Luận văn:Nghiên cứu chiết tách, chuyển hóa hydroxycitric acid trong lá, vỏ quả bứa và ứng dụng tạo sản phẩm giảm béo

Chia sẻ: Lang Nguyen | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:28

Thêm vào BST

Báo xấu

103
lượt xem 16
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Sau khi chiết tách các axit hữu cơ trong lá, vỏ quả bứa khô, kiểm tra mẫu chiết bằng phổ hồng ngoại IR, xác định HCA bằng phương pháp sắc kí lỏng cao áp (HPLC), kết quả cho thấy chiết bằng dung môi nước cho lượng axit HCA là lớn nhất, tiếp đến là axeton và metanol. Giá trị thu được chủ yếu của phương pháp HPLC được tính đến chỉ là HCA, hàm lượng trong lá và vỏ quả bứa khô lần lượt là 2,663 và 15,221%, phần axit còn lại là lượng nhỏ axit citric...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn:Nghiên cứu chiết tách, chuyển hóa hydroxycitric acid trong lá, vỏ quả bứa và ứng dụng tạo sản phẩm giảm béo

1 B GIÁO D C VÀ ĐÀO T O Đ I H C ĐÀ N NG Đ NG QUANG VINH NGHIÊN C U CHI T TÁCH, CHUY N HOÁ HYDROXYCITRIC ACID TRONG LÁ, V QU B A VÀ NG D NG T O S N PH M GI M BÉO Chuyên ngành: HOÁ H U CƠ Mã s : 62 44 27 01 TÓM T T LU N ÁN TI N SĨ HOÁ H C Đà N ng – Năm 2012
2 Công trình ñư c hoàn thành t i Đ I H C ĐÀ N NG Ngư i hư ng d n khoa h c: 1. GS. TS. ĐÀO HÙNG CƯ NG 2. PGS.TS. NGUY N THƯ NG Ph n bi n 1: PGS.TS.Tr n Văn Th ng Ph n bi n 2: PGS.TS. Lê T H i Ph n bi n 3: PGS.TS. Nguy n Th Thu Lan Lu n án s ñư c b o v t i H i ñ ng ch m Lu n án ti n s chuyên ngành Hóa h u cơ h p t i Đ i h c Đà N ng vào ngày 20 tháng 7 năm 2012. Có th tìm hi u lu n văn t i: - Trung tâm Thông tin - H c li u, Đ i h c Đà N ng - Thư vi n trư ng Đ i h c Sư ph m, Đ i h c Đà N ng
3 M Đ U 1. Tính c p thi t c a ñ tài Trên th gi i vi c nghiên c u cây b a ñã ñư c chú tr ng t lâu, tính ñ n nay ñã có hàng trăm công trình nghiên c u v cây b a bao g m các lĩnh v c chi t tách, xác ñ nh thành ph n hoá h c các h p ch t h u cơ, ng d ng trong công ngh th c ph m, công ngh dư c ph m, ñ c bi t là các lo i ch ph m gi m béo. Tuy nhiên, chưa có công trình nào công b v nghiên c u chuy n hoá HCA và ng d ng gi m béo m t cách chi ti t. Cây b a là m t lo i cây r t d tr ng, phát tri n t t, cho năng su t cao có h u h t trên các ñ a bàn Mi n Trung, Tây Nguyên. Ngư i Vi t Nam ta dùng lá và qu b a làm món ăn, dùng v qu b a ñ tr m t s b nh ngoài da và dùng búp non nhai ăn ñ ch a b nh ñ ng thai... Cho ñ n nay nư c ta chưa có m t nghiên c u nào mang tính cơ b n v thành ph n, tính ch t, kh năng chuy n hoá và ng d ng, công ngh khai thác v các h p ch t hoá h c có trong cây b a. Đây là nh ng v n ñ r t ñáng ñư c quan tâm nghiên c u nh m góp ph n quy ho ch, khai thác, ch bi n và ng d ng các s n ph m c a cây b a m t cách có hi u qu , khoa h c hơn. V i nh ng lí do trên, chúng tôi ch n ñ tài nghiên c u: "Nghiên c u chi t tách, chuy n hoá hydroxycitric acid trong v qu b a và ng d ng t o s n ph m gi m béo" làm lu n án ti n sĩ chuyên ngành hóa h u cơ c a mình. 2. M c ñích nghiên c u - Xác ñ nh hàm lư ng, tính ch t, kh năng chuy n hoá c a hydroxycitric acid trong lá và v qu b a. - T o ra ch ph m ph gia th c ph m kh o nghi m gi m béo. - Đóng góp thêm nh ng thông tin, tư li u khoa h c v cây b a.
4 3. Đ i tư ng và ph m v nghiên c u * Đ i tư ng nghiên c u: - Lá, v qu c a cây b a t i xã Hòa Liên, h. Hòa Vang, TP. ĐN. * Ph m vi nghiên c u: - Nghiên c u chi t tách b ng dung môi nư c và dung môi h u cơ, ñ nh tính và ñ nh lư ng các acid có trong trong lá, v qu b a. - Tinh ch , phân tích các ch tiêu m u thí nghi m, s n ph m. - Ph n ng chuy n hoá HCA thành các mu i kim lo i nhóm I và II (K, Ca). - Đánh giá kh năng ho t tính sinh h c c a các s n ph m sau chuy n hoá. 4. Phương pháp nghiên c u Nghiên c u lý thuy t k t h p v i th c nghi m. 5. Ý nghĩa khoa h c và th c ti n c a ñ tài Đ nh danh tên khoa h c cây b a vùng nguyên li u, xác ñ nh acid h u cơ trong lá, v qu b a. Chuy n hóa HCA trong lá, v qu b a thành các d ng mu i b n và có ho t tính sinh h c. Cung c p các thông tin v kh năng ch ng béo phì các ch ph m chuy n hóa. C p nh t các thông tin v lá, v qu b a và h p ch t HCA. T o cơ s ban ñ u ñ nghiên c u chi t tách, chuy n hóa HCA t cây b a Vi t Nam v i quy mô công nghi p ñ s n xu t th c ph m ch c năng gi m cân, thúc ñ y s phát tri n c a ngành dư c li u trong nư c. 6. C u trúc c a lu n án Lu n án g m ph n m ñ u, k t lu n và ki n ngh , các công trình ñã công b , tài li u tham kh o, ph l c và 03 chương. CHƯƠNG 1 - T NG QUAN 1.1. M T S LOÀI B A T I VI T NAM VÀ TH GI I
5 1.1.1. Đ c ñi m, phân b cây b a nư c ta còn có m t s loài b a như: B a - Garcinia oblongifolia Champ. Ex Benth (hình 1.1); B a m i - Garcinia harmandii Pierre; B a nhà - Garcinia cochinchinensis (Lour) Choisy; Tai Hình 1.1. Qu , lá, hoa c a b a chua - Garcinia pedunculata Roxb (G. cowa Roxb); B a ñ ng - Garcinia schomburgkiana Pierre; B a l a - Garcinaia fusca Pierre; B a Scheffer - Garcinaia schefferi Pierre; B a Planchon - Garcinaia planchonii Pierre; B a m vàng - Garcinia xanthochymus Hook.f.ex J. Anderson. M t s lo i b a khác n Đ như: Garcinia cambogia; Garcinia indica; Garcinia atroViridis. 1.2. K T QU NGHIÊN C U HYDROXYCITRIC ACID (HCA), CÁC MU I C A HCA TRONG NƯ C VÀ TH GI I 1.2.1. K t qu nghiên c u trên th gi i 1.2.1.1. Ngu n g c (-)-HCA (-)-HCA ñư c tìm th y trong v qu c a m t vài loài b a, bao g m tai chua (G. cowa), G. cambogia, G. indica, và G. atroViridis. Các loài này m c nhi u t i l c ñ a n ñ và phía tây Sri Lanka. 1.2.1.2. Hoá h c c a (-)-HCA S khám phá (-)-HCA: Kurian và Pandiya (1931); Screenivasan và Venkataraman (1959) nh m l n cho r ng acid trong qu G. cambogia là tartaric acid và citric acid. Lewis và c ng s (1964) ñã xác ñ nh chính xác acid trong qu G. cambogia là di- hydroxy tri-cacboxylic acid hay hydroxycitric acid.
6 COOH COOH HO C H H C OH HO C COOH HOOC C OH H C COOH H C COOH H H (-)-hydroxycitric acid (I) (+)-hydroxycitric acid (II) COOH COOH HO C H H C OH HOOC C OH HO C COOH H C COOH H C COOH H H (+)-allo-hydroxycitric acid (III) (-)-allo-hydroxycitric acid (IV) Hình 1.8. C u trúc ñ ng phân c a hydroxycitric acid Chi t tách: Lewis và Neelakantan (1965) ñã chi t tách (-)-HCA t v qu G. cambogia khô s d ng phương pháp chưng ninh trong n i áp su t (10 psi (lb/in.2) trong th i gian 15 phút v i dung môi nư c. Moffett và c ng s (1996) phát tri n chi t tách (-)-HCA b ng nư c, d ch chi t cho qua c t trao ñ i anion ñ h p th (-)- HCA, và nó ñư c r a v i natri/kali hiñroxit ñ thu (-)-HCA. Bhabani S. Jena và c ng s (2002) ñã ti n hành chi t acid trong v qu G. cowa b ng phương pháp chi t soxhlet v i dung môi axeton ho c metanol. Nh n xét: Các phương pháp chi t tách ñư c công b trên nguyên t c và r t chung, chưa có nghiên c u chi ti t quá trình chi t tách theo th i gian, t l dung môi (R/L), ho c các ñi u ki n chi t tách khác. V phương pháp chi t tách dùng hai phương pháp chính g m: Phương pháp chi t chưng ninh trong n i áp su t v i dung môi nư c và phương pháp chi t soxhlet v i dung môi h u cơ là axeton, metanol. Hoá h c l p th : HCA có 02 trung tâm b t ñ i; vì v y, có th t n t i 02 c p ñ ng phân l p th ho c 04 ñ ng phân khác nhau (Hình 1.8). Martius và Maue ñã t ng h p thành công 04 ñ ng phân l p th c a hydroxycitrate. Glusker và c ng s ñã báo cáo c u trúc và c u hình chính xác c a canxi hydroxycitrate và (-)-HCA lacton b ng
7 ch p X-quang tinh th . Stallings và c ng s báo cáo c u trúc tinh th mu i etylen di amin c p ñ ng phân l p th hydroxycitrate. Tính ch t c a (-)-HCA và lacton: Đương lư ng c a lacton s ch là 69, xác ñ nh b ng chu n ñ ki m ho c phân tích b ng mu i b c. C u trúc c a (-)-HCA lacton ñã ñư c ch ng minh b ng ph IR và 1 H-NMR. (-)- HCA lacton th hi n rõ d i sóng ph IR t i 3200, 1760, và 1680 cm-1. Quang ph 1 H-NMR c a (-)-HCA lacton cho th y 02 proton t i γ-cacbon, nó cho AB quartet t i δ 2,53 và δ 2,74 v i J = 17,1Hz, và 01 proton t i α-cacbon cho th y m t singlet t i δ 5,15. Đ nh lư ng (-)-HCA: Lowenstein và Brunengraber (1981) ñã xác ñ nh lư ng hydroxycitrate ch a trong qu G. cambogia b ng phương pháp s t ký khí. Jayaprakasha và Sakariah (1998, 2000, 2002) ñã phát tri n HPLC ñ xác ñ nh acid h u cơ trong qu c a G. cambogia, m u chi t thương m i c a G. cambogia, và lá, v qu c a G. indica. 1.2.1.3. Các mu i kim lo i c a (-)-HCA 1.2.1.3.1. Các lo i mu i kim lo i c a (-)-HCA Ibnusaud và c ng s ñã t o mu i natri hydroxycitrate b ng cách cho d ch chi t v qu G. cambogia tác d ng v i NaOH 800C. Singh và c ng s ñi u ch mu i canxi c a (-)-HCA. Ganga Raju ñã ñi u ch mu i canxi và kali c a (-)-HCA hay mu i hai kim lo i natri c a (-)-HCA và hi u qu c a nó như là nh ng ch t b sung ăn kiêng và nh ng s n ph m th c ăn ñ gi m cân n ng. 1.2.1.3.2. Nghiên c u t o mu i kali hydroxycitrate Majeed và c ng s ch ra m t cách th c m i ñ ñi u ch mu i HCK b n v ng và có ho t tính sinh h c. 1.2.1.3.4. Nghiên c u t o mu i canxi hydroxycitrate
8 Bhaskaran và Mehta ñã công b phương pháp hình thành mu i canxi và kali c a HCA và h n h p c a chúng. 1.2.1.3.5. M t s nghiên c u t o mu i kim lo i c a (-)-HCA khác Balasubramanyam và c ng s ñưa ra phương pháp t o thành c p mu i kim lo i hòa tan nhóm IA và IIA c a (-)-HCA. Gokaraju và c ng s công b d ng mu i hai kim lo i c a (-)-HCA v i các kim lo i nhóm II. Gokaraju và c ng s cũng công b công th c c a mu i ba kim lo i c a (-)-HCA. Samuel và c ng s ñã nghiên c u các mu i ph c t p ba, b n và năm kim lo i c a (-)-HCA, thành ph n c u t o và nh ng phương pháp t ng h p chúng, v i các mu i ch a ít nh t 3 kim lo i khác nhau ñư c l a ch n t k m, magie, natri, kali và canxi. Nh n xét: Các tài li u chuy n hoá ñã công b ñưa ra quy trình r t chung (quy trình nguyên t t) mà chưa ñưa ra các ñi u ki n ph n ng m t cách chi ti t. 1.2.1.4. Hoá sinh c a (-)-HCA S c ch c a enzyme chia tách mu i citrate b i (-)-HCA. Enzyme chia tách citrate, là ATP citrate lyase (ATP citrate oxaloaxetat lyase), xúc tác vi c chia tách ngo i ty th c a citrate thành oxaloaxetat và axetyl-CoA. Watson và c ng s ñã tìm th y s c ch m nh m c a ATP citrate oxaloaxetat lyase b i (-)-HCA là enzyme tinh ch t gan chu t. Cheema – Dhadli tìm th y s ch c a enzyme này c (-)-HCA t do (Ki = 8 µM) và lacton c a (-)-HCA (Ki = 50 – 100 µM). Sullivan và c ng s và Stallings và các c ng s ñã quan sát th y trong 4 ñ ng phân c a HCA thì (-)-HCA là ch t gây c ch ti m năng duy nh t c a ATP citrate lyase. 1.2.1.5. Tác d ng c a (-)-HCA và mu i kim lo i c a nó Clouatre và c ng s kh ng ñ nh các mu i Ca, Mg, K ho c Na c a (-)-HCA có hi u qu trong vi c tăng s chuy n hóa glucose
9 trong cơ th , gi m n ng ñ ñư ng cao trong máu c a b nh nhân b nh ti u ñư ng. Gokaraju và c ng s mô t vi c s d ng mu i canxi, k m c a (-)-HCA như là ngu n b sung dinh dư ng ăn u ng. Shrivastava và c ng s mô t dư c tính c a mu i Mg c a (-)-HCA trong ñi u tr b nh. Nh n xét: Trên ñây có nhi u công trình công b , nhưng chưa có công trình nào công b m t cách chi ti t v các tác d ng c a các d n xu t c a HCA trên ñ ng v t. Và cũng chưa có công trình nào nghiên c u ng d ng tr c ti p HCA trong t nhiên mà không c n ph i chuy n hoá. 1.2.2. K t qu nghiên c u trong nư c nư c ta có m t s công trình nghiên c u v chi t tách xanthon và các d n xu t phenol t m t s loài b a: b a Delpy; v cây b a c ng (Garcinia pedunculata); b a núi; v b a Lanessan, Nguy n Đình Hi p ñã nghiên c u Benzophenon có kh năng c ch các t bào ung thư t v trái b a nam (Garcinia cochinchinense). Năm 2004, Đ Th Tuyên và các c ng s ñã nghiên c u nh hư ng c a cao chi t t qu b a (Garcinia cambogia) lên các enzyme ch ng oxy hoá gan chu t b nhi m ñ c CCl4 mãn tính. Tuy nhiên, chưa có công trình nào nghiên c u các acid h u cơ t cây b a cũng như ng d ng c a nó. 1.2.3. Nh n xét chung Trên th gi i vi c nghiên c u cây b a ñã ñư c chú tr ng t lâu, tính ñ n nay ñã có hàng trăm công trình nghiên c u v cây b a bao g m các lĩnh v c chi t tách, xác ñ nh thành ph n hoá h c các h p ch t h u cơ, ng d ng trong công ngh th c ph m, công ngh dư c ph m, ñ c bi t là các lo i ch ph m gi m béo. Tuy nhiên, chưa có công trình nào công b v nghiên c u chuy n hoá HCA m t cách chi
10 ti t. Cho ñ n nay nư c ta chưa có m t nghiên c u nào mang tính cơ b n v thành ph n, tính ch t, kh năng chuy n hoá và ng d ng, công ngh khai thác v các h p ch t hoá h c có trong cây b a. Đây là nh ng v n ñ r t ñáng ñư c quan tâm nghiên c u nh m góp ph n quy ho ch, khai thác, ch bi n và ng d ng các s n ph m c a cây b a m t cách có hi u qu , khoa h c hơn. CHƯƠNG 2 - NGUYÊN LI U VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U 2.1. NGUYÊN LI U Lá, qu B a ñư c hái t xã Hoà Liên – h. Hoà Vang – TP. ĐN. 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U 2.2.1. Phương pháp v t lý Nguyên li u ñư c ki m tra ñ m, hàm lư ng tro b ng phương pháp tr ng lư ng. Các ch ph m HCCa, HCK sau chuy n hoá ñư c ki m tra b ng: ph h ng ngo i (IR); s c ký l ng cao áp; quang ph h p th nguyên t ; c ng hư ng t h t nhân; ño ñ quay c c; ph kh i lư ng. 2.2.2. Phương pháp hoá lý S d ng 03 phương pháp chi t tách ñ chi t tách HCA t lá, v qu b a g m: chi t chưng ninh trong n i áp su t; chi t soxlet và chi t b ng năng lư ng vi sóng. T ng lư ng acid trong d ch chi t ñư c xác ñ nh b ng phương pháp chu n ñ . Dùng phương pháp chuy n hoá ñ t o mu i kali và canxi c a (-)-HCA chi t tách t lá, v qu b a.
11 2.2.3. Phương pháp sinh h c Các ch ph m HCCa, HCK sau chuy n hoá ñư c ñánh giá kh năng ch ng béo phì b ng phương pháp th tác d ng dư c lý c a ch ph m trên chu t và ñư c ki m tra vi sinh v t b ng phương pháp phân tích vi sinh v t. CHƯƠNG 3 - K T QU VÀ TH O LU N 3.1. KH O SÁT NGUYÊN LI U B A 3.1.1. Đ nh danh cây b a vùng nguyên li u K t qu ñ nh danh cây b a t i x.Hoà Liên-h.Hoà Vang-TP. ĐN: Tên khoa h c: Garcinia oblongifolia Champ. Ex Benth. Tên latin khác: G. bonii Pitard. H : Clusiaceae (Guttiferae) - B a. 3.1.2. X lý nguyên li u Nguyên li u g m lá, qu b a ñư c thu hái t i x.Hoà Liên-h.Hoà Vang-TP. ĐN ñư c r a s ch, lo i b lá, qu hư h ng ñ chu n b cho các thí nghi m. 3.1.3. Xác ñ nh ñ m, hàm lư ng tro và kim lo i có trong nguyên li u lá, v qu b a 3.1.3.1. Xác ñ nh ñ m Đ m trong lá b a tươi trung bình là 70,90 %. Đ m trong v qu b a trung bình là 84,34 %. 3.1.3.2. Xác ñ nh hàm lư ng tro Hàm lư ng tro trong lá b a s y khô trung bình là 3,44 %. Hàm lư ng tro trong v qu b a khô trung bình là 1,42 %. 3.1.3.3. Xác ñ nh thành ph n kim lo i n ng K t qu phân tích thành ph n kim lo i n ng trong lá, v qu b a cho th y các ch tiêu kim lo i n ng ñ t tiêu chu n v sinh ñ i v i lương th c và th c ph m c a Vi t Nam và th gi i.
12 3.1.4. Kh o sát s ph thu c c a t ng lư ng acid, HCA, CA thu ñư c theo ñ tu i qu b a K t qu kh o sát t ng lư ng acid, HCA, citric acid trong 06 m u v qu b a theo ñ tu i t xanh non ñ n chín (03 – 09 tu n tu i). - Trong các m u ñã phân lo i t non ñ n già, m u qu b a ñ t 8 tu n tu i (qu chín) có t ng lư ng acid l n nh t (17,159%). - Lư ng HCA thu ñư c trong 6 m u tăng d n theo ñ tu i, trong ñó thu ñư c nhi u nh t 8 tu n tu i (15,22%). Lư ng citric acid thu ñư c trong 6 m u tăng d n r i gi m, trong ñó thu ñư c nhi u nh t 5 tu n tu i (0,74%). - T k t qu kh o sát cho th y t ng lư ng acid tăng t l thu n theo th i gian, lư ng citric acid trong v qu b a tu n th 3 ñ n tu n th 5 thì tăng sau ñó tu n th 6, 7, 8 thì gi m, còn lư ng HCA thì tăng theo th i gian như t ng lư ng acid. - T k t qu kh o sát trên, có th kh ng ñ nh th i ñi m thu ho ch qu b a ñ làm nguyên li u t t nh t là lúc b a chín (8 tu n tu i). 3.1.5. K t lu n 1 1. Tên khoa h c c a cây b a t i xã Hòa Liên, huy n Hòa Vang, TP. Đà N ng là Garcinia oblongifolia Champ. Ex Benth. thu c h Clusiaceae (Guttiferae) - B a. 2. Th i ñi m thu ho ch v qu b a ñ thu nh n lư ng acid h u cơ nói chung và HCA nói riêng l n nh t là lúc b a chín, kho ng 8 tu n tu i. 3. Hàm lư ng các kim lo i n ng trong lá và v qu b a vùng nguyên li u th p, ñ m b o tiêu chu n s d ng làm th c ph m. 3.2. NGHIÊN C U XÁC Đ NH ACID H U CƠ T LÁ, V QU B A
13 3.2.1. Sơ ñ quy trình chi t tách acid h u cơ t lá, v qu b a 3.2.2. Xác ñ nh t ng lư ng acid h u cơ b ng phương pháp chu n ñ acid-bazơ - T ng acid trong m u v qu b a khô chi t trong nư c là cao nh t (18,59%), acid tan t t nh t trong nư c, k ñ n là axeton (13,73%), metanol (10,49%). So sánh v i k t qu c a các loài ñã nghiên c u như Garcina cambogia (17-19,2%), Garcina india (12,48-15,1%), Garcina cowa (27,1%), k t qu chi t trong nư c c a v qu b a khô Vi t Nam cho k t qu trung bình. - T ng lư ng acid trong m u lá tươi chi t b ng nư c là 3,54%. So sánh v i k t qu c a các loài b a ñã nghiên c u như Garcina india (5,88-6,99%), Garcina cowa (4,457%), k t qu chi t trong nư c c a lá b a tươi cho k t qu th p. - V y, t ng lư ng acid chi t ñư c t v qu b a Vi t Nam b ng năng lư ng vi sóng cho cao nh t, ti p theo b ng n i áp su t, chi t soxhlet và cu i cùng là ngâm chi t. 3.2.3. Nghiên c u ñi u ki n s c kí và cách ti n hành xác ñ nh HCA b ng máy s c kí l ng cao áp (HPLC) 3.2.3.1. K t qu xây d ng ñư ng chu n Đư ng chu n ñư c xác ñ nh b ng cách thay ñ i n ng ñ c a 05 m u chu n, v i n ng ñ t 10 ñ n 320 ppm và phương trình ñư ng chu n xác ñ nh ñư c: C = 1,37A – 6,88 v i A: di n tích pic c a HCA, C: n ng ñ HCA, R2 = 0,9997. 3.2.3.2. K t qu xác ñ nh HCA trong d ch chi t v qu b a Chi t b ng dung môi nư c cho lư ng HCA là l n nh t, ti p ñ n là axeton và metanol. Giá tr thu ñư c ch y u c a phương pháp HPLC ñư c tính ñ n ch là HCA, b i vì giá tr thu ñư c t di n tích pic c a HCA l n nh t. So sánh v i các k t qu c a các tác gi nư c
14 ngoài thì hàm lư ng HCA trong v qu b a là khá cao (15,170- 15,270%), Garcina cambogia (16-18%), Garcina india (10,27- 12,74%), Garcina cowa (10,209-12,695%). K t qu trong lá b a tươi lư ng HCA cho k t qu trung bình (2,853-2,878%) so v i k t qu c a Garcina india (4,10-4,64%), Garcina cowa (1,672%) và không tìm th y lư ng citric acid. Đi u ki n s c ký ñ xác ñ nh HCA trên máy HPLC Merck Hitachi D7000: c t s c ký Lichrospher RP18 5µm x 4,6 mm x 250 mm; ñetectơ D7240 Autosampler D7200, pha ñ ng là dung d ch acid photphoric 0,1 % v i t c ñ dòng 1,0 ml/phút. Acid ch y u ñư c tìm th y trong lá, v qu b a b ng HPLC là HCA, ñư c th hi n trên s c ký ñ t i ph l c. Trên s c ký ñ , HCA cho pic ñơn trong t t c các m u chi t. Xác ñ nh pic HCA d a vào pic c a acid HCA chu n xu t hi n th i gian lưu là 3,802 phút. Th i gian lưu c a HCA ñư c tìm th y trong t t c các m u là 3,8 ± 0,14 phút. 3.2.4. K t lu n 2 T nh ng k t qu nghiên c u trên có th nh n xét sau: 1. Đã xác ñ nh ñư c t ng lư ng acid h u cơ và các acid h u cơ riêng bi t trong d ch chi t lá, v qu b a. HCA là acid h u cơ ch y u ñư c tìm th y trong d ch chi t trong lá, v qu b a. Lư ng HCA xác ñ nh ñư c t v qu b a Vi t Nam là khá cao (15,17-15,27%), cao hơn 02 loài b a c a n Đ là G. indica và G. cowa. 2. Thay ñ i các dung môi và các phương pháp chi t khác nhau, dung môi nư c cho lư ng HCA là cao nh t (15,28%), k ti p là axeton (12,99%), metanol (9,50%). Phương pháp chi t b ng năng lư ng vi sóng v i dung môi nư c cho lư ng HCA cao nh t (15,28%).
15 3.3. NGHÊN C U CÁC Y U T NH HƯ NG QUY TRÌNH CHI T ACID H U CƠ T LÁ, V QU B A 3.3.1. Chi t tách b ng năng lư ng vi sóng K t qu kh o sát quá trình chi t tách theo th i gian, c p ñ máy và t l r n l ng cho th y: th i gian chi t xu t hi u qu nh t là 25 phút; c p ñ máy thích h p là c p 2 (400W); t l r n l ng thích h p là kho ng 10 g ch t r n trên 150 ml dung môi. T ng lư ng acid và (- )- HCA chi t ñư c cao nh t trong ñi u ki n trên l n lư t là 18,59% và 15,28%. 3.3.2. Chi t tách b ng b chi t soxhlet v i dung môi axeton và metanol Chi t trong dung môi axeton cho k t qu t t hơn chi t trong dung môi metanol. Khi tăng th i gian chi t thì t ng lư ng acid tăng lên và v i th i gian chi t ñ t 8 gi cho k t qu cao nh t, n u ti p t c tăng th i gian chi t thì lư ng acid tăng không ñáng k , ho c không tăng. T ng lư ng acid thu ñư c khi s d ng dung môi axeton (13,71%), dung môi metanol (10,40%), v i th i gian chi t là 8 gi . 3.3.3. Chi t tách b ng n i áp su t v i dung môi nư c 3.3.3.1. K t qu chi t xu t acid trong lá b a: V i phương pháp chưng ninh lá b a tươi trong n i áp su t b ng dung môi nư c cho k t qu t t khi th i gian chi t là 1 gi và th tích dung môi chi t là 150 ml, t ng lư ng acid thu ñư c (2,258%). 3.3.3.2. K t qu chi t xu t acid trong v qu b a khô: V i phương pháp chưng ninh trong n i áp su t ñi u ki n 0 0,15MPa và nhi t ñ 127 C, th i gian chi t t i ưu là 90 phút và t l r n/l ng t i ưu là 10g/200ml nư c, t ng lư ng acid (17,16%). 3.3.4. K t lu n 3 1. Kh o sát 03 phương pháp chi t tách, k t qu phương pháp chi t s d ng năng lư ng vi sóng v i th i gian chi t ng n (25 phút)
16 nhưng cho k t qu HCA cao nh t (15,28%). Do th i gian chi t ng n nên phương pháp này ti t ki m năng lư ng, ñây là ưu ñi m n i b t c a phương pháp m i này so v i các phương pháp mà các tác gi nư c ngoài ñã công b . 2. Đi u ki n t i ưu ñ chi t HCA l n nh t b ng năng lư ng vi sóng là: th i gian chi t 25 phút, t l r n l ng 150ml nư c/10gam v qu b a khô, công su t lò vi sóng 400W. T ng lư ng acid h u cơ chi t ñư c là 18,59%, HCA là 15,28%. 3. Trong phương pháp chi t b ng chưng ninh trong n i áp su t các y u t v th i gian chi t, t l r n l ng ñ u nh hư ng ñ n hi u su t chi t t ng lư ng acid. 4. V i th i gian chi t là 8 gi , chi t v i dung môi metanol lư ng acid chi t ñư c 10,49%, chi t v i dung môi axeton lư ng acid chi t ñư c 13,71%. 3.4. NGHIÊN C U QUY TRÌNH CHUY N HOÁ T O MU I C A HCA 3.4.1. T o mu i kali c a HCA 3.4.1.1. Kh o sát nh hư ng c a lư ng KOH 40% ñ n quá trình chuy n hoá t o mu i kali c a HCA Đi u ki n chuy n hóa t o mu i kali cho s n ph m có th s y khô là s d ng 7,0–10,0ml KOH ñ m ñ c (40%)/d ch chi t 100g v qu b a, hàm lư ng HCK trong mu i ñi u ch xác ñ nh b ng HPLC là 77,021%. 3.4.1.2. Tinh ch mu i HCK R a tinh ch mu i HCK thô b ng cách: tăng t l c n t 60% ÷ 100% và nư c gi m 40% ÷ 0%. Hàm lư ng HCK trong mu i sau tinh ch xác ñ nh b ng HPLC là 99,221% (các k t qu ki m tra ch t lư ng, c u trúc HCK sau tinh ch th hi n m c 3.5).
17 3.4.1.3. Hi u su t t o mu i HCK Kh i lư ng mu i HCK d ng r n tinh th t o thành trung bình là 13,523g/100g m u, hi u su t t o mu i 85,06 – 87,02%. 3.4.2. T o mu i canxi c a HCA 3.4.2.1. Kh o sát nh hư ng c a pH ñ n quá trình chuy n hoá t o mu i canxi c a HCA D ch chi t sau khi làm s ch ñư c trung hoà acid b ng cách cho thêm dung d ch CaCl2. Dung d ch thu ñư c khu y tr n kho ng 30–120 phút. Khi thêm CaCl2 vào, lúc ñ u xu t hi n ít k t t a tr ng, sau xu t hi n ngày càng dày ñ c t o thành bùn, pH c a h n h p bùn thích h p t 9,5 ñ n 11. S d ng dung d ch NaOH ñ ch nh ñ pH. Ph n k t t a không tan là mu i HCCa, ph n mu i này ñư c s y khô trong t s y trong th i gian 24 gi , mu i HCCa có màu tr ng xám. 3.4.2.2. Hi u su t t o mu i Kh i lư ng mu i HCCa d ng r n t o thành trung bình là 11,207 g/100g m u, hi u su t t o mu i 83,97 – 88,83%. 3.4.3. K t lu n 3 1. Đã xác ñ nh ñư c ñi u ki n và quy trình t o mu i HCK, HCCa. Đi u ki n thích h p t o mu i HCK là 7,0 – 10,0ml KOH ñ m ñ c (40%)/ d ch chi t t 100g v qu b a khô và ñi u ki n thích h p t o mu i HCCa là pH t 9,5-11, pH ñư c ñi u ch nh b i dung d ch NaOH 10%. 2. H dung môi thích h p ñ tinh ch mu i HCK là h n h p c n/nư c, n ng ñ c n tăng t 60% ñ n c n tuy t ñ i. 3. Kh i lư ng mu i HCK d ng r n tinh th t o thành n ñ nh trung bình là 13,523g/100g m u, hi u su t t o mu i 85,06 – 87,02%. Kh i lư ng mu i HCCa d ng r n t o thành n ñ nh trung bình là
18 11,207 g/100g m u, hi u su t t o mu i 83,97 – 88,83%. 3.5. KI M TRA C U TRÚC, Đ TINH KHI T, HÀM LƯƠNG KIM LO I N NG VÀ VI SINH V T C A CH PH M MU I HCCa, HCK 3.5.1. Ki m tra s n ph m mu i HCK, HCCa b ng HPLC 1. Mu i HCK a b Hình 3.18. S c kí ñ HPLC c a s n ph m mu i HCK trư c (a) và sau tinh ch (b) K t qu ch y HPLC c a mu i HCK t o thành ta thu ñư c 04 pic v i th i gian lưu khác nhau (hình 3.18a), pic có th i gian lưu g n v i th i gian lưu c a HCA chu n cư ng ñ l n nh t, xu t hi n pic có th i gian lưu là 3,70 phút g n v i th i gian lưu c a HCA chu n là 3,77 phút và có di n tích l n nh t chi m 77,021%. Tuy nhiên, mu i HCK này còn l n nhi u t p ch t th hi n 03 pic còn l i ng v i th i gian lưu là 2,25; 2,82 và 7,11. Ta ti n hành tinh ch mu i HCK b ng cách r a v i h n h p c n nư c v i các t l khác nhau. K t qu các t p ch t gi m, pic có th i gian lưu 7,11 bi n m t ch còn 02 pic t p ch t có di n tích r t nh là pic có th i gian lưu 2,33 và 2,82 (hình 3.18b). Pic th hi n HCK có di n tích tăng và ñ t ñ tinh khi t 99,221%. Hàm lư ng mu i HCK t o ñư c có ñ tinh khi t cao so v i k t qu công b c a Majeed và các c ng s (92,840%), th i gian lưu trùng kh p nhau (3,722phút). 2. Mu i HCCa
19 K t qu ch y HPLC c a mu i HCCa t o thành ta thu ñư c 03 pic v i th i gian lưu khác nhau (hình 3.19a), pic có th i gian lưu g n v i th i gian lưu c a HCA chu n (xu t hi n pic có th i gian lưu là 3,73 phút g n v i th i gian lưu c a HCA chu n là 3,77 phút) cư ng ñ l n nh t và có di n tích l n nh t chi m 51,187%. Tuy nhiên, mu i HCCa này còn l n nhi u t p ch t th hi n 02 pic còn l i ng v i th i gian lưu là 2,23 và 2,78. Ta ti n hành tinh ch mu i HCCa b ng cách r a nhi u l n v i nư c c t. K t qu các t p ch t gi m, các pic t p ch t có di n tích r t nh là pic có th i gian lưu 2,19 và 2,79 (hình 3.19b). Pic th hi n HCCa có di n tích tăng và ñ t ñ tinh khi t 97,077%. a b Hình 3.19. S c kí ñ HPLC c a s n ph m mu i HCCa trư c (a) và sau tinh ch (b) 3.5.2. Ki m tra s n ph m mu i HCK, HCCa b ng ph IR K t qu ki m tra ph IR c a mu i HCK, HCCa và HCCa chu n v hình dáng tương t nhau (ph IR c a mu i HCCa và HCCa chu n ñ trùng l p 98,69%). Như v y, có th sơ b k t lu n nh ng mu i ñư c t o thành có c u trúc tương t v i HCCa chu n. B ng 3.25: K t qu ch p ph IR c a mu i HCK, HCCa Mu i HCCa Pic ñ c trưng Mu i HCK Mu i HCCa chu n Ph dao ñ ng nhóm -OH 3400,11 cm-1 3376,22 cm-1 3310 cm-1 Ph dao ñ ng nhóm -C=O 1599,04 cm-1 1592,53 cm-1 1582 cm-1
20 3.5.4. Ki m tra c u trúc mu i HCCa, HCK b ng ph c ng hư ng t h t nhân 1 COO Ca 1' OOC 1. Mu i HCCa HO C H HO 2 C 4 H 2' 4' 3 3' 13 HO C COO HO C COO Ph C-NMR c a mu i HCCa Ca 5 6 Ca 5' 6' Ha C COO Ha C COO chu n và HCCa ñi u ch ñư c th hi n Hb Hb 13 Hình 3.20. C u trúc mu i HCCa hình 3.21a, 3.21b. Ph C-NMR c a HCCa chu n hình 3.22a trên có 03 pic t i 39,920; 74,925; 77,716 k t qu tương ng c a methylene cacbon (C-5, 5’), methine cacbon (C-1, 1’) và cacbon b c 4 (C-3, 3’). Các pic t i 162,862; 163,158; 174,158 là c a cacbonyl cacbon (C-2, 2’; C-4, 4’ và C-6, 6’) c a 03 nhóm cacboxylat trong mu i HCCa chu n. Đ i v i ph 13C-NMR c a HCCa ñi u ch hình 3.21b trên có các pic tương t ph 13C- NMR c a HCCa chu n, c th có 03 pic t i 39,921; 75,048; 77,607 k t qu tương ng c a methylene cacbon (C-5, 5’), methine cacbon (C-1, 1’) và cacbon b c 4 (C-3, 3’). ph 13C-NMR c a HCCa ñi u ch ch xu t hi n 01 pic t i 162,527 là c a cacbonyl cacbon (C-2, 2’; C-4, 4’ và C-6, 6’). Đi u này có th gi i thích do ñ phân gi i c a máy và n ng ñ c a HCCa ñi u ch cao nên các pic 163,158 b trùng v i pic 162,527; và pic 174,158 có vùng nhô lên nhưng máy không báo k t qu . a bb 13 Hình 3.21. Ph C-NMR c a mu i HCCa 1 Ph H-NMR c a mu i HCCa chu n và HCCa ñi u ch ñư c th 1 hi n hình 3.22a, 3.22b. Tín hi u ph H-NMR c a proton methylen (Ha-5, 5’ và Hb-5, 5’) xu t hi n 2,95 và 3,02. Pic singlet t i 4,3 th hi n 1 proton c a nhóm methine (H-1 và H-1’). Ph H-NMR c a HCCa ñi u ch