nghiên cứu sơ bộ.

Năm 2011, thân cây chuối tiêu đã được Ekpo và cộng sự (2011) nghiên cứu thành phần hóa học, kết quả cho thấy dịch ép từ thân cây chứa tanin, saponin, glycosid và dịch ép gốc cây có chứa flavonoid, glycosid [45].

Một nghiên cứu khác được thực hiện bởi Onynekwe và cộng sự (2013) cho thấy dịch ép của thân cây chuối tiêu có chứa glycosid, tanin, alcaloid, saponin, flavonoid, polyphenol, đường khử [115].

Vankatesh và cộng sự 2013 cũng đã ghi nhận thành phần hóa học của thân cây chuối tiêu có chứa sterol, flavonoid, glycosid, terpenoid, tanin, quinon [170].

1.4.3.2. Nghiên cứu về tác dụng dược lý

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra các bộ phận khác nhau của cây chuối tiêu có các tác dụng sinh học bao gồm: chống oxy hóa [16], chống viêm [117], kháng khuẩn [170].

Jawla và cộng sự (2012) chiết xuất hoa cây chuối tiêu với dung môi là ethanol / nước (1:1). Kết quả cho thấy dịch chiết có tác dụng kháng khuẩn trên các chủng B. subtilis, B. cereus, E. coli, K. Pneumoniae, P. mirabilis, P. aeruginosa, S. Pneumoniae và một số vi nấm. Tác dụng này tương đương với amikacin và clotrimazol [73].

Nghiên cứu về thân của cây chuối tiêu được thực hiện bởi Vankatesh và các cộng sự (2013), kết quả cho thấy dịch chiết ethanol của thân cây chuối tiêu có tác dụng kháng khuẩn trên các loại vi khuẩn như P. vulgaris, P. aeruginosa, S. aureus, S. typhi, S. paratyphi, K. pneumoniae, B. subtilis… tác dụng này được so sánh với ciprofloxacin [170].

Năm 2017, Correa và cộng sự cũng đã sử dụng phương pháp chiết xuất siêu tới hạn thu dịch chiết từ hoa của cây chuối tiêu và ghi nhận dịch chiết này có tác dụng chống oxy hóa [36].

Quả chuối tiêu xanh được Alabi và cộng sự (2013) sấy khô nghiền thành bột và thử trên chuột với liều 500 và 1000 mg/kg/ngày, uống trong 28 ngày. Kết quả cho thấy mẫu thử có tác dụng làm tăng số lượng và chất lượng tinh trùng trên chuột cống trắng [17].

Trong nghiên cứu của Padilla-Camberos và cộng sự (2016), từ vỏ của quả chuối xanh, phân đoạn methanol và n-hexan có tác dụng chống viêm trên chuột cống [117].

Dịch chiết ethanol của thân cây chuối tiêu được Venkatesh và cộng sự (2014) nghiên cứu về tác dụng chống co giật trên chuột nhắt trắng. Kết quả cho thấy dịch chiết ethanol của thân cây chuối tiêu có tác dụng chống co giật trên chuột thực nghiệm với ghi nhận có sự giảm co giật bởi shock điện và giảm các vận động trên chuột [172].

Như vậy, các bộ phận dùng khác nhau của cây chuối tiêu đã được nghiên cứu về thành phần hóa học, tác dụng dược lý. Trong đó, tác dụng hạ glucose máu cũng được các nhà khoa học quan tâm.

Sau đây là một số nghiên cứu về tác dụng hạ glucose máu của các bộ

phận dùng khác nhau của cây chuối tiêu:

Năm 2011, Shanmuga và cộng sự đã thử nghiệm với dịch chiết ethanol của hoa cây chuối tiêu với liều sử dụng cho đường uống là 200 mg/kg trên chuột cống trắng bị tăng glucose máu bởi STZ (45mg/kg). Ghi nhận sau 30 ngày uống mẫu thử, nồng độ glucose máu giảm 62,01% so với ngày đầu tiên [142].

Nghiên cứu của Jawla và cộng sự năm 2012 trên chuột tiêm alloxan cho thấy dịch chiết ethanol: nước (1:1) của hoa cây chuối tiêu với liều sử dụng bằng đường uống cho chuột tăng glucose máu bởi alloxan (120 mg/kg) là 100; 250 và 500 mg/kg, sau 7 ngày uống mẫu thử, nồng độ glucose hạ tương ứng là 68,72; 73,18 và 66,08% [73].

Ashish và cộng sự (2016) đã thử nghiệm dịch chiết nước của hoa cây chuối tiêu và sử dụng bằng đường uống với các liều 100; 200, và 400 mg/kg cho chuột bị ĐTĐ bởi STZ 65mg/kg và nicotinamid 110mg/kg. Sau 21 ngày uống mẫu thử, nồng độ glucose máu của các lô chuột hạ tương ứng là 44,09; 61,74 và 68,11 % [22].

Năm 2012, Shodehinde và cộng sự đã tiến hành đánh giá tác dụng hạ glucose máu trên chuột cống ĐTĐ typ 2 của dịch ép quả chuối tiêu xanh. Kết quả cho thấy bột thô được điều chế từ dịch ép quả chuối tiêu ở nồng độ 4 mg/ml ức chế 70% enzym α-glucosidase in vitro [148].

Nghiên cứu về bộ phận dùng là lá của cây chuối tiêu cũng đã được các nhà khoa học quan tâm. Kappel và cộng sự (2013) đã chứng minh cắn phân đoạn dịch chiết n-butanol của lá cây chuối tiêu (với liều 50 mg/kg chuột) làm tăng dung nạp glucose trong test dung nạp glucose đường uống, tăng nồng độ glycogen ở gan và kích thích đáng kể sự bài tiết insulin của chuột cống trắng bị ĐTĐ bởi alloxan (150 mg/kg) [79].

Với một cách tiếp cận khác, Silva và cộng sự (2016) đã thử nghiệm trên chuột Wistar được gây ĐTĐ thực nghiệm bởi alloxan (150mg/kg). Chuột được cho ăn bằng thức ăn tổng hợp có bổ sung bột lá chuối với các tỷ lệ 25; 50 và 75%. Trong vòng 12 tuần, có sự giảm nồng độ glucose máu 75,06 % (ở lô có chế độ ăn chứa 75% là bột thô lá chuối). Mức hạ glucose máu ở lô chuột này tương đương với lô chuột uống metfformin (50mg/kg). Nghiên cứu này cũng ghi nhận được nồng độ lipid trong gan chuột giảm tương ứng là 23,59; 28,15 và 29,85 % so với lô chuột ăn chế độ ăn bình thường [150].

Lakshmi và cộng sự (2014) không những nghiên cứu về lá mà còn nghiên cứu về rễ, vỏ quả và gốc (thân rễ) của cây chuối tiêu trên chuột cống trắng ĐTĐ

thực nghiệm bởi STZ (45mg/kg). Nghiên cứu ghi nhận chỉ có dịch chiết ethanol lá và vỏ quả giảm nồng độ glucose máu 20,5 và 25,5 % so với lô chứng [89]. Nhiều bộ phận dùng của cây chuối tiêu đã được nghiên cứu và ghi nhận về tác dụng hạ glucose máu trên động vật thực nghiệm. Thân của cây chuối tiêu với tác dụng hạ glucose máu cũng đã được nghiên cứu.

Năm 2007, Singh và cộng sự đã tiến hành đánh giá tác dụng hạ glucose máu của thân cây chuối tiêu trên chuột cống trắng được gây ĐTĐ bằng STZ (45mg/kg). Bột thân cây chuối tiêu được sử dụng bằng đường uống với liều 500 mg/kg chuột. Kết quả ghi nhận bột thân cây chuối tiêu có tác dụng tăng glucose máu 28,3% ở chuột bình thường. Trong khi đó, ở chuột ĐTĐ thực nghiệm, kết quả tăng dung nạp glucose lên 16,4% sau 4 giờ thử test dung nạp glucose [153]. Trong nghiên cứu của Sunneetha và cộng sự (2010) đã sử dụng liều 1,0 g/kg trên mô hình chuột ĐTĐ bởi alloxan (150 mg/kg). Sau 21 ngày uống mẫu thử, ghi nhận nồng độ glucose máu giảm 75% , triglycerid giảm 14,44 % và cholesterol giảm 64,37% [163].

Năm 2011, Ekpo và cộng sự đã thử nghiệm với bột khô từ dịch ép toàn phần gốc thân cây chuối tiêu với liều 1000 mg/kg thể trọng trên chuột chuột cống bị ĐTĐ bằng alloxan (150 mg/kg). Kết quả cho thấy cắn toàn phần gốc thân cây chuối tiêu có tác dụng hạ glucose máu tại các thời điểm 2 giờ và 4 giờ, khác biệt so với lô chứng [45].

Như vậy, mặc dù đã có một số nghiên cứu bước đầu chứng minh tác dụng hạ glucose máu của thân cây chuối tiêu trên chuột thực nghiệm nhưng chưa có nghiên cứu nào đi vào tìm hiểu cơ chế hạ glucose máu cũng như tác động trên chuyển hóa của bộ phận dùng này.

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2.1.1. Dược liệu nghiên cứu

Thân giả cây chuối tiêu (Musa x paradisiaca L.) được thu hoạch ngay sau khi thu hoạch buồng. Địa điểm thu hoạch tại Xã Giang Sơn, huyện Gia Bình, tỉnh Bắc Ninh. Để đơn giản, trong đề tài này thống nhất gọi bộ phận dùng nghiên cứu theo tên thường gọi (thân cây chuối tiêu). Mẫu nghiên cứu đã được giám định bởi PGS. TS. Trần Văn Ơn, tiêu bản được lưu tại Bộ môn Thực vật, trường Đại học Dược Hà Nội. Số hiệu tiêu bản HNIP/18149/16 (phụ lục I).

Hình 2.1. Thân cây chuối tiêu thu hoạch tại xã Giang Sơn, huyện Gia Bình, tỉnh Bắc Ninh* * Thời gian chụp: tháng 6 năm 2014

- Chuột nhắt trắng, giống đực chủng Swiss, khoẻ mạnh, trọng lượng 18-

2.1.2. Động vật thí nghiệm 22g, do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp

- Chuột cống trắng, giống đực, chủng Wistar, khỏe mạnh, trọng lượng

80 20g, do Học viện Quân Y cung cấp Động vật thí nghiệm sau khi mua, được nuôi trong điều kiện bình thường của phòng thí nghiệm nuôi động của Trường Cao đẳng Dược Trung ương Hải Dương 3 ngày để ổn định các chỉ số sinh hoá, sau đó mới bắt đầu làm thực nghiệm. Chế độ chăm sóc chuột trong khi làm thực nghiệm được thực hiện theo thông tư 71/2011/TTBNNPTNT. Thức ăn của chuột bình thường là thức ăn tổng hợp của Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương. Thức ăn của chuột nuôi gây béo phì có chế độ ăn riêng được mô tả trong phần gây ĐTĐ typ 2 trên chuột cống. 2.1.3. Các dòng tế bào cho nghiên cứu in vitro

- Tế bào C2C12 (tế bào cơ vân nguyên phát chuột nhắt) (American Type

- Tế bào 3T3-L1 (Tế bào mô mỡ chuột nhắt) (American Type Culture

Culture Collection (Clone CRL-1772), Mỹ Collection (Clone CRL-1772), Mỹ 2.2. DỤNG CỤ, HÓA CHẤT NGHIÊN CỨU 2.2.1. Thiết bị, dụng cụ

- Máy ép F1-750 (Mạnh Phát), Việt Nam - Máy đo hàm ẩm MX 50 (A&D), Nhật - Máy đo glucose máu Accu-Check Active và que thử tương ứng (Roche), Đức - Máy xét nghiệm Sinh hóa tự động COBAS 6000 (Roche), Đức - Kính hiển vi sinh học gắn camera và monitor (Carl Zeiss), Đức - Máy ly tâm lạnh (Heraeus Sepatech), Đức. - Máy đo quang phổ UV-VIS (Hitachi), Nhật Bản

- Hệ thống máy ELISA gồm có máy lắc, đầu đọc có gắn liền với máy tính và máy in (Bio-Tek Instrument, máy ủ ASYS Hitech), Mỹ

- Máy cất quay (Rotavapor R-210 Buchi), Thụy Sĩ -Thiết bị điện di , thiết bị chuyển màng Western- Blot (Bio Rad), Mỹ - Máy nghiền đồng thể (Ati instruments), Đức - Máy lắc (IKA), Đức - Bản mỏng tráng sẵn silicagel GF254, sắc ký pha đảo (Merck), Đức.

- Sắc ký cột dùng Sephadex LH20; silicagel dùng cho sắc ký pha thường (Merck), Đức - Máy đo phổ khối Agilent 6310 Ion Trap và JEOL JMSHX-100 (Agilent), Mỹ

- Máy đo phổ cộng hưởng từ 500MHz (Bruker BioSpin), Thụy Sỹ. - Máy cất nướ c 2 lần (Human Lab), Hàn Quốc

- Máy cất quay chân không (RE601B), Nhật - Máy sắc kí lỏ ng HPLC Chomaster L500 (Hitachi), Nhật - Thiết bi ̣ cấp nướ c trao đổ i ion dù ng cho HPLC(Labostar DI2), Đức - Cân phân tích điện tử (Precisa), Thụy Sỹ - Máy khuấy từ gia nhiê ̣t C-MAG HS7 (IKA),Đức - Thiết bi ̣ lo ̣c hú t, màng lo ̣c 0,4µm (Sartoius), Đức - Máy đo điểm chảy (MPA161) (DigiMelt), Mỹ - Máy đo pH (EUTECH), Mỹ - Máy li tâm 6.000 v/p (EBA), Đức - Máy đo quang phổ UV/VIS kết nố i máy tính (Thermo), Mỹ - Tủ la ̣nh sâu MDF – U334 (Panasonic), Nhật - Tủ sấy 200C (Memmert), Đức - Hệ thống xử lý mẫu và đọc kết quả tự động Biomek FXp (Beckman

Coulter), Mỹ và SpectraMax MiniMax i3 (Molecular Devices), Anh.

- Tủ ấm nuôi cấy tế bào MRI 162 (Astec Bio), Nhật

2.2.2. Thuốc và hóa chất nghiên cứu

- Streptozocin (STZ) bột pha tiêm (MP Biochemicals, LCC), Pháp - Viên nén metformin hydroclorid (Glucophage 500mg, Merck), - Viên nén gliclazid (Diamicron 80mg, Les Laboratoires Biogaran,

- Huyết thanh ngựa (horse serum: HS), HEPES (4-(2- hydroxyethyl)-1-

- Môi trường nuôi cấy tế bào Roswell Park Memorial Institute (RPMI),

Servier), Pháp - Glucose 6 phosphat (G6P) (Fluka biochemie Gmbh), Đức - Kít định lượng insulin chuột sử dụng cho cả chuột nhắt và chuột cống (Ultrasensitive Rat ELISA kit) gồm các dung dịch chuẩn, cộng hợp enzym, dung dịch rửa, cơ chất 3,3’,5,5’ tetramethyl benzidin, dung dịch dừng phản ứng và bản nhựa với các giếng tráng sẵn kháng thể đơn dòng kháng insulin chuột (Crystal Chem), Mỹ - Bộ kít định lượng PTP1B bao gồm enzym PTP1B, cơ chất IR5, BIOMOL Red Reagent và các dung dịch đệm cần thiết khác (Merck Millipore Corporation), Đức - Albumin huyết thanh bào thai bê (fetal bovine serum: FBS), HEPES (Invitrogen). (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethane sulfonic acid) (Invitrogen), Đức piperazineethane sulfonic acid, (Invitrogen) Đức Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM), (Invitrogen), Đức

- Các loại kháng thể: kháng thể kháng IgG thỏ có gắn HRP (anti-rabbit IgG HRP-linked antibody), kháng thể kháng IgG chuột nhắt có kháng HRP (anti-mouse IgG HRP-linked antibody), kháng thể kháng phospho-AMPKα- Thr172, kháng thể kháng IRS-11-Ser307 (Cell Signaling Technologies (Beverly, Mass, Mỹ), kháng thể kháng β-actin (sc-47778) (Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, Califonia), Mỹ

- Bộ dung dịch ECL Prime gồm luminol, peroxide (GE Healthcare UK Ltd.).

β-actin (Sigma-Aldrich), Mỹ

- Dung dịch rửa phim, Amersham Hyperfilm ECL 18 × 24 cm (GE

Healthcare Life Science), Thụy Điển

- Nitơ lỏng, đệm tách mô động vật EZLys™ Tissue Protein Extraction

Reagent (Biovision), Mỹ

- Hóa chất đổ gel (Tris-HCl,pH=8.8 3M, Tris-HCl,pH=6.8 1M, acrylamid 30%, glycerol 50%, SDS 10%, APS (amonium persulphate) 10%, Temed), sample buffer 5X (Tris HCl pH 6.8, glycerol, SDS, 2- mercaptoetanol, bromophenol blue (BPB), H2O), marker màu prestained protein fermentas, SDS page 1X, blotting buffer 10X, methanol, TBS 1X, tween 20, sữa gầy (Nestle), Đức

Để giải quyết được các mục tiêu, luận án được thiết kế bao gồm các nội

- Định danh khoa học, điều chế mẫu nghiên cứu + Xác định tên chi, họ, loài và lưu mẫu tiêu bản tại Bộ môn Thực vật,

- Oil red (Merck), Đức - 2-chloro-4-nitrophenyl-α-D-maltotrioside (Sigma Aldrich), Mỹ - Dung dịch p-nitrophenyl-α-D-glucopyranosid (PNP-G) (Sigma Aldrich), Mỹ - Enzym α-amylase, α-glucosidase (Sigma Aldrich), Mỹ - Acid tricloacetic (Sigma Aldrich), Mỹ - NaH2PO4, Na2HPO4, NaOH và acid citric (Merck), Đức - Ni tơ lỏng (công ty Kim khí Sài Gòn), Việt Nam - Dung môi n-hexan, chloroform, ethyl acetat, n-buthanol (Merck), Đức - Các hóa chất, thuốc thử khác đạt tiêu chuẩn phân tích theo quy định của Dược điển Việt Nam IV. Các chứng dương acarbose, sumarin ở dạng tinh khiết. 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU dung như sau: Trường Đại học Dược Hà Nội. + Điều chế mẫu thử nghiệm là cắn toàn phần (dạng bột khô có hàm ẩm 5%) và hỗn dịch cắn toàn phần pha trong dung môi NaCMC 0,5% cho thử nghiệm in vivo và các dung môi khác nhau cho từng thực nghiệm in vitro. + Điều chế cắn phân đoạn (n-hexan, chloroform, ethyl acetat, n-butanol) và

. Lựa chọn phân đoạn có tác dụng hạ glucose chiếm ưu thế tiếp tục đánh

hỗn dịch cắn phân đoạn với các nồng độ dựa vào liều lựa chọn của cắn toàn phần. - Đánh giá tác dụng hạ glucose máu trên động vật thực nghiệm + Xác định tác dụng hạ glucose máu của cắn toàn phần . Trên chuột tăng glucose máu thực nghiệm bởi STZ liều 150 mg/kg. . Trên chuột ĐTĐ typ 2 thực nghiệm và đánh giá ảnh hưởng trên khả năng dung nạp glucose của cắn toàn phần trên chuột cống ĐTĐ typ 2. + Xác định phân đoạn hạ glucose máu chiếm ưu thế . Đánh giá tác dụng hạ glucose máu của cắn các phân đoạn dịch chiết n- hexan, chloroform, ethylacetat, n-butanol và cắn nước trên chuột tăng glucose máu thực nghiệm bởi STZ liều 150 mg/kg. giá tác dụng trên chuột ĐTĐ typ 2 thực nghiệm. - Phân lập chất từ phân đoạn có tác dụng hạ glucose máu chiếm ưu thế

+ Tiến hành các phản ứng hóa học đặc trưng để xác định các nhóm chất

+ Phân lập, xác định cấu trúc của một số chất từ phân đoạn trên

trong cắn toàn phần, phân đoạn hạ glucose máu chiếm ưu thế. - Nghiên cứu cơ chế hạ glucose máu

+ Thông qua tác dụng in vivo trên mô hình chuột tăng glucose máu thực nghiệm bởi STZ liều 150 mg/kg với các chỉ tiêu đánh giá: nồng độ insulin huyết thanh và hoạt độ enzym G6Pase gan, HOMA-IR, HOMA-%β

+ Thông qua tác dụng in vivo trên chuột ĐTĐ typ 2 thực nghiệm với các chỉ tiêu đánh giá: nồng độ insulin huyết thanh, hoạt độ G6Pase gan, HOMA-IR HOMA-%β và hình ảnh đại thể, vi thể mô tụy

+ Thông qua tác dụng in vitro trên hoạt độ enzym: đánh giá khả năng ức

chế PTP1B, α-glucosidase và α-amylase

+ Thông qua tác dụng in vitro trên dòng tế bào: đánh giá ảnh hưởng trên khả năng phosphoryl hóa AMPK, IRS-1 trên dòng tế bào cơ vân nguyên phát chuột nhắt C2C12.

+ Thông qua tác dụng in vitro ức chế sự biệt hóa của tế bào mô mỡ

nguyên phát chuột nhắt 3T3-L1. Các bước nghiên cứu cụ thể được thể hiện trong sơ đồ hình 2.2.

THÂN CÂY CHUỐI TIÊU CẮN TOÀN PHẦN

TIÊU CHUẨN

CẮN TOÀN PHẦN ĐẠT TIÊU CHUẨN

Cơ chế hạ glucose máu

Tác dụng hạ glucose máu

Cắn phân đoạn

Cắn toàn phần

Chất phân lập

Cắn toàn phần

In vivo

In vitro

Chuột cống ĐTĐ typ 2

Chuột nhắt tăng glucose máu = STZ 150mg/kg

Insulin HT, enzym gan G6Pase

Tế bào 3T3-L1, PTP1B

PĐ có hạ glucose máu chiếm ưu thế

Dung nạp glucose của chuột cống ĐTĐ typ 2

Lipid HT, mô bệnh học tụy

p- AMPK, p- IRS-1

KẾT LUẬN

Hình 2.2. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 49 37

2.3.1. Phương pháp điều chế mẫu nghiên cứu 2.3.1.1. Điều chế cắn toàn phần

Thân cây chuối tiêu rửa sạch, hong khô, được cắt khúc 30-40 cm sau đó ép bằng máy ép F1-750 Pro lấy dịch, lọc qua vải gạc 2-3 lần loại bỏ phần thô, cất quay chân không ở nhiệt độ 500C thu được cắn, đem sấy cắn ở 30-400C, dưới áp suất giảm (160 mmHg) thu được cắn toàn phần. 1 kg thân chuối tiêu thu được 800ml dịch ép. 1000 ml dịch ép thu được 20 g cắn toàn phần hàm ẩm 5%. 2.3.1.2. Điều chế cắn phân đoạn

Các phân đoạn thu được bằng phương pháp chiết lỏng-lỏng. Trước hết, điều chế dịch toàn phần tương tự như mô tả ở phần 2.3.1.1. Sau đó lấy dịch, lọc, cất quay chân không để loại bớt nước. Tiếp theo, lắc lần lượt với các dung môi hữu cơ có độ phân cực tăng dần n-hexan cloroform ethyl acetat n-butanol theo tỷ lệ 1:1, lặp lại 3 lần. Các phân đoạn n-hexan, cloroform, ethyl acetat, n- butanol và phân đoạn nước còn lại (sau khi lắc với n-butanol) đem cất quay chân không dưới áp suất giảm (160 mmHg và nhiệt độ 500C) để thu hồi dung môi, sấy dưới áp suất giảm (160 mmHg và nhiệt độ 400C) thu được 5 cắn tương ứng với từng phân đoạn. Sơ đồ chiết phân đoạn lỏng-lỏng được thể hiện ở hình 2.3

Hình 2.3. Sơ đồ chiết các phân đoạn dịch chiết từ thân cây chuối tiêu

Để thử nghiệm trên chuột, cắn các phân đoạn sẽ được pha tương tự như

cắn toàn phần. 2.3.1.3. Phương pháp pha mẫu thử

- Pha mẫu thử cho thực nghiệm in vivo

+ Trên chuột nhắt: để sử dụng cắn toàn phần thân cây chuối tiêu liều 1.000 mg/kg, pha mẫu thử trong dung dịch NaCMC 0,5% để được hỗn dịch 50,0 mg/ml. Thuốc chứng dương gliclazid liều 20 mg/kg và metformin liều 240 mg/kg được pha trong dung dịch NaCMC 0,5% với nồng độ 1,0 mg/ml và 12,0 mg/mL. Sử dụng kim cong đầu tù, đưa mẫu thử trực tiếp qua đường miệng vào dạ dày của chuột (khoảng 2/3 chiều dài kim cho cong). Các lô chuột khác nhau được uống các mẫu thử khác nhau với cùng một thể tích là 0,2 ml/10 g chuột. Chuột uống một lần duy nhất trong ngày thời gian bắt đầu cho uống là 8 giờ sáng hàng ngày và tuân thủ theo đúng thứ tự lần lượt là lô chuột bình thường, lô chứng bệnh, lô chứng dương, lô thử. + Trên chuột cống: để sử dụng cắn toàn phần thân cây chuối tiêu liều 500 mg/kg, pha mẫu thử trong dung dịch NaCMC 0,5% để được hỗn dịch 50,0 mg/ml. Thuốc chứng dương metformin liều 120 mg/kg được pha tương tự với nồng độ 12,0 mg/ml. Chuột cống được uống với thể tích 1,0 ml/100 g chuột. Thời gian và cách cho uống tương tự như trên. 2.3.2. Phương pháp đánh giá tác dụng hạ glucose máu thực nghiệm trên chuột 2.3.2.1.Trên chuột nhắt trắng tăng glucose máu thực nghiệm bởi STZ liều 150 mg/kg

- Đánh giá tác dụng của cắn toàn phần

Tiến hành gây tăng glucose máu thực nghiệm trên chuột nhắt trắng liều 150 mg/kg được áp dụng theo mô hình nghiên cứu của Phùng Thanh Hương và Đỗ Thị Nguyệt Quế [6], [11]. Theo đó, chuột được tiêm màng bụng (STZ pha trong đệm citrat pH 4,5 với nồng độ 15,0 mg/ml và tiêm 0,1ml/10g thể trọng chuột. Sau 72 giờ, lựa chọn các chuột có glucose máu trên 11,0 mmol/L [75], chia thành 4 lô (2,3,4,5), song song tiến hành thí nghiệm với lô 1 (chuột bình thường) làm chứng sinh lý.

+ Lô 1 (chứng sinh lý, n =10): chuột bình thường cho uống dung môi pha

hỗn dịch thử.

+ Lô 2 (chứng bệnh, n =10): cho uống dung môi pha hỗn dịch thử. + Lô 3 (chứng dương 1, n =10): cho uống gliclazid (20 mg/kg thể trọng) + Lô 4 (chứng dương 2, n =10): cho uống metformin (240 mg/kg thể trọng + Lô 5 (thử, n =10): cho uống hỗn dịch thử với liều 1.000 mg/kg thể trọng Chuột được uống mẫu thử liên tục 15 ngày (thể tích và thời gian uống mẫu thử được miêu tả trong phần 2.3.1.3). Vào ngày thứ 16 chuột sau nhịn đói 10h, lấy máu tĩnh mạch đuôi chuột định lượng glucose máu [75], thu huyết thanh

định lượng insulin và gan xác định hoạt độ enzym gan G6Pase. Các kỹ thuật được mô tả chi tiết trong phần các phương pháp định lượng hoá sinh (2.3.3 và 2.3.5). Thí nghiệm được lặp lại ba lần, lấy kết quả trung bình.

Cách đánh giá kết quả: so sánh tỷ lệ phần trăm hạ glucose máu trước và sau 15 ngày uống mẫu thử (tương tự như mô tả ở phần 2.3.3.1) của các lô chuột thí nghiệm so với lô chứng âm. Dựa vào nồng độ glucose và insulin để xác định các chỉ số kháng insulin và chức năng tế bào β [27] (Homeostasis model assessment insulin resistance: HOMA-IR theo công thức: HOMA1-IR = Io x Go/ 22,5 và HOMA1-%β = (20 × Io)/ (Go - 3,5), trong đó Io: là nồng độ insulin huyết thanh, Go là nồng độ glucose huyết thanh = nồng độ glucose máu+11% [74].

- Đánh giá tác dụng của cắn phân đoạn Mô hình tăng glucose máu thực nghiệm được tiến hành tương tự như trên.

Chuột có glucose máu lớn hơn 11,0 mmol/L được chia thành 8 lô: + Lô 1 (chứng bệnh, n =10): uống dung môi pha hỗn dịch thử. + Lô 2 (chứng dương, n =10): uống metformin với liều 240 mg/kg. + Lô 3 (thử 1, n =10): uống hỗn dịch cắn phân đoạn n-hexan (1.000 mg/kg). + Lô 4 (thử 2, n =10): uống hỗn dịch cắn phân đoạn chloroform (1.000 mg/kg). + Lô 5 (thử 3, n =10): uống hỗn dịch cắn phân đoạn ethyl acetat (1.000 mg/kg). + Lô 6 (thử 4, n =10): uống hỗn dịch cắn phân đoạn n-buthanol (1.000 mg/kg).

+ Lô 7 (thử 5, n =10): uống hỗn dịch cắn phân đoạn nước (1.000 mg/kg). + Lô 8 (thử 6, n =10): uống hỗn dịch cắn toàn phần (1.000 mg/kg). Cách đánh giá kết quả: so sánh tỷ lệ phần trăm hạ glucose máu trước và sau 15 ngày uống mẫu thử (tương tự như mô tả ở phần 2.3.3.1) của các lô chuột thí nghiệm so với lô chứng âm và so sánh mức hạ glucose máu giữa các lô chuột thí nghiệm bằng test ANOVA.

Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, lấy kết quả trung bình. Thực nghiệm được tiến hành tại Bộ môn Hóa dược, Trường Cao đẳng Dược Trung ương Hải Dương 2.3.2.2. Trên chuột cống trắng ĐTĐ typ 2 thực nghiệm - Mô hình ĐTĐ typ 2 thực nghiệm Sử dụng mô hình gây ĐTĐ thực nghiệm kiểu typ 2 dựa trên chế độ ăn giàu chất béo kết hợp với STZ liều thấp của Vicker [173]. Mô hình này đã được triển khai bởi một số tác giả Việt Nam, gồm 3 bước [6], [11]. Bước 1: Gây tình trạng kháng insulin bằng chế độ ăn giàu chất béo Chuột cống trắng, giống đực chưa trưởng thành có cân nặng trung bình

80,0±20,0g được nuôi bằng chế độ ăn giàu lipid với 60% tổng số calo của khẩu phần ăn là chất béo [11]. Tiến hành trong cùng điều kiện 1 nhóm đối chứng là chuột bình thường được ăn chế độ ăn do Viện Vệ sinh Dịch tễ TW cung cấp. Hai nhóm chuột được cho ăn với hai loại thức ăn tương ứng trong vòng 60 ngày. Thành phần trong công thức làm thức ăn cho chuột thí nghiệm được tính theo bảng thành phần dinh dưỡng thực phẩm Việt Nam của Viện Dinh dưỡng được trình bày trong bảng 2.1 [12].

Bảng 2.1. Thành phần dinh dưỡng trong khẩu phần ăn của chuột thí nghiệm

Thức ăn giàu chất béo

Carbohydrat Protein Chất béo Các TP khác Tổng calo Khối lượng (g) Thành phần

300 100 60 40 500 500 ăn

Thức tổng hợp

0 0 269,19 0 269,19 30 Mỡ lợn

76,8 217,6 1162,8 0,50 1457,7 400

Lòng đỏ trứng gà

bò 100 19,2 19 30,15 0,30 68,65

Sữa tươi

Lạc nhân 140 86,8 154 560,7 0,20 801,7

Bột Ngô 50 143,6 17 14,4 0,40 175,4

Đậu tương 200 195,2 272 331,2 1,00 799,4

Tổng 1420 821,60 779,60 2428,44 42,40 4072,04

20% 19% 60% 1,0% 100%

Tỷ lệ riêng từng TP cung cấp calo

Thức ăn thường (Viện Vệ sinh Dịch tễ TW cung cấp)

Carbon (%) protid lipid khác

60% 20% 12% 8% Tỷ lệ riêng từng TP cung cấp calo

(Tỷ lệ % tính theo calo tổng số) Bước 2. Xác định mức độ kháng insulin của chuột béo phì và chuột béo phì tiêm STZ

Sau 60 ngày với hai chế độ ăn thường và ăn thức ăn giàu chất béo, chia

chuột ở hai nhóm làm 4 lô

+ Lô 1: Chuột bình thường

+ Lô 2: Chuột bình thường tiêm STZ + Lô chuột béo phì + Lô chuột béo phì tiêm STZ Tiến hành tiêm STZ liều 50mg/kg (STZ pha trong đệm citrate pH=4,5, pha với nồng độ 25 mg/2ml và tiêm 0,2ml dung dịch STZ/100 g thể trọng chuột), 72 giờ sau xác định trọng lượng chuột, nồng độ glucose máu, Cho TP , TG và insulin huyết thanh của các lô chuột (đã nhịn đói 10 giờ).

Cách đánh giá kết quả: so sánh mức độ kháng inslulin của các lô chuột thí nghiệm với lô chuột bình thường thông qua giá trị của HOMA-IR và HOMA- %β của các lô chuột (cách tính kết quả tương tự như phần 2.3.2.1) [180]. Bước 3: Gây ĐTĐ cho chuột đã bị béo phì đã kháng insulin

Tiêm màng bụng dung dịch STZ với liều 50 mg/kg (pha trong đệm citrat pH 4,5) cho nhóm chuột ăn chế độ ăn giàu chất béo. Sau 72 giờ lấy máu định lượng glucose máu lúc đói của chuột. Những chuột có glucose máu trên 11 mmol/L được lựa chọn là chuột gây được ĐTĐ typ 2 thực nghiệm [75]. - Đánh giá tác dụng của cắn toàn phần

+ Lô 1 (Chứng sinh lý, n =8): chuột bình thường được cho uống dung môi

Chuột ĐTĐ typ 2 được chia thành 3 lô (2, 3, 4) tiến hành song song với lô 1 (chuột bình thường). Các lô chuột thí nghiệm lần lượt được uống các mẫu thử như sau. pha hỗn dịch thử.

+ Lô 2 (Chứng bệnh, n =8): chuột ĐTĐ typ 2 uống dung môi pha hỗn

dịch thử.

+ Lô 3 (Chứng dương, n =8): chuột ĐTĐ typ 2 uống metformin với liều

+ Lô 4 (Thử, n =8): chuột ĐTĐ typ 2 uống hỗn dịch thử với liều 500 mg

120 mg/kg cắn/kg. Trong thời gian thí nghiệm, chuột ở lô 2, 3, 4 được tiếp tục cho ăn thức ăn giàu chất béo, chuột ở lô 1 được cho ăn thức ăn tổng hợp do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp, chuột ở các lô đều được cho uống nước tự do. Cho chuột uống mẫu thử tương ứng liên tục trong 15 ngày. Vào ngày thứ 16, chuột sau nhịn đói 10h, lấy máu tĩnh mạch đuôi định lượng glucose [75], huyết thanh để định lượng insulin, triglycerid (TG), cholesterol toàn phần (Cho TP), lấy gan để xác định hoạt độ G6Pase, lấy tụy để kiểm tra tình trạng đại thể và vi thể (kỹ thuật được mô tả chi tiết trong phần 2.3.3 và 2.3.4).

Cách đánh giá kết quả: so sánh tỷ lệ phần trăm hạ glucose máu trước và sau 15 ngày uống mẫu thử của các lô chuột thí nghiệm so với lô chứng âm (cách tính kết quả tương tự như mô tả ở phần 2.3.3.1).

Thí nghiệm được lặp lại 3 lần và lấy kết quả trung bình. Thực nghiệm tiến

+ Lô 1 (Chứng sinh lý, n =8): chuột bình thường uống dung môi pha hỗn

hành tại Bộ môn Hóa dược - Trường Cao đẳng Dược TW Hải Dương. - Đánh giá tác dụng của cắn phân đoạn Chuột ĐTĐ typ 2 thực nghiệm được chia thành 4 lô (2,3,4,5), tiến hành song song với lô 1 (chuột bình thường). Các lô chuột thí nghiệm lần lượt được uống các mẫu thử như sau: dịch thử.

+ Lô 2 (Chứng bệnh, n =8): chuột ĐTĐ typ 2 uống dung môi pha hỗn

dịch thử.

+ Lô 3 (Chứng dương, n =8): chuột ĐTĐ typ 2 uống metformin với liều

+ Lô 4 (Thử 1, n =8): chuột ĐTĐ typ 2 uống hỗn dịch cắn phân đoạn

+ Lô 5 (Thử 2, n =8): chuột ĐTĐ typ 2 uống hỗn dịch cắn phân đoạn n-

Định lượng nồng độ glucose máu lúc đói của chuột trước và sau 15 ngày

120 mg/kg ethyl acetat liều 1000 mg/kg. butanol liều 1000 mg/kg. uống mẫu thử.

Cách đánh giá kết quả: so sánh tỷ lệ phần trăm hạ glucose máu trước và sau 15 ngày uống mẫu thử (tương tự như mô tả ở phần 2.3.3.1) của các lô chuột thí nghiệm so với lô chứng âm và so sánh mức hạ glucose máu giữa các lô chuột thí nghiệm bằng test ANOVA.

Thí nghiệm được lặp lại 3 lần và lấy kết quả trung bình. Thực nghiệm tiến

hành tại Bộ môn Hóa dược - Trường Cao đẳng Dược TW Hải Dương. 2.3.2.3. Trên khả năng dung nạp glucose của chuột cống trắng ĐTĐ typ 2 thực nghiệm

Gây ĐTĐ kiểu typ 2 cho chuột tương tự như trên. Chuột ĐTĐ typ 2 thực nghiệm được chia làm 3 lô (2,3,4). Tiến hành song song cùng điều kiện với lô 1 là chuột bình thường uống dung môi pha hỗn dịch thử

- Lô 1 (Chứng sinh lý, n =8): chuột bình thường uống dung môi pha hỗn

dịch thử.

- Lô 2 (Chứng dương, n =8): chuột ĐTĐ typ 2 uống metformin với liều

120 mg/kg.

- Lô 3 (Chứng bệnh, n =8): chuột ĐTĐ typ 2 uống dung môi pha hỗn dịch

thử.

- Lô 4 (Thử, n =8): chuột ĐTĐ typ 2 uống hỗn dịch cắn toàn phần liều

500 mg/kg.

Chuột được uống mẫu thử liên tục trong 15 ngày, kết thúc 15 ngày, cho chuột nhịn đói 10 giờ, sau đó cho uống dung dịch glucose liều 3 g/kg thể trọng (glucose pha dung dịch ở dạng khan, thể tích cho uống là 0,2 ml/50g chuột). Định lượng glucose máu (như mô tả trong phần 2.3.3.1) sau khi uống dung dịch glucose ở các thời điểm 0 phút; 30 phút; 60 phút, 90 phút và 120 phút [23].

Cách đánh giá kết quả: xác định sự tồn lưu glucose trong máu của các lô chuột thí nghiệm thông qua diện tích dưới đường cong (AUC) được tính bằng tổng tích phân của nồng độ glucose tại các thời điểm 0-30; 30-60; 60-90; 90-120 [23]. So sánh sự tồn lưu glucose trong máu của các lô chuột thí nghiệm với lô chứng âm.

Thí nghiệm được lặp lại 3 lần và lấy kết quả trung bình. Thực nghiệm tiến

hành tại Bộ môn Hóa dược - Trường Cao đẳng Dược TW Hải Dương. 2.3.3. Các kỹ thuật định lượng hóa sinh trong thực nghiệm in vivo 2.3.3.1. Định lượng glucose máu

Tiến hành theo phương pháp glucose oxidase với máy đo glucose máu

Glucose oxidase Acid gluconic + H2O2 (1)

Accu-Chek Active và bộ kit tương ứng của Roche-Đức.

Nguyên tắc: oxi hóa glucose thành acid gluconic theo phản ứng (1) Glucose + H2O + O2 H2O2 tạo thành bị peroxidase phân hủy, giải phóng oxi, oxy hóa O-

Peroxidase Phức hợp vàng nâu + H2O (2)

dianisidin để tạo thành phức hợp có màu vàng nâu theo phản ứng (2)

O-dianisidin + H2O2

Cường độ màu tỷ lệ với lượng glucose cần định lượng. Máu để định lượng glucose là máu toàn phần lấy từ tĩnh mạch đuôi chuột được tiến hành như sau [23]: Tiệt khuẩn dao mổ và đuôi chuột bằng cồn 700, cắt một vết nhỏ khoảng 0,2-0,3 mm vào tĩnh mạch đuôi chuột, bỏ đi giọt máu đầu tiên, lấy giọt máu thứ hai nhỏ vào đầu que thử đã được cắm sẵn trong máy đo glucose máu (máy đo glucose máu đã được chuẩn hoá bằng lọ dung dịch chuẩn đi kèm với bộ kít thử). Đợi khoảng 20 giây, có tín hiệu báo nồng độ glucose máu hiện trên màn hình của máy. Cách đánh giá kết quả: tỷ lệ phần trăm hạ glucose máu của chuột trước

khi uống mẫu thử và sau khi uống mẫu thử được tính theo công thức ;

C trước – C sau X = *100

Trong đó: X là tỷ lệ % hạ glucose máu (%) C trước C trước là nồng độ glucose máu ngay trước khi uống mẫu thử (mmol/L) C sau là nồng độ glucose máu sau 15 ngày uống mẫu thử (mmol/L) Xét nghiệm tiến hành tại Bộ môn Hóa dược, Trường Cao Đẳng Dược TW,

Hải Dương. 2.3.3.2. Định lượng insulin huyết thanh

Kết thúc việc đo glucose máu của tất cả các lô chuột thí nghiệm, tiến hành máu hốc mắt bằng cách sử dụng một ống mao quản chọc vào hốc mắt của chuột, để máu chảy theo ống dẫn mao quản vào trong một ống chống đông, ly tâm 3000 vòng/phút/10 phút thu huyết thanh để định lượng insulin .

Theo phương pháp định lượng hấp phụ miễn dịch liên kết enzym 2 lớp (Sandwich ELISA) với bộ sinh phẩm định lượng insulin chuột Ultrasensitive Rat ELISA kit (Crystal Chem) sử dụng được cho cả chuột nhắt và chuột cống.

- Nguyên tắc: Insulin trong mẫu phản ứng với kháng thể kháng insulin liên kết với enzym peroxidase và kháng thể kháng insulin cố định trên giếng phản ứng. Sau khi rửa để loại bỏ các kháng thể không gắn, phát hiện các kháng thể gắn bằng phản ứng với 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidin. Dừng phản ứng bằng dung dịch acid sulfuric 1 N, đo quang ở bước sóng 450 nm.

Cách đánh giá kết quả: Dựa vào đường chuẩn được xây dựng trên các nồng độ khác nhau của insulin chuẩn và mật độ quang phụ thuộc tuyến tính, xác định phương trình hồi quy tuyến tính và hệ số tương quan R để tính nồng độ insulin trong mẫu thử dựa vào mật độ quang của mẫu thử

Tiến hành theo quy trình của nhà sản xuất bộ kit. Quy trình được tóm tắt

theo sơ đồ hình 2.4.

Kháng thể cố định trong mỗi giếng của bản nhựa đáy nhọn

Cho 95 µL dung dịch pha loãng mẫu vào mỗi giếng

5 µL mẫu thử/insulin chuẩn (mỗi mẫu cho vào 1 giếng)

Ủ 2 giờ ở 40C

Rửa sạch 5 lần với đệm (Wash buffer stock solution)

100 µL kháng thể đặc hiệu của insulin đã gắn với enzym vào mỗi giếng

Ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng

Rửa 7 lần với đệm (Wash buffer stock solution)

Cho 100 µL cơ chất vào mỗi giếng

Ủ trong bóng tối, nhiệt độ phòng, trong vòng 40 phút

Đo mật độ quang (A450nm)

Dừng phản ứng bằng cách thêm 100 µL acid sulfuric 1 N

Tính toán nồng độ insulin thông qua đường chuẩn

Hình 2.4. Sơ đồ quy trình định lượng insulin huyết thanh

Xét nghiệm thực hiện tại Bộ môn Hóa sinh, Trường Đại học Dược Hà Nội

2.3.3.3. Định lượng cholesterol toàn phần huyết thanh

Cholesterol este

Cholesterol + acid béo (1)

Cholesterol + O2

Cholesten-3-on + H2O2 (2)

- Nguyên tắc: Thuỷ phân cholesterol este bằng enzym cholesterol esterase (CHE) và oxy hóa bằng cholesterol oxydase (CHO). Đo mật độ quang của quinonimin tạo nên từ phản ứng của hydrogen peroxid với 4-aminophenazon và phenol nhờ xúc tác của peroxidase theo các phản ứng sau:

Quinoneimin + 2 H2O (3) 2 H2O2 + 4-aminoantipyrine + pHBS

Cholesterol este được thủy phân tạo cholesterol theo phản ứng (1). Oxi oxy hóa cholesterol nhờ cholesterol oxidase tạo H2O2 (2). H2O2 tham gia phản ứng (3) tạo ra quinoneimin màu đỏ. Độ hấp thụ ở 520 nm tỷ lệ với nồng độ cholesterol toàn phần trong mẫu thử [41].

- Tiến hành: Theo mô tả của Deeg và hướng dẫn của nhà sản xuất [41]. Kỹ thuật thực hiện tại Khoa Sinh hóa và Huyết học, Bệnh viện Đa khoa

Glycerol + acid béo (1)

tỉnh Hải Dương. 2.3.3.4. Định lượng triglycerid huyết thanh

Dihydroxyaceton phosphat + H2O2 (3)

Glycerol 1 phosphat + ADP (2)

Quinoneimin + 2 H2O (4)

2 H2O2 + 4-aminoantipyrin + pHBS

Glycerol 1 phosphat

- Nguyên tắc: Thuỷ phân triglycerid bằng enzym lipase, định lượng glycerol giải phóng ra bằng phương pháp đo màu của quinonimin tạo thành từ 4- aminoantipyryl và 4-chlorophenol phản ứng với peroxide hydrogen theo các phản ứng sau Triglycerid Glycerol + ATP Triglycerid được thủy phân tạo glycerol theo phản ứng (1). Glycerol được phosphoryl hóa theo phản ứng (2). Glycerol 1 phosphat tạo ra bị oxy hóa theo phản ứng (3) tạo H2O2. H2O2 tham gia phản ứng (4) tạo ra quinoneimin màu đỏ. Độ hấp thụ ở 520 nm tỷ lệ với nồng độ triglycerid trong mẫu thử [62].

- Tiến hành: Theo mô tả của Gowan và hướng dẫn của nhà sản xuất [62]. Kỹ thuật thực hiện tại Khoa Sinh hóa và Huyết học, Bệnh viện Đa khoa

tỉnh Hải Dương. 2.3.4. Kỹ thuật xét nghiệm mô bệnh học

Nguyên tắc: Theo phương pháp nhuộm hematoxylin-eosin (HE) thường quy nhân tế

bào β bắt màu xanh đen, bào tương bắt màu hồng [133].

Tiến hành: Tụy chuột được lấy ra khỏi cơ thể được cố định ngay trong dung dịch formol đệm trung tính 10% với tỷ lệ thể tích dung dịch cố định nhiều gấp 20 - 30 lần thể tích tụy chuột. Thời gian cố định 10 giờ bằng dung dịch Bouin. Sau cố định, cắt bệnh phẩm dày 3-4 µm nhộm Hematoxylin eosin và dán lên phiến kính đã được tráng Silan Silan (3-aminopropyltriethoxy-silane). Thực

hiện theo quy trình hướng dẫn quy trình kỹ thuật chuyên ngành Giải phẫu bệnh - Tế bào học của Bộ Y tế [2].

Các tiêu bản được đọc dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần để đánh giá tổn thương với phương pháp mù đơn (người đọc không biết ký hiệu của các lô chuột thực nghiệm) [133]..

Chỉ tiêu đánh giá: Tình trạng chung đại thể và vi thể của tụy nội tiết các

lô chuột thí nghiệm. So sánh mức độ tổn thương, thoái hoá đảo tụy của lô chuột

uống mẫu thử, chứng dương với lô chứng bệnh và lô chuột bình thường.

Thực nghiệm được thực hiện tại khoa Giải phẫu bệnh, Bệnh viện Đa khoa

tỉnh Hải Dương.

2.3.5. Phương pháp xác định hoạt độ enzym G6Pase gan (EC 3.1.3.9)

Glucose-6-phosphat + H2O

- Nguyên tắ c

Glucose + phospho vô cơ (Pi)

Phospho vô cơ đươ ̣c xác đi ̣nh theo kỹ thuâ ̣t được mô tả bởi Nguyễn Văn Mùi [9]. Hoa ̣t đô ̣ củ a G6Pase đươ ̣c tính bằng lượng phospho vô cơ sinh ra trong 1 phú t trên 1mg protein gan ở điều kiê ̣n nhiê ̣t đô ̣ 370C, pH 6,5. Hàm lươ ̣ng protein trong gan đươ ̣c đi ̣nh lươ ̣ng bằng phương pháp Lowry được mô tả bởi Dawson [39].

- Tiến hành + Lấy mẫu bệnh phẩm gan bằng cách kéo căng đầu chuột rút tuỷ sống để chuột chết lâm sàng và tiến hành mổ chuột bằng kéo phẫu thuật. Gan chuột được bảo quản trong ni tơ lỏng sau đó chuyển vào tủ lạnh âm sâu 700C gan để xác định hoạt độ G6Pase. + Cân 1,0 g gan chuột, cắt thành các miếng nhỏ , sau đó cho vào ố ng nghiê ̣m đã có sẵn 1,0 mL dung di ̣ch đê ̣m la ̣nh (đê ̣m citrat pH=6,5). Nghiền gan trong điều kiê ̣n la ̣nh (nhiệt độ dưới 40C) đến khi thu đươ ̣c di ̣ch đồ ng thể, sau đó thêm đê ̣m la ̣nh để đươ ̣c tỉ lê ̣ 1: 5. Di ̣ch nghiền thu đươ ̣c đem ly tâm la ̣nh ở 00C vớ i tố c đô ̣ 3.000 vò ng/phú t trong 10 phú t, lấy dịch trong tiếp tục ly tâm lạnh tốc độ 10.000 vòng/phút trong vòng 30 phút. Phần di ̣ch trong thu đươ ̣c sau khi ly tâm đươ ̣c dù ng để xác đi ̣nh hoa ̣t đô ̣ enzym.

+ Phản ứ ng đươ ̣c tiến hành trong ố ng nghiê ̣m 5mL gồ m: 0,5mL đê ̣m citrat (0,1M, pH 6,5); 0,2 mL nướ c cất; 0,1 mL cơ chất. Dung di ̣ch enzym và dung dịch cơ chất đươ ̣c ủ ở 370C trong 10 phú t. Thờ i gian phản ứ ng đươ ̣c tính từ lú c thêm 0,2 mL di ̣ch enzym. Tiếp tu ̣c ủ trong 10 phú t ở 370C. Sau đó thêm 2

mL acid tricloacetic (TCA) 10% để dừ ng phản ứ ng, lắc kỹ, để yên 5 phú t, ly tâm 5.000 vò ng/phú t trong 10 phú t, thu đươ ̣c di ̣ch trong làm thí nghiê ̣m xác đi ̣nh phospho vô cơ. Khảo sát sự tương quan giữa mật độ quang (ở bước sóng 700 nm) và lượng phospho vô cơ và tính kết quả.

+ Tiến hành tương tự với mẫu đố i chứ ng thay cơ chất bằ ng nướ c cất, mẫu

trắng thay cơ chất và di ̣ch chiết enzym bằng nướ c cất.

Xét nghiệm thực hiện tại Bộ môn Hóa sinh, Trường Đại học Dược Hà Nội.

2.3.6. Phương pháp đánh giá khả năng ức chế các enzym in vitro

Dựa vào nghiên của Linlin Fang (2014) [51] và Shibata (2015) [146] khi đánh giá tác dụng ức chế PTP1B, enzym α-glucosidse kết hợp với thực tế khảo sát thăm dò nồng các độ mẫu thử cho phù hợp, luận án tiến hành pha mẫu thử là cắn toàn phần nồng độ 5, 10, 30 µg/ml, các chất phân lập và chứng dương nồng độ là 0,5; 1,0; 5,0; 10,0 và 25 µM. Dung môi pha mẫu thử được trình bày trong các thí nghiệm cụ thể. 2.3.6.1. Đánh giá khả năng ức chế enzym α-amylase (EC 3.2.1.1)

Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng thủy phân cơ chất là 2-chloro-4-nitrophenyl-α-D- maltotriosid bởi enzym α-amylase tạo thành thành 2-chloro-4-nitrophenol và maltotriose. Phát hiện màu của 2-chloro-4-nitrophenol ở bước sóng 400 nm [53].

Tiến hành: Mẫu thử, chứng dương, enzym, cơ chất đều được pha trong đệm phosphat (pH 6,9), thực hiện đồng thời các mẫu với thành phần phản ứng và nồng độ cuối cùng trong hỗn hợp phản ứng mô tả ở bảng 2.2

Bảng 2.2. Thành phần phản ứng đánh giá tác dụng ức chế enzym α-amylase

Lô

Thành phần phản ứng Trắng control Mẫu control Trắng thử Mẫu thử

Mẫu chứng dương ✓ ✓ ✓

Trắng chứng dương ✓ ✓ ✓ ✓ ✓

✓ ✓ ✓ ✓ ✓

✓ ✓ ✓ ✓ ✓ ✓

Đệm (pH=6,9) Mẫu thử Acarbose * α-amylase 10 µl 2-chloro-4- nitrophenyl-α-D- maltotriosid (CNP-G3) 10µl.

Chú thích: Các loại mẫu dùng trong thí nghiệm: Mẫu control: thể hiện hoạt tính đầy đủ của enzym, trắng control: loại trừ sự hấp thụ nền của các thành phần trong mẫu control, mẫu thử, chứng dương: cho biết khả năng ức chế enzym của mẫu thử, chứng dương, trắng thử, trắng dương: loại trừ sự hấp thụ nền của các thành phần trong mẫu thử, chứng dương

- Mẫu thử gồm có: + Cắn toàn phần, thử với nồng độ cuối cùng là 5, 10, 30 µg/ml. + Chất phân lập: cycloeucalenon, acid myristic, bis (2-ethylhexyl) hexanoat, β-sitosterol, acid protocatechuic, daucosterol thử với nồng độ cuối cùng là 0,5; 1,0; 5,0; 10,0 và 25 µM, pha trong đệm phosphat pH =6,9

+ *: Chứng dương: acarbose với các nồng độ tương tự như mẫu thử.

- Trình tự thao tác:

+ Cơ chất 2-chloro-4-nitrophenyl-α-D-maltotriosid (CNP-G3) được hòa

tan trong 40 mM dung dịch đệm phosphat (pH 6,9) đến nồng độ 6,6 mg/ml.

+ Enzym α-amylase được chuẩn bị với nồng độ 10 μg/ml + Thêm 10 μl α-amylase vào nồng độ khác nhau của mẫu thử hòa tan trong đệm phosphat (pH 6,9). Hỗn hợp phản ứng được hoạt hóa trong bóng tối trước 10 phút ở 370C.

+ Phản ứng bắt đầu khi thêm 10 μl CNP-G3 và được ủ trong 10 phút. + Dừng phản ứng bằng đệm natri carbonat pH = 9,6 + Hỗn hợp phản ứng được đo độ hấp thụ quang phổ ở bước sóng 400 nm. + Làm tương tự với trắng control, trắng thử, trắng dương không có enzym Cách đánh giá kết quả: - Tỷ lệ phần trăm ức chế hoạt động của enzym α-amylase tính theo công

thức: A chứng – A thử

I = *100

A chứng

Trong đó: I: tỷ lệ phần trăm ức chế hoạt động của enzym A chứng = mật độ quang của lô chứng - mật độ quang của lô chứng trắng A thử = mật độ quang của lô thử - mật độ quang của lô chứng thử Nồng độ ức chế 50% (IC50) được tính dựa trên đồ thị bán log biểu diễn sự

phụ thuộc % ức chế enzym vào log (nồng độ mẫu thử).

Thực nghiệm được lặp lại 3 lần với mỗi nồng độ và lấy kết quả trung bình.

Kỹ thuật được thực hiện tại Bộ môn Hoá sinh, trường Đại học Dược Hà Nội.

2.3.6.2. Đánh giá khả năng ức chế enzym α-glucosidase (EC 3.2.1.20)

- Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng thủy phân cơ chất p-nitrophenyl-α-D-glucopyranosid (PNP-G) bởi α-glucosidase tạo ra α-D-glucose và p-nitrophenol (PNP). Trong môi trường kiềm p-nitrophenol chuyển thành p-nitrophenolat có màu vàng. Định lượng p-nitrophenolat tạo thành bằng phương pháp đo quang ở bước sóng 405nm [51].

Tiến hành: Mẫu thử, chứng dương, enzym, cơ chất đều được pha trong đệm phosphat (pH 6,9), thực hiện đồng thời các mẫu với thành phần phản ứng và nồng độ cuối cùng trong hỗn hợp phản ứng như bảng 2.3.

Bảng 2.3. Thành phần phản ứng đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase

Các giếng thử

Thành phần phản ứng

Trắng control Mẫu control Trắng thử Mẫu thử

Mẫu chứng dương ✓ Đệm (pH=6,9) ✓ ✓

Trắng chứng dương ✓ ✓ ✓ Mẫu thử 25µl ✓ ✓

Acarbose * ✓ ✓

✓ ✓ ✓ α-glucosidase 50µl (1 U/ml)

✓ ✓ ✓ ✓ ✓ ✓

P-nitrophenyl glucopyranoside (pNPG) 25 μl

- Mẫu thử gồm có: + Mẫu thử là cắn toàn phần và các chất phân lập pha với nồng độ tương tự

như mô tả trong phần 2.3.6.1

+ *: Chứng dương là acarbose với các nồng độ tương đương mẫu thử. - Trình tự thao tác: + Cơ chất p-nitrophenyl glucopyranosid (pNPG) hòa tan trong 20 mM

dung dịch đệm phosphat (pH 6,9) đến nồng độ cuối cùng 3 mM.

+ Enzym α-glucosidase được hòa tan trong 20 mM dung dịch đệm

phosphat (pH 6,9 ) với nồng độ 1 U/ml.

+ Thêm 50 μl α-glucosidase được vào các nồng độ khác nhau của mẫu

thử, hoạt hóa ở 370C trong 10 phút.

+ Phản ứng được bắt đầu khi bổ sung 25 μl cơ chất pNPG - Hỗn hợp phản ứng được ủ trong 20 phút - Dừng phản ứng bằng đệm natri carbonat pH = 9,6 - Đo độ hấp thụ quang phổ ở bước sóng 405 nm. - Làm tương tự với trắng control, trắng thử, trắng dương không có enzym. Cách đánh giá kết quả: - Tỷ lệ phần trăm ức chế hoạt động của enzym α-glucosidse tính theo

công thức tương tự như mô tả trong phần 2.3.6.1

Thực nghiệm được lặp lại 3 lần với mỗi nồng độ và lấy kết quả trung bình.

Kỹ thuật được thực hiện tại Bộ môn Hoá sinh, trường Đại học Dược Hà Nội. 2.3.6.3. Đánh giá khả năng ức chế protein tyrosin phosphatase 1B (PTP1B - EC 3.1.3.48)

- Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng loại bỏ nhóm phosphat ở phân tử tyrosin đã được phosphoryl hóa (pTyr 1158) trong tiểu đơn vị β receptor của insulin dưới tác dụng của protein tyrosin phosphatase 1B (PTP1B). Cụ thể, trong thí nghiệm này cơ chất của PTP1B được sử dụng là một đoạn polypeptid của tiểu đơn vị β của insulin receptor trong đó phân tử tyrosin 1158 đã được phosphoryl hóa (cơ chất này được đặt tên là IR5). Phần phospho tự do (Pi) tạo ra từ phản ứng này được định lượng dựa trên phản ứng giữa xanh malachit, ammonium molybdat và Pi trong môi trường acid [20]. Định lượng xanh malachit phosphomolybdat tạo thành bằng phương pháp đo quang ở bước sóng 595nm. Lượng xanh malachit phosphomolybdat tạo thành tỷ lệ với lượng phosphat tự do (Pi) có trong hỗn hợp phản ứng. Thí nghiệm được tiến hành song song giữa mẫu thử và các mẫu chứng.

- Tiến hành + Các mẫu nghiên cứu được hòa tan trong dung dịch DMSO 0,1%, thực hiện đồng thời các phản ứng với thành phần phản ứng và nồng độ cuối cùng trong hỗn hợp phản ứng như bảng 2.4. Thể tích hỗn hợp phản ứng cuối cùng trong mỗi giếng là 50µL.

Bảng 2.4. Thành phần phản ứng đánh giá tác dụng ức chế PTP1B

Các giếng thử

Thành phần phản ứng Trắng control Mẫu control Trắng thử Mẫu thử

Đệm (pH=6,0) ✓ ✓ Trắng chứng dương ✓ Mẫu chứng dương ✓

DMSO 0,1% ✓ ✓ ✓ ✓

✓ ✓ Mẫu thử

Suramin ✓ ✓

✓ ✓ ✓ PTP1B 2,5ng/giếng

✓ ✓ ✓ ✓ IR5: 75µM ✓ ✓

- Mẫu thử gồm có: + Mẫu thử là cắn toàn phần và các chất phân lập pha với nồng độ tương tự

như mô tả trong phần 2.3.6.1 và pha trong dung môi DMSO 0,1%

+ Chứng dương: suramin pha các nồng độ 0,5; 1,0; 5,0; 10,0 và 25 µM.

- Trình tự thao tác:

+ Ủ các mẫu thử (mẫu control, mẫu thử, mẫu chứng dương) với enzym

trong thời gian 30 phút ở 30oC

+ Bổ sung cơ chất IR5 vào hỗn hợp phản ứng và ủ ở 300C trong 30 phút + Bổ sung red reagent, để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút + Đo quang ở bước sóng 595nm

+ Làm tương tự với trắng control, trắng thử, trắng dương không có enzym Cách đánh giá kết quả: - Tỷ lệ phần trăm ức chế hoạt động của PTP1B tính theo công thức tương

tự như mô tả trong phần 2.3.6.1

Thực nghiệm được lặp lại 3 lần với mỗi nồng độ và lấy kết quả trung bình.

Kỹ thuật được thực hiện tại Bộ môn Hoá sinh, trường Đại học Dược Hà Nội 2.3.7. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng trên sự phosphoryl hóa AMPK và IRS-1

Nguyên tắc: AMPK được hoạt hóa khi phosphoryl hóa gốc Threonin 172 trên tiểu đơn vị α của AMPK. Trong khi đó IRS-1 bị mất hoạt tính, từ đó làm gián đoạn chuỗi truyền tín hiệu nội bào của insulin khi gốc Serin 307 trên protein này được phosphoryl hóa. Nghiên cứu đánh giá khả năng tăng phosphoryl hóa AMPKα

(Thr172) và ức chế sự phosphoryl hóa IRS-1 (Ser307) thông qua bán định lượng p-AMPK (Thr 172) và p-IRS-1 (Ser 307) ở tế bào C2C12 (tế bào cơ vân chuột nhắt nguyên phát) sau khi đã được ủ với các mẫu thử tương ứng (cắn toàn phần và 2 chất tinh khiết: cycloeucalenone và daucosterol) bằng kĩ thuật Western Blot [111], [179].

Để đánh giá ảnh hưởng của mẫu nghiên cứu lên sự phosphoryl hóa IRS-1

Thu tế bào và tách protein tổng số

(Ser 307) và AMPKα (Thr172), thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ hình 2.5

Hình 2.5. Sơ đồ quy trình thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của mẫu thử trên sự phosphoryl hóa của IRS-1 và AMPK

Quy trình thí nghiệm

- Nuôi cấy tế bào và ủ mẫu thử Hoạt hóa tế bào C2C12 (được lưu trữ trong Nitơ lỏng) và nuôi cấy 24h trong môi trường DMEM đã bổ sung 10% FBS, penicillin 100 UI/ml, streptomycin 0,1 mg/ml ở 37oC ở không khí bão hoà 5% CO2. Cấy chuyển tế bào vào đĩa 6 giếng với mật độ 106 tế bào/2ml môi trường và tiếp tục nuôi tế bào 24h ở 37oC trong môi trường không khí bão hoà 5% CO2.

Thúc đẩy sự biệt hóa tế bào bằng môi trường DMEM có chứa 5% huyết

thanh ngựa (HS) trong 72h.

Thay môi trường DMEM chứa 5% HS bằng môi trường DMEM chứa 1% HS, tiếp tục nuôi cấy tế bào trong 24h. Trước khi tiến hành bổ sung mẫu thử vào các giếng tế bào 1h, thay môi trường DMEM chứa 1% HS mới. Bổ sung mẫu thử (đã được hòa tan trong dung dịch DMSO) vào các giếng (2µL). Ủ tế bào với mẫu thử 1 giờ trong tủ nuôi cấy ở 37oC trong điều kiện không khí chứa 5% CO2.

- Thu tế bào và tách protein tổng số Tế bào sau khi ủ với mẫu thử, hút loại bỏ hết môi trường nuôi cấy, bổ sung dung dịch ly giải ECB (gồm Tris HCl 50mM, NaCl 120mM, EDTA 1mM, NP-

40 0.5% và NaF 50mM) để phá vỡ màng tế bào. Thu toàn bộ phần tế bào trong dung dịch EBC vào ống ly tâm. Ly tâm ở 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC, loại bỏ cặn thu lấy phần dịch nổi chứa protein toàn phần (các bước tiến hành thu protein đều được tiến hành ở nhiệt độ thấp để tránh hiện tượng phá huỷ protein). Định lượng protein toàn phần bằng phương pháp Bradford [29] và điều chỉnh nồng độ protein toàn phần trong các mẫu dung dịch thu được sao cho nồng độ protein toàn phần trong các mẫu đều là 2,5 µg/µL.

- Điện di protein

Điện di protein trên gel polyacrylamid 8% với đệm tải mẫu là đệm sodium

dodecyl sulfat (SDS) [11].

- Phát hiện protein bằng kỹ thuật Western Blot [166].

+ Chuyển màng: Chuyển toàn bộ protein trên bản gel sang màng nitrocellulose. Sau đó được chuyển sang màng nitrocellulose bằng cách để bản gel tiếp xúc trực tiếp với màng nitrocellulose và đặt trong điện trường theo hướng bản gel nằm ở cực âm, màng nitrocellulose nằm hướng về cực dương. Đổ đầy môi trường trong hộp chuyển màng bằng dung dịch transfer buffer (dung dịch đệm chuyển màng gồm: glycin 14,4g, tris base 3,03g methanol 100ml, nước cất vđ 1L. Chuyển màng trong vòng 150 phút với hiệu điện thế 90V. Các phân tử protein sẽ chạy từ cực âm (bản gel) sang cực dương (màng nitrocellulose). + Rửa màng: Rửa màng nitrocellulose 3 lần bằng dung dịch TBS-T 1X (25mM đệm tris-buffered saline có bổ sung tween 20 (0.05%), mỗi lần rửa 5 phút. + Phong bế màng: Các vị trí chưa liên kết với protein trên màng sẽ được phong bế bằng dung dịch protein loãng (sữa gầy). Rửa màng 3 lần bằng dung dịch TBS-T 1X, mỗi lần 5 phút.

+ Nhận biết protein trên màng nitrocellulose

a) Nhận biết p-AMPKα (Thr172)

Nguyên tắc:

p-AMPK được nhận diện bằng phản ứng đặc hiệu với kháng thể kháng p- AMPK (kháng thể 1-kháng thể sơ cấp) hình thành phức hợp “p-AMPK -kháng thể”. Phức hợp này sau đó sẽ được nhận diện bằng phương pháp hóa phát quang. Cụ thể, sử dụng kháng thể 2 là kháng thể thứ cấp có gắn horseradish peroxidase (HRP) gắn lên phức hợp “protein-kháng thể 1”. Khi có mặt hydrogen peroxid, HRP xúc tác cho phản ứng oxy hóa luminol tạo thành chất phát quang, ánh sáng quang học được phát hiện trên film X-quang.

b) Nhận biết p-IRS-1 (Ser307) và β-actin (protein đối chứng)

Nguyên tắc và cách tiến hành tương tự như nhận biết p-AMPKα (Thr172). Trong đó kháng thể sơ cấp là kháng thể kháng p-IRS-1 (Ser307) và β-actin. Kháng thể thứ cấp là kháng thể anti-rabbit IgG, HRP-linked và kháng thể anti- mouse IgG, HRP-linked. + Đọc kết quả: Nhỏ dung dịch hiện màu ECL primer (gồm dung dịch luminol và dung dịch peroxid) lên trên màng. Áp màng với phim X-quang, sau đó tiến hành rửa phim trong phòng tối. + Cách đánh giá kết quả

Lượng p-AMPK, p-IRS-1 và β-actin tỷ lệ với mật độ ánh sáng của các dải protein tương ứng trên phim X-quang. Nghiên cứu sử dụng β-actin là protein đối chứng nhằm kiểm soát sự đồng đều về lượng mẫu giữa các giếng và xác nhận tính hiệu quả của quá trình chuyển màng trong quy trình Western Blot. Tỷ số giữa mật độ quang của protein đích/mật độ quang của protein đối chứng được dùng để bán định lượng protein đích. So sánh lượng protein đích giữa các lô với nhau để đánh giá ảnh hưởng của mẫu thử. Mật độ ánh sáng được phân tích bằng phần mềm Image J software [166].

Kỹ thuật được thực hiện tại Bộ môn Dược lực, Đại học Dược Hà Nội.

2.3.8. Phương pháp đánh giá khả năng ức chế sự biệt hóa của tế bào mô mỡ 3T3-L1

Nguyên tắc: Tế bào 3T3-L1 nguyên phát có dạng nguyên bào sợi, nhưng trong môi trường nuôi cấy thích hợp, dưới tác dụng của một số chất cảm ứng và kích thích sẽ biệt hóa để tạo thành các tế bào mô mỡ trưởng thành thể hiện thông qua khả năng tổng hợp triglycerid (TG), dự trữ dưới dạng các giọt mỡ trong bào tương. Lượng TG hòa tan trong dầu đỏ (Oil Red) được định lượng bằng phương pháp đo quang ở bước sóng 500nm. Mức độ biệt hóa tế bào 3T3-L1 tỷ lệ với lượng TG tạo thành. Quy trình được thực hiện theo mô tả của Rizzatti và cộng sự (2013) [136].

Tiến hành:

- Nuôi cấy tế bào và ủ mẫu thử

Hoạt hóa tế bào (được lưu trữ trong Nitơ lỏng) và nuôi cấy 48 giờ trong môi trường DMEM đã bổ sung 10% huyết thanh bào thai bê, penicillin, streptomycin, natri pyruvat, glutamin ở 37oC không khí bão hoà 5% CO2. Cấy chuyển tế bào vào đĩa 6 hoặc 24 giếng và tiếp tục nuôi cấy trong 48 giờ.

Thúc đẩy sự biệt hóa tế bào bằng môi trường DMEM chứa 10% huyết thanh bào thai bê (chứa 10% huyết thanh bào thai bê mới, 1,7 µM insulin, 1 µM dexamethason, 0,5 mM 1-methyl-3-isobutylxanthin) và 0,1 mg/ml cắn toàn phần thân cây chuối tiêu, tiếp tục nuôi cấy trong 48 giờ. Sau đó thay dung môi mới không chứa dexamethason và 1-methyl-3-isobutylxanthin, chỉ còn môi trường DMEM và 10% huyết thanh bào thai bê, 1,7 µM insulin và mẫu thử (hai ngày thay dung môi một lần).

Tiếp tục nuôi tế bào 10 ngày, cố định tế bào bằng dung dịch formaldehyd

3,7% sau đó ủ với dầu đỏ (Oil red) pha trong dung dịch isopropanol 60%.

Nồng độ triglycerid tan trong dung dịch dầu đỏ/isopropanol được xác định bằng phương pháp đo quang ở bước sóng 500nm. Tiến hành song song với mẫu chứng trắng không chứa mẫu thử [136].

Kỹ thuật được thực hiện tại Khoa Hóa sinh và Vi sinh, Đại học Hóa học

và Công nghệ Praha, Cộng hòa Czech. 2.3.9. Các phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học của cắn toàn phần thân cây chuối tiêu 2.3.9.1. Định tính các nhóm chất hóa học

Sử dụng các phản ứng đặc trưng để định tính các nhóm chất saponin,

alcaloid, polyphenol, sterol, flavonoid, glycosid, terpenoid, tanin, quinon.. [5]. 2.3.9.2. Phân lập chất

- Điều chế cắn phân đoạn theo quy trình hình 2.3. - Tiến hành phân lập hoạt chất từ 2 phân đoạn có tác dụng hạ glucose máu tốt nhất là phân đoạn ethyl acetat và phân đoạn n-butanol bằng kỹ thuật sắc ký cột pha thường và pha đảo.

- Kiểm tra độ tinh khiết của các chất phân lập được bằng sắc ký lớp mỏng.

2.3.9.3. Xác định cấu trúc - Nhận dạng các chất phân lập được dựa trên các thông số lý hóa như nhiệt độ nóng chảy, dữ liệu các phổ MS, 1H- NMR, 13C- NMR, DEPT. Khối lượng phân tử m/z của các chất được so sánh với dữ liệu phổ đã công bố để kết luận về cấu trúc của các chất được phân lập [126]. - Các thực nghiệm đo phổ được tiến hành tại Viện Hóa sinh biển và Viện Hóa học các Hợp chất Thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Kết quả trình bày trong luận án được biểu diễn dưới dạng Xtb±SD (Xbt:

2.3.10. Xử lý số liệu giá trị trung bình của ba lần làm thí nghiệm của mỗi lô, SD: độ lệch chuẩn).

So sánh các giá trị trung bình bằng test T giữa lô thử và lô chứng và test ANOVA để so sánh giữa các lô với nhau. Xử lí số liệu bằng phần mềm SPSS 16 và Microft Excel 2007. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p<0,05.

Sử dụng phần mềm Graphpad Prism 7.03 để tính IC50 trong các thực

nghiệm trên hoạt độ enzym.

Sử dụng phần mềm Wolfram alpha để tính diện tích dưới đường cong AUC

glucose trong test dung nạp glucose đường uống của chuột cống ĐTĐ typ 2.

Sử dụng phần mềm Image J để so sánh mật độ ánh sáng trong phát hiện protein đích giữa các lô với nhau bằng kỹ thuật Western blot để đánh giá mức độ hóa hoạt AMPK và ức chế IRS-1 (Ser 307).

CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG HẠ GLUCOSE MÁU TRÊN

ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM

Trước khi đánh giá tác dụng hạ glucose máu của thân cây chuối tiêu trên

động vật thực nghiệm, luận án tiến hành xây dựng tiêu chuẩn của mẫu thử và

xác định liều cho thử nghiệm, kết quả được trình bày chi tiết trong các phụ

lục II và phụ lục III.

3.1.1. Kết quả tác dụng hạ glucose máu của cắn toàn phần

3.1.1.1. Tác dụng của cắn toàn phần trên glucose máu của chuột tiêm

STZ liều 150mg/kg

Ảnh hưởng của mẫu thử và các thuốc đối chứng trên chuột trắng tăng

glucose máu bởi STZ liều 150 mg/kg được đánh giá trên 4 lô chuột tăng

glucose máu và 1 lô chuột bình thường. Sau 15 ngày uống mẫu thử, tiến hành

định lượng glucose máu lúc đói của chuột, kết quả được trình bày tại bảng 3.1

và hình 3.1

Bảng 3.1. Nồng độ glucose máu chuột tăng glucose máu thực nghiệm bằng STZ (150 mg/kg) sau 15 ngày uống mẫu thử

Nồng độ glucose máu (mmo/L)

Lô

Mẫu thử

Ngày 1 5,48  1,05**

Ngày 16 5,91  1,33**

15,3  2,36

14,68  1,78

14,85  2,22

7,12  1,39*

15,20  2,48

7,35  1,44*

Lô 1 (Chứng sinh lý) n =10 Lô 2 (Chứng bệnh), n = 10 Lô 3 (Chứng dương 1), n = 10 Lô 4 (Chứng dương 2), n =10 Lô 5 (Thử), n =10

14,75  2,33

7,41  1,47*

DM pha hỗn dịch thử DM pha hỗn dịch thử Gliclazid (20 mg/kg) Metformin (240 mg/kg) Cắn toàn phần (1.000 mg/kg)

*:p<0,01 và **: p<0,001 so với lô chứng bệnh.

Nhận xét: sau khi tiêm STZ với liều 150 mg/kg, glucose máu của 4 lô

chuột đều tăng trên 14,5 mmol/L và có sự khác biệt đáng kể so với lô chuột

bình thường (p<0,001). Sau khi cho uống mẫu thử liên tục 15 ngày, nồng độ

glucose máu của lô 2, lô 3 và lô 4 hạ xuống dưới 7,5 mmol/L, khác biệt có ý

nghĩa thống kê (p<0,01) so với lô chứng bệnh. Mức hạ glucose máu của các

lô chuột thí nghiệm sau 15 ngày uống mẫu thử so với ngày đầu tiên được thể

hiện trong hình 3.1.

Hình 3.1. So sánh mức hạ glucose máu của các lô chuột thí nghiệm tiêm STZ (150 mg/kg) sau 15 ngày uống mẫu thử

*: p<0,01 so với lô chứng bệnh

Nhận xét: sau 15 ngày uống mẫu thử, mức hạ glucose máu của lô thử

uống hỗn dịch cắn toàn phần (1.000 mg/kg) là 49,6%, khác biệt đáng kể

(p<0,01) so với lô chứng bệnh. Mức hạ glucose máu của lô chuột uống mẫu

thử tương đương với hai lô chứng dương. Trong khi đó, ở lô 1 (chuột bình

thường) glucose máu không hạ mà còn tăng nhẹ so với ngày đầu tiên (tăng

4,5%).

3.1.1.2. Tác dụng của cắn toàn phần trên glucose máu của chuột ĐTĐ typ 2

Gây ĐTĐ typ 2 thực nghiệm bởi chế độ ăn giàu chất béo và tiêm STZ

liều 50 mg/kg. Sau đó chuột ĐTĐ typ 2 được cho uống hỗn dịch cắn toàn

phần trong 15 ngày. Ngày thứ 16, định lượng nồng độ glucose máu lúc đói

của chuột. Sự thay đổi nồng độ glucose máu của các lô chuột sau 15 ngày

uống mẫu thử được thể hiện ở bảng 3.2.

Bảng 3.2. Nồng độ glucose máu của chuột cống ĐTĐ typ 2 sau 15 ngày uống mẫu thử

Glucose máu (mmol/L)

Lô chuột

Mẫu thử

Ngày 1

Ngày 16

DM pha hỗn dịch thử

5,88  0,94***

5,69  0,88***

DM pha hỗn dịch thử

18,95  2,48

18,75  2,00

19,18  1,97

9,01  1,37**

Lô 1 (Chứng sinh lý, n = 8) Lô 2 (Chứng bệnh, n = 8) Lô 3 (Chứng dương, n = 8) Lô 4 (Thử, n = 8)

19,07  2,17

14,02  1,66*

Metformin (120 mg/kg) Cắn toàn phần (500 mg/kg)

*: p<0,05, **: p<0,01 và ***: p<0,001 so với lô chứng bệnh

Nhận xét: trước khi uống mẫu thử, nồng độ glucose máu của các lô chuột

ĐTĐ typ 2 đều tăng trên 18,0 mmol/L, khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô

chuột bình thường (p<0,001). Sau 15 ngày uống mẫu thử, nồng độ glucose

máu của lô 3 và lô 4 (uống metformin và hỗn dịch cắn toàn phần), giảm khác

biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh (p<0,01 và p<0,05). Kết quả

mức hạ glucose máu của các lô chuột thử nghiệm sau 15 ngày uống mẫu thử

được thể hiện trên hình 3.2.

Hình 3.2. Mức hạ glucose máu của các lô chuột ĐTĐ typ 2 sau 15 ngày uống mẫu thử

*: p<0,05 và **: p<0,01 so với lô chứng bệnh

Nhận xét: sau 15 ngày uống mẫu thử, mức hạ glucose máu của lô uống

metformin là cao nhất (53,06%), khác biệt rõ rệt so với lô chứng bệnh

(p<0,01). Lô chuột uống hỗn dịch cắn toàn phần có mức hạ glucose máu là

26,34%, khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh (p<0,05). Trong

khi đó, lô chuột bình thường có glucose máu tương đối ổn định.

3.1.1.3. Tác dụng của cắn toàn phần trên khả năng dung nạp glucose của

chuột ĐTĐ typ 2

Chuột cống ĐTĐ typ 2 uống hỗn dịch cắn toàn phần với liều 500 mg/kg.

Sau 15 ngày, cho uống dung dịch glucose với liều 3,0 g/kg. Định lượng

glucose máu sau khi uống dung dịch glucose ở các thời điểm 0, 30, 60, 90 và

120 phút, kết quả được trình bày trong bảng 3.3.

Bảng 3.3. Nồng độ glucose máu của các lô chuột ĐTĐ typ 2 thực nghiệm sau khi uống dung dịch glucose

Glucose máu (mmol/L) Lô chuột Mẫu thử 0 phút 30 phút 60 phút 90 phút 120 phút

5,38±

9,08±

7,81±

6,79±

5,57±

Lô 1 (Chứng DM pha hỗn

0,74***

1,37***

1,04***

0,93***

0,86***

sinh lý, n = 8) dịch thử

20,72±

30,37±

26,1±

22,19±

20,32±

Lô 2 (Chứng DM pha hỗn

1,39

1,92

1,86

1,71

bệnh, n = 8) dịch thử

10,60±

17,52±

15,84±

14,52±

11,94±

Lô 3 (Chứng Metformin

1,52**

1,82**

1,76**

1,77**

1,28**

dương, n = 8) (120 mg/kg)

19,84±

18,25±

16,03±

13,97±

22,39±

Lô 4 (Thử, n = Cắn toàn

2,14*

1,49*

1,76*

1,44*

2,31*

phần (500 8)

*: p<0,05; **: p<0,01 và ***: p<0,001 so với lô chứng bệnh

mg/kg)

Nhận xét: nồng độ glucose máu của các lô chuột sau 15 ngày uống mẫu thử

là khác nhau, do đó sau khi uống dung dịch glucose tại các thời điểm

0,30,60,90 và 120 phút, nồng độ glucose máu của các lô chuột tăng và giảm

khác nhau. Đồ thị biểu diễn sự thay đổi nồng độ glucose của chuột ĐTĐ typ 2

sau 15 ngày uống mẫu thử trong test dung nạp glucose bằng đường uống

được thể hiện trong hình 3.3.

*: p<0,05; **: p<0,01 và ***: p<0,001 so với lô chứng bệnh

Hình 3.3. Sự thay đổi nồng độ glucose máu của chuột ĐTĐ typ 2 thực nghiệm trong test dung nạp glucose

Nhận xét: sau 30, 60,90 và 120 phút, nồng độ glucose ở lô chứng bệnh

tăng khác biệt với lô chuột uống mẫu thử là cắn toàn phần và lô uống

metformin (p<0,05 và p<0,01). Tuy nhiên, ở lô chuột bình thường nồng độ

glucose tăng lên đến 9,08 mmol/L, sau đó giảm dần gần về mức ban đầu.

Ảnh hưởng của hỗn dịch cắn toàn phần lên sự dung nạp glucose của

chuột cống ĐTĐ typ 2 được đánh giá bằng diện tích dưới đường cong (AUC)

glucose trong vòng 120 phút thí nghiệm. Kết quả được thể hiện trong hình 3.4.

Hình 3.4. Sự tồn lưu glucose trong máu của chuột cống ĐTĐ typ 2 thực nghiệm trong test dung nạp glucose đường uống sau 120 phút

*: p<0,05 và **: p<0,01 so với lô chứng bệnh

Nhận xét: Sự tồn lưu glucose trong máu của các lô chuột thí nghiệm thể

hiện thông qua diện tích dưới đường cong (AUC) glucose của lô 3 và lô 4

(được cho uống metformin và hỗn dịch cắn toàn phần), giảm khác biệt so với

lô chứng bệnh (p<0,01 và p<0,05).

3.1.2. Kết quả tác dụng của cắn phân đoạn

3.1.2.1. Tác dụng của cắn phân đoạn trên glucose máu của chuột tiêm

STZ liều 150mg/kg

Để xác định các chất có tác dụng hạ glucose máu trong thân chuối tiêu,

trước hết, cần xác định các phân đoạn có tác dụng ưu thế để từ đó tiếp tục

phân lập các chất dùng cho thử nghiệm. 8 lô chuột tăng glucose máu thực

nghiệm bởi STZ liều 150 mg/kg được cho uống hỗn dịch cắn phân đoạn với

liều 1.000 mg cắn /kg chuột trong 15 ngày. Định lượng glucose máu lúc đói

của chuột vào ngày thứ 16. Sự thay đổi glucose máu của 8 lô chuột uống các

mẫu thử được thể hiện trong bảng 3.4.

Bảng 3.4. Nồng độ glucose máu của các lô chuột tăng glucose máu bằng STZ (150mg/kg) sau 15 ngày uống các hỗn dịch cắn phân đoạn

Lô chuột

Mẫu thử

Glucose máu (mmol/L) Ngày 16 Ngày 1

DM pha mẫu thử

21,23±2,40

21,0±2,57

Metformin (240 mg/kg)

21,50±2,08

10,3±1,69*

20,9±2,12

20,14±2,19

Lô 1 (Chứng bệnh, n =10) Lô 2 (Chứng dương, n =10) Lô 3 (Thử 1, n =10)

Cắn phân đoạn n-hexan (1.000 mg/kg)

21,26±2,32

20,63±2,16

Lô 4 (Thử 2, n =10)

Cắn phân đoạn chloroform (1.000 mg/kg)

20,15±2,19

12,41±2,33*

Lô 5 (Thử 3, n =10)

Cắn phân đoạn ethyl acetat (1000 mg/kg)

21,30±2,27

10,62±2,14*

Lô 6 (Thử 4, n =10)

Cắn phân đoạn n-buthanol (1.000 mg/kg)

21,90±2,38

20,12±1,79

Lô 7 (Thử 5, n =10)

Cắn dịch nước còn lại (1.000 mg/kg)

21,75±1,94

11,48±1,8*

Lô 8 (Thử 6, n =10)

Cắn toàn phần (1.000 mg/kg)

*p<0,01 so với lô chứng bệnh

Nhận xét: sau tiêm STZ với liều 150 mg/kg, glucose máu của cả 8 lô

chuột thí nghiệm đều tăng trên 20,0 mmol/L và được chia ngẫu nhiên vào các

lô, không có sự khác biệt về glucose máu ở thời điểm trước khi uống mẫu

thử. Sau khi cho uống mẫu thử liên tục trong 15 ngày, nồng độ glucose máu

của lô 2, 5, 6 và lô 8 (uống metformin, hỗn dịch cắn phân đoạn ethyl acetat,

buthanol và hỗn dịch cắn toàn phần) hạ xuống dưới 13,0 mmol/L, khác biệt

so với lô chứng bệnh (p<0,01). Cắn phân đoạn chloroform (lô 4) và dịch nước

còn lại (lô 7) không có tác dụng hạ glucose máu so với lô chứng bệnh

(p>0,05).

Mức hạ glucose máu của các lô chuột thí nghiệm sau 15 ngày uống

hỗn dịch cắn các phân đoạn, cắn toàn phần và metformin được thể hiện trong

hình 3.5.

Hình 3.5. Mức hạ glucose máu của các lô chuột tiêm STZ 150 mg/kg sau 15 ngày uống hỗn dịch cắn các phân đoạn

*: p<0,01 và **: p<0,001 so với lô chứng bệnh

Nhận xét: sau 15 ngày uống mẫu thử, lô 2 (uống hỗn dịch metformin)

có mức độ hạ glucose máu cao nhất (52,06%), khác biệt có ý nghĩa thống kê

so với lô chứng bệnh (p<0,001). Trong các phân đoạn dịch chiết, chỉ có lô 5

và lô 6 (uống phân đoạn ethyl acetat và phân đoạn n-buthanol) có mức hạ

glucose máu lần lượt là 38,56% và 50,3%, khác biệt có ý nghĩa thống kê

(p<0,01 và p<0,001) so với lô chứng bệnh. Các lô chuột uống mẫu thử là hỗn

dịch cắn phân đoạn chloroform và cắn nước còn lại có mức hạ glucose máu

đều không khác biệt so với lô chứng âm (p >0,05).

3.1.2.2. Tác dụng của cắn phân đoạn trên chuột ĐTĐ typ 2

Từ kết quả của thí nghiệm 3.1.2.1, 2 phân đoạn ethyl acetat và n-butanol

được tiếp tục thử nghiệm trên chuột ĐTĐ typ 2 để kiểm tra tác dụng hạ

glucose máu. Chuột được uống hỗn dịch cắn phân đoạn ethyl acetat và n-

butanol liều 500 mg/kg trong 15 ngày liên tục vào cùng một thời điểm trong

ngày. Định lượng glucose máu lúc đói của chuột vào ngày thứ 16. Sự thay đổi

glucose máu của chuột được thể hiện trong bảng 3.5.

Bảng 3.5. Nồng độ glucose máu của chuột cống ĐTĐ typ 2 sau 15 ngày uống hỗn dịch cắn phân đoạn

Lô chuột

Mẫu thử

Glucose máu (mmol/L) Ngày 16 Ngày 1

DM pha mẫu thử

5,88±0,98**

5,75±0,71**

DM pha mẫu thử

21,75±2,14

22,85±2,50

22,14± 2,16

10,57±1,94*

Lô 1 (Chứng sinh lý, n = 8) Lô 2 (Chứng bệnh, n = 8) Lô 3 (Chứng dương, n = 8)

Lô 4 (Thử 1, n = 8)

21,23±2,22

11,78±2,40*

Lô 5 (Thử 2, n = 8)

21,47±1,23

10,87±1,85*

Metformin (120 mg/kg) Cắn PĐ ethyl acetat (500 mg/kg) Cắn PĐ n-butanol (500 mg/kg)

*: p<0,01 và**: p<0,001 so với lô chứng bệnh

Nhận xét: sau khi gây ĐTĐ typ 2 trên chuột thực nghiệm, nồng độ

glucose máu của các lô chuột ĐTĐ typ 2 không khác nhau và đều cao khác

biệt so với lô chuột bình thường (p<0,001). Sau khi cho uống mẫu thử liên tục

trong 15 ngày, nồng độ glucose máu của lô 2, 3, 4 (uống hỗn dịch cắn phân

đoạn ethyl acetat, cắn phân đoạn n-butanol và hỗn dịch metformin) đều giảm

đáng kể so với lô chứng bệnh (p<0,01).

Mức hạ glucose máu của các lô chuột ĐTĐ typ 2 sau 15 ngày uống

mẫu thử là cắn các phân đoạn và chứng dương metformin được thể hiện trong

hình 3.6.

Hình 3.6. Mức hạ glucose máu của các lô chuột ĐTĐ typ 2 sau 15 ngày uống hỗn dịch cắn phân đoạn *: p<0,001 so với lô chứng bệnh

Nhận xét: mức hạ glucose máu ở lô 4 và lô 5 (uống hỗn dịch cắn phân

đoạn ethylacetat và n-butanol) có sự khác biệt so với lô chứng bệnh

(p<0,001). Trong khi đó, lô chuột bình thường (chứng sinh lý), có glucose

máu tương đối ổn định (mức hạ 2,15%).

3.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CẮN

TOÀN PHẦN THÂN CÂY CHUỐI TIÊU

3.2.1. Kết quả định tính các nhóm chất

Dịch ép toàn phần thân cây chuối tiêu được tiến hành định tính với các

thuốc thử đặc trưng của 14 nhóm chất cơ bản trong dược liệu. Kết quả cho

thấy cắn toàn phần thân cây chuối tiêu có chứa các hợp chất tanin, sterol,

đường khử và acid hữu cơ.

Từ kết quả trên chuột thực nghiệm, xác định được phân đoạn ethylacetat

và n-butanol có tác dụng hạ glucose máu chiếm ưu thế, luận án tiếp tục định

tính 4 nhóm chất trên trong hai phân ethyl acetat và phân đoạn n-butanol. Kết

quả phân đoạn ethylacetat có cả 3 nhóm chất tanin, sterol, acid hữu cơ, phân

đoạn n-butanol chủ yếu có sterol, đường khử.

Kết quả tiếp theo của luận án là kết quả phân lập, nhận dạng các chất

trong hai phân đoạn trên theo định hướng tác dụng điều trị đái tháo đường.

3.2.2. Kết quả phân lập các hợp chất trong phân đoạn ethylacetat

- Lấy 3,5 g cắn phân đoạn ethyl acetat (E) hòa tan vào lượng methanol tối

thiểu, sau đó tẩm với silicagel pha thường. Khối silicagel ẩm này được cất quay

thu hồi dung môi tới thể chất tơi mịn.

- Chuẩn bị cột: Cột sắc ký được rửa sạch, tráng bằng methanol, để khô tự

nhiên. Lót bông ở đáy cột và cố định chắc chắn lên giá. Cho silicagel pha thuận

lên cột. Gõ nhẹ vào thành cột cho tới khi không còn bọt khí, mặt thóang chất hấp

phụ phẳng và không tụt thêm nữa. Ổn định cột trong vòng 6 giờ. Sau đó đưa

lượng chất đã tẩm silicagel nói trên lên cột, gõ nhẹ để bột phân bố đều.

- Cột sắc ký được khai triển bằng hệ dung môi n-hexan dichlomethan với

gradient tăng dần từ 0-100%. Sau đó tiếp tục khai triển bằng hệ dung môi

dichlomethan-aceton với gradient tăng dần từ 0-100% thu được 12 phân đoạn ký

Quy trình phân lập các hợp chất trong phân đoạn ethyl acetat và kiểm tra

nhiệt độ nóng chảy và phần giải phổ của các chất phân lập được miêu tả chi

tiết trong phụ lục V.

hiệu từ FE1 đến FE12.

3.2.2.1. Nhận dạng hợp chất 1 (FE1C)

Tính chất: FE1C là chất rắn màu trắng, không mùi

Nhiệt độ nóng chảy (mp) =84-86°C.

Phổ khối lượng (ESI-MS) có pic ion giả phân tử là m/z [M + H] là

425,1, cho biết khối lượng phân tử của hợp chất FE1Clà 424,0 tương ứng với

công thức phân tử là C30H48O.

Từ tính chất vật lý và dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, ESI-MS của hợp

chất FE1C gợi ý xác định hợp chất này là cycloeucalenon. So sánh dữ liệu

phổ với tài liệu tham khảo được trình bày ở bảng 3.6 là hoàn toàn phù hợp

[84].

Bảng 3.6. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất FE1C và chất

tham khảo

Vị trí 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

13C (FE1C) 32,8 40,9 213,3 50,0 46,0 25,2 28,1 47,0 24,9 29,3 25,9 35,4 45,4 48,8 32,8 26,9 52,2 17,9 27,2

13Ca 32,8 40,8 212,2 49,8 45,9 25,1 28,0 46,9 24,9 29,3 25,8 35,3 45,2 48,7 32,8 26,9 52,1 17,9 27,1

20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

1H (FE1C) 1,00 (3H, s) 0,62 (1H, d, J= 3,5 Hz) 0,39 (1H, d, J= 3,5 Hz) 0,90 (3H, d, J= 7,0 Hz) 1,04 (3H, d, J= 7,0 Hz) 1,02 (3H, d, J= 7,0 Hz) 4,72 (1H, br) 4,66 (1H, br) 0,98 (3H, d, J= 6,5 Hz) 0,91 (3H, s)

36,1 18,3 35,0 31,3 156,8 33,8 22,0 21,8 105,9 19,1 10,7

36,0 18,3 35,0 31,3 156,1 33,7 21,8 21,8 105,6 19,1 10,7

a: Đo phổ trong CDCl3, 300 MHz với 1H NMR, 75 MHz với 13C NMR (với 13C thì giá trị MHz = 1/4 của 1H)

So sánh số liệu phổ với tài liệu tham khảo cho thấy hợp chất FE1C là

cycloeucalenon (hình 3.7).

Hình 3.7. Cấu trúc hóa học của hợp chất FE1C

3.2.2.2. Nhận dạng hợp chất 2 (FE6B)

Tính chất: FE6B là chất rắn màu trắng, không mùi. Nhiệt độ nóng chảy (mp) =53-55°C Phổ ESI-MS có pic ion giả phân tử là m/z [M + H] là 229,1 cho biết khối lượng phân tử của hợp chất FE6B là 228, tương ứng với công thức phân tử C14H28O2.

Dữ liệu phổ 1H-NMR và13C-NMR của hợp chất FE6B so sánh với hợp chất

acid myristic được trình bày ở bảng 3.7 các dữ liệu phổ là phù hợp [189].

Bảng 3.7. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất FE6B và chất tham khảo

1H (FE6B)

1Ha

13Ca

Vị trí 1 2 3

180,5 34,2 32,1

2,35 (2H, t, J = 7,5Hz) 1,63 (2H, quin, J = 7,5 Hz )

13C (FE6B) 180,4 2,34 (2H, t, J = 7,6 Hz) 34,1 31,9 1.63 (2H, quin., J = 7.6 Hz)

1,40-1,20 (20H)

1.39-1.20 (m, 20H)

4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 0,88 (3H, t, J = 7,0 Hz ) 0,88 (3H, m)

29,7 29,6 29,6 29,6 29,4 29,3 29,2 29,0 24,6 22,7 14,1

29,8 29,8 29,8 29,8 29,7 29,6 29,5 29,2 24,8 22,8 14,2

a: Đo phổ trong CDCl3, 500 MHz với 1H NMR, 125 MHz với 13C NMR (với

13C thì giá trị MHz = 1/4 của 1H)

So sánh số liệu phổ với tài liệu tham khảo cho thấy hợp chất FE6B là

acid myristic (hình 3.8)

Hình 3.8. Cấu trúc hóa học của hợp chất FE6B

3.2.2.3. Nhận dạng hợp chất 3 (FE10A)

Tính chất: FE10Alà chất rắn dưới dạng bột trắng, không mùi

Nhiệt độ nóng chảy: 210-212oC.

Phổ ESI-MS có pic ion giả phân tử là m/z [M -H]+ là 153,1 cho biết

khối lượng phân tử của hợp chất FE10Alà 154, tương ứng với công thức phân

tử C7H6O4.

Dữ liệu phổ 1H, 13C-NMR của hợp chất FE10A so sánh với hợp chất

acid protocatechuic được trình bày ở bảng 3.8, dữ liệu phổ là phù hợp [94].

Bảng 3.8. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất FE10A và chất tham khảo

Vị trí

1H (FE10A)

13C (FE10A)

1Ha

121,6 116,4

1 2

13Ca 122,1 116,6

144,0 149,6 114,5

3 4 5

144,9 150,3 114,6

123,2

122,7

7,43 (1H, d, J = 1,8 Hz) 6,79 (1H, d, J = 8,0 Hz) 7,40 (1H, dd, J= 8,0, 1,8 Hz)

7,41 (1H, d, J = 1,5 Hz) 6,76 (1H, d, J = 8,5 Hz) 7,41 (1H, dd, J = 8,5 Hz, J =1,5 Hz)

COOH

169,4

169.5

a: Đo phổ trong CD3OD, 500 MHz với 1H NMR, 125 MHz với 13C NMR (với

13C thì giá trị MHz = 1/4 của 1H)

So sánh số liệu phổ với tài liệu tham khảo cho thấy hợp chất FE10A là

acid protocatechuic (hình 3.9).

Hình 3.9. Cấu trúc hóa học của hợp chất FE10A

3.2.2.4. Nhận dạng các chất 4 (FE12A)

Tính chất: FE12A là bột màu trắng, không mùi

Nhiệt độ nóng chảy (mp) =275-277°C.

Phổ khối lượng (ESI-MS) có pic ion giả phân tử là m/z [M + H]+ là

577,1 cho biết khối lượng phân tử của hợp chất FE12A là 576, tương ứng với

công thức phân tử là C35H60O6.

Dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, ESI-MS của FE12A gợi ý xác định

hợp chất này là daucosterol.So sánh dữ liệu phổ với tài liệu tham khảo được

trình bày ở bảng 3.9 các dữ liệu phổ là phù hợp [161].

Bảng 3.9. Dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR của hợp chất FE12A và chất

tham khảo.

1H (FE12A)

13C FE12A) 36,8 29,2 76,9 38,3

Vị trí 1 2 3 4

13Ca 36,7 29,2 76,8 38,2

3,44 (1H, m) 2,36 (1H, dd, J = 10,0 Hz) 2,12 (1H, m) 5,34 (1H, br) 0,64 (3H, s) 0,95 (3H, s) 0,90 (3H, d, J = 6,5 Hz) 0,79 (3H, d, J = 7,0 Hz) 0,81 (3H, t, J = 7,0 Hz) 0,82 (3H, t, J = 7,0 Hz) 4,21 (1H, d, J = 8,0 Hz) 2,89 (1H, t, J = 8,0 Hz) 3,12 (1H, d, J = 8.5 Hz) 3,01-3,08 (2H, m)

5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 D-glucoside 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’

140,2 121,1 31,3 31,3 49,5 36,1 20,5 39,1 41,8 56,1 23,8 27,7 55,5 11,6 19,0 35,4 18,1 33,3 25,4 45,1 28,6 18,6 19,6 22,5 11,6 100,8 73,4 76,6 70,0 76,4 61,0

140,6 121,1 31,4 31,3 49,6 36,2 20,5 39,2 41,8 56,1 23,8 27,7 55,4 11,7 19,0 35,4 18,6 33,3 25,4 45,1 28,7 18,9 19,6 22,6 11,6 100,8 73,4 76,7 70,1 76,7 61,1

3,63 (1H, d, J = 12,0 Hz) 3,40 (1H, m)

a: Đo phổ trong DMSO-d6, 500 MHz với 1H NMR, 125 MHz với 13C NMR

(với 13C thì giá trị MHz = 1/4 của 1H)

So sánh số liệu phổ với tài liệu tham khảo cho thấy hợp chất FE12A là

daucosterol (hình 3.10)

Hình 3.10. Cấu trúc hóa học của hợp chất FE12A

3.2.3. Kết quả phân lập các hợp chất trong phân đoạn n-butanol

Dịch chiết butanol tổng (4,5g), được cho lên cột sephadex LH-20, khai

triển với dung môi MeOH 100% thu được 4 phân đoạn: FB1 (1,5g), FB2

(2,3g), FB3 (0,5g), FB4 (0,2g). Các phân đoạn này được tinh chế tiếp để thu

được chất sạch. Các hợp chất phân lập từ phân đoạn nào được ký hiệu như

phân đoạn đó.

Trong phân đoạn FB1 chủ yếu là chất keo màu nâu, triển khai trên sắc

ký lớp mỏng các vệt không tách nhau trong các hệ dung môi nên không tinh

chế tiếp.

- Phân đoạn FB2 được tinh chế qua cột silicagel với hệ dung môi

aceton/MeOH với gradient (0-10%) thu được 4 phân đoạn nhỏ FB2.1 (130

mg) và FB2.2 (1,4g), FB2.3 (0,5g) và 1 chất sạch FB2A (15mg).

Phân đoạn FB2.1 tiếp tục được tinh chế qua cột silicagel n-hexan/CH2Cl2

gradient (0-50%) thu được chất sạch FB2B (5mg) là chất dầu màu vàng.

- Phân đoạn FB2.3 tinh chế qua cột silicagel với hệ dung môi

aceton/MeOH với gradient (0-10%) thu được hợp chất FB2C (90 mg) là chất

keo màu trắng. Phân đoạn FB22 chủ yếu là FB2C và được xác định là hỗn

hợp của đường.

- Phân đoạn FB3 có nhiều chất rắn không tan trong MeOH, dùng dung

môi MeOH rửa thu được hợp chất sạch FB3 (130 mg) là chất rắn vô định

hình màu trắng, tan trong nước, không có UV, không hiện thuốc thử được dự

đoán là muối vô cơ của ammoni.

Sơ đồ phân lập các hợp chất trong phân đoạn n-butanol và kiểm tra độ và

phần biện giải phổ của các chất phân lập được miêu tả chi tiết trong phụ lục V.

3.2.3.1. Nhận dạng hợp chất 5 (FB2A)

Hợp chất FB2A thu được dưới dạng bột màu trắng, không mùi.

Nhiệt độ nóng chảy (mp) =136-137°C.

Phổ khối lượng (ESI-MS) có pic ion giả phân tử là m/z [M+H]+là 415,1,

cho biết khối lượng phân tử của hợp chất FB2Alà 414, tương ứng với công

thức phân tử là C29H50O.

Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR, ESI-MS của MP-2 gợi ý xác định hợp

chất này là β-sitosterol [154]. Dữ liệu phổ được trình bày trong bảng 3.10

Bảng 3.10. Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất FB2A và tài liệu tham khảo

13Ca

1H (Hợp chất FB2A)

13C (Hợp chất FB2A) 37,2 31,6 71,8

37,2 31,5 71,7

Vị trí 1 2 3

3,52(1H, m)

42,4

42,3

2,20-2,31 (2H, m)

140, 7 121,6 31,8 31,8 50,1 36,4 21,0 39,7 42,2 56,7 24,2 28,2 56,0 11,8 19,3 36,1 18,7 33,8 26,0 45,7 29,0 18,9 19,7 22,9 11,9

140,7 121,7 31,9 31,9 50,1 36,5 21,1 39,8 42,3 56,7 24,3 28,2 56,0 11,8 19,4 36,1 18,7 33,9 26,1 45,8 29,1 19,0 19,8 23,1 11,9

5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29

5,34 (1H, br d, J = 5,0 Hz) 0,68 (3H, s) 1,01 (3H, s) 0,92 (3H, d, J = 6,5 Hz) 0,81(3H, d, J =6.5 Hz) 0,83 (3H, d, J =7.0 Hz) 0,84 (3H, t, J=7,5 Hz)

a: Đo phổ trong CDCl3, 300 MHz với 1H NMR, 75 MHz với 13C NMR (với 13C

thì giá trị MHz = 1/4 của 1H)

So sánh số liệu phổ với tài liệu tham khảo cho thấy hợp chất FB2A là

β-sitosterol (hình 3.11).

Hình 3.11. Cấu trúc hóa học của hợp chất FB2A

3.3.3.2. Nhận dạng hợp chất 6 (FB2B)

Tính chất: FB2B là chất dầu màu vàng, không mùi

Dữ liệu phổ MS, 1H- NMR, 13C-NMR, DEPT cho biết khối lượng phân

tử của hợp chất FB2B là 370 tương ứng với công thức phân tử là C22H42O4

Số liệu phổ NMR của hợp chất FB2B và tài liệu tham khảo [184] được

trình bày ở bảng 3.11.

Bảng 3.11. Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất FB2B và tài liệu tham khảo

1H(FB2B)

1Ha

Vị trí 1,6 2,5

13C(FB2B) 173,5 34,0

13Ca 173,5 33,9

3,4

24,5

24,4

1’

66,8

66,7

2,33 (4H, td, J= 7,0 Hz, J= 1,0 Hz ) 1,66 (4H, td, J= 7,0 Hz, J= 1,0 Hz ) 3,98 (4H, dd, J= 3,5 Hz; 6,0 Hz)

2,35 (4H, t, J = 7,2 Hz) 1,69 (4H, t, J = 7,2 Hz) 4,00 (4H, dd, J= 2,8 Hz; 5,6 Hz)

1,34 (m, 4H) 1,29 (m, 8H)

1,38 (m, 4H) 1,30 (m, 8H)

0,87 (t, 6H) 1,56 (4H, m) 0,88 (t, 6H)

0,91 (t, 6H) 1,56 (4H, m) 0,91 (t, 6H)

38,7 30,9 28,9 22,9 10,9 23,7 14,0

38,7 30,4 28,9 22,9 10,9 23,8 14,0

2’ 3’ 4’ 5’ 6’ 1’’ 2’’ a:Đo phổ trong CDCl3, 400 MHz với 1H NMR, 100 MHz với 13C NMR (với

13C thì giá trị MHz = 1/4 của 1H)

Căn cứ vào số liệu phổ MS, 1H- NMR, 13C-NMR, DEPT và so với tài

liệu tham khảo, cho phép xác định hợp chất FB2B là bis (2-ethylhexyl)

hexanoat hình 3.12.

Hình 3.12. Cấu trúc hóa học của hợp chất FB2B

Như vậy, các chất được phân lập từ hai phân đoạn có tác dụng hạ glucose

máu tốt nhất. Kết quả thu chiết được 6 chất là cycloeucalenon, acid myristic,

acid protocatechuic, daucosterol, bis(2-ethylhexyl) hexanoat và β-sitosterol.

3.3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CƠ CHẾ HẠ GLUCOSE MÁU CỦA

CẮN TOÀN PHẦN THÂN CÂY CHUỐI TIÊU

3.3.1. Kết quả trên các mô hình thực nghiệm in vivo

3.3.1.1. Nồng độ insulin huyết thanh

- Trên chuột tiêm STZ liều 150mg/kg

Chuột tăng glucose máu bằng STZ liều 150 mg/kg, được cho uống

mẫu thử trong 15 ngày, định lượng insulin huyết thanh của chuột, dựa vào

nồng độ insulin huyết thanh và nồng độ glucose để xác định chỉ số kháng

insulin và khả năng bài tiết insulin của tế bào β của chuột thí nghiệm, kết quả

được trình bày trong bảng 3.12.

Bảng 3.12. Nồng độ insulin huyết thanh của các lô chuột tiêm STZ 150 mg/kg sau 15 ngày uống mẫu thử

Mẫu thử

IR

%β

Lô

Insulin (ng/mL)

598,92±24,07

1,440,13** 19,15±4,03

0,41±0,06 13,64±3,56

29,4±5,61

Lô 1 (Chứng sinh lý, n =10) Lô 2 (Chứng bệnh, n = 10)

0,84±0,08* 13,49±3,21 194,78±17,91***

Lô 3 (Chứng dương 1, n = 10)

0,45±0,07 7,44±2,64**

99,33±6,33**

Lô 4 (Chứng dương 2, n =10)

0,43±0,07

7,13±2,6**

94,58±7,51**

Lô 5 (Thử, n =10)

DM pha mẫu thử DM pha mẫu thử Gliclazid (20 mg/kg) Metformin (240 mg/kg) Cắn TP (1.000 mg/kg)

Trong đó: %β là chức năng tế bào β, IR là chỉ số kháng insulin. *: p<0,05;

*: p< 0,05 và **:p< 0,01 so với lô chứng bệnh.

Nhận xét: khi tiêm STZ liều 150 mg/kg và sau 15 ngày uống mẫu thử,

nồng độ insulin huyết thanh của lô chuột bình thường cao khác biệt so với lô

chứng bệnh (<0,01). Lô chuột uống cắn toàn phần và lô chuột uống

metformin nồng độ insulin không khác biệt, nhưng chỉ số kháng insulin giảm

khác (p<0,01) so với lô chứng bệnh. Lô chuột uống gliclazid có nồng độ

insulin huyết thanh, chức năng bài tiết insulin của tế bào β tăng so với lô

chứng bệnh (p< 0,05.

- Trên chuột ĐTĐ typ 2

+ Kết quả các chỉ số sinh học của chuột sau 60 ngày ăn chế độ ăn

giàu chất béo và tiêm STZ

Chuột cống bình thường chia làm hai nhóm: một nhóm ăn chế độ ăn

bình thường, nhóm thứ hai ăn chế độ ăn giàu chất béo. Sau 60 ngày, cân trọng

lượng các lô chuột và tiến hành tiêm màng bụng dung dịch STZ liều 50

mg/kg. 72 giờ sau khi tiêm STZ, lấy máu hốc mắt của chuột, ly tâm lấy huyết

thanh định lượng nồng độ insulin, triglyceride và cholesterol toàn phần của

các lô chuột, kết quả thể hiện trong bảng 3.13.

Bảng 3.13. Ảnh hưởng của chế độ ăn giàu chất béo kết hợp STZ (50 mg/kg) trên một số chỉ số sinh học của chuột cống trắng

Chuột bình thường Chuột ăn thức ăn giàu chất béo

Chỉ số Không tiêm Tiêm STZ Không tiêm Tiêm STZ

STZ STZ

Cân nặng (g) 188,7226,89 160,6016,35 377,0623,07** 346,9627,29**

Glucose 5,880,94 8,400,84* 5,940,95 19,052,19**

(mmol/L)

TG (mmol/L) 1,250,27 1,030,34 9,021,86** 10,641,43**

Cho TP 3,090,70 3,090, 33 7,921,19** 9,421,51**

(mmol/L)

Insulin 0,730,20 0,710,24 1,860,35** 1,370,26*

*: p,0,05; **: p<0,01 và ***: p<0,001 so với lô chuột bình thường

(ng/L)

Nhận xét: chuột ăn bằng chế độ ăn béo giàu chất béo, sau 60 ngày có trọng

lượng cơ thể, nồng độ TG, Cho TP, insulin huyết thanh cao khác biệt so với

lô chuột bình thường (p<0,05 và p<0,01). Dựa vào nồng độ glucose máu (quy

đổi ra nồng độ glucose huyết thanh) và insulin huyết thanh của chuột để xác

định các chỉ số kháng insulin và chức năng tế bào β, kết quả được trình bày trong

bảng 3.14.

Bảng 3.14. Chức năng tế bào β và chỉ số kháng insulin của các lô chuột cống béo phì tiêm STZ liều 50 mg/kg

IR %β

TT

Lô chuột

Bình thường

Bình thường tiêm STZ

9,732,51 262,6514,97

Béo phì

13,04,29 113,6811,83

Béo tiêm STZ

21,825,02* 852,0728,93**

Trong đó: %β là chức năng tế bào β, IR là chỉ số kháng insulin.

59,407,93** 71,018,13**

*: p<0,01và **:p<0,001 so với lô chuột bình thường.

Nhận xét: ở lô chuột béo phì không tiêm STZ chức năng tế bào β và chỉ số

kháng insulin tăng so với lô chuột bình thường (p<0,01). Khi tiêm STZ cho lô

chuột béo phì, chỉ số kháng insulin tăng và chức năng bài tiết insulin của tế bào

β giảm p<0,001).

+ Kết quả nồng độ insulin của chuột ĐTĐ typ 2 sau 15 ngày uống

mẫu thử

Chuột ĐTĐ typ 2 được cho uống các mẫu thử trong 15 ngày. Sau đó,

định lượng insulin huyết thanh, kết quả được trình bày trong bảng 3.15.

Bảng 3.15. Nồng độ insulin huyết thanh của chuột cống ĐTĐ typ 2 sau 15 ngày uống mẫu thử

%β IR

Lô

Mẫu thử

Insulin huyết thanh

(ng/ml)

Lô 1 (Chứng sinh

DM pha mẫu

0,78±0,10** 9,732,51*** 10,123,02** 262,6514,97

0,730,20**

271,8515,38

lý, n = 8)

thử

***

Lô 2 (Chứng

DM pha mẫu

1,42±0,17

Ngày 1 Ngày 1 Ngày 1 Ngày thứ 16 Ngày thứ 16 Ngày thứ 16

1,390,23

53,316,54

69,765,97

bệnh, n = 8)

thử

Lô 3 (Chứng

Metformin

1,38±0,19

73,329,36 59,566,94

1,410,29

201,2313,14

dương, n = 8)

(120 mg/kg)

***

Lô 4 (Thử, n = 8) Cắn toàn phần

1,35±0,14

57,317,46 28,413,09** 67,409,03

1,320,35

102,229,31**

(500 mg/kg)

Trong đó%β là chức năng tế bào β và IR là chỉ số kháng insulin. *: p<0,05 và **: p<0,01và ***: p<0,001 so với lô chứng bệnh.

61,337,25 43,396,56* 72,327,64

Nhận xét: Chuột ĐTĐ typ 2 thực nghiệm (chuột béo phì tiêm STZ) có nồng độ insulin huyết thanh, chức năng tế bào β và

chỉ số kháng insulin là không khác nhau giữa các lô chuột. Sau 15 ngày uống mẫu thử, ở lô chuột uống metformin và cắn toàn

phần đã có sự khác biệt về chức năng tế bào β và chỉ số kháng insulin của lô chuột uống metformin và cắn toàn phần so với lô

chứng bệnh (p<0,01 và p<0,05).

3.3.1.2. Tình trạng mô tụy nội tiết và tế bào β của chuột ĐTĐ typ 2

Kết quả đánh giá ảnh hưởng của mẫu thử đến tình trạng mô tụy của

chuột được thực hiện trên tất cả 24 chuột/1 lô (ba lần làm thí nghiệm). Kết

quả được trình bày trong hình 3.13 là đại diện cho từng lô chuột.

1.Chứng sinh lý

2. Chứng bệnh

3.Chứng dương (metformin)

4. Cắn toàn phần

Hình 3.13. Mô bệnh học tụy của các lô chuột ĐTĐ typ 2 sau 15 ngày uống mẫu thử (nhuộm HE x 400 lần) B: tế bào β; T: dấu hiệu thoái hóa và sự mất tế bào trên diện rộng

Nhận xét: kết quả cho thấy ở lô chứng bệnh (lô 2), mật độ tiểu đảo tụy

giảm, đảo tụy biến dạng, giảm về kích thước, tế bào tiểu đảo tụy giảm về số

lượng, có dấu hiệu thoái hóa hốc, mất tế bào trên diện rộng. Trong khi đó, ở

lô 3 và lô 4 (chuột uống metformin và hỗn dịch cắn toàn phần), mật độ tiểu

đảo tụy ít hơn so với bình thường, đảo tụy có giảm về kích thước so với lô 1

(chứng sinh lý) nhưng ít có dấu hiệu tổn thương, thoái hóa.

3.3.1.3. Nồng độ lipid huyết thanh

Để có thêm bằng chứng về sự gián tiếp giảm kháng insulin để bước đầu

tìm hiểu cơ chế hạ glucose máu của cắn toàn phần thân cây chuối tiêu, tiến

hành định lượng nồng độ lipid huyết thanh của chuột ĐTĐ typ 2 thông qua

nồng độ triglycerid và cholesterol toàn phần huyết thanh, kết quả được thể

hiện ở bảng 3.16

Bảng 3.16. Nồng độ triglycerid và cholesterol toàn phần huyết thanh của chuột ĐTĐ typ 2 sau 15 ngày uống mẫu thử

Lô

Mẫu thử Cholesterol toàn phần

Triglycerid (mmol/L)

(mmol/L)

Ngày 1

Ngày 16

Ngày 1

Ngày 16

Lô 1

DM pha

(Chứng

mẫu thử

3,09±0,70

3,27±0,97

1,26±0,26

1,28±0,38

***

sinh lý, n

= 8)

DM pha

Lô 2

(Chứng

mẫu thử

9,15±1,70 8,25±1,58

11,1±1,32

10,09±1,88

bệnh, n =

Lô 3

Metformin

(Chứng

(120 mg/kg) 9,4±1,31

4,76±1,24*

10,56±1,58

4,27±1,38

dương, n

= 8)

Lô 4

Cắn toàn

9,8±1,47

5,0±1,29*

10,34±1,31

4,75±1,14

(Thử, n =

phần (500

mg/kg)

*: p<0,05 **: p<0,01 và ***: p<0,001 so với lô chứng bệnh

Nhận xét: sau 15 ngày uống mẫu thử, nồng độ cholesterol toàn phần

và triglycerid ở lô 3 và lô 4 (uống metformin và hỗn dịch cắn toàn) giảm có ý

nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh (p<0,05 và p<0,01). Mức hạ nồng độ

Cho TP và TG của các lô chuột sau 15 ngày uống mẫu thử được thể hiện

trong hình 3.14

Hình 3.14. Phần trăm hạ cholesterol và triglyceride của các lô chuột thí : nghiệm trước và sau khi uống mẫu thử : p<0,01 so với lô chứng bệnh

Nhận xét: ở lô chuột bình thường nồng độ Cho TP và TG tương đối ổn định,

chỉ tăng nhẹ không có ý nghĩa thống kê so với ban đầu. Trong khi đó, ở lô

chuột uống cắn toàn phần thân cây chuối tiêu và lô chuột uống metformin có

mức hạ Cho TP và TG khác biệt so với lô chứng bệnh (p<0,01).

3.3.1.4. Kết quả trên hoạt độ enzym G6Pase gan

- Hoạt độ enzym G6Pase gan của chuột tăng glucose máu bằng STZ

liều 150mg/kg

Để đánh giá tác dụng của cắn toàn phần thân cây chuối tiêu trên sự tổng hợp glucose nội sinh, tiến hành đánh giá ảnh hưởng của mẫu thử trên hoạt độ enzym G6Pase ở gan chuột của các lô thí nghiệm, kết quả được trình bày ở bảng 3.17.

Bảng 3.17. Hoa ̣t độ G6Pase gan của các lô chuột tiêm STZ 150 mg/kg sau 15 ngày uống mẫu thử

Lô Mẫu thử % hoạt độ enzym Hoạt độ riêng G6Pase (µgPi/phút/mg protein)

DM pha hỗn dịch thử 0,54±0,14* 100,00%

DM pha hỗn dịch thử 0,81±0,17 150,00%

Gliclazid (20 mg/kg) 0,56±0,15* 103,70 %

101,85% 0,55±0,16*

*: p<0,05 so với lô chứng bệnh

0,57±0,16* 105,56% Lô 1 (Chứng sinh lý, n =10) Lô 2 (Chứng bệnh, n = 10) Lô 3 (Chứng dương 1, n = 10) Lô 4 (Chứng dương 2, n =10) Lô 5 (Thử, n =10) Metformin (240 mg/kg) Cắn toàn phần (1000 mg/kg)

Nhận xét: chuột tiêm STZ (150 mg/kg) có hoạt độ enzym G6Pase gan

tăng khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng sinh lý. Các lô uống hỗn

dịch cắn toàn phần, gliclazid và metformin làm giảm hoạt độ G6Pase có ý

nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh (p<0,05). % ức chế hoạt độ enzym

G6Pase của các lô chuột thí nghiệm so với lô chứng bệnh được thể hiện trong

hình 3.15

Hình 3.15. Phần trăm ức chế hoạt độ enzym G6Pase của các lô chuột tăng glucose máu bởi STZ liều 150 mg/kg sau 15 ngày uống mẫu thử

Nhận xét: sau 15 ngày uống thuốc chứng dương gliclazid, metformin và

mẫu thử là cắn toàn phần thân cây cây chuối tiêu, cả ba lô chuột thí nghiệm

đều có hoạt độ enzym gan giảm, tương đương với ức chế trên 44% hoạt độ

enzym gan G6Pase so với lô chứng bệnh.

- Hoạt độ enzym G6Pase gan của chuột ĐTĐ typ 2

Chuột ĐTĐ typ 2 sau khi uống hỗn dịch thử trong 15 ngày được định

lượng hoạt độ G6Pase gan, kết qủa được thể hiện trong bảng 3.18.

Bảng 3.18. Hoạt độ enzym G6Pase gan của chuột ĐTĐ typ 2 sau 15 ngày uống mẫu thử

Lô

Mẫu thử

% hoạt độ enzym

Hoạt độ riêng enzym G6Pase (µgPi/phút/mg protein)

1,98±0,59*

100%

152,02%

103%

111,11%

Lô 1 (Chứng sinh lý, n = 8 Lô 2 (Chứng bệnh, n = 8) Lô 3 (Chứng dương, n = 8) Lô 5 (Thử, n = 8)

DM pha hỗn dịch thử DM pha hỗn dịch thử Metformin (120 mg/kg) Cắn toàn phần (500 mg/kg)

3,01±0,87 2,03±0,77* 2,20±0,73*

*: p<0,05 so với lô chứng bệnh

Nhận xét: sau 15 ngày uống mẫu thử, hoạt độ G6Pase ở gan ở lô chứng

bệnh tăng khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng sinh lý (p<0,05).

Trong khi đó, hoạt độ enzym G6Pase gan ở lô 2 (uống hỗn dịch cắn toàn

phần) và lô 3 (uống metformin) giảm có ý nghĩa so với lô chứng bệnh

(p<0,05). % ức chế hoạt độ enzym G6Pase của các lô chuột thí nghiệm so với

lô chứng bệnh được thể hiện trong hình 3.16.

Hình 3.16. Phần trăm ức chế hoạt độ enzym G6Pase của các lô chuột ĐTĐ typ 2 sau 15 ngày uống mẫu thử

Nhận xét: Các lô chuột ĐTĐ typ 2, sau 15 ngày uống thuốc chứng

dương metformin và mẫu thử là cắn toàn phần thân cây cây chuối tiêu, cả 2 lô

chuột thí nghiệm đều có hoạt độ enzym gan giảm, tương đương với ức chế

trên 40% hoạt độ enzym gan G6Pase so với lô chứng bệnh.

3.3.2. Kết quả trên các mô hình thực nghiệm in vitro

3.3.2.1. Tác dụng ức chế enzym α-amylase

Kết quả tác dụng ức chế enzym α- amylase của các nồng độ khác nhau

của cắn toàn phần thân cây chuối tiêu được thể hiện trong bảng 3.19

Bảng 3.19. Kết quả tác dụng ức chế enzym α- amylase in vitro của cắn toàn phần thân cây chuối tiêu

TT 1 Mẫu thử Cắn toàn phần

2 Acarbose*

(-): không có tác dụng ;

*: chứng dương

Nồng độ 5µg/ml 10µg/ml 30µg/ml 5µM 10µM Khả năng ức chế (%) - - - 29,77±4,45 37,64± 2,17

Nhận xét: Cắn toàn phần thân cây chuối tiêu không ức chế enzym α- amylase ở

nồng độ 5, 10 và 30 µg/ml. Trong khi cùng điều kiện khả năng ức chế enzym α-

amylase của chứng dương acarbose ở nồng độ 5 và 10 µM là 29,77 và

37,64%.

Thí nghiệm tiếp tục được tiến hành với 6 chất được phân lập từ thân cây

chuối tiêu (cycloeucalenon, acid myristic, acid protocatechuic , bis(2-

ethylhexyl) hexanoat, β-sitosterol và daucosterol) trên khả năng ức chế hoạt

tính của enzym α-amylase, kết quả được trình bày trong bảng 3.20

Bảng 3.20. Khả năng ức chế enzym α-amylase của các chất phân lập từ thân cây chuối tiêu

Tên chất

Cycloeucalenon Acid myristic Bis(2-ethylhexyl) hexanoat β-sitosterol Acid protocatechuic Daucosterol Acarbose*

5µM - - - 16,34±1,47 - - 29,77±4,45

25µM - - - 51,95±0,85 - - 55,22±1,5

Khả năng ức chế (%) 10µM - - - 23,38±0,9 - - 37,64± 2,17 *: chứng dương

(-): không có tác dụng ;

Nhận xét: Trong số 6 chất được phân lập, chỉ có β-sitosterol có tác

dụng ức chế enzym α-amylase với các nồng độ thử khác nhau. Dựa vào tác

dụng ức chế enzym α-amylase của β-sitosterol và chứng dương acarbose, tiến

hành khảo sát IC50 ở 5 nồng độ thử (0,5; 1,0; 5,0; 10,0 và 25,0 µM ), kết quả

được trình bày trong bảng 3.21.

Bảng 3.21. IC50 của các chất có tác dụng ức chế α-amylase

Tên chất

IC50 (µM)

β-sitosterol Acarbose

23,88±0,25 20,37±1,06

Nhận xét: β-sitosterol được phân lập từ thân cây chuối tiêu, có tác dụng

ức chế enzym α-amylase với IC50 là 23,88±0,25 µM, gần tương đương với

IC50 của chứng dương acarbose (20,37±1,06).

3.3.2.2. Tác dụng ức chế enzym α-glucosidase

Thực nghiệm in vitro tiếp theo luận án đánh giá tác dụng ức chế enzym

α-glucosidase của cắn toàn phần thân cây chuối tiêu trên tác dụng ức chế

enzym α- glucosidase, kết quả được trình bày trong bảng 3.22

Bảng 3.22. Kết quả tác dụng ức chế enzym α-glucosidase in vitro của cắn toàn phần thân cây chuối tiêu

TT 1 Mẫu thử Cắn toàn phần

2 Acarbose*

*: chứng dương

Nồng độ 5µg/ml 10µg/ml 30µg/ml 5µM 10µM Khả năng ức chế (%) 14,03±3,03 25,07±4,0 75,09±3,53 34,68±1,83 39,07±1,38

Nhận xét: Cắn toàn phần thân cây chuối tiêu thể hiện khả năng ức chế enzym

α-glucosidase ở nồng độ 10 và 30 µg/ml là 25,07 và 75,09 %.

Thí nghiệm tiếp tục được tiến hành với 6 chất được phân lập từ thân cây

chuối tiêu trên khả năng ức chế hoạt tính của enzym α-glucosidase, kết quả

được trình bày trong bảng 3.23.

Bảng 3.23. Khả năng ức chế enzym α-glucosidase của các chất phân lập từ thân cây chuối tiêu

Khả năng ức chế (%)

Tên chất

5µM

Cycloeucalenon Acid myristic Bis(2-ethylhexyl) hexanoat β-sitosterol Acid protocatechuic Daucosterol Acarbose*

- - - 24,56±2,67 - 19,14±2,39 34,68±1,83

25µM - - - 52,19±1,40 - 70,38 ±2,41 53,2±0,46

(-): không có tác dụng ;

10µM - - - 33,73±1,14 - 28,25 ±0,83 39,07±1,38 *: chứng dương

Nhận xét: Trong số 6 chất được khảo sát khả năng ức chế enzym α-

glucosidase, có hai chất là daucosterol và β-sitosterol có tác dụng ức chế

enzym α-glucosidase với các mức liều thử nghiệm khác nhau. Dựa vào kết

quả tác dụng ức chế enzym α- glucosidase của β-sitosterol, daucosterol và

chứng dương acarbose, tiến hành khảo sát IC50 của ở nồng độ thử (0,5; 1,0;

5,0; 10,0 và 25,0 µM), kết quả được trình bày trong bảng 3.24.

Bảng 3.24. IC50 của các chất có tác dụng ức chế α-glucosidase

Tên chất Daucosterol β-sitosterol Acarbose

IC50 (µM) 17,43±0,45 22,60±0,82 21,77±0,65

Nhận xét: Daucosterol và β-sitosterol được phân lập từ thân cây chuối

tiêu có tác dụng ức chế enzym α-glucosidase với IC50 là 17,43±0,45 và

22,60±0,82µM. IC50 của daucosterol thấp hơn IC50 chứng dương acarbose.

3.3.2.3. Tác dụng ức chế enzym PTP1B

Kết quả tác dụng ức chế PTP1B ở các nồng độ khác của cắn toàn phần

được thể hiện trong bảng 3.25

Bảng 3.25. Kết quả tác dụng ức chế PTP1B in vitro của cắn toàn phần

TT 1 Mẫu thử Cắn toàn phần Khả năng ức chế (%) 17,77±0,23 Nồng độ 5µg/ml

10µg/ml 34,61±0,81

30µg/ml 46,53±1,09

5µM 28,18±0,43 2 Suramin*

*: chứng dương

10µM 51,83±0,31

Nhận xét: Cắn toàn phần thân cây chuối tiêu thể hiện khả năng ức chế

enzym PTP1B 34,61 và 46,53% ở nồng độ 10 và 30 µg/ml.

Sáu chất được phân lập từ thân cây chuối tiêu đã được đánh giá tác dụng

ức chế PTP1B in vitro. Suramin được sử dụng làm chứng dương. Kết quả

được trình bày trong bảng 3.26

Bảng 3.26. Kết quả tác dụng ức chế PTP1B in vitro của các chất phân lập từ thân cây chuối tiêu

Tên chất

5µM

Cycloeucalenon Acid myristic Bis(2-ethylhexyl) hexanoat β-sitosterol Acid protocatechuic Daucosterol Suramin*

61,16±1,24 34,20±1,08 - - - - 28,18±0,43

Khả năng ức chế (%) 10µM 72,39±0,78 47,60±0,35 - - - - 51,83±0,31

25µM 83,97±0,83 69,86±1,13 - - - - 78,62±0,58

(-): không có tác dụng; *: chứng dương

Nhận xét: với các nồng độ mẫu thử khác nhau, trong 6 chất phân lập, chỉ

có hai chất là cycloeucalenon và acid myristic có khả năng ức chế PTP1B. Ở

nồng độ mẫu thử cao nhất (25µM), khả năng ức chế PTP1B của

cycloeucalenon và acid myristic là 83,97 và 69,86 %.

Dựa vào kết quả thực nghiệm về khả năng ức chế PTP1B của các chất

phân lập được và chứng dương suramin, tiến hành khảo sát IC50 ở nồng độ

thử (0,5; 1,0; 5,0; 10,0 và 25,0 µM), kết quả thể hiện ở bảng 3.27.

Bảng 3.27. IC50 của các chất có tác dụng ức chế PTP1B

Tên chất Cycloeucalenon Acid myristic Suramin*

IC50 (µM) 3,11±0,44 10,75±0,58 9,5±0,2

Nhận xét: acid myristic ức chế PTP1B với IC50 là 10,75µM,

cycloeucalenon ức chế PTP1B với IC50 là 3,11 µM, nhỏ hơn so với IC50 của

chứng dương (9,5µM).

3.3.2.4. Tác dụng ức chế sự phosphoryl hóa IRS-1(Ser 307) trên dòng tế

bào cơ vân chuột nhắt C2C12

- Tác dụng của cắn toàn phần Để đánh giá tác dụng ức chế sự phosphoryl hóa IRS1 (Ser307) của cắn toàn phần thân cây chuối tiêu, tiến hành thử với 3 nồng độ khác nhau, mỗi nồng độ lặp lại thí nghiệm 3 lần, kết quả được thể hiện trong hình 3.17

Cắn toàn phần (µg/ml) Chứng 12,5 25 50

p-IRS-1

(Ser307)

β-actin

Hình 3.17. Tác dụng của cắn toàn phần ở các nồng độ khác nhau trên lượng IRS-1 phosphoryl hóa ở Ser307

Mật độ ánh sáng của các dải protein được phân tích bằng phần mềm

Image J, kết quả được trình bày tại hình 3.18.

Hình 3.18. So sánh lượng p-IRS-1 (Ser307) giữa các lô ủ với cắn toàn phần ở các nồng độ khác nhau

Nhận xét: với mức độ biểu hiện của β-actin không thay đổi, ở các lô ủ

với cắn toàn phần, có sự giảm dần lượng p-IRS-1(Ser307) khi tăng nồng độ

cắn trong hỗn hợp phản ứng. Tuy nhiên, cả 3 nồng độ thử (12,5 µg/ml, 25

µg/ml, 50 µg/ml) đều không làm giảm lượng p-IRS-1(Ser307) có ý nghĩa

thống kê so với lô chứng (p > 0,05).

- Tác dụng của hai chất phân lập là cycloeucalenon và daucosterol

Tế bào C2C12 đã được biệt hóa, sau khi ủ với các mẫu thử trong 1 giờ, được thu protein, chạy điện di và phân tích Western Blot theo quy trình mô tả ở phần 2.3.7. Kết quả được trình bày tại hình 3.19

Chứng

H125

H150

H225

H250

p-IRS-1

(Ser307)

Β-actin

Hình 3.19. Ảnh hưởng của cycloeucalenon (H1) và daucosterol (H2) ở các nồng độ khác nhau trên lượng IRS-1 phosphoryl hóa ở Ser307

Mật độ ánh sáng của các dải protein được phân tích bằng phần mềm

Image J, kết quả được trình bày tại hình 3.20.

Hình 3.20. So sánh lượng p-IRS-1 (Ser307) giữa các lô ủ với cycloeucalenon (H1) và daucosterol (H2) ở các nồng độ khác nhau

*: p<0,05 so với lô chứng

Nhận xét: Với mức độ biểu hiện của β-actin không thay đổi, đối với

cycloeucalenon (H1), sự thay đổi lượng p-IRS-1(Ser307) ở cả 2 nồng độ thử

nghiệm đều không có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (p>0,05). Trong khi

đó, lượng p-IRS-1(Ser307) ở các lô ủ với daucosterol (H2) giảm so với lô

chứng bệnh. Tuy nhiên, trong 2 nồng độ thử nghiệm, nồng độ 50 µg/ml làm

giảm lượng p-IRS-1(Ser307) có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (p<0,01).

3.3.2.5. Tác dụng hoạt hoá AMPK trên dòng tế bào cơ vân nguyên phát

chuột nhắt C2C12

- Tác dụng của cắn toàn phần Để đánh giá tác dụng trên sự phosphoryl hóa AMPKα của cắn toàn

phần thân cây chuối tiêu, tiến hành thử với 3 nồng độ khác nhau, mỗi nồng độ

lặp lại thí nghiệm 3 lần, kết quả được thể hiện ở hình 3.21.

Chứng

Cắn toàn phần (µg/ml)

Chứng

dương

12,5

25,0

50,0

AMPKα

β actin

Hình 3.21. Tác dụng của cắn toàn phần ở các nồng độ khác nhau trên lượng AMPKα phosphoryl hóa ở Thr172

Cường độ tín hiệu hóa phát quang được xử lý bằng phần mềm Image J, với chất đối chứng là β actin đã cho phép so sánh lượng pAMPKα (Thr 172) giữa các lô, kết quả được thể hiện ở hình 3.22.

Hình 3.22. So sánh lượng p-AMPKα (Thr172) giữa các lô ủ với cắn toàn phần ở các nồng độ khác nhau *: p<0,05 và **: p<0,001 so với lô chứng

Nhận xét: Lượng p-AMPKα (Thr 172) của lô chứng dương tăng gấp

hơn 2 lần so với chứng (p<0,001). Ở các lô ủ với cắn toàn phần, có sự tăng

dần lượng p-AMPK (Thr 172) theo nồng độ cắn trong hỗn hợp phản ứng. Tuy

nhiên, chỉ nồng độ cắn 50 µg/ml làm tăng lượng p-AMPK (Thr 172) có ý

nghĩa thống kê so với lô chứng (p<0,05).

- Tác dụng của hai chất phân lập là cycloeucalenon và daucosterol

Thực nghiệm đánh giá tác dụng hoạt hóa AMPK thông qua tăng

phosphoryl hóa AMPKα (Thr172) được tiến hành với 2 chất phân lập từ phân

đoạn ethylacetat của thân cây chuối tiêu là: cycloeucalenon (H1) và

daucosterol (H2). Kết quả được thể hiện trong hình 3.23.

Chứng

H125

H150

H225

H250

dương

p-AMPKα

(Thr172)

β-actin

Hình 3.23. Tác dụng của cycloeucalenon (H1) và daucosterol (H2) trên lượng AMPK phosphoryl hóa ở Thr172

Mật độ ánh sáng của các dải protein được phân tích bằng phần mềm

ImageJ,kết quả được trình bày tại hình 3.24

Hình 3.24. So sánh lượng p-AMPKα (Thr172) giữa các lô ủ với cycloeucalenon (H1) và daucosterol (H2) ở các nồng độ khác nhau

* p<0,05 so với lô chứng

Nhận xét: Với mức độ biểu hiện của β-actin không thay đổi, lượng p-

AMPK (Thr 172) ở lô chứng dương (AICAR 1mM) tăng gấp hơn 1,36 lần so

với chứng (p<0,05). Ở các lô ủ với chất phân lập cycloeucalenon (H1) và

daucosterol (H2), có sự tăng lượng p-AMPK (Thr 172) khi tăng nồng độ của

mẫu thử trong giếng phản ứng. Tuy nhiên, cả 2 nồng độ thử (25 µg/ml và 50

µg/ml) của cycloeucalenon (H1) và daucosterol (H2) đều không làm tăng có ý

nghĩa thống kê lượng p-AMPK (Thr 172) so với lô chứng (p>0,05).

3.3.2.6. Tác dụng trên sự biệt hóa tế bào 3T3-L1

Tác dụng ức chế biệt hóa tế bào 3T3-L1 của cắn toàn phần thân cây

chuối tiêu và hai chất phân lập là cycloeucalenon và daucosterol được đánh

giá thông qua so sánh lượng TG mà tế bào sau biệt hóa tạo thành ở lô chứng

và các lô thử, kết quả được thể hiện trong hình 3.25.

Hình 3.25. So sánh mức độ tổng hợp triglycerid của tế bào mô mỡ 3T3-L1

Nhận xét: Ở nồng độ mẫu thử 0,1 mg/ml, cắn toàn phần thân cây chuối

tiêu không có tác dụng ức chế sự biệt hóa tế bào 3T3-L1. Tương tự như vậy,

ở lô ủ mẫu thử với hai chất phân lập được là cycloeucalenon và daucosterol

nồng độ triglycerid cũng không khác biệt so với nhóm chứng (p>0,05).

CHƯƠNG IV. BÀN LUẬN

4.1. VỀ TÁC DỤNG HẠ GLUCOSE MÁU CỦA THÂN CÂY CHUỐI TIÊU

Để đánh giá tác dụng hạ glucose máu của thân cây chuối tiêu, các thí

nghiệm được tiến hành trên chuột nhắt tăng glucose máu thực nghiệm bởi

STZ liều 150 mg/kg và chuột cống béo phì ĐTĐ typ 2. Sự kết hợp hai mô

hình thực nghiệm giúp khẳng định rõ hơn khả năng gây hạ glucose máu, đồng

thời giúp đưa ra những nhận định ban đầu về cơ chế hạ glucose máu của thân

cây chuối tiêu..

4.1.1. Lựa chọn liều thử nghiệm

Trước hết việc lựa chọn liều sử dụng cho nghiên cứu là cần thiết, do đó luận án tiến hành thử nghiệm đầu tiên trên chuột tăng glucose máu bằng STZ liều 150 mg/kg. Theo tham khảo của các nghiên cứu sơ bộ về tác dụng của thân cây chuối tiêu trên chuột đái tháo đường thực nghiệm cho thấy: Năm 2007, Singh và cộng sự đã sử dụng bột thân cây với liều 500 mg/kg chuột cống (quy đổi ra liều chuột nhắt là 1000 mg/kg) làm tăng dung nạp glucose ở chuột lên 16,4% [153], năm 2010 Sunneetha và cộng sự đã sử dụng liều 1000,0 mg/kg (quy đổi ra liều chuột nhắt là 2000 mg/kg) trên mô hình chuột cống ĐTĐ bởi alloxan và ghi nhận nồng độ glucose máu giảm 75% , triglycerid giảm 14,44 % và cholesterol giảm 64,37% [163]. Tiếp theo, năm 2011, Ekpo và cộng sự đã thử nghiệm với bột khô từ dịch ép toàn phần gốc thân cây chuối tiêu với liều 1000 mg/kg thể trọng chuột cống bị ĐTĐ bằng alloxan (quy đổi ra liều chuột nhắt là 2000 mg/kg), kết quả cho thấy cắn toàn phần gốc thân cây chuối tiêu có tác dụng hạ glucose máu tại các thời điểm 2 giờ và 4 giờ [45]. Tham khảo kinh nghiệm dân gian, người bệnh bị ĐTĐ thường sử dụng dịch từ thân cây chuối là 100-200ml/ngày. Theo phương pháp ngoại suy liều sử dụng giữa người và chuột của Đỗ trung Đàm (2003) và kết quả thực tế khi chiết xuất dịch ép thân cây chuối tiêu thành bột khô hàm ẩm 5% sẽ tương đương với liều 480-960 mg/kg chuột nhắt. Như vậy, các nghiên cứu thực nghiệm và kinh nghiệm dân gian khi sử dụng thân cây chuối tiêu xoay quanh mức liều 500 - 2000 mg/kg chuột nhắt. Để tìm được mức liều thấp nhất có tác dụng hạ glucose máu là liều chiếm ưu thế cho nghiên cứu, luận án tiến hành khảo sát các mức liều thử nghiệm từ 250-2000 mg/kg. Kết quả trên mô hình này cho thấy: ở lô chuột được uống cắn toàn phần thân cây chuối liều 250 mg/kg và 500 mg/kg mức hạ glucose máu trên chuột

nhắt là 18,75% và 29,9% (độ chênh lệch quá lớn ± 12,96). Trong khi đó ở hai lô chuột uống cắn toàn phần thân cây chuối liều 1000 và 2000 mg/kg có mức hạ glucose tương đương nhau (53,55 và 54,46%) (phụ lục III). Từ các kết quả trong thực nghiệm, luận án quyết định lựa chọn liều sử dụng là 1000 mg/kg chuột nhắt tương đương với liều 500 mg/kg chuột cống cho các nghiên cứu tiếp theo.

4.1.2. Tác dụng của cắn toàn phần

4.1.2.2.Trên chuột tiêm STZ liều 150 mg/kg

Streptozocin (STZ) là một tác nhân được sử dụng rộng rãi trên thế giới

để gây mô hình ĐTĐ thực nghiệm do khả năng phá hủy chọn lọc tế bào β của

tiểu đảo tụy. Tùy theo liều lượng STZ sử dụng, tụy bị tổn thương với mức độ

khác nhau và dẫn đến mức tăng glucose máu tương ứng. Để gây ĐTĐ thực

nghiệm trên chuột nhắt, các tác giả dùng nhiều mức liều STZ khác nhau, từ

50 mg/kg trở lên [10], [113]. Theo Nguyễn Trung Quân, trên chuột nhắt trắng

chủng Swiss được tiêm STZ với các mức liều khác nhau (50, 100,150 và 200

mg/kg), nồng độ glucose máu của các lô chuột lần lượt là 7,17; 7,82; 18,09 và

28,61 mmol/L [10]. Đặc biệt, STZ với liều 150 mg/kg cũng là một mô hình

được dùng khá phổ biến để sàng lọc tác dụng hạ glucose máu của dược liệu

trên thế giới cũng như ở Việt Nam,[13], [113]. Do vậy, luận án lựa chọn liều

STZ 150 mg/kg trên chuột nhắt trắng để gây được mức glucose máu tăng cao

nhưng vẫn đảm bảo sự đáp ứng với mẫu thử.

Mô hình này chưa thể gọi là ĐTĐ typ 1 bởi tế bào β bị phá hủy một phần

và vẫn có thể đáp ứng với gliclazid để tăng sản xuất insulin, giảm glucose

máu [10]. Điều này được khẳng định thông qua kết quả của luận án, lô chuột

uống gliclazid có mức hạ glucose máu là 51,87% đi kèm với nồng độ insulin

tăng gấp 2,05 lần và chức năng bài tiết insulin của tế bào β tăng gấp 6,63 lần

so với lô chứng bệnh.

Mô hình này cũng chưa thể gọi là ĐTĐ typ 2 bởi cho đến nay, chưa có

tác giả nào công bố bằng chứng về sự kháng insulin khi chuột được tiêm STZ

liều 150 mg/kg. Kết hợp với kết quả thực nghiệm của luận án cho thấy các chỉ

số kháng insulin (IR) của các lô chuột tiêm STZ liều 150 mg/kg đều thấp hơn

100

lô chuột bình thường (bảng 3.12). Do vậy, đây là một mô hình tăng glucose

máu thực nghiệm hơn là một mô hình ĐTĐ thực nghiệm.

Trong thí nghiệm này, với tác dụng của cắn toàn phần trên chuột gây

tăng glucose máu bởi STZ, kết quả cho thấy nồng độ glucose máu của cả 4 lô

chuột thí nghiệm sau 72 giờ tiêm STZ đều tăng cao (>14,5 mmol/L) trong khi

đó lô chuột bình thường có nồng độ glucose máu là 5,48 mmol/L. Mức tăng

glucose máu của các lô chuột thí nghiệm sau khi tiêm STZ liều 150 mg/kg

của luận án phù hợp với nhiều nghiên cứu khác [11], [121]. Sau 15 ngày cho

uống mẫu thử, nồng độ glucose máu của lô chuột uống cắn toàn phần (1.000

mg/kg) giảm có ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh (p<0,01). Kết quả

nghiên cứu của luận án là phù hợp với một nghiên cứu của Sunneetha và cộng

sự (2010) về tác dụng hạ glucose máu của thân cây chuối tiêu trên chuột nhắt

trắng tiêm alloxan liều150 mg/kg, (một tác nhân gây phá huỷ tụy với cơ chế

tương tự STZ) [163]. Điều này giúp khẳng định tác dụng hạ glucose máu của

cắn toàn phần thân cây chuối tiêu trên mô hình tăng glucose máu thực nghiệm

do STZ (150 mg/kg).

Các nghiên cứu đánh giá tác dụng hạ glucose máu của dược liệu thường

sử dụng chứng dương là các thuốc đã được chứng minh có tác dụng hạ

glucose máu theo các cơ chế khác nhau [11], [121]. Do đó, trong mô hình

này, luận án đã sử dụng hai thuốc chứng dương là những thuốc kinh điển vẫn

đang được sử dụng rộng rãi trong điều trị ĐTĐ với hai cơ chế hạ glucose máu

khác nhau. Gliclazid là một sulfonylure có cơ chế tác dụng thông qua kích

thích tế bào β giải phóng insulin và metformin được biết đến với tác dụng

theo cơ chế không phụ thuộc vào tế bào β [19]. Trong khi đó cắn toàn phần

thân cây chuối tiêu có mức hạ glucose máu (49,60%) tương đương với lô

chuột uống gliclazid (51,87%) và metformin (51,33%). Khi so sánh nồng độ

insulin và chức năng bài tiết insulin của tế bào β của lô chuột uống mẫu thử là

cắn toàn phần và lô chuột uống gliclazid là hoàn toàn khác nhau (bảng 3.12).

Lô chuột uống gliclazid có nồng độ insulin huyết thanh cao gấp 1,95 lần và

101

chức năng bài tiết insulin của tế bào β cao gấp 1,96 lần so với lô chuột uống

mẫu thử là cắn toàn phần. Trong khi đó, hai chỉ số này ở lô chuột uống

metformin và cắn toàn phần là không khác nhau (p>0,05).

Như vậy, nồng độ glucose máu của lô chuột uống cắn toàn phần và lô

chuột uống metformin giảm hoàn toàn không phải do kích thích tế bào β của

đảo tụy tăng sản xuất insulin như lô chuột uống gliclazid. Điều này hoàn toàn

phù hợp với cơ chế tác dụng của metformin là tác dụng hạ glucose máu

không phải thông qua tăng bài tiết insulin. Từ các kết quả trên thực nghiệm

luận án quyết định lựa chọn metformin làm thuốc chứng dương cho các mô

hình nghiên cứu tiếp theo.

4.1.2.2. Trên chuột cống ĐTĐ typ 2

Để nghiên cứu tác dụng của thuốc trong điều trị ĐTĐ typ 2, không thể

thiếu được các mô hình ĐTĐ typ 2 thực nghiệm. Trên thế giới nói chung, mô

hình ĐTĐ typ 2 được sử dụng phổ biến thường là các chủng chuột mang đột

biến di truyền dẫn đến tình trạng béo phì kèm theo kháng insulin [86]. Ở Việt

Nam, vì nhiều lí do khác nhau, rất khó có thể sử dụng các mô hình ĐTĐ di

truyền này. Trong những năm gần đây, một mô hình ĐTĐ typ 2 đã được triển

khai ở một số nước trên thế giới và ở Việt Nam. Đó là sự kết hợp giữa việc

gây béo phì cho chuột bằng chế độ ăn, dẫn đến kháng insulin và làm giảm sản

xuất insulin ở tụy bằng cách sử dụng STZ liều thấp. Mô hình này đã mô

phỏng được diễn biến sinh bệnh học của ĐTĐ typ 2 ở người với những biểu

hiện đặc trưng như tăng glucose máu, tăng nhẹ insulin, tăng các chỉ số lipid

máu [54], [131].

Trước hết có thể thấy mô hình gây ĐTĐ typ 2 của luận án đã sử dụng

chuột nuôi chế độ ăn giàu chất béo. Sau 60 ngày, kết quả thể trọng chuột ở

tăng cao hơn gấp 2 lần so với lô chuột ăn chế độ ăn bình thường. Đi kèm với

tăng trọng lượng của chuột, nồng độ Cho TP và TG cũng tăng cao.

Để chứng minh chuột ăn chế độ ăn giàu chất béo có sự kháng insulin,

luận án tiến hành định lượng nồng độ glucose máu của lô chuột bình thường

102

và chuột béo phì. Mặc dù nồng độ glucose máu ở lô chuột béo phì (5,94

mmol/L) không khác so với lô chuột bình thường (5,88 mmol/L), nhưng nồng

độ insulin của lô chuột béo phì đã tăng gấp 2,55 lần (bảng 3.13) và đi kèm

theo đó là chỉ số kháng insulin (IR) tăng gấp 2,24 lần so với chuột bình

thường (bảng 3.14). Kết quả này cho thấy chuột béo phì đã bị kháng insulin

do đó tế bào β của đảo tụy phải tăng tiết insulin (chức năng bài tiết insulin

tăng gấp 3,24 lần so với chuột bình thường), để đáp ứng việc chuyển hoá

glucose bình thường của cơ thể.

Bước tiêp theo của luận án là gây ĐTĐ typ 2 thực nghiệm bằng cách sử

dụng STZ liều thấp (50 mg/kg) tiêm màng bụng cho chuột béo phì đã kháng

insulin. Kết quả sau 72 giờ tiêm STZ, nồng độ glucose máu của lô chuột béo

phì tăng lên 19,05 mmol/L. Tiến hành so sánh với lô chuột bình thường cũng

tiêm STZ liều 50 mg/kg, nồng độ glucose là 8,4 mmol/L. STZ là tác nhân phá

huỷ tế bào β đảo tụy. Tuy nhiên, liều STZ 50mg/kg thể trọng chuột cống là

liều thấp mới chỉ gây mức độ tổn thương vừa phải đảo tụy. Trên những chuột

bình thường khoẻ mạnh với cơ chế tự miễn dịch, nồng độ glucose máu của

những chuột bình thường chỉ tăng nhẹ (gấp 1,4 lần so với ban đầu). Những

chuột béo phì đã bị kháng insulin, khi dụng liều STZ 50mg/kg thể trọng

glucose máu tăng cao (gấp 3,21 lần so với ban đầu). Bởi vì, ở các lô chuột

béo phì, tế bào β thường xuyên bị quá tải do phải bài tiết insulin để đáp ứng

với tình trạng kháng insulin, dẫn đến tế bào tế bào β bị suy yếu, chỉ cần một

tác nhân nhẹ như STZ liều 50mg/kg cũng có thể gây tổn thương và tăng

glucose máu. Kết quả trên thực nghiệm của luận án đã chứng minh cho giả

thuyết nêu trên thông qua chỉ số kháng insulin (IR) của chuột béo phì tiêm

STZ tăng cao gấp 6,1 lần và chức năng bài tiết insulin của tế bào β giảm còn

27,02% so với lô chuột bình thường dẫn đến rối loạn bài tiết insulin làm cho

nồng độ glucose máu ở chuột béo phì tiêm STZ tăng cao, dẫn đến ĐTĐ typ 2

thực nghiệm.

103

Kết quả trên mô hình gây bệnh ĐTĐ typ 2 của luận án hoàn toàn phù

hợp với bệnh sinh của ĐTĐ typ 2 mà phần tổng quan (1.1.2.2) và các tác giả

khác khi sử dụng mô hình thực nghiệm trên chuột béo phì và tiêm STZ liều

50 mg/kg để gây bệnh ĐTĐ typ 2 thực nghiệm [6], [11], [131].

Chuột ĐTĐ typ 2 thực nghiệm được chia làm các lô để tiến hành đánh

giá tác dụng của cắn toàn phần từ dịch ép thân cây chuối tiêu. Kết quả cho

thấy: sau 15 ngày, lô chuột uống hỗn dịch cắn toàn phần thân cây chuối tiêu

và lô uống metformin đều giảm glucose máu (26,34 và 53,06%) khác biệt so

với lô chứng bệnh (p<0,05 và p<0,01). Cho tới thời điểm này, theo tài liệu

luận án tham khảo được, chưa tìm thấy một nghiên cứu nào đánh giá tác dụng

hạ glucose máu của thân cây chuối tiêu trên chuột ĐTĐ typ 2 thực nghiệm.

Các bộ phận dùng khác của cây chuối tiêu (hoa, quả, lá, rễ...) cũng chưa được

nghiên cứu trên mô hình này. Kết quả của luận án là công bố đầu tiên về tác

dụng hạ glucose máu của cắn toàn phần thân cây chuối tiêu trên chuột ĐTĐ

typ 2.

4.1.2.3. Trên khả năng dung nạp glucose của chuột cống ĐTĐ typ 2

Trên mô hình chuột ĐTĐ typ 2 thực nghiệm, luận án tiến hành đánh giá

ảnh hưởng của cắn toàn phần trên khả năng dung nạp glucose của chuột bằng

test dung nạp glucose đường uống. Mặc dù cho tới thời điểm này, chưa tìm

thấy nghiên cứu nào đánh giá ảnh hưởng trên sự dung nạp glucose của cắn

toàn phần thân cây chuối tiêu trên chuột đái tháo đường typ 2, tuy nhiên, một

bộ phận dùng khác của cây chuối tiêu là rễ đã được Mallick và cộng sự

(2007) nghiên cứu. Sử dụng liều 800 mg/kg cho chuột ĐTĐ typ 2 uống 14

ngày, test dung nạp glucose cho kết quả ở lô chuột sử dụng rễ cây chuối tiêu

có sự tồn lưu glucose trong máu giảm 34,99% so với lô chứng bệnh [101].

Một nghiên cứu khác trên bộ phận dùng là hoa của cây chuối tiêu cũng đã

được Ashish và cộng sự (2016) đánh giá khả năng dung nạp glucose của

chuột ĐTĐ typ 2 (gây ĐTĐ bằng streptozotocin-nicotinamid (65 -110

mg/kg). Sau 14 ngày sử dụng hoa của cây chuối tiêu với liều 400 mg/kg, test

104

dung nạp glucose cũng được tiến hành và cho kết quả, sự tồn lưu glucose

trong máu giảm 43,83% so với lô chứng bệnh [22]

Kết quả trên mô hình này của luận án thể hiện trong bảng 3.3 cho thấy,

nồng độ glucose máu của các lô chuột ĐTĐ typ 2 sau 15 ngày uống các mẫu

thử (cắn toàn phần, metformin) là khác nhau (p<0,05 và p<0,01 so với lô

chứng bệnh. Do đó, khi thử nghiệm test dung nạp glucose bằng đường uống

liều 3g/kg thể trọng, nồng độ glucose máu của các lô chuột tại các thời điểm

30,60,90 và 120 phút của các lô chuột thí nghiệm luôn khác biệt (p<0,05 và

p<0,01). Để đánh giá sự tồn lưu glucose trong máu của các lô chuột thí

nghiệm, luận án đã sử dụng phương pháp tính tổng tích phân nồng độ glucose

tại các thời điểm liền kề 0-30; 30-60; 60-90; 90-120 phút. Kết quả hình 3.4

thể hiện sự tồn lưu glucose trong máu của 3 lô chuột thông qua sự khác biệt

về diện tích dưới đường cong (AUC) glucose. Sự tồn lưu glucose trong máu

sau 120 phút của lô chuột uống cắn toàn phần thân cây chuối tiêu giảm

27,31% so với lô chứng bệnh. Kết quả trên mô hình này của luận án đã ghi

nhận cắn toàn phần thân cây chuối tiêu có tác dụng tăng dung nạp glucose

trong test dung nạp glucose trên chuột cống trắng ĐTĐ typ 2 thực nghiệm.

Sau khi đã khẳng định đươc tác dụng hạ glucose máu của cắn toàn phần

thân cây chuối tiêu trên chuột ĐTĐ thực nghiệm, một vấn đề đặt ra là hợp

chất nào trong thân cây chuối tiêu có tác dụng hạ glucose máu. Nội dung tiếp

theo của luận án xác định phân đoạn có tác dụng hạ glucose máu chiếm ưu

thế với mục đích phân lập chất theo định hướng tác dụng hạ glucose máu.

4.1.3. Tác dụng của cắn phân đoạn

Hiện nay, các thuốc có nguồn gốc dược liệu đang được các nhà khoa

học đặc biệt quan tâm. Vì vậy, xu hướng tách chiết, phân lập các hoạt chất

trong dược liệu để hướng tới mục tiêu làm thuốc là một vấn đề hết sức cần

thiết khi nghiên cứu về tác dụng của dược liệu. Dịch toàn phần là hỗn hợp của

nhiều chất khác nhau, do đó việc tách chiết, phân lập các chất không thể thực

hiện được. Để thực hiện được điều này, trước hết phải chiết tách các nhóm

105

chất trong thân cây chuối tiêu theo độ phân cực khác nhau. Bốn dung môi với

độ phân cực tăng dần là n-hexan, cloroform, ethylacetat và n-butanol được

chiết lần lượt với dịch toàn phần. Kết quả thu được 4 phân đoạn tương ứng và

phần dịch chiết nước còn lại. Năm phân đoạn này được thử tác dụng hạ

glucose máu trên chuột tăng glucose máu thực nghiệm bởi STZ liều 150

mg/kg để lựa chọn phân đoạn có tác dụng hạ glucose máu chiếm ưu thế. Kết

quả trong hình 3.5 cho thấy, trong các lô chuột uống hỗn dịch cắn các phân

đoạn, chỉ có lô uống hỗn dịch phân đoạn ethyl acetat và n-butanol làm hạ

glucose máu lần lượt là 38,56% và 50,3%, khác biệt có ý nghĩa thống kê

(p<0,05) so với lô chứng bệnh. Kết quả trên thí nghiệm này giúp lựa chọn hai

phân đoạn ethylacetat và n-butanol là hai phân đoạn có tác dụng hạ glucose

máu chiếm ưu thế.

Để một lần nữa khẳng định nhận xét nêu trên, luận án tiến hành đánh

giá tác dụng hạ glucose máu của phân đoạn ethylacetat và phân đoạn n-

butanol trên mô hình chuột cống gây ĐTĐ typ 2. Kết quả hình 3.6 cho thấy cả

hai phân đoạn ethyl acetat và phân đoạn n-butanol đều có tác dụng hạ glucose

máu lần lượt là 44,45% và 49,26%. Mặc dù ở mức độ khác nhau, kết quả này

một lần nữa giúp khẳng định nhận định ban đầu đưa ra về tác dụng của phân

đoạn ethyl acetat và phân đoạn n-butanol.

Như vậy, các kết quả đều chỉ ra rằng thân cây chuối tiêu có tác dụng hạ

glucose máu trên chuột tăng glucose máu thực nghiệm. Các kết quả này là

minh chứng khoa học cho việc sử dụng dịch thân cây chuối tiêu để điều trị

ĐTĐ theo kinh nghiệm dân gian ở một số địa phương.

Nội dung tiếp theo của luận án hướng là phân lập chất định hướng điều

trị ĐTĐ trong hai phân đoạn có tác dụng hạ glucose máu chiếm ưu thế là

phân đoạn ethylacetat và n-butanol.

4.2. VỀ VIỆC PHÂN LẬP CHẤT TRONG PHÂN ĐOẠN CÓ TÁC

DỤNG HẠ GLUCOSE MÁU CHIẾM ƯU THẾ

106

Kết quả thử nghiệm trên các mô hình thực nghiệm nêu trên đã khẳng

định tác dụng hạ glucose máu của cắn toàn phần thân cây chuối tiêu. Vấn đề

đặt ra là hoạt chất hoặc nhóm hoạt chất nào trong thân cây chuối tiêu có tác

dụng hạ glucose máu trong dược liệu này? Để làm rõ mối liên quan giữa

thành phần hóa học và tác dụng hạ glucose máu của dược liệu, luận án tiến

hành định tính sơ bộ các nhóm chất hóa học trong cắn toàn phần và 2 phân

đoạn có tác dụng hạ glucose máu bằng các phản ứng hóa học đặc trưng. Kết

quả cho thấy cắn toàn phần chứa 4 nhóm chất chính là tanin, sterol, đường

khử và acid hữu cơ, trong đó tanin, sterol và acid hữu cơ tập trung trong phân

đoạn ethylacetat. Sterol, đường khử có mặt chủ yếu trong phân đoạn n-

butanol. Theo các tài liệu tham khảo luận án tìm được, ở Việt Nam hiện nay

chưa có một nghiên cứu nào về thành phần hóa học của thân cây chuối tiêu.

Kết quả này của luận án phù hợp với các kết quả nghiên cứu về thành phần

hóa học của thân cây chuối tiêu mà các tác giả trên thế giới đã công bố [45],

[115],[170]. Tuy nhiên, các nghiên cứu cũng mới chỉ ghi nhận về thành phần

hoá học trong thân cây chuối tiêu. Cho tới thời điểm này, theo tài liệu tham

khảo, luận án chưa tìm thấy có nghiên cứu ghi nhận về phân lập chất trong

thân cây chuối tiêu.

Việc phân lập chất được thực hiện dựa trên định hướng tác dụng sinh

học với mong muốn tìm ra các chất có hoạt tính hạ glucose máu từ thân cây

chuối tiêu. Luận án đã sử dụng kết hợp các phương pháp kinh điển để phân

lập chất từ phân đoạn ethylacetat và n-butanol, các chất sau khi phân lập được

kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng, sử dụng ba hệ dung môi có độ

phân cực khác nhau (phụ lục V). Do kết quả định tính cho thấy hai phân đoạn

ethylacetat và n-butanol chứa chủ yếu các hợp chất sterol nên ngoài việc quan

sát bản mỏng dưới ánh sáng tử ngoại, thuốc thử hiện màu được lựa chọn là

vanillin/H2SO4 đặc. Các chất được coi là tương đối tinh khiết khi trên các sắc

ký đồ chỉ cho một vết chất. Kết quả từ phân đoạn dịch chiết ethylacetat và n-

butanol thu được 6 chất, ký hiệu FE1C, FE6B, FE10A, FE12A, FB2A và

107

FB2B. Trong đó có 5 chất phân lập được dưới dạng tinh thể và một chất dạng

chất dầu màu vàng. Các chất này được nhận dạng dựa trên kết quả phổ khối,

phổ cộng hưởng từ hạt nhân (phụ lục V) và qua so sánh với các dữ liệu phổ

đã được công bố. Kết quả nhận dạng cho thấy FE1C là cycloeucalenon, FE6B

là acid myristic, FE10A là acid protocatechuic và FE12A là daucosterol ,

FB2A là β-sitosterol và FB2B là bis (2-ethylhexyl) hexanoat. Trong 6 hợp

chất phân lập được có 3 hợp chất thuộc nhóm sterol là cycloeucalenon,

daucosterol và β-sitosterol. Điều này hoàn toàn phù hợp với kết quả định tính.

Theo đó, trong phân đoạn ethylacetat và phân đoạn n-butanol có chứa nhóm

hợp chất sterol. Trong hai phân đoạn này, phân đoạn ethylacetat ít phân cực

hơn phân đoạn n-butanol. Thực tế β-sitosterol là một phytosterol có độ phân

cực hơn cycloeucalenon và daucosterol nên β-sitosterol đã được phân lập từ

phân đoạn n-butanol. Mặc dù chưa có nghiên cứu nào khác tiến hành phân lập

các chất trong thân cây chuối tiêu. Tuy nhiên, kết quả các chất phân lập được

trong thân cây chuối tiêu trong luận án tương tự như các chất mà Silva và

cộng sự (2014) phân lập được từ quả của cây chuối tiêu [149]. Qua tài liệu

tham khảo được, 6 chất phân lập được có những đặc điểm tác dụng dược lý

cụ thể như sau:

Cycloeucalenone là một sterol được phân lập từ loài Solanum

cernuum Vell [99], Tinospora crispa [87]. giảm đau, chống viêm [99], điều

hòa và kiểm soát nhẹ nhịp tim [87]. Theo công bố của Linlin Fang năm 2014

cho kết quả Cycloeucalenon chiết xuất trong ngũ vị tử (Schisandra chinensis)

có tác dụng ức chế PTP1B [51]. Như vậy có khả năng Cycloeucalenon trong

thân cây chuối tiêu cũng góp phần làm hạ glucose máu của thân cây chuối

tiêu. Để có thêm bằng chứng cho kết luận này, luận án sẽ có các nghiên cứu

tiếp theo về tác dụng hạ glucose máu in vitro của cycloeucalenon chiết xuất

từ thân cây chuối tiêu.

Daucosterol là một β-sitosterol khá quen thuộc đã được phân lập từ

các loài thực vật khác nhau như Mitragyna speciosa [95], Benincasa hispida

108

(Thunb.) Cogn [65]... Tác dụng dược lý của daucosterol đã được chứng minh

qua các nghiên cứu. Theo đó, daucosterol có tác dụng giảm đau, chống viêm

[78]… Đặc biệt là tác dụng hạ glucose máu [188] . Tác dụng hạ glucose máu

của daucosterol cũng đã được nghiên cứu: Khi dùng daucosterol (phân lập từ

loài Urtica angustifolia) có tác dụng làm tăng dung nạp glucose máu trong

test dung nạp glucose bằng đường uống trên chuột thực nghiệm [188]. Theo

nghiên cứu của Miyazawa và cộng sự năm 2005, daucosterol chiết xuất từ

Arctium lappa L có tác dụng ức chế α-glucosidase [104]. Từ các nghiên cứu

trên cho thấy, daucosterol cũng có thể đóng góp không nhỏ vào tác dụng hạ

glucose máu của dịch ép thân cây chuối tiêu. Để có thêm kết luận về

daucosterol, luận án sẽ tiến hành thử nghiệm đánh giá tác dụng hạ glucose

máu in vitro của daucosterol chiết xuất từ phân đoạn ethylacetat của thân cây

chuối tiêu trên các mô hình thực nghiệm in vitro tiếp theo.

Acid protocatechuic là một hợp chất phenolic rất quen thuộc. Các

nghiên cứu trên thế giới đã chỉ ra rằng, acid protocatechuic có tác dụng kháng

khuẩn [102], bảo vệ cơ thể chống lại độc tố Cadmi gây ngộ độc gan và thận

[14], bảo vệ tim trong những tổn thương do thiếu máu cục bộ/ tái tưới máu

trên chuột [164], cải thiện chức năng tim, ngăn ngừa rối loạn chức năng ty thể

tim và tăng protein chống thiếu dinh dưỡng trên chuột gây tăng glucose máu

bởi STZ liều 50 mg/kg thể trọng chuột [141]. Điều này cho thấy, việc sử dụng

dịch ép thân cây chuối tiêu không những có tác dụng hạ glucose máu mà còn

có thể giảm cholesterol máu và dự phòng biến chứng trên tim mạch ở bệnh

nhân ĐTĐ.

Acid myristic là một acid béo chưa no với tác dụng chống oxy hóa.

giảm đáng kể cholesterol toàn phần và LDL, giảm HbA1c và tăng HDL-

cholesterol [112]. Ngoài ra, acid myristic cũng đã được biết đến với tác dụng

tăng dung nạp glucose trên tế bào C2C12 của chuột nhắt. Nghiên cứu của

Yuko và cộng sự (2016) đã chỉ ra Acid myristic tăng 1,4 lần nồng độ insulin

không phụ thuộc nồng độ glucose [187] và acid myristic đã được Shibata và

109

cộng sự (2013) chứng minh có tác dụng ức chế PTP1B [146]. Nghiên cứu tác

dụng hạ glucose máu in vitro của acid myristic chiết xuất từ cắn phân đoạn

ethyacetat của thân cây chuối tiêu sẽ góp phần làm sáng tỏ thêm về cơ chế hạ

glucose máu của thân cây chuối tiêu.

β-sitosterol có cấu trúc gần giống với cholesterol có trong thức ăn, do

đó gây ức chế cạnh tranh làm giảm hấp thu cholesterol tại đường tiêu hóa,

làm giảm nồng độ cholesterol trong máu có lợi cho bệnh nhân ĐTĐ typ 2

[105]. β-sitosterol có tác dụng tương tự làm hạ glucose máu và làm tăng nồng

độ insulin trong máu trên cả chuột bình thường và cả chuột bị tăng glucose

máu [71]. Trên chuột cống trắng ĐTĐ typ 2 β-sitosterol làm giảm glucose

máu, tăng insulin huyết, tăng khả năng chống oxy hóa của tế bào β đảo tụy

[128]. Do vậy, β-sitosterol được tách chiết từ phân đoạn n-butanol của thân

cây chuối tiêu có thể đóng vai trò quan trọng trong việc giảm TG và Cho TP

trên chuột ĐTĐ typ 2 ăn chế độ ăn giàu chất béo và gây rối loạn chuyển hóa

bởi STZ (50mg/kg) và đóng một vai trò quan trọng trong cơ chế tác dụng làm

giảm kháng insulin của thân cây Chuối tiêu.

Bis(2-ethylhexyl) hexanoat có tác kích hoạt receptor kích hoạt

proliferator peroxisome (PPAR) trên tế bào F9 trong một nghiên cứu của

Alfonso và cộng sự với tác dụng điều trị ung thư [18]. Gần đây, chưa có

nghiên cứu nào về tác dụng của Bis(2-ethylhexyl) hexanoat liên quan đến

ĐTĐ.

Như vậy, luận án đã phân lập được 6 chất, tìm hiểu qua các tài liệu tham

khảo, dựa trên điều kiện thực tế và mục tiêu của đề tài, luận án tiến hành thử

tác dụng in vitro của cả 6 chất đã phân lập được từ thân cây chuối tiêu trên

khả năng ức chế các enzym PTB1B, α- amylase và α-glucosidase và hai chất

là cycloeucalenon và daucosterol sẽ được tiến hành thử tác dụng hoạt hóa

AMPK và IRS1 trên tế bào cơ vân nguyên phát chuột nhắt C2C12 và ức chế

biệt hoá tế bào mô mỡ 3T3-L1 chuột nhắt. Các kết quả của luận án trên mô

hình thử nghiệm in vivo và in vitro là những cơ sở khoa học để đánh giá về cơ

110

chế tác dụng của thân cây chuối tiêu ứng dụng trong hỗ trợ/điều trị đái tháo

đường. Nội dung tiếp theo của luận án là tìm hiểu cơ chế hạ glucose máu của

thân cây chuối tiêu thông qua các kết quả trên thực nghiệm.

4.3. VỀ CƠ CHẾ TÁC DỤNG HẠ GLUCOSE MÁU CỦA THÂN CÂY

CHUỐI TIÊU

Sau khi đánh giá tác dụng hạ glucose máu trên mô hình thực nghiệm in

vivo trên chuột nhắt trắng tăng glucose máu bởi STZ liều 150 mg/kg. Thông

qua việc định lượng nồng độ glucose máu và insulin huyết thanh của lô chuột

uống cắn toàn phần thân cây chuối tiêu và các lô chuột uống các thuốc đối

chứng dương là gliclazid và metformin là hai loại thuốc được sử dụng phổ

biến nhất trong điều trị đái tháo đường typ 2 hiện nay [19]. Kết quả trên mô

hình này đã chứng minh được tác dụng hạ glucose máu của lô chuột uống

mẫu thử là cắn toàn phần thân cây chuối tiêu có tác dụng tương tự như

metformin thông qua việc định lượng nồng độ glucose máu, insulin huyết

thanh và xác định chỉ số kháng insulin và chức năng bài tiết insulin của tế bào

beta đảo tụy. Kết quả này được lặp lại trên mô hình chuột cống đái tháo

đường typ 2.

Nghiên cứu tiếp theo để định hướng xác định cơ chế hạ glucose máu

của thân cây chuối tiêu, luận án xác định cơ chế hạ glucose máu theo hai

hướng là tác dụng trên chuyển hoá và tác dụng trên sự nhạy cảm của mô đích

với insulin. Đây là hai cơ chế hạ glucose máu của metformin đã được công bố

[88],[132]. Theo đó, các nghiên cứu in vitro luận án xác định cơ chế hạ

glucose máu theo hướng tác dụng trên chuyển hoá và tác dụng trên sự nhạy

cảm của mô đích với insulin. Dựa theo các tài liệu tham khảo trong phần tổng

quan, các nhà khoa học trên thế giới thực hiện nghiên cứu cơ chế hạ glucose

máu trên các dược liệu khác nhau [11], [109], [159]. Kết hợp với điều kiện và

khả năng thực hiện được luận án tại Việt Nam, theo đó hướng nghiên cứu tác

dụng của cắn toàn phần và chất phân lập từ thân cây chuối tiêu trên chuyển

hoá, luận án đánh giá tác dụng in vitro trên enzym ức chế tiêu hoá glucid là α-

111

amylase và α-glucosidase, enzym ức chế tân tạo glucose là enzym G6Pase.

Nghiên cứu theo hướng tăng nhạy cảm của mô đích với insulin thông qua ức

chế PTP1B, ức chế IRS-1 (Ser 307). Kết hợp tác dụng trên chuyển hoá và

tăng nhạy cảm của mô đích với insulin luận án đánh giá tác dụng ức chế biệt

hoá tế bào 3T3L1 và hoạt hoá AMPK. Các nghiên cứu lần lượt được thể hiện

ở mức độ cơ thể, mức độ tế bào và phân tử.

4.3.1. Cơ chế hạ glucose máu ở mức độ cơ thể

4.3.1.1. Về tác dụng trên nồng độ insulin huyết thanh

Sau khi khẳng định được tác dụng hạ glucose máu của cắn toàn phần

thân cây chuối tiêu trên chuột tăng glucose máu bởi STZ liều 150 mg/kg, với

mục đích kiểm tra cơ chế tác dụng của cắn toàn phần thân cây chuối tiêu có

phải thông qua insulin hay không? Luận án tiến hành định lượng nồng độ

insulin huyết thanh của 5 lô chuột thí nghiệm.

Kết quả trong bảng 3.12 cho thấy trong 4 lô chuột thí nghiệm, chỉ có lô 3

(chuột uống gliclazid) nồng độ insulin huyết thanh tăng cao hơn một cách có

ý nghĩa thống kê (p<0,01). Tác dụng làm hạ glucose máu ở lô 3 là do

gliclazid với cơ chế phong bế kênh K+ phụ thuộc ATP của tế bào β, do đó,

làm giảm nồng độ K+, gây khử cực màng và mở kênh Ca2+ phụ thuộc điện

thế, kết quả là làm tăng giải phóng insulin từ tế bào β [118]. Kết quả trên mô

hình này cho thấy lô chuột uống gliclazid nồng độ insulin huyết thanh tăng

cao (0,84 ng/ml) khác biệt so với lô chứng bệnh và hai lô chuột uống

metformin và cắn toàn phần (p<0,05). Mặt khác, khi so sánh nồng độ glucose

máu ở các lô chuột cho thấy cả ba lô chuột uống gliclazid, metformin và cắn

toàn phần đều giảm khác biệt so với lô chứng. Điều này có thể giải thích như

sau: Ở lô chuột uống gliclazid nồng độ insulin tăng cao, đi kèm với tăng chức

năng bài tiết insulin của tế bào β đáp ứng được với sự tăng nồng độ glucose

máu do đó làm hạ glucose máu. Trong khi đó hai lô chuột uống metformin và

cắn toàn phần thân cây chuối tiêu cũng gây hạ glucose máu khác biệt so với

lô chứng bệnh. Tuy nhiên theo một cơ chế khác với lô chuột uống gliclazid

112

bởi có sự khác biệt về chỉ số kháng insulin và chức năng bài tiết insulin

(p<0,05). Do đó có thể suy luận cắn toàn phần thân cây chuối tiêu có tác dụng

hạ glucose máu không phải do kích thích tế bào β đảo tụy sản xuất insulin

như gliclazid mà tác dụng theo kiểu metformin tác dụng hạ glucose máu đa

cơ chế, chủ yếu do làm tăng tác dụng của insulin ở mô đích hơn là tăng số

lượng insulin. Việc định lượng nồng độ insulin huyết thanh và xác định chỉ số

kháng insulin (IR) và chức năng bài tiết insulin của tế bào β giúp luận án lựa

chọn chứng dương phù hợp định hướng nghiên cứu cơ chế tác dụng của cắn

toàn phần thân cây chuối tiêu.

Giải thích cho giả thuyết trên, tiến hành định lượng nồng độ insulin

huyết thanh trên chuột ĐTĐ typ 2 thực nghiệm.

Sau khi được uống các mẫu thử trong 15 ngày, lô chuột uống metformin

và cắn toàn phần thân cây chuối có khác biệt so với lô chứng bệnh (p<0,01 và

p<0,05). Định lượng nồng độ insulin huyết thanh của các lô chuột thí nghiệm,

kết quả bảng 3.17 cho thấy: mặc dù nồng độ insulin của các lô chuột ĐTĐ typ

2 không giảm so với ngày đầu tiên, nhưng đã có sự giảm chỉ số kháng insulin

và cải thiện chức năng tế bào β ở hai lô chuột uống metformin và cắn toàn

phần (p<0,01 và p<0,05 so với lô chứng bệnh), kèm theo đó là mức hạ

glucose máu (hình 3.2) của lô chuột uống mẫu thử là cắn toàn phần thân cây

chuối là 26,34% và lô chuột uống metformin là 53,06% so với lô chứng bệnh

(p<0,05 và p<0,01). Mặc dù mức độ giảm glucose máu là khác nhau, nhưng

đã có sự cải thiện tình trạng kháng insulin thông qua giảm chỉ số kháng

insulin ở lô chuột uống cắn toàn phần và lô chuột uống metformin (bảng

3.15) giảm khác biệt so với lô chứng bệnh (p<0,05 và p<0,01). Cho tới thời

điểm này, luận án chưa tìm thấy tài liệu tham khảo nào ghi nhận tác dụng của

cắn toàn phần thân cây chuối tiêu trên nồng độ insulin trên chuột ĐTĐ thực

nghiệm.

Để tiếp tục tìm hiểu về cơ chế tác dụng của cắn toàn phần thân cây chuối

tiêu ở mức độ cơ thể, xác định nồng độ glucose máu của các lô chuột ĐTĐ

113

typ 2 trong test dung nạp glucose bằng đường uống là nội dung tiếp theo của

luận án.

4.3.1.2. Về tác dụng tăng dung nạp glucose trong test dung nạp glucose

bằng đường uống

Trong test dung nạp glucose bằng đường uống, kết quả của luận án đã

ghi nhận cắn toàn phần thân cây chuối tiêu có tác dụng tăng dung nạp

glucose thể hiện bằng sự tồn lưu glucose trong máu thông qua diện tích

dưới đường cong (AUC) trong 120 phút của lô chuột uống cắn toàn phần

thân cây chuối tiêu khác biệt so với lô chứng bệnh (p <0,05, hình 3.4).

Trong thí nghiệm này, mức tăng dung nạp glucose của lô chuột uống hỗn

dịch cắn toàn phần thân cây chuối tiêu tương tự như lô uống metformin là

thuốc từ lâu đã được chứng minh có cơ chế tác dụng là làm tăng sử dụng

glucose ở tế bào, tăng nhạy cảm với insulin, ức chế tổng hợp glucose ở gan

[88],[132]. Bên cạnh đó, có thể cắn toàn phần thân cây chuối tiêu có tác dụng

tăng dung nạp glucose trong test dung nạp glucose bằng đường uống thông qua

tăng vận chuyển glucose vào trong tế bào do tăng tổng hợp GLUT4, một

protein có vai trò quan trọng trong vận chuyển glucose vào trong tế bào [42]. Ở

mức độ cơ thể, từ kết quả thực nghiệm, cho thấy cắn toàn phần thân cây chuối

tiêu có tác dụng tăng dung nạp glucose trong test dung nạp glucose đường

uống trên chuột ĐTĐ typ 2 với nhiều cơ chế khác nhau như đã giả thuyết ở

trên. Để làm sáng tỏ giả thuyết này, cần có các kết quả của các mô hình thực

nghiệm khác để đánh giá cơ chế hạ glucose máu thân cây chuối tiêu.

Trong phần tổng quan về bệnh sinh của ĐTĐ typ 2 của luận án đã đề

cập tới, béo phì, tăng nồng độ acid béo tự do là một trong các nguyên nhân cơ

bản gây kháng insulin. Giảm nồng độ lipid huyết thanh tuy không phải là cơ

chế tác động trực tiếp vào tác dụng hạ glucose máu, nhưng đây cũng là một

cơ chế gián tiếp làm giảm kháng insulin. Do đó nội dung tiếp theo của luận án

là định lượng nồng độ lipid huyết thanh của các lô chuột ĐTĐ typ 2.

4.3.1.3. Về tác dụng trên nồng độ lipid huyết thanh

114

Tăng nồng độ lipid nói chung và nồng độ acid béo tự do (FFA) trong

huyết tương là một trong những cơ chế bệnh sinh của ĐTĐ typ 2. Sự tăng

FFA kéo theo tăng acetyl CoA, một chất ức chế pyruvat dehydrogenase trong

tế bào; tăng tỷ lệ NADH/NAD+ dẫn đến ức chế chu trình Krebs, gây tích luỹ

citrat, một chất gián tiếp ức chế hexokinase. Tổng hợp tất cả các biến đổi trên

là sự suy giảm thoái hóa glucose [40]. Bên cạnh đó, nồng độ acid béo tự do

tăng trong máu có ảnh hưởng lớn đến cơ chế truyền tín hiệu nội bào của

insulin ở tế bào đích. Sự tăng FFA thường đi kèm với tăng TG, diacyl

glycerol, acyl CoA chuỗi dài, từ đó hình thành khái niệm về độc tính gây ra

bởi lipid. Sự tăng nồng độ FFA trong huyết tương dẫn đến tăng nồng độ acyl

CoA và diacyl glycerol, tăng tổng hợp protein kinase C, ức chế quá trình

phosphoryl hóa tyrosin của IRS-1[145]. Do đó, làm giảm sự hoạt động

insulin, dẫn đến đề kháng insulin ở tế bào đích. Tuy trong luận án chưa tiến

hành định lượng nồng độ FFA trong huyết thanh nhưng đã có sự ghi nhận

giảm TG, Cho TP thường đi kèm với giảm FFA và gián tiếp giúp cải thiện

tình trạng kháng insulin ở cả người bệnh ĐTĐ typ 2 và động vật ĐTĐ thực

nghiệm [145].

Kết quả gây mô hình ĐTĐ typ 2 cho thấy sau 60 ngày ăn bằng chế độ ăn

giàu chất béo, không chỉ có sự tăng lên về nồng độ glucose máu mà nồng độ

lipid máu cũng tăng cao khác biệt so với lô chuột bình thường (bảng 3.13). Sự

gia tăng nồng độ Cho TP và TG xuất hiện ở chuột ăn chế độ ăn nhiều chất

béo và được tiêm STZ liều thấp với mức tăng gấp 7,8 lần TG và gấp 2,5 lần

Cho TP của chuột ăn chế độ bình thường (bảng 3.13). So sánh với các nghiên

cứu tại Việt Nam như nghiên cứu của Trần Thị Chi Mai, sau 30 ngày ăn chế

độ ăn giàu chất béo và tiêm STZ liều 50 mg/kg, TG lên gấp 2,5 lần và Cho

TP tăng gấp 2,3 lần so với lô chuột bình thường [8]. Nghiên cứu của

Srinivasan K, chế độ ăn chứa 58% lipid làm tăng TG gấp 2 lần, Cho TP tăng

gấp 2,3 lần. Sự kết hợp với STZ liều thấp (35 mg/kg) khiến nồng độ TG tăng

gấp 6 lần, Cho TP tăng gấp 4 lần so với bình thường [158]. Như vậy, so với

115

các nghiên cứu đã tiến hành ở Việt Nam và trên thế giới, chuột ĐTĐ typ 2

trong nghiên cứu của luận án xuất hiện rối loạn chuyển hóa lipid (bảng 3.16)

tương tự như các nghiên cứu đã công bố, biểu hiện thông qua sự tăng cao về

nồng độ Cho TP và TG huyết thanh [11], [158]. Chuột ĐTĐ typ 2 trong luận

án xuất hiện sự tích tụ mỡ trong ổ bụng với khối lượng mô mỡ khác biệt so

với lô chuột bình thường (phụ lục IV) tương tự như các nghiên cứu đã công

bố [11], [129]. Sau 15 ngày thử nghiệm, kết quả trong hình 3.14 cho thấy lô

chuột uống cắn toàn phần thân cây chuối tiêu có nồng độ Cho TP và TG giảm

49,0 đến 59,6% so với ngày đầu tiên, có sự khác biệt so với lô chứng bệnh chỉ

giảm 9,8% và 9,1% (p<0,05). Nồng độ Cho TP và TG của lô chuột uống cắn

toàn phần thân cây chuối tiêu tương đương với lô chuột uống metformin liều

120 mg/kg (p>0,05). Kết quả trên mô hình này của luận án phù hợp với công

bố của Sunneetha và cộng sự (2010) về tác dụng của cắn toàn phần thân cây

chuối tiêu trên glucose máu, Cho TP và TG của chuột ĐTĐ thực nghiệm

[163]. Kết quả của luận án chỉ ra rằng, dưới tác dụng của cắn toàn phân cây

chuối tiêu, một yếu tố bệnh sinh quan trọng của ĐTĐ typ 2 đã được cải thiện.

Đây là một nguyên nhân giúp lô chuột ĐTĐ typ 2 được uống cắn toàn phần

thân cây chuối có những dấu hiệu cải thiện đáng kể cả nồng độ glucose máu

và khả năng dung nạp glucose.

Như vậy, ở mức độ cơ thể, cắn toàn phần thân cây chuối tiêu không có

tác dụng tăng tiết insulin nhưng lại có tác dụng tăng nhạy cảm của mô đích

với insulin, tăng dung nạp glucose trong test dung nạp glucose bằng đường

uống và giảm nồng độ TG, Cho TP gián tiếp cải thiện tình trạng kháng insulin

trên chuột ĐTĐ thực nghiệm. Để làm sáng tỏ hơn các cơ chế hạ glucose máu

của dược liệu này, từ những kết quả có được trong thực nghiệm, luận án tiếp

tục tìm hiểu các cơ chế ở mức độ tế bào, phân tử.

4.3.2. Cơ chế hạ glucose máu ở mức độ tế bào, phân tử

4.3.2.1. Về tác dụng trên mô tụy nội tiết và tế bào β của chuột ĐTĐ typ 2

116

Theo kết quả của luận án, chuột ĐTĐ typ 2 thực nghiệm uống hỗn dịch

cắn toàn phần không có tác dụng tăng nồng độ insulin nhưng lại có tác dụng

giảm nồng độ glucose máu, với mức độ tương đương lô dùng metformin. Kết

quả này một lần nữa gợi ý rằng thân cây chuối tiêu làm tăng nhạy cảm của

mô đích với insulin, cải thiện tình trạng kháng insulin, do đó nhu cầu sản xuất

insulin từ tụy ổn định, tránh được tình trạng quá tải của tế bào . Kết quả này

đã được xác định thông qua khả năng bài tiết insulin, chỉ số kháng insulin của

các lô chuột ĐTĐ typ 2 thực nghiệm (bảng 3.15). Theo đó, ở lô chuột uống

metformin và lô uống cắn toàn phần thân cây chuối tiêu có chỉ số kháng

insulin (IR) giảm khác biệt so với lô chứng bệnh (p<0,01 và p<0,05). Nhận

định này được làm sáng tỏ bằng kết quả về tình trạng mô tụy nội tiết của các

lô chuột ĐTĐ typ 2. Lô chứng bệnh có mật độ tiểu đảo tụy giảm, đảo tụy biến

dạng, giảm về kích thước và có sự mất tế bào β trên diện rộng, tế bào β tiểu

đảo tụy giảm về số lượng, có dấu hiệu thoái hóa hốc. Trong khi đó, ở 2 lô

uống cắn toàn phần thân cây chuối tiêu và metformin đảo tụy có giảm về kích

thước so với lô chuột bình thường nhưng ít có dấu hiệu tổn thương, thoái hóa

(hình 3.13). Hình ảnh mô bệnh học tụy chuột ĐTĐ typ 2 của luận án tương tự

như hình ảnh mô tụy chuột trong một số công bố trước đây về mô hình ĐTĐ

typ 2 bằng chế độ ăn giàu chất béo kết hợp STZ liều thấp [6],[11]. Các kết

quả này cho thấy cắn toàn phần thân cây chuối tiêu có xu hướng tác dụng làm

giảm kháng insulin tương tự như metformin không thông qua cơ chế kích

thích giải phóng insulin ở tuyến tụy do đó giúp tiểu đảo tụy có khả năng phục

hồi. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với sinh lý đảo tụy, khi các tế bào β đảo

tụy được phục hồi thì chức năng bài tiết insulin của tế bào β ở hai lô chuột

uống metformin và cắn toàn phần cũng tăng lên khác biệt so với lô chứng

bệnh (p<0,01 và p<0,05). Tuy nhiên, nồng độ insulin ở hai lô chuột này

không khác so với ban đầu (p>0,05), bởi vì trong thời gian 15 ngày, tế bào bắt

đầu hồi phục và nồng độ insulin trong máu của chuột ĐTĐ typ 2 vẫn còn cao

khác biệt so với lô chuột bình thường (p<0,01). Mặt khác, hai lô chuột này đã

117

được uống cắn toàn phần thân cây chuối tiêu và metformin làm giảm glucose

không thông qua tác dụng kích thích tế bào β sản xuất insulin, do đó tế bào β

có thời gian để phục hồi các tổn thương gây ra bởi STZ. Bên cạnh đó, lô

chứng bệnh mặc dù nồng độ insulin có tăng hơn so với ngày đầu tiên để đáp

ứng với tình trạng tăng glucose máu, nhưng chức năng bài tiết insulin của tế

bào β không được cải thiện, dẫn đến các tế bào β đảo tụy bị quá tải trầm trọng

và chuột ở lô chứng bệnh thường chết sau 15 ngày nếu không cấp cứu bằng

cách tiêm insulin cho lô chuột này.

Như vậy, các kết quả về mô bệnh học tụy của luận án hoàn toàn phù

hợp với sinh lý tụy nội tiết, điều này giúp giải thích thêm về cơ chế tác dụng

của thân cây chuối tiêu trong tăng cường tác dụng của mô đích với insulin để

giảm tình trạng quá tải cho tế bào β đảo tụy, giúp tụy có khả năng phục hồi.

Một trong những nguyên nhân chính làm gia tăng sự biểu hiện của các

yếu tố gây kháng insulin là thừa cân, béo phì. Nguyên nhân gây béo phì là do

chế độ ăn nhiều chất béo và ít vận động [171]. Biểu hiện là tăng tổng hợp

triglycerid tích tụ thành các mô mỡ trong cơ thể. Như vậy, ức chế tổng hợp

TG cũng là một yếu tố gián tiếp làm giảm kháng insulin. Nghiên cứu cơ chế

hạ glucose máu mức độ tế bào, để làm rõ hơn ảnh hưởng của thân chuối tiêu

trên chuyển hóa lipid, luận án tiếp tục tìm hiểu về tác dụng ức chế tổng hợp

TG của thân cây chuối tiêu thông qua tác dụng ức chế sự biệt hoá của tế bào

3T3-L1 mô mỡ nguyên phát chuột nhắt

4.3.2.2. Về tác dụng trên sự biệt hóa tế bào mỡ 3T3-L1

3T3-L1 là một dòng tế bào có nguồn gốc từ chuột, khi được biệt hóa

thành các tế bào tạo mỡ sẽ tăng khả năng tổng hợp và tích tụ triglycerid

[55],[72]. Tuy nhiên, trong thí nghiệm này, cắn toàn phần thân cây chuối tiêu

và hai chất được phân lập là cycloeucalenon và daucosterol không có tác

dụng ức chế sự biệt hóa tế bào 3T3-L1 thành tế bào mô mỡ, do đó, nồng độ

TG ở các lô ử với mẫu thử và lô chứng là không khác nhau (p>0,05, hình

3.25). Từ kết quả này cho thấy nồng độ lipid máu của chuột ĐTĐ typ 2 giảm

118

có thể không phải do tác động lên sự biệt hóa và khả năng tổng hợp

triglycerid của tế bào mỡ mà có thể do các cơ chế khác như tác động lên

chuyển hóa lipid ở gan, tác động lên chuyển hóa của các lipoprotein...

Để tiếp tục đánh giá cơ chế tác dụng hạ glucose máu của thân cây chuối

tiêu, luận án đánh giá tác động của cắn toàn phần và các chất phần và các chất

phân lập được ở mức độ phân tử.

Trước hết là tác dụng trên các enzym tiêu hoá glucid bởi vì tăng glucose

máu sau ăn cũng là một trong các nguy cơ mà bệnh nhân ĐTĐ gặp phải, do

đó hạn chế glucose máu sau ăn cũng là một trong các biện pháp tích cực có

thể giúp bệnh nhân ĐTĐ hạn chế được các tai biến do tăng glucose máu gây

ra. Do đó, luận án đánh giá tác dụng ức chế enzym tiêu hoá glucid của thân

cây chuối tiêu.

4.3.2.3. Về khả năng ức chế enzym tiêu hóa glucid

Hai enzym tiêu hoá glucid được luận án đề cập đến là enzym α-amylase

và enzym α-glucosidase.

Enzym α-amylase là một trong những sản phẩm tiết chính của tuyến tụy

và tuyến nước bọt, đóng vai trò quan trọng thực hiện bước đầu tiên trong việc

tiêu hoá tinh bột và glycogen [80]. Việc ức chế enzym này sẽ làm đình trệ

việc tiêu hoá carbohydrat của các enzym khác. Vì vậy, nếu ức chế được hoạt

động của enzym α-amylase sẽ làm quá trình thuỷ phân tinh bột chậm lại,

lượng glucose được tạo ra từ từ nên glucose máu sẽ giảm. Bệnh ĐTĐ có mức

glucose máu cao nên ức chế enzym α-amylase cũng là một trong các mục tiêu

giúp hạ glucose máu trong trị bệnh ĐTĐ. Chính vì vậy enzym α-amylase

cũng đóng góp một vai trò quan trọng trong việc kiểm soát glucose máu trong

bệnh ĐTĐ. Từ việc nghiên cứu các chất trong thực vật có khả năng ức chế

một số enzym thuỷ phân tinh bột in vitro đến nghiên cứu trên chuột mắc bệnh

ĐTĐ đã được nhiều công trình nghiên cứu ở một số trường đại học trên thế

giới áp dụng và công bố thành công. Kết quả chứng minh được khả năng hạ

glucose máu ở các loài thực vật như đậu tây (Phaseolus vulgaris), sen

119

(Nelumbo nucifera) [106]… Năm 2014 Reddy và cộng sự đã công bố về khả

năng ức chế α-amylase của cắn toàn phần thân cây chuối tiêu (Musa

paradisiaca L.) được trồng tại Ấn Độ với nồng độ 100 μg/ml ức chế 83%

enzym α-amylase [130].

Trong mô hình này của luận án, cắn toàn phần thân cây chuối tiêu được

trồng tại Việt Nam không thể hiện tác dụng ức chế enzym α-amylase. Tuy

nhiên, trong số 6 chất phân lập được từ hai phân đoạn ethylacetat và n-butanol

thì chỉ có là β-sistosterol ở mức liều thử nghiệm 25 μM có tác dụng ức chế

51,95% hoạt tính enzym α-amylase (bảng 3.20). Dựa trên các kết quả thực

nghiệm của β-Sistosterol ở 5 nồng độ khác nhau, khảo sát IC50 của β-

sistosterol ức chế enzym α-amylase với IC50 là 23,88 μM (bảng 3.21). Cho tới

thời điểm này, luận án tham khảo được chưa có công bố nào ghi nhận tác dụng

ức chế enzym α-amylase của β-sitosterol phân lập từ thân cây chuối tiêu.

Cắn toàn phần thân cây chuối tiêu được trồng tại Ấn Độ đã được Reddy

và cộng sự (2014) ghi nhận không chỉ có tác dụng ức chế enzym α- amylase

mà còn thể hiện tác dụng ức chế enzym α- glucosidase. Nội dung tiếp theo

của luận án là đánh giá tác dụng ức chế enzym α- glucosidase của cắn toàn

phần và chất phân lập từ thân cây chuối tiêu.

Alpha-glucosidase hay cò n có tên khác là maltase là mô ̣t enzym phân bố nhiều ở diềm bàn chải, màng ngoài tế bào thành ruô ̣t non, có hoa ̣t tính xú c tác phản ứ ng thủ y phân maltose thành D-glucose. Carbohydrat chỉ đươ ̣c hấp thu qua màng ruô ̣t non dướ i da ̣ng monosaccharid, do đó viê ̣c thủ y phân các disaccharid thành monosaccharid đó ng vai trò quan tro ̣ng trong sự hấp thu. Như vậy, ứ c chế α-glucosidase có thể làm châ ̣m hấp thu carbohydrat ở ruô ̣t non, làm ha ̣n chế sự tăng glucose máu sau khi ăn [107].

Các nhà khoa học trong và ngoài nước cũng đã tiến hành thực nghiệm

in vitro để đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase của một số dược

liệu như lá vối [4], rễ cây chóc máu Nam [11], nấm (Aspergillus terreus)

[135].

120

Trên mô hình này, luận án tiến hành đánh giá khả năng ức chế enzym

α-glucosidase của cắn toàn phần và 6 chất phân lập được từ thân cây Chuối

tiêu. Kết quả bảng 3.22 cho thấy, cắn toàn phần thân cây chuối tiêu ở mức

liều thử nghiệm là 10 và 30 μg/ml có tác dụng ức chế 25,07 và 75,09% hoạt

tính enzym α-glucosidase.

Khi so sánh với cắn toàn phần thân cây chuối tiêu trồng tại Ấn Độ trong

nghiên cứu của Reddy và cộng sự (2014) thì cắn toàn phần thân cây chuối

tiêu trồng tại Việt Nam không thể hiện tác dụng ức chế enzym α-amylase

nhưng lại thể hiện tác dụng ức chế enzym α-glucosidase (75,09%) ở nồng độ

thử nghiệm (30µg/ml) chưa bằng 1/3 nồng độ cắn toàn phần thân cây chuối

tiêu trồng tại Ấn Độ (100 μg/ml) ức chế 80% enzym α-glucosidase [130]. Sự

khác nhau giữa các kết quả của luận án và kết quả của Reddy (2014) có thể

được giải thích do điều kiện về khí hậu, thổ nhưỡng, do đó thành phần hoá

học trong cây chuối tiêu có thể khác nhau do đó tác dụng sinh học không

hoàn toàn là giống nhau.

Tiếp tục đánh giá tác dụng của 6 chất phân lập được từ hai phân đoạn

ethylacetat và n-butanol, kết quả bảng 3.23 cho thấy: trong 6 chất thử nghiệm

thì chỉ có hai chất là daucosterol và β-sistosterol có tác dụng ức chế enzym α-

glucosidase ở mức liều thử nghiệm 10 và 25μM thì khả năng ức chế enzym α-

glucosidase của daucosterol và β-sistosterol tương ứng 28,25; 70,38% và

33,73; 52,19%. Dựa vào các kết quả trong thực nghiệm ở 5 nồng độ khác

nhau, khảo sát IC50 của daucosterol và β-sistosterol (bảng 3.24) cho thấy

daucosterol và β-sitosterol ức chế enzym α-glucosidase với IC50 là 19,92 và

22,60μM. Kết quả nghiên cứu của luận án là phù hợp với công bố của Đỗ Thị

Nguyệt Quế khi nghiên cứu tác dụng ức chế enzym α-glucosidase của β-

sitosterol chiết xuất từ rễ cây chóc máu Nam ( 22,99μM) [11] và Miyazawa

và cộng sự (2005) cũng đã ghi nhận daucosterol chiết xuất từ Arctium lappa L

có IC50 là 30 μM/ml [104].

121

Như vậy, ở mức độ phân tử, thân cây chuối tiêu thể hiện tác dụng ức chế

hai enzym tiêu hoá glucid là enzym α-amylase và enzym α-glucosidase. Mặc

dù cắn toàn phần thân cây chuối tiêu sử dụng trong luận án chưa thể hiện tác

dụng ức chế enzym α-amylase nhưng chất phân lập từ phân đoạn n-butanol

chiết từ thân cây chuối tiêu lại có tác dụng ức chế enzym này. Trong khi đó cả

cắn toàn phần và hai chất phân lập được từ thân cây chuối tiêu (daucosterol

và β-sitosterol) đều thể hiện tác dụng ức chế enzym α-glucosidase.

Tiếp theo, ở mức độ phân tử, để tìm hiểu về tác dụng tăng nhạy cảm của

mô đích với insulin, trên con đường truyền tín hiệu của insulin nội bào, luận

án đề cập tới khả năng ức chế PTP1B của cắn toàn phần thân cây chuối tiêu

và các chất phân lập.

4.3.2.4. Về tác dụng ức chế PTP1B

Insulin có 2 con đường truyền tín hiệu chính trong tế bào là con đường

MAPK và con đường PI3/Akt, trong đó, con đường PI3K/Akt trực tiếp liên

quan tới những tác động điều hòa chuyển hóa làm giảm glucose máu.

Trên con đường truyền tín hiệu của insulin, tín hiệu mà receptor nhận

được là kết quả của sự cân bằng giữa quá trình phosphoryl hóa tyrosin bởi

protein tyrosinkinase và quá trình khử phosphoryl tyrosin bởi các protein

tyrosinphosphatase (PTP), đặc biệt là protein tyrosin phosphatase 1B

(PTP1B). Tuy nhiên, nếu tăng hoạt tính của PTP1B quá mức có thể thay đổi

cân bằng giữa 2 enzym, dẫn đến giảm sự phosphoryl hóa tyrosin và giảm tính

nhạy cảm với insulin của tế bào [51]. Trong nhiều nghiên cứu, PTP1B tăng

hoạt tính ở cả người bệnh ĐTĐ typ 2 và động vật thí nghiệm gây ĐTĐ typ 2,

ức chế hoạt tính PTP1B làm giảm kháng insulin, cải thiện kiểm soát glucose

máu [46]. Do đó hiện nay, PTP1B được coi là một đích tác dụng đầy triển

vọng của thuốc điều trị ĐTĐ typ 2. Nhiều dược liệu trên thế giới đã được

chứng minh cơ chế tác dụng giảm kháng insulin thông qua khả năng ức chế

PTP1B giúp làm tăng sự nhạy cảm của mô đích với insulin, cải thiện tình

trạng kháng insulin [51], [174]. Do đó, luận án tiếp tục với các thử nghiệm in

122

vitro đánh giá khả năng ức chế PTP1B của cắn toàn phần thân cây chuối. Kết

quả bảng 3.25 cho thấy với nồng độ mẫu thử 10 và 30 μM/ml, cắn toàn phần

thu được từ thân cây chuối tiêu có tác dụng ức chế enzym PTP1B 46,06%

thêm một lần nữa ghi nhận tác dụng giảm kháng insulin của dược liệu này.

Tiếp tục đánh giá tác dụng in vitro của 6 chất phân lập được từ thân

cây chuối tiêu, kết quả bảng 3.26 cho thấy cycloeucalenol với nồng độ 5,10

và 25µM có tác dụng ức chế PTP1B tương ứng là 61,16; 72,39 và 83,97%.

Dựa trên các kết quả thu được trong thực nghiệm ở 5 nồng độ khác nhau để

khảo sát IC50, kết quả cho thấy cycloeucalenon được phân lập từ phân lập từ

thân cây chuối tiêu có tác dụng ức chế mạnh PTP1B với IC50 là 3,11µM, nhỏ

hơn chứng dương suramin, một chất ức chế PTP1B kinh điển (bảng 3.27).

Kết quả này cho thấy cycloeucalenon là một thành phần quan trọng mang lại

tác dụng hạ glucose máu của thân chuối tiêu.

Bên cạnh cycloeucalenon, một chất phân lập khác cũng có tác dụng ức

chế PTP1B là acid myristic với nồng độ thử nghiệm như trên acid myristic có

tác dụng ức chế PTP1B là 34,2; 47,6 và 69,86%. Năm 2013, Shibata và cộng

đã ghi nhận acid myristic ở nồng độ 30µM có tác dụng ức chế PTP1B 82%,

tuy nhiên trong nghiên cứu này, tác giả chưa khảo sát IC50 của acid myristic

[146]. Kết quả của luận án trong bảng 3.27 cho thấy acid myristic được phân

lập từ thân cây chuối tiêu có tác dụng ức chế PTP1B với kết quả IC50 là 10,75

µM. Kết quả này lại một lần nữa cho thấy cả cắn toàn phần và chất phân lập

từ thân cây chuối tiêu đều có tác dụng ức chế PTP1B, giúp cải thiện tình trạng

kháng insulin của dược liệu này lần đầu tiên được ghi nhận từ các kết quả của

luận án

Như vậy, có sự tương đồng giữa kết quả nghiên cứu in vivo và kết quả

in vitro. Các kết quả thu được đã giúp giải thích một phần cơ chế tác dụng

của thân chuối tiêu trong điều trị ĐTĐ typ 2. Bên cạnh PTP1B, luận án còn

tìm hiểu một protein có vai trò quan trọng trong sự truyền tín hiệu của insulin

là IRS-1. Nội dung tiếp theo để xác định cơ chế hạ glucose máu của cắn toàn

123

phần thân cây chuối tiêu trên sự tăng nhạy cảm của mô đích với insulin ở

mức độ phân tử ,luận án tìm hiểu về khả năng ức chế IRS-1 (Ser 307).

4.3.2.5. Về tác dụng ức phosphoryl hóa IRS-1(Ser 307)

IRS-1 là một trong sáu cơ chất của insulin receptor (IR), cùng với nhiều

protein khác, tham gia vào con đường truyền tín hiệu nội bào của insulin [92].

Dưới tác dụng kích thích của insulin, IR hoạt hóa và tương tác với IRS-1.

Ngay sau đó, các gốc tyrosin trên IRS-1 được phosphoryl hóa và kích hoạt

các bước tiếp theo trong chuỗi truyền tín hiệu nội bào của insulin, cuối cùng

làm gia tăng nhanh chóng sự thu nạp glucose vào trong tế bào thông qua gia

tăng số lượng GLUT4 [42]. Vì vậy, sự phosphoryl hóa các gốc tyrosin của

IRS-1 nhờ hoạt tính tyrosin kinase của IR là một bước quyết định trong chuỗi

truyền tín hiệu nội bào nhằm hoạt hóa các đích phân tử tiếp theo.

Tuy nhiên, bên cạnh sự phosphoryl hóa các gốc tyrosin, IRS-1 còn có thể

bị phosphoryl hóa các gốc Serin/threonin ở nhiều vị trí khác nhau. Nhiều

nghiên cứu cho thấy, sự phosphoryl hóa các gốc Serin/threonin trên IRS-1, đặc

biệt là Ser307 lại gây xuất hiện tình trạng kháng insulin hoặc ĐTĐ typ 2 [138],

[139]. Quá trình phosphoryl hóa Ser307 của IRS-1 ức chế protein này liên kết

với IR để phosphoryl hóa các gốc tyrosin [139]. Lúc này, vùng SHP2 trên phân

tử IRS-1 không còn để lộ các vị trí gắn cho các phân tử nội bào chứa vùng

SH2, bao gồm PI3K và Grb-2, từ đó ức chế hai con đường PI3K và MAPK.

Hậu quả là làm tăng tình trạng kháng insulin và giảm sự hoàn thiện của tế bào.

Vì vậy, sự phosphoryl hóa Ser là cơ chế gây ức chế chuỗi truyền tín hiệu nội

bào của insulin, từ đó phát triển thành tình trạng ĐTĐ typ 2 [138].

Theo nhiều tác giả, IRS-1 được coi là một đích tác dụng tiềm năng trong

điều trị ĐTĐ. Để mang lại tác dụng tăng cường nhạy cảm với insulin, có thể

tác động lên protein này theo nhiều xu hướng khác nhau. Trong đó, hai xu

hướng chính được nghiên cứu nhiều nhất là tăng cường sự phosphoryl hóa

các gốc tyrosin hoặc ức chế sự phosphoryl hóa các gốc Serin, đặc biệt là

Ser307 trên phân tử IRS-1. Thực tế, xu hướng nghiên cứu về các chất có khả

124

năng ức chế sự phosphoryl hóa IRS-1 (Ser307) để làm giảm tình trạng kháng

insulin mới bắt đầu được quan tâm trong những năm gần đây [144], [152].

Theo nghiên cứu của She năm 2014, tế bào tạo mỡ 3T3-L1 bị gây kháng

insulin trước đó bởi acid palmitic (300µM, 6h) sau khi được ủ với metalonin

trong vòng 30 phút, có sự gia tăng đáng kể lượng GLUT4 và giảm lượng IRS-

1 được phosphoryl hóa ở vị trí Ser307 [144]. Năm 2016, Simom-Szabo và

cộng sự đã tiến hành một nghiên cứu lớn nhằm sàng lọc khả năng ức chế sự

phosphoryl hóa Ser307 trên IRS-1 ở mô hình tế bào bị gây kháng insulin thực

nghiệm của 51 hợp chất là dẫn chất của pyrido [2,3-d] pyrimidin-7-on. Kết

quả nghiên cứu đã chỉ ra 5/51 hợp chất ức chế hiệu quả sự phosphoryl hóa

Ser307 của IRS-1. Mặc dù sự phosphoryl hóa gốc Serin trên IRS-1 có thể xảy

ra ở nhiều vị trí khác nhau như Ser-307, -302 và -318 [152] nhưng vị trí được

nghiên cứu nhiều nhất là Ser307. Vì vậy luận án sử dụng kháng thể kháng

dạng IRS-1 phoshoryl hóa ở vị trí Ser307 trong quy trình Western Blot. Kết

quả nghiên cứu trong hình 3.18 cho thấy cắn toàn phần thân cây chuối tiêu

không có tác dụng ức chế sự phosphoryl hóa Ser307 của IRS-1.

Thí nghiệm tiếp theo về khả năng ức sự phosphoryl hóa IRS-1(Ser307)

của hai chất phân lập từ thân cây chuối tiêu là cycloeucalenon và daucosterol,

kết quả trong hình 3.20 cho thấy ở nồng độ 50 µg/ml cycloeucalenon không

có tác dụng chế ức chế sự phosphoryl hóa IRS-1(Ser307). Trong khi đó,

daucosterol làm giảm lượng p-IRS-1(Ser307) có ý nghĩa thống kê so với lô

chứng (p<0,05). Kết quả này góp phần làm sáng tỏ thêm cơ chế gây hạ

glucose máu của daucosterol nói riêng và của thân cây chuối tiêu nói chung.

Như vậy, tác động tăng nhạy cảm của mô đích với insulin của thân

chuối tiêu chủ yếu trên sự phosphoryl hóa Tyr của receptor (thông qua ức chế

PTP1B) hơn là trên sự phosphoryl hóa IRS-1.

Các kết quả trong mô hình thực nghiệm in vivo và in vitro trong luận án

cũng đã ghi nhận về tác dụng của thân cây chuối tiêu tác động trên chuyển

hóa và trên sự nhạy cảm của mô đích với insulin. Để có thêm bằng chứng cho

125

kết luận này, luận án tiến hành đánh giá khả năng phosphoryl hoá AMPK của

cắn toàn phần thân cây chuối tiêu và hai chất phân lập được từ thân cây chuối

tiêu là cycloeucalenon và daucosterol.

4.3.2.6. Về tác dụng hoạt hóa AMPK

Kết quả về ảnh hưởng của thân cây chuối tiêu trên chuyển hóa glucid

và lipid được minh chứng ở mức độ phân tử bởi kết quả về khả năng hoạt hóa

AMPK của dược liệu này. Có 3 enzym là LKB1, CaMKK và TAK1 có khả năng hoa ̣t hó a AMPK nhờ khả năng xú c tác kinase ngươ ̣c dò ng, gây phosphoryl hó a AMPK. AMP cũng có khả năng điều hò a hoa ̣t đô ̣ng củ a AMPK. Sự gắn AMP vào tiểu đơn vi ̣ γ xú c tác sự phosphoryl hó a gố c Thr củ a phần mang hoa ̣t tính kinase ở tiểu đơn vi ̣ α, kích thích hoa ̣t tính kinase củ a AMPK. Hoạt tính kinase của enzym này được hoạt hóa bởi tình trạng

stress năng lượng (ví dụ: sự giảm tỉ số ATP/AMP hoặc ATP/ADP gây ra bởi

tình trạng shock nhiệt, tình trạng thiếu oxy, tăng áp suất thẩm thấu, thiếu

glucose, thiếu máu cục bộ và tình trạng co cơ vân kéo dài …), từ đó cho phép

AMPK điều hòa lên các con đường tạo ATP và ức chế các hoạt động tiêu thụ

năng lượng thông qua phosphoryl hóa các phân tử đích khác nhau [100].

AMPK tham gia vào nhiều quá trình chuyển hó a trong cơ thể. Sự hoa ̣t hó a AMPK có thể gây tăng gia nhâ ̣p glucose vào cơ, giảm tân ta ̣o glucose ở gan, tăng oxy hó a acid béo ở gan và cơ, giảm tổ ng hơ ̣p acid béo ở gan và mô mỡ, tăng hoa ̣t đô ̣ng củ a ty thể, từ đó gây ha ̣ glucose máu [43]. AMPK được hoạt

hóa chủ yếu bằng phản ứng phosphoryl hóa ở Threonin172 trên tiểu đơn vị α

[43].

Chính vì vậy, trong nghiên cứu này, luận án đánh giá khả năng hoạt hóa

AMPK của cắn toàn phần thân chuối tiêu và hai chất phân lập từ thân cây

chuối tiêu là cycloeucalenon và daucosterol bằng kỹ thuật Western Blot với

kháng thể đặc hiệu để phát hiện p-AMPKα (Thr172).

Trong mô hình này, hai chất được phân lập là cycloeucalenon và

daucosterol không có tác dụng hoạt hoá AMPK trên tế bào C2C12. Tuy

126

nhiên, cắn toàn phần thân cây chuối tiêu lại có tác dụng hoạt hoá AMPK, thể

hiện trong hình 3.22 cho thấy cắn toàn phần thân cây chuối tiêu ở nồng độ 50

µg/ml có tác dụng tăng lượng p- AMPKα (Thr172) khác biệt so với lô chứng

(p<0,05). Trong thí nghiệm này, chứng dương được chọn là AICAR (5-

aminoimidazole-4- carboxamide-1-D-ribonucleoside). Đây là 1 chất hoạt hóa

AMPK kinh điển đã được ghi nhận tác dụng trên nhiều dòng tế bào khác

nhau, trong đó có dòng tế bào C2C12 [111].

Tác động hoạt hóa AMPK có thể giúp giải thích cho các tác dụng của

thân cây chuối tiêu trên glucose máu, lipid máu, tác dụng giảm kháng insulin,

tăng dung nạp glucose cũng như tác dụng trên nhiều thông số chuyển hóa

khác. Cho đến thời điểm này, theo như luận án tìm hiểu, chưa tìm thấy công

bố nào về tác dụng hoạt hóa AMPK của thân cây chuối tiêu.

Các thực nghiệm so sánh tác dụng của cắn toàn phần thân chuối tiêu

(liều 1.000 mg/kg chuột nhắt và 500 mg/kg chuột cống) với chứng dương

metformin (liều 240 mg/kg chuột nhắt và 120 mg/kg chuột cống) đều cho

thấy mức độ tác dụng và xu hướng tác động tương tự nhau.

Meformin là thuốc điều trị ĐTĐ typ 2 kinh điển được sử dụng rộng rãi

nhất hiện nay với tác dụng hạ glucose máu đa cơ chế như: làm tăng nhạy cảm

của mô đích với insulin thông qua AMPK do đó tăng dung nạp glucose vào

trong tế bào, ức chế G6Pase làm giảm tổng hợp glucose tại gan. Tác dụng này

của metformin là do ức chế biểu hiện gen của G6Pase và hoàn toàn độc lập

với con đường truyền tín hiệu của insulin [43], [100]. Để làm rõ thêm về tác

dụng của thân cây chuối tiêu trên chuyển hoá glucid, nội dung tiếp theo, luận

án đánh giác tác dụng ức chế enzym G6Pase của cắn toàn phần thân cây

chuối tiêu trên gan chuột thực nghiệm.

4.2.2.7. Về tác dụng ức chế G6Pase gan

Trong chuyển hóa glucid, tân tạo đường đóng một vai trò quan trọng

trong sự tăng glucose máu của bệnh nhân ĐTĐ. Cùng với quá trình thoái hóa

glycogen, tân tạo đường là nguồn cung cấp glucose nội sinh quan trọng của

cơ thể. Đối với người bình thường, sau khi nhịn đói qua đêm, lượng glucose

127

nội sinh tạo ra bởi quá trình tân tạo đường chiếm đến 50% tổng lượng glucose

trong máu. Nếu nhịn đói quá 40 giờ, quá trình tân tạo đường đóng góp đến

90% tổng lượng glucose [90]. Ở tình trạng bệnh lý ĐTĐ, có sự tăng lên đáng

kể lượng glucose nội sinh, trong đó, nguồn gốc chủ yếu là từ quá trình tân tạo

đường. Các nghiên cứu sử dụng kỹ thuật catheter tĩnh mạch gan đã nhận thấy

ở bệnh nhân ĐTĐ typ 2 có sự tăng thu nạp các tiền chất tân tạo glucose như

alanin, glycerol và đặc biệt là lactat [56]. Một nghiên cứu sử dụng đồng vị

phóng xạ deteri dioxid cũng cho thấy, ở động vật mắc ĐTĐ typ 2,90% lượng

glucose tạo thành ở gan có nguồn gốc từ quá trình tân tạo glucose [40]. Sự

tăng cường quá trình tân tạo đường được thực hiện chủ yếu qua hoạt hóa các

enzym chủ chốt như PEPCK, G6Pase, F1,6BPase. Một số nghiên cứu trên

người và động vật thí nghiệm mắc ĐTĐ typ 2 đã ghi nhận sự tăng hoạt tính

các enzym này ở gan [40], [57].

G6Pase là một enzym chủ chốt quyết định tốc độ của con đường tân

tạo đường. G6Pase chỉ có mặt ở tế bào gan và một lượng nhỏ ở thận. Điều

này quyết định gan là cơ quan quan trọng nhất có chức năng tổng hợp glucose

cung cấp cho máu và các mô ngoại vi [185]. Các mô khác mặc dù có sẵn

nguyên liệu tổng hợp glucose như cơ (có nhiều lactat giải phóng sau quá trình

co cơ) hay mô mỡ (có nhiều các sản phẩm của đường phân) nhưng không có

khả năng sản xuất glucose tự do giải phóng vào máu do thiếu G6Pase. Ngoài

vai trò quan trọng trong tân tạo đường, G6Pase còn xúc tác cho phản ứng cuối

cùng của quá trình thoái hóa glycogen để tạo thành glucose tự do giải phóng

vào máu. Do đó, G6Pase có vai trò rất quan trọng đối với sự tạo thành

glucose nội sinh trong cơ thể. Hoạt độ của G6Pase tăng lên trong bệnh lý

ĐTĐ, dẫn đến sự tăng lượng glucose nội sinh, góp một phần đáng kể trong sự

tăng glucose máu nói chung [185] . Trong thực tế, ức chế G6Pase là một cơ

chế làm giảm glucose máu được phát hiện ở nhiều dược liệu và là một đích

tiềm năng trong thiết kế thuốc mới điều trị ĐTĐ [91], [127]. Một cơ chế tác

dụng của metformin đã được khẳng định qua nhiều nghiên cứu là ức chế

128

G6Pase, đặc biệt là cơ chế này hoàn toàn độc lập với các tác dụng khác của

metformin.

Tiếp tục tìm hiểu cơ chế tác dụng của thân cây chuối tiêu, luận án đánh

giá ảnh hưởng của cắn toàn phần thân cây chuối tiêu trên hoạt độ G6Pase ở

gan của các lô chuột thí nghiệm. Kết quả ở bảng 3.17 cho thấy hoạt độ

G6Pase gan của chuột nhắt trắng tăng glucose máu bởi STZ liều 150 mg/kg

tăng cao rõ rệt so với lô chuột bình thường (p<0,05). Hoạt độ G6Pase của 3 lô

(uống hỗn dịch thử, gliclazid, metformin) giảm so với lô chứng bệnh (p<0,05)

và ức chế trên 44% hoạt độ enzym G6Pase so với lô chứng bệnh (hình 3.15).

Để có thêm bằng chứng về tác dụng ức chế enzym G6Pase của cắn toàn phần

thân cây chuối tiêu có, luận án tiếp tục đánh giá tác dụng ức chế enzym

G6Pase gan của các lô chuột ĐTĐ typ 2 thực nghiệm. Kết quả trên mô hình

này cũng ghi nhận ở lô chuột uống mẫu thử là cắn toàn phần và lô chuột uống

metformin có hoạt độ enzym gan giảm khác biệt so với lô chứng bệnh

(p<0,05) và ức chế trên 40% hoạt độ enzym G6Pase so với lô chứng bệnh

(bảng 3.18 và hình 3.16).

Cho tới thời điểm này, luận án chưa tìm thấy có công bố về tác dụng

ức chế G6Pase của thân cây chuối tiêu. Tác dụng ức chế này có thể do các

chất trong thân cây chuối tiêu trực tiếp tác động lên enzym G6Pase hoặc gián

tiếp thông qua tác dụng làm tăng nhạy cảm của mô đích với insulin, một

hormon nội sinh có tác dụng ức chế tân tạo đường.

4.4. BÀN LUẬN CHUNG

Mặc dù trước đây có một số nghiên cứu về tác dụng hạ glucose máu của

thân cây chuối tiêu [153], [163], nhưng đây là lần đầu tiên có một nghiên cứu

tương đối có hệ thống về tác dụng hạ glucose máu, thành phần hóa học và cơ

chế tác dụng của thân cây chuối tiêu (Musa x paradisiaca L.) trồng tại Việt

Nam. Các kết quả nghiên cứu của luận án đã cho thấy cắn toàn phần thân cây

chuối tiêu có tác dụng làm giảm glucose máu ở chuột nhắt trắng tăng glucose

máu thực nghiệm bởi STZ (150 mg/kg). Đặc biệt dược liệu này có triển vọng

là một giải pháp hỗ trợ điều trị ĐTĐ typ 2 hiệu quả do khả năng làm giảm

129

nồng độ glucose máu, giảm lipid huyết thanh và tăng dung nạp glucose ở

chuột cống mang các rối loạn chuyển hóa tương tự như ĐTĐ typ 2 ở người.

Từ hai phân đoạn có tác dụng hạ glucose máu của thân cây chuối tiêu, luận án

đã tiến hành phân lập, tách chiết các hợp chất theo định hướng điều trị ĐTĐ.

Cụ thể trong phân đoạn ethylacetat đã phân lập được 4 hợp chất là

cycloeucalenon, daucosterol, acid myristic và acid protocatechui, trong phân

đoạn n-butanol phân lập được 2 chất là b sitosterol và bis (2-ethylhexyl)

hexanoat. Các nghiên cứu về thành phần hóa học của cắn toàn phần và hai

phân đoạn gây hạ glucose máu đã góp phần làm sáng tỏ sự liên quan giữa

thành phần hóa học và tác dụng hạ glucose máu của thân cây chuối tiêu. Các

chất phân lập được từ hai phân đoạn ethylacetat và n-butanol có thể là thành

phần quan trọng mang lại tác dụng hạ glucose máu của thân cây chuối tiêu.

Các kết quả nghiên cứu của luận án đã chỉ ra một số cơ chế tác dụng dẫn

đến sự hạ glucose máu của thân cây chuối tiêu chưa công bố trên thế giới.Các cơ

chế tác dụng của thân cây chuối tiêu được hệ thống hóa trong hình 4.1.

130

CƠ CHẾ HẠ GLUCOSE MÁU CỦA THÂN CÂY CHUỐI TIÊU ĐÃ ĐƯỢC NGHIÊN CỨU

Tăng cường đáp ứng với insulin của tế bào mô đích

AMPK

 PTP1B

 p- IRS1(Ser307)

Trên chuyển hóa

Chuyển hóa glucid

Chuyển hóa Lipid

 tiêu hóa glucid

 tân tạo đường

Chống oxy hóa

 lipid, máu

dung nạp glucose

Tình trạng đảo tụy được cải thiện

 G6Pase gan

 NO, LPO, NPPH

catalase, GSH

 -amylase

 - glucosidase

Hình 4.1. Các cơ chế tác dụng hạ glucose máu đã được phát hiện của thân cây chuối tiêu

Hình màu màu xanh là kết quả lần đầu tiên được luận án công bố. Hình màu xám là kết quả của luận án đã được các tác giả nước

ngoài công bố [130]. [163]. Hình màu cam là kết quả của tác giả nước ngoài công bố không thuộc các kết quả của luận án [163].

131 131

Với những tác động của thân cây chuối tiêu trên các con đường chuyển

hóa, có thể thấy thân cây chuối tiêu có xu hướng tác dụng điều hòa chuyển

hóa tương tự như một số dược liệu đã được dung điều trị ĐTĐ theo y học cổ

truyền. Các dược liệu này có thể được dùng trong điều trị ĐTĐ để giúp hỗ trợ

lập lại cân bằng chuyển hóa, làm giảm glucose máu nhưng tránh được các

nhược điểm của insulin và các thuốc tổng hợp hóa dược. Mặt khác, với sự

tăng cường sự đáp ứng của mô đích với insulin, kết quả cho thấy thân cây

chuối tiêu có khả năng cải thiện tình trạng kháng insulin tại mô đích thông qua

hoạt hóa AMPK và ức chế PTP1B tương tự như như rễ cây Chóc máu nam,

Trường sinh thảo [11], [109].

Các kết quả của luận án có ý nghĩa khoa học và thực tiễn vì cây chuối

tiêu được trồng phổ biến tại Việt nam và các nước trên thế giới. Các bộ phận

dùng khác của cây chuối tiêu được nghiên cứu và đã được ghi nhận nhiều tác

dụng mà trong phần tổng quan của luận án đã đề cập tới. Bộ phận dùng là thân

chưa được nghiên cứu nhiều. Luận án là nghiên cứu có hệ thống đầu tiên trên

thế giới và Việt Nam về tác dụng hạ glucose máu, cơ chế tác dụng, thành phần

hóa học của thân cây chuối tiêu. Độc tính cấp và bán trường diễn của thân cây

chuối tiêu cũng đã được xác định, theo đó cắn toàn phần thân cây chuối tiêu ở

liệu thử nghiệm cao nhất, không có chuột chết do đó chưa xác định được độc

tính cấp của dược liệu này. Bên cạnh đó, khi thử nghiệm độc tính bán trường

diễn với liều thử nghiệm gấp 3 liều thường dùng, trong vòng 28 ngày thử

nghiệm tất cả các lô chuột thí nghiệm khoẻ mạnh, ăn uống bình thường, các

chỉ số sinh hoá bình thường ổn định. Kết quả của luận án sẽ là các minh chứng

khoa học cho việc sử dụng dịch ép thân cây chuối tiêu trong hỗ trợ điều trị đái

tháo đường typ 2 đồng thời có thể tiến tới sản xuất dược phẩm hoặc thực

phẩm chức năng từ thân cây chuối tiêu dùng cho bệnh nhân ĐTĐ typ 2.

Luận án được hoàn thành với những đóng góp mới như sau:

Công bố đầu tiên về tác dụng hạ glucose máu và tăng khả năng dung

nạp glucose của cắn toàn phần thân cây chuối tiêu trên chuột cống đái tháo

đường typ 2 thực nghiệm.

Các công bố đầu tiên về tác dụng của cắn toàn phần cây chuối tiêu:

133

Trên sự hình thành insulin nội sinh và tế bào β: không kích thích tế bào

β đảo tụy sản xuất insulin nhưng lại có tác dộng giúp cải thiện tình trạng thoái

hoá tiểu đảo tụy và tế bào β.

Trên chuyển hóa: ức chế enzym G6Pase gan, tăng hoạt hóa AMPK.

Trên chuỗi truyền tín hiệu của insulin: ức chế PTP1B, làm giảm quá

trình khử phosphoryl hoá tại Tyroxin của các protein tham gia chuỗi truyền tín

hiệu nội bào của insulin.

Về thành phần hoá học, có sự ghi nhận về việc phân lập được 6 chất từ

thân cây chuối tiêu đó là: cycloeucalenon, acid myristic, acid procatechuic,

daucosterol, β-sitosterol và Bis(2-ethyl hexyl) hexanoat.

Sự ức chế IRS-1 (Ser 307), lần đầu tiên được đánh giá tại Việt Nam với

kỹ thuật Western Blot.

Đặc biệt có ý nghĩa khi thân cây chuối tiêu là bộ phận dùng bị bỏ đi sau

khi thu hoạch quả lại có tác dụng hạ glucose máu. Kết quả của nghiên cứu là

cơ sở khoa học để bổ sung thêm nguồn dược liệu có tác dụng điều trị đái tháo

đường, giúp cho người bệnh đái tháo đường có nhiều cơ hội lựa chọn hơn.

Bên cạnh đó luận án còn có những nhược điểm nhất định như: trong

nghiên cứu in vivo, luận án chỉ áp dụng được mô hình chuột tăng glucose máu

bởi streptozocin liều 150mg/kg và mô hình chuột cống đái tháo đường typ 2

do chế độ ăn giàu chất béo và tiêm STZ liều thấp (50mg/kg). Do điều kiện

trong nước nên luận án chưa có điều kiện gây mô hình đái tháo đường typ 2

trên chuột béo phì biến đổi gen như các nhà khoa học trên thế giới đã cho rằng

đây là mô hình gây bệnh đái tháo đường typ 2 lý tưởng nhất để thử tác dụng

của các thuốc điều trị đái tháo đường typ 2.

Tóm lại, các kết quả nghiên cứu của luận án đã góp phần tạo cơ sở khoa

học cho việc sử dụng thân cây chuối tiêu, một nguồn nguyên liệu rất sẵn có và

phổ biến ở Việt Nam trong điều trị ĐTĐ, bổ sung thêm một dược liệu điều trị

ĐTĐ hiệu quả cho người dân Việt Nam, cũng như người dân các nước nhiệt

đới khác có trồng cây chuối tiêu. Để nâng cao giá trị sử dụng của dược liệu

này, cần có thêm những nghiên cứu thử nghiệm trên người tình nguyện, trên

bệnh nhân ĐTĐ typ 2 về hiệu quả điều trị, tác dụng phụ... cũng như nghiên

cứu xây dựng dạng bào chế thích hợp để có thể sử dụng rộng rãi trong cộng

đồng.

134

KẾT LUẬN

Dựa trên các kết quả thu được trong thực nghiệm về nghiên cứu tác dụng

và cơ chế hạ glucose máu của thân cây chuối tiêu (Musa x paradisiaca L.)

trên các mô hình thực nghiệm in vivo và in vitro , luận án ghi nhận các kết quả

như sau:

1. Tác dụng hạ glucose máu của cắn toàn phần thân cây chuối tiêu

- Cắn toàn phần thân cây chuối tiêu với liều 1.000 mg cắn khô/kg chuột

nhắt có tác dụng hạ glucose máu của chuột nhắt tăng glucose máu do STZ

(150 mg/kg) là 49,6%.

- Cắn toàn phần thân cây chuối tiêu với liều 500 mg cắn khô/kg chuột

cống, đã làm giảm glucose máu 26,34%, giảm nồng độ Cho TP 49,00%, TG

54,1% và tăng khả năng dung nạp glucose 27,31% của chuột cống ĐTĐ typ 2

thực nghiệm.

- Cắn phân đoạn ethylacetat và n-butanol được điều chế từ dịch ép thân

cây chuối tiêu có tác dụng hạ glucose máu trên chuột tăng glucose máu bằng

STZ liều 150mg/kg là 38,56 và 50,30% và hạ glucose máu 44,50 và 49,26%

trên chuột cống ĐTĐ typ 2 thực nghiệm.

2. Cơ chế hạ glucose máu của thân cây chuối tiêu

2.1. Trên chuyển hoá

- Ở mức độ cơ thể: Cắn toàn phần thân cây chuối tiêu có tác dụng tăng dung nạp glucose

trên chuột cống ĐTĐ typ 2 thực nghiệm.

- Ở mức độ tế bào, phân tử:

+ Cắn toàn phần thân cây chuối tiêu giảm hoạt độ enzym G6Pase gan

của chuột tăng glucose máu bằng STZ liều 150mg/kg là 44,44% và của chuột

ĐTĐ typ 2 thực nghiệm là 40,91%.

+ Cắn toàn phần thân cây chuối tiêu và hai chất phân lập từ thân cây

chuối tiêu là daucosterol và β-sitosterol ức chế ezym α-glucosidase với IC50

là: 17,43 và 22,60 µM. β-sitosterol ức chế ezym α-amylase với IC50 là:

23,88µM.

135

2.2. Trên sự nhạy cảm của mô đích với insulin

- Ở mức độ cơ thể:

Cắn toàn phần thân cây chuối tiêu không có tác dụng tăng tiết insulin

nhưng có tác dụng giảm kháng insulin trên chuột ĐTĐ typ 2 thực nghiệm.

- Ở mức độ tế bào, phân tử

+ Cắn toàn phần thân cây chuối tiêu giúp cải thiện tình trạng tiểu đảo tụy

và tế bào β tuyến tụy của chuột ĐTĐ typ 2 thực nghiệm.

+ Cắn toàn phần thân cây chuối tiêu và hai chất phân lập từ thân cây

chuối tiêu là cycloeucalenol và daucosterol không có tác dụng ức chế sự biệt

hoá của tế bào mô mỡ 3T3-L1 và sự phosphoryl hóa IRS1 ở Ser 307, nhưng

daucosterol có tác dụng ức chế sự phosphoryl hóa IRS1 ở Ser 307 ở nồng độ

50µg/ml.

+ Cắn toàn phần thân cây chuối tiêu và hai chất phân lập từ thân cây

chuối tiêu là cycloeucalenon và acid myristic có tác dụng ức chế PTP1B với

IC50 là 3,11 và 10,75µM.

2.3. Trên chuyển hoá và tăng nhạy cảm của tế bào mô đích với insulin

Cắn toàn phần thân cây chuối tiêu có tác dụng, hoạt hóa AMPK ở nồng

độ 50,0µg/ml và có tác dụng giảm nồng độ Cho TP và TG huyết thanh, gián

tiếp cải thiện tình trạng kháng insulin trên chuột ĐTĐ typ 2 thực nghiệm.

ĐỀ XUẤT

1. Tiếp tục tìm hiểu cơ chế tác dụng của thân cây chuối tiêu và các chất phân

lập trên sự phosphoryl hoá Tyroxin của IRS-1 và trên một số protein đích như

PPARγ, GLUT4…

2. Tiến hành các nghiên cứu lâm sàng và nghiên cứu dạng bào chế thích hợp

nhằm phát triển dược phẩm hoặc thực phẩm chức năng từ thân chuối tiêu để

hỗ trợ kiểm soát glucose máu cho bệnh nhân ĐTĐ typ 2.

136

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

TT

Tên bài báo khoa học Tên tạp chí, kỷ yếu

Số

Tạp chí Dược liệu

Năm công bố 2014

2015

Tác dụng của dịch ép thân cây chuối tiêu trên chuột tăng glucose máu bởi streptozocin Effects Musa of paradisiaca L. stem juice on experimentally diabetic rats

3 Chemical

constituents

2015

from Musa paradisiaca

The 1 st International Conference on Pharmacy Education and Research Network of A S E A N The 1 st International Conference on Pharmacy Education and Research Network of A S E A N Tạp chí Dược học

2016

4 Nghiên cứu ảnh hưởng của cao và chất phân lập từ thân cây chuối tiêu (Musa paradisiaca L) lên hoạt tính enzym PTP1B

Czech J. Food Sci. 35(5) 2017

5 Antidiabetic Compounds from Juice

6 11 2017 2 st

Stem in Banana”, Effects of banana stem juice and its two isolates on the phosphorylation of AMPK and IRS1 in C2C12 muscle cells The International Conference on Pharmacy Education and Research Network of ASEAN

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TIẾNG VIỆT

1. Tạ Văn Bình (2006), Bệnh đái tháo đường - tăng glucose máu, Nhà xuất bản Y học, tr.24 - 25, 50 - 51, 271 - 279, 382 - 383.

2. Bộ Y tế, (2013), Hướng dẫn quy trình kỹ thuật chuyên ngành Giải phẫu bệnh - Tế bào bệnh học, tr. 123,219,232,235,245,345.

3. Võ Văn Chi (2012), Từ điển cây thuốc Việt Nam, Tập 1, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tr. 467-469.

Trương Thị Tố Chinh, Phan Minh Giang (2016), "Thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase của lá vối Việt Nam", Tạp chí Hóa học, 54(3), tr. 331-337

5. Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu, (1980), Phương pháp nghiên cứu hoá học cây thuốc, Nhà xuất bản Y học, tr. 243-289, 327-347.

Phùng Thanh Hương (2010), Nghiên cứu tác dụng hạ glucose huyết và ảnh hưởng trên chuyển hoá glucose của dịch chiết lá Bằng lăng nước (Lagertroemia Speciosa (L.) Pers.) ở Việt Nam, Luận án tiến sĩ Dược học , Trường Đại học Dược Hà Nội, tr. 40-60.

Đỗ Ngọc Liên, Thị Lê, Xoan (2007), "Nghiên cứu thành phần hoá học và tác dụng hạ đường huyết của Dây Đau xương (Tinospora sinensis (Lour.) Merr) trên mô hình chuột nhắt gây ĐTĐ bằng STZ", Tạp chí Dược học, 378 ( 47), tr.8-10.

Trần Thị Chi Mai. (2006), Nghiên cứu tác dụng của polyphenol Chè xanh (Camellia sinensis) trên các chỉ số lipid và trạng thái chống oxy hoá trong máu chuột cống trắng đái tháo đường thực nghiệm Luận án tiến sĩ y học, Trường đại học Y Hà Nội, tr 45-60.

9. Nguyễn Văn Mùi (2002), Xác định hoạt độ enzym, NXB Khoa học và kỹ thuật, tr. 442-443.

10. Nguyễn Trung Quân (2009), Tạo mô hình tiểu đường trên chuột nhắt trắng và thử tác dụng hạ đường huyết một số chế phẩm tự nhiên, Luận văn thạc sĩ khoa học, Viện Y học cổ truyền Quân đội, tr. 25-40.

11. Đỗ Thị Nguyệt Quế (2013), Nghiên cứu tác dụng hạ glucose huyết của rễ cây chóc máu nam (Salacia cochinchinensis Lour., Celastraceace) trên thực nghiệm, Luận án tiến sĩ dược học, Viện Dược Liệu, tr. 32-60.

12. Viện Dinh Dưỡng (2011), Tình hình dinh dưỡng Việt Nam năm 2009-2010, Nhà xuất bản Y học, tr. 26.

13. Nguyễn Ngọc Xuân (2004), Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của Thổ phục linh (Smilax glabra Roxb- Liliaceae) trên xúc vật thí nghiệm, Luận án tiến sĩ, trường Đại học Y Hà Nội, tr. 45-55.

TIẾNG ANH

14. Adefegha SA., Omojokun OS, G Oboh (2015 ), "Modulatory effect of protocatechuic acid on cadmium induced nephrotoxicity and hepatoxicity in rats in vivo", Springerplus, 4, pp. 619-626.

15. Adeolu A. T. and Enesi D. O. (2013), "Assessment of proximate, mineral, vitamin and phytochemical compositions of plantain (Musa paradisiaca) bract - an agricultural waste ", International Research Journal of Plant Science, 4(7), pp. 192-197.

16. Agama-Acevedo E, Sañudo-Barajas J. A., Vélez De La Rocha R et al (2016), "Potential of plantain peels flour (Musa paradisiaca L.) as a source of dietary fiber and antioxidant compound", CyTA - Journal of Food, 14(1), pp. 117-123.

17. Alabi A.S. Omotoso G.O., Enaibe B.U. et al (2013), "Beneficial effects of low dose musa paradisiaca on the semen quality of male Wistar rats", Nigerian Medical Journal, 54(2), pp. 92-95.

18. Alfonso. L Susan. Z and Heinz. N (2003), "Teratogenic phthalate esters and metabolites activate the nuclear receptors PPARs and induce differentiation of F9 cells", Toxicology and Applied Pharmacology, 188(1), pp. 14-23.

19. American Diabetes Association (2017), "Standards of Medical Care in

Diabetes", Diabetes Care, 40(1), pp. 70-75.

20. Aria A. Looi C.Y., Wong F. W. et al (2013), "In vivo antioxidant, PTP1B inhibitory effects and hypoglycemic potential of selected medicinal plants", International Journal of Pharmacology, 10(9), pp. 50-57.

21. Arulselvan P. and Subramanian S. (2007), "Effect of Murraya koenigii leaf extract on carbohydrate metabolism studied in streptozotocin induced diabetic rats", International Journal of Biological Chemistry, 1(1), pp. 21-28.

22. Ashish M. Reddy K. R. C., Gautam D. N. S. et al (2016), "In-vivo potential of Musa paradisiaca Linn. (Stmn.) in streptozotocin-induced diabetic rats", International Journal of Green Pharmacy, 10(2), pp. 111-114.

23. Ayala et. al (2010), "Glucose Tolerance Test Protocol (GTT) ", Dis Model Mech 3, pp. 525-534.

24. Balekari U. and Veeresham C. (2015), "In vivo and in vitro evaluation of anti zeylanica", secretagogue activities of Capparis insulin diabetic and Pharmacology & Pharmacy, 6, pp. 331-320.

25. Banerjee M. Sahoo S., Sahu S. K. et al (2016), "In silico designing and molecular docking studies on selected reported & proposed new compound against PPAR-γ receptor for type 2 diabetes", Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 5(4), pp. 1022-1029.

26. Bashir S. Ali S., Andleeb S. et al (2016), "Polyherbal effects of Berberius lycium and Hedra helix on Alloxan monohydrate induced diabetes", Journal of Natural Sciences, 4(1), pp. 1-10.

27. Bellatorre A. Jackson SH., Choi K., (2017), "Development of the diabetes typologymodel for discerning Type 2 diabetesmellitus with national survey data", PloS ONE, 12(3), pp. 1-13.

28. Biswas D. Gouda S. T., Gowrishankar N. L. et al (2016), "Insignificant effect of ethanol extract of Dipterocarpus turbinatus (Dipterocarpaceae) bark on selected parameter in alloxan -induced diabetic rats", Journal of Pharmaceutical Negative Results, 7(1), pp. 29-32.

29. Bradford M. M. (1976), "A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding", Analytical Biochemistry, 72, pp. 248-254.

30. Cai S. Sun W., Fanand Y. et al (2016), "Effect of mulberry leaf (Folium mori) on insulin resistance via IRS-1/PI3K/Glut-4 signalling pathway in type 2 diabetes mellitus rats", Pharmaceutical Biology, 9, pp. 1-7.

31. Castillo-Quan J. I. Li L., Kinghornand K. .J. et al (2016), "Lithium promotes longevity through GSK3/NRF2-dependent hormesis", Cell Reports 25, pp. 638- 650.

32. Chan C-C. (2016), Animal models of ophthalmic diseases, Springer Cham Heidelberg New York Dordrecht London, pp. 1-127.

33. Chandran R. Parimelazhagan T., Shanmugam S. et al (2016), "Antidiabetic activity of Syzygium calophyllifolium in Streptozotocin-Nicotinamide induced type-2 diabetic rats", Biomedicine & Pharmacotherapy, 82, pp. 547 – 554.

34. Chu Z. L. Jones R. M., He H. et al (2007), "A role for beta-cell-expressed G protein-coupled receptor 119 in glycemic control by enhancing glucose- dependent insulin release", Endocrinology, 148(6), pp. 2601-9.

35. Coppari R. Bjørbæk C. et al (2012), "Leptin revisited: its mechanism of action and potential for treating diabetes", Nature Reviews Drug Discovery, 11(9), pp. 692-708.

36. Correa. M, Bombardelli. M.C.M, Fontana. P.D et al (2017), "Bioactivity of extracts of Musa paradisiaca L. obtained with compressed propane and supercritical CO2", The Journal of Supercritical Fluids, 122, pp. 63-69.

37. Damasceno D. C. Netto A. O., Iessi I. L. et al (2014), "Streptozotocin-induced diabetes models: pathophysiological mechanisms and fetal outcomes", Biomed Research International, 2014, pp. 81-90.

38. Das D. Mukherjee S., Das A. S., (2012), "Aqueous extract of black tea (Camellia sinensis) prevents ethanol + cholecystokinin-induced pancreatitis in a rat model", Life Sciences, 78(19), pp. 2194-2203.

39. Dawson J. M. and Heatlie P. L. (1984), "Lowry method of protein quantification: Evidence for photosensitivity", Analytical Biochemistry, 140(2), pp. 391-393.

40. De Fronzo R. A. Mandarino L. J. (2004), Diabetes and carbohydrate metabolism, Springer, pp. 912-919.

41. Deeg R. and Zlegenhorn J. (1983), "Kinetic enzymic method for automated determination of total cholesterol in serum", Clinical Chemistry, 29(10), pp. 1798-1802.

42. Dehghan F. Hajiaghaalipour F., Yusof A. et al (2016), "Saffron with resistance exercise improves diabetic parameters through the GLUT4/AMPK pathway in- vitro and in-vivo", Scientific Reports, 6, pp. 1-10.

43. Dhanya R. Arya A. D., Nisha P. and Jayamurthy P., (2017), "Quercetin, a Lead Compound against Type 2 Diabetes Ameliorates Glucose Uptake via AMPK Pathway in Skeletal Muscle Cell Line", Pharmacology, 8(336), pp. 1-7.

44. Donnier-Maréchal M. and Vidal S. (2016), "Glycogen phosphorylase inhibitors: a patent review (2013 - 2015)", Expert Opinion on Therapeutic Patents 26(2), pp. 199-212.

45.

Ekpo B. Ajebesin K. and Esesyin O. (2011), "Evaluation of hypoglycemic activity of Musa Paradisiaca L. (Musaceae) in rat", International Journal of Research in Ayurveda & Pharmacy, 2, pp. 498-501.

46.

Elchebly M. Payette P., Michaliszyn E. et al (1999), "Increased insulin sensitivity and obesity resistance in mice lacking the protein tyrosine phosphatase-1B gene", Science, 283(5407), pp. 1544-1548.

47. Erion D. M. and Shulman G. I. (2008), "Diacylglycerol-mediated insulin resistance", Nature Medicine, 16, pp. 400-402.

48.

Eva T. Miguel L., Carlos D. et al (2016), "Glucagon-like peptide 1 analogs and their effects on pancreatic islets", Trends in Endocrinology & Metabolism, 27(5), pp. 304-315.

49. Fallahi P. Corrado A., Domenicantonio D. A. et al (2016), "CXCR3, CXCR5, CXCR6, and CXCR7 in Diabetes", Current Drug Targets, 17, pp. 515-519.

50.

Fan Y. Li X., Xiao W. et al (2015), "BAMBI elimination enhances alternative TGF-b signaling and glomerular dysfunction in diabetic mice", Diabetes 64, pp. 2220 –2233

51.

Fang L. Cao J., Duan L. et al (2014), "Protein tyrosine phosphatase 1B (PTP1B) and α-glucosidase inhibitory activities of Schisandra chinensis (Turcz.) Baill", Journal of Functional Foods 9, pp. 264-270.

52.

Favaro F. Camussi E., Miceli I. et al (2011), "Islet endothelium: role in type 1 diabetes and in Coxsackievirus infections", Journal of Diabetes and its Complications, 25(11), pp. 57-69.

53. Foo A. Y. and Bais R. (1998), "Amylase measurement with 2-chloro-4- nitrophenyl maltotrioside as substrate", Clinica Chimica Acta, 4, pp. 27.

54. Fraulob J. C. Ogg-Diamantino R., Fernandes-Santos C. et al (2010), "A mouse model of metabolic syndrome: insulin resistance, fatty liver and non-alcoholic

fatty pancreas disease (NAFPD) in C57BL/6 mice fed a high fat diet", Journal of Clinical Biochemistry and Nutrition, 46, pp. 212.

55.

Frost F. C. and Lane D. M. (1985), "Evidence for the involvement of vicinal sulfhydryl groups in insulin- activated hexose transport by 3T3-Ll adipocytes", Journal of Biological Chemistry, 260(5), pp. 2646-2652.

56.

Fukushima M. Matsuyama F. and Ueda N. (2006), "Effect of corosolic acid on postchallenge plasma glucose levels", Diabetes Research and Clinical Practice, 73, pp. 174-177.

57. Gastadelli A. Baldi S., Pettiti M. et al (2000), "Influence of obesity and type 2 diabetes on gluconeogenesis and glucose output in humans: a quantitative study", Diabetes, 49, pp. 1367-1373.

58. Gerold K. D. Zheng P., Rainbow D. B. (2011), "The soluble CTLA-4 splice variant protects from type 1 diabetes and potentiates regulatory T-cell function", Diabetes, 60(7), pp. 2-8.

59. Gibbs P. E. M. Miralem T., Lerner-Marmarosh N. et al (2016), "Nanoparticle delivered human biliverdin reductase-based peptide increases glucose uptake by activating IRK/Akt/GSK3 axis: the peptide is effective in the cell and wild-type and diabetic Ob/Ob mice", Journal of Diabetes Research, 5, pp. 1-15.

60. Gilbert R. E. Huang Q., Thai K. (2011), "Histone deacetylase inhibition attenuates diabetes-associated kidney growth: potential role for epigenetic modification of the epidermal growth factor receptor", Kidney Int. , 79, pp. 1312-1321.

61. Godsland L. F. et al (2010), "Insulin resistance and hyperinsulinaemia in the development and progression of cancer", Clinical Science 118, pp. 315-332.

62. Gowan M. W. Artiss J. D., Strandbergh D. R. (1983), "A peroxidase-coupled method for the colorimetric determination of serum triglycerides", Clinical Chemistry 29, pp. 538-542.

63. Goyard D. Kónya B., Chajistamatiou A. S. et al (2016), "Glucose-derived spiro- isoxazolines are anti-hyperglycemic agents against type 2 diabetes through glycogen phosphorylase inhibition", European Journal of Medicinal Chemistry, 108, pp. 444-454.

64. Han H. S. Kang G., Kim J. S. et al (2016), "Regulation of glucose metabolism from a liver-centric perspective", Experimental & Molecular Medicine, 48, pp. 2-8.

65. Han XN. Liu CY., Liu YL. et all, (2013), "New triterpenoids and other constituents from the fruits of Benincasa hispida (Thunb.) Cogn", J Agric Food Chem., 61(51), pp. 12692-12699.

66. Hutchens T. and Piston D. W. (2015), "EphA4 receptor forward signaling inhibits glucagon secretion from α-cells", Diabetes, 64, pp. 3839-3850.

67. IDF (2015), Diabetes Atlas Seventh Edition, Press, International Symposium, pp. 15-17,73,77,81,85,86,87,93-95.

68.

Ikegami H. Noso S., Babaya N. et al (2011), "Genetics and pathogenesis of type 1 diabetes: prospects for prevention and intervention", Journal of Diabetes Investigation, 2(6), pp. 416-418.

69. Imam M. Z. and Akter S. (2011), "Musa paradisiaca L. and Musa sapientum L", Journal of Applied Pharmaceutical Science, 1(5), pp. 14-20.

70.

Irudayaraj S. S. Stalin A., Sunil C. et al (2016), "Antioxidant, antilipidemic and antidiabetic effects of ficusin with their effects on GLUT4 translocation and PPARγ expression in type 2 diabetic rats", Chemico-Biological Interactions, 256(25), pp. 85-93.

71.

Ivorra M.D. D’Ocon M.P., Paya M., Villar A. (1998), "Antihyperglycemic and insulin-releasing effects of beta-sitosterol 3-beta-D-glucoside and its aglycone, beta-sitosterol", Archives Internationales de Pharmacodynamie et de Therapie, 296, pp. 224-231.

72.

Jarvill-Taylor K. J. and Anderson R. A. (2013), "A hydroxychalcone derived from cinnamon functions as a mimetic for insulin in 3T3-L1 adipocytes", Journal of the American College of Nutrition, 20(4), pp. 327-336.

73.

Jawla S. Kumar Y., Khan M. S. Y. et al (2012), "Antimicrobial and antihyperglycemic activities of Musa ", Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 2(2), pp. 914–918.

74. Joakim Hagvik B.Sc. (2007), "Glucose Measurement: Time for a Gold Standard", Journal of Diabetes Science and Technology, 1(2), pp. 169-172.

75. Joost H-G. Al-Hasani H., Schürmann A. (2012), Animal Models in Diabetes Research, Humana Press, pp. 1-161.

76.

Joseph S. Kumar L., Bai V. N. et al (2016), "Evaluation of anti-diabetic activity of Strobilanthes cuspidata in alloxan induced diabetic rats and the effect of bioactive compounds on inhibition of α-amylase enzyme", Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, 5(3), pp. 169-175.

77. Kalra S. Aamir A. H., Raza A. et al (2015), "Place of sulfonylureas in the management of type 2 diabetes mellitus in South Asia: A consensus statement", Indian Journal of Endocrinology and Metabolism, 19(5), pp. 577-596.

78. Kamurthy H. Sumalatha Ch., Sunandan Rao N., et al, (2013), "Antinocieptive activity of stigmosterol-3-glyceryl-2-linoleiate, campesterol and daucosterol isolated from Aerva lanata Linn. aerial parts", Asian Journal of Pharmaceutical and Clinical Research, 6(1), pp. 149-152.

79. Kappel V. D. Cazarolli L. H., Pereira D. F. et al (2013), "Beneficial effects of banana leaves (Musa paradisiaca) on glucose homeostasis: multiple sites of action", Brazilian Journal of Pharmacognsosy, 23(4), pp. 706-715.

80. Kazeem M. I. and Ashafa A. O. T. (2016), "Antioxidant and inhibitory properties of Dombeya burgessiae leaf extracts on enzymes linked to diabetes mellitus", Transactions of the Royal Society of South Africa 7(2), pp. 1-8.

81. Kelly C. B. Blair L. A. et al (2003), "Isolation of islets of Langerhans from rodent pancreas", Diabetes Mellitus: Methods and Protocols, pp. 3-14.

82. Khan M. R. I. Islam M. A., Hossain M. S. et al (2010), "Antidiabetic effects of the different fractions of ethanolic extracts of Ocimum sanctum in normal and alloxan induced diabetic rats", Journal of Scientific Research, 2(1), pp. 158-168.

83. Khan S. Kumar S., Jena G. (2016), "Valproic acid reduces insulin-resistance, fat deposition and FOXO1-mediated gluconeogenesis in type-2 diabetic rat", Biochimie, 125, pp. 42-52.

II. Isolation, Structures, Cyclohomonervilol, Cyclonervilol, of

84. Kikuchi T. Kadota S., Suehara H. and Shima T., (1985), "Studies on the and Constituents of Orchidaceous Plants. Stereochemistry and Dihydrocycloeucalenol C-24 Epimers, New Triterpenes from Nervilia purpurea SCHLECHTER", Phytochemistry, 33, pp. 1913-1927.

85. Kim Y. S. Jung D. H., Lee I. S., Pyun B. J., Kim J. S. (2016), "Osteomeles schwerinae extracts inhibits the binding to receptors of advanced glycation end productsand TGF-β 1 expression in mesangial cellsunder diabetic conditions", Phytomedicine, 23, pp. 388–397.

86. King A. J. F. (2012), "The use of animal models in diabetes research", British Journal of Pharmacology 166, pp. 877-894.

87. Kongkathip N. Dhumma-upakorn P., Kongkathip P. et al, (2002), "Study on cardiac contractility of cycloeucalenol and cycloeucalenone isolated from Tinospora crispa", Journal of Ethnopharmacology, 83, pp. 95-99.

88. Korbonits M. and Pernicova I. (2014), "Metformin-mode of action and clinical implications for diabetes and cancer", Nature Reviews Endocrinology, 10, pp. 143-156.

89.

Lakshmi V. Agarwal S. K., Ansari J. A. et al (2014), "Antidiabetic potential of Musa paradisiaca in Streptozotocin-induced diabetic rats ", Journal of Phytopharmacology 3(2), pp. 77-81.

90.

Landau B. R. Wahren J., Chandramouli V. et al (1996), "Contribution of gluconeogenesis to glucose production in the fasted state", Journal of Clinical Investigation, 98, pp. 378-385.

91.

Latha M. and Pari L. (2003), "Antihyperglycemic effect of Cassia auriculata in experimental diabetes and its effect on key metabolic enzymes invoved in cacrbohydrate metabolism", Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology, 30, pp. 38-43.

92. Lavin P. D. White M. F., Brazil P. D. et al (2016), "IRS proteins and diabetic complications", Diabetologia, pp. 4072-4077.

93.

Lee S. M. Hay D. L., Pioszak A. A. et al (2016), "Calcitonin and amylin receptor peptide interaction mechanisms", Journal of Biological Chemistry, 291(16), pp. 8686 -8696.

94. Lee S. Y. Kim K. H., Lee I. K. et al (2012), "A new flavonol glycoside from Hylomecon vernalis", Archives of Pharmacal Research, 35(3), pp. 415-421.

95.

León F. Habib E., Adkins JE et al, (2009), "Phytochemical characterization of the leaves of Mitragyna speciosa grown in U.S.A."", Nat Prod Commun, 4(7), pp. 907-910.

96.

Li X. Q. Wang L. J., Shi D. Y. et al (2016), "The design strategy of selective PTP1B inhibitors over TCPTP", Bioorganic & Medicinal Chemistry, 6(35), pp. 3-24.

97.

Lin X. Pelletier S., Gingras S. et al (2015), "Generation of NOD mice carrying R619W mutation in PTPN22 gene by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering (BA4P.134)", The Journal of Immunology, 194, pp. 14-47.

98.

Liu D. Liang X., Zhang H. et al (2016), "Effects of high glucose on cell viability and differentiation in primary cultured Schwann cells: potential role of ERK signaling pathway", Neurochemical Research, 41, pp. 1281-1290.

99.

anti-inflammatory analgesic and Luciane C. L. Carvalho J. C. Marise Kakimore M. et al (2014), "31- norcycloartanones with properties", Pharmacological characterization of Solanum cernuum, 22(3), pp. 179-185.

100. Luo T. Nocon A., Fry J. et al (2016), "AMPK activation by metformin suppresses abnormal adipose tissue extracellular matrix remodeling and ameliorates insulin resistance in obesity", Diabetes, 65(8), pp. 2295–2310.

101. Mallick C. Chatterjee K., GuhaBiswas M. et al (2007), "Antihyperglycemic effects of separate and composite extract of root of musa paradisiaca and leaf of coccinia indica in streptozoin-induced diabetic male albio rat", African Journal of Traditional, Complementary and Alternative Medicines, 4(3), pp. 362 - 371.

102. Marino A. Zengin G., Nostro A. and et al., (2016), "Antimicrobial activities, toxicity and phenolic composition of Asphodeline anatolica E. Tuzlaci leaf extracts from Turkey", Nat Prod Res., pp. 1-4.

103. Mesa G.M. (2014), "Antidiabetic potential of plants used in Cuba", Pharm. Res., 1, pp. 52-62.

104. Miyazawa M. Yagi N. and Taguchi K. (2005), "Inhibitory Compounds of alpha- Glucosidase Activity from Arctium lappa L.", Article in journal of oleo science, 54(11), pp. 589-594

105. Moreau R.A (2002), "Phytosterols, phytostanols, and their conjugates in foods: structural diversity, quantitative analysis, and health-promoting uses", Prog Lipid Res, 41(6), pp. 457-500.

106. Mukherjee PK. Saha K., Pal M. et al, (1997), "Effect of Nelumbo nucifera rhizome extract on blood sugar level in rats", J ethnopharmacol, 58(3), pp. 207- 213.

107. Mutiu I. K. and Anofi O.T.A (2016), "Antioxidant and inhibitory properties of Dombeya burgessiae leaf extracts on enzymes linked to diabetes mellitus," Royal Societ y of South Africa, 7, pp. 1-8.

108. Nauck M. (2016), "Incretin therapies: highlighting common features and differences in the modes of action of glucagon-like peptide-1 receptor agonists and dipeptidyl peptidase-4 inhibitors", Diabetes, Obesity and Metabolism, 18(3), pp. 203-216.

109. Nguyen P. H. Zhao B. T., Ali M. Y. et al (2015), "Insulin-mimetic selaginellins from Selaginella tamariscina with protein tyrosine phosphatase 1B (PTP1B) inhibitory activity", Journal of natural products, 78, pp. 34− 42.

110. Nguyen T. (2016), "Keeping up with safety warnings of oral antidiabetic drugs", Journal for nurse practitioners, 12(1), pp. 60-62.

111. Niesler C. U. Myburgh K. H., Moore F. et al (2006), "The changing AMPK expression profile in differentiating mouse skeletal muscle myoblast cells helps confer increasing resistance to apoptosis", Experimental Physiology, 92(1), pp. 207-217.

112. Nita G F Albert. K, Stephen J. S and et al, (2014), "Differences in the prospective association between individual plasma phospholipid saturated fatty acids and incident type 2 diabetes: the EPIC-InterAct case-cohort study", Diabetes & Endocrinology, 2(10), pp. 810-818.

113. Nitta K. Shi S., Nagai T. et al (2016), "Oral administration of N-acetyl-seryl- aspartyl-lysyl-proline ameliorates kidney disease in both type 1 and type 2 diabetic mice via a therapeutic regimen", BioMed Research International, 2016, pp. 1-10.

114. Oldstone M. B. A. (2016), "A Jekyll and Hyde profile: type 1 interferon signaling plays a prominent role in the initiation and maintenance of a persistent virus infection", The Journal of Infectious Diseases, pp. 32-35.

115. Onyenekwe P. C. Okereke O. E. and Owolewa S. O. (2013), "Phytochemical screening and effect of Musa paradisiaca stem extrude on rat haematological parameters", Current Research Journal of Biological Sciences, 5(1), pp. 26-29.

116. Osmund E. C. Christian O. E. and Prince A. O. (2014), "Anti-oxidant vitamins, phytochemicals and proximate composition of the ethanol extract of the leaves of Musa paradisiaca", African Journal of Pharmacy and Pharmacology, 8(18), pp. 464-468.

117. Padilla-Camberos E. Flores-Fernández J. M., Canales-Aguirre A. A. et al (2016), "Wound healing and antioxidant capacity of Musa paradisiaca Linn. peel extracts", Journal of Pharmacy & Pharmacognosy Research, 4(5), pp. 165-173.

118. Pagliuca F. W and Melton D. A. (2013), "How to make a functional β-cell", NIH consensus statement, 140(12), pp. 2472-2483.

119. Pandey M. K. and DeGrado T. R. (2016), "Glycogen synthase kinase-3 (GSK- 3)-targeted therapy and imaging", Theranostics 6(4), pp. 571-593.

120. Pelletier J. Domingues N., Castro M. M. C. A. et al (2016), "In vitro effects of or bis(1,2-dimethyl-3-hydroxy-4-pyridinonato)oxidovanadium(IV), VO(dmpp)2,on insulin secretion inpancreatic islets of type 2 diabetic Goto- Kakizaki rats", Journal of Inorganic Biochemistry, 154, pp. 29-34.

associated with hyperglycemia ameliorates inhibiting

121. Pengfei X. Yingjie Z., Xinghao J. et al (2016), "Canine fibroblast growth factor 21 hepatic gluconeogenesis and improving pancreatic beta-cell survival in diabetic mice and dogs", PloS ONE, 3(20), pp. 1-18.

Biochemical Biophysical L-cells", and 122. Pham H. Hui H., Morvaridi S. et al (2016), "A bitter pill for type 2 diabetes? The activation of bitter taste receptor TAS2R38 can stimulate GLP-1 release from Research enteroendocrine Communications, 475, pp. 295-300.

123. Piqueras L. Reynolds A. R., Hodivala-Dilke K. M. et al (2007), "Activation of angiogenesis", proliferation endothelial induces and cell PPARβ/δ Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology, 27, pp. 63-69.

124. Poelje P. D. Dang Q, . and Erion M. D., (2007), "Discovery of fructose-1,6- bisphosphatase inhibitors for the treatment of type 2 diabetes", Current opinion in drug discovery & development 10(4), pp. 430-437.

125. Poudel R. R. (2013), "Renal glucose handling in diabetes and sodium glucose cotransporter 2 inhibition", Indian Journal of Endocrinology and Metabolism, 17(4), pp. 588-593.

126. Pretsch E. Buhlmann P. and Badertscher M. (2009), Structure Determination of Organic Compounds, Springer-Verlag Berlin Heidelberg, pp. 10-7, 69-242.

127. Prince S. M. P. and Kamalakkannan N. (2006), "Rutin improves glucose homeostasis in streptozotocin diabetic tissues by altering glycolytic and gluconeogenic enzymes", Journal of Biochemical and Molecular Toxicology, 20(2), pp. 96-102.

128. Rajnish.G Anil K.S and et al (2011), "Antidiabetic and antioxidant potential of β-sitosterol in streptozocin - induced experimental hyperglycemia", Journal of Diabetes & Metabolism, 3, pp. 29-37.

129. Ranjbari A. Azarbayjani M. A., Yusof A. et al (2016), "In vivo and in vitro evaluation of the effects of Urtica dioica and swimming activity on diabetic factors and pancreatic beta cells", BMC Complementary and Alternative Medicine, pp. 1-44.

130. Reddy J. and Hemachandran J. (2014), "Comparative evaluation of the antidiabetic and hypoglycaemic potentials of the parts Musa paradisiaca plant

extracts", International Journal of Scientific and Research Publications, 4(4), pp. 1-5.

131. Reed M. J. Meszaros K., Entes L. J. et al (2000), "A new rat model of type 2 diabetes: the fat-fed, streptozocin-treated rat", Metabolism, 49(11), pp. 1390- 1394.

132. Rena G. Pearson Ewan R., Sakamoto K., (2013), "Molecular mechanism of action of metformin: old or new insights?", Diabetologia, 56(9), pp. 1898-1906.

133. Rifaai R. A. El-Tahawy N. F., Saber E. A. et al (2012), "Effect of quercetin on the endocrine pancreas of the experimentally induced diabetes in male albino rats: a histological and immunohistochemical study", Journal of Diabetes & Metabolism, 3(3), pp. 1-11.

134. Ritter K. Buning C., Halland N. et al (2015), "G protein-coupled receptor 119 (GPR119) agonists for the treatment of diabetes: recent progress and prevailing challenges", Journal of Medicinal Chemistry, 59, pp. 3579− 3592.

135. Rizna T.D. Sanro. T, Sofa. F and Muhammad. H, (2015), "a-Glucosidase inhibitor compounds from Aspergillus terreus RCC1 and their antioxidant activity", Medical chemystry research, 24, pp. 737-743.

136. Rizzatti V. Boschi F., Pedrotti M. et al (2013), "Lipid droplets characterization in adipocyte differentiated 3T3-L1 cells: size and optical density distribution", European Journal of Histochemistry, 57(3), pp. 159-161.

137. Rudolph J. Esler W. P., O'Connor S. et al (2007), "Quinazolinone derivatives as orally available ghrelin receptor antagonists for the treatment of diabetes and obesity", Journal of Medicinal Chemistry, 50(21), pp. 5202-16.

138. Rui L. Aguirre V., Kim J. K. et al (2001), "Insulin/IGF-1 and TNF-alpha stimulate phosphorylation of IRS-1 at inhibitory Ser307 via distinct pathways", Journal of Clinical Investigation, 107, pp. 181-189.

139. Ruiz-Alcaraz J. A. Liu H. K., Cuthbertson D. J. et al (2005), "A novel regulation of IRS1 (insulin receptor substrate-1) expression following short term insulin administration", Biochemical Journal, 392(2), pp. 345-352.

140. Sarabia. V Ramlal. T, Klip. A, (1990), "Glucose uptake in human and animal muscle cells in culture", Biochem Cell Biology, 68(2), pp. 536-542.

141. Semaming Y. Kumfu S., Pannangpetch P. and et al, (2014), "Protocatechuic acid exerts a cardioprotective effect in type 1 diabetic rats", J Endocrinol., 223(1), pp. 13-23.

142. Shanmuga S. C. and Subramanian S. (2011), "Biochemical evaluation of hypoglycemic activity of Musa paradisiaca (Plantain) flowers in STZ induced experimental diabetes in rats", Asian Journal of Research in Chemistry, 4(5), pp. 827-833.

143. Sharma S. and Taliyan R. (2016), "Histone deacetylase inhibitors: Future therapeutics for insulin resistance and type 2 diabetes", Pharmacological Research, 113, pp. 320–326.

144. She M. Hongjie H., Zongbao W. et al (2014), "Melatonin rescues 3T3-L1 adipocytes from FFA-induced insulin resistance by inhibiting phosphorylation of IRS-1 on Ser307", Biochimie, 3, pp. 60-65.

145. Shi and Cheng D. (2009), "Beyond triglyceride synthesis: the dynamic functional roles of MGAT and DGAT enzymes in energy metabolism", American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism, 27(1), pp. 10- 18.

146. Shibata E. (2013), "Free fatty acids inhibit protein tyrosine phosphatase 1B and activate Akt", Cellular Physiology and Biochemistry, 32, pp. 871-879.

147. Shin D. Lee S. C., Heo Y. S. et al (2007), "Design and synthesis of 7-hydroxy- 1H-benzoimidazole derivatives as novel inhibitors of glycogen synthase kinase- 3β", Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 17, pp. 5686-5689.

148. Shodehinde S. A. and Oboh G. (2012), "In vitro antioxidant activities and inhibitory effects of aqueous extracts of unripe plantain pulp (Musa paradisiaca) on enzymes linked with type 2 diabetes and hypertension", Journal of Toxicology and Environmental Health Sciences, 4(4), pp. 65-75.

149. Silva A. A. S. Morais S. M., Vieira I. G. P. et al (2014), "Activity of cycloartane-type triterpenes and sterols isolated from musa paradisiaca fruit peel against Leishmania infantum chagasi", Phytomedicine, 20(11), pp. 1419- 1423.

150. Silva A. R. Cerdeira C. D., Brito A. R. et al (2016), "Green banana pasta diet prevents oxidative damage in liver and kidney and improves biochemical parameters in type 1 diabetic rats", Archives of Endocrinology and Metabolism, 60(4), pp. 355-366.

151. Silvestre M. P. and Acero L. H. (2016), "Hypoglycemic Potential of Banana Leaves (Musa paradisiaca) in Albino Rats", International Journal of Food Engineering, 2(1), pp. 71-73.

152. Simon-Szabo L. Kokas M., Greff Z. et al (2016), "Novel compounds reducing IRS-1 serine phosphorylation for treatment of diabetes", Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 26(15), pp. 424–428.

153. Singh S. K. Kesari A. N., Rai P. K. et al (2007), "Assessment of glycemic potential of Musa paradisiaca stem juice", Indian Journal of Clinical Biochemistry, 22(2), pp. 48-52.

154. Sosinska E. Przybylski R., Hazendonk P., et al (2013), "Characterisation of non- polar dimers formed during thermo-oxidative degradation of β-sitosterol", Food Chemistry,, 139, pp. 464-474.

155. Soty M. Chilloux J., Delalande F. et al (2016), "Post-Translational regulation of the glucose-6-phosphatase complex by cyclic adenosine monophosphate is a crucial determinant of endogenous glucose production and is controlled by the glucose-6-phosphate transporter", Journal of Proteome Research, 15, pp. 1342− 1349.

fatty acid free the

156. Sparks S. M. Chen G., Collins J. L. et al (2014), "Identification of receptor 4 diarylsulfonamides as agonists of (FFA4/GPR120)", Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 24 pp. 3100– 3103.

157. Sridhar M. G. Vinayagamoorthi R., Suyambunathan A. V. et al (2007), "Bitter gourd (Momordica charantia) improves insulin sensitivity by increasing skeletal muscle insulin-stimulated IRS-1 tyrosine phosphorylation in high-fat-fed rats", British Journal of Nutrition, 99(4), pp. 806-812.

158. Srinivasan K. Viswanad B., Asrat L., Kaul C. L., Ramarao P. (2005), "Combination of high-fat diet-fed and low-dose streptozotocin-treated rat: a model for type 2 diabetes and pharmacological screening", Pharmacological Research, 52(4), pp. 313-320.

159. Srinivasan S. Sathish G., Jayanthi M. et al (2014), "Ameliorating effect of eugenol on hyperglycemia by attenuating the key enzymes of glucose metabolism in streptozotocin-induced diabetic rats", Molecular and Cellular Biochemistry, 385, pp. 159-168.

160. Srivastava A. Yano J., Hirozane Y. et al (2014), "High-resolution structure of the human GPR40 receptor bound to allosteric agonist TAK-875", Nature, 513, pp. 124-127.

161. Sun HX. Ye YP. , Yang K., (2002), "Studies on the chemical constituents in radix Astilbes chinensis", China Journal of Chinese Materia Medica, 27(10), pp. 751-754.

162. Sun Y. Asnicar M., Saha P. K. et al (2006), "Ablation of ghrelin improves the diabetic but not obese phenotype of ob/ob mice", Cell Metabolism, 3(5), pp. 379-386.

163. Suneetha B. Sujatha D. and Prasad K. (2010), "Antidiabetic and antioxidant activities of stem juice of Musa paradisiaca on alloxan induced diabetic rats", An International Journal of Advances In Pharmaceutical Sciences 1(2), pp. 167- 174.

164. Tang XL. Liu JX, Dong W. and et al, (2014), "Cardioprotective effect of protocatechuic acid on myocardial ischemia/reperfusion injury", J Pharmacol Sci. , 125(2), pp. 176-183.

165. Tartaglia L. A. Dembski M., Weng X. et al (1995), "Identification and expression cloning of a leptin receptor, OB-R", Cell, 83(7), pp. 1263-1271.

166. Taylor S. C. Berkelman T., Yadav G. et al (2013), "A defined methodology for reliable quantification of Western blot data", Molecular Biotechnology, 55(3), pp. 217–226.

167. Thomas A. Rajesh E. K., Kumar D. S. et al (2016), "The significance of Tinospora crispa in treatment of diabetes mellitus", Phytothrerapy research, 30, pp. 30: 357– 366.

168. Trammell S. A. J. Weidemann B. J., Chadda A. et al (2016), "Nicotinamide riboside opposes type 2 diabetes and neuropathy in mice", Scientific Reports, 27, pp. 1-7.

169. Tsou R. C. (2014), The role of protein tyrosine phosphatase 1b in the central regulation of energy homeostasis, University of Pennsylvania, pp. 13, 50-55,70- 77.

170. Vankatesh K. V. Kumar G. K., Pradeepa K. et al (2013), "Antibacterial activity of ethanol extract of Musa paradisiaca cv. Puttabale and Musa acuminate cv. Grand Naine", Asian Journal of Pharmaceutical and Clinical Research, 6(2), pp. 169-172.

171. Venables M. C. and Jeukendrup A. E. (2009), "Physical inactivity and obesity: links with insulin resistance and type 2 diabetes mellitus", Diabetes/Metabolism Research and Reviews, 25(1), pp. 18-23.

172. Venkatesh K. V. Krishna P., Kumar S. et al (2014), "Pharmacological properties corm ethanol extract of Musa paradisiace (L) CV. puttabale", Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 3(5), pp. 1362-1383.

173. Vickers S. P. Klein T., Jones R. B. et al (2012), "Effect of empagliflozin, on body weight, glucose control and plasma parameters in STZ-induced diabetic rats fed a high-fat diet: comparison with exenatide", Diabetologia, 771(48), pp. 1-5.

174. Vo Q. H. Nguyen P. H., Zhao B. T. et al (2015), "Protein tyrosine phosphatase 1B (PTP1B) inhibitory constituents from the aerial parts of Tradescantia spathacea Sw", Fitoterapia, 103, pp. 113-121.

175. Wagner L. Kaestner F., Wolf R. et al (2016), "Identifying neuropeptide Y(NPY) as the main stress-related substrate of dipeptidyl peptidase 4 (DPP4) inblood circulation", Neuropeptides, 57, pp. 21-23.

176. Wållberg M. and Cooke A. (2013), "Immune mechanisms in type 1 diabetes", Trends in Immunology, 34(12), pp. 583-591.

177. Wang C. Chi Y., Li J. et al (2014), "FAM3A activates PI3K p110α/Akt signaling to ameliorate hepatic gluconeogenesis and lipogenesis", Hepatology, 59(5), pp. 1779-1789.

178. Wang Y. Xu L., Yuan L. et al (2016), "Sodium-glucose co-transporter-2 inhibitors suppress atrial natriuretic peptide secretion in patients with newly diagnosed type 2 diabetes", Diabetic Medicine, pp. 2-5.

179. Weigert C. Kron M., Kalbacher H. and et al, (2008), "Interplay and Effects of Temporal Changes in the Phosphorylation State of Serine-302, -307, and -318 of Insulin Receptor Substrate-1 on Insulin Action in Skeletal Muscle Cells", Molecular Endocrinology, 22(1), pp. 2729-2740.

180. Wilson R.D. and Shahidul Islam Md. (2012), "Fructose-fed streptozotocin- injected rat: an alternative model for type 2 diabetes", Pharmacological Reports, 64, pp. 129-139.

181. World Health Organization, Global report on diabetes, in Report of WHO/IDF Consultation. 2016,. p. pp.1-83.

182. Yang J. (2010), "Role of clusters in insulin-regulated GLUT4 trafficking in adipose cells", International Journal of Biological Sciences 6(7), pp. 716-718.

183. Yap A. Nishiumi S., Yoshida K. et al (2007), "Rat L6 myotubes as an in vitro model system to study GLUT4-dependent glucose uptake stimulated by inositol derivatives", Cytotechnology, 55(2), pp. 103-108.

184. Yayli N. Yildirim N., Usta A. et al (2003), "Chemical constitutents of Campanula lactifora", Turkish Journal of Chemistry, 27, pp. 749-755.

185. Yoshida M. Lee E. Y., Kohno T. et al (2016), "Importance of hepatocyte nuclear factor 4α in glycerol-induced glucose-6-phosphatase expression in liver", Biomedical Research, 37(2), pp. 85-93.

186. Yoshida T. Okuno A., Izumi M. et al (2008), "CS-917, a fructose 1,6- bisphosphatase inhibitor, improves postprandial hyperglycemia after meal loading in non-obese type 2 diabetic Goto-Kakizaki rats", European Journal of Pharmacology, 601(1-3), pp. 192-7.

187. Yuko W. Sakiyama H. and Fumio S. (2016), "Myristic Acid Enhances Diacylglycerol Kinase δ-Dependent Glucose Uptake in Myotubes", Lipids, 51(8), pp. 897-903.

188. Zhang H. Yan X., Yan Jiang Y. et all, (2011), "The extraction, identification and quantification of hypoglycemic active ingredients from stinging nettle (Urtica angustifolia) ", African Journal of Biotechnology, 10(46), pp. 9428-9437.

189. Zitterl-Eglseera K. Sosab S., Jurenitschc J. and et al, (1997), "Anti-oedematous activities of the main triterpendiol esters of marigold (Calendula officinalis L.)", Journal of Ethnopharmacology, 57(2), pp. 139-144.

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC

NỘI DUNG

Phụ lục I. Phiếu giám định tên khoa học

Phụ lục II. Phương pháp và kết quả tiêu chuẩn cắn toàn phần thân cây

Chuối tiêu

Phụ lục III. Kết quả liều thử nghiệm

Phụ lục IV. Sự tích tụ mô mỡ trong ổ bụng của chuột cống ĐTĐ typ 2

Phụ lục V. Quy trình chi tiết xác định thành phần hóa học của thân cây

Chuối tiêu

Phụ lục VI. Kết quả xác định độc tính của cắn toàn phần thân cây chuối

tiêu

PHỤ LỤC I PHIẾU GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC

PHỤ LỤC II

PHƯƠNG PHÁP VÀ KẾT QUẢ TIÊU CHUẨN CẮN TOÀN PHẦN THÂN

CÂY CHUỐI TIÊU

2.1. PHƯƠNG PHÁP

2.1.1. Cảm quan

Quan sát bằng mắt thường về màu sắc, cảm quan về mùi vị đặc trưng của

thân cây chuối.

2.1.2. Mất khối lượng do làm khô

Cân chính xác khoảng 1g chế phẩm, thử theo DĐVN IV, phụ lục 9.6

(105C, 4 giờ)

2.1.3. Định tính bằng sắc ký lớp mỏng

Cắn toàn phần thể hiện phép thử định tính của thân cây chuối tiêu (Musa

x paradisiaca L)

Chuẩn bị dịch chấm sắc ký: Lấy khoảng 0,1g cắn toàn phần thân cây

chuối tiêu hòa tan trong lượng tối thiểu methanol để chấm sắc ký.

Bản mỏng silicagel GF254 được hoạt hóa ở 110C trong 1giờ.

Quan sát sắc ký đồ thu được sau khi khai triển với hệ dung môi Sau khi

khai triển với các hệ dung môi toluen:etylacetat:aceton:acid formic (5:2:2:1)

dưới ánh sáng tử ngoại ở hai bước sóng λ=254nm, λ=366nm và sau khi hiện màu

bằng dung dịch acid sulfuric10%/ethanol (sấy ở 110C trong 10 phút).

2.1.4. Tro toàn phần

Cân chính xác khoảng 1g chế phẩm, thử theo DĐVN IV, phụ lục 9.8,

phương pháp 2

2.1.5. Xác định hàm lượng nguyên tố độc bằng phương pháp quang phổ hấp

thụ nguyên tử.

- Thuốc thử đạt tiêu chuẩn tinh khiết dùng cho phép đo AAS

+ Nước trao đổi ion (suất điện trở ≥16 MΩ.cm)

+ Dung dịch chuẩn gốc Asen (As), Thủy ngân (Hg), Chì (Pb), Cadimi

(Cd) có nồng độ 1.000 mg/L (Merck)

+ Acid nitric 65% (Merck)

+ Dung dịch acid nitric 10%

+ Dung dịch acid nitric 1%

+ Nước oxy già (H2O2) 30% (Merck)

+ Acid hydrocloric 3%

+ Dung dịch KI 10% trong acid ascorbic 5%

Dung dịch natri borohydrid (NaBH4) 0,6% pha trong dung dịch NaOH

0,4%.

+ Dung dịch K2Cr2O7 10% trong nước

+ Dung dịch natri borohydrid (NaBH4) 0,6% pha trong dung dịch NaOH

0,2%.

+ Dung dịch acid hydrocloric 0,3% trong dung dich acid nitric 0,6%

+ Dung dịch Amoni dihydrophosphat 1% (Merck).

Tiến hành

- Xác định hàm lượng Pb, Cd

+ Chuẩn bị dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 0,3 đến 0,5 g mẫu vào

cốc teflon dung tích 60ml, thêm 3 ml acid nitric 65%, 1ml nước oxy già 30%, để

yên 1 giờ. Tiến hành vô cơ hóa trong lò vi sóng theo chương trình nhiệt độ, công

suất và áp suất như bảng 2.1

Bảng 2.1. Chương trình vô cơ hóa mẫu trong lò vi sóng

Giai Thời gian Áp suất Nhiệt độ (0C) Công suất (W) đoạn (phút) (bar)

1 10 30 1.800 100

2 15 30 1.800 135

3 15 32 1.800 165

4 15 32 1.800 185

5 10 30 1.800 120

Khi quá trình vô cơ hóa mẫu kết thúc, để nguội, chuyển cốc phá mẫu ra

khỏi lò vi sóng, mở nắp để khói trong cốc bay hết. Thêm 10 ml nước trao đổi ion

vào cốc, lắc đều, lọc qua giấy, phễu lọc vào bình định mức 50 ml. Tráng rửa cốc

phá mẫu 2 lần, mỗi lần 10 ml nước trao đổi ion, gộp dịch rửa qua phễu lọc vào

bình định mức trên, vừa đủ bằng nước trao đổi ion đến vạch, lắc đều.

+ Chuẩn bị các dung dịch chuẩn Pb, Cd:

* Từ dung dịch chuẩn gốc Pb có nồng độ 1000 mg/L, tiến hành pha loãng

với nước trao đổi ion để được dung dịch chuẩn Pb có nồng độ 40 ng/ml. Dùng

dung dịch Pb nồng độ 40 ng/ml với dung dịch pha loãng là dung dịch acid nitric

0,5% để hệ thống pha mẫu tự động pha các dung dịch chuẩn Pb làm việc có các

nồng độ lần lượt là 4, 8, 16, 32 và 40 ng/ml.

* Từ dung dịch chuẩn gốc Cd có nồng độ 1000 mg/L, tiến hành pha loãng

với nước trao đổi ion để được dung dịch chuẩn Cd có nồng độ 10 ng/ml. Dùng

dung dịch Cadimi nồng độ 10 ng/ml với dung dịch pha loãng là dung dịch acid

nitric 0,5% để hệ thống pha mẫu tự động pha các dung dịch chuẩn Cadimi làm

việc có các nồng độ lần lượt là 0,5; 1; 2; 3 và 4 ng/ml

Mẫu trắng: dung dịch acid nitric 0,5%

+ Quy trình phân tích:

Điều kiện tiến hành được thể hiện tại bảng 2.2 và bảng 2.3

Bảng 2.2. Các thông số máy tối ưu để phân tích Pb, Cd

Thông số Điều kiện Pb Cd

Cathod rỗng Pb Cathod rỗng Cd Loại đèn

Cường độ đèn (mA) 3 4,0

Bước sóng (nm) 228,8 283,3

Độ rộng khe sáng (nm) 1,2 0,8

Cuvet graphit Wall Wall

Tốc độ khí mang (Argon) tại giai đoạn Max Max nguyên tử hóa (ml/phút)

20 20 Thể tích mẫu (l)

5 5 Thể tích dung dịch làm ổn định (l)

Bảng 2.3. Chương trình nhiệt độ tối ưu để phân tích Pb, Cd

Thời gian tăng/ duy Nhiệt độ bắt Tốc độ dòng trì nhiệt độ (giây) Giai đoạn đầu/ kết thúc khí (ml/ phút) (0C) Pb Cd

7,4/5 8,6/5 80

Làm khô 3,6/10 3,6/10 Max 105

130 5/15 5/15

400 2,7/10 2,8/10 Max Tro hóa 550 0,3/20 2,5/20

Max Nguyên tử hóa 2000 0,7/4 0,8/4

Max Làm sạch lò 2300 0,6/4 0,8/4

Max Làm nguội lò 0/0 0/17 0/17

* Cách tiến hành

Với các thông số đã đưa ra ở trên, tiến hành đo độ hấp thụ Pb (Cd) trong

dung dịch chuẩn, dung dịch thử trên thiết bị quang phổ hấp thụ nguyên tử, kỹ

thuật nguyên tử hóa không ngọn lửa, sử dụng cuvet graphit (pha loãng dung dịch

thử nếu cần, sao cho nồng độ Pb, Cd trong dung dịch thử phải nằm trong dãy các

dung dịch chuẩn có nồng độ tương ứng từ 4-40 ng/ml (với Pb) và 0,5 - 4ng/ml

(với Cd). Mẫu trắng là dung dịch acid nitric 0,5%. Lập đường chuẩn biểu diễn sự

phụ thuộc tuyến tính giữa độ hấp thụ và nồng độ Pb (Cd) trong dãy chuẩn. Tính

toán nồng độ Pb (Cd) trong dung dịch thử dựa vào đường chuẩn.

* Tính kết quả

Hàm lượng Pb (Cd) trong mẫu (g/g) được tính theo công thức sau:

Trong đó: C: Nồng độ Pb (Cd) trong dung dịch thử (ng/ml hay µg/L)

p: Khối lượng mẫu thử đem xác định (g).

D: Hệ số pha loãng của dung dịch thử.

- Xác định hàm lượng Arsen

+ Chuẩn bị dung dịch thử: Hút chính xác 5 ml dung dịch phân tích vào

bình định mức 50 ml, thêm 5 ml dung dịch kali iodid 10% / acid ascorbic 5%,

thêm acid hydrocloric 3% đến vạch, lắc đều.

+ Chuẩn bị các dung dịch chuẩn:

Từ dung dịch chuẩn gốc arsen có nồng độ 1.000 mg/l, tiến hành pha loãng bằng

nước để được dung dịch chuẩn arsen có nồng độ 50 ng/ml. Pha loãng dung dịch

chuẩn arsen nồng độ 50 ng/ml với dung dịch acid hydrocloric 3% để được các

dung dịch chuẩn arsen làm việc có các nồng độ lần lượt là 1, 2, 4, 5 và 8 ng/ml,

thêm dung dịch kali iodid 10% vào dung dịch cuối với tỷ lệ 1/10.

+ Chuẩn bị mẫu trắng:

Hút chính xác 5 ml dung dịch kali iodid 10% vào bình định mức 50 ml,

thêm dung dịch acid hydrocloric 3% vừa đủ tới vạch, lắc đều.

+ Qui trình phân tích: Điều kiện tiến hành thể hiện trong bảng 2.4

Bảng 2.4. Các thông số máy tối ưu để phân tích Arsen

Điều kiện Thông số

Loại đèn Cathod rỗng arsen

Cường độ đèn (mA) 12

Bước sóng (nm) 193,7

Độ rộng khe sáng (nm) 1,2

Nhiệt độ Cell 980

Tốc độ dẫn dung dịch natri borohydrid 0,6% 8 ml/ phút (ml/phút)

Tốc độ dẫn dung dịch acid hydrocloric 3% 8 ml/ phút (ml/phút)

Tốc độ dẫn mẫu (ml/phút) 12 ml/phút

100 ml/phút (purge 1) Tốc độ khí mang (Argon) (ml/phút) 310 ml/phút (purge 2)

* Cách tiến hành

Với các thông số đã đưa ra trong bảng trên, tiến hành lần lượt đo độ hấp thụ

arsen của mẫu trắng, các dung dịch chuẩn, dung dịch thử trên thiết bị quang phổ

hấp thụ nguyên tử, kỹ thuật hóa hơi hydrid (pha loãng dung dịch thử nếu cần,

sao cho nồng độ arsen trong dung dịch thử phải nằm trong dãy chuẩn). Lập

đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa độ hấp thụ và nồng độ arsen

trong dãy chuẩn. Tính toán nồng độ arsen trong dung dịch thử dựa vào đường

chuẩn.

* Tính kết quả

Hàm lượng arsen trong mẫu (g/g) được tính theo công thức sau:

Trong đó:

C: Nồng độ Arsen trong dung dịch thử (ng/ml hay µg/L)

p: Khối lượng mẫu thử đem xác định (g).

D: Hệ số pha loãng của dung dịch thử.

- Xác định hàm lượng Hg

+ Chuẩn bị dung dịch thử: Hút chính xác 10 ml dung dịch phân tích vào

bình định mức 25 ml, thêm 1 ml dung dịch kali dicromat 10% trong nước, thêm

acid hydrocloric 0,3% trong dung dich acid nitric 0,6% đến vạch, lắc đều.

+ Chuẩn bị các dung dịch chuẩn:

Từ dung dịch chuẩn gốc Hg có nồng độ 1000 mg/l, tiến hành pha loãng

với nước để được dung dịch chuẩn Hg có nồng độ 50 ng/ml. Pha loãng dung

dịch chuẩn Hg nồng độ 50 ng/ml với dung dịch thêm acid hydrocloric 0,3%

trong dung dịch acid nitric 0,6% đến vạch, lắc đều để được các dung dịch chuẩn

Hg làm việc có các nồng độ lần lượt là 1, 2, 4, 5 và 8 ng/ml, thêm dung dịch kali

dicromat 10% trong nước vào dung dịch cuối với tỷ lệ 1/25.

+ Chuẩn bị mẫu trắng:

Hút chính xác 2 ml dung dịch kali dicromat 10% trong nước vào bình định mức

50 ml, thêm dung dịch acid hydrocloric 3% vừa đủ tới vạch, lắc đều.

+ Qui trình phân tích

+ Điều kiện phân tích thể hiện trong bảng 2.5

Bảng 2.5. Các thông số máy tối ưu để phân tích Hg

Điều kiện Thông số

Cathod rỗng Hg Loại đèn

Cường độ đèn (mA) 3

Bước sóng (nm) 253,7

Độ rộng khe sáng (nm) 0,5

Tốc độ dẫn dung dịch natri borohydrid 0,6% 8 ml/ phút (ml/phút)

Tốc độ dẫn dung dịch acid hydrocloric 3% 8 ml/ phút (ml/phút)

Tốc độ dẫn mẫu (ml/phút) 12 ml/phút

100 ml/phút (purge 1) Tốc độ khí mang (Argon) (ml/phút) 310 ml/phút (purge 2)

* Cách tiến hành

Trước khi tiến hành phân tích, để các dung dịch chuẩn, thử và trắng vào

nước nóng tại 700C trong 30 phút, để nguội.

Với các thông số đã đưa ra trong bảng trên, tiến hành đo mẫu trắng, lần lượt

đo độ hấp thụ Hg của các dung dịch chuẩn, dung dịch thử trên thiết bị quang phổ

hấp thụ nguyên tử, kỹ thuật hóa hơi hydride (pha loãng dung dịch thử nếu cần

sao cho nồng độ Hg trong dung dich thử phải nằm trong dãy chuẩn). Lập đường

chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa độ hấp thụ và nồng độ Hg trong

dãy chuẩn. Tính toán nồng độ Hg trong dung dịch thử dựa vào đường chuẩn.

* Tính kết quả

Hàm lượng Hg trong mẫu (g/g) được tính theo công thức sau:

Trong đó:

C: Nồng độ Hg trong dung dịch thử (ng/ml hay µg/L)

p: Khối lượng mẫu thử (g).

D: Hệ số pha loãng của dung dịch thử.

2.1.6. Độ nhiễm khuẩn

Tổng số vi khuẩn hiếu khí, tổng số nấm men, nấm mốc, E.coli, Samonella,

B.aureus, Coliforms, C.perfringens: Thử theo DĐVN IV - Phụ lục 13.6

- Chuẩn bị dụng cụ

+ Bao gói dụng cụ phương pháp tiệt trùng khô trước khi tiệt trùng

+ Hộp petri: các hộp petri đã được rửa sạch và sấy khô, đưa vào trong các

hộp inox đậy kín hoặc bao gói bằng giấy nhôm.

+ Ống nghiệm: nút kín các ống nghiệm bằng giấy nhôm, để trong giá inox

đựng ống nghiệm. Các pipet 10ml, 5ml, 1ml: đưa vào trong các hộp inox đậy kín

hoặc bao gói kín các loại pipet bằng giấy nhôm.

+ Bình tam giác cân và pha loãng mẫu: bao gói bằng giấy nhôm.

+ Thìa cân: bao gói bằng giấy nhôm.

+ Tiệt trùng dụng cụ bằng nhiệt khô: thực hiện trong tủ sấy ở 1600C

+ Bao gói dụng cụ phương pháp hấp tiệt trùng:

Ống nghiệm: nút kín bằng nút xoáy, đặt trong các giá ống nghiệm hoặc

trong thời gian 2 giờ. Với đầu côn dùng cho micropipet: cho vào cốc 250ml bao kín bằng giấy nhôm. bao gói bằng giấy nhôm. Găng tay: bao gói bằng giấy nhôm hoặc túi nilon chịu nhiệt.Tiệt trùng dụng cụ bằng phương pháp hấp: thực hiện tiệt trùng bằng cách hấp 1210C/15 phút. - Chuẩn bị môi trường Pha môi trường:Môi trường cơ bản 1 theo bảng 2.6 Bảng 2.6. Thành phần pha môi trường cơ bản 1

Pepton từ casein 10,0 g

Cao thịt bò 1,0 g

D-mannitol 10,0 g

Natri clorua (NaCl) 10,0 g

Phenol đỏ 0,025 ml

Thạch 12 - 18 g

Nước 900 ml

pH sau tiệt khuẩn 7,2±0,2

Hòa tan môi trường bằng cách đun nóng nếu cần. Hấp tiệt trùng môi

trường 1210C/ 15 phút.

+ Dung dịch gốc polymycin B theo bảng 2.7

Bảng 2.7. Thành phần pha môi trường polymycin B

Polymycin B sulfat 106 IU

Nước hòa tan polymycin B sulfat trong nước, khử trùng bằng 100,0 ml

cách lọc.

Dung dịch nhũ tương lòng đỏ trứng (hoặc có thể dùng dạng thương phẩm)

Sử dụng quả trứng gà còn nguyên vẹn. Dùng bàn chải, rửa trứng trong

dung dịch tẩy rửa. Tráng sạch dưới dòng nước chảy, ngâm trong ethanol 95%

(V/V) trong 30 giây rồi để khô. Bằng kỹ thuật vô trùng, đập vỡ từng quả trứng

và tách riêng lòng đỏ trứng bằng cách chuyển lòng đỏ từ nửa vỏ quả này sang

nửa vỏ quả kia. Cho lòng đỏ trứng vào ống đong vô trùng và thêm bốn phần còn

lại bằng nước vô trùng. Chuyển chế phẩm vô trùng sang bình cầu vô trùng và

khuấy mạnh.

Đun nóng hỗn hợp 2h trong nồi cách thủy đặt 44 – 47C. Sau đó để yên

18 – 24 giờ ở 5±3C để tạo kết tủa.

Bằng cách vô trùng thu lấy nhũ tương phía trên.

Dung dịch nhũ tương này có thể bảo quản đến 72 h ở 5±3C. Pha môi

trường hòan chỉnh theo bảng 2.8

Bảng 2.8. Thành phần pha môi trường hòan chỉnh

Môi trường hòan chỉnh 1 (thạch MYP)

Môi trường cơ bản 1 90 ml

Dung dịch polymycin B 1,0 ml

Dung dịch nhũ tương lòng đỏ trứng 10,0 ml

Môi trường cơ bản 2: (Thạch huyết No.2)

Pepton proteoza hoặc pepton tương đương 15,0 g

Sản phẩm thủy phân gan 2,5 g

Cao nấm men 5,0 g

Natri clorua (NaCl) 5,0 g

Thạch 12 - 18 g

Nước 1000 ml

pH sau tiệt khuẩn 7,0±0,2

Môi trường hòan chỉnh 2: (Thạch huyết cừu)

Môi trường cơ bản 2 90 ml

Huyết cừu đã khử sợi huyết 5 - 7 ml

Sau khi đã làm nguội môi trường đến nhiệt độ 44 – 47C, bổ sung huyết

cừu đã khử sợi huyết vào môi trường cơ bản, trộn đều.

+ Tiến hành.

Pha loãng mẫu bằng dung dịch đệm pepton-clorid ở độ pha loãng 1/10,

1/100.

Cho vào mỗi đĩa 0,1 ml mẫu thử nếu chế phẩm ở dạng lỏng hoặc 0,1 ml

chế phẩm đã pha loãng nếu chế phẩm ban đầu ở dạng khác chứa sẵn môi trường

hòan chỉnh. Dùng que trang vô trùng dàn đều mẫu trên bề mặt thạch càng nhanh

càng tốt và không chạm vào các mép đĩa. Đậy nắp đĩa và để ổn định 15 phút ở

nhiệt độ phòng.

Đối với một số sản phẩm nhất định, tốt nhất để ước tính B.cereus với số

lượng nhỏ, là tăng giới hạn phát hiện lên 10 lần bằng cách kiểm tra 1,0 ml mẫu

thử nếu sản phẩm ban đầu ở dạng lỏng, hoặc 1,0 ml dịch mẫu đã pha loãng nếu

sản phẩm ở dạng khác. Phân phối 1 ml dịch cấy lên bề mặt của 2 đĩa petri lớn

(110 mm) hoặc lên khắp bề mặt của 3 đĩa nhỏ (90 mm) sử dụng dụng cụ dàn

mẫu vô trùng. Trong cả hai trường hợp, chuẩn bị cho phép xác định kép 4 đĩa to

hoặc 6 đĩa nhỏ.

Lật úp đĩa và ủ ở 30-35C trong 18 đến 24 giờ. Sau thời gian ủ quan sát

và đếm số khuẩn lạc với đặc điểm màu hồng (không lên men mannitol) có vùng

kết tủa bao quanh (do hình thành men lexitinase). Nếu không thể nhìn rõ các

khuẩn lạc thì ủ các đĩa thêm 24 giờ trước khi đếm.

Lấy khuẩn lạc nghi ngờ cấy đâm sâu xuống môi trường hòan chỉnh 2. Ủ ở

30 – 35C trong 18 - 24 giờ. Nếu có phản ứng dương tính (tan hồng cầu) thì kết

luận có mặt của B. aureus.

Nếu trên hai hoặc ba đĩa môi trường hòan chỉnh 1 không có các khuẩn lạc

như mô tả thì kết luận có ít hơn f CFU/ 1 ml mẫu (hoặc f CFU/ 1g mẫu), trong

đó f là hệ số pha loãng.

Lấy khuẩn lạc nghi ngờ từ môi trường hòan chỉnh 1, thử phản ứng tan

huyết trên môi trường hòan chỉnh 2. Nếu có phản ứng tan huyết thì chế phẩm có

mặt của B. cereus.

- Tính ra số lượng B.cereus trong 1g hoặc 1ml chế phẩm

Từ các cặp đĩa trên môi trường hòan chỉnh 1, lấy cặp đĩa có tổng số khuẩn lạc

lớn nhất có phản ứng tan huyết trên môi trường hòan chỉnh 2 (mà số khuẩn lạc

trên đĩa không được lớn hơn 300), tính ra số vi khuẩn B. cereus trong 1g (hoặc

1ml) chế phẩm theo công thức:

Trong đó: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên cặp đĩa có số khuẩn lạc lớn

nhất V: Thể tích cấy trên cặp đĩa đã chọn (tính bằng ml).

d: Hệ số pha loãng của đậm độ pha loãng thứ nhất.

2.2. KẾT QUẢ

2.2.1.Cảm quan và mất khối lượng do làm khô

Dạng bột khô, màu nâu thơm mùi của chuối tiêu (Musa paradisiaca L) và

mất khối lượng do làm khô đạt 5,0%.

2.2.2. Định tính

formic (5:2:2:1) thu được hình ảnh sắc ký đồ như hình 2.1

Sau khi khai triển với các hệ dung môi toluen:etylacetat:aceton:acid

A. Soi ở bước sóng 366nm B. Phun thuốc thử hiện màu H2SO4 10%/ethanol 96%, sấy nhiệt độ

1100C/10 phút soi ở bước sóng 254nm.

C. Phun hiện màu H2SO4 10%/ethanol 96%, sấy nhiệt độ 1100C/10 phút,

soi bước sóng 366nm.

Hình 2.1. Sắc ký đồ của cắn toàn phần thân cây chuối tiêu

Nhận xét: Trên sắc ký đồ của cắn toàn phần thân cây chuối tiêu có thể thấy ở

H2SO4 10%/ethanol 96%, soi ở bước sóng λ = 254nm chỉ thấy một vết màu

hồng nhạt. Tuy nhiên, các vết chất hiện màu khi soi ở bước sóng λ = 366nm.

bước sóng λ = 366nm chỉ thấy có một vết chất màu sáng. Khi phun thuốc thử

2.2.3. Tro toàn phần

Kết quả 11,0% (tính theo chế phẩm đã làm khô)

2.2.4. Giới hạn kim loại nặng

Cắn toàn phần thân cây chuối tiêu được xác định hàm lượng nguyên tố

độc bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử kết quả được thể hiện trong

bảng 2.9.

Bảng 2.9. Hàm lượng các nguyên tố độc có trong cắn toàn phần thân cây

chuối tiêu

Các nguyên tố độc Asen Chì Thủy ngân Cadimi Giới hạn cho phép < 0,4 ppm < 0,09 ppm < 0,03 ppm < 0,2 ppm

Kết quả < 0 ,182 ppm < 0 ,380ppm < 0,087ppm < 0,025 Nhận xét: Hàm lượng các nguyên tố độc Arsen, Chì, Cadimi và Thủy

ngân trong cắn toàn phần thân cây chuối tiêu đều nhỏ hơn giới hạn cho phép

theo quy định của DĐVN.

Kiểm tra độ nhiễm khuẩn của cắn toàn phần thân cây chuối tiêu, kết quả

được trình bày trong bảng 2.10.

Bảng 2.10. Độ nhiễm khuẩn của cắn toàn phần thân cây chuối tiêu

TT Tên chỉ tiêu Đơn vị tính Kết quả

1 Tổng số VKHK khuẩn lạc/g 2

2 Tổng số nấm mốc, nấm khuẩn lạc/g Không phát hiện

men

Coliforms

Cl. Perfringens

Bacillus cereus

3 E. Coli khuẩn lạc/g Không phát hiện

4 Salmonella khuẩn lạc/25g Không phát hiện

Nhận xét: Bằng phương pháp thử độ nhiễm khuẩn của chế phẩm theo

DĐVN IV - Phụ lục 13.6 kết quả cho thấy cắn toàn phần thân cây chuối tiêu

không bị nhiễm các vi khuẩn như coliforms, escherichia coli, salmonella, Cl.

perfringensvà bacillus cereus. Tuy nhiên trong cắn toàn phần vẫn có 2 khuẩn lạc

của vi khuẩn hiếu khí /1 g cắn toàn phần.

PHỤ LỤC III

KẾT QUẢ DÒ LIỀU THỬ NGHIỆM

Chuột nhắt trắng gây tăng glucose máu (STZ liều 150mg/kg), chia làm 6 lô (2-6)

Lô 2 (Chứng bệnh, n =10) uống dung môi pha hỗ dịch thử

Lô 3 (Chứng dương, n =10) uống metformin liều 240 mg/kg

Lô 4 (Thử, n =10) uống cắn toàn phần liều 250 mg/kg

Lô 5 (Thử, n =10) uống cắn toàn phần liều 500 mg/kg

Lô 6 (Thử, n =10) uống cắn toàn phần liều 1000 mg/kg

Lô 7 (Thử, n =10) uống cắn toàn phần liều 2000 mg/kg

Tiến hành song song cùng điều kiện là lô 1 chuột bình thường (chứng

sinh lý, uống dung môi pha hỗn dịch thử). Sau 15 ngày đo nồng độ glucose máu

của các lô chuột, kết quả được trình bày trong bảng 3.1

Bảng 3.1. Kết quả nồng độ glucose máu của các lô chuột thí nghiệm sau 15

ngày uống các mẫu thử

Các lô chuột Mẫu thử

Nồng độ glucose máu ngày 1 (mmol/L) 5,55±0,23 Nồng độ glucose máu ngày 16 (mmol/L) 5,37±0,14

16,79±1,16 15,73±0,80 Uống dung môi pha hỗ dịch thử Uống dung môi pha hỗ dịch thử

17,07±1,11 7,14±0,44 Uống metformin liều 240 mg/kg

17,11±1,04 12,79±0,95 Lô 1 (n=10, chứng sinh lý) Lô 2 (Chứng bệnh, n =10) Lô 3 (Chứng dương, n =10) Lô 4 (Thử, n =10) Uống cắn toàn phần liều 250 mg/kg

17,10±0,83 11,11±1,93 Lô 5 (Thử, n =10 Uống cắn toàn phần liều 500 mg/kg

16,89±1,11 7,3±0,33 Lô 6 (Thử, n =10) Uống cắn toàn phần liều 1000 mg/kg

17,04±0,86 7,11±0,82 Lô 7 (Thử, n =10) Uống cắn toàn phần liều 2000 mg/kg

% hạ glucose máu của các lô chuột thí nghiệm được xác định sau 15 ngày

uống các mẫu thử. Kết quả % hạ glucose máu của các lô chuột so với ngày 1 và

so với lô chứng bệnh kết quả được trình bày trong bảng 3.2

Bảng 3.2. % hạ glucose máu của các lô chuột sau 15 ngày uống mẫu thử

Các lô chuột Mẫu thử % hạ so với ngày 1 % hạ so với lô

3,2±1,7 chứng bệnh

7,15±5,47 Uống dung môi pha hỗ dịch thử Uống dung môi pha hỗ dịch thử

58,09±3,32 54,61±0,53 Uống metformin liều 240 mg/kg

25,13±6,32 18,75±2,13 Lô 1 (n=10, chứng sinh lý) Lô 2 (Chứng bệnh, n =10) Lô 3 (Chứng dương, n =10) Lô 4 (Thử, n =10) Uống cắn toàn phần liều 250 mg/kg

35,25±7,99 29,19±12,96

Lô 5 (Thử, n =10 Uống cắn toàn phần liều 500 mg/kg

56,61±4,08 53,55±1,78 Lô 6 (Thử, n =10) Uống cắn toàn phần liều 1000 mg/kg

58,04±7,04 54,6±7,08 Lô 7 (Thử, n =10) Uống cắn toàn phần liều 2000 mg/kg

Nhận xét: Với các mức liều thử nghiệm khác nhau, mức hạ glucose máu của lô

6 uống cắn toàn phần liều 1000 mg/kg, % hạ glucose máu so với ngày 1 và lô

chứng bệnh ổn định và tương đương với % hạ glucose máu của lô chứng dương

và lô uống cắn toàn phần 2000 mg/kg. Do đó, các nghiên cứu tiếp theo sử dụng

liều 1000 mg/ kg thể trọng chuột nhắt trắng và chuột cống là 500 mg/kg theo quy

đổi từ liều chuột nhắt sang liều chuột cống

PHỤ LỤC IV

SỰ TÍCH TỤ MÔ MỠ TRONG Ổ BỤNG CHUỘT ĐTĐ TYP 2

Chuột ĐTĐ typ 2 được gây bằng cách cho chuột ăn chế độ ăn giàu chất

béo kết hợp tiêm STZ liều thấp. Sau 15 ngày cho chuột uống cắn toàn phần liều

500 mg/kg. Kết quả sự tích tụ mô mỡ trong ổ bụng của các lô chuột thí nghiệm

được thể hiện trong hình 4.1

Hình 4.1. Sự tích tụ mô mỡ trong ổ bụng của chuột đái tháo đường typ 2 sau

15 ngày uống mẫu thử

(1: Chứng sinh lý; 2: Chứng bệnh; 3: Chứng dương; 4: Thử)

Tiến hành cân trọng lượng chuột, sau đó tách các mô mỡ trong ổ bụng

(mỡ bám trên các tạng trong ổ bụng) và cân tiếp. Tính tỷ lệ mô mỡ trên trọng

lượng cơ thể, kết quả được thể hiện trong bảng 4.2.

Bảng 4.2. % khối lượng mô mỡ trong ổ bụng/trọng lượng cơ thể của 4 lô

chuột ĐTĐ typ 2 thực nghiệm

Lô Mẫu thử

Khối lượng mỡ bụng/ trọng lượng cơ thể (%)

DM pha hỗn dịch thử 0,4±0,5**

DM pha hỗn dịch thử 1,6±0,7

Metformin (120 mg/kg) 0,8±0,3*

* : p < 0,01 và ** : p < 0,001 so với lô chứng bệnh

Lô 1 (Chứng sinh lý, n = 8 Lô 2 (Chứng bệnh, n = 8) Lô 3 (Chứng dương, n =8) Lô 4 (Thử, n =8) 0,9±0,2* Hỗn dịch cắn toàn phần(500 mg/kg)

Nhận xét: Sau 2 tháng ăn chế độ giàu lipid, tỷ lệ khối lượng mỡ bụng/trọng

lượng cơ thể của chuột cống tăng 400 % so với lô chuột bình thường (p <0,001).

Ở động vật ĐTĐ typ 2 bị béo phì khi sử dụng metformin và cắn toàn phần thân

cây chuối tiêu, tỷ lệ này giảm còn 50,0 và 56,25 % so với lô chứng bệnh (p <

0,01).

PHỤ LỤC V

QUY TRÌNH CHI TIẾT XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC

5.1. CÁC PHẢN ỨNG ĐỊNH TÍNH

5.1.1. Định tính flavonoid

Lấy khoảng 10 ml dịch ép thân cây chuối tiêu vào chén sứ. Đun cách thủy

cho tới cắn khô. Hòa tan cắn vào 5ml cồn 90%, lọc, chia dịch vào 3 ống nghiệm:

- Phản ứng Cyanidin: Thêm một ít bột Mg kim loại, thêm tiếp vài giọt

HCl đặc, đun cách thủy. Thấy dịch chiết không chuyển sang màu đỏ.

- Phản ứng với FeCl3 5%: Thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5%. Thấy dịch

chiết chuyển sang màu xanh đen.

- Tác dụng với kiềm: Thêm vài giọt NaOH 10%. Màu vàng của dung dịch

đậm lên.

Kết luận: Trong dịch ép không có flavonoid.

5.1.2. Định tính alcaloid

Lấy 10 ml dịch ép cho vào bình lắng gạn 50ml, kiềm hóa dịch chiết tới

pH = 10 bằng dung dịch NH4OH 10% và chiết bằng chloroform (10ml x 3 lần).

Gộp chung và rửa lớp dung môi hữu cơ với 10ml nước cất. Lắc lớp chloroform

với dung dịch HCl 5% (2ml x 3 lần). Chia dung dịch làm 3 ống nghiệm nhỏ:

- Ống nghiệm 1: Thêm 2-3 giọt thuốc thử Mayer, không thấy xuất hiện

tủa bông trắng.

- Ống nghiệm 2: Thêm 2-3 giọt thuốc thử Dragendorff, không thấy xuất

hiện tủa màu cam.

- Ống nghiệm 3: Thêm 2-3 giọt thuốc thử Bouchardat, không thấy xuất

hiện tủa đỏ nâu.

Kết luận: Trong dịch ép không có alcaloid.

5.1.3. Định tính saponin

Lấy khoảng 5 ml dịch ép thân cây chuối tiêu vào chén sứ. Đun cách thủy

cho tới cắn khô. Hòa cắn với 5ml cồn 25%, lọc vào ống nghiệm, pha loãng với

5ml nước, lắc mạnh theo chiều dọc 15 giây. Thấy cột bọt không bền.

Kết luận: Trong dịch ép không có saponin

5.1.4. Định tính glycosid tim

Lấy khoảng 20 ml dịch ép thân cây chuối tiêu vào chén sứ. Đun cách thủy

cho tới cắn khô. Hòa tan cắn vào 5ml cồn 900, lọc, chia dịch vào 3 ống nghiệm,

bốc hơi trên nồi cách thủy đến cắn để tiến hành các phản ứng sau:

- Phản ứng Liebermann- Burchard: Hòa tan cắn trong ống nghiệm thứ nhất bằng

0,5ml anhydric acetic. Đặt ống nghiệm nghiêng 45°, thêm từ từ 0,5ml H2SO4 đặc

theo thành ống nghiệm để dịch lỏng trong ống nghiệm chia thành 2 lớp. Quan sát

thấy mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng xuất hiện vòng tím đỏ.

- Phản ứng Legal:Cắn trong ống nghiệm thứ 2 đem hòa tan bằng 0,5ml EtOH

90%. Thêm 5 giọt nitroprussiat 1% và 5 giọt NaOH 10%. Không thấy xuất hiện

màu hồng trong ống nghiệm.

- Phản ứng Baljet:Cắn trong ống nghiệm thứ 3 được hòa tan bằng 0,5ml EtOH

90%, thêm thuốc thử Baljet mới pha (1 phần dung dịch acid picric 1% và 9 phần

dung dịch NaOH 10%). Không thấy xuất hiện màu vàng cam.

Kết luận:Trong dịch ép không có glycosid tim.

5.1.5. Định tính coumarin

Lấy khoảng 10 ml dịch ép thân cây chuối tiêu vào chén sứ. Đun cách thủy

cho tới cắn khô. Hòa tan cắn vào 5ml cồn 90%, lọc. Dịch chiết thu được đem

làm các phản ứng sau:

- Phản ứng mở đóng vòng lacton:Cho dịch chiết vào 2 ống nghiệm nhỏ,

mỗi ống 1ml.

+ Ống 1: thêm 0,5ml dung dịch NaOH

+ Ống 2: để nguyên.

Đun cả 2 ống trên nồi cách thủy đến sôi. Quan sát thấy:

+ Ống 1 có tủa vẩn đục.

+ Ống 2 vẫn trong.

Thêm vào cả 2 ống nghiệm mỗi ống 2 ml nước cất. Lắc đều rồi quan sát:

+ Ống 1 vẫn có tủa vẩn đục

+ Ống 2 vẫn trong.

- Phản ứng Diazo: Cho 1 ml dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ, thêm 2ml

dung dịch NaOH 10%. Đun cách thủy đến sôi, để nguội. Thêm vài giọt thuốc thử

diazo, không thấy xuất hiện tủa đỏ gạch.

Kết luận: Trong dịch ép không có coumarin.

5.1.6. Định tính tanin

- Ống 1: Lấy khoảng 1ml dịch ép cho vào ống nghiệm nhỏ. Thêm 2-3 giọt

dung dịch FeCl3 5%. Quan sát thấy xuất hiện màu xanh đen.

- Ống 2: Lấy khoảng 1ml dịch ép cho vào ống nghiệm nhỏ. Thêm vài giọt

dung dịch chì acetat 10%. Quan sát thấy xuất hiện tủa trắng.

- Ống 3: Lấy khoảng 1ml dịch ép cho vào ống nghiệm nhỏ. Thêm 5 giọt

dung dịch gelatin 2%. thấy xuất hiện tủa trắng mờ.

Kết luận: Trong dịch ép có tannin và hợp chất polyphenol.

5.1.7. Định tính anthranoid

Lấy khoảng 10 ml dịch ép thân cây chuối tiêu. Thêm 1ml dung dịch

H2SO4 20%, đun sôi trên bếp cách thủy 10 phút. Để nguội, lọc lấy dịch lọc, cho

vào bình lắng gạn 50ml. Thêm 5 ml ether ethylic lắc nhẹ, gạn lấy dịch chiết ether

ethylic.

Cho 1 ml dịch chiết ether ethylic vào ống nghiệm sạch thêm 10 ml NaOH

10%. Không thấy xuất hiện màu hồng.

Kết luận: Trong dịch ép không có anthranoid.

5.1.8. Định tính sterol

Lấy khoảng 10 ml dịch ép thân cây chuối tiêu. Thêm 1ml dung dịch

H2SO4 20%, đun sôi trên bếp cách thủy 10 phút. Để nguội, lọc lấy dịch lọc, cho

vào bình lắng gạn 50 ml. Thêm 5ml ether ethylic lắc nhẹ, gạn lấy dịch chiết ether

ethylic cho vào chén sứ. Bốc hơi trên nồi cách thủy đến cắn. Hòa tan cắn bằng

0,5 ml anhydric acetic rồi thêm vào 0,5 ml chloroform. Chuyển dung dịch vào 1

ống nghiệm khô. Đặt ống nghiệm nghiêng 45° rồi thêm từ từ 0,5 ml H2SO4 đặc

theo thành ống nghiệm. Mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng có vòng tròn tím đỏ.

Kết luận: Trong dịch ép có sterol.

5.1.9. Định tính đường khử

Cho 1 ml dịch ép vào ống nghiệm, thêm 3 giọt thuốc thử Fehling A và 3

giọt thuốc thử Fehling B. Đun cách thủy trong 5 phút. Quan sát thấy trong ống

xuất hiện tủa đỏ gạch.

Kết luận: Trong dịch ép có đường khử.

5.1.10. Định tính acid hữu cơ

Cho 2 ml dịch ép vào ống nghiệm và cho thêm một ít tinh thể Na2CO3,

thấy bọt khí nổi lên

Kết luận: Trong dịch ép có acid hữu cơ.

5.1.11. Định tính acid amin

Cho 2 ml dịch ép vào ống nghiệm, nhỏ 3 giọt thuốc thử Ninhydrin 3%.

Đun cách thủy trong 10 phút. Không thấy xuất hiện màu xanh tím.

Kết luận: Trong dịch ép không có acid amin.

5.1.12. Định tính polysaccharid

- Ống 1: 4ml dịch ép và 5 giọt thuốc thử Lugol

- Ống 2: 4ml nước cất và 5 giọt thuốc thử Lugol

Hiện tượng: ống 1 không có màu đỏ đậm hơn ống 2

Kết luận: Trong dịch ép không có polysaccharid.

5.1.13. Định tính chất béo

Nhỏ vài giọt dịch ép thân cây chuối tiêu lên giấy lọc, hơ khô, không có

vết mờ trên giấy

Kết luận: Trong dịch ép không có chất béo

5.1.14. Định tính Caroten

Cho vào ống nghiệm 4ml dịch ép, cô tới cắn, nhỏ vài giọt acid H2SO4,

không thấy xuất hiện màu xanh ve.

Kết luận: Trong dịch ép không có caroten

5.2. PHÂN LẬP HỢP CHẤT

5.2.1. Phân lập hợp chất trong phân đoạn ethylacetat

5.2.1.1. Phân tách các hợp chất