Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu thu thập và lưu trữ nguồn gen của cây Thất diệp nhất chi hoa (Paris polyphylla Sm.)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

NÔNG LỆ THÙY

NGHIÊN CỨU THU THẬP VÀ LƢU TRỮ NGUỒN GEN CÂY THẤT DIỆP NHẤT CHI HOA (PARIS POLYPHYLLA SM.)

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 60.42.01.21

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. VŨ THỊ THU THỦY

THÁI NGUYÊN - 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung

thực và chưa được sử dụng để bảo vệ cho bất kỳ một học vị nào.

Tác giả

NÔNG LỆ THÙY

i

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Vũ Thị Thu Thủy đã tận tình

hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ để tôi hoàn thành công trình

nghiên cứu này.

Tôi xin chân thành cảm ơn GS.TS Chu Hoàng Mậu, Ban lãnh đạo

Trường Đại học sư phạm Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Sinh học và các

thầy cô giáo, cán bộ của Khoa, sự giúp đỡ tận tình của TS. Nguyễn Thị Thu

Ngà, KTV Trần Thị Hồng đã giúp tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này.

Tôi xin trân trọng cảm ơn sự hỗ trợ về kinh phí của đề tài NCKH cấp Bộ

có mã số - - -

Sinh họ - ủ trì.

Tôi xin cảm ơn sự động viên của gia đình, bạn bè trong suốt thời gian

học tập và hoàn thành luận văn.

Tác giả

ii

NÔNG LỆ THÙY

MỤC LỤC

Trang

Trang bìa phụ

Lời cam đoan ........................................................................................................ i

Lời cảm ơn ........................................................................................................... ii

Mục lục ............................................................................................................... iii

Danh mục các bảng .............................................................................................. v

MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1

1. Đặt vấn đề ........................................................................................................ 1

2. Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................ 2

3. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................... 2

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3

1.1. Đặc điểm chung về cây Thất diệp nhất chi hoa ............................................ 3

1.1.1. Nguồn gốc và phân loại ............................................................................. 3

1.1.2. Đặc điểm nông sinh học ............................................................................ 4

1.1.3. Thành phần hóa học và công dụng ............................................................ 5

1.1.4. Một số bài thuốc sử dụng cây Thất diệp nhất chi hoa ............................... 7

1.2. Một số phương pháp định danh thực vật ...................................................... 8

1.3. Một số phương phương pháp lưu trữ và bảo tồn giống cây trồng ................... 10

1.3.1 Bảo tồn nội vi( in – situ) ........................................................................... 11

1.3.2 Bảo tồn ngoại vi (Ex – situ) ...................................................................... 12

1.3.3 Bảo tồn giống bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro ......................................... 13

1.3.3.1 Cơ sở lý luận của phương pháp bảo quản và nhân giống in vitro ......... 13

1.3.3.2. Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy in vitro .............................................. 15

1.3.3.3. Các đường hướng trong nhân giống in vitro ........................................ 18

Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................... 22

2.1. Vật liệu nghiên cứu ..................................................................................... 22

iii

2.1.1. Vật liệu ..................................................................................................... 22

2.1.2. Hóa chất, thiết bị ...................................................................................... 22

2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................ 23

2.2.1. Phương pháp thu thập mẫu ...................................................................... 23

Thu thập mẫu cây Thất diệp nhất chi hoa trong tự nhiên, mô tả và chụp ảnh. ...... 23

2.2.2. Phương pháp bảo tồn cây Thất diệp nhất chi hoa tại Thái Nguyên ........ 23

2.2.3. Phương pháp phân lập gen rpoC1 ........................................................... 23

2.2.4. Phương pháp nuôi cấy in vitro ................................................................ 24

2.2.5. Phương pháp xử lí số liệu ........................................................................ 26

2.3. Địa điểm tiến hành thí nghiệm ................................................................... 26

Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN........................... 27

3.1. Kết quả thu thập mẫu cây Thất diệp nhất chi hoa tại một số tỉnh miền núi

phía Bắc của Việt Nam ...................................................................................... 27

3.1.1. Đặc điểm mẫu cây Thất diệp nhất chi hoa thu thập tại huyện Bình Gia-

Lạng Sơn ........................................................................................................... 27

3.1.2. Đặc điểm mẫu cây Thất diệp nhất chi hoa thu thập tại huyện Quản Bạ-

Hà Giang ............................................................................................................ 29

3.1.3. Đặc điểm mẫu cây Thất diệp nhất chi hoa thu thập tại huyện Sa Pa- Lào Cai 30

3.2. Kết quả phân tích gen rpoC1 của cây Thất diệp nhất chi hoa .................... 32

3.3. Kết quả nghiên cứu bảo tồn cây Thất diệp nhất chi hoa trồng tại tỉnh Thái Nguyên34

3.4. Kết quả bảo tồn cây Thất diệp nhất chi hoa in vitro ................................... 37

3.4.1. Kết quả khử trùng mẫu ............................................................................ 37

3.4.2. Kết quả thăm dò môi trường nảy mầm và phát sinh hình thái của các mẫu

nghiên cứu.......................................................................................................... 42

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................. 46

iv

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 47

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

2,4D 2,4 Dichlorphenoxyacetic acid

Cs Cộng sự

CT Công thức

ĐHST Điều hòa sinh trưởng

IBA Indole-3-buttyric acid

BAP 6-Benzylaminopurine

IAA Indole - 3 - acetic - acid

MS Murashige and Skoog

NAA 1-Naphthalene acetic acid

GA3 Gibberellic acid

DNA Deoxyribonucleic acid

RNA Ribonucleic acid

iv

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1. Mẫu cây thu được tại huyện Bình Gia - Lạng Sơn ........................... 27

Bảng 3.2. Số lượng mẫu Thất diệp nhất chi hoa thu tại Hà Giang .................... 29

Bảng 3.3. Số lượng mẫu Thất diệp nhất chi hoa thu tại Sa Pa .......................... 31

Bảng 3.4. Tên loài và mã số trình tự gen rpoC1 ............................................... 33

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của giá thể tới tỉ lệ sống của cây Thất diệp nhất chi hoa ..... 35

Bảng 3.6. Đặc điểm sinh trưởng của cây Thất diệp nhất chi hoa trong phòng

sinh trưởng tại Thái Nguyên. ............................................................................. 36

Bảng 3.7. Kết quả khử trùng hạt cây Thất diệp nhất chi hoa ............................ 38

Bảng 3.8. Kết quả khử trùng lá cây Thất diệp nhất chi hoa .............................. 40

Bảng 3.9. Kết quả khử trùng củ Thất diệp nhất chi hoa .................................... 41

v

Bảng 3.10. Ảnh hưởng của các chất ĐHST đến hệ số nảy mầm của củ ........... 44

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Hình thái cây Bảy lá một hoa ................................................................... 3

Hình 3.1. Cây Thất diệp nhất chi hoa tại Hồng Phong - Bình Gia - Lạng Sơn ........ 28

Hình 3.2. Mẫu cây Thất diệp nhất chi hoa tại xã Hội Hoan, huyện Bình Gia .. 28

Hình 3.3. Mẫu củ thu được tại Quản Bạ - Hà Giang ......................................... 29

Hình 3.4. Quả và hạt cây Thất diệp nhất chi hoa thu tại Hà Giang ................... 30

Hình 3.5. Cây Thất diệp nhất chi hoa tại Sa Pa ................................................. 31

Hình 3.6. Cây Thất diệp nhất chi hoa trong phòng sinh trưởng của cây in vitro

tại Thái Nguyên ................................................................................................. 37

Hình 3.7. Kết quả điện di sản phẩm nhân gen rpoC1 ....................................... 32

rpo ất diệp nhất chi hoa ..... 34

ệt Nam ............................................................................... 34

Hình 3.9. Mẫu hạt sạch cây Thất diệp nhất chi hoa cấy trên môi trường MS cơ bản .. 39

Hình 3.10. Mẫu sạch khử trùng củ Thất diệp nhất chi hoa ............................... 42

Hình 3.11. Ảnh hưởng của chất ĐHST đến sự phát sinh hình thái mô lá. ........ 43

Hình 3.12. Mẫu sạch từ củ cây Thất diệp nhất chi hoa trên môi trường MS có

bổ sung thêm các chất kích thích sinh trưởng ................................................... 44

Hình 3.13. Mẫu củ bật chồi có bổ sung BAP 0,5mg/l + Than hoạt tính ........... 45

vi

Hình 3.14. Mẫu củ bật chồi bổ sung BAP 0.5mg/l ........................................... 45

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề

Thất diệp nhất chi hoa có tên khoa học là Paris polyphylla Sm., hay còn

gọi là cây Bảy lá một hoa, độc cước liên, thiết đăng đài, chi hoa đầu, tảo hưu,

thảo hà xà…[9]. Chi Paris gồm 27 loài phân bố rộng khắp ở Châu Âu và Châu

Á trong đó tập trung nhiều nhất ở Trung Quốc. Chi Paris gồm các loài từ 03lá

đến 11 lá. Loài Paris Polyphylla có 13 giống [52].

Tại Việt Nam, cây Thất diệp nhất chi hoa được phát hiện tại các vùng núi

Cúc Phương (Ninh Bình), Sapa (Lào Cai), Đà Bắc (Hòa Bình), Hà Giang, Lạng

Sơn, Lai Châu… Cây Thất diệp nhất chi hoa được Pectelot phát hiện đầu tiên

vào năm 1934 tại Sapa với nhiều loài khác nhau [9]. Theo y học cổ truyền, cây

Thất diệp nhất chi hoa có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, trị rắn cắn, trị viêm

tuyến vú, trị sốt rét, trị ho lâu ngày [9]. Trong những năm gần đây, cây Thất

diệp nhất chi hoa còn được phát hiện có tác dụng diệt khuẩn, kháng viêm mạnh,

ức chế các virus, tăng cường chức năng của tuyến thượng thận, an thần, trấn

tĩnh, chống ho. Đặc biệt, cây có tác dụng ức chế tế bào ung thư phổi và ung thư

dạ dày, kéo dài tuổi thọ cho người bệnh [11], [42], [43], [46].

Với nhiều tác dụng chống lại bệnh nên cây Thất diệp nhất chi hoa đang là

đối tượng được thu mua và khai thác với số lượng lớn. Bên cạnh đó, nạn phá

rừng làm nương rẫy dẫn đến giảm khả năng tái sinh và phân bố của cây Thất

diệp nhất chi hoa trong tự nhiên bị thu hẹp.

Theo phân hạng về độ góc bảo tồn, cây Thất diệp nhất chi hoa được xếp

hạng EN A1 c,d, và cấp đánh giá ở mức hiếm (R). Cây cũng được khuyến cáo

khai thác, sử dụng hợp lí và cần thiết phải lưu giữ và bảo vệ nguồn gen [6].

Việc lưu giữ và bảo tồn giống cây trồng có thể được thực hiện bằng nhiều

cách khác nhau như: bảo tồn tại chỗ, bảo tồn chuyển chỗ và bảo tồn in vitro.

Công tác tái sinh và nhân giống vô tính cây Thất diệp nhất chi hoa đã được thực

1

hiện tại một số tỉnh miền núi phía bắc Việt Nam như: Hà Giang, Sơn La, Lai

Châu. Tuy nhiên, kết quả tái sinh cây chưa được như mong muốn.

Trên cơ sở đó chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu thu thập và lƣu

trữ nguồn gen của cây Thất diệp nhất chi hoa (Paris polyphylla Sm.) nhằm

bảo tồn nguồn gen và phục vụ cho công tác phục tráng giống sau này.

2. Mục tiêu nghiên cứu

Thu thập được một số cây Thất diệp nhất chi hoa ở một số miên núi phía

Bắc Việt Nam

Bước đầu sử dụng được kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu định

loại mẫu cây Thất diệp nhất chi hoa .

Lưu trữ được một số mẫu cấy Thất diệp nhất chi hoa trong phòng sinh

trưởng và nuôi cấy in vitro.

3. Nội dung nghiên cứu

Nghiên cứu đặc điểm và thu thập mẫu của Thất diệp nhất chi hoa ở một

số địa phương miền núi phía Bắc Việt Nam.

Phân lập và xác định trình tự nucleotit của gen rpoC1

Nghiên cứu một số chỉ tiêu sinh lý, sinh trưởng của cây Thất diệp nhất chi

hoa trong phòng sinh trưởng cây in vitro của phòng công nghệ tế bào tại trường

Đại học sư phạm Thái Nguyên.

2

Nghiên cứu bảo tồn cây Thất diệp nhất chi hoa bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro.

Chƣơng 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Đặc điểm chung về cây Thất diệp nhất chi hoa

1.1.1. Nguồn gốc và phân loại

Cây Thất diệp nhất chi hoa có tên khoa

học là Paris polyphylla Sm., hay còn gọi là

Bảy lá một hoa, độc cước liên, thiết đăng đài,

chi hoa đầu, tảo hưu, thảo hà xà [9].

Theo trung tâm dữ liệu thực vật

Việt Nam, cây Thất diệp nhất chi hoa

được phân loại thuộc giới thực vật; ngành

thực vật có hoa, mộc lan, hạt kín; lớp một

Hình 1.1. Hình thái cây Bảy lá một hoa [60]

lá mầm; bộ củ nâu; họ trọng lâu; chi Paris

[54]. Chi này gồm có 27 loài, loài Paris

Polyphylla gồm 13 giống có dị thảo từ 3 - 11 lá [52].

Cây Thất diệp nhất chi hoa được tìm thấy đầu tiên ở độ cao 1500 - 3000m

tại dãy núi Hymalaya (Ấn Độ) và được Smith miêu tả lần đầu vào năm 1813

[9]. Trên thế giới, cây phân bố ở Trung Quốc (bao gồm An Huy, Phúc Kiến,

Quảng Đông, Giang Tây, Tứ Xuyên...), Ấn Độ, Nepal và Myanma [25].

Tại Việt Nam, cây Thất diệp nhất chi hoa được tìm thấy ở các vùng núi

Cúc Phương (Ninh Bình), Sapa (Lào Cai), Đà Bắc (Hòa Bình), Hà Giang, Lạng

Sơn, Lai Châu… Cây Thất diệp nhất chi hoa được Pectelot phát hiện đầu tiên

vào năm 1934 tại Sapa với nhiều loài khác nhau [9]. Theo nghiên cứu của

Pectelot, ở nước ta ít nhất có 5 loài khác nhau, trong đó có 3 loài được mô tả

khá kĩ.

Loài thứ nhất có tên khoa học là Paris delavayi Franch. Cây của loài

Paris delavayi Franch có thân gầy, cao chừng 1m, cành lá khoảng 2/3 phía trên

thân. Lá dài chừng 20cm, rộng khoảng 3,5cm, có 3 gân xuất phát từ cuống lá,

3

gân giữa rõ hơn, gân hai bên chạy cách theo mép lá chừng 5mm. Cuống lá dài

khoảng 2cm, phiến lá hình mác dài, đầu lá và cuống lá nhọn. Cánh tràng hình

sợi. Lá đài nhỏ hơn lá thật, dài khoảng 4 - 4,5cm, rộng khoảng 8mm. Thường

thấy mọc ở độ cao khoảng 1.400m đến 1.800m, trong những rừng ẩm ở Sapa

(Lào Cai). Loài này ra hoa vào tháng 4, kết quả vào tháng 6 hoặc tháng 7 [9].

Loài thứ 2 có tên khoa học Paris hainanensis. Loài này có thân cây to,

cao chừng 0,80m. Lá tập trung thành vành, gồm 6 lá, ở vào khoảng 2/3 ở phía

trên thân. Lá dài khoảng 20cm, rộng khoảng 12cm. Đầu lá nhọn, hình ba cạnh

dài 1cm. Cuống lá dài tới 7cm, phiến lá hình trứng rộng, hơi không đối xứng.

Lá đài khoảng 5cm, rộng khoảng 2cm. Cánh tràng hình sợi, dài gấp 2 lần lá đài.

Loài Paris hainanensis ra hoa vào tháng 4, đậu quả vào tháng 6, loài này hay

gặp hơn ở những vùng rừng ẩm, thấp quanh Sapa, độ cao chừng 1500m [9].

Loài thứ 3 được gọi là Paris fargessi Franch. Thân của loài này cao

chừng 1m đến 1,3m. Vành lá cũng ở khoảng 2/3 phía trên thân, gồm 5 lá. Cuống

lá dài khoảng 5 - 5,5cm, phiến lá hình bầu dục, phía cuống hình tim, đầu lá

nhọn, lá có 5 gân. Lá đài hình mác, dài khoảng 6cm, rộng khoảng 1,2cm. Cánh

tràng hình sợi, ngắn hơn lá đài. Cây ra hoa vào tháng 4, kết quả vào tháng 6. So

với các loài trên, loài Paris fargessi Franch hiếm hơn [9].

Trong số 2 loài Paris chưa xác định được tên, có một loại cao tới 2,5m.

Petelot phát hiện thấy 2 cây nhỏ trên đường từ Sapa (Lào Cai) đến Bình lư (Tam

Đường – Lai Châu) [9]. Loại thứ 2 được phát hiện ở độ cao 400m vùng núi Ba

Vì (Hòa Bình) và trên bờ suối có nhiều bóng rợp, khoảng giữa từ Hà Nội đến

Hòa Bình [9].

1.1.2. Đặc điểm nông sinh học

Cây Thất diệp nhất chi hoa là một loại cây nhỏ, sống lâu năm. Cây

thường mọc hoang ở những khe núi ẩm ướt, có độ cao trên 600m và ưa bóng,

hoặc dọc theo các bờ khe suối, trên đất ẩm nhiều mùn. Phần thân trên mặt

4

đất, lụi hàng năm vào cuối thu. Thân rễ mang 1 - 2 chồi ngủ tồn tại qua mùa

đông và mọc lại vào giữa mùa xuân năm sau. Trong tự nhiên, thường chỉ

những cây lớn có chiều dài thân rễ trên 5cm mới thấy có hoa, quả [25].

Cây Thất diệp nhất chi hoa ưa nơi có khí hậu mát, ít gió, nhưng không chịu

được úng. Cây chưa được trồng trên quy mô lớn mà chỉ ở phạm vi các vườn cây

thuốc tại một số địa phương theo phương thức nhân giống bằng hạt hoặc bằng thân

rễ. Theo đó, hàng năm vào khoảng tháng 10 - 11, người ta thu quả chín, đem gieo

trong vườn ươm hoặc phơi khô để đến mùa xuân năm sau mới reo. Mỗi cây chỉ có

một hoa, mỗi hoa chỉ có ít hạt nên hệ số nhân giống bằng hạt không cao. Thân rễ

Thất diệp nhất chi hoa có nhiều đốt chứa mắt ngủ, có thể tách từng đoạn để trồng.

Thời vụ trồng chủ yếu là mùa xuân và mùa thu [25].

Theo Đỗ Tất Lợi, ở Việt Nam cây Thất diệp nhất chi hoa được mô tả là

những cây có thân rễ ngắn, dài chừng 5 - 15cm, đường kính 2,5 - 5cm rất nhiều

đốt, khó bẻ, vết bẻ trông như có bột, màu vàng trắng hay xám vàng. Từ thân rễ

nổi lên mặt đất một thân mọc thẳng đứng cao tới 1m, phía gốc có một số lá

thoái hóa thành vẩy, bao lấy thân. Giữa thân có một tầng lá mọc vòng, gồm 3-10

lá, nhưng thường là 7 lá. Cuống lá dài 2,5 - 3cm, phiến lá hình mác rộng, dài

15- 21cm, rộng 4 - 8cm. Đầu phiến lá nhọn, mép lá nguyên, hai mặt lá nhẵn,

mặt dưới màu xanh nhạt, đôi khi có màu tím nhạt. Hoa mọc đơn độc ở đỉnh

cành, cuống hoa dài 15 - 30cm. Số cánh tràng bằng số lá đài, hình sợi rủ xuống,

màu vàng nâu. Chiều dài của cánh tràng bằng hay ngắn hơn chiều dài của lá đài.

Nhụy màu đỏ tím, bầu thường gồm 3 ngăn. Quả mọng, màu tím đen. Ở Sapa,

cây ra hoa vào các tháng 3, 4, 5 và tạo quả vào các tháng 10 - 11 [9].

Người ta thường dùng thân rễ với tên Tảo hưu. Có thể thu hái Tảo hưu

quanh năm, nhưng tốt nhất là vào thu đông, tảo hưu được đào về rửa sạch và

phơi khô [9].

1.1.3. Thành phần hóa học và công dụng

Bộ phận làm thuốc của cây Thất diệp nhất chi hoa là thân rễ. Theo

đông y, Tảo hưu có vị ngọt, hơi cay, tính bình, không độc. Tác dụng chủ yếu

5

của Tảo hưu là thanh nhiệt, giải độc, điều trị rắn độc cắn, trị viêm tuyến vú,

trị sốt rét, trị ho lao, trị ho lâu ngày, trị hen xuyễn... Nếu dùng ngoài da thì

đắp lên những nơi sưng đau [9].

Các công trình nghiên cứu y học hiện đại đã tìm thấy trong cây Thất diệp

nhất chi hoa có chất glicozit. Đặc biệt loại glucozit có lợi cho sức khỏe được kể

đến như tinh chất saponin (gọi là paridin C16H28O7) và tinh chất paristaphin

(C38H64O18) [9], [32].

Ở Nepal, Devkota (2005) đã cô lập được 6 hợp chất từ Paris polyphylla.

Các hợp chất là: przewalskinone B, polyphyllin C, polyphyllin D, saponin-1,

stigmasterol và stigmasterol-3-O-P-D-glucoside [33]. Theo đó, nghiên cứu của

Lee và cộng sự (2005), hợp chất polyphylin D của cây Thất diệp nhất chi hoa có

thể được sử dụng trong điều trị ung thư vú [40]. Một số nghiên cứu khác cũng

cho thấy, các hợp chất saponin của cây Thất diệp nhất chi hoa gây ức chế sự

tăng trưởng của khối u của bệnh ung thư phổi trên chuột thử nghiệm và gây độc

đối với các dòng tế bào ung thư của người như dòng tế bào ung thư dạ dày [41],

hay các dòng tế bào ung thư phổi A549 [42]. Dòng tế bào ung thư đại tràng

(LoVo và W-116), dòng tế bào ung thư thực quản (ECA 109) hay các bệnh ung

thư đường tiêu hóa nói chung [50].

Năm 2008, Deng và cộng sự đã đánh giá hoạt tính kháng nấm của

saponin từ cây Thất diệp nhất chi hoa với Cladosporium cladosporioides và loài

Candida. Kết quả cho thấy, saponin có hoạt tính kháng nấm. Hoạt tính này được

đem so sánh với một số thuốc thương mại, từ đó đưa ra một giải pháp thay thế

hữu hiệu cho các loại thuốc tổng hợp [32].

Năm 2005, Wang đã nghiên cứu thấy 2 hợp chất steroid là dioscin và

polyphyllin D có tiềm năng là tác nhân chống lại ký sinh trùng Dactylogyrus [50].

Năm 2012, Li và cộng sự đã phân lập được bốn hợp chất saponin steroid

mới đó là parisyunnanasides G-J và 3 hợp chất đặc biết của Paris polyphylla

6

var. Yunnanensis là padelaoside B, pinnatasterone, và 20-hydroxyecdyson. Tất

cả các hợp chất trên được đánh giá có khả năng gây độc chống lại tế bào ung

thư bạch cầu CCRF của người [41].

Ngoài ra, cây Thất diệp nhất chi hoa còn có tác dụng trong điều trị các rối

loạn về da liễu [9], hoạt động co cơ tử cung trên chuột thí nghiệm [36], hoạt

động diệt tinh trùng có hiệu quả ở chuột, thỏ và người. Vì vậy, có thể sử dụng

làm thuốc tránh thai [9]. Wang (2005) cho rằng Paris polyphylla var yunanensis

ở dạng thô có thời gian làm đông máu nhanh hơn so với Paris polyphylla

chinensis và chứng tỏ thành phần saponin 6 (một nhóm pennogennin) trong

những loài này là thành phần chính trong thuốc dùng để cầm máu [50].

1.1.4. Một số bài thuốc sử dụng cây Thất diệp nhất chi hoa

Hiệu quả làm thuốc của cây Thất diệp nhất chi hoa đã được thực hiện với

nhiều bài thuốc quý được sử dụng trong dân gian để chữa rắn cắn, ho hen... Sau

đây xin giới thiệu một số bài thuốc hay bằng cách sử dụng cây Thất diệp nhất

chi hoa để điều trị như:

* Chữa rắn độc cắn: Dùng 6g bột cây Thất diệp nhất chi hoa sắc uống 1

lần và uống 2 đến 3 lần trong một ngày. Hoặc có thể sắc 20g cây Thất diệp nhất

chi hoa lấy nước uống trong ngày. Nếu dùng thân rễ tươi thì giã nát, sau đó trộn

với rượu trắng đắp vào chỗ bị rắn cắn, cách chữa này không kể liều lượng [59].

* Chữa sốt cao co giật, quai bị, sởi: Trộn 4g bột khô của cây Thất diệp

nhất chi hoa với 12g bạc hà và 8g thiên hoa phấn sắc lấy nước uống. Chia làm 3

lần uống trong ngày sẽ chữa được sốt cai, co giật, quai bị, sởi.

* Chữa trẻ nhỏ kinh sài, chân tay co giật: Dùng bột Thất diệp nhất chi

hoa để uống, uống 4-5 lần/ ngày, mỗi lần 0,5 - 1g [59].

* Chữa lòi dom: Mài củ cây Thất diệp nhất chi hoa trộn với dấm rồi bôi

trực tiếp nước thuốc vào hậu môn, sau đó dùng gạc băng lại. Ngày làm 2 - 3 lần

7

sẽ khỏi bệnh lòi dom [59].

* Chữa ho, hen suyễn lâu ngày: Sắc 15g Thất diệp nhất chi hoa lấy

nước uống; hoặc hầm với thịt gà hay phổi lợn để ăn [59].

* Chữa các loại mụn độc sƣng thũng: Thất diệp nhất chi hoa trộn với

dấm, giã nát, đắp lên chỗ sưng đau. Làm đến khi khỏi bệnh [59].

1.2. Một số phƣơng pháp định danh thực vật

Việt Nam là đất nước có hệ sinh thái đa dạng, ở đó số loài thực vật cũng

vô cùng phong phú. Để mô tả, xếp loại hay định tên cho thực vật người ta phải

dùng nhiều phương pháp phân loại khác nhau. Có 2 nhóm phương pháp chủ yếu

đó là phương pháp truyền thống và phương pháp phân loại phân tử. Các phương

pháp truyền thống cần phải kể đến như: hình thái so sánh, giải phẫu so sánh, cổ

thực vật học, hóa sinh học...

Sử dụng phương pháp hình thái so sánh, người nghiên cứu sẽ dựa vào đặc

điểm hình thái, nhất là hình thái cơ quan sinh sản. Những thực vật càng gần

nhau thì càng có nhiều đặc điểm hình thái giống nhau. Hiện nay, ngoài những

đặc điểm hình thái bên ngoài, người ta còn dùng cả những đặc điểm vi hình thái

(micromorphologie), tức là hình thái cấu trúc của tế bào, của mô, kể cả cấu trúc

siêu hiển vi, để phân loại [61].

Với phương pháp giải phẫu so sánh, đây là phương pháp chính xác và

khách quan cho phép xác lập mối quan hệ thân cận không những của các nhóm

lớn (như lớp, bộ, họ) mà còn cả các nhóm nhỏ (giống, loài...) và quan hệ chủng

loại. Ví dụ: cây 2 lá mầm phân biệt với cây 1 lá mầm bởi cấu tạo và sự sắp xếp

của mô dẫn truyền trong thân. Phương pháp này bổ sung thêm cho phương pháp

hình thái so sánh [61].

Phân loại theo phương pháp cổ thực vật học, người nghiên cứu dựa vào

các mẫu hóa đá của thực vật để tìm quan hệ thân thuộc, tìm nguồn gốc của các

nhóm thực vật [57].

Những nghiên cứu về bào tử và phấn hoa, đặc biệt di tích của phấn

8

hoa trong các thời đại địa chất đã giúp xác định thành công quan hệ họ

hàng của một số thực vật và góp phần vào việc xây dựng hệ thống chủng

loại phát sinh [61].

Theo phương pháp hóa sinh học, các loài gần nhau thường chứa những

hợp chất hoá học giống nhau. Ví dụ, các loài thuốc lá chứa nicotin, các loài họ

Hoa môi chứa tinh dầu... Phương pháp này có ý nghĩa thực tiễn rất lớn, nó cho

ta hướng tìm những hợp chất cần thiết trong các loài gần gũi nhau [61].

Phương pháp phát triển cá thể, dựa trên cơ sở của qui luật phát triển cá

thể: Trong quá trình phát triển, mỗi cá thể đều lặp lại những giai đoạn (những

hình thức) chủ yếu mà tổ tiên nó đã trải qua. Theo dõi quá trình phát triển lịch

sử của cây để xét đoán quan hệ nguồn gốc của nó [61].

Ngày nay, khoa học hiện đại ngày càng phát triển, các phương tiện

nghiên cứu về định loại sinh vật khá nhanh chóng và chính xác nhờ phương

pháp phân loại học phân tử. Theo đó, phân loại học phân tử là phương pháp

phân loại sinh vật ở mức độ phân tử thông qua các dẫn liệu so sánh hóa sinh của

các phân tử lớn như DNA, RNA, protein [56].

Hiện nay, phân loại sinh học phân tử đã và đang trở thành khoa học mũi

nhọn trong phân loại học, bổ sung cho phân loại học truyền thống những

phương pháp nghiên cứu mới và đặc biệt phân loại hoàn toàn khác với những

phân loại đã dùng trước đây. Một số phương pháp thường dùng hiện nay như:

so sánh hàm lượng và thành phần protein, so sánh trình tự gen lục lạp, trình tự

rRNA... [56].

Đa số hệ gen lục lạp thường tồn tại ở dạng vòng kép, lớn. Hệ gen lục lạp

chỉ chứa khoảng 100 gen, đặc biệt với thực vật ở cạn các gen gần như là giống

nhau, chúng mã hóa cho 4 loại RNA ribosom, 30 - 31 tRNA, 21 loại protein

ribosom và 4 tiểu đơn vị của RNA polymerase [49].

Hệ gen lục lạp có một phần nhỏ chứa những đoạn trình tự bảo thủ, khó

bị đột biến, và gần như không biến đổi trong quá trình tiến hóa. Do vậy,

nhiều nhà khoa học đã sử dụng các đoạn gen này ở các loại thực vật khác

9

nhau để làm chỉ thị định danh thực vật. Các vùng gen trong hệ gen lục lạp

được sử dụng trong công nghệ mã vạch DNA hiện nay như atpF-atpH,

gen matK, gen rbcL, gen rpoC1, vùng xen psbK-psbI, vùng xen trnH-psbA

và vùng gen nhân ITSAB [49].

rpoC1 là một gen mã hóa cho tiểu phần của

Gen rpoC1 rất bảo thủ mức độ đột biến trong trình tự nucleotit của gen có

thể phân biệt được loài này với loài kia, hay xác định được quan hệ họ hàng với

các loại nghiên cứu. Theo Kwon - Lee KH và cs (2010) cho rằng gen rpoC1 có

thể là một marker quan trọng để phân biệt nhân sâm trồng và nhân sâm hoang

dại [39]. Phân tích trình tự gen rpoC1 cho phép xác định sự khác biệt giữa các

chủng C. Raciborskii [37]. Trên GenBank hiện nay đã có 10 trình tự gen rpoC1

của lúa [56].

Ở cây Thất diệp nhất chi hoa các công trình nghiên cứu về gen rpoC1

công bố còn khá hạn chế. Theo Do và cs (2014) phân lập gen rpoC1 từ DNA

của chi Paris polyphylla thu được gen có kích thước 2784bp trong đó gồm 2

exon và 1 intron [30]. Theo Zhu và cs phân lập gen rpoC1 của chi Paris công

bố trên ngân hàng gen Bank có mã số GU178917 đến GU178922. Đều thu được

gen có kích thước giống nhau dài 487bp trong đó chứa 1 intron từ DNA nhằm

xác định loài của 10 loại paris đã lấy mẫu nghiên cứu [64].

Theo tổ chức Hệ thống dữ liệu mã vạch của sự sống (The Barcode of

Life Data - viết tắt là BOLD) để tăng hiệu quả giám định loài cần kết hợp kết

quả của nhiều vùng gen trong đó có gen rpoC1. Ví dụ, như tổ hợp gen rpoC1

kết hợp với gen rpoB và gen matK hay sự kết hợp của rpoC1 với gen matK

và gen trnH-psbA; một tổ hợp khác là sự kết hợp của 5 gen bao gồm rbcL,

trnH, atpF-H, psbK-I, và gen matK cũng đã được thực hiện [62].

1.3. Một số phƣơng phƣơng pháp lƣu trữ và bảo tồn giống cây trồng

Nằm ở vùng Đông Nam châu Á với diện tích khoảng 330.541 km2, Việt

Nam là một trong 16 nước có tính đa dạng sinh học cao trên thế giới. nguồn tài

10

nguyên đa dạng sinh học trong các ngành Nông nghiệp, Lâm nghiệp, Thủy sản

hàng năm cung cấp cho đất nước khoảng 2 tỷ đô la [9]. Nguồn tài nguyên

thiên nhiên quý giá về sinh giới này, có thể đáp ứng những nhu cầu hiện tại và

tương lai của chúng ta trong quá trình phát triển về kinh tế, y tế... Tuy nhiên

thay vì bảo tồn nguồn tài nguyên này, thì trong thực tế hoạt động khai thác quá

mức và bừa bãi nguồn tài nguyên quý giá này. Nhiều loài hiện đã trở nên

hiếm, một số loài đang có nguy cơ bị diệt vong. Hiện nay, nguồn tài nguyên

này đang suy thoái nhanh chóng [12]. Nhiều báo cáo đã ghi nhận sự biến mất

của các loài thực vật bị đe dọa ở Việt Nam trong đó có những loài cây thuốc

quý có tên trong sách đỏ do tình trạng khai thác không có kế hoạch. Khi các

loài thực vật biến mất khỏi tự nhiên, đó là sự ra đi vĩnh viễn và nguồn gen

không thể tái tạo được [6].

Theo số liệu điều tra của Viện Dược liệu năm 2000, Việt Nam có tới

3.800 cây thuốc thuộc khoảng 270 họ thực vật. Các loài cây thuốc phân bổ khắp

các vùng sinh thái ở Việt Nam. Trong số đó, phần lớn các cây thuốc là mọc tự

nhiên và khoảng 20% đã được gieo trồng. Từ năm 1988, công tác bảo tồn nguồn

gen cây thuốc đã được triển khai. Tuy vậy, trong số 848 loài cây thuốc được xác

định cần bảo tồn mới chỉ có 120 loài, dưới loài được bảo tồn trong các vùng và

các cơ sở nghiên cứu

Để ngăn ngừa sự suy thoái đa dạng sinh học, Việt Nam đã tiến hành công

tác bảo tồn đa dạng sinh học khá sớm. Hai hình thức bảo tồn đa dạng sinh học

phổ biến được áp dụng ở Việt Nam là: Bảo tồn nội vi hay nguyên vị (Insitu

conservation) và bảo tồn ngoại vi hay chuyển vị (Exsitu conservation).

1.3.1 Bảo tồn nội vi( in – situ)

Bảo tồn nội vi bao gồm các phương pháp và công cụ nhằm mục đích bảo

vệ các loài, các chủng và các sinh cảnh, các hệ sinh thái trong điều kiện tự

nhiên. Tuỳ theo đối tượng bảo tồn để áp dụng các hình thức quản lý thích hợp.

Thông thường bảo tồn nguyên vị được thực hiện bằng cách thành lập các khu

11

bảo tồn và đề xuất các biện pháp quản lý phù hợp.

Bảo tồn tại chỗ hay bảo tồn nội vi (Insitu conservation) là hình thức bảo

tồn nguồn gen tại vùng chúng được trồng, được tồn tại trong điều kiện sinh thái

tự nhiên, có thể bảo tồn trong trang trại, bảo tồn trong vườn gia đình hoặc xây

dựng các vườn quốc gia [12].

Bảo tồn nội vi là hình thức chủ yếu ở Việt Nam, phương pháp này thể

hiện rõ rệt nhất là đã xây dựng và đưa vào hoạt động hệ thống một hệ thống

rừng đặc dụng. Theo số liệu thống kê đến 10/2006 – Cục kiểm lâm và viện điều

tra quy hoạch rừng có 128 khu bảo tồn rừng. Trong đó, có 30 Vườn quốc gia

(VQG), 48 Khu dữ trữ thiên nhiên, 12 khu bảo tồn loài và sinh cảnh, 38 khu bảo

vệ cảnh quan, với tổng diện tích 2.400.092 ha, chiếm gần 7,24% diện tích tự

nhiên trên đất liền của cả nước. Như Khu bảo tồn vườn quốc gia Cúc Phương là

khu bảo tồn được thành lập đầu tiên ở miền bắc, vườn quốc gia Ba Bể (Bắc

Cạn), vườn quốc gia Hoàng Liên (Lào Cai)... Tuy nhiên, sự đa dạng di truyền

vẫn bị đe dọa [12]

1.3.2 Bảo tồn ngoại vi (Ex – situ)

Bảo tồn ngoại vi hay bảo tồn chuyển chỗ (ex-situ consertion) là một trong

những biện pháp quan trọng và có hiệu quả trong bảo tồn và phát triển đa dạng

sinh học.

Bảo tồn ngoại vi bao gồm các vườn thực vật, vườn động vật, các bể nuôi

thuỷ hải sản, các bộ sưu tập vi sinh vật, các bảo tàng, các ngân hàng hạt giống,

bộ sưu tập các chất mầm, mô cấy... Các biện pháp gồm di dời các loài cây, con

và các vi sinh vật ra khỏi môi trường sống thiên nhiên của chúng. Mục đích của

việc di dời này là để nhân giống, lưu giữ, nhân nuôi vô tính hay cứu hộ trong

trường hợp: Nơi sinh sống bị suy thoái hay huỷ hoại không thể lưu giữ lâu hơn

các loài nói trên, Dùng để làm vật liệu cho nghiên cứu, thực nghiệm và phát

triển sản phẩm mới, để nâng cao kiến thức cho cộng đồng.

Kỹ thuật bảo quản nguồn gen thực vật in vitro là một trong các phương

12

pháp bảo quản nguồn gen có vai trò quan trọng và là một bước tiến bộ vượt bậc

của khoa học kỹ thuật trong công tác nhân giống cây trồng. Bảo quản in vitro

chỉ thực hiện trong không gian hẹp nhưng có thể lưu giữ được khối lượng lớn cá

thể, điều kiện bảo quản hoàn toàn chủ động và là biện pháp hiệu quả đối với cây

trồng nhân giống vô tính [12].

1.3.3 Bảo tồn giống bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro

Bảo tồn giống bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro từ lâu đã thành công trên

nhiều đối tượng cây trồng, đặc biệt kỹ thuật này có nhiều đặc tính ưu việt mà

các loại hình khác không có được như: Có khả năng bảo quản giống đơn giản,

cây có tỷ lệ phục tráng cao, tạo ra số lượng đồng đều không hạn chế, tiết kiệm

chi phí và nâng cao hiệu quả kinh tế.

1.3.3.1 Cơ sở lý luận của phương pháp bảo quản và nhân giống in vitro

Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô, tế bào in vitro là học thuyết

về tính toàn năng của tế bào. Theo Haberland.G, nhà thực vật học người Đức,

tất cả các tế bào của cây đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền của cơ thể,

khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đó đều có khả năng tái sinh và phát triển

thành cá thể hoàn chỉnh [35].

Thực tế đã chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn

chỉnh từ một tế bào riêng rẽ. Hàng trăm loài cây trồng đã được nhân giống trên

quy mô thương mại bằng cách nuôi cấy trong môi trường nhân tạo vô trùng và

tái sinh chúng thành cây với hệ số nhân giống vô cùng lớn [1]. Morel là người

đầu tiên đã thành công trong việc tái sinh và nhân nhanh giống lan quý

Cymbidium bằng phương pháp này [47]. Trong một thời gian ngắn người ta có

thể thu được hàng triệu cá thể. Nhờ vậy, mà hoa Cymbidium vốn đắt tiền đã có

giá thành hạ hơn và đáp ứng được nhu cầu tiêu dùng của nhiều người. Ở Thái

Lan, 90% hoa lan thương mại được nhân bằng phương pháp nuôi cấy in vitro.

Thành công đối với họ Orchidaceae không những chỉ là bằng chứng mà còn mở

đường cho việc ứng dụng kỹ thuật này đối với các loài cây khác như cây ăn quả,

13

cây lương thực, cây lâm nghiệp, cây thuốc, cây cảnh... Ở nhiều nước trên thế

giới như Nhật Bản, Trung Quốc, Mỹ, đặc biệt ở Hà Lan đã sử dụng phương pháp này để nhân giống cúc cho hệ số nhân giống cao từ 410-1010/năm [8]. Các

lĩnh vực ứng dụng khác trong kỹ thuật in vitro cũng mang lại nhiều kết quả

trong việc cải tạo và phục tráng giống cây trồng.

Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy in vitro thực vật thực chất là

kết quả của các quá trình phân hoá và phản phân hoá. Tất cả các tế bào trong các

cơ quan khác nhau của cơ thể thực vật trưởng thành đều bắt nguồn từ tế bào phôi

sinh. Sự chuyển tế bào phôi sinh thành các tế bào chuyên hoá để đảm nhiệm các

chức năng khác nhau được gọi là sự phân hoá tế bào. Còn quá trình phản phân

hoá thì ngược lại với qúa trình phân hoá, có nghĩa là tế bào đã phân hoá thành mô

chức năng không hoàn toàn mất đi khả năng phân chia mà ở điều kiện thích hợp,

chúng có thể trở về dạng phôi sinh và tái phân chia [1].

Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật để thành công cần đảm bảo 3 yếu tố chính:

Thứ nhất, bảo đảm điều kiện vô trùng. Môi trường để nuôi cấy mô và tế

bào thực vật có chứa đường, vitamin, muối khoáng... rất thích hợp cho các loại

nấm và vi khuẩn phát triển. Do tốc độ phân bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn rất

nhiều so với tế bào thực vật, nếu trong môi trường nuôi cấy chỉ nhiễm một vài

bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì sau vài ngày đến một tuần, toàn bộ bề mặt môi

trường và mô nuôi cấy sẽ phủ đầy một hoặc nhiều loại nấm và vi khuẩn. Nên thí

nghiệm phải bỏ đi và trong điều kiện này mô nuôi cấy sẽ không phát triển và chết

dần. Chính vì vậy, vô trùng tuyệt đối là điều kiện cần thiết đầu tiên để thành công

trong nuôi cấy mô tế bào thực vật [5].

Thứ hai, chọn đúng môi trường và chuẩn bị môi trường đúng cách. Trong

hàng trăm loại môi trường do nhiều tác giả đề nghị cho nhiều loại cây và nhiều

mục đích nuôi cấy khác nhau, về cơ bản có thể chia làm 3 loại, môi trường nghèo

dinh dưỡng điển hình là môi trường White, Knop và Knudson C; Môi trường có

hàm lượng dinh dưỡng trung bình điển hình như môi trường B5 của Gamborg và

môi trường giàu dinh dưỡng như môi trường MS (Murashige – Skoog). Mỗi loại

14

cây khác nhau, thích nghi với từng môi trường khác nhau. Với những đối tượng

cây trồng mới chưa có tài liệu trước đó, cần thăm dò môi trường phù hợp trên

từng đối tượng loại cây trồng. Hiện nay môi trường MS được coi là môi trường

thích hợp với nhiều loại cây do giàu và cân bằng về mặt dinh dưỡng [5].

Thứ 3, chọn mô cấy và xử lí mô cấy thích hợp trước và sau khi cấy. Các

mô có thể sử dụng làm mô cấy như là thịt quả non, chồi nách, cuống hoa, đế hoa,

mô phân sinh..., khi đặt vào môi trường nuôi cấy có chứa một chất sinh trưởng

thích hợp đều có khả năng phân chia và phân hóa. Sau khi cấy, mô cấy cần đặt

trong điều kiện nhiệt độ và ánh sáng ổn định, tùy vào các mục đích nghiên cứu

mà có các chế độ chiếu sáng khác nhau. Chẳng hạn, quá trình tạo mô sẹo có thể

cần bóng tối hay ánh sáng, nhưng quá trình tái sinh và nhân giống vô tính nhất

thiết phải có ánh sáng [5].

Vì vậy, cần thực hiện đúng các thao tác kỹ thuật và lựa chọn môi trường

nuôi cấy phù hợp nhằm đạt kết quả cao trong nuôi cấy mô tế bào thực vật.

1.3.3.2. Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy in vitro

Nuôi cấy mô tế bào thực vật, thực chất là một phương pháp nhân giống

vô tính Đối với nhiều loài thực vật quý hiếm, có giá trị kinh tế và ý nghĩa sinh

học khi gặp khó khăn trong vấn đề nhân giống hữu tính thì nhân giống vô tính

in vitro là công cụ vô cùng hữu ích. Trên thực tế, có nhiều loài thực vật nhân

giống hữu tính bằng hạt có hệ số nhân cao nhưng vẫn tiến hành nhân giống vô

tính in vitro là do các phương pháp nhân giống hữu tính bằng hạt mặc dù cho hệ

số nhân giống cao, dễ bảo quản và vận chuyển nhưng với một số cây trồng, khi

nhân giống bằng hạt sẽ cho ra các cây con không hoàn toàn giống bố mẹ cả về

hình thái và thành phần hoá học [8]. Sự không đồng nhất này gây ra khó khăn

trong việc đưa cây vào sản xuất theo dây truyền công nghiệp vì các cây có chất

lượng sản phẩm không đồng đều, làm giảm giá trị thương phẩm. Đặc biệt, đối

với nhiều cây dược liệu, việc nhân giống hữu tính gặp khó khăn như Ô dầu,

Bạch truật có hạt nảy mầm chậm, hay với đan sâm hạt chín không đều và thời

gian nảy mầm kéo dài, gây khó khăn cho việc sản xuất đại trà. Một số cây gỗ

15

khác có thời gian sinh trưởng kéo dài như Sơn thù và Đỗ trọng khi di thực về

trồng ở SaPa phải mất mười năm cây mới ra hoa, bộ phận làm thuốc của cây

sơn thù là quả nhưng khi cây còn trẻ chỉ cho hoa đực vì vậy không có quả. Các

cây Tam thất, Nhân sâm, hoàng liên phải sử dụng hạt tươi mới nảy mầm nên thu

hoạch đến đâu cần gieo ngay đến đó gây nhiều khó khăn cho sản xuất…[2]. Mặt

khác, phương pháp nhân giống truyền thống (chiết, giâm, ghép) vẫn còn nhiều

nhược điểm như sự lây nhiễm bệnh qua nguyên liệu thường phổ biến và phức

tạp, hệ số nhân thấp, việc sử dụng chính các bộ phận làm thuốc để nhân giống

rất lãng phí, tốn kém.

Việc không đồng nhất về chất lượng (hàm lượng các chất hoạt tính)

trong nhân giống truyền thống sẽ dẫn đến hậu quả là nguyên liệu không ổn

định, không đáp ứng được nhu cầu sản xuất. Ví dụ: đối với các cây lấy tinh

dầu, việc nhân giống bằng hạt dẫn tới sự phân ly không đều về hàm lượng

các thành phần hoạt chất, cây cọ dầu khi nhân giống bằng hạt, hàm lượng

tinh dầu ở cây con phân ly từ 0,5% đến 11,3%, hàm lượng lynalylacetat từ

11% đến 78%; cây Bạc hà nhân giống hữu tính có sự phân ly rất lớn về hàm

lượng và thành phần tinh dầu [48].

Để khắc phục những nhược điểm trên, phương pháp nhân giống vô tính

được áp dụng đã mang lại nhiều hiệu quả kinh tế và ý nghĩa sinh học lớn lao,

nhân giống vô tính tạo ra các cây con đồng đều về mặt di truyền do duy trì

được các tính trạng của cây mẹ nên có thể áp dụng sản xuất đại trà cho sản

phẩm có chất lượng ổn định; rút ngắn thời gian từ khi trồng đến khi thu

hoạch tạo điều kiện cho tăng vụ, tăng sản lượng đối với những cây có thời

gian nảy mầm của hạt kéo dài…[3]. Chính vì vậy, phương pháp nhân giống

in vitro ngày càng được khai thác và sử dụng một cách triệt để. Có rất nhiều

loại cây trồng nói chung và cây thuốc nói riêng được nhân nhanh bằng

phương pháp này. Ví dụ: Từ một cây D.floribunda bằng phương pháp nhân

giống thông thường chỉ tạo ra 8 - 10 cây con trong vòng một năm, nhưng

cùng thời gian một năm với phương pháp nhân giống in vitro bằng cách sử

16

dụng chồi nách để nhân có thể tạo ra hàng vạn cây D.floribunda, hay tạo ra

26 vạn cây Cam thảo trong năm tháng [29].

Ở Việt Nam, Mai Thị Tân và cộng sự (1993) đã đạt được hệ số nhân 532 trong vòng 1 năm đối với khoai tây [16]. Hệ số nhân giống của cây Hà thủ ô đỏ là 105/ năm. Đặc biệt, cây Cọ dầu thường phải mất 10 - 15 năm mới

cho quả thu hoạch và nhân giống từ hạt. Ứng dụng nhân nhanh in vitro cho

đối tựơng này, người ta có thể cung cấp được 500.000 cây con giống hệt

nhau trong vòng một năm [48]. Mai Xuân Lương, Nguyễn Văn Kết (1994) dự tính hàng năm có thể thu được 76 cây giống khi nuôi cấy chồi của cây

cẩm chướng [10].

Trong công tác giống cây trồng, vấn đề được quan tâm hàng đầu là chất

lượng và số lượng giống. Bằng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, người ta

đã tạo ra được những giống cây hoàn toàn sạch virus. Limasset và Cornel (1949)

đã chứng minh được rằng nồng độ virus trong thực vật giảm dần ở bộ phận gần

đỉnh sinh trưởng. Riêng đỉnh sinh trưởng thì hoàn toàn sạch virus. Nguyên nhân

của hiện tượng này là đỉnh sinh trưởng không có hệ thống mô dẫn làm cho virus

và vi sinh vật không có khả năng xâm nhập. Đỉnh sinh trưởng là nơi sinh tổng

hợp của auxin và auxin có tác dụng ức chế sinh sản của virus. Qúa trình phân

chia tế bào đỉnh sinh trưởng không kéo theo sự phân chia của virus [43].

Nuôi cấy mô tế bào chủ yếu được dùng để phục tráng và nhân nhanh theo

các hướng vi nhân giống, sản xuất hạt giống nhân tạo và làm sạch bệnh. Qua

nuôi cấy in vitro, tế bào được trẻ hoá thông qua quá trình phản phân hoá để trở

về trạng thái phôi sinh. Từ đó cho ra đời những cây con có tuổi sinh lý trẻ hơn,

làm sức sống của cây trồng tăng lên, dẫn đến tăng năng suất và chất lượng sản

phẩm [12]. Những kỹ thuật này, ở nước ngoài đã được áp dụng trên phần lớn

cây trồng. Đối với cây thuốc, giống địa hoàng, ở Trung Quốc, Hàn Quốc, bạch

truật ở Nhật Bản…. cũng đã thành công theo phương pháp này.

Sở dĩ nuôi cấy in vitro có thể chủ động trong sản xuất do có những điểm

17

khác biệt so với các phương pháp nhân giống truyền thống đó là, nhân giống in

vitro được thực hiện trên một môi trường đặc biệt, cung cấp đầy đủ các điều

kiện cho mô, tế bào nuôi cấy phát triển. Môi trường nuôi cấy là yếu tố quan

trọng quyết định đến kết quả của nuôi cấy mô tế bào.

1.3.3.3. Các đường hướng trong nhân giống in vitro

Quá trình thực hiện, nhân giống in vitro sẽ tạo ra các dòng vô tính. Theo

đó, dòng vô tính là một nhóm cá thể có kiểu gen tương tự nhau, chúng được

nhân bằng sinh sản vô tính. Trong nuôi cấy in vitro, các dòng vô tính này sẽ

được tạo ra theo hai đường hướng chính: (i) Tái sinh cây trực tiếp từ đỉnh sinh

trưởng, phôi, ngọn chồi, chồi nách; (ii) Tái sinh cây gián tiếp thông qua giai

đoạn hình thành mô sẹo.

Tái sinh trực tiếp từ mẫu nuôi cấy là quá trình phát động những điểm tồn tại

sẵn có trong mô nuôi cấy phân chia và tái sinh thành cây. Xét về nguồn gốc các

cây này có thể phát sinh từ chồi đỉnh, chồi nách phá ngủ hoặc từ chồi mới phát

sinh. Các cây con này, được phát sinh từ các đỉnh sinh trưởng có bộ nhiễm sắc thể

2n, hoàn toàn đồng nhất về mặt di truyền và duy trì được các tính trạng của cây

mẹ. Tái sinh trực tiếp cũng có thể xuất phát từ những tế bào không nằm trên đỉnh

sinh trưởng đó là các đoạn thân, mảnh lá, cuống lá, mảnh hoa….Trong trường hợp

này, các tế bào thường phân chia nhưng không hình thành các tế bào mô sẹo mà

tạo thành các điểm sinh trưởng phụ sau đó tái sinh thành cây con. Xác xuất biến dị

và đột biến thường cao hơn so với tái sinh từ ở trường hợp nói trên [22].

Nghiên cứu khả năng tái sinh chồi và cụm chồi trong nuôi cấy in vitro

cây Hà thủ ô đỏ (Polygonum multiflorunb.) theo cách sử dụng những đoạn thân

mang một mắt của cây Hà thủ ô trưởng thành ngoài tự nhiên, đầu tiên đoạn thân được khử trùng bằng cồn 70o trong 30 giây, sau đó dùng NaClO 0,5% khử trùng

trong 10 phút, rồi cấy trên môi trường MS cơ bản có bổ sung BAP 4mg/l và

NAA 0,1mg/l nhằm kích thích đoạn thân tạo cụm chồi. Các chồi đơn được tách

từ cụm chồi in vitro và tạo rễ trên môi trường MS có bổ sung NAA 0,5 mg/l.

Kết quả tạo ra những cây hà thủ ô con có đặc điểm giống cây mẹ từ nuôi cấy in

18

vitro chồi và cụm chồi [7].

Theo con đường tái sinh gián tiếp, mẫu cấy khi nuôi cấy trong môi trường

thích hợp có chứa auxin và cytokinin có thể đem lại sự

không tổ chức đó chính là các tế bào mô sẹo. Trong nuôi cấy, sự tăng sinh này có

thể được duy trì nhiều hay ít là không hạn định, chỉ cần mô sẹo được cấy chuyển

sang môi trường mới theo chu kỳ. Tuy nhiên, tế bào mô sẹo khi cấy chuyển nhiều

lần sẽ không ổn định về mặt di truyền. Để tránh tình trạng này nên sử dụng các mô

sẹo vừa mới phát sinh. Nuôi cấy mô sẹo có vai trò vô cùng quan trọng trong công

nghệ sinh học thực vật. Tỷ lệ auxin và cytokinin trong môi trường có thể dẫn tới sự

phát triển của ngọn, rễ hay phôi soma từ đó có thể tạo thành cây hoàn chỉnh. Nuôi

cấy mô sẹo cũng có thể được sử dụng để mở đầu nuôi cấy tế bào dịch huyền phù

hay tạo ra hạt nhân tạo [7].

Để có thể thực hiện nuôi cấy có kết quả tốt, dù bằng con đường nào đi

chăng nữa cũng cần chú ý tới các yếu tố ảnh hưởng tới nuôi cấy vì chính các

yếu tố này quyết định đường hướng vô tính cũng như chất lượng của cây

giống thu được.

Nhân giống in vitro cây Mỏ quạ được tiến hành thông qua sự hình thành

mô sẹo, mô sẹo tạo phôi vô tính và cây con là một minh chứng của con đường

tái sinh gián tiếp. Theo đó, mô sẹo được hình thành trên môi trường MS bổ sung

2,4D nồng độ 0,5, 1,0 và 1,5 mg/l kết hợp với BAP. Mô sẹo có khả năng phát

sinh phôi vô tính, tạo cây con trên môi trường có sự kết hợp 2 BAP mg/l và

NAA 0,05 và 0,1 mg/l [4].

Theo Nguyễn Thị Lý Anh và Đinh Thị Phòng (2007), quá trình nhân giống in

vitro bao gồm 5 bước [1].

Bước thứ nhất: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ. Trong bước này phải chọn cây

mẹ sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virus và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh. Việc trồng các

cây mẹ trong điều kiện môi trường thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu

bệnh hiệu quả trước khi cấy mẫu sẽ làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống,

sinh trưởng của mẫu nuôi cấy.

Bước thứ hai: Nuôi cấy khởi động, đây là giai đoạn khử trùng đưa các mẫu

19

vào nuôi cấy in vitro. Các khâu chủ yếu của giai đoạn này như: Khử trùng bề mặt mẫu

vật, cấy mẫu vào ống nghiệm hoặc bình nuôi cấy có sẵn môi trường nhân tạo. Yêu

cầu ở giai đoạn này phải có tỷ lệ mẫu nhiễm thấp, tỷ lệ mẫu sống cao, mẫu sinh

trưởng và phát triển tốt. Sau một thời gian nhất định, từ mẫu nuôi cấy bắt đầu xuất

hiện các cụm tế bào hoặc cơ quan (chồi, cụm chồi, rễ) hoặc các phôi vô tính có đặc

tính gần như phôi hữu tính. Sau một thời gian nhất định tuỳ thuộc vào loại cây, mẫu

cấy đó được chuyển sang giai đoạn tiếp theo.

Bước thứ ba: Bước nhân nhanh. Khi mẫu cấy sạch đã được tạo ra, từ đó

nhân lên thành các cụm chồi hoặc các phôi vô tính. Giai đoạn này cần tạo ra tốc

độ nhân nhanh cao nhất trong điều kiện nuôi cấy. Vì vậy, thành phần và điều

kiện môi trường phải được tối ưu nhằm đạt được mục tiêu nhân nhanh.

Quy trình cấy chuyển nhân nhanh thường diễn ra trong khoảng từ một

đến hai tháng tháng tuỳ loại cây. Tỷ lệ nhân nhanh sau mỗi lần cấy chuyển đạt

khoảng 2 - 8 lần cấy chuyển. Giai đoạn nhân nhanh chồi từ một vài chồi ban

đầu không nên kéo dài quá lâu để tránh biến dị soma.

Kết quả nhân nhanh chồi cây Chuối cho thấy, từ một chồi cây Chuối chọn

lọc ban đầu người ta chỉ nên nhân khoảng 2000 đến 3000 chồi cây mới sau 7 - 8

lần cấy chuyển sẽ hạn chế được sự xuất hiện biến dị soma [20].

Các chồi nhân nhanh cần được chuyển sang môi trường tạo rễ để tái sinh

thành cây hoàn chỉnh

Bước 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh

Các chồi hình thành trong quá trình nuôi cấy có thể phát rễ tự sinh nhưng

thông thường các chồi này phải được cấy chuyển sang một môi trường khác để

kích thích tạo rễ. Ở một số loài khác thì các chồi sẽ tạo rễ khi được chuyển trực

tiếp ra đất. Giai đoạn này trong vòng từ 2 - 8 tuần. Sau khi cây đã được tái sinh

hoàn chỉnh sẽ được đưa trở về điều kiện tự nhiên để sản xuất đại trà.

Bước 5: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên

20

Đây là giai đoạn đầu tiên chuyển cây từ điều kiện vô trùng trong phòng thí

nghiệm ra thích ứng với điều kiện môi trường ngoài tự nhiên. Cây cần được chăm

sóc cẩn thận để đạt tỷ lệ sống cao. Giai đoạn này đòi hỏi từ 4 - 16 tuần tuỳ từng đối

tượng nghiên cứu [1].

Hiện nay chưa có công trình nghiên cứu nào công bố nhân giống in vitro

thành công trên cây Thất diệp nhất chi hoa . Tuy nhiên đã thành công trên nhiều

đối tượng cây trồng khác nhau, trong đó có một số cây dạng thân củ, ví dụ như

nghiên cứu của Nguyễn Quang Thạch và cs (2010) đã tạo được giống cây Khoai

môn sọ từ kỹ thuật nuôi cấy in vitro theo cách: Khử trùng mẫu củ Khoai môn sọ

bằng dung dịch HgCl2 0,1% trong 15 phút sau đó ngâm mẫu vào dung dịch

Johson trong 15 phút. Tạo tỷ lệ mẫu sạch bệnh đạt 66,67% - 88,67%. Các mắt

ngủ được cắt thành những tế bào lớp mỏng, nhân nhanh trên nền môi trường

MS có bổ sung TDZ 1,5mg/l cho hệ số nhân giống của các thí nghiệm tăng từ

8,07 đến 9,12 lần. Cây Khoai môn sọ in vitro ra rễ hiệu quả trên môi trường MS

cơ bản [16].

Dựa trên những thành tựu nghiên cứu đã thành công bước đầu nghiên cứu

nhân giống in vitro cây Thất diệp nhất chi hoa tạo nền tảng nhằm phục vụ cho

21

quy trình nghiên cứu và tạo cây hoàn chỉnh.

Chƣơng 2

VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu nghiên cứu

2.1.1. Vật liệu

Mẫu cây Thất diệp nhất chi hoa thu thập từ các tỉnh Lào Cai, Hà Giang,

Lạng Sơn được sử dụng làm vật liệu nghiên cứu.

C rpoC1-1f/rpoC1-3r do phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện

Công nghệ Sinh học Việt Nam cung cấp. Cặp mồi có trình tự nucleotide như sau:

rpoC1-1f: 5’-GTGGATACACTTCTTGATAATGG-3’;

rpoC1-3r: 5’-TGAGAAAACATAAGTAAACGGGC-3’

2.1.2. Hóa chất, thiết bị

2.1.2.1. Hóa chất

Sử dụng hóa chất có nguồn gốc rõ ràng, đặc biệt là các hóa chất dùng

trong sinh học phân tử của các hãng có uy tín, Fermentas (Đức) như: CTAB,

SDS, EDTA, Tris-HCl, Trung Quốc như: NaCl, sodium acetate, Merck (Đức)

như: ethanol, agarose, ethidium bromide.

- Môi trường nuôi cấy cơ bản là môi trường MS (Murashige và Skoog,

1962) có bổ sung thạch agar (8,5g/lít), đường (30g/lít) và các chất kích thích

sinh trưởng với nhiều nồng độ khác nhau, pH môi trường được điều chỉnh tới 5,8 và khử trùng dưới áp suất 1,2atm ở nhiệt độ 1210C trong 22 phút.

2.1.2.2. Thiết bị

Box cấy, nồi hấp khử trùng, máy sấy, cân điện tử, bình tam giác có kích

thước từ 250 đến 500ml, pipet, dụng cụ nuôi cấy…Các hóa chất và thiết bị cần

thiết phục vụ cho quá trình nghiên cứu nuôi cấy mô tại phòng công nghệ tế bào

thuộc khoa Sinh học, trường Đại học sư phạm Thái Nguyên.

Các thí nghiệm phân lập gen, được tiến hành trên trang thiết bị của phòng

Công nghệ DNA ứng dụng, phòng công nghệ tế bào thực vật và phòng thí

nghiệm trọng điểm công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm

22

Khoa học và công nghệ Việt Nam.

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp thu thập mẫu

Thu thập mẫu cây Thất diệp nhất chi hoa trong tự nhiên, mô tả và chụp ảnh.

2.2.2. Phương pháp bảo tồn cây Thất diệp nhất chi hoa tại Thái Nguyên

Số cây con sau khi thu được đưa về trồng tại vườn ươm của trường Đại

học sư phạm Thái Nguyên,

Thí nghiệm 1. Trồng cây tại vườn ươm của trường Đại học Sư phạm Thái

Nguyên. Tổng số 26 cây được bố trí trồng trên 2 luống, mỗi luống chia làm 2

hàng cách nhau 40cm, cây cách cây 40cm, tưới nước ngày 1 lần vào buổi chiều.

Thí nghiệm 2. Trồng cây trong phòng sinh trưởng cây in vitro của phòng

công nghệ tế bào. Mỗi cây trồng 1 chậu. Mỗi chậu có kích thước rộng 30cm, cao 30cm. Nhiệt độ 25oC ±2. Độ ẩm 50 - 70%. Chiếu sáng 12 giờ/ngày.

Các chỉ tiêu theo dõi được mô tả theo thứ tự ở bảng 3.5

Đánh giá kết quả ngoài vườn ươm.

Tỉ lệ cây sống

Tỷ lệ cây chết

Chiều cao trung bình/cây (cm)

Số lá/cây (cm)

Chiều rộng lá/cây (cm)

Chiều dài lá/cây (cm)

Số gân/lá

2.2.3. Phương pháp phân lập gen rpoC1

Lá non của cây Thất diệp nhất chi hoa thu thập tịa huyện Bình Gia – Lạng

Sơn. Được sử dụng để tách chiết DNA tổng số theo phương pháp CTAB của

Doyle.JJ (1987) [30]. DNA tổng số được định tính và định lượng bằng phương

23

pháp quang phổ kế và điện di trên gel agarose 1%. DNA được tinh sạch theo bộ

Kit GenJET PCR Purification của hãng Thermo Scientific và hướng dẫn của

nhà sản xuất.

Gen rpoC1 được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu

oC - 30 giây, 55oC - 40 giây, 72oC - 40 giây); 72oC - 10 phút và giữ ở 4oC.

rpoC1-1f/rpoC1-3r theo chu trình nhiệt như sau: 94oC - 4 phút; lặp lại 35 chu kì

Thành phần phản ứng PCR bao gồm: master mix (2X) - 7,5 μl, mồi xuôi

(10pmol/μl) - 0,5 μl, mồi ngược (10 pmol/μl) - 0,5μl, DNA khuôn (10ng/μl)- 0,5

μl. Tổng thể tích phản ứng - 15μl.

2.2.4. Phương pháp nuôi cấy in vitro

- Phương pháp lấy mẫu: Cây được lựa chọn để lấy mẫu là những cây sinh

trưởng khoẻ không bị sâu .

Tạo nguồn vật liệu ban đầu

+ Rửa mẫu (hạt, lá, củ) nhiều lần bằng nước sạch, tránh làm dập mẫu.

+ Ngâm trong nước xà phòng loãng 1% khoảng 5 - 7 phút.

+ Tiếp tục rửa mẫu bằng nước sạch nhiều lần

+ Chuyển mẫu vào bình tam giác và tráng lại nhiều lần bằng nước cất vô

trùng trước khi khử trùng với hóa chất.

Thí nghiệm 3. Khử trùng hạt bằng 3 loại hóa chất

nồng độ 0,1% trong 5 phút, 8 phút.

CT 1: Javen nồng độ 65% trong 15 phút và 75% trong 10 phút.

CT 2: HgCl2

CT 3: Khí clo (HCl và javen theo tỉ lệ 4 : 20ml) trong 16 giờ.

Thí nghiệm 4. Khử trùng củ bằng cách kết hợp cồn, javen và HgCl2

CT 1: cồn 70% trong 3 phút sau đó sử dụng javen 7% trong 3phút, tiếp

đến dùng HgCl2 0,1% trong 4 phút.

CT 2: cồn 70% trong 3 phút, sau đó sử dụng javen 7% trong 5 phút tiếp

24

đến dùng HgCl2 0,1% 5 phút.

CT 3: cồn 70% trong 3 phút sau đó sử dụng javen7% trong 7 phút tiếp

đến dùng HgCl2 0,1% trong 6 phút.

CT 4: cồn 70% trong 3 phút sau đó sử dụng javen 7% trong 9 phút tiếp

đến dùng HgCl2 0,1% trong 8 phút.

Thí nghiệm 5. Khử trùng lá bằng:

Công thức 1: javen 7% trong 10 phút

Công thức 2: javen 7% trong 15 phút.

Công thức 3: cồn 70% trong 1 phút sau đó sử dụng javen 20% 10 phút tiếp

đến dùng HgCl2 0,1% trong 5 phút.

Nhân nhanh chồi cây Thất diệp nhất chi hoa

Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của GA3 đến sự nảy mầm của hạt.

Hạt cấy trên môi trường MS có bổ sung GA3 nồng độ từ 0,3 đến 1,9

mg/l, mỗi bậc cách nhau 0,2mg/l.

Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của BAP đến sự nảy mầm của hạt

Hạt cấy trên môi trường MS có bổ sung BAP nồng độ từ 1,0 đến 5mg/l,

mỗi bậc cách nhau 0,5ml.

Thí nghiệm 8: Ảnh hưởng của các ĐHST đến sự phát sinh hình thái của lá

Hạt cấy trên môi trường MS có bổ sung

Công thức 1: 2,4-D nồng độ từ 1,0 đến 4 mg/l bước nhảy 0,5mg/l.

Công thức 2: BAP nồng độ từ 1,0 đến 4mg/l bước nhảy 0,5mg/l.

Công thức 3: IBA nồng độ từ 1,0 đến 4mg/l bước nhảy 0,5mg/l.

Thí nghiệm 9: Ảnh hưởng của các chất ĐHST đến sự phát sinh hình thái

của tế bào lớp mỏng

Củ của cây Thất diệp nhất chi hoa sau khi khử trùng được cắt thành từng

lát mỏng theo kích thước khoảng 0,5 x 1cm dày khoảng 0,2cm và được cấy trên

25

môi trường MS cơ bản có bổ sung :

Công thức 1: IBA nồng độ từ 0,2 đến 1,4 bước nhảy 0,2 mg/l

Công thức 2: 2,4-D nồng độ từ 0,2 đến 1,4 bước nhảy 0,2 mg/l

Thí nghiệm 10: Ảnh hưởng của các ĐHST đến sự phát sinh hình thái

của củ.

Công thức 1: MS cơ bản

Công thức 2: MS + BAP (0; 0,5; 1; 2 mg/l)

Công thức 3: MS + BAP (0; 0,5; 1 mg/l) + than hoạt tính.

2.2.5. Phương pháp xử lí số liệu

Các số liệu phân tích được thực hiện trên máy tính theo chương trình excel.

Các công thức so sánh được tiến hành theo phương pháp kiểm tra sự sai khác

giữa các giá trị trung bình bằng phép ước lượng, đọc kết quả dựa vào bảng ANOVA

Trình tự nucleotit của rpoC1 được phân tích, so sánh bằng các phần mềm

Bioedit, BLAST, ClustalW, DNA star.

2.3. Địa điểm tiến hành thí nghiệm

Các thí nghiệm trên được tiến hành tại khoa Sinh học của trường Đại học

sư phạm Thái Nguyên. Phòng Công nghệ DNA ứng dụng, Viện Công nghệ sinh

26

học, Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam.

Chƣơng 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả thu thập mẫu cây Thất diệp nhất chi hoa tại một số tỉnh miền

núi phía Bắc của Việt Nam

Xuất phát từ những thông tin ban đầu về sự đa dạng và rộng khắp của cây

Thất diệp nhất chi hoa , chúng tôi tiến hành khảo sát và thu thập mẫu tại 3 tỉnh

Lạng Sơn, Hà Giang và Lào Cai. Kết quả nghiên cứu nhằm bổ sung các thông tin

về đặc điểm sinh trưởng của cây Thất diệp nhất chi hoa ở khu vực miền núi phía

bắc Việt Nam.

3.1.1. Đặc điểm mẫu cây Thất diệp nhất chi hoa thu thập tại huyện Bình Gia-

Lạng Sơn

Bình Gia là một huyện của tỉnh Lạng Sơn, cách thành phố chừng 70km

về phía đông bắc theo tuyến đường quốc lộ 1B. Địa hình bị chia cắt bởi những dãy núi đất, núi đá, độ dốc trung bình từ 25 - 30oC. Khí hậu nhiệt đới gió mùa vùng núi, nhiệt độ trung bình năm 20,8oC, độ ẩm trung bình năm là 82%, mùa

mưa từ tháng 4 đến tháng 9, lượng mưa trung bình 1,540 mm/năm [53].

Tiến hành thu mẫu cây Thất diệp nhất chi hoa tại hai xã của huyện Bình

Gia, tỉnh Lạng Sơn chúng tôi thu được tổng cộng 4 cây hoàn chỉnh. Kết quả thể

hiện ở bảng 3.1, hình 3.1 và 3.2.

Bảng 3.1. Mẫu cây thu đƣợc tại huyện Bình Gia - Lạng Sơn

Điều kiện tự nhiên của xã

Số lƣợng Loại mẫu Xã thu mẫu Độ cao Nhiệt độ/năm Độ ẩm/năm (cây)

(m) (oC) (%)

Cây 06 lá 03 Hồng Phong 800 - 20,8oC 82% 1000m Cây 05 lá 01 Hội Hoan

Kết quả nghiên cứu ở bảng 3.1 cho thấy, tại xã Hồng Phong, huyện Bình

Gia, tỉnh Lạng Sơn chúng tôi thu được 03 mẫu cây, cả 3 cây đều có 06 lá/cây.

27

Các cây có chiều cao từ 30 - 80cm. Trong tháng 9 và 10, cây đang ở độ sinh

trưởng và phát triển mạnh, thân cây to, mọng nước, lá rộng và xanh, trên lá có 5

gân chạy hình vòng cung. Đến tháng 10 có 01 cây xuất hiện cuống mang nụ

hoa, mọc ra từ đỉnh vành lá. Sang tháng 11, phần cuống của cây hoa này dài

50cm, hoa nở với 06 cánh tràng và 06 lá đài. Nhị hoa màu vàng, nhụy hoa màu

tím đen. Tuy nhiên, sau đó hoa lụy tàn không nhận thấy quả được hình thành.

a. Hình ảnh cây trong tháng 10 b. Hình ảnh cây trong tháng 11

Hình 3.1. Cây Thất diệp nhất chi hoa tại Hồng Phong - Bình Gia - Lạng Sơn

Tại xã Hội Hoan - Bình Gia - Lạng Sơn thu được 01 mẫu cây cây hoàn

chỉnh. Theo hình 3.2 mẫu cây Thất diệp nhất chi hoa thuộc dạng dị thảo, cây có

5 lá, lá có hình bầu dục, phiến lá trơn, viền lá nhẵn. Lá có kích thước chiều rộng

8cm, chiều dài 9,5cm. Năm cuống lá cùng xuất phát từ một vị trí. Hiện tại đây là

phần cao nhất của thân cây, Thân cây dạng thảo, mọng nước, kích thước thân

dài 9cm, Thân củ có 5 mắt đốt và nhiều rễ nhỏ mọc xung quanh.

28

Hình 3.2. Mẫu cây Thất diệp nhất chi hoa tại xã Hội Hoan, huyện Bình Gia

3.1.2. Đặc điểm mẫu cây Thất diệp nhất chi hoa thu thập tại huyện Quản Bạ- Hà

Giang

Quản bạ là huyện vùng cao biên giới phía bắc của tỉnh Hà giang, cách trung

tâm thành phố Hà Giang 44 km, gồm nhiều khu vực núi đá vôi, độ cao trung bình từ

1.000 - 1.600m, chịu ảnh hưởng của khí hậu nhiệt đới gió mùa, lượng mưa bình

quân/năm đạt 1.745mm tập trung chủ yếu từ tháng 5 đến tháng 9 [54].

Qua quá trình thu thập mẫu cây Thất diệp nhất chi hoa chúng tôi đã thu

được kết quả ở bảng 3.2.

Bảng 3.2. Số lƣợng mẫu Thất diệp nhất chi hoa thu tại Hà Giang

Nhiệt Độ Số Độ cao Loại mẫu Mẫu ẩm/năm lƣợng (m) độ/năm (oC) (%)

01 quả chứa 105 hạt. Quả hạt 02 01 quả chứa 124 hạt. 1000- 15-20oC 85% 1600m Các củ có kích thước không Củ 70 đều, trọng lượng củ 4 - 30g.

Theo bảng 3.2 và hình 3.3, mẫu củ thu được ở huyện Quản Bạ - Hà Giang là

mẫu thu mua từ người dân bản địa (hình 3.3). Các mẫu củ đều có màu xám đen, có

trọng lượng thay đổi từ 4g đến 30g, nhiều củ đang trong quá trình lên mầm cây mới.

29

Hình 3.3. Mẫu củ thu đƣợc tại Quản Bạ - Hà Giang

Với phần quả thu được thể hiện trên bảng 3.2 và hình 3.4 cho thấy, quả

của cây Thất diệp nhất chi hoa có dạng hình cầu, đường kính khoảng 3 - 4cm.

Phần vỏ bên ngoài cứng, màu xám đen. Vỏ quả chín để lộ nhiều hạt màu đỏ

hình hơi tròn. Tổng số hạt của 2 quả đếm được gồm 229 hạt. Mỗi hạt có kích

thước khoảng 0,3 - 0,5cm, nặng khoảng 0,9 - 0,11g. (hình 3.4)

Hình 3.4. Quả và hạt cây Thất diệp nhất chi hoa thu tại Hà Giang

3.1.3. Đặc điểm mẫu cây Thất diệp nhất chi hoa thu thập tại huyện Sa Pa- Lào Cai

Nằm ở phía Tây Bắc của Việt Nam, thị trấn Sa Pa ở độ cao 1.600 mét so

với mực nước biển, cách thành phố Lào Cai 38 km. Sa Pa có khí hậu cận nhiệt

đới ẩm, ôn đới, không khí mát mẻ quanh năm. Nhiệt độ không khí trung bình

năm của Sa Pa là 15°C [53].

Về đa dạng sinh học huyện Sa Pa có vườn quốc gia Hoàng Liên Sơn có

diện tích 29.845 ha vùng lõi và 38.724 ha vùng đệm chủ yếu là cây nguyên sinh

được bảo vệ nghiêm ngặt. Vườn được bảo vệ nghiêm ngặt, vườn có kho tàng

quỹ gen thực vật quý hiếm chiếm 50% số loài thực vật quý hiếm của Việt Nam,

thống kê có 2024 loài thực vật, 113 loài thực vật quý hiếm đang có nguy cơ

tuyệt chủng trên thế giới [55] trong đó có cây Thất diệp nhất chi hoa . Kết quả

30

nghiên cứu trình bày ở bảng 3.3.

Bảng 3.3. Số lƣợng mẫu Thất diệp nhất chi hoa thu tại Sa Pa

Loại Độ cao Độ ẩm/năm Số lƣợng Mẫu mẫu (m) Nhiệt độ/năm (oC) (%)

Cây 03 lá có 07 cây 27 Cây hoàn Cây 05 lá có 9 cây ≥1000m 15-23oC 86-87% chỉnh Cây 06 lá có 8 cây

Cây 07 lá có 3 cây

Tại Sa Pa chúng tôi đã quan sát được sự có mặt của cây Thất diệp nhất

chi hoa tại hai khu vực: Khu vực thứ nhất tại vườn quốc gia Hoàng Liên chúng

tôi thống kê được 27 cây đang được bảo tồn, đây là những cây hoàn chỉnh, trong

đó có nhiều dạng dị thảo khác nhau (hình 3.5A); Khu vực thứ 2, quan sát thấy

cây Thất diệp nhất chi hoa tại xã Bản Khoang, huyện Sa Pa, tỉnh lào Cai khu

vực này được người dân thu gom và trồng với diện tích khoảng 40m2 (hình

3.5B), cây sinh trưởng phát triển mạnh, đẻ nhiều nhánh con và nhiều cá thể có

B

A

hoa và quả.

Hình 3.5. Cây Thất diệp nhất chi hoa tại Sa Pa

(A. Cây Thất diệp nhất chi hoa tại xã Bản Khoang

B. Cây Thất diệp nhất chi hoa tại trung tâm bảo tồn vườn quốc gia Hoàng Liên)

Qua thực địa tìm kiếm cây Thất diệp nhất chi hoa tại 03 vùng trên và

chúng tôi nhận thấy: Cây phân bố chủ yếu ở nơi có cường độ ánh sáng trung

31

bình, nhiệt độ từ 20 - 25o C, độ ẩm cao. Cây phát triển tốt hơn tại những nơi có

độ mùn dày và lớp lá phủ nhiều trên mặt đất, đặc biệt gần các khe nước. Tại Sa

Pa chúng tôi nhận thấy rằng cây sinh trưởng và phát triển rất tốt thân củ đẻ

nhiều nhánh con, thân cây to mập, chiều cao chủ yếu từ 30-120cm, đa số cây ra

hoa và hình thành quả, số lượng cá thể nhiều. Tuy nhiên, tại Lạng Sơn và Hà

Giang số lượng cá thể tìm thấy trong tự nhiên còn ít.

3.2. Kết quả phân tích gen rpoC1 của cây Thất diệp nhất chi hoa

Kết quả nhân bản gen rpoC1 bằng kỹ thuật PCR

Sau khi tách chiết, DNA tổng số được kiểm tra bằng kỹ thuật điện di

trên gel agarose 0,8% đã phát hiện DNA đủ sạch để tiến hành các thí

nghiệm tiếp theo.

Quá trình nhân bản gen rpoC1 được tiến hành với

cặp mồi rpoC1- 1F/ rpoC1-3r. Theo tính toán lý thuyết, gen rpoC1 nhân được

có kích thước hơn 500 bp. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1%, kết

quả được trình bày ở hình 3.6.

Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm nhân gen rpoC1

M: thang DNA 1kb;

32

TD: sản phẩm nhân gen rpoC1từ mẫu 05 lá thu tại Lạng Sơn

Sản phẩm PCR thu được ở hình 3.7 là một băng DNA sáng rõ nét, có kích

thước khoảng 500 bp phù hợp với kích thước lý thuyết của gen rpoC1 dự kiến

nhân bản. Kết quả điện di cũng cho thấy, không có băng DNA phụ xuất hiện,

như vậy sản phẩm PCR nhân bản gen rpoC1 rất đặc hiệu, có thể sử dụng trực

tiếp các sản phẩm này để xác định trình trình tự nucleotide.

Sau khi được khuếch đại, sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit Gen

JET PCR Purification của hãng Thermo Scientific và được xác định trình tự trên

máy giải trình tự tự động ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analyzer.

Khi so sánh trình tự gen rpoC1 với các trình tự gen rpoC1 khác thuộc các

loài khác bằng phần mềm BLAST, chúng tôi nhận thấy trình tự gen rpoC1 của

chúng tôi có độ tương đồng cao nhất với trình tự gen rpoC1 của chi Paris

verticillata voucher với độ tương đồng là 99% (Bảng 3.4).

Bảng 3.4. Tên loài và mã số trình tự gen rpoC1

TT Tên loài Mã số Độ tương đồng

Paris verticillata voucher KJ433485 99% 1

Trillium tschonoskii KR780076 99% 2

Trillium maculatum KR780075 98% 3

Xeronema callistemon JQ274619 97% 4

Doryanthes palmeri JQ274594 97% 5

Xanthorrhoea preissii JQ274618 96% 6

33

Scadoxus cinnabarinus JQ274585 96% 7

Xác định và phân tích trình tự gen rpoC1

Sau khi xác định và phân tích trình tự, đoạn gen rpoC1 mà chúng tôi thu

được có chiều dài là 558 bp. Kết quả trình bày ở hình 3.7.

rpo ất diệp nhất chi hoa

ệt Nam

Dựa trên trình tự gen rpoC1 của cây Thất diệp nhất chi hoa thu thập tại

Lạng Sơn có độ tương đồng từ 96%- 99% so với gen rpoC1 của các loài khác

như Trillium tschonoskii (KR780076), Xeronema callistemon (JQ274619),

Doryanthes palmeri (JQ274594), Xanthorrhoea preissii (JQ274618), Scadoxus

cinnabarinus (JQ274585),... Dựa trên gen rpoC1, Các loài này đều là các loiaf

thực vật có hoa.

3.3. Kết quả nghiên cứu bảo tồn cây Thất diệp nhất chi hoa trồng tại tỉnh

Thái Nguyên

Với mục đích bảo tồn cây Thất diệp nhất chi hoa ở các vùng sinh thái

34

khác nhau, chúng tôi tiến hành nhân giống vô tính cây Thất diệp nhất chi hoa từ

các mầm củ thu được tại huyện Quản Bạ tỉnh Hà Giang. Thí nghiệm được tiến

hành tại trường Đại học Sư Phạm theo mô tả ở mục 2.2.2

Kết quả nghiên cứu ở thí nghiệm thứ nhất, cây Thất diệp nhất chi hoa

sau khi thu thập, được trồng tại vườn ươm của trường Đại học sư phạm Thái

Nguyên trong điều kiện môi trường tự nhiên. Toàn bộ số cây trồng đều không

thích nghi được và chết.

Ở thí nghiệm thứ 2 chúng tôi đã chọn 2 giá thể khác nhau gồm giá thể

bằng đất và giá thể hỗn hợp của đất với cát (theo tỉ lệ 1:1). Chúng tôi lựa chọn

phòng sinh trưởng làm điểm nuôi cấy, với đặc điểm phòng này có sự ổn định nhiệt độ trong khoảng 25oC ± 2oC, ánh sáng chiếu 14 giờ/ngày, độ ẩm khoảng

50 - 70%. Qua 5 tuần theo dõi, kết quả thu được trình bày ở bảng 3.5.

Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của giá thể tới tỉ lệ sống của cây Thất diệp nhất chi hoa

(Thời điểm sau 35 ngày trồng)

Công thức thí nghiệm Tỷ lệ cây sống (%)

Giá thể đất thịt 51%

Giá thể hỗn hợp (đất + cát) 100%

Kết quả thu được ở bảng 3.4 cho thấy, nền giá thể hỗn hợp cho tỉ lệ sống

100%, giá thể đất cho tỉ lệ sống thấp hơn (51%). Qua quan sát thấy rằng cây

Thất diệp nhất chi hoa trồng trên giá thể hỗn hợp có bộ rễ phát triển mạnh hơn

khi trồng trên nền giá thể đất, có thể do nền giá thể hỗn hợp chứa cát nên thông

thoáng hơn và cây dễ hấp thụ đạt tỷ lệ sống cao hơn.

Nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng của cây Thất diệp nhất chi hoa trên giá

35

thể hỗn hợp ở thí nghiệm 2 chúng tôi thu được kết quả trình bày ở bảng 3.6.

Bảng 3.6. Đặc điểm sinh trƣởng của cây Thất diệp nhất chi hoa trong

phòng sinh trƣởng tại Thái Nguyên.

Đặc điểm Sau 10 ngày Sau 20 ngày Sau 30 ngày Sau 40 ngày

Chiều cao cây 8,21 ± 1,45 13,39 ± 2,10 16,06 ± 2,31 21,25 ± 4,09 (cm)

Chiều dài lá (cm) 7,40 ± 0,34 9,02 ± 0,42 10,08 ± 0,44 10,75 ± 0,45

Chiều rộng lá 3,94 ± 0,25 4,39 ± 0,32 4,74 ± 0,36 5,13 ± 0,38 (cm)

Chiều dài cuống 1,09 ± 0,05 1,39 ± 0,06 1,80 ± 0,11 2,12 ± 0,15 lá (cm)

Số gân lá/mẫu 4,24 4,24 4,24 4,24

Số lá/mẫu 4,33 4,33 4,33 4,33

Màu sắc thân Xanh tím Xanh tím Xanh tím Xanh tím

Màu sắc lá Xanh nhạt Xanh nhạt Xanh đậm Xanh đậm

Theo dõi sự phát triển của 15 mẫu cây bật chồi trên giá thể hỗn hợp

chúng tôi nhận thấy các cây trồng gồm nhiều dạng dị thảo khác nhau, đó là các

cây có 3, 4, 5, 6 và 8 lá, chúng tôi không thu được cây 7 lá.

Qua 40 ngày sinh trưởng, chúng tôi thấy tốc độ tăng trưởng giữa các cây

có sự chênh lệch nhau. Chiều cao cây thấp nhất chỉ đạt 6,5cm cây cao nhất đạt

trên 60cm. Chiều cao trung bình của các cây tăng từ 8,21cm (thời điểm trong 10

ngày đầu) đến 21,25cm (thời điểm sau 40 ngày theo dõi). Chiều dài lá tăng từ

7,40cm đến 10,75cm. Chiều rộng lá từ 3,94cm đến 5,13cm. Cuống lá cũng thay

đổi từ 1,09cm đến 2,12cm. Tuy nhiên số lá trên cây và số gân trong quá trình

theo dõi từ 10 - 40 ngày vẫn giữ nguyên số lượng. Màu sắc của các lá thay đổi

dần từ màu xanh nhạt sang màu xanh đậm. Gốc các thân cây đều có màu tím,

lên đến phần ngọn chuyển màu xanh dần. Sau 3 tuần một số cây bắt đầu ra hoa,

cuống hoa dài từ 6 - 30cm, số cánh tràng bằng số lá đài, hoa lưỡng tính, gồm

36

nhiều chỉ nhị màu vàng, nhụy màu tím đen.

4 Lá

3 Lá

5 Lá

8 Lá

Hình 3.8. Cây Thất diệp nhất chi hoa trong phòng sinh trƣởng của cây in

vitro tại Thái Nguyên

Như vậy, kết quả nghiên cứu bảo tồn cây Thất diệp nhất chi hoa bằng

phương pháp nhân giống vô tính tại Thái Nguyên bước đầu cho thấy cây có khả

năng sinh trưởng và phát triển phải trong điều kiện tương đối ổn định về điều

kiện tự nhiên như nhiệt độ mát lạnh, độ ẩm và ánh sáng phù hợp Vì vậy, việc

biến đổi nguồn gen cây Thất diệp nhất chi hoa để cây có khả năng thích nghi

với nhiều kiểu điều kiện sinh thái khác nhau là hướng đến của các nhà khoa học.

3.4. Kết quả bảo tồn cây Thất diệp nhất chi hoa in vitro

3.4.1. Kết quả khử trùng mẫu

Khử trùng mẫu là giai đoạn đầu tiên của quá trình nuôi cấy in vitro. Mẫu

được lấy từ các bộ phận khác nhau của cây, vì vậy thường dễ nhiễm các loại vi

37

khuẩn, virus, nấm…Ở giai đoạn đầu tiên này các thao tác kỹ thuật và các thí

nghiệm cần phải đạt được những yêu cầu như: có tỷ lệ mẫu nhiễm thấp, có tỷ lệ

mẫu sống cao hơn thế, mẫu phải tồn tại, phân hóa, sinh trưởng tốt.

Để đạt được mục đích này, cần phải tìm ra phương pháp khử trùng có

hiệu quả. Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến kết quả khử trùng như thời gian khử

trùng, hóa chất khử trùng, phương pháp lấy mẫu, thời điểm lấy mẫu… Tuy

nhiên trong kỹ thuật in vitro, hai yếu tố ảnh hưởng sâu sắc nhất đến kết quả khử

trùng là hóa chất khử trùng và thời gian khử trùng. Loại hóa chất thường được

sử dụng để làm sạch mẫu cấy thường là các chất hóa học như: canxihypocloxit

(CaOCl2), natrihypoclorit (H2O2), clorua thủy ngân (HgCl2), axit clohydrich

(HCl)… Việc lựa chọn hóa chất, nồng độ, thời gian khử trùng phụ thuộc rất lớn

vào đặc điểm tình trạng mẫu cấy [20].

Từ nguồn mẫu thu thập được chúng tôi tiến hành lựa chọn phần hạt, phần

củ và lá non của cây Thất diệp nhất chi hoa làm vật liệu nuôi cấy. Để đạt được

hiệu quả khử trùng cao chúng tôi lựa chọn các hóa chất gồm javen, HgCl2, cồn

và HCl với nồng độ khác nhau, nhằm thu được lượng mẫu sạch cao.

3.4.1.1. Kết quả khử trùng mẫu hạt cây Thất diệp nhất chi hoa

Ảnh hưởng của hóa chất, thời gian và nồng độ khử trùng được đánh giá

qua một số chỉ tiêu: tỷ lệ nhiễm, tỷ lệ chết, tỷ lệ sống. Sau 3 tuần theo dõi chúng

tôi thu được kết quả trình bày ở bảng 3.7 dưới đây:

Bảng 3.7. Kết quả khử trùng hạt cây Thất diệp nhất chi hoa

Số mẫu

Hóa chất Tỷ lệ mẫu sạch (%) Nồng độ (%) Mẫu nhiễm Mẫu sạch Thời gian (phút)

Javen 65 15 36 4 11,0 40

(NaOCl) 75 10 30 10 25,0 40

5 30 11 27,5 40

0,1 HgCl2 8 22 18 45,0 40

38

Khí Clo 16 giờ 5 35 87,5 40

Nhìn vào bảng số liệu bảng 3.7 hạt Thất diệp nhất chi hoa được khử trùng

với ba loại hóa chất javen, HgCl2, khí clo với các nồng độ khác nhau sau đó cấy

lên môi trường MS cơ bản đã thu được lượng mẫu sạch không giống nhau. Sử

dụng javen nồng độ 65% trong thời gian 15 phút, thu được 11% mẫu hạt sạch.

Nâng nồng độ javen lên 75% và giảm thời gian khử trùng xuống 10 phút chúng

tôi thu được 25% mẫu sạch. Tỷ lệ này thấp hơn khi khử trùng hạt bằng HgCl2

nồng độ 0,1% trong 5 phút đạt 27,5%, tăng thời gian khử trùng lên 8 phút với

nồng độ HgCl2 0,1% thu được 45% mẫu sạch. Hiệu quả khử trùng cao nhất khi

sử dụng khí clo trong 16 giờ các mẫu thu được không có hiện tượng nhiễm và tỷ

lệ sống đạt 87,5%. Đây cũng là công thức hiệu quả nhất trong các thí nghiệm

trên, hạt trắng sạch (hình 3.9). Tuy nhiên sau 04 tuần nuôi cấy chưa nhận thấy

hạt có sự thay đổi nào.

Hình 3.9. Mẫu hạt sạch cây Thất diệp nhất chi hoa cấy

trên môi trƣờng MS cơ bản

3.4.1.2. Kết quả khử trùng mẫu lá cây Thất diệp nhất chi hoa

Chúng tôi sử dụng HgCl2 và javen để khử trùng lá cây Thất diệp nhất chi

hoa . Việc khử trùng được thực hiện theo 03 cách như mô tả ở mục 2.2.3, mỗi

39

công thức được thí nghiệm trên 20 bình mẫu lá (mỗi bình mẫu bố trí 6 mảnh lá).

Mẫu khử trùng được cấy lên môi trường MS cơ bản, đánh giá kết quả khử trùng

sau 02 tuần nuôi cấy thể hiện ở bảng 3.8.

Bảng 3.8. Kết quả khử trùng lá cây Thất diệp nhất chi hoa

(Sau 2 tuần nuôi cấy)

Tỷ lệ mẫu sạch Nồng độ Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) (%)

CT1 35 65

CT2 75 25

CT3 95 5

Nhìn vào bảng 3.8, lá của cây Thất diệp nhất chi hoa được khử trùng theo

3 công thức khác nhau sau khi khử trùng, lá được cắt thành từng mảnh nhỏ có

kích thước rộng khoảng 1cm dài 1,5cm sau đó cấy trên môi trường MS cơ bản.

Sau 02 tuần theo dõi kết quả thu được: công thức 1 sử dụng javen với nồng độ

7% để khử trùng lá trong 10 phút, sau 2 tuần nuôi cấy kết quả thu được 65%

mẫu lá sạch, khi tăng thời gian khử trùng javen nồng độ 7% lên 15 phút ở công

thức 2 nhận thấy tỷ lệ mẫu sạch giảm còn 25%, trong khi đó tỷ lệ mẫu nhiễm

tăng lên từ 35 đến 75%. Công thức 3 khử trùng lá cây Thất diệp nhất chi hoa

bằng cồn 70% trong 1 phút, javen 20% trong 10 phút và HgCl2 0,1% trong 5

phút, kết quả tỉ lệ mẫu nhiễm chiếm cao nhất tới 95%, mẫu sạch chỉ đạt 5%.

Như vậy, trong 3 công thức khử trùng lá của cây Thất diệp nhất chi hoa thì công

thức khử trùng lá đạt hiệu quả cao nhất là công thức 1 chiếm 65% mẫu sạch,

40

thấp nhất là công thức 3 đạt 5% mẫu sạch.

3.4.1.3 Kết quả khử trùng củ Thất diệp nhất chi hoa

Củ Thất diệp nhất chi hoa sau khi được rửa sạch bằng xà phòng và nước

máy được đưa vào khử trùng bằng cồn, javen và thủy ngân HgCl2 theo các bước

mô tả ở mục 2.2.4 ở các nồng độ khác nhau cấy trên môi trường MS cơ bản sau

02 tuần khử trùng chúng tôi thu được kết quả thể hiện ở bảng 3.9.

Bảng 3.9. Kết quả khử trùng củ Thất diệp nhất chi hoa (Sau 2 tuần)

Công thức khử Số lƣợng củ mẫu nhiễm mẫu sạch trùng (CT)

CT1 25 24 1

CT2 25 23 2

CT3 25 10 15

CT4 25 16 9

Nhìn vào bảng 3.9 củ Thất diệp nhất chi hoa được khử trùng với 4 công

thức khác nhau trong 4 công thức có sự kết hợp của 3 hóa chất đó là cồn 70%,

javen 7% và HgCl2 0,1%. Trong đó, cồn được sử dụng để khử trùng ở cả 4 công

thức được giữ nguyên thời gian khử trùng là 3 phút, javen 7% tăng dần thời gian

khử trùng từ CT1 đến CT4 là 3 phút đến 9 phút mỗi công thức cách nhau 2

phút. HgCl2 0,1% tăng dần thời gian khử trùng từ 4 đến 7 phút. Qua 4 CT trên

nhận thấy CT1 và CT2 đạt tỷ lệ mẫu sạch thấp trong đó CT1 là thấp nhất chỉ thu

được 1 mẫu sạch, CT2 thu được 2 mẫu sạch, tiếp đến là CT4 đạt 9 mẫu sạch.

CT3 thu được 15 mẫu sạch và đây cũng chính là công thức đạt hiệu quả khử

41

trùng mẫu củ cao nhất trong 4 CT khử trùng trên.

Hình 3.10. Mẫu sạch khử trùng củ Thất diệp nhất chi hoa

3.4.2. Kết quả thăm dò môi trường nảy mầm và phát sinh hình thái của các mẫu

nghiên cứu

Từ những năm 50 của thế kỷ XX, người ta đã nhận thấy vai trò của nhóm

cytokinin có ảnh hưởng rõ rệt và đặc trưng lên sự phân hóa các cơ quan của

thực vật đặc biệt là sự phân hóa chồi. Vì vậy, để tăng hệ số nhân, người ta đã sử

sụng thêm một số chất có trong nhóm cytokinin trong môi trường nuôi cấy.

3.4.2.1. Kết quả thăm dò môi trường nảy mầm của hạt

a. Ảnh hưởng của GA3 đến hệ số nảy mầm của hạt

GA3 là một loại của gibberellin có công thức hóa học là C19H22O6.

Gibberellin kích thích sự nảy mầm của hạt, nảy chồi của các mầm, do đó nó có

tác dụng trong việc phá bỏ trạng thái ngủ nghỉ của cây [63]. Theo kinh nghiệm

thực tiễn của người dân, hạt Thất diệp nhất chi hoa có thời gian ngủ dài, sau khi

thu hoạch hạt đem gieo trồng thì sau 5 - 8 tháng hạt mới nảy mầm. Chính vì

vậy, chúng tôi đã sử dụng hạt cây Thất diệp nhất chi hoa cấy trên môi trường

MS cơ bản có bổ sung GA3 nồng độ từ 0,3mg/l đến 1,9 mg/l để thăm dò môi

trường nảy mầm của hạt. Tuy nhiên, sau 05 tuần theo dõi nhận thấy hạt không

có bất kỳ sự thay đổi nào của hạt.

b. Ảnh hưởng của BAP đến sự biến đổi của hạt

BAP là một chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin được sử

dụng thông dụng, nên trong nghiên cứu chúng tôi chọn cấy hạt trên môi

42

trường MS có bổ sung BAP để khảo sát khả năng nảy mầm ở cây Thất diệp

nhất chi hoa ở các theo thí nghiệm 7. Sau 04 tuần nuôi cấy cũng không nhận

thấy sự thay đổi nào của hạt.

3.4.2.2. Kết quả thăm dò môi trường phát sinh hình thái mô lá

Quá trình tái sinh của cây in vitro có thể thông qua con đường trực tiếp

hoặc gián tiếp qua giai đoạn mô sẹo. Với mục tiêu tạo ra các khối mô sẹo từ lá,

chúng tôi đã bổ sung vào môi trường nuôi cấy các chất kích thích sinh trưởng

loại 2,4D, IBA và BAP nồng độ từ 1mg/l đến 4mg/l, bước nhảy 0,5mg/l. Sau 03

tuần theo dõi mẫu lá có bổ sung 2,4-D nhận thấy mẫu lá bị mất màu diệp lục

chuyển sang màu vàng, còn mẫu lá có bổ sung BAP và IBA chuyển dần sang

vàng và chết đen.

Như vậy, cả ba loại auxin ở những nồng độ trên đều không có tác dụng kích

thích hình thành mô sẹo và tạo chồi ở lá cây Thất diệp nhất chi hoa hình 3.11

Hình 3.11. Ảnh hƣởng của chất ĐHST đến sự phát sinh hình thái mô lá.

3.4.2.3. Kết quả thăm dò môi trường biến đổi của tế bào lớp mỏng từ củ

43

Xuất phát từ những thành công của các công trình nghiên cứu nuôi cấy tế bào lớp mỏng cây khoai môn sọ [19] và cây Sâm ngọc linh [28]. Chúng tôi tiến hành tạo tế bào lớp mỏng cắt ngang từ củ cây Thất diệp nhất chi hoa. Các lát cắt mỏng có kích thước rộng 0,5cm, dài 1cm và dày 0,2cm, Cấy trên môi trường MS cơ bản có bổ sung kích thích sinh trưởng IBA, 2,4-D, ở các nồng độ từ 0,2mg/l đến 1,4mg/l bước nhảy giữa mỗi nồng độ là 0,2mg/l. Sau 08 tuần nuôi cấy, các mô nuôi cấy cũng không có hiện tượng tạo mô sẹo hay tạo đa chồi xuất hiện. Sau 08 tuần các mảnh mẫu có hiện tượng úa dần và chết hình 3.12.

IBA

ĐC

BAP

2,4D

Hình 3.12. Mẫu sạch từ củ cây Thất diệp nhất chi hoa trên môi trƣờng MS có bổ sung thêm các chất kích thích sinh trƣởng

3.4.2.4. Kết quả thăm dò môi trường biến đổi của chồi củ nguyên vẹn

Sau khi thực hiện với phương pháp nuôi cây tế bào lớp mỏng trên không

thu được kết quả mong muốn. Chúng tôi đã chuyển sang phương pháp nuôi cấy

giữ nguyên phần thân củ, sau khi thu mẫu củ sạch chúng tôi tiến hành chuyển

tổng số 21 mẫu sang môi trường có bổ sung BAP nồng độ từ 0,5mg/l đến 2,0

mg/l. Kết quả theo dõi sau 30 ngày, chúng tôi thu được kết quả ở bảng 3.9.

Bảng 3.10. Ảnh hƣởng của các chất ĐHST đến hệ số nảy mầm của củ

Công thức Nồng độ Số mẫu Tỷ lệ bật chồi

0,5 4 1

BAP 1,0 4 0

2,0 4 0

0,5 4 1 BAP + than hoạt

44

tính 1,0 5 0

Bảng số liệu 3.10 cho ta thấy, đã thu được 02 mẫu nuôi cấy trên môi trường

có bổ sung BAP ở nồng độ 0,5mg/l đã bật chồi, tuy nhiên qua quan sát tôi nhận thấy

mẫu có bổ sung thêm than hoạt tính củ ra chồi và phát triển nhanh hơn mẫu không

có bổ sung than hoạt tính, tính từ thời điểm bật chồi trong 30 ngày mẫu có bổ sung

than hoạt tính có chiều cao hơn 7cm, trong khi đó mẫu không có than hoạt tính chỉ

đạt chiều cao chồi 1,5cm, còn lại 05 mẫu MS cơ bản làm đối chứng không nhận thấy

có sự thay đổi nào.

So với các thí phương pháp nghiệm trên khi sử dụng chất kích thích sinh

trưởng trên mảnh lá, hạt, hay củ lát mỏng đều nhận thấy có biệu hiện của sự sống,

thì phương pháp thí nghiệm nuôi cấy thân củ trên môi trường MS cơ bản có bổ

sung BAP nồng độ 0,5mg/l và bổ sung than hoạt hoạt tính là hiệu quả nhất.

Hình 3.13. Mẫu củ bật chồi có bổ sung BAP 0,5mg/l + Than hoạt tính

45

Hình 3.14. Mẫu củ bật chồi bổ sung BAP 0.5mg/l

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

1. KẾT LUẬN

1. Cây Thất diệp nhất chi hoa có mặt ở 3 tỉnh Lạng Sơn, Hà Giang và

Lào Cai của Việt Nam có dạng dị thảo từ hai đến tám lá.

2. Cây Thất diệp nhất chi hoa có thể nhân giống vô tính tại Thái Nguyên

trên giá thể hỗn hợp đất và cát theo tỷ lệ 1:1, trong điều kiện nhiệt độ 25oC ± 2, độ

ẩm 50% - 70%.

3. Hạt trưởng thành của cây Thất diệp nhất chi hoa khử trùng bằng hỗn

hợp HCl và javen với tỉ lệ 4 : 20ml trong 16 giờ, thu được 90% mẫu sạch; Lá

được khử trùng bằng javen 7% trong 15 phút thu được 65% mẫu sạch; Củ khử

trùng bằng hỗn hợp javen 70% trong 7 phút + HgCl 0.1% trong 6 phút thu được

60% mẫu sạch.

Môi trường nuôi cấy thân củ gồm MS cơ bản + BAP 0,5mg/l + than hoạt

tính đã thu được 02 mẫu bật chồi trong ống nghiệm

4. Sử dụng cặp mồi đặc hiệu rpoC1-1f/rpoC1-3r đã khuếch đại thành

công gen rpoC1 từ DNA cây Thất diệp nhất chi hoa . Gen rpoC1 có kích thước

558 nucleotide. Trình tự nucleotit gen rpoC1của cây Thất diệp nhất cho hoa có

mối quan hệ gần gũi nhất với loài Paris verticillata voucher (độ tương đồng

99% ).

2. ĐỀ NGHỊ

1. Tiếp tục nhân giống vô tính cây Thất diệp nhất chi hoa nhằm lưu giữ và

phát triển nguồn gen cây thuốc quý.

2. Tiếp tục nghiên cứu giám định mẫu cây Thất diệp nhất chi hoa thu thập

46

được các loài khác của cây Thất diệp nhất chi hoa.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu Tiếng Việt

1. Nguyễn Thị Lý Anh, Đinh Thị Phòng (2007), Công nghệ nuôi cấy mô, NXB

Nông nghiệp Hà Nội.

2. Lê Trần Chấn, Trần Ngọc Ninh, Trần Thị Thúy Vân (2013), “Đa dạng sinh

học và giải pháp bảo, phát triền bền vững vùng núi đá vôi ở tỉnh Hà

Giang”, Hội thảo khoa học và diễn đàn đầu tư Vì Hà Giang phát triển,

115-120.

3. Lê Thị Kim Đào, Lê Thị Hạnh, Huỳnh Xuân Trường, Đỗ Thị Thu Hiền,

Đoàn Minh Hải (2002), “Nghiên cứu thử nghiệm nhân một số cây trồng

rừng bằng phương pháp nuôi cấy mô (bạch đàn E. urophylla, cây hồng,

giổi xanh, trầm hương)”, Trung tâm ứng dụng tiến bộ khoa học kỹ thuật

Bình Định, Báo cáo tổng kết khoa học và kỹ thuật dự án SXTN KC.04-

DA9, 9-11.

4. Lê Hồng Giang và Nguyễn Bảo Toàn (2011), “Sự hình thành mô sẹo, phôi

và cây con ở cây Mỏ quạ in vitro (Dischidia Raflesiana Wall)”, Tạp chí

Khoa học, Trường Đại học Cần Thơ, 20a 61-67.

5. Mai Thị Phương Hoa, Đỗ Tiến Vinh (2012), “Thực hành nuôi cấy mô tế bào

thực vật”, Tạp trí Khoa học Trường Đại học Nguyễn Tất Thành, 2-13.

6. Lê Thị Thanh Hương, Trần Thị Ngọc Anh, Nguyễn Thị Ngọc Yến, Nguyễn

Trung Thành, Nguyễn Nghĩa Thìn (2012), “Thực trạng các loài cây thuốc

quý hiếm tại tỉnh Thái Nguyên”, Tạp chí Khoa học Đại học Quốc gia Hà

Nội, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, 28:173-194.

7. Hoàng Thị Kim Hồng (2011), nghiên cứu khả năng tái sinh chồi và cụm

chồi trong nuôi cấy in vitro cây Hà thủ ô đỏ (Polygonum multiflorunb.),

Tạp chí khoa học, Đại học Huế, 64(1), 23-32.

8. Dương Công Kiên (2002), Nuôi cấy mô thực vật, NXB Đại Học Quốc Gia

47

Tp. Hồ Chí Minh.

9. Đỗ Tất Lợi (2014), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Hồng Đức.

10. Mai Xuân Lương, Nguyễn Văn Kết (1994), “Ứng dụng nuôi cấy mô trong nhân

giống cây cẩm chướng”, Tạp chí khoa học, Đại học tổng hợp Đà Lạt, 7-11.

11. Phan Lê, Lê Quý Ngưu, Tú Văn Lương (2002), Cây thuốc phòng trị ung

thư, NXB Thuận Hóa, Huế.

12. Trần Đình Long (1996), Chiến lược bảo tồn và sử dụng nguồn tài nguyên di

truyền cây trồng Việt Nam, Tài nguyên di truyền thực vật Việt Nam, NXB

Nông nghiệp Hà Nội, 54-61.

13. Vũ Triệu Mân (1986), Bệnh virus hại khoai tây, NXB khoa học Hà Nội.

14. Trần Văn Minh, Bùi Thị Tường Thu (2007), “Ứng dụng công nghệ tế bào thực

vật bảo tồn nguồn gen lát hoa Côn Đảo (Chukrasia taburais A. Juss)”, Hội

nghị Khoa học và Công nghệ - Viện Sinh học Nhiệt Đới, 367- 371.

15. Nguyễn Thị Quỳnh (2005), “Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi

trường lên sự tăng trưởng của một số cây thân gỗ nhiệt đới và cận nhiệt đới

trong điều kiện nuôi cấy in vitro”, Hội nghị tổng kết NCCB trong KHTN khu

vực phía Nam, NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội, 42 - 44.

16. Mai Thị Tân (1993), “Phục tráng giống khoai tây Thường Tín bằng phương

pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng”, Kết quả nghiên cứu khoa học khoa trồng

trọt, Trường Đại học Nông Nghiệp 1, NXB Hà Nội, Tr 90 - 94.

17. Nguyễn Thị Tần (2013), “Cây dược liệu - lợi thế để người dân vùng cao Lào

Cai thoát nghèo”, Tạp chí kinh tế kỹ thuật Lào Cai:24: 455.

18. Hoàng Minh Tấn, Vũ Quang Sáng, Nguyễn Kim Thanh, (2004), Sinh lý thực

vật, NXB Đại học Sư phạm Hà Nội.

19. Nguyễn Quang Thạch, Đào Huy Chiên, Đỗ Thị Bích Nga (2010), Kết quả

nghiên cứu nhân giống khoai môn sọ bằng phương pháp in vitro, Kết quả

nghiên cứu khoa học công nghệ 2006 - 2010, Viện Khoa học Nông nghiệp

Việt Nam, NXB Nông nghiệp Hà Nội, 573 - 580.

48

20. Đoàn Thị Ái Thuyền, Nguyễn Thị Quỳnh, Trần Văn Minh, Nguyễn Đức

Hùng (1993) “Nhân Giống chuối bằng phương pháp cấy mô”, NXB Nông

nghiệp, TP Hồ Chí Minh.

21. Trung tâm nghiên cứu Tài nguyên và Môi trường Đại học Quốc gia Hà Nội,

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật - Trung tâm Khoa học tự nhiên và

Công nghệ Quốc gia (2001-2005), Danh lục các loài thực vật Việt Nam,

tập 1-3, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.

22. Nguyễn Văn Uyển (1985), Ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật trong

công tác chọn giống cây trồng, NXB TP. Hồ Chí Minh.

23. Đỗ Năng Vịnh (2002), Công nghệ sinh học cây trồng, NXB Nông Nghiệp Hà Nội.

24. Viện Khoa học và Công Nghệ Việt Nam, Sách đỏ Việt Nam, 2007.

25. Viện dược liệu (2003), “Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam”, tập

1 NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội, 182-184.

26. Vũ Văn Vụ (1992), Sinh lý thực vật ứng dụng, NXB Giáo dục.

Tài liệu nƣớc ngoài

27. Bammi, R.K., Randhava, G.S (1975), Dioscorea Improvement Project -

Status Report. IJHR. Bangalore.

28. Bhojwani S.S (1980), factors affecting in vitro stage of micropropagation.

Plant physiol., 65: 90.

29. Chaturvedi, H.C., Sinha, M. (1979), Mass propagation of Dioscorea

floribunda by tissue culture. Ext. Bull. No 6. NBRI. Lucknow. India.

30. Do,H.D.K., Kim,J.S., Kim,J.H.(2014), “Paris verticillata voucher KWU02222

plastid, complete genome”, Genome Biol Evol 6 (7), 1699-1706.

31. Doyle. JJ, JL. Doyle (1987), A rapid DNA isolation procedure for small

quantities of fresh leaf tissue. Phytochem Bull 19: 11-15.

32. Deng, D., Lauren, D.R., Cooney, J.M., Jensen, D.J., Wurms, K.V.,

Upritchard, J.E., Cannon, R.D., Wang, M.Z., Li, M.Z. (2008), Antifungal

49

saponins from Paris polyphylla Smith. Planta Med 24(11): 1397-1402.

33. Devkota, K.P. (2005), “Bioprospecting studies on Sarcococca hookeriana

Bail, Sonchus wightianus DC, Paris polyphylla Smith and related

Medicinal Herbs of Nepal”, Ph D Thesis, HEJResearch Institute of

Chemistry, International Centre for Chemical Science, University of

Karachi Pakistan, Karachi 75,270.

34. Ford C.S, Ayres K.L, Toomey (2009), Selection of candidate coding DNA

barcoding regions for use on DNA plants. Botanical Journal of the

Linnean Society, 159 (1): 1 - 11.

35. Haberlandt, G. (1902) Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen.

Sitzungsber. Akad. Wiss. Wien. Math.-Naturwiss. Kl., Abt. J. 111, 69 - 92.

36. Jun, Z (1989), “Some bioactive substances from plants of West china”, Pure

& Appl Chem, 61(3), 457 - 460.

37. Kim M. Wilson, Mark A. Schembri, Peter D. Baker, Christopher P. Saint,

(2000), ”Molecular characterization of the toxic cyanobacterium

cylindrospermopsis raciborskii and design of a Species-Specific PCR”,

Applied and Environmental Microbiology, 66 (1) 332 - 338 .

38. Kumar M.H., Dhiman V., Choudhary R., Chikara A. (2014), Anticancer

activity of hydroalcoholic extracts from Paris polyphylla rhizomes

against human A549 lung cancer cell lines using MMT assay, IRJP,

5(4): 290 - 294.

39. Lee KH, Kwon KR, Kang Wm, Jeon EM, Jang JH (2010), ”Identification

and analysis of the chloroplast rpoC1 gene differentially expressed in wild

giseng” , J Pharmacopuncture, 15(2): 20-3

40. Lee M.S., Yuet-Wa J.C., Kong S.K., Yu B., EngChoon V.O., Nai-Ching

H.W., Wai T.M., Fung K.P. (2005), Effects of polyphyllin D, a steroidal

saponin in Paris polyphylla, in growth inhibition of human breast cancer

cells and in xenograft, Cancer Bio. Ther., 4(11): 1248-1254.

41. Li P. K., Yi X. L., Tolga E., Else D., He S. Y., Yang Z., Cheng Q. X., Chao

L., Thomas E., Bai P. M. (2012), “Polyhydroxylated Steroidal Glycosides

50

from Paris polyphylla”, Journal of Natural Products, 75, 1201-1205.

42. Li F.R., Jiao P., Yao S.T., Sang H., Qin S.C., Zhang W., Zhang Y.B., Gao

L.L. (2012), Paris polyphylla Smith extract induces apoptosis and activates

cancer suppressor gene connexin26 expression, Asian Pac. J. Cancer Prev,

13(1): 205-209.

43. Limasset cad Cornel (1949), Recherche du virus de la masoïque du tabac

(Marmor tabaci Holmes) dans les méristèmes des plantes infectées, C.R

Acad. Sci Paris 228. 1888-1890.

44. Murashige T. (1980) Plant Growth, Substances & Commercial uses of

tissues verlarg, Berlin, Heidelberg, Newyork, 642-677.

45. Murashige T, Skoog F (1962), A revised medium for rapid growth on bio -

assays with tabaco tissue culture. Physiol Plantar. 15: 473-477.

46. Murashige, T., Serpa, M., Jones, J.B. (1974), Clonal multiplication of

Gerbera Through tissue culture. Hortcience, 9, 175-180.

47. Morel, Martin (1952), Guerison de pomes de terre attains d’une maladie a

virus. C.R Acad. Sci: 235, 1324 - 1325.

48. Staritsky, G. (1970), Tissue culture of the oil palm (Elaeis guineensis Jacq)

as a tool for its vegetative propagation, Euphytica, 288 - 292.

49. Vijayan K, Tsoul C. H (2010). DNA barcoding in plant: taxonomy in a new

perspective, Curent Science, 99 (11): 1530-1538.

50. Wang Qiang (2005): Acta Botanica of nanging pharmaceutical University in

press, Journal of Chinese Pharmaceutical, 14(3), 1.762.180.

51. Yan, L.L., Zhang, Y.J., Gao, W.J., Man, S.L., Wang, L. (2009), In vitro

anticancer activity of steroid saponins of Paris polyphylla var.

yunnanensis. Exp. Oncol., 31(1): 27-32.

Trang Website

52. https://vi.wikipedia.org

53. ww.langson.gov.vn/binhgia/.../DE%20AN%20NTM%20BINH%20GIA..

51

54. http://duan600.vn/huyen-ngheo/Huyen-Quan-Ba-Ha-Giang-28/

55. http://trungtamhoclieuthainguyen.com/chi-tiet/danh-gia-da-dang-sinh-hoc-

thuc-vat-dac-huu-va-quy-hiem-tai-vuon-quoc-gia-hoang-lien-huyen-sa-pa-

tinh-lao-cai-38747.html

56. http://timtailieu.vn/tai-lieu/phan-loai-sinh-hoc-phan-tu-32678/

57. http://text.123doc.org/document/2575722-dai-cuong-ve-phan-loai-hoc-thuc-

vat.htm

58. http://www. botanyvn.com/default.asp

59. http://www.baithuocquy.com/suc-khoe/bai-thuoc-tu-cay-that-diep-nhat-chi-

mai/d3277

60. http://www.zhongyao.org.cn/zy/tp/gj/201102/246087.html

61. https://websrv1.ctu.edu.vn/coursewares/supham/phanloaitv/ch1.htm

62. http://www.vnbiobarcode.org/publication?id=27

63. http://www.bvtvhcm.gov.vn/handbook.php?id=13&cid=1

52

64. http://www.ncbi.nlm.nih.gov