Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Tạo dòng tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên A (nhóm máu A) trên màng tế bào hồng cầu người

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

- - - - -  - - - - -

Nguyễn Thị Hằng

TẠO DÒNG TẾ BÀO LAI SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ĐƠN

DÒNG KHÁNG KHÁNG NGUYÊN A (NHÓM MÁU A)

TRÊN MÀNG TẾ BÀO HỒNG CẦU NGƢỜI

Chuyên ngành sinh học thực nghiệm

Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC

TS. Nguyễn Thị Trung

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

HÀ NỘI, 12/2015

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả đƣợc công bố trong luận văn là hoàn

toàn trung thực, chính xác và chƣa đƣợc công bố ở bất kỳ công trình nào khác.

Hà Nội, ngày tháng năm 2015

Học viên

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Nguyễn Thị Hằng

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thà nh tớ i TS. Nguyễn Thị Trung chủ

nhiệm đề tài KC04.13/11-15 đã hết lòng giúp đỡ, động viên và tạo mọi điều kiện

thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu để hoàn thành luận văn tốt

nghiệp.

Tiếp theo, tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn tới các thầy, cô của trường Đại học

Thái Nguyên, Viện Sinh thái và Tài Nguyên sinh vật và các thầy, cô của Viện Công

nghệ sinh học đã nhiệt tình giảng dạy cho tôi trong suốt thời gian tham gia khóa học.

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn TS. Lê Văn Phan, ThS. Vũ Thị Thu Hằng,

BSTY. Thân Đức Dương và các cán bộ phòng kiểm nghiệm – Công ty cổ phần phát

triển công nghệ nông thôn đã tạo mọi điều kiện để tôi thực hiện luận văn tốt nghiệp.

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến GS. TS. Trương Nam Hải và các

cán bộ phòng Kỹ thuật di truyền, những người thân trong gia đình cùng bạn bè đã

luôn hỗ trợ, động viên, khuyến khích tôi trong suốt quá trình học tập.

Hà Nội, ngày tháng năm 2015

Học viên

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Nguyễn Thị Hằng

iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................................. i

LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................................... ii

DANH MỤC HÌNH............................................................................................................ vi

DANH MỤC BẢNG ........................................................................................................ viii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................................. ix

MỞ ĐẦU ............................................................................................................................. 1

NỘI DUNG .......................................................................................................................... 3

Chƣơng 1. Tổng quan .......................................................................................................... 3

1.1. Tổng quan về miễn dịch ............................................................................................... 3

1.1.1. Hệ miễn dịch .............................................................................................................. 3

1.1.2. Hệ thống miễn dịch bẩm sinh .................................................................................... 4

1.1.3. Hệ thống miễn dịch thích ứng ................................................................................... 5

1.1.3.1. Đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào ............................................................... 7

1.1.3.2. Đáp ứng miễn dịch dịch thể .................................................................................... 8

1.1.4. Kháng nguyên ............................................................................................................ 9

1.1.5. Kháng thể ................................................................................................................. 10

1.2. Khái quát về hệ thống nhóm máu ngƣời .................................................................... 12

1.2.1. Phân loại hệ thống nhóm máu ở ngƣời .................................................................... 12

1.2.2. Hệ thống nhóm máu ABO ....................................................................................... 13

1.2.3. Vai trò của máu trong y học .................................................................................... 14

1.2.4. Truyền máu và nguyên tắc truyền máu ................................................................... 14

1.2.5. Phƣơng pháp xác định nhóm máu hệ ABO ............................................................. 15

1.3. Kháng thể đơn dòng.................................................................................................... 16

1.3.1. Công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng ................................................................. 16

1.3.2. Sản xuất kháng thể đơn dòng bằng công nghệ tế bào lai ........................................ 19

1.3.3. Vai trò của kháng thể đơn dòng ............................................................................... 20

1.3.4. Tình hình sản xuất kháng thể đơn dòng đặc hiệu kháng nguyên nhóm máu hệ

ABO ................................................................................................................................... 21

1.4. Động lực học sinh trƣởng và sản xuất của tế bào động vật ........................................ 21

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Chƣơng 2. Vật liệu và phƣơng pháp .................................................................................. 25

2.1. Vật liệu ....................................................................................................................... 25

2.1.1. Động vật .................................................................................................................. 25

2.1.2. Hồng cầu mẫu .......................................................................................................... 25

2.1.3. Dòng tế bào myeloma .............................................................................................. 25

2.1.3. Hóa chất ................................................................................................................... 25

2.1.4. Máy móc thiết bị ...................................................................................................... 26

2.2. Phƣơng pháp ............................................................................................................... 26

2.2.1. Gây miễn dịch .......................................................................................................... 26

2.2.2. Chuẩn bị tế bào nền ................................................................................................. 27

2.2.3. Nuôi cấy tế bào myeloma ........................................................................................ 28

2.2.4. Dung hợp và tạo dòng tế bào lai .............................................................................. 29

2.2.5. Tách dòng tế bào lai................................................................................................. 31

2.2.6. Phản ứng ngƣng kết hồng cầu trên đĩa 96 giếng ..................................................... 32

2.2.7. Phản ứng ngƣng kết hồng cầu trên phiến kính ........................................................ 33

2.2.8. Phƣơng pháp đếm tế bào ......................................................................................... 33

2.2.9. Xây dựng đƣờng cong sinh trƣởng để nghiên cứu sự sinh trƣởng và sản xuất

kháng thể của các dòng tế bào lai ...................................................................................... 33

2.2.10. Xác định loại globulin miễn dịch .......................................................................... 34

2.2.11. Loại bỏ phenol bằng ammonium sulfate ............................................................... 35

2.2.12. Tạo sinh phẩm xác định nhóm máu A ................................................................... 36

2.2.13. Xác định độ đặc hiệu ............................................................................................. 36

2.2.14. Xác định hiệu giá ................................................................................................... 36

2.2.15. Xác định cƣờng độ và ái tính ................................................................................. 36

Chƣơng 3. Kết quả ............................................................................................................. 38 3.1. Đánh giá hiệu quả gây miễn dịch của hồng cầu mẫu A+ ............................................ 38

3.2. Dung hợp tạo tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên A ......... 39

3.3. Sàng lọc hỗn hợp tế bào lai sản xuất kháng thể kháng kháng nguyên A ................... 41

3.4. Tạo dòng tế bào lai đơn sản xuất kháng thể đơn dòng kháng lại kháng nguyên A .... 43

3.5. Xác định phân lớp kháng thể do dòng tế bào A6G11C9 sản xuất ............................. 44

3.6. Sự sinh trƣởng và sản xuất kháng thể của dòng tế bào lai A6G11C9 tiết kháng thể

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

kháng kháng nguyên A ...................................................................................................... 45

3.7. Hiệu giá kháng thể trong dịch nuôi cấy tế bào lai A6G11C9 ..................................... 49

3.8. Độ nhạy và độ đặc hiệu của kháng thể do dòng tế bào lai A6G11C9 sản xuất ......... 50

3.9. Loại bỏ phenol đỏ ra khỏi dịch nuôi cấy tế bào lai A6G11C9 bằng phƣơng pháp

tủa ammonium sulfate ....................................................................................................... 52

3.10. Tạo sinh phẩm xác định nhóm máu A ...................................................................... 55

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................................... 57

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................... 58

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Thành phần của đáp ứng miễn dịch bẩm sinh và đáp ứng miễn dịch đặc hiệu

............................................................................................................................................. 3

Hình 1.2. Quá trình thực bào .............................................................................................. 4

Hình 1.3. Cách tế bào NK và protein bổ thể tạo lỗ trên màng để tiêu diệt tế bào lây

nhiễm tác nhân gây bệnh ..................................................................................................... 5

Hình 1.4. Tế bào T bám vào kháng nguyên lạ liên kết với protein MHC ........................... 6

Hình 1.5. Kháng nguyên đƣợc hiện diện cùng protein MHC ............................................. 7

Hình 1.6. Hàng rào miễn dịch tế bào T .............................................................................. 8

Hình 1.7. Hàng rào miễn dịch tế bào B ............................................................................... 9

Hình 1.8. Cấu trúc của phân tử kháng thể ......................................................................... 11

Hình 1.9. Kháng nguyên nhóm máu của ngƣời ................................................................. 13

Hình 1.10. Sơ đồ truyền máu ............................................................................................. 15

Hình 1.11. Các phƣơng pháp sản xuất kháng thể đơn dòng .............................................. 19

Hình 1.12. Công nghệ tế bào lai ........................................................................................ 20

Hình 1.13. Phản ứng ngƣng kết giữa kháng nguyên - kháng thể ...................................... 21

Hình 1.14. Đƣờng cong sinh trƣởng của tế bào ................................................................ 24

Hình 2.1. Tế bào đại thực bào khi nuôi cấy tĩnh……………………………………........28

Hình 2.2. Sơ đồ pha loãng tới hạn ..................................................................................... 31

Hình 2.3. Phản ứng ngƣng kết hồng cầu trên đĩa đáy chữ V............................................. 32

Hình 2.4. Cách đọc kết của của phản ứng ngƣng kết hồng cầu trên đĩa 96 đáy chữ V ..... 32

Hình 2.5. Buồng đếm tế bào .............................................................................................. 33

Hình 2.6. Cơ chế và cách đọc kết quả của phản ứng ELISA xác định phân lớp kháng

thể ...................................................................................................................................... 35

Hình 3.1. Phản ứng ngƣng kết giữa huyết thanh của chuột đƣợc gây miễn dịch với hồng cầu mẫu A+, B+, O+ 38

Hình 3.2. Lách và hạch vùng kheo thu đƣợc từ chuột đƣợc gây miễn dịch với hồng

cầu mẫu A+ ........................................................................................................................ 39

Hình 3.3. Tế bào sau dung hợp .......................................................................................... 40

Hình 3.4. Tế bào lai hình thành sau 6 ngày dung hợp ....................................................... 40

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Hình 3.5. Tế bào lai sau 2 ngày dung hợp ở các giếng khác nhau .................................... 41

vii

Hình 3.6. Sự phát triển của tế bào lai ................................................................................ 42

Hình 3.7. Sàng lọc giếng chứa hỗn hợp tế bào lai sản xuất kháng thể kháng kháng

nguyên A ............................................................................................................................ 43

Hình 3.8. Sàng lọc dòng tế bào lai đơn sản xuất kháng thể kháng kháng nguyên A ........ 44

Hình 3.9. Chọn dòng tế bào lai sản xuất kháng thể kháng kháng nguyên A tốt nhất ....... 44

Hình 3.10. Phản ứng ELISA xác định isotye kháng thể .................................................... 45

Hình 3.11. Đƣờng cong sinh trƣởng của dòng tế bào lai A6G11C9 trong môi trƣờng

DMEM + 10% FBS ........................................................................................................... 47

Hình 3.12. Đƣờng cong sinh trƣởng của dòng tế bào lai A6G11C9 khi nuôi cấy trong

môi trƣờng có nồng độ huyết thanh thấp DMEM + 1%FBS ............................................ 48

Hình 3.13. Đồ thị biểu thị sự hình thành kháng thể của dòng tế bào A6G11C9 khi nuôi

cấy trong môi trƣờng DMEM + 10% FBS ........................................................................ 49

Hình 3.14. Đồ thị biểu thị sự hình thành kháng thể của dòng tế bào A6G11C9 khi nuôi

cấy trong môi trƣờng DMEM + 1% FBS .......................................................................... 49

Hình 3.15. Xác định hiệu giá kháng thể bằng phƣơng pháp ngƣng kết hồng cầu ............ 50

Hình 3.16. Phản ứng ngƣng kết hồng cầu trên đĩa 96 giếng đáy chữ V xác định độ đặc

hiệu của kháng thể ............................................................................................................. 51

Hình 3.17. Phản ứng ngƣng kết hồng cầu trên phiến kính xác định ái tính kháng thể và

cƣờng độ của phản ứng ngƣng kết..................................................................................... 52

Hình 3.18. Dịch nuôi cấy trƣớc và sau khi tủa ammonium sulphate ................................ 53

Hình 3.19. Độ đặc hiệu của kháng thể trƣớc và sau khi tủa .............................................. 54

Hình 3.20. Hiệu giá kháng thể trƣớc và sau khi tủa ammonium sulfate ........................... 54

Hình 3.21. Sinh phẩm A và phản ứng ngƣng kết hồng cầu của sinh phẩm với panel

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

hồng cầu hệ ABO .............................................................................................................. 56

viii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1. 1. Hƣỡng dẫn đọc kết quả của phƣơng pháp huyết thanh mẫu ............................ 16

Bảng 1. 2. Hƣỡng dẫn đọc kết quả của phƣơng pháp hồng cầu mẫu ................................ 16

Bảng 2. 1. Môi trƣờng sử dụng……………………………………………………….......25

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Bảng 2. 2. Một số dung dịch .............................................................................................. 26

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Từ viết đầy đủ

Major histocompatibility complex MHC

Antigen presenting cell APC

International society of blood transfusion ISBT

Ethylenediaminetetraacetic acid EDTA

Epstein – Barr virus EBV

Single chain fragment variable scFv

Variable domains of the heavy VH

Variable domains of the light VL

RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction

Enzyme-linked immunosorbent assay ELISA

Human monoclonal antibody hmAb

Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase HGPRT

Polyethylene glycol PEG

Hypoxanthyl aminoteptrin thymidine HAT

DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium

Fetal bovine serum FBS

Freund’s complete adjuvant FCA

Freund’s incomplete adjuvant FIA

Hypoxanthine thymine HT

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

DMSO Dimethylsulfoxide

MỞ ĐẦU

Máu đƣợc xem là một loại thuốc đặc biệt đƣợc sử dụng trong điều trị nội khoa,

cấp cứu ngoại khoa, sản khoa và triển khai nhiều kỹ thuật y học cao cấp nhƣ ghép

tạng, mổ tim, lọc máu ngoài thận... Tuy nhiên, có rất nhiều tai biến nguy hiểm xảy ra

khi sử dụng máu trong điều trị bệnh do có sự ngƣng kết giữa kháng nguyên trên màng

hồng cầu ngƣời cho với kháng thể trong huyết thanh của ngƣời nhận. Năm 2014, Hiệp

hội truyền máu quốc tế đã thống kê có 35 hệ nhóm máu với hơn 300 kháng nguyên

nhóm máu khác nhau. Hầu hết các kháng nguyên trên màng hồng cầu có tính sinh

miễn dịch yếu đƣợc dùng để nghiên cứu di truyền và quan hệ huyết thống, chỉ có hai

nhóm kháng nguyên đặc biệt quan trọng gây ra phản ứng ngƣng kết khi truyền máu

dẫn đến tai biến đó là kháng nguyên A, B của hệ nhóm máu ABO và kháng nguyên D

của hệ nhóm máu Rh. Để truyền máu thành công phải có sự tƣơng thích giữa máu

ngƣời cho và ngƣời nhận. Do đó, trƣớc khi truyền máu cần phải tiến hành xác định

nhóm máu. Nhóm máu đƣợc xác định bằng phƣơng pháp ngƣng kết sử dụng hồng cầu

mẫu hoặc huyết thanh mẫu. Huyết thanh mẫu chính là các kháng thể đơn dòng đặc

hiệu kháng nguyên nhóm máu, có 3 loại huyết thanh mẫu anti-A, anti-B, anti-AB đƣợc

sử dụng trong xác định nhóm máu hệ ABO và huyết thanh mẫu anti-D để xác định

nhóm máu hệ Rh. Nhiều phƣơng pháp đƣợc phát triển để sản xuất kháng thể đơn dòng

nhƣ công nghệ lai tế bào, công nghệ bất tử tế bào B, công nghệ phage display, công

nghệ kháng thể tái tổ hợp. Phƣơng pháp lai tế bào đã đƣợc đƣợc ứng dụng thành công

để tạo dòng tế bào lai sản xuất kháng thể kháng lại kháng nguyên nhóm máu hệ ABO.

Hiện nay, thuốc thử xác định nhóm máu có bản chất là các kháng thể đơn dòng đã

đƣợc sản xuất thành công nhƣ Blood Grouping (Prestige Diagnostics U.K.),

Monoclonal blood grouping reagent (Maxwin international), Anti – A Monoclonal

reagent (Atlas Medical), Transclone® (Biorad)….

Ngày nay, nhu cầu sử dụng máu trong điều trị bệnh ngày càng lớn do vậy nhu

cầu sử dụng huyết thanh mẫu ngày càng gia tăng. Tuy nhiên, Việt Nam vẫn chƣa sản

xuất đƣợc kháng thể đơn dòng xác định nhóm máu mà chủ yếu sử dụng hồng cầu mẫu

thu thập từ các tình nguyện viên hoặc kháng thể đơn dòng nhập ngoại. Việc sử dụng

thuốc thử xác định nhóm máu là hồng cầu mẫu tốn ít chi phí nhƣng lại mất rất nhiều Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

máu thu đƣợc từ tình nguyện viên. Còn việc sử dụng huyết thanh mẫu nhập ngoại lại

có giá thành cao nhƣ vậy chi phí để mua huyết thanh mẫu dùng trong xác định nhóm

máu cho số lƣợng máu thu gom hàng năm lên đến hàng trăm tỷ đồng sẽ làm tăng gánh

nặng kinh tế đối với bệnh nhân. Xuất phát từ những cơ sở khoa học và thực tiễn trên,

chúng tôi thực hiện đề tài“Tạo dòng tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng

kháng nguyên A (nhóm máu A) trên màng tế bào hồng cầu người” với mục tiêu tạo ra

dòng tế bào lai đơn sản xuất kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên A sử dụng nhƣ

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

thuốc thử xác định nhóm máu A ở ngƣời.

NỘI DUNG

Chƣơng 1. Tổng quan

1.1. Tổng quan về miễn dịch

1.1.1. Hệ miễn dịch

Hệ thống miễn dịch là một tập hợp của các tế bào, các mô và các phân tử có vai

trò bảo vệ cơ thể chống lại một lƣợng lớn các tác nhân gây bệnh (virus, vi khuẩn, nấm,

ký sinh trùng), sự sinh trƣởng của các tế bào ung thƣ và các độc tố của môi trƣờng

[35].

Lớp phòng thủ thứ nhất giúp cơ thể chống lại tác nhân gây bệnh là hàng rào vật

lý (da và màng nhày). Lớp phòng thủ này bao gồm các enzyme và dịch nhày có thể tấn

công trực tiếp tác nhân gây bệnh hoặc ức chế tác nhân gây bệnh để ngăn chặn sự xâm

nhập của chúng. Tuy nhiên, bề mặt keratine của da hoặc khoang cơ thể chứa dịch nhày

là môi trƣờng lý tƣởng cho hầu hết sinh vật do đó tác nhân gây bệnh có thể vƣợt qua

hàng rào vật lý này. Khi tác nhân gây bệnh vƣợt qua lớp phòng thủ thứ nhất đi vào cơ

thể, nó sẽ chạm trán với hệ thống miễn dịch của cơ thể.

Hình 1.1. Thành phần của đáp ứng miễn dịch bẩm sinh và đáp ứng miễn dịch đặc hiệu

[36]

Hệ thống này đƣợc chia thành hai loại: 1) hệ thống miễn dịch bẩm sinh đáp ứng

nhanh và không đặc hiệu, 2) hệ thống miễn dịch thích ứng đáp ứng chậm và đặc hiệu

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

với từng tác nhân gây bệnh. Mỗi loại khác nhau về cách nó đáp ứng với tác nhân gây

bệnh (nhanh hay chậm), các tế bào thẩm quyền miễn dịch và sự đặc hiệu của nó cho

từng loại tác nhân gây bệnh tuy nhiên cả hai loại đáp ứng miễn dịch đều có vai trò

quan trọng nhƣ nhau trong hệ miễn dịch [27, 33].

1.1.2. Hệ thống miễn dịch bẩm sinh

Hệ thống miễn dịch bẩm sinh bao gồm các hàng rào (vật lý, hóa học, sinh học),

thành phần tế bào (các tế bào thực bào, tế bào giết tự nhiên, tế bào tua) và thành phần

hóa học (protein bổ thể, các cytokine và protein cấp). Đặc điểm nổi bật của hệ thống

miễn dịch bẩm sinh là thiếu trí nhớ miễn dịch do vậy các đáp ứng miễn dịch bẩm sinh

duy trì không thay đổi mặc dù tiếp xúc với kháng nguyên nhiều lần.

Tế bào thực bào gồm đại thực bào (macrophage) và tế bào bạch cầu trung tính

(neutrophil). Tế bào đại thực bào có các thụ thể carbohydrate cho phép nó phân biệt

các tế bào của cơ thể và các tế bào lạ. Các tế bào thực bào nuốt tác nhân gây bệnh vào

trong phagosome. Sau đó, phagosome dung hợp với lysosome chứa các enzyme và các

chất hóa học để phân giải tác nhân gây bệnh bằng cách giải phóng lƣợng lớn gốc oxy

tự do. Tế bào đại thực bào không chỉ tiêu diệt tác nhân gây bệnh mà nó còn tiêu diệt

các tế bào già, tế bào chết hoặc các tế bào bị tổn thƣơng của cơ thể.

Hình 1.2. Quá trình thực bào [40]

Tế bào tua (Dendritic Cell – DC) là thành phần tế bào chính của đáp ứng miễn

dịch bẩm sinh. Tế bào này có mặt trong nhiều mô khác nhau, ở da nó đƣợc gọi là tế

bào Langerhans. Nó là tế bào trình diện kháng nguyên (Antigen presenting cell –

APC) có chức năng chính là xử lý kháng nguyên và trình diện kháng nguyên trên bề

mặt tế bào T của hệ thống miễn dịch.

Tế bào giết tự nhiên (natural killer cell - NK cell) không tấn công trực tiếp tác

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

nhân gây bệnh mà chúng giết chết tế bào của cơ thể đã bị lây nhiễm tác nhân gây bệnh.

Tế bào giết tự nhiên giết tế bào bằng cách hình thành lỗ hổng trên màng tế bào.

Perforin đƣợc giải phóng bởi tế bào giết tự nhiên và chèn vào màng tế bào của tế bào

bị lây nhiễm để tạo thành lỗ trên màng. Lỗ này cho phép nƣớc đi vào làm tế bào căng

lên sau đó vỡ ra. Tế bào giết tự nhiên cũng tấn công các tế bào ung thƣ trƣớc khi

chúng có thể thay đổi để phát triển thành khối u.

Bổ thể gồm 20 loại protein khác nhau tuần hoàn tự do trong máu. Khi chúng

tiếp xúc với vi khuẩn hoặc thành tế bào nấm, những protein này ngƣng kết lại tạo

thành phức hợp tấn công màng và chèn vào màng tế bào của tế bào lạ sau đó hình

thành lỗ tƣơng tự nhƣ tế bào NK. Một vài protein khác nhƣ interferon α, β,  đóng vai

trò nhƣ những phân tử tín hiệu bảo vệ các tế bào bình thƣờng khi tiếp xúc với các tế

bào đã bị lây nhiễm.

Hình 1.3. Cách tế bào NK và protein bổ thể tạo lỗ trên màng để tiêu diệt tế bào lây

nhiễm tác nhân gây bệnh [26]

Sự kết hợp của các tế bào thực bào, tế bào giết tự nhiên và hệ thống bổ thể một

cách hiệu quả giúp loại bỏ hầu hết vi khuẩn và nấm. Tuy nhiên, các tác nhân gây bệnh

cụ thể có thể tiến hóa để ẩn nấp bên trong tế bào chủ khi các tế bào thực bào và bổ thể

không thể bắt lấy chúng [26].

1.1.3. Hệ thống miễn dịch thích ứng

Bề mặt của hầu hết tế bào động vật có xƣơng sống chứa glycoprotein đƣợc sản

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

xuất bởi phức hợp tƣơng hợp mô chính (Major histocompatibility complex – MHC).

Những glycoprotein này đƣợc gọi là protein MHC và ở ngƣời nó là protein HLA

(human leukocyte antigen). Gen mã hóa protein MHC có độ đa hình cao do đó hiếm

khi hai cá thể có cùng một MHC. Chính vì vậy, MHC đƣợc sử dụng nhƣ một marker

để phân biệt các tế bào của cơ thể và các tế bào lạ. Có 2 lớp protein MHC. MHC lớp I

có mặt trên mọi tế bào có nhân của cơ thể. Tuy nhiên, MHC lớp II chỉ đƣợc tìm thấy

trên tế bào đại thực bào, tế bào B và tế bào T CD4+. Ba loại tế bào này làm việc với

nhau trong một dạng của đáp ứng miễn dịch và maker protein MHC – II của chúng

cho phép chúng nhận diện các tế bào khác. Tế bào T độc (phá hủy tế bào lây nhiễm) có

đồng thụ thể CD8+ chỉ tƣơng tác với kháng nguyên hiện diện cùng với protein MHC –

I của tế bào bị lây nhiễm. Tế bào T trợ giúp có thụ thể CD4+ chỉ có thể tƣơng tác với

kháng nguyên hiện diện cùng với protein MHC – II của các tế bào lympho khác.

Hình 1.4. Tế bào T bám vào kháng nguyên lạ liên kết với protein MHC [26]

Khi các phân tử lạ xâm nhập vào cơ thể, nó có thể lây nhiễm vào các tế bào của

cơ thể hoặc bị bắt bởi các tế bào APC. Trong tế bào, kháng nguyên của phân tử lạ

đƣợc xử lý và chuyển đến màng tế bào. Ở màng tế bào, kháng nguyên đã xử lý đƣợc

kết hợp với protein MHC – I và điều này cho phép tế bào T độc (T CD8+) nhận diện

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

sự có mặt của kháng nguyên khi chúng hiện diện cùng với protein MHC – I.

Hình 1.5. Kháng nguyên đƣợc hiện diện cùng protein MHC [26]

(A. Tế bào của cơ thể có protein MHC trên bề mặt để xác định chúng là các tế bào tự

thân. Hệ thống miễn dịch không tấn công các tế bào này; B. Tế bào lạ hoặc vi sinh vật

có kháng nguyên trên bề mặt. Tế bào B có khả năng bám trực tiếp vào kháng nguyên

tự do trong cơ thể và khởi đầu sự tấn công phân tử lạ xâm lấn; C. Tế bào T chỉ có thể

bám vào kháng nguyên sau khi kháng nguyên được xử lý và kết hợp với protein MHC

trên bề mặt của tế bào trình diện kháng nguyên APC)

Các tế bào đại thực bào kiểm tra bề mặt của tất cả các tế bào mà nó đi qua. Khi

đại thực bào tiếp xúc với phân tử lạ trong cơ thể, nó phân giải một phần phân tử lạ

đồng thời kháng nguyên của phân tử lạ sẽ đƣợc kết hợp với protein MHC – II của tế

bào đại thực bào. Sự tổ hợp của protein MHC – II và kháng nguyên lạ là cần thiết cho

sự tƣơng tác với thụ thể trên bề mặt của tế bào T trợ giúp (T CD4+). Ở cùng thời điểm,

khi đại thực bào tiếp xúc với kháng nguyên thì nó sẽ giải phóng interleukin – 1. Tế bào

T trợ giúp đáp ứng với interleukin – 1 để kích hoạt đáp ứng miễn dịch qua trung gian

tế bào đƣợc thực hiện bởi tế bào T và đáp ứng miễn dịch dịch thể đƣợc thực hiện bởi tế

bào B [26].

1.1.3.1. Đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào

Đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào đƣợc thực hiện bởi tế bào T có vai trò

bảo vệ cơ thể tránh khỏi sự lây nhiễm virus, giết chết các tế bào bất thƣờng hoặc tế bào

của cơ thể bị nhiễm virus. Khi đại thực bào xử lý kháng nguyên lạ, chúng sẽ tiết ra

interleukin – 1 để kích hoạt sự phân chia và tăng sinh tế bào T trợ giúp. Tế bào T trợ

giúp đƣợc hoạt hóa bởi phức hợp kháng nguyên và protein MHC – II có mặt trên đại

thực bào, nó sẽ tiết các cytokine đƣợc gọi là yếu tố kích hoạt dòng đại thực bào

(Macrophage Colony-Stimulating Factor – MSCF) và interferon –  để điều khiển hoạt

động của tế bào đại thực bào. Bên cạnh đó, tế bào T trợ giúp tiết interleukin – 2 để Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

kích hoạt sự tăng sinh của tế bào T độc đặc hiệu với kháng nguyên. Tế bào T độc có

thể phân hủy tế bào nhiễm chỉ khi những tế bào này biểu hiện kháng nguyên lạ kết hợp

với protein MHC – I [26].

Hình 1.6. Hàng rào miễn dịch tế bào T [26]

1.1.3.2. Đáp ứng miễn dịch dịch thể

Tế bào B nhận diện kháng nguyên bằng kháng thể liên kết màng (thụ thể kháng

thể). Những thụ thể kháng thể này có khả năng nhận diện nhiều cấu trúc hóa học khác

nhau (protein, lipid, polysaccharide và các chất hóa học nhỏ,…). Mỗi tế bào B có một

thụ thể riêng và chỉ có khả năng nhận diện đặc hiệu một kháng nguyên. Do vậy, một

kháng nguyên đơn sẽ hoạt hóa một tế bào B đơn và quá trình này đƣợc gọi là sự chọn

lọc dòng tế bào B vì kháng nguyên đã chọn lọc tế bào B với sự đặc hiệu chính xác để

hoạt hóa chúng [36].

Khi tế bào B tiếp xúc với phân tử lạ, phần kháng nguyên sẽ đi vào tế bào B bởi

quá trình endocytosis và đƣợc tổ hợp với protein MHC-II. Tế bào T trợ giúp nhận diện

kháng nguyên đặc hiệu hiện diện cùng protein MHC-II có trên bề mặt tế bào B và giải

phóng ra interleukin – 2. Phân tử tín hiệu này kích thích sự phân chia của tế bào B.

Bên cạnh đó, các kháng nguyên tự do không đi vào tế bào B sẽ kết hợp với thụ thể

kháng thể trên bề mặt của tế bào B. Sự tiếp xúc kháng nguyên này kích thích sự sinh

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

sản của tế bào B hoạt hóa.

Các tế bào B hoạt hóa sau đó sẽ đƣợc biệt hóa thành các tế bào B nhớ và các tế

bào plasma sản xuất kháng thể. Kháng thể đƣợc giải phóng vào huyết tƣơng, bạch

huyết, dịch ngoại bào để trung hòa kháng nguyên và đánh dấu cho sự tiêu diệt phân tử

lạ của tế bào đại thực bào hoặc hoạt hóa bổ thể của hệ thống miễn dịch bẩm sinh. Khi

đáp ứng miễn dịch dịch thể giảm xuống, một số tế bào plasma bị chết theo con đƣờng

appotosis và một số tế bào di chuyển đến tủy xƣơng và tiết kháng thể trong vài năm.

Sự hoạt hóa ban đầu của của các tế bào lympho nguyên bản cũng kích hoạt sự biệt hóa

của các tế bào nhớ có đời sống dài, có thể tồn tại nhiều năm sau lây nhiễm. Các tế bào

nhớ đáp ứng nhanh và hiệu quả hơn các tế bào lympho B nguyên bản [26].

Hình 1.7. Hàng rào miễn dịch tế bào B [26]

1.1.4. Kháng nguyên

Kháng nguyên là bất kỳ cơ chất nào có khả năng cảm ứng sự hình thành kháng

thể và phản ứng đặc hiệu với kháng thể đƣợc tạo ra. Chúng phản ứng với cả thụ thể

của tế bào T và kháng thể. Hai đặc tính quan trọng của kháng nguyên là: 1) tính đặc

hiệu (có khả năng kết hợp đặc hiệu với các sản phẩm của đáp ứng miễn dịch (kháng

thể và thụ thể của tế bào T); 2) tính sinh miễn dịch (có khả năng kích thích cơ thể sinh

đáp ứng miễn dịch đặc hiệu).

Mỗi phân tử kháng nguyên này có một hoặc một số quyết định kháng nguyên

đƣợc gọi là epitope và mỗi epitope có thể liên kết với một kháng thể đặc hiệu do đó

một kháng nguyên có thể liên kết với nhiều kháng thể tại các vị trí liên kết khác nhau. Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Các kháng nguyên có khối lƣợng phân tử thấp đƣợc gọi là hapten không có khả năng

gây đáp ứng miễn dịch nhƣng có thể phản ứng với kháng thể sẵn có. Những phân tử

này cần đƣợc ghép với phân tử mang để cảm ứng sự hình thành kháng thể. Phân tử

mang có thể là một protein của vật chủ.

Cấu trúc bậc bốn của phân tử kháng nguyên đóng vai trò quan trọng trong việc

xác định tính kháng nguyên. Các phân tử nhƣ lipid và ADN thƣờng là các kháng

nguyên yếu. Hầu hết kháng nguyên là kháng nguyên phụ thuộc tuyến ức hoặc kháng

nguyên không phụ thuộc tuyến ức. Kháng nguyên phụ thuộc tuyến ức cần có sự hỗ trợ

của tế bào T mới kích thích đƣợc tế bào B biệt hóa thành tế bào plasma sản xuất kháng

thể, ví dụ nhƣ protein và tế bào máu ngoại lai. Kháng nguyên không phụ tuyến ức

không yêu cầu sự tham gia của tế bào T để sản xuất kháng thể. Thay vào đó, chúng

trực tiếp kích hoạt tế bào B đặc hiệu bằng cách liên kết với thụ thể kháng thể trên bề

mặt tế bào B. Những phân tử này sản xuất kháng thể IgM và IgG2 và không kích hoạt

tế bào nhớ sau thời gian dài. Hầu hết polysaccharide của vi khuẩn (tìm thấy ở thành tế

bào vi khuẩn) đƣợc xếp vào nhóm kháng nguyên này. Polysaccharide nhất định nhƣ

LPS (lipopolysaccharide) không chỉ cảm ứng sự hoạt động của tế bào B đặc hiệu mà

còn có thể tác động kích hoạt nhiều tế bào B [15].

1.1.5. Kháng thể

Kháng thể là các phân tử glycoprotein đƣợc sản xuất bởi tế bào B của hệ thống

miễn dịch. Mỗi phân tử kháng thể bao gồm 2 chuỗi polypeptide ngắn giống nhau đƣợc

gọi là chuỗi nhẹ và 2 chuỗi polypeptide dài giống nhau đƣợc gọi là chuỗi nặng. Bốn

chuỗi này đƣợc liên kết với nhau bằng cầu nối disulfide hình thành phân tử dạng chữ

Mỗi chuỗi nhẹ gồm một vùng hằng định (light chain constant region, CL) và

một vùng biến đổi (light chain variable region, VL). Vùng chức năng đầu N của chuỗi

nhẹ (VL) có trình tự axit amin biến đổi là vị trí liên kết với kháng nguyên. Tuy nhiên,

để liên kết đƣợc với kháng nguyên thì vùng biến đổi của chuỗi nhẹ cần kết hợp với

vùng biến đổi của chuỗi nặng Vùng chức năng đầu C của chuỗi nhẹ (CL) có trình tự

axit amin không thay đổi có thể là kappa (κ) hoặc lamda (λ) và khoảng 60% chuỗi nhẹ

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

ở ngƣời là kappa.

Mỗi chuỗi nặng gồm ba hoặc bốn vùng hằng định (heavy chain constant region

– CH1, CH2, CH3) và một vùng biến đổi (heavy chain variable region – VH). Vùng biến

đổi của chuỗi nặng nằm ở đầu N đối xứng với vùng biến đổi của chuỗi nhẹ. Trình tự

amino acid của vùng biến đổi rất khác nhau giữa các phân tử kháng thể. Hầu hết phần

khác nhau này thuộc khu vực siêu biến đổi và thƣờng chỉ gồm 6 – 10 amino acid. Mỗi

vùng biến đổi tồn tại 3 miền siêu biến đổi (complementarity determining regions -

CDR). Các miền siêu biến đổi trên cả chuỗi nặng và chuỗi nhẹ đƣợc căn thẳng nhau để

hình thành vị trí liên kết kháng nguyên và xác định tính đặc hiệu của phân tử kháng

thể. Một vài kiểu khác nhau của vùng hằng định của chuỗi nặng liên quan đến sự xác

định các phân lớp khác nhau của kháng thể. Chuỗi nặng của kháng thể có thể là

γ(IgG), α(IgA), µ(IgM), ε(IgE) hoặc δ(IgD). IgG, IgA và IgD có 3 vùng hằng định và

một vùng bản lề, IgM và IgE có 4 vùng hằng định nhƣng không có vùng bản lề. Vùng

bản lề là trình tự peptide định vị giữa vùng hằng định 1 và 2 của chuỗi nặng. Nó cho

phép vùng Fab có thể di chuyển chống lại vùng Fc từ 0 đến 90º. Điều này cho phép

kháng thể tƣơng tác tốt hơn với quyết định kháng nguyên [20].

Hình 1.8. Cấu trúc của phân tử kháng thể [41]

IgG là kháng thể phổ biến nhất đƣợc tìm thấy ở trong máu. IgG điều khiển sự

tiêu diệt các vi sinh vật ngoại lai trong các đáp ứng miễn dịch thứ cấp. Kháng thể này

đƣợc sử dụng để xác định sự có mặt của virus ở trong máu.

IgM gồm có 5 phân tử nhỏ đƣợc tập hợp lại bởi chuỗi J. Nó là phân tử kháng

thể đƣợc sản xuất đầu tiên trong đáp ứng miễn dịch sơ cấp có chức năng trung hòa

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

virus và hoạt hóa bổ thể.

IgA đƣợc cấu tạo từ 2 phân tử nhỏ liên kết với nhau qua chuỗi J. Nó đƣợc tìm

thấy ở khu vực niêm mạc nhƣ ruột, phổi có chức năng ngăn chặn sự cố định của tác

nhân gây bệnh. IgA còn đƣợc tìm thấy trong nƣớc bọt, nƣớc mắt và sữa. IgE bám vào

thụ thể Fc trên tế bào đại thực bào và bạch cầu ƣa kiềm và gây ra phản ứng dị ứng. Nó

cũng liên kết với hệ thống phòng thủ chống lại ký sinh. Nó có mặt trong máu với nồng

độ khá thấp. Thông thƣờng, kháng thể này đƣợc sử dụng để kiểm tra sự dị ứng.

IgD là một thành phần nhỏ của máu chiếm khoảng 1% protein trên màng của tế

bào lympho B và nó đƣợc đồng biểu hiện với một kháng thể bề mặt khác gọi là IgM.

Ngoài ra, IgD còn hoạt hóa bạch cầu ƣa axit và tế bào mast sản xuất các yếu tố kháng

vi sinh vật [34].

1.2. Khái quát về hệ thống nhóm máu ngƣời

1.2.1. Phân loại hệ thống nhóm máu ở ngƣời

Trƣớc năm 1900, ngƣời ta nghĩ rằng tất cả các loại máu là nhƣ nhau. Sự hiểu

biết sai lầm này dẫn đến nhiều trƣờng hợp tử vong khi truyền máu từ động vật vào

ngƣời và từ ngƣời vào ngƣời. Việc truyền máu trở nên an toàn hơn khi Karl

Landsteiner phát hiện ra hệ thống nhóm máu ABO vào năm 1901. Nhƣ vậy, kiểu

nhóm máu của những ngƣời khác nhau có thể không giống nhau và nó phụ thuộc vào

marker bề mặt (kháng nguyên) đƣợc tìm thấy trên màng tế bào hồng cầu (Red blood

cell – RBC). Do đó, nhóm máu đƣợc phân loại dựa vào sự có mặt của kháng nguyên

có mặt trên màng RBC. Hiện nay, có khoảng 35 nhóm máu (ABO, Rh, MNS, Kell,

Lewis, Duffy, Kidd, Indian,…) với hơn 300 kháng nguyên nhóm máu đã đƣợc thống

kê bởi hiệp hội truyền máu quốc tế (International Society of Blood Transfusion –

ISBT) năm 2014 [37]. Hầu hết, kháng nguyên nhóm máu trên bề mặt hồng cầu có tính

kháng nguyên yếu và đƣợc sử dụng trong nghiên cứu di truyền. Chỉ có 2 kháng

nguyên A, B của hệ thống nhóm máu ABO và kháng nguyên D của hệ thống nhóm

máu Rh có tính kháng nguyên mạnh đóng vai trò quan trọng trong truyền máu và trong

sản khoa.

Kháng nguyên nhóm máu có thể là đƣờng hoặc protein, chúng liên kết với các

thành phần khác nhau trên màng hồng cầu. Kháng nguyên nhóm máu ABO có bản

chất là đƣờng. Chúng đƣợc sản xuất bởi một loạt các phản ứng với sự tham gia của các Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

enzyme xúc tác chuyển hóa các đơn vị đƣờng. ADN của ngƣời xác định kiểu enzyme

mà họ có do đó quy định kiểu kháng nguyên đƣờng hình thành trên màng tế bào hồng

cầu của họ. Ngƣợc lại, kháng nguyên của nhóm máu Rh lại có bản chất là protein.

ADN của mỗi ngƣời mang thông tin di truyền của kháng nguyên protein. Gen RhD mã

hóa kháng nguyên D. Một số ngƣời không có gen RhD nên không sản xuất kháng

nguyên D và do đó protein RhD vắng mặt trên tế bào hồng cầu của họ. Bên cạnh

kháng nguyên đƣờng (glycan hoặc carbohydrate), tế bào hồng cầu có ba loại protein

mang kháng nguyên nhóm máu: protein xuyên màng một lần, protein xuyên màng

nhiều lần và protein liên kết glycosylphosphatidylinositol (GPI) [6].

Hình 1.9. Kháng nguyên nhóm máu của ngƣời [6]

1.2.2. Hệ thống nhóm máu ABO

Hệ thống nhóm máu ABO gồm 4 nhóm máu A, B, AB và O đƣợc xác định

bằng sự có mặt hoặc vắng mặt của hai kháng nguyên A và B. Kháng nguyên nhóm

máu ABO là các cấu trúc carbohydrate có mặt trên màng hồng cầu và nhiều mô.

Những kháng nguyên này đƣợc định vị tại đầu tận cùng của chuỗi glucizic và biểu

hiện ở nhiều dạng khác nhau: oligosaccharide trong nƣớc tiểu, glycoprotein trong dịch

tiết của cơ thể và dịch mô, glycolipid ở màng. Trong hệ thống nhóm máu ABO, mỗi

kháng nguyên đƣợc đặc trƣng bởi một gốc đƣờng đặc hiệu. Kháng nguyên A có đầu

tận cùng là N-acetylgalactosamine và kháng nguyên B có đầu tận cùng là galactose

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

[22].

Kháng nguyên trên màng hồng cầu là các kháng nguyên tự thân và đƣợc bỏ qua

bởi hệ miễn dịch. Tuy nhiên, hệ miễn dịch sẽ sản xuất các kháng thể chống lại các

kháng nguyên khác với kháng nguyên tự thân của hồng cầu [6]. Ngƣời nhóm máu A

có kháng nguyên A trên hồng cầu mà không có kháng nguyên B do đó có kháng thể

kháng kháng nguyên B trong huyết thanh. Ngƣời nhóm máu B có kháng nguyên B trên

màng hồng cầu và kháng thể kháng kháng nguyên A trong huyết thanh. Ngƣời nhóm

máu AB có cả kháng nguyên A và B trên màng hồng cầu do vậy không có kháng thể

kháng kháng nguyên A và kháng thể kháng kháng nguyên B trong huyết thanh. Còn

ngƣời có nhóm máu O thì huyết thanh có cả kháng thể kháng kháng nguyên A và

kháng thể kháng kháng nguyên B do màng hồng cầu thiếu cả hai kháng nguyên A và B

[17].

1.2.3. Vai trò của máu trong y học

Trong cơ thể của mỗi ngƣời trƣởng thành có khoảng hơn 5 lít máu. Máu mang

oxy và các chất dinh dƣỡng đến các tế bào đồng thời cũng mang đi các các sản phẩm

dƣ thừa của các tế bào này. Ngoài ra, máu còn vận chuyển các tế bào miễn dịch để

chống lại các tác nhân lây nhiễm và mang tiểu cầu để tạo thành các vết đông máu khi

mạch máu bị tổn thƣơng để ngăn chặn sự mất máu. Máu đƣợc vận chuyển đi khắp cơ

thể qua hệ thống tuần hoàn. Khi cơ thể hoạt động nhiều, tim sẽ bơm máu mạnh và

nhanh hơn để cung cấp nhiều máu từ đó tăng cƣờng oxy cho cơ. Khi cơ thể bị viêm

nhiễm, máu vận chuyển nhiều tế bào miễn dịch đến vị trí lây nhiễm, tại đây các tế bào

miễn dịch tập hợp lại để ngăn chặn các tác nhân có hại [5].

Với những chức năng nhƣ trên máu đóng vai trò rất quan trọng đối với cơ thể

và nó đƣợc coi là một loại thuốc đặc biệt trong y tế. Máu thƣờng đƣợc sử dụng khi: i)

ngƣời bị mất máu do phẫu thuật, bị thƣơng hoặc bị ốm; ii) khi cơ thể không có khả

năng tạo đủ máu (Một số bệnh và quá trình điều trị có thể gây trở ngại với khả năng

tạo máu của tủy xƣơng. Ví dụ, ngƣời bị bệnh ung thƣ thƣờng cần truyền máu bởi vì

hóa trị làm giảm sự sản xuất tế bào máu mới của tủy xƣơng); iii) để ngăn các biến

chứng từ sự rối loạn máu: bệnh hồng cầu hình lƣỡi liềm, bệnh thiếu máu địa trung hải,

bệnh thiếu máu cấp…[38].

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

1.2.4. Truyền máu và nguyên tắc truyền máu

Truyền máu là quá trình tiếp nhận các sản phẩm của máu vào trong tĩnh mạch

của một ngƣời khác. Trƣớc đây, máu toàn phần đƣợc sử dụng để truyền máu nhƣng

hiện nay nó hiếm khi đƣợc sử dụng. Thay thế vào đó, nhiều thành phần đặc biệt của

máu đƣợc truyền khi cần thiết. Tế bào hồng cầu là thành phần đƣợc sử dụng để tăng

khả năng vận chuyển oxy của máu và tránh sự mệt mỏi và các biến chứng khác.

Truyền máu mất khoảng 1-4 giờ phụ thuộc vào thành phần và thể tích máu đƣợc

truyền. Hầu hết truyền máu đƣợc thực hiện tại bệnh viện nhƣng nó cũng đƣợc thực

hiện ở bất cứ nơi nào khi cần thiết. Trong hầu hết trƣờng hợp, máu có nguồn gốc từ

những tình nguyện viên [39].

Hình 1.10. Sơ đồ truyền máu [42]

Kháng nguyên là bất kỳ cơ chất nào có khả năng gây đáp ứng miễn dịch. Nếu

hệ thống miễn dịch tiếp xúc với kháng nguyên không đƣợc tìm thấy trong tế bào của

chính cơ thể, nó sẽ khởi đầu sự tấn công chống lại kháng nguyên. Ngƣợc lại, kháng

nguyên đƣợc tìm thấy trong tế bào của cơ thể đƣợc gọi là “kháng nguyên tự thân”,

thông thƣờng hệ miễn dịch sẽ không tấn công những kháng nguyên này. Màng của

mỗi tế bào hồng cầu chứa hàng triệu kháng nguyên bị bỏ qua bởi hệ miễn dịch. Tuy

nhiên khi bệnh nhân nhận truyền máu, các kháng thể tự nhiên của hệ thống nhóm máu

ABO có trong huyết tƣơng của ngƣời nhận sẽ tấn công bất kỳ tế bào hồng cầu cho nào

chứa kháng nguyên khác với kháng nguyên tự thân sau đó phá hủy chúng gây ra phản

ứng tan máu cấp tính. Do đó, việc xác định đúng nhóm máu ngƣời cho, nhóm máu

ngƣời nhận cũng nhƣ sự tƣơng tích nhóm máu giữa ngƣời cho và ngƣời nhận là cần

thiết để truyền máu an toàn [7].

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

1.2.5. Phƣơng pháp xác định nhóm máu hệ ABO

Kiểu nhóm máu của hệ nhóm máu ABO có thể đƣợc xác định bằng phƣơng

pháp huyết thanh mẫu hoặc phƣơng pháp hồng cầu mẫu.

Phƣơng pháp huyết thanh mẫu dùng huyết thanh đã biết trƣớc kháng thể cho

phản ứng với hồng cầu của bệnh nhận để xác định sự có mặt của kháng nguyên trên bề

mặt hồng cầu từ đó xác định đƣợc kiểu nhóm máu của bệnh nhân.

Bảng 1.1. Hƣớng dẫn đọc kết quả của phƣơng pháp huyết thanh mẫu

Nhóm máu A Nhóm máu B Nhóm máu AB Nhóm máu O Huyết thanh mẫu A Huyết thanh mẫu B Huyết thanh mẫu AB + - + - + + + - - + + -

(+) có ngưng kết, (-) không ngưng kết

Phƣơng pháp hồng cầu mẫu sử dụng hồng cầu mẫu đã biết trƣớc kháng nguyên

cho phản ứng với kháng thể của bệnh nhân để xác định kháng thể có mặt trong huyết

thanh từ đó xác định kiểu nhóm máu của bệnh nhân [35].

Bảng 1.2. Hƣớng dẫn đọc kết quả của phƣơng pháp hồng cầu mẫu

Hồng cầu mẫu A - + - + Hồng cầu mẫu B + - - + Hồng cầu mẫu O - - - -

Nhóm máu A Nhóm máu B Nhóm máu AB Nhóm máu O 1.3. Kháng thể đơn dòng

1.3.1. Công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng

Kháng thể đơn dòng là kháng thể đƣợc sản xuất bởi một dòng tế bào B và nhận

diện đặc hiệu một kháng nguyên. Một vài phƣơng pháp đƣợc sử dụng để sản xuất

kháng thể đơn dòng của ngƣời gồm: bất tử tế bào B, công nghệ phage display, chuột

chuyển gen, công nghệ kháng thể đơn dòng tái tổ hợp.

Bất tử tế bào B đƣợc thực hiện bằng công nghệ lai tế bào hoặc công nghệ bất tử

EBV (Epstein – Barr virus). Với công nghệ lai tế bào, sự dung hợp giữa tế bào lympho

B miễn dịch với tế bào myeloma (ngƣời hoặc chuột) tạo ra tế bào lai mang đặc tính

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

của cả 2 dòng tế bào đó là khả năng sinh trƣởng vô hạn và sản xuất kháng thể đặc hiệu

với kháng nguyên gây miễn dịch. Công nghệ tế bào lai đƣợc sử dụng thành công để

tạo tế bào lai chuột tuy nhiên tế bào lai ngƣời lại gặp phải trở ngại do thiếu dòng tế bào

myeloma ngƣời phù hợp. Tế bào B cũng đƣợc bất tử bằng cách biến nạp EBV vào tế

bào lympho B miễn dịch. Tuy nhiên, tế bào lympho B biến nạp EBV không thể sinh

trƣởng vô hạn bởi vì chúng không phải là các tế bào ung thƣ, chúng khó nhân dòng và

thƣờng chỉ sản xuất một lƣợng nhỏ kháng thể. Công nghệ tế bào lai – EBV đƣợc thiết

lập dựa trên sự kết hợp của 2 phƣơng pháp và duy trì những ƣu điểm của cả hai.

Công nghệ phage display là phƣơng pháp chọn lọc các gen vùng biến đổi đặc

hiệu kháng nguyên để biểu hiện các mảnh kháng thể chức năng. Các bƣớc chính trong

phage display bao gồm: xây dựng thƣ viện kháng thể, biểu hiện trên bề mặt phage,

bio-panning (lựa chọn phage biểu hiện kháng thể), sàng lọc phage biểu hiện kháng thể

đặc hiệu với kháng nguyên đích. Mảnh gen VH và VL đƣợc khuếch đại từ mARN của

tế bào lympho B sử dụng RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction).

Mảnh gen mã hóa vùng biến đổi chuỗi đơn (single chain fragment variable_scFv)

đƣợc tạo ra bằng cách tổ hợp ngẫu nhiên mảnh gen VH và VL sử dụng PCR. Thƣ viện

sau đó sẽ đƣợc tách dòng để biểu hiện scFv trên bề mặt của thực khuẩn thể. Lựa chọn

phage biểu hiện scFv đặc hiệu với kháng nguyên mong muốn bằng cách cho các dòng

thực khuẩn thể biểu hiện scFv liên liên kết với các kháng nguyên hoặc hapten khác

nhau. Các kháng thể không bám đƣợc loại bỏ bằng cách rửa sau đó kháng thể bám

đƣợc rửa giải và nhân lên bằng cách lây nhiễm vào E. coli. Lặp lại bƣớc này một vài

lần thì có thể lựa chọn đƣợc các mảnh scFv đặc hiệu kháng nguyên. Sau đó, sự đặc

hiệu của mảnh scFv có thể đƣợc sàng lọc sử dụng phƣơng pháp miễn dịch enzyme

(enzyme-linked immunosorbent assay_ELISA) hoặc lọc tế bào hoạt hóa huỳnh quang

(fluorescent-activated cell sorting_FACS) nếu protein liên kết màng tế bào là đích. Khi

sự đặc hiệu đã đƣợc phân lập, gen của các vùng biến đổi kháng thể đƣợc đƣa vào

vector biểu hiện toàn bộ kháng thể ngƣời và chuyển vào tế bào để sản xuất kháng thể

đơn dòng ngƣời đầy đủ (human mAbs_hmAbs). Một thƣ viện phage display phân lập

mAb đã đƣợc cấp phép bởi FDA và ít nhất 35 mARN ngƣời tạo ra từ công nghệ phage

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

display đã đƣợc đƣa vào thử nghiệm lâm sàng.

Chuột chuyển gen là một kỹ thuật khác để tạo kháng thể đơn dòng. Chuột

chuyển gen biểu kháng thể ngƣời đƣợc báo cáo lần đầu tiên năm 1994. Kỹ thuật

chuyển gen chuột bao gồm sự phân hủy các locus gen mã hóa chuỗi nặng và chuỗi nhẹ

của chuột và chuyển vào gen mã hóa chuỗi nặng và chuỗi nhẹ kappa của ngƣời. Qua

một vài thập kỷ, đoạn gen V đã đƣợc chuyển thêm vào chuột chuyển gen để kéo dài

thời gian thu hồi kháng thể. Hiện nay, hơn 50 kháng thể đơn dòng sản xuất từ chuột

chuyển gen đã đƣợc đƣa vào thử nghiệm lâm sàng và 6 kháng thể đơn dòng đã đƣợc

cấp phép cho thƣơng mại. Sự biểu hiện kháng thể ngƣời trong chuột chuyển gen ngăn

chặn đáp ứng kháng thể chuột chống ngƣời và duy trì những thuận lợi của công nghệ

lai tế bào chuột phục vụ sản xuất kháng thể cho thử nghiệm.

Công nghệ kháng thể tái tổ hợp từ dòng tế bào B của ngƣời sản xuất kháng thể.

Để thực hiện phƣơng pháp này cần phải phân lập đƣợc tế bào B đơn từ lách chuột hoặc

tế bào máu ngoại vi PBMC (Peripheral blood mononuclear cell) ngƣời sử dụng vi hạt

kết hợp với marker chọn lọc tế bào B hoặc phân loại tế bào hoạt hóa huỳnh quang dựa

vào marker bề mặt của tế bào B đơn. Sau khi phân lập đƣợc tế bào B đơn, tách mRNA

để tổng hợp cADN của gen chuỗi nặng và chuỗi nhẹ mã hóa cho các đoạn biến đổi của

kháng thể trong mỗi tế bào bằng RT-PCR và tổ hợp các gen chuỗi nặng và chuỗi nhẹ

lại với nhau sử dụng kỹ thuật PCR overlapping. Đối với mỗi tế bào, chuỗi nặng và

chuỗi nhẹ tƣơng ứng đƣợc khuếch đại bằng RT-PCR lồng và biểu hiện trong vector

nhân dòng để sản xuất kháng thể đơn dòng ngƣời đặc hiệu in – vitro. Sử dụng những

phƣơng pháp để nhân và biểu hiện kháng thể đơn dòng ngƣời có hiệu quả cao và yêu

cầu ít tế bào. Hơn nữa, kháng thể tái tổ hợp cho phép tạo ra nhanh chóng số lƣợng

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

kháng thể đơn dòng đặc hiệu kháng nguyên trong một thời gian ngắn [30].

Hình 1.11. Các phƣơng pháp sản xuất kháng thể đơn dòng [43]

1.3.2. Sản xuất kháng thể đơn dòng bằng công nghệ tế bào lai

Tế bào lai là tế bào đƣợc tạo ra để sản xuất một lƣợng lớn kháng thể đặc hiệu

kháng nguyên (kháng thể đơn dòng). Để sản xuất kháng thể đơn dòng, chuột đƣợc gây

miễn dịch với kháng nguyên đặc hiệu. Sau một vài tuần, thu máu từ chuột đã gây miễn

dịch để định lƣợng kháng thể trong huyết thanh. Khi hiệu giá kháng thể đủ cao, chuột

đƣợc giết và thu lấy lách để tách tế bào lympho B. Những tế bào lympho này đƣợc

dung hợp với tế bào ung thƣ tủy myeloma thiếu gen HGPRT (hypoxanthine-guanine

phosphoribosyltransferase) sử dụng PEG (polyethylene glycol) hoặc Sendai virus. Các

tế bào dung hợp đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng HAT (hypoxanthyl aminoteptrin

thymidine). Tế bào myeloma mất khả năng tổng hợp kháng thể và thiếu enzyme

HGPRT là những enzyme cho phép tế bào tổng hợp purine từ hypoxanthine. Ban đầu,

sự vắng mặt của HGPRT không phải là vấn đề vì tế bào có thể sử dụng con đƣờng

thay thế để tổng hợp purine. Tuy nhiên, khi tế bào nuôi cấy trong môi trƣờng

aminoteprin, chúng không thể sử dụng con đƣờng thay thế khác và nó phụ thuộc hoàn

toàn vào HGPRT để tồn tại. Tế bào lympho B đƣợc phân lập từ chuột có enzyme Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

HGPRT và cũng có khả năng sản xuất kháng thể, khi tiếp xúc với kháng nguyên nó sẽ

biệt hóa thành tƣơng bào plasma sản xuất kháng thể nhƣng đó lại là giai đoạn cuối

cùng của quá trình biệt hóa nên chúng không thể nhân lên trong nuôi cấy. Do vậy, chỉ

có tế bào lai mới có khả năng tồn tại trong môi trƣờng HAT. Dịch nuôi cấy tế bào lai

đƣợc kiểm tra để tìm những tế bào sản xuất kháng thể mong muốn. Vì có thể có nhiều

hơn một tế bào lai trong các giếng ban đầu, các tế bào đơn từ các giếng dƣơng tính

kháng thể phải đƣợc tạo dòng và cấy truyền. Sau khi tạo đƣợc dòng tế bào lai đặc hiệu

kháng nguyên thì kháng thể đơn dòng đƣợc sản xuất bằng cách tiêm dòng tế bào lai

này vào khoang bụng của chuột hoặc sử dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào in – vitro [8, 23,

25].

Hình 1.12. Công nghệ tế bào lai [44]

1.3.3. Vai trò của kháng thể đơn dòng

Kháng thể đơn dòng là công cụ hữu ích trong nhiều nghiên cứu y sinh và có giá

trị kinh tế cũng nhƣ giá trị y học lớn. Một số lƣợng lớn kháng thể đơn dòng tinh sạch

đƣợc phát triển cho nhiều thử nghiệm có độ nhạy cao. Ví dụ phản ứng thử thai, sử

dụng các hạt đƣợc bao phủ bởi kháng thể đơn dòng kháng lại hormone sinh sản

(human chorionic gonadotropin – hCG) nhƣ là kháng nguyên. Khi những hạt này đƣợc

trộn với mẫu có chứa hormone của một phụ nữ có thai, phản ứng kháng nguyên –

kháng thể có thể quan sát đƣợc bằng mắt. Nhóm máu hệ ABO có thể đƣợc xác định

sớm với sự giúp đỡ của huyết thanh ngƣời mang kháng thể đặc hiệu đã biết. Những

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

huyết thanh này đã đƣợc thay thế bởi kháng thể đơn dòng đƣợc sản xuất bởi tế bào lai.

Do đó giá trị chuẩn đoán và sàng lọc của kháng thể đơn dòng qua phản ứng huyết

thanh học đã đƣợc chứng minh. Bên cạnh việc sử dụng kháng thể đơn dòng để xác

định nhóm máu, kháng thể đơn dòng còn đƣợc sử dụng trong chuẩn đoán (các phản

ứng Elisa để phát hiện virus), tinh sạch miễn dịch và trong trị liệu [26].

Hình 1.13. Phản ứng ngƣng kết giữa kháng nguyên - kháng thể [26]

1.3.4. Tình hình sản xuất kháng thể đơn dòng đặc hiệu kháng nguyên nhóm máu

hệ ABO

Trƣớc đây, thuốc thử xác định nhóm máu hệ ABO là huyết thanh đa dòng có

nguồn gốc từ ngƣời hoặc dịch chiết lectin của thực vật [19]. Ngày nay, kháng thể đơn

dòng đƣợc sử dụng để tạo thuốc thử xác định nhóm máu hệ ABO. Kháng thể đơn dòng

chuột có nhiều ƣu điểm hơn so với kháng thể đa dòng có nguồn gốc từ ngƣời bao gồm

nhận diện kháng nguyên A và B yếu, loại bỏ kháng thể lẫn tạp, hiệu quả giá thành và

nguồn kháng thể có sẵn không phụ thuộc vào ngƣời. Đã có nhiều báo cáo sản xuất

thành công kháng thể đơn dòng chuột để xác định nhóm máu hệ ABO [1, 14, 28]. Hiê ̣n

nay, trên thế giớ i đã có rất nhiều thuốc thƣ̉ xác định nhóm máu hệ ABO có bản chất là

kháng thể đơn dòng đã đƣợc thƣơng mại nhƣ: Febrile Antigen Reagents (Atlas

Medical), Transclone (Biorad), Blood grouping anti sera (Maxwin international),

Blood Grouping (Prestige Diagnostics U.K.), ALBAclone (Quotient)…Tuy nhiên,

kháng thể đơn dòng sử dụng để xác định nhóm máu hệ ABO vẫn chƣa đƣợc sản xuất

tại Việt Nam.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

1.4. Động lực học sinh trƣởng và sản xuất của tế bào động vật

Nuôi cấy tế bào động vật khó hơn nuôi cấy vi sinh vật bởi vì chúng yêu cầu

nhiều dinh dƣỡng hơn và thông thƣờng chỉ sinh trƣởng trên một bề mặt đặc biệt. Mặc

dù vậy, nhiều tế bào động vật khác nhau bao gồm tế bào biệt hóa và không biệt hóa đã

đƣợc nuôi cấy thành công.

Tế bào động vật không thể tổng hợp đƣợc các amino acid thiết yếu và sự sinh

trƣởng của tế bào động vật trong nuôi cấy cần cung cấp 9 axit amin này (histidine,

isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, threonine, tryptophan và

valine). Ngoài ra, nuôi cấy tế bào động vật thƣờng yêu cầu thêm cysteine, glutamine

và tyrosine. Các thành phần thiết yếu khác của môi trƣờng cần cho nuôi cấy tế bào

động vật là vitamin, muối vô cơ, carbohydrate (glucose…) và huyết thanh. Huyết

thanh là một hỗn hợp gồm hàng trăm protein và nhiều yếu tố khác cần cho sự biệt hóa

của tế bào của tế bào trong nuôi cấy. Insuline trong huyết thanh là một hormone đƣợc

yêu cầu cho sự sinh trƣởng của tế bào động vật có xƣơng sống…Mặc dù tế bào động

vật có thể sinh trƣởng trên môi trƣờng không huyết thanh vì các loại tế bào này yêu

cầu yếu tố sinh trƣởng đặc biệt không có mặt trong huyết thanh. Ví dụ, tế bào tiền thân

tạo máu yêu cầu hormone erythropoietin và tế bào lympho T của hệ thống miễn dịch

yêu cầu interleulin – 2. Các yếu tố này bám vào protein thụ thể trên màng tế bào tạo ra

tín hiệu để tế bào tăng sinh.

Trong mô động vật nguyên vẹn, hầu hết các tế bào liên hệ chặt chẽ và tƣơng tác

với các tế bào khác thông qua một loạt cầu nối tế bào. Các tế bào cũng liên hệ với chất

nền ngoại bào (một mạng lƣới phức tạp các protein tiết và carbohydrate để lấp đầy

khoảng trống giữa các tế bào). Chất nền đƣợc tiết bởi chính các tế bào giúp tế bào liên

kết với các tế bào khác trong mô. Chất nền ngoại bào bao gồm các thành phần:

collagen, axit hyaluronic, mucopolysaccharise, proteoglycan, glycoprotein. Tế bào

đông vật in – vivo có xu hƣớng tƣơng tác với nhau và với chất nền ngoại bào. Không

giống nhƣ vi khuẩn và nấm men có thể sinh trƣởng ở trạng thái lơ lửng, hầu hết tế bào

động vật đều cần bề mặt rắn đặc biệt đƣợc phủ chất nền ngoại bào (ECM –

extracellular matrix) để sinh trƣởng. Chất nền ngoại bào đóng vai trò nhƣ cầu nối để

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

liên kết các tế bào lại với nhau.

Sự sinh trƣởng của tế bào động vật tƣơng tự nhƣ sự sinh trƣởng của hầu hết vi

sinh vật và đƣợc nghiên cứu bằng cách phân tích đƣờng cong sinh trƣởng khi nuôi cấy

theo mẻ. Tức là tế bào động vật đƣợc nuôi cấy trong hệ thống kín, trong quá trình nuôi

cấy không thay đổi môi trƣờng và thời gian nuôi cấy càng kéo dài thì nồng độ chất

dinh dƣỡng càng giảm sút, các chất thải trong trong môi trƣờng tăng lên. Sự sinh

trƣởng của tế bào động vật trải qua 4 giai đoạn. Trong suốt giai đoạn đầu đƣợc gọi là

lag phase, số lƣợng tế bào ít thay đổi do tế bào ít hoặc hầu nhƣ không phân chia mà

chủ yếu chỉ thích ứng với môi trƣờng mới. Sau đó, tế bào bắt đầu bƣớc vào giai đoạn

sinh trƣởng theo cấp số nhân đƣợc gọi là log phase (hay exponential growth phase)

làm gia tăng kích thƣớc quần thể với thời gian nhân đôi từ 18 đến 24 giờ (đối với tế

bào lai chuột là 12 đến 24 giờ), sự sinh sản của tế bào chủ yếu đƣợc thực hiện trong

giai đoạn này với thời gian thế hệ tối thiểu, mật độ tế bào tối đa đạt đƣợc trong nuôi cấy tĩnh là 106 tế bào/ml. Trong nuôi cấy theo mẻ, sự sinh trƣởng theo cấp số nhân

thƣờng đƣợc theo sau bởi giai đoạn chuyển tiếp và đạt đến giai đoạn cân bằng đƣợc

gọi là stationary phase, đặc trƣng bởi sự giới hạn sinh trƣởng, sự cạn kiệt nguồn dinh

dƣỡng, ức chế sản xuất hoặc tích tụ các sản phẩm độc hại. Đối với nuôi cấy tế bào

động vật, tế bào sẽ ngừng sinh trƣởng khi đã hình thành một lớp đơn liên tục trên bề

mặt dụng cụ nuôi do sự ức chế tiếp xúc. Sau pha cân bằng tế bào đi vào giai đoạn cuối

cùng đƣợc gọi là pha suy vong (death phase) đặc trƣng bởi số lƣợng tế bào chết vƣợt

qua số lƣợng tế bào mới hình thành [2]. Một vài thông số quan trọng thƣờng đƣợc tính

toán trong nuôi cấy tế bào đó là:

Số thế hệ là số lần mà tế bào phân chia (g) Nt = No.2g g = log (Ne/No)/ln2= (log Nt – log No)/ln2

Tốc độ sinh trƣởng (k) là số thế hệ sinh ra trong một đơn vị thời gian thƣờng biểu thị

bằng số thế hệ trong một giờ:

k = g/t = (log Nt – log No)/(t.ln2)

Thời gian thế hệ là thời gian cần thiết để số lƣợng quần thể tăng lên gấp đôi:

T= 1/k

Trong đó:

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

t: thời gian nuôi cấy

Nt: Số lƣợng tế bào ở thời điểm t

No: Số lƣợng tế bào ban đầu

Hình 1.14. Đƣờng cong sinh trƣởng của tế bào

Tốc độ sản xuất kháng thể không phụ thuộc vào tốc độ sinh trƣởng. Ví dụ, một

số tác giả đã quan sát kháng thể tiếp tục đƣợc sản xuất ở giai đoạn cân bằng và trong

một số trƣờng hợp tốc độ sản xuất khác thể đạt tối đa trong suốt giai đoạn cân bằng.

Ngƣợc lại, một vài dòng tế bào lai cho thấy tốc độ sản xuất kháng thể giảm khi chúng

đạt đến giai đoạn cân bằng. Động lực học sản xuất kháng thể có thể do một vài cơ chế

ức chế, môi trƣờng cạn kiệt làm giảm đáng kể tốc độ sản xuất kháng thể của những tế

bào này. Trái lại, Fazekas de St Groth (1983) đã kiểm tra một số dòng tế bào lai trong

nuôi cấy liên tục và không thấy sự ực chế ngƣợc của sự tổng hợp kháng thể bởi tốc độ sản xuất kháng thể về cơ bản là giống nhau ở mật độ tế bào 105 và 106 tế bào/ml. Cơ

chế hình thành động lực học kháng thể có thể đƣợc giải thích nhƣ sau: thứ nhất, kháng

thể hình thành trong tế bào và đƣợc giải phóng trong suốt giai đoạn chết khi màng tế

bào bị phân giải; thứ hai, tốc độ sản xuất kháng thể tăng trong suốt giai đoạn cân bằng.

Một vài nghiên cứu đã cho thấy quần thể tế bào cân bằng đạt đƣợc tốc độ sản xuất

kháng thể cao hơn trong suốt giai đoạn sinh trƣởng và tốc độ sản xuất kháng thể có

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

liên quan đến số lƣợng tế bào sống [12, 21, 24].

Chƣơng 2. Vật liệu và phƣơng pháp

2.1. Vật liệu

2.1.1. Động vật

Chuột Balb/c đực thuần chủng (do Viện 103 cung cấp) đƣợc sử dụng làm vật

chủ để gây miễn dịch.

2.1.2. Hồng cầu mẫu

Bộ hồng cầu mẫu ABO – Rh dƣơng 5% do Viện huyết học và truyền máu trung

ƣơng cung cấp đƣợc sử dụng làm vật liệu gây miễn dịch và làm panel hồng cầu sàng

lọc dòng tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu.

2.1.3. Dòng tế bào myeloma

Dòng tế bào myeloma sp2/0 đƣợc sử dụng làm nguồn tế bào dung hợp có nguồn

gốc từ chuột Balb/c.

2.1.3. Hóa chất

Môi trƣờng nuôi cấy tế bào động vật Dulbecco's Modified Eagle's Medium –

DMEM của hãng Gibco (Mỹ). Huyết thanh Fetal Bovine Serum – FBS của hãng

Sigma (Mỹ). Tá chất Freund’s complete adjuvant – FCA và Freund’s incomplete

adjuvant – FIA của hãng Sigma (Mỹ). Môi trƣờng chọn lọc Hypoxanthine

aminopterine thymine – HAT 50X, Hypoxanthine thymine – HT 50X của hãng Sigma

(Mỹ). Chất bảo quản đông lạnh Dimethylsulfoxide – DMSO của hãng Sigma (Mỹ).

Tác nhân dung hợp Polyethylene Glycol – PEG 50% 1500 của hãng Sigma (Mỹ). Kit

xác định loại globulin miễn dịch Pierce® Rapid ELISA mouse mAb isotyping kit của

hãng Thermo (Mỹ). Huyết thanh mẫu anti-A của hãng Biorad (Pháp). Các hóa chất

khác đƣợc nhập từ hãng Merck (Đức).

Bảng 2.1. Môi trƣờng sử dụng

STT Môi trƣờng Thành phần

1 DMEM + 10% FBS 450 ml DMEM + 50 ml FBS

(500 ml)

2 DMEM + 20% FBS 80 ml DMEM + 20 ml FBS

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

(100 ml )

3 DMEM + 1% FBS 99 ml DMEM + 1 ml FBS

(100 ml )

4 HAT (100 ml) 88 ml DMEM + 10 ml FBS + 2 ml HAT 50X

5 HT (100 ml) 88 ml DMEM + 10 ml FBS + 2 ml HT 50X

Bảng 2.2. Một số dung dịch

STT Tên dung dịch Thành phần

1 NaCl 0,9% 9 g NaCl + 1000 ml H2O

2 PBS 1X, pH = 7.8 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4.2H2O,

0.24 g KH2PO4 vào 800 ml nƣớc deion.

Chỉnh pH = 7.8 bằng NaOH 10N hoặc HCl

10N

3 (NH4)2SO4 bão hòa 100% (1 541,8 g (NH4)2SO4 sau đó bổ sung nƣớc đến

lít) thể tích 1000 ml

4 (NH4)2SO4 bão hòa 50% 500 ml dung dịch (NH4)2SO4 bão hòa 100%

vào 500 ml nƣớc deion

5 EDTA 0,5 M Cân 18, 612 g EDTA.Na.2H2O (M=372,24

g/mol) bổ sung vào 80 ml nƣớc deion. Dùng

NaOH 10N để chỉnh pH=8. Bổ sung nuocs

đến thể tích 100 ml

2.1.4. Máy móc thiết bị

Tủ nuôi cấy tế bào động vật (Panasonic, Nhật), Tủ cấy an toàn cấp 2 (Esco,

Singapo), pipet điện cầm tay (Eppendorf, Mỹ), Máy li tâm (Eppendorf, Mỹ), Tủ lạnh

(Sanyo, Nhật), Máy khuấy từ (Ika werke, Đức), Kính hiển vi phản pha (Olympus,

Philipin), Bình bảo quản mẫu bằng nito lỏng (Taylor Wharton, Mỹ) và các máy móc

khác.

2.2. Phƣơng pháp

2.2.1. Gây miễn dịch

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

* Nguyên lý:

Quá trình tiêm các kháng nguyên vô hại cùng với chất kích thích miễn dịch (tá

chất) để kích thích cơ thể hình thành đáp ứng miễn dịch dịch thể đƣợc gọi là quá trình

gây miễn dịch. Mục đích của việc gây miễn dịch để hoạt hóa các tế bào B đặc hiệu

kháng nguyên để tạo tế bào lai. Trong đáp ứng miễn dịch dịch thể, khi cơ thể tiếp xúc

với kháng nguyên qua quá trình gây miễn dịch với tá chất dẫn đến sự hoạt hóa và mở

rộng dòng tế bào B đặc hiệu. Trong lần tiếp xúc kháng nguyên thứ 2, các tế bào

lympho B biệt hóa thành tế bào plasma tiết kháng thể hoặc tế bào B nhớ. Hầu hết tế

bào plasma có đời sống ngắn đƣợc duy trì trong cơ quan lympho thứ cấp (hạch

lympho). Có rất nhiều con đƣờng gây miễn dịch cho chuột bao gồm: tiêm dƣới da,

tiêm trong da, tiêm cơ, tiêm vào xoang bụng, tiêm tĩnh mạch, tiêm não, tiêm ngực,

tiêm mũi. Gây miễn dịch qua bàn chân chuột là phƣơng pháp phổ biến đƣợc sử dụng

để gây miễn dịch cho chuột. Đây là phƣơng pháp kết hợp giữa tiêm dƣới da và tiêm

trong da. Các tế bào lympho sẽ đƣợc tập trung chủ yếu ở hạch lympho vùng kheo ở

chân [10, 13, 16, 29].

* Quy trình:

- Chuẩn bị hồng cầu gây miễn dịch: Chuyển toàn bộ dung dịch hồng cầu mẫu 5% vào

ống Falcon 15 ml đem ly tâm 1000 vòng/phút, 5 phút. Loại bỏ dịch nổi, thu cặn hồng

cầu và tái huyền phù vào 10 ml nƣớc muối sinh lý, ly tâm 1000 vòng/phút trong 5

phút, loại bỏ dịch nổi, thu cặn hồng cầu. Lặp lại bƣớc này cho đến khi rửa hết sắc tố do

hồng cầu vỡ giải phóng ra. Pha hồng cầu 5% để gây nhũ.

- Gây miễn dịch: Hồng cầu mẫu A 5% đƣợc gây nhũ với tá chất Freund (FCA hoặc

FIA) theo tỉ lệ 1:1 để tạo thành nhũ tƣơng rồi tiêm khoảng 150 µl vào hai gan bàn chân

sau của chuột Balb/c. Chuột đƣợc gây miễn dịch 3 lần trong đó lần tiêm đầu tiên sử

dụng tá chất FCA và hai lần tiêm nhắc lại sử dụng tá chất FIA. Khoảng cách giữa các

lần tiêm là 3 ngày.

2.2.2. Chuẩn bị tế bào nền

* Nguyên lý:

Khi nuôi các tế bào lai ngƣời ta thƣờng sử dụng lớp tế bào nuôi cấy nền, lớp tế

bào này sẽ tiết các cytokine thúc đẩy quá trình dung hợp cũng nhƣ sự phát triển tế bào

lai từ một tế bào. Lớp tế bào nền thƣờng sử dụng là đại thực bào. Các tế bào đại thực Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

bào có mặt chủ yếu ở các xoang cơ thể, đặc biệt là xoang bụng do đó ta có thể dễ dàng

lấy tế bào đại thực bào từ bụng chuột. Các tế bào đại thực bào là tế bào đã biệt hóa

hoàn toàn do vậy nó không có khả năng nhân lên khi nuôi cấy in-vitro do đó không

ảnh hƣởng đến sự phát triển của tế bào lai. Tế bào đại thực bào là tế bào bám dính do

vậy khi nuôi cấy tĩnh nó sẽ có dạng dẹt [8, 25].

* Quy trình:

Chuột đƣợc gây mê bằng chloroform và khử trùng bằng cồn 70%. Từ xƣơng ức

của chuột dùng kéo để rạch 1 đƣờng ngang nhỏ sau đó dùng panh kéo căng da bụng

chuột và rạch 1 đƣờng dọc bụng chuột, kéo căng da chuột sang 2 bên sƣờn. Tiêm vào

xoang bụng chuột khoảng 10 ml môi trƣờng (HAT dùng cho dung hợp hoặc DMEM

dùng cho tách dòng) sau đó lắc nhẹ bụng chuột một vài lần để tế bào đại thực bào

bong ra. Dùng xi lanh hút lấy khoảng 8 ml dịch từ xoang bụng và bổ sung vào 20 ml

môi trƣờng, lắc đều. Chuyển 50 µl dịch vào các giếng của đĩa nuôi cấy 96 giếng. Nuôi tế bào trong tủ ấm 37oC, 5% CO2 khoảng 24 giờ.

Hình 2.1. Tế bào đại thực bào khi nuôi cấy tĩnh

2.2.3. Nuôi cấy tế bào myeloma

* Nguyên lý

Dòng tế bào myeloma sp2/0 là dòng tế bào u tủy, không có khả năng sản xuất

kháng thể nhƣng lại có thể sinh sản và phát triển nhanh trong nuôi cấy in-vitro, dòng tế

bào này thiếu enzyme HGPRT (hypoxanthine-guanine phosphoribosyl tranferase)

đƣợc sử dụng nhƣ marker chọn lọc dòng tế bào lai [25].

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

* Quy trình

Chuyển ống giống chứa tế bào myeloma sp2/0 từ trong nitơ lỏng vào bể ổn nhiệt ở 37oC. Khi ống tế bào đã tan đá hoàn toàn, khử trùng phía ngoài ống bằng cồn 70% sau đó chuyển toàn bộ tế bào trong ống giống sang ống 15 ml và bổ sung 10 ml

môi trƣờng DMEM, ly tâm 1000 vòng/phút trong 5 phút (DMSO gây độc cho tế bào,

ly tâm để loại bỏ DMSO). Gạn bỏ lớp dịch nổi phía trên và hòa cặn tế bào vào 5 ml môi trƣờng DMEM + 10% FBS và chuyển tế bào sang chai nuôi cấy T25 cm2. Nuôi tế bào ở 37oC, 5% CO2. Khi tế bào đã sinh trƣởng thành một lớp đơn liên tục thì tiến hành cấy truyền tế bào sang chai T75 cm2. Nuôi tế bào ở 37oC, 5% CO2 cho đến khi tế

bào sinh trƣởng chiếm khoảng 80-90% bề mặt chai nuôi là giai đoạn tốt nhất để dung

hợp.

2.2.4. Dung hợp và tạo dòng tế bào lai

* Nguyên lý

Các tế bào lympho đƣợc trộn với tế bào u tủy sẽ tạo thành cụm khi ly tâm. PEG

sẽ phá tách các cụm tế bào ra và biến đổi cấu trúc lớp lipid trên màng tế bào từ đó phá

vỡ một phần màng của hai tế bào cạnh nhau để sát nhập hai màng để tạo thành thành tế

bào lai dị hợp. Vì PEG là một chất độc nên sử dụng ở mức tối thiểu. Các tế bào sau khi

dung hợp đƣợc ly tâm để loại bỏ PEG và chuyển vào môi trƣờng chọn lọc HAT để

nuôi cấy [8, 23].

* Quy trình

- 3 ngày sau lần gây miễn dịch cuối cùng, chuột đƣợc gây mê bằng chloroform, khử

trùng chuột bằng cồn 70% và lấy máu ở tim để thu huyết thanh.

- Khử trùng chuột bằng cồn 70%, mổ chuột để thu lấy 2 hạch vùng kheo và lách. Rửa

lách và hạch bẹn trong 5 ml môi trƣờng DMEM, rửa 3 lần.

- Tách tế bào lympho B từ lách và hạch vùng kheo của chuột: Chuyển lách và hạch

vùng kheo vào rây, bổ sung một ít môi trƣờng vào rây và dùng chày nghiền nhẹ nhàng

để tế bào lympho B tách ra. Dùng môi trƣờng DMEM tráng rây, chày để thu tế bào.

Hút toàn bộ huyền phù tế bào chuyển vào ống Falcon 15 ml, ly tâm 1000 vòng/phút

trong 5 phút ở nhiệt độ phòng.

- Loại bỏ dịch nổi và tái huyền phù tế bào vào 5 ml NH4Cl 0,85% để phá hồng cầu. Bổ

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

sung thêm 10 ml môi trƣờng DMEM. Ly tâm 1000 vòng/phút trong 5 phút.

- Loại bỏ dịch nổi và tái huyền phù tế bào vào 10 ml môi trƣờng DMEM. Ly tâm 1000

vòng/phút trong 5 phút để loại bỏ NH4Cl.

- Loại bỏ dịch nổi và tái huyền phù tế bào vào 10 ml môi trƣờng DMEM. - Đối với tế bào myeloma: Sử dụng 1 chai nuôi cấy T75 cm2 mỗi chai có chứa 20 ml

huyền phù tế bào myeloma cho 1 con chuột. Lắc mạnh chai nuôi cấy cho tế bào bung

ra khỏi bề mặt nuôi cấy và chuyển toàn bộ huyền phù tế bào vào ống Falcon 50 ml. Ly

tâm 1000 vòng/phút trong 5 phút. Loại bỏ dịch nổi và tái huyền phù tế bào vào trong

10 ml môi trƣờng DMEM, ly tâm 1000 vòng/phút trong 5 phút để rửa tế bào. Loại bỏ

dịch nổi, tái huyền phù tế bào vào 10 ml môi trƣờng DMEM.

- Chuyển huyền phù tế bào lympho B và huyền phù tế bào myeloma vào ống Falcon

50 ml (tỉ lệ 5 tế bào lympho B:1 tế bào myeloma). Ly tâm 1000 vòng/phút trong 5

phút.

- Loại bỏ dịch nổi, tái huyền phù tế bào vào 10 ml môi trƣờng DMEM, ly tâm 1000

vòng/phút trong 5 phút để rửa tế bào.

- Loại bỏ dịch nổi, thu cặn tế bào.

- Dùng xi lanh thêm 1 ml PEG 50% (khối lƣợng phân tử là 1500) đã đƣợc làm ấm từ

trƣớc, nhỏ từng giọt một trong vòng 1 phút, vừa nhỏ vừa lắc đều ống Falcon.

- Bổ sung 1 ml môi trƣờng DMEM đã đƣợc làm ấm từ trƣớc, nhỏ từng giọt một trong

vòng 1 phút, vừa nhỏ vừa lắc đều ống Falcon.

- Lắc đều ống Falcon trong 1 phút.

- Cuối cùng bổ sung 8 ml môi trƣờng DMEM đã đƣợc làm ấm từ trƣớc, nhỏ từng giọt

một trong vòng 2 phút.

- Ly tâm 1000 vòng/phút trong 5 phút.

- Loại bỏ dịch nổi và tái huyền phù cặn tế bào vào môi trƣờng HAT. Sử dụng pipet đa

kênh chuyển 150 µl huyền phù tế bào vào các giếng của đĩa 96 giếng mỗi đĩa đã có

chứa khoảng 50 µl huyền phù tế bào đại thực bào.

- Sau 2-4 ngày, tế bào lai có thể quan sát đƣợc.

- Sau 4-6 ngày, loại bỏ môi trƣờng HAT và thay môi trƣờng HT để giảm độc lực của

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

môi trƣờng HAT, mỗi giếng bổ sung khoảng 150 l môi trƣờng HT.

- Sau 4-6 ngày thay môi trƣờng (10-12 ngày sau dung hợp), kiểm tra khả năng sản xuất

kháng thể của các tế bào lai bằng phản ứng ngƣng kết hồng cầu.

2.2.5. Tách dòng tế bào lai

* Nguyên lý

Tách dòng bằng phƣơng pháp pha loãng tới hạn đƣợc sử dụng để tạo ra một

quần thể tế bào đơn từ một quần thể ban đầu chứa nhiều dòng tế bào. Phƣơng pháp này

đƣợc tiến hành bằng cách thiết lập một loạt các dãy pha loãng tăng dần từ dịch nuôi

cấy ban đầu [8].

* Quy trình:

Hình 2.2. Sơ đồ pha loãng tới hạn

- Bổ sung 100 µl môi trƣờng DMEM + 20% FBS vào các giếng của đĩa 96 giếng đã

chuẩn bị sẵn đại thực bào ngoại trừ giếng A1

- Trộn đều tế bào với môi trƣờng với tế bào trong giếng đã sàng lọc đƣợc, chuyển 100

µl huyền phù tế bào vào ống Eppendorf có 900 µl môi trƣờng DMEM + 20% FBS và

trộn đều. Sau đó, bổ sung 200 µl huyền phù tế bào trong ống Eppendorf vào giếng A1.

- Chuyển 100 µl huyền phù tế bào từ giếng A1 sang giếng B1 và trộn đều. Pha loãng

theo cơ số 2, làm tƣơng tự cho đến giếng H1 thì loại bỏ 100 µl.

- Dùng pipet đa kênh chuyển 100 µl huyền phù từ cột 1 sang cột 2, làm tƣơng tự đến

hết cột 12 thì loại bỏ 100 µl.

- Huyền phù tế bào còn lại trong ống Eppendorf đƣợc chuyển vào giếng của đĩa 24 để

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

nuôi cấy và giữ tế bào. - Nuôi tế bào ở 37oC, 5% CO2.

2.2.6. Phản ứng ngƣng kết hồng cầu trên đĩa 96 giếng

* Nguyên lý

Ngƣng kết hồng cầu (hemagglutination) là một dạng đặc biệt của phản ứng

ngƣng kết với sự tham gia của hồng cầu. Hồng cầu đƣợc dùng nhƣ một tế bào chỉ thị

vì chúng có thể cụm lại hoặc ngƣng kết khi có kháng thể phản ứng chéo với kháng

nguyên trên bề mặt của chúng. Kháng nguyên ở đây có thể là kháng nguyên của chính

hồng cầu hoặc kháng nguyên tinh khiết đƣợc gắn lên bề mặt hồng cầu. Kháng thể

trong dịch nuôi cấy tế bào lai có thể đƣợc phát hiện. Phản ứng ngƣng kết đƣợc thực

hiện bằng cách trộn hồng cầu với dịch nuôi cấy tế bào lai. Nếu kháng thể đặc hiệu với

kháng nguyên trên màng hồng cầu thì có thể kết dính và hình thành liên kết chéo với

kháng nguyên để tạo thành đám phức hợp kháng nguyên kháng thể ở đáy giếng. Nếu

kháng thể không đặc hiệu thì các tế bào hồng cầu sẽ lắng xuống đáy giếng và hình

thành một vòng tròn màu đỏ [4,9].

Hình 2.3. Phản ứng ngƣng kết hồng cầu trên đĩa đáy chữ V

* Quy trình

Hồng cầu mẫu A, B, hoặc O đƣợc rửa với nƣớc muối sinh lý 0,9% bằng cách ly

tâm ở 1000 vòng/phút trong 10 phút. Rửa 3 lần và pha hồng cầu mẫu về 1% hoặc 2%.

Bổ sung 25 µl dịch nuôi cấy tế bào lai vào giếng của đĩa 96 giếng sau đó bổ sung 25 µl

hồng cầu mẫu 1% hoặc 2% và để ở nhiệt độ phòng khoảng 30 phút. Đọc kết quả bằng

cách nghiêng đĩa khoảng 45 độ.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Hình 2.4. Cách đọc kết của của phản ứng ngƣng kết hồng cầu trên đĩa 96 đáy chữ V

2.2.7. Phản ứng ngƣng kết hồng cầu trên phiến kính

Hồng cầu mẫu A, B, hoặc O đƣợc rửa với nƣớc muối sinh lý 0,9% bằng cách ly

tâm 1000 vòng/phút trong 10 phút. Rửa 3 lần và pha hồng cầu mẫu về 10%. Nhỏ 25 µl

dịch nuôi cấy tế bào lai lên phiến kính sau đó nhỏ 25 µl hồng cầu mẫu 10% lên giọt

dịch nuôi cấy vửa nhỏ. Dùng que thủy tinh trộn đều hồng cầu với dịch nuôi cấy. Để

yên phiến kính, sau 5 phút láng nhẹ phiến kính và đọc kết quả.

2.2.8. Phƣơng pháp đếm tế bào

* Nguyên lý:

Phƣơng pháp này sử dụng trypan blue phân biệt tế bào sống và tế bào chết.

Màng tế bào có khả năng thấm chọn lọc các chất đi vào trong tế bào. Trypan blue là

thuốc nhuộm màu xanh và gây độc cho tế bào nên nó chỉ đi qua màng sinh chất của tế

bào chết do vậy khi nhuộm tế bào với trypan blue thì tế bào sống sẽ không bắt màu

thuốc nhuộm, tế bào chết sẽ bắt màu của thuốc nhuộm và có màu xanh [2].

* Quy trình:

Làm sạch và khô buồng đếm sau đó phủ 1 tấm lamen. Nhuộm tế bào với trypan

blue 0,4% theo tỉ lệ 1:1. Chuyển một lƣợng nhỏ huyền phù tế bào vào mỗi bên buồng

đếm. Đặt buồng đếm dƣới kính hiển vi và quan dƣới vật kính 10X. Tập trung vào 4 ô

vuông của buồng đếm: 1,2,3,4. Tế bào sống là các tế bào không bắt màu của thuốc

nhuộm trypan blue, tế bào chết có màu xanh do bắt màu thuốc nhuộm.

Tính toán: mật độ tế bào = số lƣợng tế bào trung bình trong 4 ô x 2 (hệ số pha

loãng) x 104 (tế bào/ml).

Hình 2.5. Buồng đếm tế bào

2.2.9. Xây dựng đƣờng cong sinh trƣởng để nghiên cứu sự sinh trƣởng và sản

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

xuất kháng thể của các dòng tế bào lai

Tế bào lai A6G11C9 đƣợc phục hồi từ ống giống bảo quản trong nitơ lỏng - 196oC, khi tế bào đã sinh trƣởng thành một lớp đơn liên tục trên bề mặt chai nuôi T25 cm2 thì tiến hành cấy truyền tế bào ra chai T75 cm2 (Quy trình phục hồi và cấy truyền

tƣơng tự nhƣ đối với tế bào myeloma sp2/0). Khi tế bào phát triển thành một lớp đơn

liên tục (sinh trƣởng đến pha log) thì tiến hành thu tế bào để làm đƣờng cong sinh

trƣởng. Đếm tế bào để xác định lƣợng số lƣợng tế bào, tính toán để chuẩn bị 12 ml huyền phù tế bào lai với mật độ 105 tế bào/ml sau đó chuyển vào các giếng của đĩa 24, mỗi giếng 1 ml (chuyển vào 12 giếng). Đặt đĩa vào trong tủ ấm nuôi ở 37oC, 5% CO2.

Cứ sau 24 giờ thì đếm tế bào ở một giếng để xác định mật độ tế bào sống theo ngày,

dịch nuôi cấy ở giếng đó đƣợc ly tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút để loại bỏ cặn tế bào và cất giữ dịch nuôi cấy ở -20oC cho các phân tích sau này.

Các thông số tính toán:

Số thế hệ là số lần mà tế bào phân chia (g) Nt = No.2g g = log (Ne/No)/ln2= (log Nt – log No)/ln2

Tốc độ sinh trƣởng (k) là số thế hệ sinh ra trong một đơn vị thời gian thƣờng biểu thị

bằng số thế hệ trong một giờ:

k = g/t = (log Nt – log No)/(t.ln2)

Thời gian thế hệ là thời gian cần thiết để số lƣợng quần thể tăng lên gấp đôi:

T= 1/k

Trong đó:

t: thời gian nuôi cấy

Nt: Số lƣợng tế bào ở thời điểm t

No: Số lƣợng tế bào ban đầu

2.2.10. Xác định loại globulin miễn dịch

Cân bằng cơ chất TMB và đĩa ELISA đến nhiệt độ phòng. Dịch nuôi cấy tế bào

lai đƣợc pha loãng trong TBS theo tỉ lệ 1:50. Bổ sung 50 µl dịch pha loãng kháng thể

vào mỗi giếng của một hàng 8 giếng. Sau đó, bổ sung 50 µl dịch pha loãng kháng thể

cộng gộp HPR (Goat anti mouse IgG+IgA+IgM HRP) vào mỗi giếng, trộn nhẹ bằng

pipet hoặc trên máy lắc. Sau 1 tiếng ủ, loại bỏ dung dịch trong mỗi giếng và rửa bằng

đệm rửa (3 lần). Sau khi rửa, bổ sung 75 µl cơ chất TMB vào mỗi giếng (giếng dƣơng Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

tính có màu xanh, phản ứng này có thể quan sát sau 1 phút). Sau 5 – 15 phút bổ sung

dung dịch dừng phản ứng. Cuối cùng, đọc kết quả bằng mắt thƣờng hoặc đo bằng máy

quang phổ ở bƣớc sóng 450nm. Giếng dƣơng tính có giá trị OD450>0,2.

Hình 2.6. Cơ chế và cách đọc kết quả của phản ứng ELISA xác định phân lớp kháng

thể

2.2.11. Loại bỏ phenol bằng ammonium sulfate

* Nguyên lý:

Phƣơng pháp tủa ammonium sulfate thƣờng đƣợc sử dụng để làm giàu và cô

đặc kháng thể trong huyết thanh, dịch báng hoặc dịch nuôi cấy tế bào hoặc loại bỏ một

số thành phần trong dịch nuôi cấy. Khi nồng độ của muối tăng lên trong dung dịch, các

protein hoặc các đại phân tử khác trong dung dịch sẽ trở nên khó tan hơn cho đến khi

chúng kết tủa, ảnh hƣởng độ tan đƣợc gọi là “salting out” [11].

* Quy trình:

Dịch nuôi cấy tế bào lai đƣợc tủa với ammonium sulfate với nồng độ cuối cùng

là 50%: Bổ sung từ từ dung dịch ammonium sulfate bão hòa 100% vào dịch nuôi cấy

tế bào lai theo tỉ lệ 1:1, sử dụng khuấy từ để ammonium sulfate và dịch nuôi cấy tế bào trộn đều với nhau (quá trình này tiến hành ở trên đá, 4oC). Sau khi bổ sung hết

ammonium sulfate bão hòa 100% thì để quá trình tủa trong tủ lạnh trong 3 giờ hoặc

qua đêm. Ly tâm 8000 vòng/phút trong 20 phút để thu tủa. Rửa tủa 2 lần với ammonium sulfate bão hòa 50% (Tất cả các bƣớc đều tiến hành ở 4oC). Tủa sau đó

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

đƣợc tái huyền phù trong PBS 1X với thể tích bằng 1/5 thể tích ban đầu. Kháng thể sau khi loại bỏ phenol đỏ đƣợc bảo quản ở 4oC với 0,01% sodium azide.

2.2.12. Tạo sinh phẩm xác định nhóm máu A

Kháng thể A sau khi loại bỏ phenol đỏ đƣợc sử dụng để pha sinh phẩm. Thành

phần và hàm lƣợng các chất trong sinh phẩm bao gồm: 0,0035% patent blue V sodium

salt; EDTA 10 mM; 0,01% sodium azide và sử dụng đệm là PBS 1X pH=7.8.

2.2.13. Xác định độ đặc hiệu

Độ đặc hiệu của dịch nuôi cấy tế bào lai đƣợc xác định bằng phản ứng ngƣng

kết của nó chống lại panel hồng cầu của nhóm máu hệ ABO. Phƣơng pháp này đƣợc

tiến hành bằng phản ứng ngƣng kết trên đĩa 96 giếng đáy chữ V. Dịch nuôi cấy tế bào

lai A6G11C9, môi trƣờng nuôi cấy DMEM+10%FBS (đối chứng âm) và huyết thanh

mẫu anti-A của Biorad (đối chứng dƣơng) đƣợc làm phản ứng ngƣng kết trên trên đĩa 96 giếng đáy chữ V đồng thời với hồng cầu mẫu A+, B+ và O+.

2.2.14. Xác định hiệu giá

Xác định hiệu giá kháng thể bằng phản ứng ngƣng kết trên đĩa 96 giếng đáy chữ

V. Đối với 1 hàng của đĩa 96 giếng đáy chữ V, bổ sung vào mỗi giếng 25 l nƣớc

muối sinh lý. Sau đó, bổ sung 25 l dịch nuôi cấy vào giếng đầu tiên của 1 hàng, trộn

đều dịch nuôi cấy với nƣớc muối sinh lý trong giếng sau đó chuyển 25 l từ giếng đầu

sang giếng thứ 2, làm tƣơng tự cho đến giếng cuối của hàng đó thì bỏ đi 25l (kháng

thể đƣợc pha loãng theo cơ số 2). Bổ sung 25 µl hồng cầu mẫu 2% vào mỗi giếng và

để ở nhiệt độ phòng khoảng 30 phút, quan sát kết quả.

2.2.15. Xác định cƣờng độ và ái tính

Ái tính (avidity) đƣợc đánh giá thông qua thời gian cần thiết (giây) để có thể bắt

đầu quan sát phản ứng ngƣng kết bằng mắt thƣờng. Độ mạnh (Intensity) của phản ứng

kháng nguyên – kháng thể đƣợc xác định nhƣ sau: (4+) có một hạt và dịch trong, (3+)

có một vài hạt và dịch trong, (2+) một vài hạt nhỏ và dịch đục, (+1) nhiều hạt và dịch

đục, (-) không ngƣng kết [1].

Ái tính kháng thể và độ mạnh của phản ứng kháng nguyên – kháng thể đƣợc

xác định bằng cách nhỏ một giọt dịch nuôi cấy có chứa kháng thể lên một tấm kính

sạch và sau đó bổ sung thêm một giọt hồng cầu mẫu 10% và dùng đũa thủy tinh trộn

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

đều, dùng đồng hồ bấm giờ để xác định thời gian từ lúc trộn xong kháng nguyên kháng

thể đến khi quan sát đƣợc tín hiệu đầu tiên của phản ứng ngƣng kết giữa kháng nguyên

– kháng thể. Sau 5 phút thì tiến hành đánh giá độ mạnh của phản ứng kháng nguyên –

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

kháng thể.

Chƣơng 3. Kết quả 3.1. Đánh giá hiệu quả gây miễn dịch của hồng cầu mẫu A+

Để tạo đƣợc tế bào lai chuột sản xuất kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên

A, trƣớc hết cần gây miễn dịch cho chuột để thu nhận quần thể tế bào lympho B sản xuất kháng thể kháng kháng nguyên A. Hồng cầu mẫu A+ có kháng nguyên A trên

màng hồng cầu do vậy nó đƣợc sử dụng để gây miễn dịch cho chuột Balb/c theo

đƣờng tiêm vào gan bàn chân chuột để thu nhận quần thể tế bào lympho B trong hạch

lympho ngoại vi (hạch vùng kheo) và lách. Trƣớc khi dung hợp, chuột đƣợc gây mê để

thu máu ở tim sau đó tách lấy huyết thanh. Huyết thanh từ chuột đã gây miễn dịch đƣợc làm phản ứng ngƣng kết với hồng cầu mẫu A+, B+ và O+ để đánh giá hiệu quả gây miễn dịch của hồng cầu mẫu A+.

Hình 3.1. Phản ứng ngƣng kết giữa huyết thanh của chuột đƣợc gây miễn dịch với hồng cầu mẫu A+, B+, O+

Quan sát kết quả ngƣng kết (Hình 3.1) nhận thấy, huyết thanh của chuột đã gây miễn dịch ngƣng kết với hồng cầu mẫu A+ chứng tỏ hồng cầu mẫu A+ đã kích hoạt

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

thành công hệ thống miễn dịch của chuột để hình thành đáp ứng miễn dịch dịch thể. Huyết thanh của chuột đã gây miễn dịch không chỉ ngƣng kết với hồng cầu mẫu A+ mà còn ngƣng kết với cả hồng cầu mẫu B+ và O+. Điều này chứng tỏ rằng không chỉ kháng nguyên A trên màng hồng cầu A+ kích thích chuột hình thành đáp ứng miễn dịch mà các kháng nguyên khác trên màng hồng cầu A+ cũng kích thích chuột hình

thành đáp ứng miễn dịch dịch thể và các kháng nguyên này cũng có mặt trên hồng cầu mẫu B+ và O+. Nhƣ vậy, quần thể tế bào lympho B thu nhận từ chuột đã gây miễn dịch với hồng cầu mẫu A+ là tập hợp các tế bào lympho B khác nhau sản các xuất kháng thể

đặc hiệu với các kháng nguyên khác nhau trên màng hồng cầu trong đó các tế bào

lympho B sản xuất kháng thể kháng kháng nguyên A.

Hình 3.2. Lách và hạch vùng kheo thu đƣợc từ chuột đƣợc gây miễn dịch với hồng cầu

mẫu A+

Sau khi đánh giá khả năng gây miễn dịch của hồng cầu mẫu A+ bằng phản ứng

ngƣng kết hồng cầu, tiến hành giết chuột thu lách và hạch lympho để tách lấy tế bào

lympho B bằng phƣơng pháp cơ học. Lách và hạch thu nhận từ chuột gây miễn dịch có

kích thƣớc khá lớn (Hình 3.2) nhƣ vậy có nhiều tế bào lympho B tập trung tại đây

chứng tỏ hiệu quả gây miễn dịch cho chuột là tốt.

3.2. Dung hợp tạo tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên A

Quần thể tế bào lympho B đƣợc tách từ hạch và lách của chuột đƣợc dung hợp

với tế bào myeloma sp 2/0 dƣới tác dụng của PEG 1500 50%. Sau khi dung hợp, tế

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

bào đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng chọn lọc HAT (Hình 3.3).

Hình 3.3. Tế bào sau dung hợp

(Ảnh chụp vật kính 10X, thị kính 20X, độ phóng đại máy ảnh 5X)

Tế bào myeloma sp2/0 bị mất khả năng tổng hợp kháng thể và thiếu enzyme

hypoxanthine-guanine-phosphoribosyltransferase (HGPRT). Đây là những enzyme

cho phép tế bào tổng hợp purine cấp cứu sử dụng nguồn hypoxanthine. Ban đầu, sự

vắng mặt của HGPRT không phải là vấn đề vì tế bào có thể sử dụng con đƣờng thay

thế để tổng hợp purine. Tuy nhiên, khi tế bào đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng chứa

aminoteprin, chúng không thể sử dụng con đƣờng khác và nó phụ thuộc hoàn toàn vào

HGPRT để tồn tại. Còn tế bào lympho B có gen HGPRT khi tiếp xúc với kháng

nguyên chúng sẽ biệt hóa thành tƣơng bào plasma sản xuất kháng thể kháng lại kháng

nguyên gây miễn dịch. Tuy nhiên, tƣơng bào plasma là giai đoạn cuối cùng của quá

trình biệt hóa do đó chúng không thể tiếp tục nhân lên đƣợc nữa. Chỉ tế bào lai mang

đặc tính của cả tế bào myeloma (sinh trƣởng vô hạn) và tế bào lympho B (có gen

HGPRT) mới có khả năng sinh trƣởng trong môi trƣờng HAT (Hình 3.4).

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Hình 3.4. Tế bào lai hình thành sau 6 ngày dung hợp

(Ảnh chụp vật kính 10X, thị kính 20X, độ phóng đại máy ảnh 8X)

Khoảng 4 ngày sau khi dung hợp, tế bào đƣợc soi dƣới kính hiển vi để đánh dấu

các giếng có chứa tế bào lai. Trong tổng số 768 giếng dung hợp thì có 712 giếng chứa

tế bào lai nhƣ vậy hiệu suất dung hợp đạt trên 92,7%. Mỗi giếng dung hợp có thể chứa

một hoặc nhiều hơn một dòng tế bào lai và tốc độ sinh trƣởng của các dòng tế bào lai ở

các giếng khác nhau là khác nhau: có dòng sinh trƣởng nhanh hơn, có dòng sinh

trƣởng chậm hơn. Trong nuôi cấy tĩnh, tế bào lai là tế bào bán bám dính và có dạng

tròn (Hình 3.4, Hình 3.5).

Hình 3.5. Tế bào lai sau 2 ngày dung hợp ở các giếng khác nhau

(Ảnh chụp vật kính 10X, thị kính 20X, độ phóng đại máy ảnh 5X)

3.3. Sàng lọc hỗn hợp tế bào lai sản xuất kháng thể kháng kháng nguyên A

Vì quần thể tế bào lympho B thu nhận từ hạch và lách chuột là tập hợp các tế

bào lympho B sản xuất các kháng thể đặc hiệu với các kháng nguyên khác nhau trên màng hồng cầu mẫu A+ vì vậy không phải tế bào lai nào hình thành cũng tiết kháng thể

kháng kháng nguyên A. Do đó, cần tiến hành sàng lọc để thu nhận các tế bào lai sản

xuất kháng thể kháng kháng nguyên A và loại bỏ các tế bào lai không cần thiết. Các tế

bào sau khi dung hợp đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng chọn lọc HAT để loại bỏ các tế

bào không dung hợp. Những tế bào lai sống sót sẽ đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng HT

để giảm độc tố của aminoteprin đến mức tối thiểu để tạo ra sự sinh trƣởng tốt nhất cho

tế bào. Khoảng 4 – 6 ngày sau khi thay môi trƣờng (10 – 12 ngày sau dung hợp), tiến

hành lấy dịch nuôi cấy ở các giếng đã đánh dấu có tế bào lai để sàng lọc các dòng tế

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

bào lai sản xuất kháng thể kháng kháng nguyên A.

2 ngày sau dung hợp 4 ngày sau dung hợp 6 ngày sau dung hợp

Tế bào cần sàng lọc (tế bào ngày thứ 10 sau dung hợp hoặc 4 ngày sau thay môi

trƣờng)

(Ảnh chụp vật kính 10X, thị kính 20X, độ phóng đại máy ảnh 5X)

Hình 3.6. Sự phát triển của tế bào lai

Phƣơng pháp ngƣng kết hồng cầu đƣợc sử dụng để sàng lọc các giếng chứa hỗn hợp tế bào lai tiết kháng thể kháng kháng nguyên A. Sử dụng hồng cầu mẫu A+ để làm

phản ứng ngƣng kết với dịch nuôi cấy tế bào lai. Nếu tế bào lai tiết kháng thể kháng kháng nguyên A sẽ kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên A trên hồng cầu mẫu A+ tạo

thành đám phức hợp kháng nguyên – kháng thể ở đáy giếng. Trong 712 giếng có tế

bào lai đƣợc kiểm tra phản ứng ngƣng kết trên đĩa 96 giếng đáy chữ V thì có 24 giếng mà dịch nuôi cấy ngƣng kết với hồng cầu mẫu A+. Tuy nhiên, trên màng hồng cầu mẫu A+ ngoài kháng nguyên A còn có các kháng nguyên khác do vậy kháng thể trong 24

giếng trên có thể là kháng kháng nguyên A hoặc kháng một loại kháng nguyên khác.

Nhƣ vậy, để khẳng định chắc chắn kháng thể hình thành trong 24 giếng tế bào lai đã thử ngƣng kết với hồng cầu mẫu A+ là kháng thể kháng nguyên A thì chúng tôi tiến

hành thử thêm phản ứng ngƣng kết chéo giữa dịch nuôi cấy ở 24 giếng đó với hồng cầu mẫu B+ và O+. Kết quả thu đƣợc là có 6 giếng chứa tế bào lai mà dịch nuôi cấy chỉ ngƣng kết với hồng cầu A+ mà không ngƣng kết với hồng cầu B+ và O+. Nhƣ vậy, Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

chúng tôi sàng lọc đƣợc 6 giếng (A1H9, A4D11, A5B10, A6G11, A7B4, A7C3) chứa

hỗn hợp tế bào lai sản xuất kháng thể kháng kháng nguyên A.

Hồng cầu mẫu 1%

A B O A B O A B O

Hình 3.7. Sàng lọc giếng chứa hỗn hợp tế bào lai sản xuất kháng thể kháng kháng

nguyên A

3.4. Tạo dòng tế bào lai đơn sản xuất kháng thể đơn dòng kháng lại kháng

nguyên A

Trong một giếng dung hợp có thể có nhiều hơn một dòng tế bào lai do vậy cần

tiến hành tách dòng hỗn hợp tế bào lai trong giếng ban đầu để thu nhận các dòng tế

bào lai đơn. Mỗi dòng tế bào đơn chỉ sản xuất một loại kháng thể do đó kháng thể thu

nhận từ dòng tế bào lai này đƣợc gọi là kháng thể đơn dòng. Từ 6 giếng chứa hỗn hợp

tế bào lai tiết kháng thể kháng kháng nguyên A, tiến hành tách dòng bằng phƣơng

pháp pha loãng tới hạn theo 2 chiều của đĩa nuôi cấy 96 giếng. Từ 576 giếng tách dòng

thu nhận đƣợc 27 giếng có chứa tế bào đơn nhƣ vậy hiệu quả tách dòng đạt 4,7%.

Trong 27 giếng có chứa dòng tế bào lai đơn phát triển, dịch nuôi cấy của 27 giếng này

đƣợc kiểm tra khả năng sản xuất kháng thể kháng kháng nguyên A thì có 12 dòng tiết

kháng thể kháng kháng nguyên A (A4D11A9, A4D11F2, A6G11B8, A6G11B10,

A6G11C9, B4D10C6, A6G11D5, A6G11D7, A6G11E7, A7B4C11, A7D4G10,

A7D4H8). Các dòng tế bào lai đơn này sẽ đƣợc nuôi cấy trên đĩa 24 giếng sau đó chuyển sang chai T25 cm2 để thu tế bào cất giữ trong nitơ lỏng còn dịch nuôi cấy đƣợc

kiểm tra để xác định trong 12 dòng tế bào này dòng nào sản xuất kháng thể tốt nhất.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Sau khi xác định hiệu giá của kháng thể do 12 dòng tế bào lai đơn sản xuất chúng tôi

xác định đƣợc dòng tế bào lai A6G11C9 có khả năng sản xuất kháng thể đơn dòng tốt nhất với hiệu giá kháng thể đạt 29.

Hồng cầu mẫu 1%

A B O A B O A B O A B O

Hình 3.8. Sàng lọc dòng tế bào lai đơn sản xuất kháng thể kháng kháng nguyên A

A4D11A9

A4D11F2

A6G11B8

A6G11B10

A6G11C9

2 9

A6G11C6

A6G11D5

A6G11D7

A6G11E7

A7B4C11

A7D4G10

A7D4H8

Hình 3.9. Chọn dòng tế bào lai sản xuất kháng thể kháng kháng nguyên A tốt nhất

3.5. Xác định phân lớp kháng thể do dòng tế bào A6G11C9 sản xuất

Kháng thể đƣợc phân loại thành các phân lớp (isotype) có chức năng khác nhau

trong đáp ứng với kháng nguyên. Phân lớp kháng thể đƣợc phân loại dựa vào sự khác

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

nhau trong trình tự amio acid vùng hằng định của chuỗi nặng. Năm phân lớp kháng thể

chính đã đƣợc phân loại ở động vật có vú: IgA, IgD, IgE, IgG, IgM. Isotype kháng thể

IgG và IgA đƣợc phân loại tiếp thành các phân lớp phụ (ví dụ ở ngƣời IgG1, IgG2,

IgG3, IgG4, IgA1, IgA2). Bên cạnh chuỗi nặng, sự khác biệt trong trình tự amino acid

vùng hằng định của chuỗi nhẹ cũng đƣợc phân loại thành 2 phân lớp là kappa và

lamda.

Loại globulin miễn dịch của kháng thể có trong dịch nuôi cấy tế bào lai

A6G11C9 đƣợc xác định bằng Pierce® Rapid ELISA mouse mAb isotyping kit

(Thermo). Cƣờng độ màu của phản ứng Elisa đƣợc đo bằng máy đo quang phổ ở bƣớc

sóng 450 nm có 2 giá trị OD>0,2 ở giếng hàng F và G tƣơng ứng với chuỗi nặng IgM

và chuỗi nhẹ kappa. Nhƣ vậy, kháng thể do dòng tế A6G11C9 sản xuất có phân lớp

chuỗi nặng là IgM và phân lớp chuỗi nhẹ là kappa tƣơng tự nhƣ dòng tế bào A907 sản

xuất kháng thể kháng A trong báo cáo của Fouad Sadiq năm 2005 cũng có phân lớp

chuỗi nặng là IgM [28].

Hình 3.10. Phản ứng ELISA xác định isotye kháng thể

Bảng 3.1. Giá trị OD của phản ứng ELISA ở bƣớc sóng 450 nm

A 0.045

B 0.043

C 0.041

D 0.046

E 0.042

F 0.873

G 0.332

H 0.046

Phản ứng ELISA này không chỉ xác định isotype kháng thể mà còn là một

phƣơng pháp để kiểm chứng xem dòng tế bào lai đã đơn dòng hay chƣa. Cơ chế kiểm

soát sự tái sắp xếp gen globulin miễn dịch để chắc chắn rằng một tế bào đơn không thể Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

sản xuất hai chuỗi nhẹ, cơ chế kiểm soát gen chuỗi nặng và cắt ARN cho phép một

dòng tế bào đơn có thể sản xuất nhiều chuỗi nặng. Tuy nhiên, đối với tế bào lai hầu

nhƣ chỉ tiết một chuỗi nặng và một chuỗi nhẹ. Việc một dòng tế bào lai sản xuất 2

chuỗi nhẹ và nhiều chuỗi nặng nếu có xảy ra sẽ rất hiếm và việc phát hiện nhiều chuỗi

nặng có thể dòng tế bào lai mong muốn có lẫn với các dòng tế bào lai khác. Theo kết

quả thu đƣợc, dòng tế bào lai A6G11C9 chỉ sản xuất một chuỗi nặng và một chuỗi nhẹ

nhƣ vậy dòng tế bào A6G11C9 chắc chắn là đơn dòng và chỉ sản xuất kháng thể đơn

dòng đặc hiệu kháng nguyên A.

3.6. Sự sinh trƣởng và sản xuất kháng thể của dòng tế bào lai A6G11C9 tiết

kháng thể kháng kháng nguyên A

Mỗi một dòng tế bào lai có tốc độ sinh trƣởng và khả năng sản xuất kháng thể

khác nhau. Do vậy, dòng tế bào lai A6G11C9 cũng đƣợc nuôi cấy để đánh giá khả

năng sinh trƣởng và sản xuất kháng thể. Sự sinh trƣởng của dòng tế bào lai A6G11C9

trong nuôi cấy theo mẻ đƣợc thực hiện trên đĩa 24 giếng. Tế bào đƣợc nuôi cấy với mật độ ban đầu 105 tế bào/ml sử dụng môi trƣờng DMEM với hai nồng độ huyết thanh FBS khác nhau (10% và 1%) ở 37oC, 5% CO2. Cứ sau 24 giờ tế bào đƣợc thu để xác định mật độ tế bào sống và dịch nuôi cấy đƣợc thu hàng ngày sau đó bảo quản ở -20oC

cho các phân tích sau này. Hình 3.11 biểu thị đƣờng cong sinh trƣởng của tế bào lai

A6G11C9 trong nuôi cấy tĩnh sử dụng môi trƣờng có 10% FBS. Khi nuôi cấy tế bào A6G11C9 với mật độ ban đầu 105 tế bào/ml trong môi trƣờng có 10% huyết thanh thì

không quan sát đƣợc pha tiềm phát và pha cân bằng trong trong đƣờng cong sinh trƣởng của nó. Mật độ tế bào tối đa là 11.105 tế bào/ml đạt đƣợc sau khoảng 50 giờ

nuôi cấy sau đó số lƣợng tế bào giảm dần và hầu nhƣ tế bào chết sau khoảng 200-240 giờ nuôi cấy. Tốc độ sinh trƣởng của tế bào đạt 0,031h-1. Nhƣ vậy, sự sinh trƣởng của

dòng tế bào lai A6G11C9 trong nuôi cấy tĩnh tƣơng tự nhƣ sự sinh trƣởng của hầu hết

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

các dòng tế bào khác.

Hình 3.11. Đƣờng cong sinh trƣởng của dòng tế bào lai A6G11C9 trong môi trƣờng

DMEM + 10% FBS

Dòng tế bào lai A6G11C9 cũng đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng DMEM + 1%

FBS để nghiên cứu khả năng thích ứng của dòng tế bào này với môi trƣờng có nồng độ

huyết thanh thấp. Kết quả cho thấy, tế bào vẫn tăng sinh trong môi trƣờng có nồng độ

huyết thanh thấp tuy nhiên thời gian của pha tiềm phát kéo dài hơn khi nuôi cấy trong

môi trƣờng có 10% huyết thanh và cũng không quan sát đƣợc pha cân bằng trong

đƣờng cong sinh trƣởng của dòng tế bào này khi nuôi cấy ở môi trƣờng có 1% huyết thanh. Mật độ tế bào tối đa đạt đƣợc là 2.105 tế bào/ml sau khoảng 70 giờ nuôi cấy với tốc độ sinh trƣởng 0,006 h-1 và hầu hết tế bào chết sau khoảng 150 giờ nuôi cấy (hình

3.12). Sự sinh trƣởng của tế bào khi sử dụng môi trƣờng có nồng độ huyết thanh khác

nhau là khác nhau. Bởi vì, huyết thanh là nguồn cung cấp các yếu tố sinh trƣởng có tác

động khác nhau đến sự biệt hóa của các dòng tế bào khác nhau. Tế bào sinh trƣởng

trong môi trƣờng có nồng độ huyết thanh thấp phát triển chậm và kém hơn khi sinh

trƣởng trong môi trƣờng có nồng độ huyết thanh cao. Điều này chứng tỏ huyết thanh

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

đóng vai trò quan trọng đối với sự tăng sinh của dòng tế bào lai A6G11C9.

Hình 3.12. Đƣờng cong sinh trƣởng của dòng tế bào lai A6G11C9 khi nuôi cấy trong

môi trƣờng có nồng độ huyết thanh thấp DMEM + 1%FBS

Dịch nuôi cấy tế bào lai A6G11C9 đƣợc thu hàng ngày sau đó xác định hiệu giá

kháng thể để đánh giá khả năng sản xuất kháng thể của dòng tế bào này. Sự hình thành

kháng thể của dòng tế bào lai A6G11C9 tăng trong suốt pha lũy thừa của quá trình

nuôi cấy, hiệu giá kháng thể đạt cực đại sau khoảng 100 giờ nuôi cấy và không thay

đổi cho đến khi các tế bào chết hoàn toàn. Dữ liệu này quan sát đƣợc khi nuôi cấy

dòng tế bào A6G11C9 trong cả môi trƣờng DMEM + 10% FBS và trong môi trƣờng

có nồng độ huyết thanh thấp DMEM + 1% FBS. Khi nuôi cấy trong môi trƣờng DMEM + 10% FBS hiệu giá đạt cực đại là 29 còn trong môi trƣờng DMEM + 1% FBS là 27 (hình 3.13, hình 3.14). Trong khoảng thời gian sau 50-100 giờ nuôi thì hàm lƣợng

kháng thể tăng mạnh, đạt cực đại sau khoảng 100 giờ và duy trì không thay đổi. Điều

này cho thấy sau khi tế bào đạt đến mật độ tối đa thì tế bào bắt đầu chết, sau khoảng

100 giờ nuôi cấy thì số lƣợng tế bào giảm mạnh chứng tỏ kháng thể đƣợc giải phóng ra

hoàn toàn khi tế bào bị phân giải. Mặt khác, hàm lƣợng kháng thể hình thành khi nuôi

tế bào trong hai môi trƣờng có nồng độ huyết thanh khác nhau là khác nhau. Điều này

có thể đƣợc lý giải nhƣ sau: mật độ tế bào tối đa trong môi trƣờng có nồng độ huyết

thanh cao hơn so với môi trƣờng có nồng độ huyết thanh thấp do đó hàm lƣợng kháng

thể hình thành cũng sẽ cao hơn. Nhƣ vậy, hàm lƣợng kháng thể đƣợc sản xuất bởi tế

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

bào A6G11C9 có liên quan đến số lƣợng tế bào sống.

Hình 3.13. Đồ thị biểu thị sự hình thành kháng thể của dòng tế bào A6G11C9 khi nuôi

cấy trong môi trƣờng DMEM + 10% FBS

Hình 3.14. Đồ thị biểu thị sự hình thành kháng thể của dòng tế bào A6G11C9 khi nuôi

cấy trong môi trƣờng DMEM + 1% FBS

Nhƣ vậy, khi tiến hành nghiên cứu nuôi cấy dòng tế bào lai A6G11C9 nhận

thấy tế bào sinh trƣởng và sản xuất kháng thể tốt khi nuôi cấy tế bào trong môi trƣờng có 10% huyết thanh với mật độ tế bào ban đầu 105 tế bào/ml. Mật độ tế bào đạt cực đại là 11x106 tế bào/ml sau khoảng 50 giờ nuôi cấy và hiệu giá kháng thể đạt cực đại là 29

sau khoảng 100 giờ nuôi cấy đối. Do đó, khi nuôi cấy tế bào sẽ tiến hành cấy chuyển tế

bào sau khoảng 40-50 giờ nuôi cấy với tỷ lệ cấy truyền là 1/10 để mật độ nuôi cấy ban đầu đạt 105 tế bào/ml và nếu nuôi tế bào để thu đƣợc lƣợng kháng thể nhiều nhất thì sẽ

tiến hành thu dịch nuôi cấy sau khoảng 100 giờ nuôi cấy.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

3.7. Hiệu giá kháng thể trong dịch nuôi cấy tế bào lai A6G11C9

Dòng tế bào lai A6G11C9 khi nuôi cấy in – vitro sẽ tiết kháng thể đơn dòng

kháng kháng nguyên A ra môi trƣờng nuôi cấy. Tùy thuộc vào từng loại và từng dòng

tế bào lai mà hàm lƣợng kháng thể tiết ra môi trƣờng nuôi cấy có thể ít hoặc nhiều.

Hiệu giá kháng thể đƣợc sử dụng để đánh giá tƣơng đối hàm lƣợng kháng thể. Hiệu

giá càng cao thì hàm lƣợng kháng thể càng nhiều. Hiệu giá kháng thể là độ pha loãng

kháng thể lớn nhất mà tại đó phản ứng ngƣng kết hồng cầu vẫn còn xảy ra. Dòng tế

bào lai A6G11C9 đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng DMEM + 10%FBS, sau 5 ngày thu

dịch nuôi cấy để xác định hiệu giá. Độ pha loãng lớn nhất của kháng thể do dòng tế

bào lai A6G11C9 sản xuất mà tại đó sự ngƣng kết vẫn xảy là 1/512. Hiệu giá kháng thể kháng kháng nguyên A do dòng tế bào lai A6G11C9 sản xuất là 512 (29) cao hơn

so với kháng thể kháng A của dòng A907 trong báo cáo của Fouad Sadiq năm 2005 là 256 (28) và thấp hơn so với huyết thanh mẫu của hãng Biorad là 1024 (210) [28]. Nhƣ

vậy, hiệu giá kháng thể trong dịch nuôi cấy do dòng tế bào A6G11C9 sản xuất là

tƣơng đối cao tức là hàm lƣợng kháng thể trong dịch nuôi cấy tƣơng đối nhiều do đó

khả năng sản xuất kháng thể của dòng tế bào lai A6G11C9 là khá tốt.

Hình 3.15. Xác định hiệu giá kháng thể bằng phƣơng pháp ngƣng kết hồng cầu

3.8. Độ nhạy và độ đặc hiệu của kháng thể do dòng tế bào lai A6G11C9 sản xuất

Độ đặc hiệu đề cập đến khả năng một vị trí liên kết kháng nguyên của kháng

thể chỉ phản ứng với một loại kháng nguyên. Nếu dòng tế bào lai A6G11C9 sản xuất

kháng thể chỉ đặc hiệu với kháng nguyên A trên màng hồng cầu thì khi làm phản ứng ngƣng kết với panel hồng cầu nhóm máu hệ ABO (nhóm máu A+, nhóm máu B+, nhóm máu O+) sự ngƣng kết sẽ quan sát đƣợc ở phản ứng giữa dịch nuôi cấy với hồng cầu A+ mà không quan sát đƣợc ở phản ứng giữa dịch nuôi cấy tế bào với hồng cầu B+ và phản ứng giữa dịch nuôi cấy với hồng cầu O+. Khi tiến hành xác định độ đặc hiệu

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

của kháng thể do dòng tế bào A6G11C9 sản xuất thì kháng thể này chỉ ngƣng kết với

hồng cầu mẫu A+ mà không ngƣng kết với hồng cầu mẫu B+ và O+ nhƣ vậy kháng thể

kháng nguyên A do dòng tế bào lai A6G11C9 chỉ đặc hiệu cho kháng nguyên A.

Hình 3.16. Phản ứng ngƣng kết hồng cầu trên đĩa 96 giếng đáy chữ V xác định độ đặc

hiệu của kháng thể

Độ nhạy của kháng thể đƣợc đánh giá thông qua ái tính của kháng thể và cƣờng

độ của phản ứng kháng nguyên – kháng thể. Ái tính là tổng độ mạnh của nhiều quyết

định kháng nguyên với kháng thể đa hóa trị và đƣợc đánh giá bằng thời gian cần thiết

để có thể quan sát bằng mắt thƣờng dấu hiệu đầu tiên của phản ứng ngƣng kết hồng

cầu. Ái tính của kháng thể có trong dịch nuôi cấy tế bào lai A6G11C9 đƣợc xác định bằng phản ứng ngƣng kết giữa dịch nuôi cấy tế bào lai A6G11C9 và hồng cầu mẫu A+

10% và mất khoảng 2 giây để có thể nhận biết đƣợc dấu hiệu đầu tiên của phản ứng

ngƣng kết trong khi đó huyết thanh mẫu A của Biorad mất khoảng 1 giây. Cƣờng độ

đánh giá độ mạnh của phản ứng ngƣng kết giữa kháng nguyên – kháng thể và đƣợc

xác định bằng phản ứng ngƣng kết giữa dịch nuôi cấy tế bào lai A6G11C9 và hồng cầu

mẫu A 10% trên tấm thủy tinh, kết quả đƣợc đánh giá sau 5 phút bằng sự tạo cụm

ngƣng kết: 4+) một hạt và dịch trong, (3+) vài hạt và dịch trong, (2+) vài hạt nhỏ và

dịch đục, (+1) nhiều hạt nhỏ và dịch đục, (-) không ngƣng kết. Cƣờng độ của phản ứng

ngƣng kết giữa dịch nuôi cấy tế bào lai A6G11C9 và hồng cầu mẫu A 10% là 3+ vì có

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

vài cụm ngƣng kết và dịch trong còn cƣờng độ của phản ứng ngƣng kết giữa huyết

thanh mẫu A của Biorad và hồng cầu mẫu A 10% là 4+. Thông qua đánh giá về ái tính

kháng thể và cƣờng độ của phản ứng ngƣng kết hồng cầu nhận thấy kháng thể có trong

dịch nuôi cấy dòng tế bào lai A6G11C9 có độ nhạy khá cao.

Hình 3.17. Phản ứng ngƣng kết hồng cầu trên phiến kính xác định ái tính kháng thể và

cƣờng độ của phản ứng ngƣng kết

3.9. Loại bỏ phenol đỏ ra khỏi dịch nuôi cấy tế bào lai A6G11C9 bằng phƣơng

pháp tủa ammonium sulfate

Dịch nuôi cấy tế bào lai A6G11C9 có chứa kháng thể kháng kháng nguyên A

cùng với các protein và kháng thể có nguồn gốc từ huyết thanh bò (Fetal Bovine

Serum – FBS). Tuy nhiên, khi kiểm tra độ đặc hiệu của kháng thể có trong dịch nuôi cấy tế bào lai A6G11C9 với bộ hồng cầu mẫu A+, B+, O+ thì kháng thể trong dịch nuôi

cấy chỉ nhận diện đặc hiệu kháng nguyên A trên màng hồng cầu. Do vậy dịch nuôi cấy

chứa kháng thể kháng kháng nguyên A có lẫn tạp với các protein và huyết thanh của

bò không ảnh hƣởng đến độ đặc hiệu của kháng thể kháng nguyên A. Nhƣ vậy, có thể

sử dụng trực tiếp dịch nuôi cấy tế bào lai A6G11C9 để làm thuốc thử xác định nhóm

máu A. Tuy nhiên trong các bộ sinh phẩm xác định nhóm máu đã đƣợc thƣơng mại,

các kháng thể kháng A, kháng B và kháng AB đƣợc pha với các chất màu khác nhau

để có thể phân biệt và tránh nhầm lẫn xảy ra khi xác định nhóm máu. Đối với kháng

thể kháng A, sản phẩm thƣơng mại có màu xanh. Để tạo màu cho sản phẩm cần tiến

hành pha dịch nuôi cấy tế bào với chất màu. Tuy nhiên, trong môi trƣờng nuôi cấy tế

bào có sử dụng chất chỉ thị môi trƣờng là phenol đỏ do vậy để tạo màu xanh cho sản

phẩm trƣớc hết cần phải tiến hành loại bỏ phenol đỏ khỏi dịch nuôi cấy tế bào. Để loại

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

bỏ phenol đỏ thì phƣơng pháp đơn giản nhất là tủa bằng ammonium sulfate. Nhƣ vậy,

chúng tôi tinh sạch kháng thể bằng phƣơng pháp tủa với ammonium sulfate bão hòa

50% với mục đích loại bỏ phenol đỏ ra khỏi dịch nuôi cấy. Để thấy rõ khả năng loại bỏ

phenol bằng phƣơng pháp tủa ammonium sulfate, chúng tôi tiến hành nuôi cấy và thu

lƣợng nhỏ dịch nuôi cấy sau khi tế bào phát triển đến pha log. Thu dịch nuôi cấy lúc

này vì vẫn nhìn rõ màu phenol đỏ còn thu sau khi tế bào chết hoàn toàn thì lúc này môi

trƣờng đã chuyển vàng. Sau khi dịch nuôi cấy đƣợc tủa với ammonium sulfate, tiến

hành ly tâm để thu cặn có chứa kháng thể và loại bỏ dịch nổi có chứa phenol đỏ. Tủa

sau đó đƣợc rửa để loại bỏ hoàn toàn phenol đỏ và tái huyền phù vào đệm PBS 1X.

Không quan sát thấy sự hiện diện của phenol đỏ sau khi tái huyền phù tủa vào đệm.

Nhƣ vậy, chúng tôi đã loại bỏ thành công phenol đỏ ra khỏi kháng thể.

Hình 3.18. Dịch nuôi cấy trƣớc và sau khi tủa ammonium sulphate

Sau khi tinh sạch, kháng thể đƣợc làm phản ứng ngƣng kết trên phiến kính với hồng cầu mẫu A+ và B+ để đánh giá lại độ đặc hiệu của kháng thể có thay đổi sau khi

tủa muối hay không. Nhận thấy rằng, kháng thể trƣớc và sau khi tủa muối (cô đặc 5

lần hoặc hòa về bằng với thể tích ban đầu) đều chỉ nhận diện đặc hiệu kháng nguyên

A. Nhƣ vậy, độ đặc hiệu của kháng thể sau khi tủa muối không thay đổi nhƣng cƣờng

độ ngƣng kết thì thay đổi. Kháng thể đƣợc cô đặc 5 lần thì cƣờng độ ngƣng kết mạnh

hơn so với dịch nuôi cấy ban đầu còn kháng thể sau tủa đƣợc hòa về thể tích bằng với

thể tích ban đầu thì cƣờng độ ngƣng kết giảm đi. Điều này có thể là do hàm lƣợng

kháng thể bị thay đổi, trong quá trình tủa thì không phải toàn bộ kháng thể mong muốn

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

đều tủa mà nó thể bị mất một phần do vậy hàm lƣợng kháng thể giảm đi dẫn đến

cƣờng độ ngƣng kết giảm, còn khi cô đặc thì hàm lƣợng kháng thể tăng lên từ đó

cƣờng độ ngƣng kết có thể tăng theo.

Hình 3.19. Độ đặc hiệu của kháng thể trƣớc và sau khi tủa

Để xem xét có phải hàm lƣợng kháng thể bị giảm đi sau tủa hay không thì

chúng tôi tiến hành xác định hiệu giá của kháng thể trƣớc và sau khi tủa (cô đặc và hòa

về thể tích bằng thể tích ban đầu). Kết quả hiệu giá cho thấy, kháng thể sau khi tủa có

hàm lƣợng tƣơng đƣơng với với hàm lƣợng có trong dịch nuôi cấy ban đầu (hiệu giá 27), còn khi cô đặc (thể tích giảm 1/5 so với ban đầu) thì hàm lƣợng kháng thể tăng lên 4 lần đạt 29.

Hình 3.20. Hiệu giá kháng thể trƣớc và sau khi tủa ammonium sulfate

Mặc dù hàm lƣợng kháng thể trƣớc và sau khi tủa không thay đổi nhƣng cƣờng

độ ngƣng kết của kháng thể lại giảm đi. Điều này có thể là do một thành phần nào đó

trong dịch nuôi cấy tế bào có ảnh hƣởng đến cƣờng độ của phản ứng ngƣng kết hồng

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

cầu đã bị loại bỏ. Trong môi trƣờng nuôi cấy tế bào có bổ sung thêm huyết thanh bò

mà thành phần chính của huyết thanh là BSA, BSA lại có tác động làm tăng tƣơng tác

kháng nguyên kháng thể mà sau khi tủa thì hàm lƣợng BSA giảm đi do đó ảnh hƣởng

đến cƣờng độ ngƣng kết của phản ứng kháng nguyên – kháng thể [9].

3.10. Tạo sinh phẩm xác định nhóm máu A

Các thuốc thử thử anti-A đã đƣợc thƣơng mại có màu xanh do vậy chúng tôi

cần xác định đƣợc chất màu bổ sung vào trong sinh phẩm. Theo patent WO

2012083361, màu xanh trong thuốc thử anti-A thƣơng mại là patent blue V. Patent

blue V là chất màu axit với 2 nhóm sulphonic, phân ly trong nƣớc và tích điện âm do

vậy nó có thể hòa tan nhanh vào nƣớc [3]. Để tạo đƣợc màu tƣơng ứng nhƣ các sản

phẩm thƣơng mại chúng tôi tiến hành xác định hàm lƣợng chất màu bổ sung vào trong

sinh phẩm. Hàm lƣợng của patent blue V bổ sung vào sinh phẩm là 0,000035 g/ml.

Thuốc thử nhóm máu đƣợc sử dụng trong điều kiện bình thƣờng không vô trùng

mà kháng thể có bản chất là protein dễ bị phân cắt bởi các protease. Trong không khí

có rất nhiều vi khuẩn, để tránh nhiễm khuẩn vào mẫu kháng thể dẫn đến sự sản xuất

protease làm kháng thể bị phân cắt và mất hoạt tính thì chúng tôi tiến hành bổ sung

chất bảo quản là sodium azide với hàm lƣợng là 0,01% để ngăn cản sự tạp nhiễm vi

sinh vật vào trong sinh phẩm. Phản ứng ngƣng kết hồng cầu xảy ra hiệu quả trong môi

trƣờng muối có nồng độ ion thấp, thông thƣờng là sử dụng saline do vậy sử dụng đệm

phosphate (PBS) để làm đệm pha kháng thể sau tinh sạch. Kháng thể của chúng tôi

đƣợc sử dụng để xác định nhóm máu do đó chúng tôi bổ sung thêm thành phần chống

đông cho máu là EDTA với nồng độ cuối cùng là 10 mM EDTA. Nhƣ vậy chúng tôi

đã xác định đƣợc các thành phần bổ sung vào trong sinh phẩm của chúng tôi: chất màu

(Paten blue V sodium salt), chất chống vi sinh vật (sodium azide), môi trƣờng vật lý

cho phản ứng ngƣng kết hồng cầu (đệm PBS 1X) và chất chống đông (EDTA).

Dịch nuôi cấy tế bào lai A6G11C9 đƣợc tinh sạch bằng phƣơng pháp tủa với

ammonium sulfate để loại bỏ phenol đỏ. Sau khi tủa, tủa kháng thể đƣợc rửa 2 lần với

ammonium sulfate bão hòa 50%. Tủa sau khi rửa sẽ đƣợc huyền phù lại với đệm pha

sinh phẩm với thể tích bằng 1/5 thể tích ban đầu. Thành phần đệm pha sinh phẩm A

(0,0035% Patent blue V sodium salt + 0,01% sodium azide + 10mM EDTA trong

PBS 1X, pH=7,8). Sau khi tạo sinh phẩm chúng tôi làm phản ứng ngƣng kết hồng cầu Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

trên phiến kính để đánh giá độ đặc hiệu, cƣờng độ ngƣng kết và ái tính của sinh phẩm.

Kết quả cho thấy sinh phẩm xác định nhóm máu A mà chúng tôi tạo ra đảm bảo các

yêu cầu đối với thuốc thử xác định nhóm máu A thƣơng mại: sinh phẩm có màu xanh,

sinh phẩm chỉ đặc hiệu kháng nguyên A với cƣờng độ (4+) ≥3+, ái tính (2 giây) ≤10

giây, hiệu giá (512) ≥128 [18].

Hình 3.21. Sinh phẩm A và phản ứng ngƣng kết hồng cầu của sinh phẩm với panel

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

hồng cầu hệ ABO

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Kết luận

- Chúng tôi đã thành công trong việc xây dựng phƣơng pháp để tạo tế bào lai sản xuất

kháng thể kháng kháng nguyên A: thu nhận đƣợc 6 hỗn hợp tế bào lai và 12 dòng tế

bào lai đơn sản xuất kháng thể kháng kháng nguyên A, chọn đƣợc dòng A6G11C9 là

dòng sản xuất kháng thể tốt nhất.

- Đánh giá đƣợc một vài tính chất của kháng thể do dòng tế bào lai A6G11C9 sản

xuất: kháng thể có phân lớp chuỗi nặng IgM, chuỗi nhẹ kappa, kháng thể chỉ đặc hiệu kháng nguyên A với cƣờng độ ngƣng kết 3+ và ái tính 2s, hiệu giá kháng thể đạt 29.

- Đã tạo đƣợc sinh phẩm A xác định nhóm máu.

Kiến nghị

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

- Tiếp tục hoàn thiện quy trình sản xuất kháng thể ở quy mô phòng thí nghiệm.

DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng anh

1. Abhyankar A.V. (2012), “Indigenously developed monoclonal antibody specific for

human blood group B”. Journal of Hematological Malignancies, (2), pp.24-18.

2. ATTC (2011), Animal Cell Culture Basic: Tips and techniques for continuous cell

line.

3. Ballerini D.R., Li X., Shen W. (2012), Method and system for detection of blood

types, Patent number WO 2012083361 A1.

4. Costabile M. (2010), “Determining the reactivity and titer of serum using a

haemagglutination assay”, Journal of Visualized Experiments, (35), pp.1752.

5. Dean L. (2005), “Chapter 1. Blood and the cells it contains”, Blood groups and red

cell antigens, National Center for Biotechnology Information, Bethesda (MD).

6. Dean L. (2005), “Chapter 2. Blood group antigen are surface marker on the red

blood cell membrane”, Blood groups and red cell antigens, National Center for

Biotechnology Information, Bethesda (MD).

7. Dean L. (2005), “Chapter 3. Blood transfusionand the immune system”, Blood

groups and red cell antigens, National Center for Biotechnology Information,

Bethesda (MD).

8. Edward A.G. (2014), Antibodies: A laboratory manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.

9. Fitzsimmons J.M. and Morel P.A. (2003), “The effects of red blood cell suspending media on hemagglutination and the antiglobulin test”, Transfution, (19), pp.85-81.

10. Fulle A., Takahashi M. and Hurrell J.G.R. (1992), “Immunization of Mice”, Current Protocols in Molecular Biology.

11. Grodzki A.C. and Berenstein E., (2010), “Antibody Purification: Ammonium sulfate fractionation or gel filtration”, Springer.

12. Hayter P.M. (1989), An Investigation into factors that affect monoclonal antibody

production by hybridomas in culture, Department of microbiology university of Surrey

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Guildford Surrey.

13. Institutional Animal Care and Use Committee (2012), Footpad Injections Guidelines in Mice and Rats, the University of North Carolina at Chapel Hill.

14. Iyer Y.S., Vasantha K., Manisha P., Jadhav S., Gupte S.C. and Mohanty D. (2006),

“Production of murine monoclonal anti-B”, Indian Journal Medicin Research, (123),

pp. 561-564.

15. John B. Z. (2009), Essential Clinical Immunology, Cambridge University Press,

United Kingdom.

16. Kamala T. (2007), “Hock immunization: A humane alternative to mouse footpad injections”, Journal Immunol Methods.

17. Kanrko M., Kato Y., Horiuchi H. and Osawa M. (2003), “Molecular

characterization of a human monoclonal antibody to B antigen in ABO blood type”,

Immunology Letters, (86), pp.51-45.

18. Kathy D .B. and Paula R.H (2013), Basic & Applied Concepts of Blood Banking

and transfusion practices.

19. Khan F., Khan RH., Sherwani A., Mohmood S., Azfer MA., (2002). “Lectins as markers for blood grouping”, Medical Science Monitor, (8), pp. 300-293.

20. Kumagai I. and Tsumoto K., (2001), “Antigen–Antibody Binding”, Encyclopedia

of life science.

21. Lee GM, Huard TK and Palsson BO (1989), “Effect of serum concentration on

hybridoma cell growth and monoclonal antibody production at various initial cell

densities”, Hybridoma, (8), pp.75-369.

22. Levy M., Edelman L. and Dighiero G (2001), “Molecular characterization of a

monoclonal murine anti-blood group A antibody”, Immunology Letters, (76), pp.23-

15.

23. National Research Council (1999), Monoclonal Antibody Production, National

Academy Press, Washington.

24. Ozzturk S. S. and Palsson O. B. (1990), “Effect of initial cell density on hybridoma

growth, metabolism, and monoclonal antibody production”, Journal Biotechnology,

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

(16), pp. 278-259.

25. Pandey S. (2013), “Hybridoma technology for production of monoclonal

antibodies”, International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research,

(1), pp. 94 – 88.

26. Parham P (2009). The Immune System, third edition, Garland Science, London and

NewYork.

27. Peter J.D. and Ivan M.R. (2000), “The Immune System”, The New England

Journal of Medicine, (343), pp.49-37.

28. Sadiq F., Tissent A. , Habti N., Radallah D., Amrani N. E., Benchemsi N. (2005),

“Production of a new anti-A monoclonal reagent”, African Journal of Bioteachnology,

(4), pp. 846-844.

29. Shimizu S. (2004), “Routes of Administration”, The Laboratory Mouse, National Institute of Animal Health, Tsukuba, Japan.

30. Wang S. (2011), “Advances in the production of human monoclonal antibodies”,

Antibody Technology Journal, 1, pp. 4-1.

Tài liệu tiếng việt

31. Đỗ Thị Thảo, Đỗ Thị Phƣơng, Đỗ Khắc Hiếu, Hà Thị Thu, Đinh Thƣơng Vân,

Đinh Duy Kháng, Lê Trần Bình (2008), “Tạo dòng tế bào lai sản xuất kháng thể đơn

dòng kháng protein vỏ VP28 của virus gây bệnh đốm trắng trên tôm sú”, Tạp chí Công

nghệ Sinh học, (2), Tr. 203–208.

32. Nguyễn Hải Đăng (2008), Nghiên cứu tạo dòng tế bào lai sản xuất kháng thể đơn

dòng kháng progesterone, Luận văn thạc sỹ, Trƣờng Đại học Nông nghiệp Hà Nội, Hà

Nội.

33. Pham Văn Ty và Nguyễn Lân Dũng (2004), “Miễn dịch học”, Nhà xuất bản đại

học quốc gia, Hà Nội.

Tài liệu Web

34. Bioatla (2015), Antibody Isotypes, http://bioatla.com/educational-

appendix/antibody-isotypes, ngày 7/12/2015.

35. Bộ y tế (2013), Thông tƣ hƣớng dẫn hoạt động truyền máu,

http://thuvienphapluat.vn/van-ban/The-thao-Y-te/Thong-tu-26-2013-TT-BYT-nam-

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

2013-huong-dan-hoat-dong-truyen-mau-214176.aspx, ngày 12/7/2015.

36. Immunology Module (2015), The innate and adaptive immune systems,

http://missinglink.ucsf.edu, ngày 12/7/2015.

37. International Society of Blood Transfusion (2014), Table of blood group systems

v4.0, http://www.isbtweb.org, ngày 12/7/2015.

38. Jerry R. B (2015), Blood transfusion, http://www.medicinenet.com, ngày 7/12/2015.

39. Wikipedia (2015), Blood transfusion, https://en.wikipedia.org, ngày 7/12/2015.

40. http://medical-dictionary.thefreedictionary.com/phagocytosis, ngày 7/12/2015.

41. http://www.novimmune.com/science/antibodies.html, ngày 7/12/2015.

42. http://www.buzzle.com/articles/blood-types-chart.html, ngày 7/12/2015.

43. http://www.nature.com/nbt/journal/v25/n12/fig_tab/nbt1363_F1.html, ngày 7/12/2015.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

44. http://www.whatisthebiotechnology.com/blog/hybridoma-technology/, ngày 7/12/2015.

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Tạo dòng tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên A (nhóm máu A) trên màng tế bào hồng cầu người

TẠO DÒNG TẾ BÀO LAI SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ĐƠN

DÒNG KHÁNG KHÁNG NGUYÊN A (NHÓM MÁU A)

TRÊN MÀNG TẾ BÀO HỒNG CẦU NGƢỜI

Hồng cầu mẫu 1%

A B O A B O A B O

Hồng cầu mẫu 1%

A B O A B O A B O A B O

A4D11A9

A4D11F2

A6G11B8

A6G11B10

A6G11C9

2 9

A6G11C6

A6G11D5

A6G11D7

A6G11E7

A7B4C11

A7D4G10

A7D4H8

Có thể bạn quan tâm

Báo cáo ca lâm sàng: Ghép thận không tương đồng nhóm máu trên bệnh nhân mắc hội chứng tan máu tăng ure huyết không điển hình (aHUS) được điều trị bằng kháng thể đơn dòng eculizumab

Định tính βHCG

Định lượng IgE đặc hiệu cá hồi trong máu

Định lượng IgE đặc hiệu lúa mì trong máu

Định lượng IgE đặc hiệu Penicilloyl V trong máu

Định lượng IgE đặc hiệu vanilla trong máu

Định lượng IgE đặc hiệu xoài trong máu

Đề thi kết thúc học phần học kì 1 môn Hóa sinh lâm sàng 1 năm 2021-2022 có đáp án

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu kỹ thuật trồng cải bó xôi (Spinacia spp.) trên hệ thống khí canh áp suất cao

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu quy trình vi nhân giống cây xạ đen (Ehretia asperula) in vitro

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Bacillus sp. từ đất vùng rễ xoài có khả năng ức chế nấm Colletotrichum sp. gây bệnh thán thư trên xoài

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng tăng sinh của tế bào 3T3 trong điều kiện vi trọng lực mô phỏng

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu nhân giống in vitro cây tiêu thảo lá nhăn (Cryptocoryne wendtii) bằng hệ thống bioreactor

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu khả năng sử dụng mẫu lưu giữ trên thẻ tách huyết tương trong xét nghiệm theo dõi điều trị cho bệnh nhân nhiễm HIV

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Đánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn Ỉ nhân bản

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu hoạt tính chống suy giảm trí nhớ và cơ chế tác dụng của dịch chiết hoa Thiên lý (Telosma cordata) trên mô hình tế bào thần kinh

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu biểu hiện và đánh giá hoạt tính sinh miễn dịch của protein P72 tái tổ hợp của virus gây bệnh dịch tả lợn Châu Phi (African swine fever) trên Nicotiana benthamiana

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuẩn tía quang hợp bản địa ứng dụng làm probiotic trong nuôi tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu hệ gen ty thể người Việt Nam thuộc ba dân tộc Cống, Hoa và Sán Dìu

Tài liêu mới

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng thuật toán thích nghi và học tăng cường cấu trúc Actor - Critic điều khiển bám quỹ đạo cho robot di động đa hướng mecanum

Luận án Tiến sĩ: Cơ cấu bệnh tim mạch và chất lượng cuộc sống của người cao tuổi mắc suy tim, rung nhĩ điều trị tại Bệnh viện Thống Nhất, thành phố Hồ Chí Minh

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hiện tượng nứt dăm đê sông vùng đồng bằng sông Hồng và dự báo khả năng bị nứt của một số đoạn đê

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng giải pháp đảm bảo an toàn thông tin cho quá trình học liên kết dựa trên mật mã

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Phát triển năng lực đánh giá công nghệ cho học sinh trong dạy học môn Công nghệ 11 ở trường trung học phổ thông

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu phân loại chi cầu diệp – Bulbophyllum Thouars (Orchidaceae) ở vùng Tây Nguyên bằng phương pháp hình thái và phân tử

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu đặc điểm phân bố và dinh dưỡng của các loài lưỡng cư ở Vườn Quốc gia Bến En và Khu bảo tồn thiên nhiên Pù Luông, tỉnh Thanh Hóa

Luận án Tiến sĩ: Tổng hợp luật dẫn và điều khiển cho một lớp tên lửa đối hải trên cơ sở ứng dụng mạng nơ ron và hệ mờ

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu tổng hợp hệ điều khiển góc Pitch tua bin gió trong điều kiện có nhiễu tác động

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hóa học lipid của hai loài san hô thủy tức Millepora dichotoma và Millepora platyphylla ở Việt Nam

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu kiểm soát phân phối công suất kéo trên cầu chủ động của ô tô con bằng ABS

Luận án Tiến sĩ: Ứng dụng phản ứng Domino vào tổng hợp các dẫn xuất Podophyllotoxin, Pyrimidine và đánh giá hoạt tính sinh học của các chất tổng hợp được

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và một số hoạt tính sinh học của cây chùm ngây (Moringa oleifera)

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và ứng dụng ức chế ăn mòn cho thép của cao chiết xuất từ cây Lộc vừng thuộc họ Lecythidaceae

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hiện tượng nứt dăm đê sông vùng đồng bằng sông Hồng và dự báo khả năng bị nứt của một số đoạn đê

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính

Nội dung tóm tắt

Giới thiệu

Về chúng tôi

Việc làm

Quảng cáo

Liên hệ

Chính sách

Thoả thuận sử dụng

Chính sách bảo mật

Chính sách hoàn tiền

DMCA

Hỗ trợ

Hướng dẫn sử dụng

Đăng ký tài khoản VIP

093 303 0098

support@tailieu.vn

Phương thức thanh toán

Theo dõi chúng tôi

Facebook