Đề tài: Nghiên cứu begomovirus trên ớt và cà chua ở khu vực Miền Trung và Miền Nam Việt Nam

Ờ Ả Ơ L I C M  N

ỗ ự ủ ự ậ ả ậ ố Trong su t quá trình làm th c t p ngoài n  l c c a b n thân tôi đã nh n đ ượ ấ   c r t

ề ự ỡ ậ ừ ổ ứ nhi u s  giúp đ  t n tình t các cá nhân và t ch c.

ướ ỏ ự ế ơ ắ ớ ế ườ ộ Tr c tiên, tôi xin bày t s  bi t  n sâu s c t i TS. Hà Vi t C ng – Giám đ c trung tâm

ứ ệ ệ ớ ườ ạ ọ ệ ộ nghiên c u B nh cây nhi t đ i – tr ọ   ng Đ i h c Nông nghi p Hà N i, Phó khoa Nông h c

ự ế ướ ắ ậ ỉ ả ề ệ ể ạ ẫ ẫ ọ đã tr c ti p h ng d n, d n d t, t n tình ch  b o và t o m i đi u ki n đ  tôi hoàn thành

báo cáo này.

ử ờ ả ơ ấ ế ộ ộ Tôi xin g i l i c m  n chân thành nh t đ n cán b , công nhân viên thu c Trung tâm

ệ ệ ớ ườ ạ ọ ệ ộ ộ ệ ỡ B nh cây nhi t đ i ­ Tr ng Đ i h c N ng nghi p Hà N i đã nhi ạ   t tình giúp đ  và t o

ự ậ ạ ề ệ ệ ố đi u ki n cho tôi làm vi c trong su t quá trình th c t p t i Trung tâm.

ồ ờ ỏ ự ế ơ ớ ầ ộ Đ ng th i tôi cũng xin bày t s  bi t  n chân thành t i các Th y giáo, Cô giáo trong b  môn

ự ậ ư ệ ệ ầ ọ ọ Công ngh  sinh h c th c v t cũng nh  các th y cô trong khoa Công ngh  sinh h c, tr ườ   ng

ạ ọ ệ ộ ệ ỉ ả ạ ỗ ố ờ Đ i h c Nông nghi p Hà N i đã nhi ọ   t tình d y d , ch  b o tôi trong su t th i gian tôi h c

ậ ở ườ t p   tr ng.

ả ơ ớ ố ườ ạ ị Cu i cùng tôi xin c m  n t i gia đình, ng i thân các anh ch  em và b n bè đã giúp

ọ ậ ư ố ố ỡ ộ đ , đ ng viên tôi trong su t quá trình h c t p cũng nh  hoàn thành báo cáo t ệ t nghi p này.

1

ả ơ Tôi xin chân thành c m  n!

Ụ Ừ Ế Ắ DANH M C T  VI T T T

ừ ế ắ t t t

2

Ký hi uệ A. tumefaciens AS ATP Bb CP CTAB ddNTP DNA dNTP dsDNA E.coli EDTA ICTV IR Kb LB ORF PCR RCA RE Rep RNA Rnase SDS SsDNA TAE Taq Vir β ­ ME T  vi Agrobacterium tumefaciens Acetosyringone Adenosine triphosphate Base pair Capsid protein Cetryl Ammonium Bromide Dideoxynucleoside  triphosphate Deoxyribonucleic acid Deoxynucleoside triphosphate Double strand DNA Escherichia coli Ethylene diamine tetra acetic acid International Committee on Taxonomy of Viruses Itergenic region Kilo base Luria and Bertani Open reading frame Polymerase Chain Reaction Rolling circle amplification Restriction enzyme Replication protein Ribonucleic acid Ribonuclease Sodium Dodecyl Sulphate Singe strand DNA Tris – acetate – EDTA Thermus aquatic Virulence region Beta­ Mercaptoethanol

TÓM T TẮ

ứ ế ả ự ộ ộ Trong nghiên c u này chúng tôi ti n hành nhân dòng và gi i trình t toàn b  b  gen

ộ ượ ư ừ ượ ệ ở ệ ủ c a m tbipartite begomovirus , đ c cho là ch a t ng đ c phát hi n Vi ạ   t Nam gây h i

ượ ứ ễ ả ộ ộ trên cây t ớ đã đ c Nguy n Đ c Anh ậ phân l p năm ế 2013. K t qu  là ủ   toàn b  b  gen c a

ẫ ượ ế ủ m u begomovirus đã đ c nhân dòng thành công vào t bào E.coli ch ng XL1­Blue. Chúng

ả ự ượ ộ ộ ủ ẫ ớ ướ tôi cũng đã gi i trình t và thu đ c toàn b  b  gen c a  m u virus v i kích th ả   c kho ng

2.7 kb.

ứ ế ề ớ ở ề Chúng tôi ti n hành nghiên c u v  begomovirus trên t và cà chua mi n Trung và

ề ệ ệ ớ mi n Nam Vi t Nam, begomovirus m i gây b nh xoăn vàng lá trên ớ ở t hai vùng này. Nhân

ả ượ ộ ủ dòng thành công và gi i đ c b  gen DNA­A c a virus này, thông qua phân tích trình t ự ặ   , đ c

ư ử ả ệ ấ ớ ộ ạ ớ tr ng phân t và ph  h  cho th y đây là 1 loài m i thu c chi Begomovirus gây h i trên t và

3

ượ ặ đ c chúng tôi đ t tên là Chilli leaf curl virus (CLCV).

I.

1.

Ặ Ấ Ề Đ T V N Đ

ớ ệ Gi i thi u

ậ ớ ự ấ ả ọ H  ọ Geminiviridae  là h  virus th c v t l n nh t, có kho ng 200 loài( Fauquet và Stanley,

ấ ấ ọ ớ 2005).Trong đó begomovirus là chi l n nh t và quan tr ng nh t trong h ọ Geminiviridae c  vả ề

ệ ớ ồ ượ ặ ừ Bean ố ượ s  l ng loài và b nh do chúng gây ra v i cây tr ng. Begomovirus(đ c đ t tên t

ử ạ ầ ộ golden mosaic virus) có hình thái phân t ợ    d ng hình c u kép (hình chùy) và b  gen DNA s i

ơ ướ ả ề ồ vòng đ n, kích th c kho ng 2,7 kb ( ộ   Fauquet và Stanley, 2005), lan truy n trên đ ng ru ng

ề ữ ể ầ ọ ằ b ng b  ph n ( ấ Bemisia tabaci) theo ki u b n v ng tu n hoàn.

ể ơ ồ ộ ử ặ ồ ộ Begomovirus có th  có b  gen đ n (g m m t phân t ộ  DNA­A) ho c có b  gen kép (g m hai

ử Ở ộ ố ạ ỉ ầ ử ệ phân t DNA­A và DNA­B). m t s  lo i cây ch  c n phân t ứ    DNA­A đã gây tri u ch ng

ể ở ộ ố ạ ấ ầ ả ử ớ đi n hình, còn m t s  lo i c y khác thì c n có c  phân t DNA­A và DNA­B m i gây ra

ứ ệ ệ ạ ộ ử ữ ơ ướ ầ tri u ch ng b nh. G n đây, m t lo i phân t DNA vòng đ n n a, có kích th ả c kho ng 1

ườ ượ ệ ề ệ ấ ớ ộ ử n a   b   gen begomovirus  th ng   đ c   phát   hi n   th y   có   liên   quan   v i   nhi u   b nh   do

β β ượ ọ ụ ộ begomovirus  gây ra và đ c g i là các DNA­ . Các phân t ử DNA­  này ph  thu c vào

ể ượ ầ ử ệ begomovirus đ  nhân lên và do đó đ c xem là các ph n t v  tinh c a ủ begomovirus. Vai trò

β ứ ệ ệ ấ ố ộ ủ c a   phân   t ử DNA­ trong   hình   thành   tri u   ch ng   b nh   không   th ng   nh t,   m t   s ố

ặ ủ ớ ự ể ạ ứ ệ ệ ỉ begomovirus ch  có th  t o ra tri u ch ng b nh v i s  có m t c a phân t β ử DNA­  trong khi

ạ ừ ệ ệ ầ ở các loài khác l i không c n. Do đó vi c phòng tr  b nh xoăn vàng lá càng tr  nên khó khăn

h n.ơ

ề ệ ọ ồ ượ Nhi u b nh nghiêm tr ng trên cây tr ng đ ị c xác đ nh là do ư ệ   begomovirus gây ra nh  b nh

ộ ệ ượ ể ắ xoăn  vàng  lá  cà  chua  –  m t  b nh  đ ấ c   xem là   nguy hi m  nh t trên  cà  chua  kh p th ế

ự ộ ệ ớ ậ ừ gi iớ (Moriones và c ng s , 2007 ). Hi n nay, có t i 50 begomovirusphân l p t cà chua (có t ừ

ở ầ ượ ự ố ộ tomato đ u tên virus) đã đ c công b  trên th  gi ế ớ Fauquet và c ng s , 2008 i ( ). Trên cây

ứ ệ ể ạ ố ố ạ cà chua, các begomovirus t o tri u ch ng gi ng nhau, đi n hình là: cu n lá (cong l i hình

ặ ỏ ẹ ế ễ ớ thìa); mép lá (đ c bi ệ ở t lá non) bi n vàng; lá nh  h p; cây nhi m s m còi c c v i t ọ ớ ỷ ệ ậ    đ u  l

ả ấ ể ượ ấ ỉ ự ị qu  r t th p.  Danh tính  virus  ch  có th  đ c  xác  đ nh  d a  vào  các  phân  tích  phân t ử

(Moriones và Navas­Castillo, 2000).

ệ ượ ứ ạ ọ Vi t Nam đ c ch ng minh là trung tâm đa d ng quan tr ng c a ủ begomovirus(Ha,

4

ậ ố ượ ặ ự ậ ủ ị ệ ẫ 2007). M c dù v y s  l ng loài begomovirus xác đ nh trên th c v t c a Vi t Nam v n còn

ỉ ồ ượ ậ ừ ề ề ít ch  g m 19 loài đ c phân l p t nhi u loài cây, trong đó có nhi u cây d i( ạ Green và c ngộ

ệ ộ ề ệ ệ ạ ự s , 2001 ),(Ha, 2007).Theo đi u tra hi n nay, b nh do begomovirus gây h i trên di n r ng và

ư ớ ệ ệ ề ỉ không ch  gây b nh trên cà chua, chúng còn gây b nh trên nhi u loài cây khác nh ọ ậ   t, h  đ u

ủ ầ ế ề ứ ậ ỗ đ , đu đ , b u bí.... Chính vì v y chúng tôi ti n hành đ  tài: “ Nghiên c u begomovirus trên

2.

ớ ở ự ề ề ệ t và cà chua khu v c Mi n Trung và Mi n Nam Vi t Nam”

2.1.

ầ ủ ề ụ M c tiêu và yêu c u c a đ  tài

ụ M c tiêu

­ Gi

ả ự ẫ ớ ượ ậ i trình t m u virus m i đ c phân l p

ư ử ủ ớ ở ề ặ ­ Phân tích đ c tr ng phân t ẫ  c a các m u virus trên t và cà chua mi n Trung và

2.2.

ề ệ mi n Nam Vi t Nam.

Yêu c uầ

­ Nhân  dòng,   gi

ả ự ư ặ ử ẫ i  trình  t và   phân  tích  các   đ c   tr ng  phân  t m u  virus   đã   đ ượ   c

ứ ễ ậ ẵ Nguy n Đ c Anh phân l p trên ớ ở t Đà N ng năm 2013.

­ Đánh giá tính gây b nh thông qua lây nhi m nhân t o nh  vi khu n

ệ ễ ạ ờ ẩ A. tumefaciens

(Agroinoculation).

­ Chu n đoán begomovirus trên

ẩ ớ ẫ ớ t và cà chuav i các m u thu đ ượ ạ c t ề   ự i khu v c mi n

ề ệ ử ụ ệ ặ ồ Trung và mi n Nam Vi t Nam s  d ng c p m i chung phát hi n begomovirus là BegoA­

For1 và BegoA­Rev1.

­ Ch n l c các m u d

ọ ọ ẫ ươ ể ể ồ ặ ệ ớ ớ ượ ng v i BegoA đ  ki m tra v i các m i đ c hi u đã đ c xác

1/R2);   TB101   (F1/   R2);   VB65   (F1/R1);   TY   (F4/R4);To   (F4/R4);

ư ồ ị đ nh   nh   m i   ToLVHnV   (F

To100(F1/R1); TYKa­A (F1/R1), VNP93A (F1/R1), VNP93B (F1/R1)

­ Nhân dòng và gi

ả ự ẫ ớ ượ ướ i trình t các m u virus trên t và cà chua đã đ ọ c ch n, b ầ   c đ u

5

ị đ nh danh các virus.

II.

II.1.

Ổ Ệ T NG QUAN TÀI LI U

ứ ướ ữ Nh ng nghiên c u n c ngoài

II.1.1. T m quan tr ng c a

ủ ớ ọ ầ t và cà chua

ả ủ ạ ộ Ớ t  Ớ  là m t lo i qu  c a các cây thu c ộ  chi Capsicum c aủ  h  Càọ (Solanaceae). ồ   t có ngu n

ượ ế ớ ắ ồ ơ ượ ử ụ g c tố ừ châu Mỹ, ngày nay nó đ c tr ng kh p n i trên th  gi i và đ c s  d ng làm gia

ệ ướ ả ấ ớ ớ ế ớ ớ vị, rau, và thu cố . Hi n nay, n ĐẤ ộ là n c s n xu t ấ t l n nh t th  gi ệ   ả i v i kho ng 1 tri u

ỗ ỉ ệ ấ ớ ớ ơ ấ t n m i năm, n i ch  riêng Ch ợ Guntur (l n nh t châu Á) có 1 tri u bao t.

ố ừ ồ ỹ ượ ườ Cà chua (S.lycopersicum) có ngu n g c t Nam M , nó đ c ng i Tây Ban Nha lan

ề ớ ố ộ truy n t i Pilippine, Đông Nam Á và toàn b  Châu Á, cu i cùng là Châu Âu. Cà chua là loài

ườ ổ ế ấ ở ệ ấ ả ượ ả ấ trái cây v n ph  bi n nh t Hoa K . ỳ Kho ng 150 tri u t n cà chua đã đ c s n xu t ra

ế ớ ố ướ ả ế ấ ấ trên Th  gi i trong năm 2009. Trung Qu c là n ả   ớ c s n xu t cà chua l n nh t, chi m kho ng

ầ ư ả ượ ộ ế ầ ỳ m t ph n t s n l ng toàn c u, ti p theo là Hoa K  và n ĐẤ ế ế   ộ. Các khu v c ch  bi n ự

ế ượ ấ ở ỹ ả ượ ả ấ iạ  California chi m 90% l t ng s n xu t M  và 35% l ng s n xu t th  gi ế ớ Hartz và i (

ự ộ c ng s , 1997 ).

ữ ọ ạ ứ ề ệ II.1.2. Nh ng nghiên c u v  b nh virus h i cây h  cà

ử ệ ị L ch s  b nh xoăn vàng lá cà chua

ệ ượ ữ ầ ậ ạ B nh xoăn lá cà chua đ c ghi nh n đ u tiên trên th  gi ế ớ ừ ố i t cu i nh ng năm 40 t i Israel.

ệ ả ụ ị ữ ệ ấ ở ọ ầ   Các v  d ch b nh đã xu t hi n r i rác vào nh ng năm 60, tr  thành nghiêm tr ng vào đ u

ữ ệ ạ ể ạ ữ ấ ố ấ ả nh ng năm 70 khi thi t h i năng su t có th  đ t 100 %. Vào cu i nh ng năm 70, t t c  các

ồ ạ ễ ệ ị vùng tr ng cà chua t i Trung Đông đã b  nhi m b nh.

ệ ượ ạ B nh đã đ c báo cáo t i vùng Đông Nam Á (Thái Lan và Đài Loan) châu Phi và Châu Âu

ữ ệ ầ ầ ượ ố ạ ệ ỹ vào nh ng năm 80. B nh l n đ u tiên đ c công b  t i Châu M  vào năm 1993. Hi n nay,

ở ệ ấ ắ ọ ệ b nh   xoăn  vàng  lá   đã   tr thành   b nh  virus   quan  tr ng   nh t   trên   cây   cà   chua   kh p   th ế

ự ự ự ộ gi ộ i(ớ Picó và c ng s , 1996 ộ ; Ghanim và c ng s , 2001 ; Moriones và c ng s , 2007 ).

ứ ệ 2.2. Tình hình nghiên c u b nh xoăn vàng lá

ệ ể ặ 2.3. Đ c đi m c a ủ Begomovirus gây b nh xoăn vàng lá

6

̣ Begomovirus 2.3.1. Phân loai chi

ệ ệ ạ ượ ố ế ề ẩ ạ ỷ Vi c phân lo i virus gây b nh đ c ch n đoán theo U  ban Qu c t v  Phân lo i Virus

ấ ạ ự ể ặ (International Committee on Taxonomy of Viruses – ICTV) d a vào đ c đi m c u t o, hình

ư ố ư ặ ủ ệ ế ể ặ thái c a virus cũng nh  m i quan h  huy t thanh và các đ c tính khác nh  đ c đi m lan

ủ ặ ề ễ ạ ệ ọ ủ ủ ể ặ truy n, lây nhi m, ph m vi kí ch  đ c bi ạ   t là các đ c đi m c a DNA. Tên g i c a virus h i

ự ậ ủ ủ ứ ế ệ ệ ồ ị th c v t quy đ nh dùng ti ng Anh bao g m tên c a cây kí ch  chính, tri u ch ng b nh trên

ủ ố ừ ụ ệ ả ố Tobacco cây kí ch  đó và cu i cùng là t virus. Ví d : virus gây b nh kh m thu c lá ­

mosaic virus ­ vi ế ắ t t t là TMV.

ệ ố ứ ể Nghiên c u h  th ng phát sinh có th  chia begomovirus ra làm hai nhóm chính là nhóm Tân

ế ớ ế ớ ự ồ ỹ ự th  gi i (New world) bao g m Châu M  và nhóm C u th  gi i (Old world) là khu v c bán

ồ ự ộ ầ c u đông bao g m châu Âu, châu Phi, châu Á( Rybicki, 1994; Padidam và c ng s , 1999 ).

ế ớ ủ ế ớ ượ ệ Các  begomovirus  c a hai nhóm tân th  gi ự i và c u th  gi i đ c phân bi ở ặ   t nhau b i đ c

ấ ả ể ộ ở ụ ế ớ ề ộ đi m b  gen. T t c  các begomovirus c m Tân th  gi i đ u có b  gen kép, trong khi đó

ở ụ ế ớ ả ộ ơ ấ ả các  begomovirus ự  c m C u th  gi i có c  b  gen đ n và kép, thêm vào đó t t c  các

ế ớ ự ộ ủ ụ begomovirus c a c m C u th  gi ồ   i có thêm m t gen AV2 trên DNA­A, gen này không t n

ở ụ ế ớ ạ ở t i ủ ụ  các virus c a c m Tân th  gi ế ớ Rybicki, 1994). Begomovirus i ( c m Tân th  gi i có

ỗ ở ầ ỏ ở ỗ chu i PWRsmaGT đ u N trong v  protein (CP) mã hóa b i gen AV1, chu i này không có

ủ ụ ự ự ộ m t ặ ở begomovirus c a c m C u th  gi ế ớ Harrison và c ng s , 2002 i ( ).

ể ừ ự ấ ọ ể ỹ ằ Rybicki (1994) d  đoán r ng b  ph n di chuy n t Châu Á sang châu M  có th  đã mang t ổ

ế ớ ấ ủ ụ tiên virus c a c m Tân th  gi i mà chúng ta quan sát th y ngày nay. Các virus này sau đó

ộ ướ ế ở ụ ế ớ ti n hóa theo m t h ớ ng khác v i các virus ự  c m C u th  gi i.

̀ ́ ệ ố ự ằ ở ̣ ̣ Gân đây d a trên phân tích h  th ng phát sinh phat hiên ra r ng CoYVV Viêt Nam không

ỗ ở ầ ố ỏ có ORF AV2 và có chu i PWRsmaGT ớ    đ u N trong protein v  (CP), virus này gi ng v i

ế ớ ơ ế ớ ụ ự ự ở ệ ư ụ c m Tân th  gi i h n là c m C u th  gi ặ ủ i. S  có m t c a CoYVV Vi t Nam đã đ a ra

ả ớ ụ ế ằ ế ớ ặ ở ự ế ớ ướ ể gi ố  thuy t r ng virus gi ng v i c m Tân th  gi i có th  đã có m t C u th  gi i tr c khi

ở ỷ ự ộ ị b  phân chia k  Gondwana ( Ha và c ng s , 2008 ).

ủ ế ự ệ ự ủ ệ Hi n nay, vi c phân lo i ạ begomovirus ch  y u d a trên so sánh trình t ỗ  c a chu i phân t ử

ệ ạ DNA­A. Theo Fauquet et al.,2008, vi c phân lo i loài trong chi begomovirus tuân th  m t s ủ ộ ố

(i)

ẩ tiêu chu n sau:

7

ầ ủ Thành ph n c a genome có hay không có DNA­B

(ii)

(iii)

ổ ứ ộ T  ch c b  gen có hay không có gen AV2

ả ầ ộ Protein Rep không có kh  năng tái b n ả trans trong thành ph n b  gen thì có th ể

ỉ ộ ỏ ở ị ế ớ ằ ậ ớ ổ ầ ư ghi nh n loài m i. Tuy nhiên c n l u ý r ng ch  m t thay đ i nh v  trí liên k t v i Rep có

(iv)

ả ự ươ ể ứ ự ổ ợ ủ th  ngăn c n s  t ng tác ch c năng và s  tái t h p c a virus.

ộ ươ ủ ứ ể ặ ỏ ồ ự Đ c đi m c a protein v . M c đ  t ủ ng đ ng c a trình t aminoacid <90%

ứ ộ ươ ậ ộ ộ ủ ẫ ồ ớ thì ghi nh n là loài m i, tuy nhiên m c đ  t ng đ ng nucleotide c a toàn b  b  gen v n là

ế ệ ạ ầ c n thi ậ t cho vi c xác nh n phân lo i virus

2.3.2. Hình thái c a ủ Begomovirus

ệ Các begomovirus gây b nh xoăn vàng lá cà

chua nói riêng và  begomovirrus  nói chung

ộ thu c   chi Begomovirus  (h  ọ Geminivirus).

ấ ề Các  Geminivirus   đ u có c u trúc phân t ử

ươ ự (virion) t ng t ầ   ồ  nhau bao g m 2 hình c u

ặ ặ ỗ 20   m t   (icosahedron),   m i   m t   là   1   tam

ớ ố ơ ề ị giác đ u v i s   đ n v  tam giác (T) trên ủ 2.1Hinh thái c a begomovirus ệ ầ ỗ ố   m ihình c u đa di n kép (gemini). Do n i

(http://www.rothamsted.bbsrc.ac.uk) ầ ớ v i nhau nên 2 hình c u này không

ẫ ớ ỏ ượ ắ ầ ầ ỗ ỉ ệ hoàn thi n d n t ể i trên m i hình c u ch  có 55 ti u ph n protein (protein v ) đ ế   c x p x p

ỗ ơ ị ồ ể ầ ơ ị ế   thành 11 đ n v  hình thái, m i đ n v  g m 5 ti u ph n protein (pentameric capsomer). K t

ả ộ ử ể ầ ơ ị qu  là toàn b  phân t có 110 ti u ph n và 22 đ n v  hình thái( Gafni và Epel, 2002; Zhang và

ự ộ c ng s , 2010 ).

ấ ủ Begomovirus 2.3.3. C u trúc genome c a

ơ ử ặ ộ ồ ử ộ Begomovirus có b  gen đ n có phân t DNA­A ho c b  gen kép bao g m hai phân t DNA­A

ủ ấ ươ ự ở và DNA­B. C u trúc c a DNA­A là t ng t nhau hai nhóm virus này.

ủ ấ ử 2.3.3.1. C u trúc c a phân t DNA­A

ủ ể ấ ộ ồ ượ ắ ế ề C u trúc c a m t DNA­A đi n hình g m có 6 ORF đ c s p x p theo hai chi u ng ượ   c

ề ồ ồ ỏ nhau. Theo chi u kim đ ng h  có hai gen AV1 và AV2. Gen AV1(CP) mã hóa v  protein có

8

ứ ậ ế ch c năng lan truy n ề Begomovirus qua vector và nh p nhân t bào. Gen AV2 mã hóa Protein

ả ứ ệ ố ứ ủ ứ ệ ể có ch c năng c m  ng tri u ch ng, di chuy n h  th ng và tích lũy DNA c a virus. Ng ượ   c

ồ ồ ề ồ chi u kim đ ng h  g m có 4 gen AC1, AC2, AC3, AC4. Trong đó, gen AC1(rep) mã hóa

ứ ả ươ ủ ớ protein tái b n (Rep protein) có ch c năng tái sinh và t ủ ề   ng tác v i Protein c a ký ch  đi u

ỳ ế ể ứ ạ khi n chu k  t ứ    bào. Gen AC2 (TrAP) mã hóa Protein ho t hóa phiên mã có ch c năng  c

ủ ả ả ứ ế ườ ch  ph n  ng phòng th  cu  cây. Gen AC4 (Ren) mã hóa protein tăng c ứ   ng tái sinh có ch c

ươ ủ ề ỳ ế ể ớ năng t ng tác v i protein ký ch  đi u khi n chu k  t bào. Gen AC4 mã hóa protein có

(v)

ả ứ ệ ố ứ ệ ể ự ộ ứ ch c năng c m  ng tri u ch ng và di chuy n h  th ng ( Ha và c ng s , 2008 ).

ử ủ Begomovirus DNA­A c a ấ Hình 2.2. C u trúc phân t

(http://wcrc.confex.com)

ủ ấ ử 2.3.3.2. C u trúc c a phân t DNA­B.

ủ ề ả DNA­B c a các begomovirus kép mã hóa cho 2 protein BV1 và BC1 c  hai protein này đ u liên

ể ủ ệ quan trong vi c di chuy n c a virus.

ộ ứ ứ ư ộ BV1 là m t protein con thoi: ậ   BV1 có ch c năng nh  là m t protein con thoi, nó có ch c năng v n

ỏ ế ể ủ ế ệ ậ ậ chuy n virus vào và ra kh i t bào, tuy v y nó không liên quan đ n vi c nh p nhân c a virus

ứ ượ ể ở ễ trong lúc xâm nhi m, ch c năng này đ c ki m soát b i CP.

ươ ữ ể ớ ế ắ ầ ừ ạ BV1 t ệ ng tác v i BC1 trong vi c di chuy n gi a các t bào: B t đ u t ộ    nhân BV1 t o m t

ứ ợ ứ ợ ớ ế ế ợ ạ ấ ớ ph c h p v i ssDNA, ph c h p này đi ra t ứ ợ    bào ch t và k t h p v i BC1 t o thành ph c h p

ế ợ ể ế ể BV1 : ssDNA : BC1 sau đó di chuy n đ n s i liên bào và chuy n sang t bào khác( Gafni và

ố ủ ượ ị Epel, 2002).Vùng C cu i c a BV1 Squash leaf curl virus (SqLCV) đ c xác đ nh là y u t ế ố ầ    c n

9

ế ự ươ thi t cho s  t ớ ng tác v i BC1.

ứ ủ ư ể ậ ậ ộ ộ ố BC1 là m t protein v n chuy n. ể Ch c năng c a BV1 gi ng nh  là m t protein v n chuy n đã

ượ ườ ủ ợ đ c làm rõ trong hai tr ng h p sau: (1) BV1 c a virus Bean dwarf mosaic virus (BDMV)

ủ ợ ự ộ đã làm tăng size exclusion limit (SEL) c a s i liên bào ( Tice và c ng s , 2000 ); (2) BV1 c aủ

ạ ắ ấ ạ ố Squash leaf curl virus (SqLCV) đã kích thích t o ra các c u trúc d ng  ng b t ngu n t ồ ừ ớ    lu i

ữ ể ễ ấ ố ế ộ n i ch t, các  ng này làm cho virus d  dàng di chuy n gi a các t bào ( VARMA và Malathi,

ư ượ ề ậ ở ươ ứ ớ 2003).   Nh   đã   đ c   đ   c p trên,   BC1   t ợ   ng   tác   v i   BV1   thông   qua   ph c   h p

ể ậ ữ ể ế BV1:BC1:ssDNA đ  v n chuy n virus gi a các t bào ( Gafni và Epel, 2002).

ự ế ợ ủ ệ BC1 có liên quan trong tính gây b nh.ệ S  k t h p c a BC1 trong tính gây b nh đã đ ượ   c

ứ ệ ể ố ượ ể ch ng minh thông qua thí nghi m chuy n gen. Thu c lá và cà chua đã đ c chuy n gen BC1

ầ ượ ủ ữ ể ể ặ c a ủ Tomato mottle virus (TMoV) và BDMV, l n l t nh ng đ c đi m đi n hình c a virus

ượ ấ ậ ễ xâm nhi m đã đ c nh n th y.

ử ự ộ DNA­B c a ủ Begomovirus(Ha và c ng s , 2008 ) ấ Hình 2.3: C u trúc phân t

ủ ặ ể 2.3.3.3. Đ c đi m c a vùng IR

ơ ượ ử ở ị Các đ n v  sao chép ng c nhau trên phân t DNA­A và DNA­B cách nhau b i vùng liên gen

ở ầ ườ ẻ ặ ấ ợ ỉ (itergenic region (IR)), ế  h u h t các tr ng h p chúng chia s  1 vùng l p cao x p x  200

ọ ắ ầ ứ ể ộ nucleotide, g i là vùng chung (common region (CR)) . Vùng CR có ch a m t đi m b t đ u tái

ổ ứ ộ ấ ứ ấ ồ ọ b n (ả ori) có t ộ    ch c bao g m m t c u trúc thòng l ng (Stem­loop), c u trúc này ch a m t

7­C8 c n cho vi c c t và n i DNA ệ ắ

ự ế ắ ấ ạ ị ầ ố trình t nuleotide b t bi n ng n TAATATTAC, t i v  trí T

ậ ế ặ ệ ủ ượ ủ c a virus trong quá trình tái b n ộ ấ ả . IR có m t c u trúc nh n bi t đ c hi u c a virus đã đ c xác

ướ ấ ứ ộ ượ ọ ằ ị đ nh n m d i c u trúc stem­loop, nó ch a m t motif đ c g i là Interon( Argüello­Astorga và

ầ ế ậ ế ể ắ ầ ủ ợ Ruiz­Medrano, 2001), c n thi t cho nh n bi t và bám vào s i DNA c a virus đ  b t đ u tái

ổ ợ ủ ụ ộ ở ự ả b n. S  tái t h p c a virus ph  thu c vào motif này. Các virus có chung motif vùng IR có

ả ổ ợ ớ ẽ ươ ứ ộ ớ ộ ự ặ ư kh  năng tái t ỗ  h p v i nhau. M i m t motif s  t ng  ng v i m t trình t ầ    đ c tr ng trên đ u

10

ủ N (Interon related domain – IRD) c a protein REP.

ử ấ 2.3.3.4. C u trúc c a phân t DNA­ .β ủ

β ộ ử ệ ạ ơ ượ ế ợ ấ ớ M t phân t v  tinh DNA d ng vòng đ n (DNA­ ) đã đ c tìm th y k t h p v i các

ễ ạ ộ ơ ồ ồ begomovirus có b  gen đ n xâm nhi m trên các cây tr ng và cây d i bao g m bông (cotton),

ướ ụ ụ ẩ ỳ ỳ m p tây (okar), dâm b t (hibiscus), cây th c qu  (hollyhock), cây đay c m qu  (malvaceae),

ố cây   kim   ngân  (Caprifoliaceae),   cây   cà   chua   (tomato),   cây   thu c   lá   (tobacco),   và   cây ớ   t

(solanaceae), squash (Cucurbitaceae), cây hoa cúc và ageratum (Asteraceae)(Briddon, 2003)

β ử ượ ự ể ừ (Zhou et al., 2003). Phân t DNA­ đã thu hút đ c s  chú ý k  t khi (Briddon, 2003)ch ngứ

ứ ệ ể ệ ằ minh r ng tri u ch ng đi n hình trên cây ageratum (b nh vàng gân trên cây ageratum) và cây

ệ ể ố ỉ bông (b nh cu n lá bông) ch  có th  hình thành khi Ageratum yellow vein virus  (AYVV) và

β ượ ễ ộ ử ươ Cotton leaf curl virus  (CLCV) cũng đ ớ c lây nhi m v i m t phân t DNA – t ứ   ng  ng.

β ử ộ ơ ớ ướ ấ ỉ Phân t ợ  DNA­  có b  gen s i vòng đ n v i kích th c x p x  1350 nucleotide mang 3 vùng

ặ ư đ c tr ng ( Briddon, 2003).

ủ ủ ệ ả ả Vùng b o th  c a v  tinh (Satellite conserved region (SCR): Vùng này kho ng 200 nucleotide

ấ ộ ỗ ự ắ ặ bao quanh c u trúc stem­loop có mang m t chu i trình t ư    ng n TAT/ATATTAC đ c tr ng

ủ ả ộ ớ c a ủ Nanovuruses và Geminiviruses và m t vùng b o th  cao v i trên 100 nucleotide đã đ ượ   c

ằ ở ị ả ủ ầ ủ ủ ề ả ấ xác đ nh n m phía bên ph i c a đ u 5’ c a stem­loop. Vùng b o th  này có r t nhi u GC

ỉ ả ấ x p x  kho ng 70% ( Briddon, 2003)

β ử ứ ư ặ ộ Vùng  giàu  A  (A  rich  region):  Phân  t DNA­ ch a m t vùng giàu A (đ c tr ng 160­180

ả ị ượ ằ ị nucleotide có kho ng 60 % A) ( Briddon, 2003). V  trí đ ữ c xác đ nh n m gi a nucleotide ±700

ế ằ ượ ằ và ±1000 (Zhou et al., 2003). Có ý ki n r ng vùng giàu A này đã đ c thêm vào nh m tăng

ướ ủ ể ở ướ ấ ướ thêm kích th c c a chúng đ  tr  thành có kích th ỉ c x p x  kích th c ½ kích th ướ ủ   c c a

ằ ử ộ b  gen virus (Mansoor et al.,  2003). B ng cách này phân t DNA­ β có th  l p ráp đ ể ắ ượ   c

ơ ế ọ ọ ướ ử thông qua c  ch  ch n l c kích th ặ c nghiêm ng t trong phân t virus.

β β ượ ử ộ ọ ở Vùng ng c nghĩa mã hóa: Phân t ợ    DNA­  mang m t khung đ c m   C1 trên s i

ả ủ ở ớ ướ ặ ọ phía bên ph i c a genome. Khung đ c m  này mã hóa 1 protein v i kích th ư   c đ c tr ng

ể ế ộ ứ (đi n hình) 118 amino acids. Thông qua phân tích đ t bi n (Zhou et al., 2003) đã ch ng minh

β β ứ ứ ể ệ ệ ầ ẩ ệ ả s n ph m  C1 có ch c năng trong bi u hi n tri u ch ng. G n đây protein v  tinh  C1

β ủ (Y10 ) c a virus Tomato yellow leaf curl China virus ch ng ủ Y10 (TYLCCNV­Y10) đã đ cượ

11

ả ứ ủ ủ ứ ả ặ ch ng minh là có kh  năng ngăn ch n ph n  ng phòng th  c a cây (Cui et al., 2005).

SCR=Satellite Conserved Region

ủ ấ ử Hình 2.4: C u trúc c a phân t DNA­β

(http://wcrc.confex.com)

2.3.4. Tái sinh c a ủ Begomovirus

ế ế ơ ơ Begomovirus tái sinh theo c  ch  vòng lăn (rolling circular mechanism). C  ch  vòng lăn có

ể ượ ượ ự ệ ế ộ th  đ c chia làm 2 pha và đ c th c hi n trong nhân t bào ký ch  ( ự   ủ Picó và c ng s ,

1996)P

ặ ợ ơ ợ ổ ộ ử ợ (1) Pha t ng h p s i DNA vòng đ n (b  gen có m t trong phân t virus) thành s i DNA

ộ ượ ể ế ư ậ ợ ẽ ồ vòng kép khi b  gen virus đ c chuy n vào nhân t ộ ợ    bào. Nh  v y s i kép s  g m m t s i

ộ ợ ươ ư ượ ẫ ồ virus và m t s i t ng đ ng virus. Pha này v n ch a đ ể c hi u rõ.

ế ơ ượ ổ ẽ ắ ợ ợ (2) Pha tái sinh theo c  ch  vòng lăn: Protein Rep (sau khi đ c t ng h p) s  c t s i virus

ờ ậ ệ ỗ ả ư ạ t i chu i b o toàn TATATTAC. Nh  v t li u cũng nh  enzyme DNA polymearase c a t ủ ế

ượ ổ ợ ươ ụ ợ ồ ợ bào, s i virus đ c t ng h p liên t c trên s i t ng đ ng virus. Protein Rep l ạ ế ụ ắ   i ti p t c c t

ớ ượ ổ ợ ạ ớ ượ ổ ừ ỗ ợ s i virus m i đ c t ng h p t i chu i TATATTAC (cũng v a m i đ ơ c t ng h p) thành

ộ ợ ỉ ướ ạ ợ ơ ẽ ố ạ ẳ m t s i virus hoàn ch nh d ầ   i d ng s i đ n m ch th ng. Protein Rep sau đó s  n i 2 đ u

. ợ ơ ể ạ ạ ạ ẳ ộ ỉ ủ c a m ch th ng đ  t o ra b  gen virus s i đ n m ch vòng hoàn ch nh

ươ ổ ơ ủ Begomovirus 2.3.5. T ng tác và tái t h p c a

ồ ở ệ ớ ậ ệ ớ ườ ễ ặ ị ề geminivirus Cây tr ng vùng nhi t đ i và c n nhi t đ i th ng b  nhi m hai ho c nhi u

ự ự ự ộ (Harrison và c ng s , 2002 ộ ; Ribeiro và c ng s , 2006 ộ ; Briddon và c ng s , 2008 )(Harrison và

ự ộ ươ ự ộ c ng s , 2002 ; Briddon, 2003; Ribeiro và c ng s , 2006 ). Trong cây virus t ớ ng tác v i nhau

12

ứ ệ ợ ạ t o ra ph c h p b nh (complex disease) ( Moriones và Navas­Castillo, 2000; Chakraborty và

ể ươ ủ ễ ệ ạ ồ ự ộ c ng s , 2003 ). Ki u t ng tác đ ng nhi m b nh c a các virus (co­infection virus) t o ra

ứ ệ ở ị ừ ươ ể ệ ơ tri u ch ng rõ r t h n khi quan sát ạ  cây b  t ng lo i virus riêng. T ng tác có th  là s  b ự ổ

ặ ợ ổ ợ tr  (complementation) ho c tái t h p.

ụ ữ ổ ợ ể ả ề ạ ớ ố ợ Tác d ng ph i h p gi a hai Geminivirus tái t ệ    h p m i có th  x y ra, và t o ra nhi u tri u

ư ở ụ ứ ơ ổ ợ ượ ạ ch ng h n. Ví d  nh Cameroon, tái t h p kép (double recombinant) đ c t o thành khi

ễ ề ệ ạ ồ đ ng xâm nhi m các isolate c a ứ   ủ African cassava mosaic virus, đã t o ra nhi u tri u ch ng

ừ ự ụ ễ ớ ộ ị ữ ơ h n so v i cây b  nhi m t ng isolate riêng. M t ví d  khác là s  tái t ổ ợ ự  h p t nhiên gi a hai

ạ ỏ ơ begomovirus là TYLCSV và TYLCV (Tây Ban Nha), đã t o ra virus kh e h n hai virus ban

đ u (ầ Moriones và Navas­Castillo, 2000).

ổ ợ ượ ế ị ớ ự ế ặ ệ ở Tái t h p đ c cho là đóng vai trò quy t đ nh t ủ i s  ti n hóa c a virus, đ c bi t là ầ    qu n

ầ ạ ự ạ th  ể Geminivirus, góp ph n t o nên s  đa d ng di truy n( ề Sarkar và Kulshreshtha, 1978). Tái

ể ả ở ứ ủ ộ ự ộ (Markham và c ng s , 1996 ; ổ ợ t h p c a ủ begomovirus có th  x y ra m c đ  ch ng loài

Briddon, 2003) chi, và ngay trong cùng m t h  ( ộ ọ Jones, 2003)

ứ ệ ệ 2.3.6. Tri u ch ng b nh

ứ ệ ệ ệ ễ ệ ầ ấ B nh xoăn vàng lá xu t hi n tri u ch ng trong vòng 2­4 tu n sau khi nhi m b nh và phát

ầ ủ ệ ứ ứ ề ể ể ệ ệ ổ tri n đ y đ  tri u ch ng trong vòng 2 tháng. Tri u ch ng có th  thay đ i theo đi u ki n môi

ườ ưở ủ ề ệ ạ ễ ể ệ ờ tr ạ ng, giai đo n sinh tr ng và đi u ki n sinh lý c a cây t i th i đi m nhi m b nh( Picó

ự ộ và c ng s , 1996 ả ự ). Do ph i d a hoàn to

ấ ủ ế ậ ự ậ ể ể ạ ả àn vào v t ch t c a t bào th c v t đ  sinh s n, các virus đã phát tri n m nh trên cây non và

ộ Ở ẽ ậ ỗ ạ ư ầ ế t bào non trong m t cây. các cây già c i, quá trình này s  ch m l ừ   i hay h u nh  ng ng

ả ấ ủ ạ ầ ậ ổ ơ ẳ h n. Chính vì v y, tu i cây non và ph n non c a cây là n i virus sinh s n r t m nh. Các

ạ ả ư ệ ề ệ ộ ủ ấ ộ ườ đi u ki n ngo i c nh nh : nhi t đ  quá cao, th p, đ  pH c a môi tr ng, ánh sáng, ch  đ ế ộ

ưỡ ấ ượ ộ ề ấ ậ ả ọ dinh d ng, chăm sóc. M t ch t đ c nhi u nhà khoa h c xác nh n có b n ch t protein tan

ể ả ớ ồ ủ ậ là interferon có th  s n sinh ra ở ế  t ộ ấ    bào ký ch  khi virus xâm nh p. V i n ng đ  th p

ả ủ ữ ệ ế ả ả ầ ộ ứ kho ng m t ph n tri u gram đã có kh  năng  c ch  sinh s n c a virus. Chính vì nh ng lý

13

ệ ượ ỷ ệ ườ ự do trên b nh virus không gây đ ạ c tác h i hu  di t ngay mà th ng gây thoái hoá. S  hu ỷ

ệ ỉ ả ề ệ ườ ậ ợ ả di t ch  x y ra khi đi u ki n môi tr ệ ng và cây b nh thu n l i cho virus sinh s n và lây

ủ ệ ư ễ ậ ị ữ nhi m, nh  trong các tr n d ch c a b nh lúa vàng l ụ ở ướ  n i c ta nh ng năm 1960.

ứ ệ ớ ố ướ ấ Tri u ch ng s m nh t là lá cong xu ng d ề i vào phía bên trong. V  sau, lá không có hình

ỏ ẹ ế ừ ữ ố ạ d ng, nh  h p, bi n vàng t mép và chót lá lan vào gi a gân; lá cu n cong lên phía trên

ạ ể ắ ố ặ   ỏ ẹ . Cu ng lá có th  xo n v n. ế thành hình thuy nề ; lá non bi n vàng m nh, giòn và nh  h p

ỏ ố ề ễ ắ ọ ọ ớ ườ Cây lùn còi c c, m c nhi u cành nhánh nh , đ t thân ng n. Cây nhi m s m th ng không

ị ụ ả ự ộ ườ ụ ệ ấ ra qu  do hoa b  r ng ( Picó và c ng s , 1996 ệ ). B nh th ờ   ng xu t hi n vào các v  có th i

ế ư ti t nóng nh  hè thu và xuân hè.

ứ ớ Begomovirus gây ra trên t và cà chua ệ Hình 2.6. Tri u ch ng do

(httpwww.avrdc.org)

ề ủ Begomovirus 2.3.7. Lan truy n c a

ế ằ ằ ị Virus  lây lan b ng d ch cây,  b ng ti p xúc  c ơ

ớ ủ ế ọ ấ Bemisia tabaci gi i và ch  y u là do b  ph n

ừ ệ ồ chích hút t ỏ   ề  cây b nh r i truy n sang cây kh e

ậ ộ ọ ữ ề ể ấ   ầ theo ki u b n v ng tu n hoàn. M t đ  b  ph n

ị ệ càng cao thì t ỷ ệ  l ề    cây b  b nh xoăn lá càng nhi u.

ể ẫ ấ ạ ọ ọ B  ph n dùng vòi ch c vào mô m ch d n đ  hút

ừ ạ ượ ị d ch   cây   t m ch   phloem.   Virus   đ c   hút  qua

ớ ề ấ ộ vòi, t i di u, th m qua màng ru t vào xoang c ơ ọ ấ Bemisia tabaci Hình 2.7. B  ph n

ể ạ ớ ướ ọ th ,   đ t  t ế i   tuy n  n ố c   b t  và   cu i   cùng  vào

14

ố ướ ọ ng n c b t.

ệ ạ ế 2.3.8. Thi t h i kinh t do Begomovirus gây ra

ề ệ ồ ượ ọ Nhi u b nh nghiêm tr ng trên cây tr ng đã đ ị c xác đ nh là do begomovirus  gây ra như

ộ ệ ệ ọ ượ ệ ể ệ b nh b nh xoăn vàng lá (ng n) cà chua, m t b nh đ ấ   c xem là b nh virus nguy hi m nh t

ể ệ ắ ươ trên cà chua kh p th  gi ế ớ Moriones và Navas­Castillo, 2000)Các b nh nguy hi m t i ( ng t ự

ệ ệ ả ắ ố là b nh kh m lá s n (Legg và Fauquet, 2004), b nh cu n lá bông ( Briddon, 2003). Trong đó

ệ ạ ớ ệ ấ ọ gây thi t h i l n nh t là b nh xoăn vàng lá ng n cà chua.

ệ ệ ạ ớ ả ề ấ ượ ấ B nh xoăn vàng lá cà chua gây thi t h i l n c  v  năng su t và ch t l ệ ng. B nh đã tr ở

ế ệ ắ ọ ớ ệ ệ ớ ấ thành b nh virus quan tr ng nh t trên cây cà chua kh p Th  Gi ặ i, đ c bi t vùng nhi t đ i và

ự ộ ậ c n nhi ệ ớ Picó và c ng s , 1996 t đ i ( ).

ệ ừ 2.3.9. Bi n pháp phòng tr

ớ ườ ư ệ ố Cho t i nay, ng ấ i ta ch a phát hi n th y gen kháng R ch ng l ạ begomovirus trên cây cà chua i

ộ ố ồ ố tr ng (Lycopersicon esculentum). Tuy nhiên m t s  gen kháng ch ng l ạ begomovirus đã đ i cượ

ộ ố ố ư ệ ạ ấ ượ ậ ừ phát hi n th y trên m t s  gi ng cà chua d i. Nh  gen Ty1 đ c phân l p t ạ    cây cà chua d i

ộ ộ ự ộ (Lycopersicon chilense) và là m t gen kháng tr i không hoàn toàn ( Ha và c ng s , 2008 ).

ữ ệ ầ ướ ượ ứ ệ ả ụ ấ Nh ng năm g n đây công ngh  gen b ầ c đ u đ ố   c  ng d ng trong vi c s n xu t gi ng

ệ ể ệ ằ ắ ươ ả ố kháng b nh b ng bi n pháp b n gen, chuy n gen. Ch ấ ng trình s n xu t gi ng cà chua

ượ ắ ầ ừ ố ượ ể ạ ệ kháng b nh đã đ c b t đ u t cu i năm 1960 và đ c phát tri n m nh sau đó ơ ở ủ   . C  s  c a

ươ ể ệ ệ ừ ch ể ng trình này là vi c lai đ  chuy n gen kháng b nh t ạ  các loài cà chua d i sang loài cà chua

ồ ừ ặ ồ ộ ượ tr ng. Có t ả  1­5 gen kháng bao g m c  gen tr i và gen l n đã đ c công b  b i ( ố ở Picó và c ngộ

15

ế ị ượ ủ ế ế ị ự s , 1996 ). Năm 1998, Vidavski & Czosnek cho bi t tính ch u đ ở   c quy t đ nh ch  y u b i

ộ ượ ở ừ ặ gen tr i còn tính kháng đ ế ị c quy t đ nh b i t 2­3 gen l n.

ượ ứ ể ạ ụ ố C  ch ơ ế RNA slencing cũng đã đ c  ng d ng đ  t o ra gi ng kháng đ ượ begomovirus. Ở c

ệ ứ ệ ề ế ề ệ Vi ề ấ   ệ t Nam hi n nay Vi n Di truy n Nông nghi p đang ti n hành đ  tài nghiên c u v  v n

ộ ấ ề ặ ả ế ủ ề đ  này. Tuy nhiên, có m t v n đ  g p ph i là ố   ộ ơ RNA silencing là m t c  ch  c a cây ch ng

ơ ế ể ố ạ ự ủ ườ ạ l i virus thì virus cũng có c  ch  đ  ch ng l i s  silencing c a cây. Ng ứ i ta đã ch ng minh

ể ứ ế ườ ự ằ ướ ệ ằ b ng th c nghi m r ng AC4 c a ủ begomovirrus có th   c ch  đ ng h ng RNA silencing

ủ ế ấ ủ c a cây ký ch  trong t bào ch t.

ệ ươ ệ ạ ể ụ ệ Bi n pháp đang đ c áp d ng hi n t i đ  phòng b nh do begomovirus gây ra là di ệ ừ ọ ấ   t tr  b  ph n,

ọ ể ừ ọ ử ụ ệ ấ ấ ố ố ả bi n pháp canh tác và s n xu t gi ng kháng b nh ệ .S  d ng thu c hoá h c đ  tr  b  ph n là

ệ ộ ượ ế ệ ử ụ ệ ả ố m t bi n pháp đã đ c ti n hành và cho hi u qu  cao. Tuy nhiên vi c s  d ng thu c không ch ỉ

ườ ố ễ gây ô nhi m môi tr ng s ng mà còn làm tăng tính kháng thu c c a b  ph n. ố ủ ọ ấ Chúng ta cũng có

2.4.

ọ ấ ệ ể ắ ẫ th  s  d ng ể ử ụ bi n pháp dùng b y dính màu vàng đ  thu hút b  ph n tr ng.

ươ Ph ng pháp RCA (rolling circle amplification )

ươ ộ ượ ể ớ ướ ạ ơ Là ph ng pháp dùng đ  nhân m t l ng l n DNA d i d ng các polymer theo c  ch ế

ươ ự ờ ộ ư ủ ạ ẫ ồ vòng lăn (t ng t nh  quá trình tái sinh c a virus) nh  m t đo n m i ng u nhiên (Random

0C trong vòng 18 giờ

ạ ộ ở ệ ộ hexamer), và enzyme phi 29 DNA polymerase ho t đ ng nhi t đ  30

ể ổ ợ ớ ợ ướ ớ ớ ượ ợ đ  t ng h p và kéo dài s i m i có kích th c lên t i 10kb. Các s i m i đ c hình thành l ạ   i

ợ ế ạ ợ ở ể ổ tr  thành đo n khuôn đ  t ng h p các s i ti p theo.

2.5. K  thu t xác đ nh trình t

ậ ỹ ị ự

ữ ươ ị ự ượ ử ụ Nh ng ph ng pháp xác đ nh trình t axit nucleic đang đ ề ự   c s  d ng ngày nay đ u d a

ươ ả ế ủ ươ ượ ọ trên ph ng pháp c a Frederick Sanger (1977), có c i ti n. Ph ng pháp này còn đ c g i là

ươ ọ ươ ph ng pháp enzyme h c hay ph ng pháp dideoxy.

ươ ườ ử ụ ố ế ệ ặ Trong ph ng pháp này, ng i ta s  d ng các nhân t k t thúc đ c hi u quá trình kéo dài

ợ ổ ố ế AND khi t ng h p. Nhân t k t thúc là các 2,3 dideoxynucleosid triphosphat (ddNTP). Các

ể ế ợ ư ỗ ổ ợ ddNTP có th  k t h p vào chu i DNA đang t ng h p qua nhóm 5 triphosphat nh ng l ạ   i

ể ế ụ ế ợ ượ ớ ử ế không th  ti p t c k t h p đ c v i phân t desoxynucleosid triphosphat ti p theo. Do đó

ộ ẫ ượ ạ ỏ ớ khi tr n l n l ng nh  dideoxynucleosid triphosphat v i 4 lo i desoxynucleosid triphosphat

16

ẽ ổ ợ ượ ạ ạ ộ ờ ồ ế r i ti n hành t ng h p DNA nh  DNA polymerase thì s  thu đ c m t lo t các đo n DNA

ượ ở ố ệ ế ệ ế ặ ờ đ ỗ   c k t thúc đ c hi u b i g c dideoxy nucleotit. Ti n hành 4 thí nghi m tách r i, m i

ả ứ ẽ ạ ổ ượ ế ạ ph n  ng b  sung 1 lo i dideoxy nucleotit khác nhau s  thu đ c các đo n DNA có k t thúc

ệ ạ ơ ạ   ằ b ng các dideoxy nucleotit khác nhau và h n kém nhau 1 nucleotit. Ch y đi n di các đo n

17

ệ ể ồ ị ự ủ ỗ này r i hi n hình chúng, ta có th  xác đ nh trình t c a chu i DNA quan tâm.

2.6. K  thu t agroinoculation

ậ ỹ

ể ấ ễ ậ ỹ ế ượ K  thu t chuy n c u trúc xâm nhi m vào t ờ  bào cây nh  vi khu n ẩ A.tumerfaciens đ ọ   c g i

ả ậ ỏ ỹ ế ế ễ ấ là agroinoculation. K  thu t agroinoculation đòi h i ph i thi t k  1 c u trúc xâm nhi m bao

ệ ặ ộ ượ ế ế ứ ố ở ồ g m b  gen virus (ho c v  tinh) đ c thi ồ t k  ch a 2 ngu n g c tái sinh ( ori) ầ  2 đ u và

ượ ả ủ ữ ấ ằ ờ ố ờ ị ị đ c n i vào 1 v  trí n m gi a b  trái và b  ph i c a 1 vector nh  nguyên. C u trúc xâm

ẽ ượ ễ ế ế ễ ế nhi m s  đ ạ c bi n n p vào t bào vi khu n ẩ A. tumerfaciens.   Khi lây nhi m, t bào vi

ẩ ẽ ế ớ ế ứ ủ ằ khu n s  ti p xúc v i t bào cây ký ch  và các protein ch c năng (n m trên Ti plasmid) s ẽ

ả ủ ấ ữ ể ễ ằ ầ ộ ờ ờ chuy n toàn b  ph n DNA n m gi a b  trái và b  ph i c a c u trúc xâm nhi m vào nhân

ủ ầ ợ ổ ộ ế ủ ế ế t bào cây ký ch  và t ng h p ph n DNA này vào b  gen t bào cây ký ch . Trong t bào

ẽ ượ ủ ể ệ ể chuy n gen, gen Rep c a virus s  đ c bi u hi n thành protein Rep. Protein Rep s  c t b ẽ ắ ộ

ỏ ộ ế ạ ị ố ạ ệ ặ ỗ ộ gen virus kh i b  gen t bào cây t i v  trí đ c hi u trên chu i ori và n i l i thành b  gen

ẽ ự ứ ẹ ệ ẹ ộ ọ virus nguyên v n. B  gen virus nguyên v n này s  th c hi n ch c năng sinh h c và gây

b nh.ệ

A: Agrobacterium tumefaciens. B: Agrobacterium genome. C: Ti Plasmid  : a: T­DNA , b: Vir

genes , c: Replication origin , d: Opines catabolism genes. D: Plant cell. E: Mitochondria. F:

Chloroplast. G: Nucleus

ậ ỹ ấ ượ Có 3 k  thu t agroinoculation chính là: (i) th m chân không (lá cây đ c nhúng trong dung

ẩ ượ ử ẩ ẽ ễ ể ị d ch vi khu n, đ c x  lý chân không đ  hút khí trong gian bào; vi khu n s  d  dàng xâm

ấ ậ ổ ườ nh p vào trong mô qua khí kh ng khi áp su t tr ở ạ  l i bình th ng); (ii) ự tiêm tr c ti p ế vi

ẩ ẩ ị ướ ự ế t khu n vào mô; và (iii) ấ i tr c ti p d ch vi khu n vào đ t

18

ậ ỹ 2.7. K  thu t RCA (Rolling Circle Amplification)

ầ ộ ươ ậ ả ớ ỹ G n   đây,   m t   ph ng   pháp   nhân   b n   DNA   m i   dùng   k   thu t   RCA   (Rolling   Circle

ượ ử ụ ể ạ ạ ậ ộ ỹ Amplification) đã đ c s  d ng đ  nhân các b  gen DNA d ng m ch vòng. K  thu t RCA

Φ ủ ự ể ạ ộ ể   ẩ dùng enzyme DNA polymerase c a th c khu n th   29, m t enzyme có ho t tính chuy n

ể ạ ấ ồ ử m ch (strand­displacement) r t cao, và m i hexamer đ  nhân các phân t ạ  DNA m ch vòng

ề ế ạ ẳ ả ồ ộ ẩ   thành các multimer m ch th ng (g m nhi u b  gen virus liên ti p) (Hình 2.10) S n ph m

ẽ ượ ắ ằ ắ ớ ạ ợ ượ RCA s  đ c c t b ng enzyme c t gi i h n thích h p và đ c dòng hóa trong các vector

ườ ứ ụ ệ ấ ậ ỹ dòng hóa thông th ng. Đây là k  thu t hi n đang r t thông d ng trong nghiên c u các virus

ệ ạ ộ ộ ể ả có b  gen DNA m ch vòng k  c  các begomovirus và v  tinh ( ự   Inoue­Nagata và c ng s ,

ự ộ 2004; Haible và c ng s , 2006 ; Knierim và Maiss, 2007).

ơ ế ả ử ạ ậ ằ ỹ  DNA m ch vòng b ng k  thu t RCA (Rolling Circle Hình 2.10. C  ch  tái b n các phân t

Φ ự Amplification) dùng hexamer và  29 polymerase DNA ( ộ Fujii và c ng s , 2006 )

ậ ỹ ượ ứ ể ế ế ủ ễ ấ K  thu t RCA đã đ ụ c  ng d ng đ  thi t k  các c u trúc xâm nhi m c a begomovirus.

ẩ ả ạ ượ ắ ơ ằ ắ ớ ạ ợ S n ph m RCA d ng multimers đ c c t đ n b ng enzyme c t gi i h n thích h p trong

19

ệ ề ệ ể ể ạ ề ả ẩ ộ ộ đi u ki n không tri t đ  đ  t o ra nhi u s n ph m monomer (1 b  gen), dimer (2 b  gen) và

ề ẩ ả ộ ỉ ượ ế ỏ multimer (nhi u b  gen). Ch  các s n ph m dimer đ c tinh chi ố   t kh i gel agarose và n i

ủ ễ ả ấ ằ ơ ị vào vector nh  nguyên B ng cách đ n gi n này, các c u trúc xâm nhi m c a begomovirus có

ể ượ ạ ự ộ th  đ c t o ra khá nhanh chóng ( Inoue­Nagata và c ng s , 2004 ; Knierim và Maiss, 2007;

20

ự ự ự ộ Ferreira và c ng s , 2008 ộ ; Wu và c ng s , 2008 ộ ; Wyant và c ng s , 2011 )

III.

Ậ ƯƠ Ứ Ệ V T LI U VÀ PH NG PHÁP NGHIÊN C U

ố ượ ờ ể ị ậ ệ ứ 3.1.Đ a đi m, th i gian, đ i t ng và v t li u nghiên c u

ố ượ ứ 3.1.1.  Đ i t ng nghiên c u

ả ệ ở ề ệ B ng 3.1: Các begomovirus gây b nh xoăn vàng lá ớ ượ t đ c thu mi n Trung Vi t Nam.

ự ể ị ứ ệ Ký hi uệ ẫ Đ a đi m, khu v c thu m u Tri u ch ng

Đ iố   ngượ t

21

ể VNP624 Túy Loan – Đà N ngẵ tớ Begomovirus đi n hình

ả VNP626 Túy Loan – Đà N ngẵ tớ Kh m vàng

ể VNP628 Túy Loan – Đà N ngẵ tớ Begomovirus đi n hình

22

ệ ả VNP635 Đi n Bàn – Qu ng Nam tớ Begomovirus nhẹ

ố VNP722 Vinh – Ngh  Anệ tớ ọ Cu n lá ng n

VNP867 Túy Loan – Đà N ngẵ tớ Begomovirus nhẹ

23

VNP868 Hòa Vang – Đà N ngẵ tớ Kh mả

VNP869 Hòa Vang – Đà N ngẵ tớ Kh mả

VNP870 Hòa Vang – Đà N ngẵ tớ Kh mả

24

VNP871 Hòa Vang – Đà N ngẵ tớ Kh mả

VNP872 Hòa Vang – Đà N ngẵ tớ Kh mả

VNP873 Hòa Vang – Đà N ngẵ tớ Kh mả

25

VNP874 Hòa Vang – Đà N ngẵ tớ Kh mả

ỏ VNP875 Hòa Vang – Đà N ngẵ tớ Lá nhăn nh , già

VNP876 Hòa Vang – Đà N ngẵ tớ Kh mả

26

VNP877 Hòa Vang – Đà N ngẵ tớ Kh mả

VNP878 Hòa Vang – Đà N ngẵ tớ Lá nhăn

VNP879 Hòa Vang – Đà N ngẵ tớ Kh mả

27

VNP880 Hòa Vang – Đà N ngẵ tớ Kh mả

VNP883 Hòa Vang – Đà N ngẵ tớ Kh mả

VNP884 Hòa Vang – Đà N ngẵ tớ Kh mả

28

VNP885 Hòa Vang – Đà N ngẵ tớ Kh mả

VNP886 Hòa Vang – Đà N ngẵ tớ Kh mả

VNP887 Hòa Vang – Đà N ngẵ tớ Kh mả

29

VNP888 Hòa Vang – Đà N ngẵ tớ Kh mả

ả ơ VNP889 Hòa Vang – Đà N ngẵ tớ Lá kh m, h i nhăn

VNP890 Hòa Vang – Đà N ngẵ tớ Kh mả

30

VNP891 Hòa Vang – Đà N ngẵ tớ Kh mả

ả VNP892 Hòa Vang – Đà N ngẵ tớ Kh m , nhăn lá

ả ừ VNP907 Túy Loan – Đà N ngẵ tớ Kh m vàng t trong ra

31

VNP908 Túy Loan – Đà N ngẵ tớ Kh mả

ả VNP909 Túy Loan – Đà N ngẵ tớ Kh m, xoăn lá

ả VNP910 Túy Loan – Đà N ngẵ tớ Kh m, xoăn lá

ừ VNP911 Túy Loan – Đà N ngẵ tớ ả Kh m t trong ra, xoăn lá

32

ả ệ ở ề ệ B ng 3.2: Các begomovirus gây b nh xoăn vàng lá ớ ượ t đ c thu mi n Nam Vi t Nam

ự ể ị ứ ệ Ký hi uệ ẫ Đ a đi m, khu v c thu m u Tri u ch ng

Đ iố   ngượ t

VNP313 Châu Thành – An Giang tớ Kh mả

33

VNP319 Châu Thành – An Giang tớ Xoăn lá

VNP323 Châu Thành – An Giang tớ Xoăn lá

ỹ ị VNP641 Phú M  ­ Bình Đ nh tớ ỏ ố Begomovirus, lá nh  cu n

Phù Cát – Bình Đ nhị tớ begomovirus

34

VNP64 6

VNP650 Phù Cát – Bình Đ nhị tớ begomovirus

VNP673 Châu Thành – An Giang tớ begomovirus

35

ồ VNP675 Cao Lãnh – Đ ng Tháp tớ begomovirus

ồ VNP683 Thanh Bình – Đ ng Tháp tớ begomovirus

ồ ả VNP687 Thanh Bình – Đ ng Tháp tớ Kh m vàng

36

ả VNP701 Châu Thành – An Giang tớ Kh m vàng

Châu Thành – An Giang tớ Begomovirus

VNP70 4

ủ ầ ơ ỏ ứ VNP717 Bình Th y – C n Th tớ Lá nh , c ng, vàng

37

ầ ơ ể VNP718 Ô Môn – C n Th tớ Xoăn vàng lá đi n hình

ồ ặ ả ươ VNP826 Đan D ng – Lâm Đ ng tớ Kh m n ng

ồ ả ươ VNP827 Đan D ng – Lâm Đ ng tớ Kh m vàng, lá nhăn

38

ồ ả ỏ ươ VNP828 Đan D ng – Lâm Đ ng tớ Kh m vàng, lá nh

ồ ố ươ VNP829 Đan D ng – Lâm Đ ng tớ Lá đ m,vàng rõ

ồ ươ VNP831 Đan D ng – Lâm Đ ng tớ Lá nhăn, vàng rõ

39

VNP854 Playku – Gia Lai tớ begomovirus

VNP855 Playku – Gia Lai tớ begomovirus

VNP856 Playku – Gia Lai tớ Begomovirus

ả ệ ượ ở ề ệ B ng 3.3: Các begomovirus gây b nh xoăn vàng lá cà chua đ c thu mi n Trung Vi t Nam

ự ể ị ứ ệ Ký hi uệ ẫ Đ a đi m, khu v c thu m u Tri u ch ng

40

Đ iố   ngượ t

ệ ễ VNP436 Di n Châu – Ngh  An Cà chua Xoăn vàng lá

ệ ễ VNP441 Di n Châu – Ngh  An Cà chua Xoăn vàng lá

41

VNP725 Vinh – Ngh  Anệ Cà chua Xoăn vàng lá

ễ ệ VNP727 Di n Châu – Ngh  An Cà chua Xoăn vàng lá

ệ ễ VNP893 Di n Châu – Ngh  An Cà chua Xoăn vàng lá

42

ễ ệ ả VNP894 Di n Châu – Ngh  An Cà chua Kh m vàng

ễ ệ ế ạ ố VNP895 Di n Châu – Ngh  An Cà chua Xoăn ch t ho i, đ m

ễ ệ ế ố VNP896 Di n Châu – Ngh  An Cà chua ạ Vàng, ch t ho i gân, cu ng lá

43

ễ ệ VNP897 Di n Châu – Ngh  An Cà chua Xoăn vàng lá

ễ ệ ế ạ ố VNP898 Di n Châu – Ngh  An Cà chua Đ m vàng. Ch t ho i gân

ễ ệ VNP899 Di n Châu – Ngh  An Cà chua Xoăn vàng lá

44

ệ ễ VNO900 Di n Châu – Ngh  An Cà chua Xoăn vàng lá

ễ ệ ế ố VNP901 Di n Châu – Ngh  An Cà chua ạ Đ m xanh, ch t ho i

ễ ệ VNP902 Di n Châu – Ngh  An Cà chua Xoăn vàng lá

45

ệ ễ VNP903 Di n Châu – Ngh  An Cà chua Xoăn vàng lá

ệ ễ ế ố VNP904 Di n Châu – Ngh  An Cà chua ạ Xanh đ m, ch t ho i

ệ ễ VNP905 Di n Châu – Ngh  An Cà chua Xoăn vàng lá

ễ ệ VNP906 Di n Châu – Ngh  An Cà chua Xoăn vàng lá

46

ả ệ ượ ở ề ệ B ng 3.4: Các begomovirus gây b nh xoăn vàng lá cà chua đ c thu mi n Nam Vi t Nam

ự ể ị ứ ệ Ký hi uệ ẫ Đ a đi m, khu v c thu m u Tri u ch ng

ể

ạ ế

ồ ồ ồ ồ

ỏ

ả ả Đ iố   ngượ t Cà chua Cà chua Cà chua Cà chua Cà chua Cà chua Cà chua Cà chua Begomovirus đi n hình Nhăn tím, ch t ho i gân Nhăn lá, không kh mả ả ỏ Xoăn lá nh , ko kh m Xoăn, cu n láộ Xoăn, lá nhỏ Kh m vàng, lá nhăn nh Kh m vàng, lá không nhăn

ạ ư ạ

ậ ậ ậ ậ ỏ

ố

ẹ c lên phía trên

Cà chua Cà chua Cà chua Cà chua Cà chua Cà chua Cà chua Cà chua Xoăn, lá nhăn, bé ọ Vàng lá ng n, nh  b ch t ng Vàng lá ng nọ ả Lá kh m, vàng, xoăn nh ạ ế Đ m ch t ho i ọ Xoăn vàng ng n nh ượ Mép lá xoăn ng Lá xoăn, vàng nhăn

ạ

VNP310 Long Xuyên – An Giang VNP326 Long Xuyên – An Giang ươ VNP820 Đan D ng – Lâm Đ ng ươ VNP821 Đan D ng – Lâm Đ ng ươ VNP822 Đan D ng – Lâm Đ ng ươ VNP823 Đan D ng – Lâm Đ ng ậ VNP843 Buôn ma thu t – Đăk Lăk ậ Buôn ma thu t – Đăk Lăk VNP84 4 VNP845 Buôn ma thu t – Đăk Lăk VNP846 Buôn ma thu t – Đăk Lăk VNP847 Buôn ma thu t – Đăk Lăk VNP848 Buôn ma thu t – Đăk Lăk VNP857 Playku – Gia Lai VNP862 Playku – Gia Lai VNP863 Playku – Gia Lai Playku – Gia Lai VNP86 4 VNP865 Playku – Gia Lai VNP866 Playku – Gia Lai Cà chua Cà chua ọ Xoăn ng n m nh ọ ọ Xoăn ng n, chùn ng n

ị ứ

ứ ệ ệ ớ ườ ạ ọ ệ ể 3.1.2.  Đ a đi m nghiên c u Trung tâm nghiên c u b nh cây nhi t đ i ­ Tr ộ ng Đ i h c Nông nghi p Hà N i

ờ ứ

ừ ế 3.1.3. Th i gian nghiên c u T  tháng 6/2013 đ n tháng 12/2013

ậ ệ ứ 3.1.4. V t li u nghiên c u

ấ 3.1.4.1.  Ch t  kháng sinh

ượ ử ụ ứ ồ Các kháng sinh đ c s  d ng trong nghiên c u g m: Rifampicin, kanamycin, streptomycin,

ượ ị ướ ạ ư ố tetracylin. Các kháng sinh đ ẩ c chu n b  d ị i d ng dung d ch g c nh  sau:

­  Rifampicin 34 μg/μl: hòa 0,034 g trong 1 ml Methanol

47

ướ ấ ­  Kanamycin 100 μg/μl: hòa 0,1 g trong 1 ml n ầ c c t hai l n

ướ ấ ­  Streptomycin 50 μg/μl: hòa 0,05 g trong 1 ml n ầ c c t hai l n

­  Tetracylin 12,5 μg/μl: hòa 0,012 g trong 1 ml ethanol 70 %

0C, trong đó rifampicin và kanamycin đ

ượ ả Các kháng sinh đ c b o qu n ả ở ủ ạ  t l nh sâu – 20 cượ

ằ ạ ấ ọ b c kín b ng gi y b c.

ễ ấ 3.1.4.2. C u trúc xâm nhi m

β ộ ộ ễ ặ ấ ồ ượ ộ ố Các c u trúc xâm nhi m g m toàn b  b  gen virus (ho c DNA­ ) đ c n i vào m t vector

ố ớ ả ọ ọ ự ậ ị nh  nguyên pCAMBIA­2300 mang gen kháng kanamycin đ i v i c  ch n l c th c v t và

ọ ọ ẩ ộ ộ ị ch n l c vi khu n. Đây đây là m t vector nh  nguyên thu c nhóm vector pCAMBIA đ ượ   c

ệ ở ạ t o ra b i vi n CAMBIA (http://www.cambia.org/daisy/cambia/home.html). pCAMBIA­2300

ố ự ể ể ậ ượ ử ụ ố là   vector   t i   thi u   cho   chuy n   gen   th c   v t   và   đ c   s d ng   t ệ   t   trong   thí   nghi m

agroinoculation.

β β ầ ặ ượ ự ặ Ph n gen virus (ho c DNA­ ) đ ộ ộ c xây d ng sao cho toàn b  b  gen virus (ho c DNA­ ) có

ồ ở ố 2 vùng ngu n g c tái sinh (ori) ầ  2 đ u.

ẩ ử ụ ủ Các ch ng vi khu n s  d ng

ả ế ủ Ch ng vi khu n ẩ  A. Tumefaciens kh  bi n

ủ ượ ử ụ ủ ứ Ch ng  vi  khu n ẩ A.tumefaciens  đ c   s  d ng  là  LBA4404.   Ch ng này  ch a  Ti  plasmid

ẩ ằ ộ pAL4404. Gen kháng Rifampicin n m trên b  genome vi khu n còn gen kháng streptomycin

ằ n m trên Ti plasmid pAL4404.

H   ình 3.2 : Hinh thái vi khu n ẩ A..tumefaciens

48

ả ế ủ ẩ Ch ng vi khu n E. Coli kh  bi n

ủ

ẩ

ượ

ử ụ

ứ

ủ

ủ

Ch ng   vi   khu n   E.coli   đ

c   s   d ng   là   ch ng   XL1­Blue.   Ch ng   này   ch a   gen   kháng

ủ

ằ

ộ

ẩ Tetracylin n m trên b  gen c a vi khu n

ả ứ ệ ầ 3.1.4.3. Thành  ph n cho ph n  ng PCR, RCA, Đi n  di

ặ ồ C p m i chung DNA­A c a ủ Begomovirus là BegoA­ReV1 & Bego­AFor1 (Ha Viet Cuong et

al., 2006).

BegoA­ReV1: 5’­ ATHCCMDCHATCKTBCTiTGCAATCC*­3’

BegoA­For1  : 5’­ TGYGARGGiCCiTGYAARGTYCARTC* ­3’

*  Y (C / T), R (G / A), H (A / C / T), M (A / C), B (C / G / T), D (A / G / T), K (G / T)

và i = inosine.

ồ ặ ệ ượ ử ụ ặ Các c p m i đ c hi u đ c s  d ng

ả B ng 3.5 ệ ồ ặ  : Các m i đ c hi u

ướ Các m iồ Trình t ự ồ  m i th ả   c   s n ệ Phát hi n virus

leaf Curl ToLCHnV­F1 TCAGTTATTCGTGCTAAGGAC Kích   ph mẩ 1260 bp

Tomato   Hainam virus CAACGCCAAGAAAGCAACG

ToLCHnV­ R2 TB101­ F1 CGAGTTGGTAAACGTTTCTGC 320bp

Curl   Tomato   Leaf ChinaVirus (ToLCCNV) TB101­ R1 TCCTGGTGATTGTACACTACG

VB VB65 –F1 TCCTCCGTCGAATTGGTCTC 780bp

VB65 –R1 GAAGGCAAATTCATCTGCACG

AAGAGCCTCCGACTTACTGC 330bp TY –F4

CAAAACCTAAACACCCCAACG TY –R4

CGTTTTCAAGTTCTTCGTCGA 530bp Tomato   Yellow   Leaf  Curl   Vietnam   Virus   (TYLCVNV) ToLCVV To –F4

AAAACAGGCCCTTCCTATCG To –R4

49

Tomato leaf curl Hanoi To100 –F1 CTTCTGTATCAATTGTGCCTTC 150bp

To100 –R1 GTTTTCTAATCTGCCGAGTTTG VirusToLCHanV

TYKa­A –F1 CCTTTTCCAGAGAGTTTGCAC 680bp

Tomato   Yellow   Leaf  Curl Kachanaburi Virus TYKa­A –R1 GATGCTGAGAAACGATGAAGC

ƯƠ 3.2. PH NG PHÁP

ế ổ ố 3.2.1. Chi t DNA t ng s

ượ ng pháp: c chi

mô lá đ ế ằ ế t theo các ph t nhanh nhanh b ng NaOH ươ (Wang et al., 1993):

ẫ ệ ế ị ố ừ ổ DNA t ng s  t ươ ng pháp chi + Ph ả Cho kho ng 50 mg mô lá m u b nh vào tube 1,5 mL, cho ti p 500 µl dung d ch NaOH 0,5 M vào

ự ụ ễ ể ề ấ ẫ ị ệ   tube 1,5mL, dùng chày nh a chuyên d ng đ  nghi n nhuy n m u lá. L y 100 µl dung d ch đ m

ề ẫ ấ ị ề Tris 0,1 M, pH = 8 vào tube 1,5mL, sau khi nghi n m u xong l y 2 µl d ch nghi n cho vào tube

ứ ệ ị ị ượ 1,5mL ch a dung d ch đ m Tris 0,1M, pH = 8. D ch hòa loãng này đ ể ạ c dùng đ  ch y PCR.

ươ ế ệ ằ ị ng pháp c hi t DNA b ng dung d ch đ m CTAB  ( + Ph Cetryl Ammonium Bromide ) theo mô

ư ả ủ t c a Doyle & Doyle (1987), Wang et al., 1993 nh  sau:

ẫ ươ ề ệ ổ ả Nghi n kho ng 0.1g m u t i trong 500µl đ m CTAB (đã b  xung Beta­ mercaptalthanol).

ẫ ượ ị ế ầ ằ ỗ Sau đó, dung d ch m u đ c chi t 2 l n b ng h n h p ợ Chlorofom : isoamyl alcohol 24:1. DNA

ố ượ ủ ử ặ ầ ằ ằ ổ t ng s  đ c t a b ng Propanol 100%, r a c n DNA 2 l n b ng 700µl Etanol 70% và đ ể

ặ ặ ấ ướ ấ ầ khô c n DNA trong không khí ít nh t 30 phút. Hoà c n DNA trong 100µl n c c t hai l n đã

0C.

50

ả ở ả ấ h p vô trùng, b o qu n DNA ­20

ả ứ 3.2.2. Ph n  ng RCA (rolling circle amplification )

ượ

ớ ổ

ế

ả ứ Ph n  ng đ

ể c ti n hành v i t ng th  tích là 20 μL trong đó có

dd H2O

4.75 μl

DNA

2.5 μl

dNTPs (10 mM each) :

1.0 μl

20X Exo­Hexamer (500 μM, Fermentas)

0.25 μl

10XPhi29 buffer (Fermentas)

1.0 μl

Phi29 enzyme (10 U/μL, Fermentas)

0.25 μl

Pyrophosphate (0.1U/μL, Fermentas)

0.25 μl

ể ấ

ạ

ả ứ Ph n  ng đ

ượ ủ ở c

30

oC trong 18h sau đó

ủ ở

65

oC đ  b t ho t enzyme.

ắ ả ớ ổ ả ứ ự ệ ể ẩ ớ ằ Th c hi n ph n  ng c t s n ph m RCA b ng BamHI v i t ng th  tích là 10 μL v i các

ả ứ ư ầ thành ph n ph n  ng nh  sau:

H2O

6 μL

React 3 X 10

1 μL

BamHI (10u/ μL)

1 μL

ả

ẩ S n ph m RCA

2 μL

0C trong 5phút và b t ho t enzyme b ng 0.5 μL EDTA  0.5M. Đi n ệ

ộ ủ ở ằ ạ ấ ề Tr n đ u và tube 37

51

ứ ả ẩ ắ di s n ph m c t trên agarose gel 1 % và ch a 0.5 mg/mL ethidium bromide.

ả ứ ệ ả 3.2.3.Ti n hành ph n  ng PCR (Polymerase Chain Reaction) và đi n di s n ph m ẩ

ế PCR.

ả ứ 3.2.3.1. Chu trình ph n  ng PCR.

ả ứ ầ ả ỗ ủ B ng 3.6.Thành ph n c a m i ph n  ng PCR

H2O

l

Buffer

l

dNTPs

l

M i Fồ

l

M i Rồ

l

MgCl2

l

Taq (Fermantas)

l

DNA

l

ể

ổ

T ng th  tích

18.75(cid:0) 2.5(cid:0) 0.5(cid:0) 0.5(cid:0) 0.5(cid:0) 1.5(cid:0) 0.25(cid:0) 0.5(cid:0) 25(cid:0)

l

ả ứ

ự

ệ Quy trình th c hi n ph n  ng PCR

94oC

x 1

4 phút

94oC

35 giây

52oC

35 giây                    x 35

72oC

1 phút

72oC

5 phút

ệ ẩ ả 3.2.3.2. Đi n di s n ph m PCR.

ả ượ ệ ượ ị ằ ẩ ẩ ­  S n ph m PCR đ c đi n di trên gel agarose 1 % đ ứ   ệ c chu n b  b ng đ m TAE và ch a

0.5 mg/mL ethidium bromide.

ượ ạ ế ị ệ ớ ệ ở ệ ­ Gel đ c ch y trên thi t b  đi n di là Mini­Sub Cell (Biorad) v i đ m TAE đi n th ế

52

100V trong 30 ­ 40 phút.

ả ượ ể ướ ử ượ ụ ạ ằ ụ ­ B n gel đ c ki m tra d i ánh sáng t ạ  ngo i và đ c ch p l i b ng máy ch p chuyên

ặ ỹ ậ ố ả ụ d ng ho c máy  nh k  thu t s .

3.2.4. Tinh chi

Các

ế ả ộ S  d ng b  kit tinh chi ế ệ ẩ t s n ph m đi n di ế ủ t c a BioNeer ­ Accuprep Gel Purification Kit.   ẫ ủ ướ ấ ả ướ ử ụ ệ ự t th c hi n theo h ng d n c a nhà s n xu t. b c tinh chi

ự ễ ấ 3.2.5. Xây d ng c u trúc xâm nhi m

ằ ở

­

M  vector pCAMBIA2300 b ng BamHI

DNA plasmid 10 μL

BamHI (10u/ μL) 2 μL

10X  React 3 2 μL

ấ H2O h p vô trùng 6 μL

0C trong m t gi

ộ ờ ệ ế ừ Ủ ở 37 sau đó đi n di và tinh chi t DNA plasmid t ằ    gel agarose b ng

kit Accuprep gel purification kit (Bioneer)

ượ ở Dephosphorylation vector pCAMBIA­2300 sau khi đ ằ c m  vòng b ng BamHI

ắ ằ pCAMBIA (c t b ng BamHI, purified) 30

10X Alkaline Phosphatase buffer (Roche) 4

Alkaline Phosphatase (Roche) 6

0C   trong   m t   gi

ộ ờ ằ ạ Sau   đó ủ ở 37 và   tinh   s ch   b ng   kit   Purelink   PCR   purification   kit

(Invitrogen)

ố N i vector pCAMBIA (dephosphorylated, purified) and Dimeric (gel purified)

spCAMBIA­2300 3μL

Dimer 13 μL

T4 ligation buffer 2 μL

T4 ligase (5U/ μL) 2 μL

oC trong 2h và đ

53

Sau đó ủ ở 22 4ể ở  oC qua đêm

ả ế ủ ẩ ị 3.2.6. Chu n b  E.coli ch ng X1 Blue kh  bi n

ả ế ượ ế ẩ ị T  bào E.coli X1Blue kh  bi n đ c chu n b  theo An và cs. (1988)

ướ ấ ườ ể ỏ ở ẩ  Nuôi c y vi khu n trong 5 ml môi tr ng LB l ng, đ  qua đêm nhi ệ ộ  t đ B c 1:

ủ ấ 370C trong t ắ  nuôi c y có l c (250 rpm).

ướ ể ị ườ Chuy n 2 ml d ch vi khu n ẩ ở ướ  b c 1 sang 50 ml môi tr ự   ỏ ng LB l ng đ ng B c 2:

0C) cho t

ọ ị ứ ở Ủ ủ ấ ớ trong l đ nh m c 500 ml. trong t ắ  nuôi c y có l c (250 rpm / 37 i khi m t đ ậ ộ

ạ quang OD600 đ t 0,5 ­ 1,0.

ướ ể ằ ả ạ ẩ ộ Làm l nh vi khu n b ng đ  bình trong đá kho ng 5 phút. Cho toàn b  dung B c 3:

ứ ẩ ớ ố ộ ị d ch ch a vi khu n ly tâm v i t c đ  3000 g trong vòng 5 phút ở 0C.  4

ướ ạ ỏ ị ế ị ủ ủ ặ ẩ    Lo i b  d ch trên t a (dùng pipes hút h t d ch trên t a). Hoà c n vi khu n B c 4:

2 100 mM đã đ

ị ượ ướ ố ứ ớ v i 1 ml dung d ch CaCl ạ c làm l nh tr c trong đá. Sau đó phân ph i c  0,1

ạ ẩ ị ượ ướ ml d ch vi khu n thì cho vào 1 tube Eppendorf lo i 1,5 ml đ ạ c làm l nh tr c trong đá. Hoá

0C.

ả ế ẩ ả ả ủ ạ đông vi khu n kh  bi n và b o qu n trong t l nh sâu ­ 80

ễ ạ ế ả ế bào vi khu n ằ   ẩ E.coli  kh  bi n b ng

ố ươ ế 3.2.7. Bi n n p c u trúc xâm nhi m vào t ng pháp s c nhi ấ ệ t ph

oC ) cho lên khay đá v nụ

ở ủ ứ ầ ấ ­ Đ u tiên l y tube ch a XL1–Blue compentent cell (  t ­80

ể ể ấ đ  tan đông trong 20 – 30 phút (đ  trong box c y).

oC, chu n b  4 đĩa LB đ c. ị

ủ ầ ặ ệ ộ ẩ ặ ắ ­ Cho máy l c vào trong t m và đ t nhi t đ  37

ặ ẩ ướ ­ Cho 150 μL vi khu n dã đông vào tube 1.5 ml đã đ t trên đá tr ả   c đó. Cho 10 μL s n

ẩ ủ ứ ẩ ố ấ ph m n i vào tube ch a vi khu n, trên đá ít nh t 30 phút.

oC trong 1 phút r i đ  trên đá l nh 5 phút, spin nh . ẹ

ồ ể ạ ố ­ S c nhi ệ ở t 42

oC

ắ ỗ ­ Thêm 600 μL SOC vào m i tube, nuôi l c 1 gi ờ ở 37

ạ ỏ ị ủ ể ạ ­ Ly tâm 3­5 phút, lo i b  d ch trên t a đ  l i 100 μL.

ấ ẩ ị C y d ch vi khu n trên đĩa LB agar + Kanamycin  + Tetracylin .

oC trong t

54

ở ủ ẩ ạ ể ọ ­ Nuôi qua đêm 37 ố  binder, ki m tra s  khu n l c m c.

ẩ ạ ả ứ ọ ể ườ 3.2.8. Ph n  ng PCR ki m tra các khu n l c m c trên môi tr ọ ọ ng ch n l c

ấ ừ ẩ ạ ọ ườ ứ ạ ỏ Nuôi c y t ng khu n l c m c trong 3 ml môi tr ng LB l ng (ch a hai lo i kháng sinh) ở

ử ặ ẩ ẩ ắ 37  oC, l c 250 vòng/ phút qua đêm. Ly tâm d ch vi khu n sau đó r a c n vi khu n hai l n ầ   ị

oC

ướ ướ ể ẩ ủ ằ b ng n c vô trùng. Hút 50 μL n ặ c vô trùng và hòa tan c n vi khu n và đ  trong t ­20

ấ ả ướ ề ả ẩ ị ấ ít nh t 30 phút. L y tube ra th  vào n c sôi 10 phút, đ o đ u tube và đem d ch vi khu n đi

ạ ch y PCR

ế 3.2.9. Tinh chi t plasmid

ượ ế ừ ế ẩ ậ ỹ ế DNA   plasmid   đ c   chi t   t t vi   khu n   theo   k   thu t   chi ủ   t   plasmid   (miniprep)   c a

Sambrook và cs. (1989).

ướ ấ ấ ị ườ ứ ỏ ẩ   L y 1,5 ml d ch vi khu n nuôi c y trong môi tr ng LB l ng ch a kháng B c 1:

ạ ỗ sinh cho vào m i tube Eppendorf lo i 1,5 ml.

ướ ở ạ ỏ ị ể ắ ể ẩ Ly tâm 3 phút ặ  máy ly tâm đ  bàn đ  l ng c n vi khu n. Lo i b  d ch trong B c 2:

ể ặ đ  nguyên c n trong tube.

ướ ặ ạ ướ ế ẩ ị Cho ti p 1,5 ml d ch vi khu n vào tube và l p l i b c 2. B c 3:

ướ ạ ỏ ị ể ắ ể ặ ẩ ặ Ly tâm 3 phút đ  l ng c n vi khu n, lo i b  d ch trong đ  nguyên c n trong B c 4:

ế ị ể ả ủ tube. Dùng pipes hút h t d ch trên t a. Đ  tube trên đá kho ng 3 phút.

ướ ị ượ ể ạ ế Cho 100 μl dung d ch I đã đ c đ  l nh trên đá vào tube. Cho ti p   2 μl B c 5:

ể ẩ ố ị RNAse A (dung d ch g c 10 mg/mL). Votex đ  hòa tan vi khu n.

ướ ị ế ủ ể ầ ị Cho 200 μl dung d ch II vào tube (c n ki m tra xem SDS có b  k t t a không B c 6:

ể ầ ấ ị ầ ế n u có c n làm  m dung d ch đ  hoà tan SDS). Ở ướ  b ộ c này không c n tr n tube và ph i đ ả ể

ượ ể ị ễ ị ế ở ồ tube trên đá và không đ c đ  d ch tan quá 2 phút vì plasmid d  b  bi n tính ộ ề    n ng đ  ki m

ướ ướ ế ả cao. B c này là b ỷ c phá hu  vách t bào gi i phóng DNA genom và DNA plasmid nên

ấ ầ ở ị d ch tan tr  nên r t nh y.

ướ ể ạ ướ ề ằ ộ ị  Cho 150 μl dung d ch III đã đ  l nh tr ắ   c trên đá vào tube, tr n đ u b ng l c B c 7:

55

ề ầ ướ ộ tube nhi u l n. Đây là b c trung hoà, toàn b  protein và DNA genom (vì có kích th ướ ớ   c l n)

ướ ẫ ỏ ị ẽ ị ế ủ s  b  k t t a còn DNA plasmid (vì có kích th c nh ) nên v n hoà tan trong dung d ch. Đ ể

ả tube trên đá kho ng 3 phút.

ướ ể ế ủ ể ị ị Ly tâm dung d ch 5 phút đ  k t t a prtein và DNA genomic. Chuy n d ch B c 8:

ạ ỏ ứ ủ ả ớ ộ ặ   trên t a (kho ng 400 μl) có ch a DNA plasmid sang m t tube m i, lo i b  tube cũ và c n

bên trong tube.

ướ ể ộ ươ ươ ả Cho m t th  tích t ng đ ộ   ng (kho ng 400 μl) isopropanol vào tube. Tr n B c 9:

ề ầ ể ằ ả ở ệ ộ ả ướ ề đ u b ng đ o tube nhi u l n. Đ  tube nhi t đ  phòng kho ng 5 phút. Trong b c này

ế ủ ẽ isopropanol s  làm k t t a DNA plasmid.

ướ ể ế ủ ạ ỏ ị Ly tâm 5 phút đ  k t t a DNA plasmid. Lo i b  d ch trong gi ữ ạ ặ   i c n l B c 10:

ể ắ ấ ả ị ố ướ DNA plasmid. Ly tâm nhanh đ  l ng t t c  d ch bám trên thành tube xu ng d i và dùng

ế ị pipes hút h t d ch

ướ ể ử ặ ạ ỏ ồ ồ ướ Cho 500 μl c n 70 % vào tube đ  r a c n, lo i b  c n (trong b ử   c này r a B c 11:

ề ầ ố ể ạ ỏ ế ồ ổ ế ồ ỏ ồ c n càng nhi u l n càng t t). Đ  lo i b  h t c n ra kh i tube, thì sau khi đ  h t c n ra ly

ể ắ ắ ả ấ ả ồ ố ướ tâm ng n kho ng vài giây đ  l ng t t c  c n bám trên thành tube xu ng d i và dùng pipes

ế ồ hút h t c n.

ướ ể ả ặ Đ  khô c n DNA trong không khí kho ng 30 phút. B c 12:

2O vô trùng ho c đ m TE (pH = 8).

ướ ệ ặ ặ ớ Hoà c n DNA plasmid v i 50 μl dd H B c 13:

0C.

ị ờ ể ượ ặ ả ả ứ ả ở D ch DNA bây gi có th  đ c dùng cho các ph n  ng enzyme ho c b o qu n ­20

ả ế ẩ ẩ ị 3.2.10. Chu n b  vi khu n A. tumefaciens kh  bi n (competent cells)

ế ả ế ượ ẩ ị T  bào A. tumefaciens kh  bi n đ c chu n b  theo An và cs. (1988)

ướ ấ ườ ể ỏ ở ẩ  Nuôi c y vi khu n trong 5 ml môi tr ng LB l ng, đ  qua đêm nhi ệ ộ  t đ B c 1:

ủ ấ 28 oC trong t ắ  nuôi c y có l c (250 rpm).

ướ ể ị ườ Chuy n 2 ml d ch vi khu n ẩ ở ướ  b c 1 sang 50 ml môi tr ự   ỏ ng LB l ng đ ng B c 2:

oC) cho t

ọ ị ứ ở Ủ ủ ấ ớ trong l đ nh m c 500 ml. trong t ắ  nuôi c y có l c (250 rpm / 28 i khi m t đ ậ ộ

56

ạ quang OD600 đ t 0,5 ­ 1,0.

ướ ể ằ ả ạ ẩ ộ Làm l nh vi khu n b ng đ  bình trong đá kho ng 5 phút. Cho toàn b  dung B c 3:

ứ ẩ ớ ố ộ ị d ch ch a vi khu n ly tâm v i t c đ  3000 g trong vòng 5 phút ở oC.  4

ướ ạ ỏ ị ế ị ủ ủ ặ ẩ    Lo i b  d ch trên t a (dùng pipes hút h t d ch trên t a). Hoà c n vi khu n B c 4:

ị ượ ướ ố ứ ớ v i 1 ml dung d ch CaCl2 20 mM đã đ ạ c làm l nh tr c trong đá. Sau đó phân ph i c  0,1

ạ ẩ ị ượ ướ ml d ch vi khu n thì cho vào 1 tube Eppendorf lo i 1,5 ml đ ạ c làm l nh tr c trong đá. Hoá

oC.

ả ế ẩ ả ả ủ ạ đông vi khu n kh  bi n và b o qu n trong t l nh sâu – 80

ạ ấ ễ ế ế 3.2.11. Bi n n p c u trúc xâm nhi m vào t bào vi khu n ẩ A. tumefaciens  khả

bi nế

ừ ượ ễ ấ ế ế ẩ Các c u trúc xâm nhi m v a đ c thi ế ế ượ t k  đ ạ c bi n n p vào t bào vi khu n kh ả

ế ươ ề ệ bi n theo ph ng pháp đông tan (Hofgen & Willmitzer, 1988). Trong đi u ki n phòng thí

oC thay vì b ng nit

ướ ượ ớ ủ ạ ư ằ ơ ỏ ệ nghi m, b c đông tan đ ệ c th c hi n v i t l nh sâu – 80 l ng. Các

ướ ụ ể b c c  th  là:

oC. Đ  vi khu n tan đông trong đá.

ướ ấ ế ừ ủ ạ ể ẩ L y t bào A. tumefaciens t l nh ­ 80 t B c 1:

ướ ỗ ấ ủ ấ ị ế L y 10 μl d ch DNA c a m i c u trúc cho vào tube t ộ   ẩ  bào vi khu n và tr n B c 2:

đ u.ề

oC trong vòng 15

ướ ể ỗ ẩ ợ ị ủ ạ Đ  h n h p d ch vi khu n và DNA vào t l nh sâu – 80 B c 3:

phút.

oC trong vòng 5 phút.

ướ ể ỗ ợ ị ệ ẩ Đ  h n h p d ch vi khu n và DNA vào block nhi t 37 B c 4:

ướ ẩ ị ượ ứ ệ ố Cho d ch vi khu n đã đ c transfomation vào  ng nghi m ch a 1 ml môi B c 5:

oC trong  1gi

ườ ỏ ủ ố ủ ấ ắ ở tr ng LB l ng, ệ   ng nghi m trong t m có l c 28 .ờ

ướ ể ẩ ị Chuy n d ch vi khu n vào tube 1,5 ml. B c 6:

ướ ạ ặ ủ ế ấ ầ ị Ly tâm trong 3 phút, l y ph n d ch trên t a, lo i c n, sau đó cho ti p 100 μl B c 7:

ườ ỏ môi tr ng LB l ng.

ướ ị ượ ấ ườ D ch vi khu n ẩ ở ướ  b c 8 đ c c y trên đĩa môi tr ạ   ng LB ­ agar có 3 lo i B c 8:

57

kháng sinh (Streptomicin 200 μg/mL, rifampicin 34 μg/mL và kanamycin 100 μg/mL).

oC trong vòng 2 ngày. Ki m tra s  hình thành

ướ ự ể Các đĩa petri đ ượ ủ ở c 28 B c 9:

ẩ ạ khu n l c

ướ ọ ượ ẩ ở ỗ ử ấ ộ Dùng tăm nh n đã đ ấ c h p kh  trùng l y m t ít vi khu n ẩ    m i khu n B c 10:

ứ ệ ả ố ườ ỏ ở ạ ồ l c r i th  vào trong  ng nghi m ch a 4 mL môi tr ứ ng LB l ng ch a 3 kháng sinh trên.

oC).

ướ ệ ố ờ ủ ấ ắ Các  ng nghi m đ ượ ủ c 24 gi trong t m có l c (200 rpm / 28 B c 11:

ướ ể ể ưở ủ ườ ặ  Ki m tra đ c đi m sinh tr ẩ ng c a vi khu n trong môi tr ỏ ng LB l ng và B c 12:

ặ ủ ấ ự ể ẩ ằ ế ễ ki m tra s  có m t c a c u trúc xâm nhi m trong vi khu n b ng PCR sau khi chi t DNA

plasmid

ị ự ố ệ ụ ử ề ằ ầ 3.2.12.Xác đ nh trình t gen và x  lý s  li u b ng các ph n m m chuyên d ng

ả ứ ượ ể ế ử ố Ph n  ng sequence đ c chúng tôi g i sang Macrogen (Hàn Qu c) đ  ti n hành gi ả   i

ự ử ụ ẩ ẫ ả ớ ồ ộ trình t các m u.S  d ng 5µl s n ph m c ng v i 5µl m i.

ả ả ế ự ượ ề ầ ằ K t qu  gi i trình t gen đ c phân tích trên máy tính b ng các ph n m m: Ch ngươ

trình BLAST ( NCBI ), BioEdit 7.0.9, DNAstar 7.1 (Lasergene), Vecter NTI Advance 11.5

(Invitrogene), ClustalX 2.0 và Mega 4.0.,  Sequencing Analysis 5.2, Seqscape 2.5 và so sánh

ự ủ ạ ớ ự ớ v i trình t c a đo n DNA v i trình t ẩ  chu n.

ạ ử ụ ễ ậ ỹ 3.2.9. Lây nhi m nhân t o s  d ng k  thu t agroinoculation

ử ụ ự ế ẩ ậ ỹ ị S  d ng k  thu t tiêm tr c ti p d ch vi khu n vào cây (Kheyr­Pour et al., 1991; Navot

ướ ư ự et al., 1991). Các b ệ c th c hi n nh  sau :

ứ ấ ễ ấ ẩ ườ Nuôi c y dòng vi khu n ch a c u trúc xâm nhi m trong 200 ml môi tr ỏ   ng LB l ng

ứ ạ ch a 3 lo i kháng sinh (streptomicin 200  μg/mL, rifampicin 34 μg/mL và kanamycin 100

ủ ẩ ắ ấ ị μg/mL) trong t nuôi c y có l c (250 rpm / 28°C/ 2 ngày). Ly tâm d ch vi khu n (3000G/ 5

ặ ẩ ớ ồ ườ ư ứ ỏ phút ) r i hòa c n vi khu n v i 5 ml môi tr ạ ng LB l ng ch a 3 lo i kháng sinh nh  trên.

ườ ẩ ồ ị Dùng kim tiêm 18 gauge (đ ng kính 1.02362 mm) tiêm d ch vi khu n vào lá, ch i và 4 nách

ỗ ị ứ ế ễ ỗ ợ ẩ   lá ti p theo; m i v  trí tiêm 10 µl. Trong các công th c lây nhi m h n h p, các dòng vi khu n

ể ớ ộ ươ ươ ẽ ượ s  đ c tr n v i th  tích t ng đ ng.

58

ả ệ ễ ượ ự ệ Thí nghi m lây nhi m đ ứ ớ c th c hi n v i các công th c B ng 3.6:

Ố ƯỢ NG

ẩ ễ ứ ấ STT CT1 Đ I T Cà chua

ẩ ứ ấ ễ CT2 Cà chua

ứ ấ ễ ẩ CT3 tớ

ứ ấ ễ ẩ CT4 tớ

ứ ố CT5 CÔNG TH CỨ ủ   Tiêm dòng vi khu n có ch a c u trúc xâm nhi m c a VNP93­5­4 (DNA­A) ủ   Tiêm dòng vi khu n có ch a c u trúc xâm nhi m c a VNP93­5­4 (DNA­A) và VNP93­5­8 (DNA­B) ủ   Tiêm dòng vi khu n có ch a c u trúc xâm nhi m c a VNP93­5­4 (DNA­A) ủ   Tiêm dòng vi khu n có ch a c u trúc xâm nhi m c a VNP93­5­4 (DNA­A) và VNP93­5­8 (DNA­B) Cây đ i ch ng không tiêm Cà chua và tớ

3.2.10. Đánh giá tính gây b nhệ

ị ệ ự ệ ố ướ ề ­ D a vào tri u ch ng ứ cây b  b nh có lá cong xu ng d i vào phía bên trong. V  sau,

ỏ ẹ ế ạ ừ ữ ố lá không có hình d ng, nh  h p, bi n vàng t mép và chóp lá lan vào gi a gân; lá cu n cong

ỏ ẹ ề ế ạ ố lên phía trên thành hình thuy n; lá non bi n vàng m nh, giòn và nh  h p. Cu ng lá có th ể

ỏ ố ề ắ ặ ắ ọ ọ xo n v n. Cây lùn còi c c, m c nhi u cành nhánh nh , đ t thân ng n.

ệ ự ặ ủ

ả ứ ượ ớ ổ ả ứ ự ể ể ự ­ D a vào ph n  ng PCR đ  phát hi n s  có m t c a virus ệ ả ứ Các ph n  ng PCR đ c th c hi n trong tube 0.5 mL v i t ng th  tích ph n  ng 20 μL

ứ ệ ạ ỗ ị ch a 2.0 μL dung d ch đ m PCR X10 (Roche); 0.5 μL dNTPs (10mM m i lo i A, T, G, C,

ồ ặ ệ ạ ỗ ượ ề ươ Roche); 0.5 μL m i lo i m i đ c hi u xuôi dòng và ng c dòng (đ u đ ẩ c chu n b ị ở ồ    n ng

ặ ộ đ  20 μM); 0,5 μL Taq polymerase (Roche) và 0,5 μL khuôn DNA (DNA plasmid ho c DNA

chi ế ừ t t cây).

ả ứ ượ ự ệ ề ệ ớ Ph n  ng PCR đ c th c hi n trên máy PCR PTC­100 (MJ Research Inc.) v i đi u ki n sau:

0C trong 4 phút; ti p theo là 35 chu trình PCR (bi n tính

0C trong

ở ầ ế ở ế ế ở kh i đ u bi n tính 94 94

0C trong 35 giây và t ng h p s i

0C trong 1 phút 30 giây). Ph nả

ồ ở ắ ợ ợ ở ổ 40 giây, g n m i 52 72

0C. S n ph m PCR đ ẩ

ứ ượ ế ớ ở ả ượ ệ ng đ c k t thúc v i 5 phút 72 c đi n di trên gel agarose 1% đ ươ   c

ị ằ ệ ẩ ượ ứ chu n b  b ng đ m TAE X 0.5 và ch a 0.5 mg/mL ethidium bromide. Gel đ ạ c ch y trên

ế ị ệ ớ ệ ở ệ ế thi t b  đi n di là Mini­Sub Cell (Biorad) v i đ m TAE 0.5X đi n th  100 V trong 25 ­ 30

ượ ể ướ ử ượ ằ ả phút. B n gel đ c ki m tra d i ánh sáng t ạ  ngo i và đ ớ   c chup b ng phim Polaroid v i

59

ả máy  nh Polaroid Gel Cam (UK).

IV.

Ậ Ả Ả Ế K T QU  VÀ TH O LU N

IV.1. Nhân dòng và gi

ả ự ộ ộ ẫ ớ i trình t ủ  toàn b  b  gene c a m u virus trên t

ứ ễ ậ ượ Trong năm 2013, Nguy n Đ c Anh (CNSH54B) đã phân l p đ ư   c begomovirus ch a

ượ ệ ở ệ ớ ả ả ự ự ế ừ t ng đ c phát hi n Vi ạ t Nam gây h i trên cây t. Tác gi đã gi i trình t tr c ti p đ ượ   c

ủ ầ ộ ộ m t ph n b  gen c a virus này.

ể ượ ỉ ị ị ạ ủ Vì danh tính và v  trí phân lo i c a begomovirus ch  có th  đ c xác đ nh chính xác

ộ ự ủ ủ ủ ụ ầ ự d a trên toàn b  trình t c a begomovirus nên m c tiêu c a ph n 4.1 c a chúng tôi là gi ả   i

60

ự ộ ộ ủ trình t toàn b  b  gen c avirus này.

ứ

ủ

ệ

ạ

ẫ

ẵ

Hình 4.1. Tri u ch ng c a begomovirus gây h i trên

ớ ạ t t

i Đà N ng (m u VNP93)

ụ ạ ế ồ ủ ấ ồ Chúng tôi ti n hành h i ph c l i ngu n E.coli ch ng XL1 blue mang c u trúc xâm

0C. Sau đó ti n hành ki m tra l

ủ ễ ượ ế ể ạ nhi m c a virus này đ c gi ữ ở ­80 ằ i các clone b ng PCR và

61

ả ứ ắ ph n  ng c t.

ễ IV.2. Lây nhi m nhân t o ạ Chilli Yellow  Leaf Curl Virus  (ChYLCV) nh  viờ

khu n ẩ Agrobacterium tumerfaciens (Agroinoculation)

ụ ươ M c đích và ph ng pháp:

ớ ữ ề ệ ệ ọ ồ Cà chua và ủ   t là nh ng cây tr ng quan tr ng trong n n nông nghi p hi n nay c a

ướ ớ ầ ệ ở ầ ệ n c ta. Chilli yellow leaf curl virus là loài m i l n đ u tiên phát hi n Vi ầ   t Nam và l n

ớ ự ễ ệ ệ ọ ầ đ u tiên trên cây t. Vi c phát hi n ra loài này có ý nghĩa quan trong th c ti n và khoa h c.

ễ ế ấ ạ Sau khi bi n n p thành công c u trúc xâm nhi m c a ủ Chilli Yellow Leaf Curl Virusvào

ế ễ ạ ẩ ờ vi khu n Agrobacterium tumerfaciens thì chúng tôi ti n hành lây nhi m nhân t o nh  vi

ẩ ừ ể ễ ơ khu n Agrobacterium tumerfaciens (Agroinoculation),  t ệ    đó có th  d  dàng h n trong vi c

ọ ủ ư ừ ệ ệ ặ ợ đánh giá tính gây b nh, đ c tr ng sinh h c c a virus này và có bi n pháp phòng tr  phù h p.

0C đ

ễ ả ẩ ượ ụ ồ ằ ứ ấ Các dòng vi khu n ch a c u trúc xâm nhi m b o ­80ở c ph c h i b ng cách

ả ườ ứ ằ ạ ấ c y tr i trên môi tr ng LB agar ch a 3 lo i kháng sinh (rifampicin – gen kháng n m trên b ộ

ằ gen vi khu n ẩ A.tumerfaciens dòng LBA4404; streptomycin – gen kháng n m trên Ti plasmid

ằ ị ư ậ   pAL4404 và kanamycin – gen kháng n m trên vector nh  nguyên pCAMBIA­2300). Nh  v y,

ỉ ế ứ ế ề v   lý   thuy t,   ch   có   t bào   vi   khu n ẩ A.   tumerfaciens  dòng   LBA4404   ch a   Ti   plasmid

ể ố ễ ấ ớ ượ ườ ứ pAL4404 và các c u trúc xâm nhi m m i có th  s ng đ c trên môi tr ạ   ng ch a 3 lo i

ẩ ạ ọ ườ ế kháng sinh trên. Sau khi các khu n l c đã m c trên môi tr ng chúng tôi ti n hành nuôi trong

0C có l c đ  nhân sinh

ườ ạ ổ ỏ ở ệ ộ ắ ể môi tr ng LB l ng có b  xung ba lo i kháng sinh trên nhi t đ  37

ễ ẩ ố ị ẩ kh i vi khu n chu n b  cho lây nhi m.

ẩ ị ượ ắ ượ ỏ ặ D ch vi khu n thu đ c sau khi nuôi l ng, l c đ ẩ   ấ c mang đi li tâm l y c n vi khu n

2  cùng v i 1 µl/ml acetonringone 0.1M giúp kích

ệ ặ ẩ ằ ớ và hòa tan c n vi khu n b ng đ m MgCl

ự ể ẩ ế ủ ẩ ượ ử ụ ể ủ thích s  phát tri n c a vi khu n trong t ị  bào ký ch . D ch vi khu n đ c s  d ng đ  lây

ử ụ ự ế ễ ằ ườ nhi m   b ng   cách   tiêm   tr c   ti p   vào   mô   lá   s   d ng   kim   tiêm   18   gauge   (đ ng   kính

ệ ồ ớ ừ ượ ế ẫ 1.02362mm). Các cây thí nghi m g m cà chua HT7 và t s ng trâu đã đ c bi ả   t m n c m

ệ ể ớ ệ v i b nh đ  thí nghi m.

62

ế ượ ễ ả K t qu  thu đ c sau 15 ngày lây nhi m:

IV.3. Nghiên c u begomovirus trên cà chua và

ứ ề ề ớ ạ t t i mi n Trung và mi n Nam Vi ệ   t

Nam.

IV.3.1. Begomovirs trên

ề ề ệ ớ ạ t t i mi n Trung và mi n Nam Vi t Nam

ế ả ớ ằ ẩ IV.3.1.1. K t qu  chu n đoán begomovirus trên ả ứ t b ng ph n  ng PCR

ụ ẫ ớ ế ể ậ ề Chúng tôi ti n hành ki m tra các m u t thu th p đ ượ ạ c t i mi n Trung và M c đích:

1

ử ụ ả ứ ề ệ ặ ằ ồ mi n Namb ng ph n  ng PCR s  d ng c p m i chung phát hi n begomovirus là BegoA­F

và BegoA­R1

ả B ng 4.2: Các m u ẫ ớ ở ề t mi n Trung

ị ế STT Ký hi uệ

ể   Đ a   đi m, ự   khu   v c   thu m uẫ ả ể K t qu  ki m tra L n 1ầ + VNP624 1 L n 2ầ +

VNP626 2 +

VNP628 Túy Loan – Đà N ngẵ Túy Loan – Đà N ngẵ Túy Loan – Đà N ngẵ 3 + + (m )ờ +

ả ệ VNP635 4 + +

VNP722 5 + +

VNP867 6 ­ ­

VNP868 7 ­ ­

VNP869 8 ­ ­

VNP870 9 ­ ­

VNP871 10 ­ ­

VNP872 11 ­ ­

VNP873 12 ­ ­

VNP874 13 ­ ­

VNP875 14 ­ ­

VNP876 15 ­ ­

VNP877 16 ­ ­

VNP878 17 ­ ­

VNP879 18 ­ ­

VNP880 19 ­ ­

VNP883 20 ­ ­

VNP884 21 ­ ­

63

VNP885 Đi n Bàn – Qu ng Nam Vinh – Ngh  Anệ Túy Loan – Đà N ngẵ Hòa Vang – Đà N ngẵ Hòa Vang – Đà N ngẵ Hòa Vang – Đà N ngẵ Hòa Vang – Đà N ngẵ Hòa Vang – Đà N ngẵ Hòa Vang – Đà N ngẵ Hòa Vang – Đà N ngẵ Hòa Vang – Đà N ngẵ Hòa Vang – Đà N ngẵ Hòa Vang – Đà N ngẵ Hòa Vang – Đà N ngẵ Hòa Vang – Đà N ngẵ Hòa Vang – Đà N ngẵ Hòa Vang – Đà N ngẵ Hòa Vang – Đà N ngẵ Hòa Vang – Đà N ngẵ 22 ­ ­

VNP886 ­ ­ 23

VNP887 ­ ­ 24

VNP888 ­ ­ 25

VNP889 ­ ­ 26

VNP890 ­ ­ 27

VNP891 ­ ­ 28

VNP892 ­ ­ 29

VNP907 + + 30

VNP908 ­ ­ 31

VNP909 ­ ­ 32

VNP910 ­ ­ 33

VNP911 Hòa Vang – Đà N ngẵ Hòa Vang – Đà N ngẵ Hòa Vang – Đà N ngẵ Hòa Vang – Đà N ngẵ Hòa Vang – Đà N ngẵ Hòa Vang – Đà N ngẵ Hòa Vang – Đà N ngẵ Túy Loan – Đà N ngẵ Túy Loan – Đà N ngẵ Túy Loan – Đà N ngẵ Túy Loan – Đà N ngẵ Túy Loan – Đà N ngẵ ­ ­ 34

ả ệ ẫ ớ ở ủ ế ả ẩ ồ ớ ề Hình 4.1: k t qu  đi n di s n ph m PCR v i m i BegoA c a các m u t mi n Trung

Marker  VNP624 VNP626 VNP628 VNP867VNP635 VNP722 VNP907

(ladder: 1kb)

ả B ng 4.3: Các m u ẫ ớ ở ề t mi n Nam

ị ế STT Ký hi uệ

64

ả ể K t qu  ki m tra L n 1ầ L n 2ầ ể   Đ a   đi m, ự khu  v c   thu   m uẫ

VNP313 Châu Thành – An Giang + 1

VNP319 Châu Thành – An Giang + 2

VNP323 Châu Thành – An Giang + + (m )ờ + (m )ờ + (m )ờ 3

ị ỹ VNP641 + 4

VNP646 + + + (m )ờ 5

VNP650 Phú M  ­ Bình Đ nh Phù Cát – Bình Đ nhị Phù Cát – Bình Đ nhị + + 6

VNP673 Châu Thành – An Giang + 7

ồ VNP675 Cao Lãnh – Đ ng Tháp + + (m )ờ + 8

ồ VNP683 Thanh Bình – Đ ng Tháp ­ 9

ồ VNP687 Thanh Bình – Đ ng Tháp + ­ + (m )ờ 10

VNP701 Châu Thành – An Giang + + 11

VNP704 Châu Thành – An Giang ­ ­ 12

ủ ầ ơ VNP717 Bình Th y – C n Th ­ ­ 13

ầ ơ VNP718 + + 14

Ô Môn – C n Th ươ ồ VNP826 Đan D ng – Lâm Đ ng ­ ­ 15

ươ ồ VNP827 Đan D ng – Lâm Đ ng ­ ­ 16

ươ ồ VNP828 Đan D ng – Lâm Đ ng ­ ­ 17

ươ ồ VNP829 Đan D ng – Lâm Đ ng ­ ­ 18

ươ ồ VNP831 Đan D ng – Lâm Đ ng ­ ­ 19

VNP854 Playku – Gia Lai ­ ­ 20

VNP855 Playku – Gia Lai ­ + 21

VNP856 Playku – Gia Lai ­ ­ 22

ả ệ ẫ ớ ủ ế ẩ ả ồ ớ ề Hình 4.2: K t qu  đi n di s n ph m PCR v i m i begoA c a các m u t mi n Nam

M VNP650 VNP683 VNP675 VNP704 VNP831 VNP854 VNP673

65

VNP717 VNP718 (ladder 1kb)

ứ

ủ

ệ

ả

ầ

ơ

Hình 4.3. Tri u ch ng c a begomovirus trên

ớ ạ t t

i Qu ng Nam và C n Th

IV.3.1.2.

ả ể ẫ ớ ử ụ ệ ớ ồ ặ ế K t qu  ki m tra các m u ộ ố ạ   t s  d ng các m i đ c hi u v i m t s  lo i

ượ ệ ạ begomovirus đ c phát hi n t ế i VN tính đ n năm 2013

ụ ươ M c đích và ph ng pháp:

ồ ặ ử ụ ủ ể ế ệ ẫ Chúng tôi ti n hành ki m tra các m u trên s  d ng các m i đ c hi u c a m t s ộ ố

1/R1); TB101(F1/R1); VB65 (F1/R1);

ượ ệ ạ ồ begomovirus đ c phát hi n t i VN bao g mToLCHnV (F

ữ ằ ị TY (F4/R4); To (F4/R4); To100 (F1/R1); TYKa­A (F1/R1)nh m xác đ nh nh ng virus này có

ữ ộ ộ ượ ệ ạ ệ ả ể ế thu c m t trong nh ng virus đã đ c phát hi n t i Vi t Nam hay không. K t qu  ki m tra

ượ ở ả đ c trình bày b ng 4.4.

STT

ID

ả ạ ồ ặ ế ệ ả ớ B ng 4.4: k t qu  ch y v i các m i đ c hi u

ự Khu   v c   thu m uẫ

TYKa­A  (F1/R1) ­

ToLCHnV (F1/R2) ­

TB101 (F1/R1) ­

VB65 (F1/R1) ­

TY (F4/R4) ­

To (F4/R4) ­

To100 (F1/R ­

VNP313 An Giang 1

VNP319 An Giang ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ 2

­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ 3

­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ 4

Đ iố   ngượ t tớ tớ tớ tớ tớ

66

VNP323 An Giang VNP624 Đà N ngẵ VNP626 Đà N ngẵ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ 5

VNP628 Đà N ngẵ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ 6

ả ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ 7

­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ 8

­ ­ ­ ­ ­ ­ + 9

VNP635 Qu ng Nam VNP641 Bình Đ nhị VNP646 Bình Đ nhị VNP650 Bình Đ nhị ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ 10

VNP673 An Giang ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ 11

ồ VNP675 Đ ng Tháp ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ 12

ồ VNP683 Đ ng Tháp ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ 13

ồ VNP687 Đ ng Tháp ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ 14

ồ VNP698 Đ ng Tháp ­ ­ ­ ­ ­ ­ 15

VNP701 An Giang ­ + (m )ờ ­ ­ ­ ­ ­ ­ 16

­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ 17

VNP704 An Giang ơ ầ VNP717 C n Th ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ 18

ơ ầ ­ ­ ­ ­ ­ ­ + 19

­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ 20

VNP718 C n Th VNP722 Ngh  Anệ VNP842 Lâm Đ ngồ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ 21

­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ 22

VNP855 Gia Lai VNP907 Đà N ngẵ tớ tớ tớ tớ tớ tớ tớ tớ tớ tớ tớ tớ tớ tớ tớ tớ tớ tớ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ 23

ừ ế ữ ế ế ề ả ả ậ ầ ộ T  k t qu  trên k t lu n h u h t các virus này đ u không ph i thu c nh ng loài đã

ượ ệ ướ ư ự ữ ể ẫ ừ t ng đ c   phát  hi n  tr c   đây.  Chúng tôi  đ a   ra  d   đoán  nh ng m u  này có th  loài

ể ớ ị ạ ẵ begomovirus m i. Đ  xác đ nh chính xác begomovirus trên t i Đà N ng (ChYLCV) có đúng

ủ ạ ề ề là ch ng begomovirus gây h i trên ớ ạ t t ộ   i mi n Trung và mi n Nam hay không hay là m t

1/R1) và

ớ ế ế ặ ồ ặ ệ ệ loài m i,   chúng tôi thi tk  c p m i  đ c hi u phát hi n ChYLCV làVNP93A(F

ể ệ ớ VNP93/97B (F1/R1) đ  phát hi n loài virus m i này.

ồ ∙         M i xuôi VNP93­A­F: CATGCTAGTAATCCAGTGTATGC (996­1018)

ồ ượ ∙         M i ng c VNP93­A­R: ATCTGCCAACGACGCATATGC (2194­2215)

ướ ả Kích th ẩ c s n ph m: 1,2kb

∙         VNP93/97­B­F: GTGATTCATGTTATACGCCTTCG (1363­1385)

∙         VNP93/97­B­R: TCAATCGCTCTGCCTTCTCTC (2610­2622)

67

ướ ả Kích th ẩ c s n ph m 1,2kb

ả ể ế ả ồ ớ B ng 4.5: K t qu  ki m tra v i m i VNP93A và VNP93/97B

ự ẫ ố ượ ng

STT ID 2 VNP313 Khu v c thu m u An Giang VNP93A (F1/R1) VNP93/97B (F1/R1) ­ ­

VNP319 An Giang ­ ­ 3

­ ­ 4

­ ­ 8

­ ­ 9

VNP323 An Giang VNP624 Đà N ngẵ VNP626 Đà N ngẵ VNP628 Đà N ngẵ ­ ­ 10

ả VNP635 Qu ng Nam + + 11

VNP641 ­ ­ 12

VNP646 ­ ­ 13

VNP650 Bình Đ nhị Bình Đ nhị Bình Đ nhị + + 14

VNP673 An Giang + + 15

ồ VNP675 Đ ng Tháp + + 16

ồ VNP683 Đ ng Tháp ­ ­ 17

ồ VNP687 Đ ng Tháp ­ ­ 18

ồ VNP698 Đ ng Tháp + + 19

VNP701 An Giang ­ ­ 20

­ ­ 21

VNP704 An Giang ơ ầ VNP717 C n Th ­ ­ 22

ầ ơ C n Th ­ ­ 23

VNP718 VNP722 Ngh  Anệ ­ ­ 24

VNP842 Lâm Đ ngồ + ­ 27

­ ­ 29

68

VNP855 Gia Lai VNP907 Đà N ngẵ Đ i t tớ tớ tớ tớ tớ tớ tớ tớ tớ tớ tớ tớ tớ tớ tớ tớ tớ tớ tớ tớ tớ tớ tớ ­ ­ 37

ớ ồ ạ Hình 4.5: K t quế ả đi n diệ ch y PCR v i m i VNP93A

VNP635  VNP650  VNP673  VNP675  VNP698  VNP842  M (ladder 1kb)

ả ệ ế ồ ớ ạ Hình 4.6: k t qu  đi n di ch y PCR v i m i VNP93/97B

M  VNP635  VNP650  VNP673  VNP675  VNP698  VNP842 (ladder 1kb)

ừ ế ẫ ấ ả ồ T  k t qu  trên cho th y các m uthu đ ượ ạ c t i Lâm Đông, An Giang, Đ ng Tháp,

ả ị ươ ứ ệ ặ ồ ớ ỏ Qu ng Nam, Bình Đ nh d ng tính v i 2 c p m i phát hi n ChYLCV, ch ng t loài virus

ữ ị ươ ạ ớ ố ẵ ạ gây h i trên ớ ạ t t i nh ng đ a ph ng trên là gi ng v i loài virus gây h i trên ớ ạ t t i Đà N ng.

ỉ ắ ặ ắ ặ ẫ ớ ồ ồ   ớ Tuy   nhiên   có   m u   VNP842   ch   b t   c p   v i   m i   VNP93A   mà   không   b t   c p   v i   m i

ỏ ề ủ ề ặ ử ủ VNP93B, đi u này đ t ra câu h i v  vài trò c a 2 phân t DNA­A và DNA­B c a virus này

ẽ ượ ứ ệ ể ẫ ả ệ trong quá trình bi u hi n tri u ch ng. C  6 m u này s  đ c chúng tôi nhân dòng và gi ả   i

ự ể ư ế ậ trình t đ  đ a ra k t lu n chính xác.

IV.3.2. Begomovirs trên cà chua t

ạ ề ề ệ i mi n Trung và mi n Nam Vi t Nam

ả ứ ế ả ằ ẩ

IV.3.2.1. K t qu  chu n đoán begomovirus trên cà chua b ng ph n  ng PCR

69

ụ ậ ượ ạ ế ể ẫ ề Chúng tôi ti n hành ki m tra các m u cà chua thu th p đ c t i mi n Trung M c đích:

ử ụ ả ứ ệ ề ằ ồ ặ và mi n Namb ng ph n  ng PCR s  d ng c p m i chung phát hi n begomovirus là BegoA­

ả ượ ế ở ả F1 và BegoA­R1. K t qu  đ c trình bày b ng 4.6.

ả ượ ở ề ẫ B ng 4.6: Các m u cà chua thu đ mi n Trung c

ế ị STT Ký hi uệ ả ể K t qu  ki m tra

ể   Đ a   đi m, ự khu v c thu   m uẫ ễ ệ Di n Châu – Ngh  An L n 2ầ + L n 1ầ + VNP436 1

ễ ệ ­ VNP441 2

Di n Châu – Ngh  An Vinh – Ngh  Anệ ­ + (m )ờ VNP725 3

ễ ệ Di n Châu – Ngh  An + + (m )ờ + VNP727 4

ễ ệ Di n Châu – Ngh  An ­ + VNP893 5

ệ ễ Di n Châu – Ngh  An ­ ­ VNP894 6

ễ ệ Di n Châu – Ngh  An ­ ­ VNP895 7

ệ ễ Di n Châu – Ngh  An ­ ­ VNP896 8

ệ ễ Di n Châu – Ngh  An + + VNP897 9

ệ ễ Di n Châu – Ngh  An ­ ­ VNP898 10

ệ ễ Di n Châu – Ngh  An + + VNP899 11

ễ ệ Di n Châu – Ngh  An + + VNO900 12

ệ ễ Di n Châu – Ngh  An ­ ­ VNP901 13

ệ ễ Di n Châu – Ngh  An ­ ­ VNP902 14

ễ ệ Di n Châu – Ngh  An ­ ­ VNP903 15

ễ ệ Di n Châu – Ngh  An ­ ­ VNP904 16

ễ ệ Di n Châu – Ngh  An + + VNP905 17

70

ệ ễ Di n Châu – Ngh  An ­ ­ VNP906 18

ế ệ ẫ ẩ ả ả ạ ớ ồ ề   Hình 4.7: K t qu  ch y đi n di s n ph m PCR v i m i BegoA các m u   cà chua mi n

Trung

M  VNP425VNP725  VNP727  VNP441  VNP896  VNP899VNP900

VNP906 VNP893 VNP905 (ladder 1kb)

ẫ ả ở ề B ng 4.7: Các m u cà chua thu mi n Nam

ế ị STT Ký hi uệ ả ể K t qu  ki m tra

ể   Đ a   đi m, ự khu v c thu   m uẫ L n 1ầ + L n 2ầ + Long Xuyên – An Giang VNP310 1

Long Xuyên – An Giang ­ ­ VNP326 2

ươ ồ Đan D ng – Lâm Đ ng ­ ­ VNP820 3

ươ ồ Đan D ng – Lâm Đ ng ­ ­ VNP821 4

ươ ồ Đan D ng – Lâm Đ ng + + VNP822 5

ồ ươ ­ ­ VNP823 6

+ + VNP843 7

+ + VNP844 8

­ ­ VNP845 9

­ ­ VNP846 10

­ ­ VNP847 11

Đan D ng – Lâm Đ ng ậ Buôn ma thu t – Đăk Lăk ậ Buôn ma thu t – Đăk Lăk ậ Buôn ma thu t – Đăk Lăk ậ Buôn ma thu t – Đăk Lăk ậ Buôn ma thu t – Đăk Lăk ậ Buôn ma thu t – Đăk Lăk ­ ­ VNP848 12

Playku – Gia Lai ­ ­ VNP857 13

Playku – Gia Lai + + VNP862 14

Playku – Gia Lai ­ ­ VNP863 15

Playku – Gia Lai ­ ­ VNP864 16

71

Playku – Gia Lai ­ ­ VNP865 17

18 VNP866 Playku – Gia Lai ­ ­

ả ạ ệ ế ề ẩ ẫ ả ồ ớ Hình 4.8: K t qu  ch y đi n di s n ph m PCR v i m i BegoA các m u cà chua mi n Nam

M1  VNP901  VNP902  VNP903  VNP822  VNP823VNP843VNP844

VNP845  VNP846  VNP847VNP848  VNP857  VNP863  VNP864  VNP865

VNP866  VNP821  VNP310  VNP326  VNP862  VNP820  VNP895VNP895

VNP896 M2 (ladder 1kb)

ứ ệ ả ả Ph i có  nh tri u ch ng

ồ ặ ả ể ử ụ ớ ệ ế ẫ ộ   4.3.1.2. K t qu  ki m tra các m u cà chua s  d ng các m i đ c hi u v i m t

ượ ệ ạ ố ạ s  lo i begomovirus đ c phát hi n t ế i VN tính đ n năm 2013

ụ ươ M c đích và ph ng pháp:

ồ ặ ử ụ ủ ể ệ ế ẫ Chúng tôi ti n hành ki m tra các m u trên s  d ng các m i đ c hi u c a m t s ộ ố

1/R1);   TB101(F1/R1);   VB65

ượ ệ ạ ồ begomovirus   đ c   phát   hi n   t i   VN   bao   g m   ToLCHnV   (F

ữ ằ ị (F1/R1); TY (F4/R4); To (F4/R4); To100 (F1/R1); TYKa­A (F1/R1)nh m xác đ nh nh ng virus này

ữ ộ ộ ượ ệ ạ ệ ế có thu c m t trong nh ng virus đã đ c phát hi n t i Vi ả ể   t Nam hay không. K t qu  ki m

ượ ở ả tra đ c trình bày b ng 4.8.

72

ả ể ồ ặ ệ ế ặ ả ớ ẫ B ng 4.8: K t qu  ki m tra các m u cà chua v i các c p m i đ c hi u

STT

ID

ự Khu   v c   thu m uẫ

TYKa­A  (F1/R1) ­

ToLCHnV (F1/R2) ­

TB101 (F1/R1) ­

VB65 (F1/R1) ­

TY (F4/R4) ­

To (F4/R4) ­

To100 (F1/R +

Đ iố   ngượ t Cà chua

VNP310 An Giang 1

Cà chua ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ 2

Cà chua ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ 3

Cà chua ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ 4

Cà chua ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ 5

VNP326 An Giang VNP436 Ngh  Anệ VNP441 Ngh  Anệ VNP725 Ngh  Anệ VNP827 Ngh  Anệ Cà chua ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ 6

VNP843 Đăk Lăk Cà chua + (rõ) ­ ­ ­ ­ + ­ 7

VNP857 Gia Lai ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ 8

Cà chua Cà chua + (m )ờ ­ ­ ­ ­ ­ ­ 9

Cà chua ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ 10

Cà chua ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ 11

Cà chua ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ 12

Cà chua ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ 13

VNP862 Gia Lai VNP893 Ngh  Anệ VNP897 Ngh  Anệ VNP899 Ngh  Anệ VNP900 Ngh  Anệ VNP905 Ngh  Anệ Cà chua ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ 14

IV.3.2.2.

1/R1) và VNP93B (F1/R1)

ớ ồ ả ể ế ẫ ể K t qu  ki m tra các m Ki m tra v i m i VNP93A (F

ớ ặ ớ ượ ế ể ẫ ồ Sau đó chúng tôi cũng ti n hành ki m tra các m u này v i c p m i m i đ c thi ế ế t k

ế ả ẫ ả ớ ồ B ng 4.9: K t qu  PCA các m u cà chua v i m i VNP93A và VNP93/97B

ự ố ượ ẫ Đ i t ng

STT ID 1 Khu v c thu m u An Giang VNP93A (F1/R1) VNP93/97B (F1/R1) ­ ­ VNP310 Cà chua

VNP326 Cà chua ­ ­ 2

VNP436 Cà chua ­ ­ 3

VNP441 Cà chua ­ ­ 4

VNP725 Cà chua + ­ 5

VNP827 An Giang Ngh  Anệ Ngh  Anệ Ngh  Anệ Ngh  Anệ Cà chua ­ ­ 6

VNP843 Đăk Lăk Cà chua ­ ­ 7

VNP857 Gia Lai Cà chua ­ ­ 8

VNP862 Cà chua + ­ 9

VNP893 Cà chua ­ ­ 10

73

VNP897 Gia Lai Ngh  Anệ Ngh  Anệ Cà chua + ­ 11

12 VNP899 Cà chua ­ ­

13 VNP900 Cà chua ­ ­

14 VNP905 Ngh  Anệ Ngh  Anệ Ngh  Anệ Cà chua ­ ­

ộ ố ẫ ắ ặ ừ ế ả ấ ồ ớ ắ ặ   T  k t qu  trên cho th y m t s  m u cà chua b t c p v i m i VNP93A mà không b t c p

ố ồ ạ ặ ắ ồ ớ v i m i VNP93B. S  còn l i thì không b t 2 c p m i này.

IV.3.3. Nhân dòng và gi

ả ự ẫ i trình t các m u virus trên ớ t

ẩ ị 4.2.3.1.Chu n b  vector pCAMBIA2300

ượ ử ụ ễ ể ấ ị Vector   nh   nguyên   đ c   s d ng   đ   làm   c u   trúc   xâm   nhi m   là   vector

ượ ạ ệ ể ở pCAMBIA2300 đ c t o ra b i vi n CAMBIA.pCAMBIA­2300 là vector cho chuy n gen

ự ậ ượ ử ụ ố ệ th c v t và đ c s  d ng t t trong thí nghi m agroinoculation.

ơ ồ Hình 4.9.S  đ  vector pCAMBIA2300

oCđ

ạ ượ ả ả ở ủ ượ Vector pCAMBIA2300 d ng khô đ c b o qu n t ­80 c hòa loãng v i n ớ ướ   c

74

ử ụ ế ạ ươ ố ệ ượ ấ ủ và bi n n p vào E.coli ch ng XL1­Blue s  d ng ph ng pháp s c nhi t và đ ả   c c y tr i

ườ ọ ọ ấ ớ trên môi tr ể ng LB v i tetracyline và kanamycine đ  ch c l c các dòng mang c u trúc xâm

nhi m.ễ

oC thì có 200 khu n l c đ n m c trên môi tr

ủ ở ẩ ạ ơ ọ ườ ớ ặ ể Sau khi 18h 37 ặ   ng LB v i đ c đi m đ c

ề ặ ơ ủ ư ữ ề ắ tr ng c a E.coli ( màu tr ng s a, có vi n bao quanh, b  m t tr n).

ẩ ạ ơ ượ ộ ố ỗ ố ể ệ ắ M t s  khu n l c đ n đ ệ   ố c chuy n qua nuôi l c trong  ng nghi m, m i  ng nghi m

ườ ứ ắ ỏ có   5ml   môi   tr ng   LB   l ng   ch a   tetracyline   và   kanamycine,   nuôi   l c   200   rpm.   Sau   đó

ẽ ượ ế ằ plasmid s  đ c tinh chi t b ng Purelink quick plasmid miniprep kit (Invitrogen), m t l ộ ượ   ng

ỏ ả ẽ ượ ẩ ệ ủ ồ ặ ử ụ ể ặ ằ nh  s n ph m minipreps s  đ c ki m tra b ng PCR s  d ng c p m i đ c hi u c a vector

ồ pCAMBIA2300 là m i pCAMseqF1 và pCAMseqR.

0C trong 4

ả ứ ượ ở ầ ự ệ ế ề ệ ớ ở Ph n  ng PCR đ c th c hi n v i đi u ki n sau: kh i đ u bi n tính 94

0C trong 40 giây, g n m i

0C trong 35

ế ế ở ồ ở ắ phút; ti p theo là 35 chu trình PCR (bi n tính 94 50

0C trong 1 phút 30 giây). Ph n  ng đ

ợ ở ợ ổ ả ứ ượ ế ớ giây và t ng h p s i 72 c k t thúc v i 5 phút ở

720C.

ử ụ

ệ

ể

ả

ặ

ẩ

ồ   Hình 4.10. Đi n di s n ph m PCR ki m tra plasmid s  d ng c p m i

pCAMseqF1/R

ượ ế ẽ ượ ể ở Vector pCAMBIA2300 sau khi đ c tinh chi t và ki m tra s  đ ằ   c m  vòng b ng

ằ ượ enzyme Bam HI sau đó desphosphoryl hóa b ng alkaline phosphase và đ ằ   ạ c tinh s ch b ng

75

Purelink PCR purification kit (Invitrogen).

4.2.3.3.

ở ệ ẩ ằ ả Hình 4.11: Đi n di s n ph m khi m  vòng pCAMBIA 2300 b ng BamHI

ả ứ ộ ộ ủ Ph n  ng RCA nhân lên toàn b  b  gen c a virus

ả ứ ế ượ ự ệ ớ Chúng tôi ti n hành ph n  ng RCA đ ẫ c th c hi n v i 6 m u VNP635, VNP650,

ộ ộ ủ ể ạ   VNP673,   VNP675,   VNP698,   VNP842  đ   nhân   toàn   b   b   gen   c a   begomovirus   d ng

ử ể ẩ ả ẩ ả multimer sau đó x  lý s n ph m đ  thu s n ph m 3kb.

ố ư ử ế ệ ẩ ả ắ Sau khi đã t i  u hóa vi c x  lý các s n ph m RCA, chúng tôi ti n hành c t hoàn

ớ ả ế ả ẫ ạ ượ ả toàn 6 m u trên v i c  3 lo i enzyme là BamHI, PstI và E.coRI (k t qu  thu đ c b ng 4.10,

hình 4.12,hình 4.13 và hình 4.14):

ả ướ ả ượ B ng 4.10: kích th ẩ c s n ph m thu đ ắ c sau khi c t

ả ắ ằ ế STT ID K t qu  c t b ng các RE

ể ị Đ a đi m thu m uẫ Bam HI E.co RI PstI

ệ ả ạ VNP 635 Đ i An, Đi n Bàn, Qu ng Nam 2,7 2,7 ; 2,3 ; 0,7 2,7 1

VNP 650 Cát Lâm, Phù Cát, Bình Đ nhị 2,2 ; 0,7 2,7 2,7 2

VNP 673 Hòa An, Châu Thành, An Giang 2,7 2,3 ; 0,5 2,7 3

ồ VNP 675 Hòa An, cao Lãnh, Đ ng Tháp 2,7 2,3 ; 0,5 2,7 4

ầ VNP 698 p   T n   Thu n,   TT   thanh   Bình, 2,7 2,3 ; 0,5 2,7 5

ậ ồ Ấ Thanh Bình, Đ ng Tháp

76

ạ ồ ỹ VNP 842 Th ch M , Lâm Đ ng 2,7 2,3 ; 0,7 2,3 ; 0,5 6

ằ ắ Hình 4.12: C t hoàn toàn ẩ ả s n ph m RCA b ng EcoRI

VNP842 VNP635 VNP650 VNP673 VNP675 VNP698 M (ladder 1kb)

ẩ ằ ắ ả Hình 4.13: C t hoàn toàn s n ph m RCA b ng BamHI

M VNP635 VNP650 VNP673 VNP675 VNP698 VNP842 (ladder 1kb)

77

ả ằ ắ ẩ Hình 4.14: C t hoàn toàn s n ph m RCA b ng PstI

M VNP635 VNP650 VNP673 VNP675 VNP698 VNP842 (ladder 1kb)

ọ ử ụ ừ ế ả ắ ẫ ở ạ T  k t qu  c t hoàn toàn 6 m u b i 3 lo i enzyme chúng tôi ch n s  d ng enzyme

ể ắ BamHI đ  c t hoàn toàn

ạ ấ ủ ễ ế 4.3.2.2. Bi n n p c u trúc xâm nhi m vào E.coli ch ng XL1­Blue kh  bi n ả ế

ắ ạ ằ ẫ ượ ắ C t l i 6 m u trên b ng BamHI thu băng ~3kb, sau đó thì băng 3kb đ c c t ra

ỏ ả kh i b n gel agarose  và tinh chi ế ằ Accuprep gel purification kit (Bioneer) sau đó đ t b ng cượ

ượ ằ ở ố n i vào vector pCAMBIA 2300 đã đ ả   c m  vòng b ng enzyme T4 ligase (Fermentas).S n

ẽ ượ ẩ ố ả ế ế ạ ph m n i sau đó s  đ c bi n n p vào E.coli XL1­Blue kh  bi n.

ả ượ ế ầ ạ ầ ố B ng 4.9: s  clone thu đ c sau l n bi n n p đ u tiên

ố ế ầ M uẫ S  clone thu đ

ượ ạ   c trong l n bi n n p ầ đ u tiên

VNP635 3

VNP650 2

VNP673 3

VNP675 1

VNP698 4

VNP842 5

ượ ệ ế ể Sau khi đã thu đ ủ   c các clone thì chúng tôi ti n hành ki m tra li u đã có genome c a

ượ ư ố ươ ể ể virus đ c n i vào trong vector hay ch a.Có 2 ph ả ứ   ng pháp đ  ki m tra đó là: Ph n  ng

ớ ặ ả ứ ể ả ặ ắ ẩ ồ ố   PCR v i c p m i BegoAFor1 và BegoARev1 ho c là ph n  ng c t ki m tra s n ph m n i

ắ ử ụ s  d ng enzyme c t BamHI.

ấ ả ẽ ượ ạ ẩ ơ ắ ộ ỏ T t   c   khu n   l c   đ n   s   đ ớ   c   nuôi   l c   200   rpm   trong   5ml   LB   l ng   c ng   v i

ế ằ ươ kanamycine   và   tetracycline.Sau   đó   tinh   chi t   plasmid   b ng   ph ng   pháp   minipreps

78

ượ ế ể ả (Sambrook và cs.).Sau khi thu đ ằ   c plasmid chúng tôi ti n hành ki m tra c  14 clones b ng

ể ẩ ắ ắ ả ằ ắ ằ ố cách   c t   b ng   enzyme   Bam   HI   đ   ch c   ch n   r ng   có   s n   ph m   n i   trong   vector

pCAMBIA2300.

ả

ổ ợ

ằ

ể B ng4.10 : Ki m tra vector tái t

h p (miniprep) b ng BamHI

ả ậ ả ế ẩ ố K t lu n s n ph m n i ế   ẫ M u bi n n pạ ắ ằ   ẩ S n ph m c t b ng BamHi Dòng (clone)

ố ả 635­1 4.5 Do n i c  dimer vào vector

ố ả Do n i c  dimer vào vector VPN635 635­2 4.5

ố ả Do n i c  dimer vào vector 635­3 5.0

ố ả 689­1 2.7 Do n i c  dimer vào vector

ố ả Do n i c  dimer vào vector 689­2 5.0

VNP698

Đúng 689­3 2.7

689­4 ­ Do quá trình tinh chi tế

650­1 ­ ự ố T  n i

VNP650

ễ ế 650­2 ­ ạ Nhi m t p/tinh chi t?

673­1 ­ ự ố T  n i

VNP673 673­2 ­ ạ ễ Nhi m t p

ễ 673­3 ­ ạ Nhi m t p/tinh chi ế t

79

­ VNP675 675­1 Do quá trình tinh chi tế

842­1 2.7 Đúng

842­2 2.7 Đúng

VNP842 842­3 2.7 Đúng

842­4 ­ ự ố T  n i

842­5 ­ ự ố T  n i

ắ ằ ộ ố ủ ệ ẩ ả ả ượ Hình 4.14: Hình  nh đi n di s n ph m c t b ng BamHI c a m t s  clone thu đ c sau khi

ế ạ bi n n p và XL1­Blue

M VNP635(1) VNP635(2) VNP635(3) VNP698(1) VNP698(2) VNP698(4)

ộ ố ệ ắ ả ượ ằ ẩ Hình 4.15: Đi n di s n ph m c t m t s  clone thu đ c b ng BamHI

MVNP650(1) VNP650(2) VNP673(1) VNP673(2) VNP673(3) VNP675(1)

80

VNP698(3) VNP842(1) VNP842(2) VNP842(3) VNP842(4) VNP842(5)

ừ ế ế ị ả ọ T  k t qu  trên chúng tôi quy t đ nh ch n 2 clone VNP698( 3) và VNP842(1) đ  gi ể ả   i

ẫ ằ ị trình tự nh m đ nh danh chính xác loài begomovirus trên 2 m u VNP689 và VNP842.

ồ ả ả B ng 4.11: B ng các clone và m i sequencing

STT Mã sequencing ID Clone M iồ

1

13D1ZAB039 VNP698 VNP­698­3 (A) pCAMBIASeqF

2

13D1ZAB040 VNP698 VNP­698­3 (A) pCAMBIASeqR

3

13D1ZAB041 VNP698 VNP­698­3 (A) VNP93­A­F

4

13D1ZAB042 VNP698 VNP­698­3 (A) VNP93­A­R

5

13D1ZAB043 VNP842 VNP­842­1 (A) pCAMBIASeqF

6

13D1ZAB044 VNP842 VNP­842­1 (A) pCAMBIASeqR

7

13D1ZAB045 VNP842 VNP­842­1 (A) VNP93­A­F

8

81

13D1ZAB046 VNP842 VNP­842­1 (A) VNP93­A­R

82

Ả Ệ TÀI LI U THAM KH O

 TÀI LI U TI NG VI T

Ệ Ệ Ế

1. Hà Vi

ế ườ ạ ọ ệ ệ t C ng (2010), B nh cây. NXB Đ i h c Nông nghi p.

2. Hà Vi

ế ườ ệ ọ ệ t C ng (2010), Công ngh  sinh h c trong b nh cây.

3. Hà Vi

ế ườ ạ ọ ệ t C ng (2010), Virus. NXB Đ i h c Nông nghi p.

ệ

ệ

ẩ

ạ

Ch n đoán nhanh b nh h i th c v t,

4. Vũ Tri u Mân (2003),

ự ậ NXB Nông Nghi p.ệ

ươ

ủ

ề

ệ

ệ

ệ

ng T  ch  biên (2001). Giáo trình B nh cây Nông Nghi p. NXB

5. Vũ Tri u Mân – Lê L Nông Nghi p.ệ

ươ

ề

ệ

ẩ

ồ

ạ B nh vi khu n và virus h i cây tr ng. NXB Giáo d c

ệ ng T , Vũ Tri u Mân (1999),

ụ ,

6. Lê L Hà N i.ộ

ị ễ ủ ệ

ả ễ ươ ạ ằ ộ ố  ẩ   ng pháp lây nhi m nhân t o dùng vi khu n

ị 7. Nguy n Th  Hà Uyên (2012). Xác đ nh  và đánh giá kh  năng gây b nh c a m t s begomovirus   trên cây cà chua b ng ph Agrobacterium tumerfaciens.

ầ ộ ố ệ ọ ị c a m t s  virus thu c chi

ặ ư ự ậ ố ử ủ ệ ọ ộ 8. Tr n Ng c Ti p (2010). Xác đ nh và đ c tr ng phân t . Begomovirus (h  Geminiviridae). Báo cáo th c t p t p nghi p, chuyên ngành CNSH

ễ

ứ ề ệ ứ 9. Nguy n Đ c Anh (2012)   ậ đ u xanh và begomovirus trên .Nghiên c u Mungbean yellow mosaic virus (MYMV) trên ớ ạ . t t i mi n Trung Vi t Nam

 TÀI LI U TI NG ANH

Ệ Ế

10.  G.   Argüello­Astorga   and   R.   Ruiz­Medrano   (2001).   An   iteron­related   domain   is  associated to Motif 1 in the replication proteins of geminiviruses: identification of potential  interacting amino acid­base pairs by a comparative approach. Archives of Virology 146(8):  1465.

β

11.  R. Briddon, J. Brown, E. Moriones, J. Stanley, M. Zerbini, X. Zhou and C. Fauquet  (2008). Recommendations for the classification and nomenclature of the DNA­  satellites   of begomoviruses. Archives of virology 153(4): 763.

12.  R.   W.   Briddon   (2003).   Cotton   leaf   curl   disease,   a   multicomponent   begomovirus  complex. Molecular Plant Pathology 4(6): 427.

83

13. S. Chakraborty, P. Pandey, M. Banerjee, G. Kalloo and C. Fauquet (2003). Tomato leaf  curl Gujarat virus, a new begomovirus species causing a severe leaf curl disease of tomato  in Varanasi, India. Phytopathology 93(12): 1485.

14.  C. Fauquet, R. Briddon, J. Brown, E. Moriones, J. Stanley, M. Zerbini and X. Zhou  (2008).   Geminivirus  strain  demarcation  and nomenclature.  Archives   of  virology  153(4):  783.

15.  C. Fauquet and J. Stanley (2005). Revising the way we conceive and name viruses  below   the   species   level:   a   review   of   geminivirus   taxonomy   calls   for   new   standardized  isolate descriptors. Archives of virology 150(10): 2151.

16. P. T. Ferreira, T. O. Lemos, T. Nagata and A. K. Inoue­Nagata (2008). One­step cloning  approach for construction of agroinfectious begomovirus clones. J Virol Methods  147(2):  351.

17. R. Fujii, M. Kitaoka and K. Hayashi (2006). Error­prone rolling circle amplification: the  simplest random mutagenesis protocol. Nature protocols 1(5): 2493.

18.  Y. Gafni and B. L. Epel (2002). The role of host and viral proteins in intra­and inter­ cellular trafficking of geminiviruses. Physiological and Molecular Plant Pathology  60(5):  231.

19.  M. Ghanim, S. Morin and H. Czosnek (2001). Rate of Tomato yellow leaf curl virus  translocation in the circulative transmission pathway of its vector, the whitefly Bemisia  tabaci. Phytopathology 91(2): 188.

20.  (2001). Molecular characterization of begomoviruses associated with leafcurl diseases  of tomato in Bangladesh, Laos, Malaysia, Myanmar, and Vietnam. Plant Disease  85(12):  1286.

21.  C.   Ha,   S.   Coombs,   P.   Revill,   R.   Harding,   M.   Vu   and   J.   Dale   (2008).   Molecular  characterization of begomoviruses and DNA satellites from Vietnam: additional evidence  that   the   New   World   geminiviruses   were   present   in   the   Old   World   prior   to   continental  separation. Journal of General Virology 89(1): 312.

22.  C.   V.   Ha   (2007).   Detection   and   identification   of   potyviruses   and   geminiviruses   in  Vietnam.

23.  D. Haible, S. Kober and H. Jeske (2006). Rolling circle amplification revolutionizes  diagnosis and genomics of geminiviruses. J Virol Methods 135(1): 9.

84

24. B. Harrison, M. Swanson and D. Fargette (2002). Begomovirus coat protein: serology,  variation and functions. Physiological and molecular plant pathology 60(5): 257.

25. T. Hartz, G. Miyao, J. Mickler, M. Le Strange, S. Stoddard, J. Nunez and B. Aegerter  (1997). Processing tomato production in California, UCANR Publications.

26. A. K. Inoue­Nagata, L. C. Albuquerque, W. B. Rocha and T. Nagata (2004). A simple  method for cloning the complete begomovirus genome using the bacteriophage phi29 DNA  polymerase. J Virol Methods 116(2): 209.

27.  D. R. Jones (2003). Plant viruses transmitted by whiteflies. European Journal of Plant  Pathology 109(3): 195.

28.  D.   Knierim   and   E.   Maiss   (2007).   Application   of   Phi29   DNA   polymerase   in  identification and full­length clone inoculation of tomato yellow leaf curl Thailand virus  and tobacco leaf curl Thailand virus. Arch Virol 152(5): 941.

29. P. Markham, I. Bedford, S. Liu, D. Frolich, R. Rosell and J. Brown (1996). transmission  of  geminiviruses  by  biotypes   of  Bemisia  tabaci (Gennadius).  Bemisia:  1995,  taxonomy,  biology, damage, control and management.

30.  E.   Moriones,   S.   García­Andrés   and   J.   Navas­Castillo   (2007).   Recombination   in   the  TYLCV   complex:   a   mechanism   to   increase   genetic   diversity.   Implications   for   plant  resistance development. Tomato Yellow Leaf Curl Virus Disease, Springer: 119.

31. E. Moriones and J. Navas­Castillo (2000). Tomato yellow leaf curl virus, an emerging  virus complex causing epidemics worldwide. Virus Research 71(1): 123.

32.  M.   Padidam,   S.   Sawyer   and   C.   M.   Fauquet   (1999).   Possible   emergence   of   new  geminiviruses by frequent recombination. Virology 265(2): 218.

33.  B. Picó, M. J. Díez and F. Nuez (1996). Viral diseases causing the greatest economic  losses   to   the   tomato   crop.   II.   The   Tomato   yellow   leaf   curl   virus—a   review.   Scientia  Horticulturae 67(3): 151.

34.  S.   Ribeiro,   A.   Inoue‐Nagata,   J.   Daniels   and   A.   DeÁvila   (2006).   Potato   deforming  mosaic disease is caused by an isolate of Tomato yellow vein streak virus. Plant Pathology  55(4): 569.

35.  E. Rybicki (1994). A phylogenetic and evolutionary justification for three genera of  Geminiviridae. Archives of Virology 139(1­2): 49.

85

36. K. Sarkar and K. Kulshreshtha (1978). Crotalaria striata DC. a new natural host of bean  common mosaic virus. Current Science 47(7).

37.    R.   Tice,   E.   Agurell,   D.   Anderson,   B.   Burlinson,   A.   Hartmann,   H.   Kobayashi,   Y.  Miyamae, E. Rojas, J. Ryu and Y. Sasaki (2000). Single cell gel/comet assay: guidelines for  in vitro and in vivo genetic toxicology testing. Environmental and molecular mutagenesis  35(3): 206.

38. A. VARMA and V. Malathi (2003). Emerging geminivirus problems: a serious threat to  crop production. Annals of Applied Biology 142(2): 145.

39. C. Y. Wu, Y. C. Lai, N. S. Lin, Y. H. Hsu, H. T. Tsai, J. Y. Liao and C. C. Hu (2008). A  simplified   method   of   constructing   infectious   clones   of   begomovirus   employing   limited  restriction enzyme digestion of products of rolling circle amplification. J Virol Methods  147(2): 355.

40. P. S. Wyant, D. Gotthardt, B. Schafer, B. Krenz and H. Jeske (2011). The genomes of  four novel begomoviruses and a new Sida  micrantha mosaic virus  strain from Bolivian  weeds. Arch Virol 156(2): 347.

  CÁC TRANG WEB

41.  H. Zhang, G. Hu and X. Zhou (2010). Molecular characterization of Tomato leaf curl  Hainan   virus,   a   new   begomovirus,   and   evidence   for   recombination.   Journal   of  Phytopathology 158(11‐12): 829.

http://www.avrdc.org

http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html

http://wcrc.confex.com

http://www.informaworld.com

http://www.ncbi.nlm.nih.gov

86

http://www.rothamsted.bbsrc.ac.uk

Ụ Ụ PH  L C

Ph  l c 1 ụ ụ : Các môi tr ngườ

(cid:0) Môi tr

ườ ng LB­agar: Trypton (10 g/L), yest extract (5 g/L), NaCl (5 g/L) và agar (15 g/L).

0C trong

ầ ượ ướ ấ ườ ượ ấ ở Các thành ph n đ c hòa trong n c c t và môi tr ng đ ử c h p kh  trùng 121

0C r i rót vào đĩa petri đ

ể ườ ả ộ ồ ươ 30 phút. Đ  môi tr ng ngu i kho ng 55 ng kính 9 cm. Các kháng

ế ượ ổ ướ ườ ầ sinh c n thi c b  sung tr t đ c khi rót môi tr ng ra đĩa petri.

(cid:0) Môi tr

ườ ỏ ượ ị ư ố ớ ẩ ườ ế ng LB l ng: đ c chu n b  nh  đ i v i môi tr ư ng LB­agar nh ng thi u agar.

ố ệ ị ụ ụ Ph  l c 2: Các dung d ch g c và đ m

(cid:0) ượ EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) 0,5 M, pH = 8.  EDTA đ c hòa trong n ướ ấ   c c t

ượ ể ả ớ ỉ ị ượ ấ ử và pH đ c ch nh v i NaOH tinh th  ( kho ng 2g / 100 mL). Dung d ch đ c h p kh  trùng

0C trong vòng 30 phút. Chú ý: EDTA s  không tan cho t

ẽ ớ 121ở i khi PH 8.≈

(cid:0) ề ướ ấ ằ ỉ Tris ­ HCl 1M, pH = 8. Hòa Tris base (Tris ki m) trong n c c t và ch nh pH b ng HCl

0C trong vòng 30 phút.

ả ị ượ ấ ở ặ đ c (kho ng 4,2 mL /100 mL). Dung d ch đ ử c h p kh  trùng 121

(cid:0) ướ ấ SDS (sodium dodecyl sulfate) 20 %. Hòa SDS trong n c c t.

87

(cid:0) ướ ấ NaOH 1 M. Hòa NaOH trong n c c t.

(cid:0) ệ ị ượ ị ừ ị TE, pH = 8. Tris­Cl 10 mM và EDTA 1 mM. Dung d ch đ m đ ẩ c chu n b  t dung d ch

0C trong vòng 30

ượ ấ ở EDTA 0,5 M (pH = 8) và Tris­Cl 10 mM (pH = 8) đ ử c h p kh  trùng 121

ả ả ủ ạ ườ phút và b o qu n trong t l nh th ng

(cid:0) ứ ệ ặ ậ TAE (X1): 10 mM Tris­acetate ch a 0.5 mM EDTA (pH = 7.8 ). Đ m đ m đ c (5X) đ ượ   c

ị ừ ẩ chu n b  t Tris base (24,2 g/L), acid acetic băng (5.71 mL/L) và EDTA 0.5 M pH = 8 (10

0C trong vòng 30 phút và b o qu n trong t

ệ ượ ấ ở ả ả mL / L). Đ m đ ử c h p kh  trùng 121 ủ ạ    l nh

ườ ượ ử ụ ể ạ ệ th ệ ng. Đ m đ c s  d ng đ  ch y đi n di gel agarose.

ự ộ ộ ủ ụ ụ Ph  l c 3: Trình t toàn b  b  gen c a VNP93, VNP698, VNP842

>VNP93­A­cg

ACCGGATGGCCGCGATTTTTTTTTAACGTGGTCCCCGCACGCATGCCCGTCCAATC

ACAGCCATTCCTCAAAGCTTATTTATGCAGTGGTCCCCCTATATAACTTAGTCTCCA

AGTACCCACATCAAAACATGTGGGATCCTTTACTAAACGAGTTTCCTGAAACCGTG

CATGGTTTTAGGTGTATGTTAGCTATTAAGTATTTGCAACAAGTAGAAAATACATA

CTCTCCCGATACATTAGGCTACGACCTAATACGTGATCTCATCTTGGTGATTCGTGC

TAGGGATTATGGCGAAGCGTCCCGCAGATATAGTCATTTCCACACCCGCCTCGAAG

GTTCGTCGCCGTCTGAACTTCGACAGCCCATATCTCAGCCGTGTTGCTGCCCCCACT

GTCCTCGTCACAAACAAAAAGAGGTCATGGGCCAATCGGCCCATGTACAGAAAGC

CCAGGATATACAGGATGTACAAAAGCCCTGATGTTCCTCGGGGGTGTGAAGGCCC

ATGTAAGGTCCAGTCCTATGAACAACGGCATGATGTAGCCCATGTAGGTAAGGTA

ATATGTGTCTCTGATGTCACTCGAGGTAATGGGCTGACACATCGTGTTGGTAAGAG

GTTCTGTATCAAGTCTGTCTATGTACTGGGCAAAATCTGGATGGATGAGAATATTA

AGACGAAGAACCATACCAATACTGTCATGTTCTTTTTAGTTCGTGATAGGAGACCA

88

TTTGGCACGCCACAGGATTTTGGTCAAGTGTTCAACATGTATGATAATGAGCCCAG

TACTGCCACTGTGAAGAACGACAACAGAGATCGATTCCAAGTTCTTCGTCGTTTTC

AGGCAACTGTGACAGGTGGTCAATATGCAAGCAAGGAACAAGCCATAGTTAGGAA

ATTTATGAAGGTCAACAATCATGTGACCTACAACCATCAAGAAGCTGCGAAGTAT

GACAATCACACGGAGAATGCTCTTTTATTGTATATGGCATGTACTCATGCTAGTAA

TCCAGTGTATGCGACCTTGAAGATCAGAATCTATTTCTATGATTCAGTTCAAAATT

AATAAATATTAAATTTTATTATATCCGAAAGATGAGCATCAATTGTGCCCTCAAGT

ACATTGTACAATACATGTCGAATTGCCCGAATTACATTGTTGATACTAATCACTCCT

AAATGGTCTAAATACTTTATACATTGGTATTTAAATACTCGTAAGAAACGCGAGGT

CTGAGGACGTAAACGAGTCCAGATTTGGCAGATTAGGTAGCATTGGTGTAGTCCCA

ACACTCTCCTCAGGTTGTAGTTGAACTGGATCTGTACTGTGATGATGTCGTGGTTCA

TCATGAATGGTCTCTCGCGGTGGTGGGTTATTTTGAAATATAGGGGATTGTTGACC

ATCCAGATATATACGCCATTCTCTGCCTGAGCTGCAGTGATGCGTTCCCCTGTGCGT

GAATCCATGGTTGTGGCAACCTAGAGCGACGAAATACGAACAACCACAAGGGAGA

TCAACTCTTCTCCTTCTATTGGTCTTCTTGGCGATTCGGTGTTGCACCTTGATAGGT

ACCTGAGTAGAGTGGGCCTTGGAGGGTGATGAAGATTGCATTCTTCACAGCCCAAT

TTTTAAGTGCGGTGTTCTTTTCTTCCTGCAAGAACTCTTTATAACTGGAATGTGG

TCCTGGATTGCAGAGGAAGATAGTGGGAATTCCCCCTTTAATTTGAACTGGTCGCC

CGTACTTGGTGTTGCTTTGCCAGTCTCTTTGGGCCCCCATAAACTCTTTAAAGTGCT

TTAAGTAATGCGGATCGACGTCATCAATGACGTTATACCAAGCAGCATTACTGTAC

ACTTTTGGACTTAAGTCTAAATGACCACATAAGTAGTTATGTGGTCCCAATGATCT

GGCCCACATTGTCTTCCCCGTACGACTACCGCCCTCTACCACTATGCTTATCGGTCT

TATTGGCCGCGCAGCGGCAGCACTCACATTCGCAGAAACCCACTCTTCAAGTTCTT

CTGGAACTTGATCGAAAGAAGAAGACAAAAAAGGACAAACAAAAACCTCTAAAG

GAGGTGTAAAAATCCTATCTAAATTACTACTTAAATTATGAAACTGTAAAACAAAA

TCTTTGGGAGCCTTCTCCTTTAATATATTGAGGGCCGCTGCTTTGGACCCTGAATTG

ATTGCCTCGGCATATGCGTCGTTGGCAGATCGGCAACCTCCTCTAGCTGATCTTC

CATCGATCTGGAAAACTCCATGATCAAGCACGTCTCCGTCTTTTTCCATGTATGCTT

89

TAACATCTGAAGAGCTCTTAGCTCCCTGAATGTTCGGATGGAAATGTGCTGACCTG

CTTGGAGAGTTGAGATCGAAGAATCGGTTGTTTTGGCACTTGAATTTGCCTTCGAA

CTGGATGAGGACATGCAGGTGAGGAGACCCATCTTCGTGTAGCTCCCTGCAAATAC

GTATGAATAATTTATTAGTCGGGGTTGATAAGCCTGAGATTTGGGAAAGTGCCTCT

TCTTTAGTAAGGGAGCAGTGTGGATAAGTGAGGAAATAATTCTTGGCATTTATTAA

AAATTTTCTGGGCGGAGGCATATTGACTGGTCAATCAGGTCCTCTCAAACTTGGCT

ATGCAATCGGGGAATGGGTCCTTACTTATAGTTGAGGACCTAAATGGCATTATTGT

AATTTCTTAAAGAAATTCAAATTCCAAAAGCGGCCATCCGTATAATATT

>VNP93­B­cg

ACCGGATGGCCGCGATTTTTTTTTAACGTGGTCCCCGCACGCGTTTGTGACATTTTC

CTCATTTTGAACAATCGCATCCATTGAATCTGAACACGTGTTACGATCTTAAGGCA

GGAATGTTTCCATGTCTGTTTCTATATATTTGTCCTATGTATTTCCTCACTCATTTGT

AACTAAAAATGAGAGTTCCAATCCGGAGGATTTCAGGCTTCAATTCTGACCGTCGT

CCTTTCAATGGCTCAATCCACCGTTGGAACTACCCATATTCCAGCTATTTTGGGAG

GAGGATTGGCAACCGTGTATACGGCATGCCATTCGGAAACCAACAAGGTCAACGA

CGTGAGTGTAAGCAAACTCAACGTCTTACCAAGACTGTTGAGCAAGTTGCATCTAG

GAGGAAGTGTATGAAGACGGTTGAGGAAATTCATGATGGTACTGACTACTTGCTGT

GCAGTAACACGTCTAAGGTGTCGTACATTAGCTACCCGCCTCTATCCGGCACTGAA

TATGGTAGCAGAGCGGAATCCTATATCAAAGTCTTGGGAGTCACTGTATCTGGGTC

TGCGGTGCTGAAGCAGACAGGCATGCGTGAAGCAGATGGGTCTCAAGGAATTCAT

GGGATATTTACCACAGTAATCGTTCGTGACAAGAGACCATGTCAGTTCTCTGCCGT

GGATCCTATTATCCCACTTGCGGAGCTGTTTGGACAAGAGAAGAGAGCATGCTCCT

CATTACGTGTTAGAGAGTCTTATAAGAATCGATTTAGTGTTGTCTACCAGAAGAAA

CATGTAGTAAATAGTGCTCTGTCAACACATGTATTTAGGTATAATTTCAACGTTAA

ATTCTCTAGGTTTCCTTTCTGGGTATCTTTCAAAGACACCTGTAACGCAGATCCTAC

GGGGCGATATTCCAATGTCTCTAAGAACGCATTGATTGTGTATTACGTGTGGCTAT

GTGATTCAAATGTAACAGCCGAAGTGCACGTACAATATGATTTGAACTACATTGGA

90

TAAATAAAATTATATTTTTTTTACATTTGAGGATACATTACTCCCCTCCATACATAG

TTCAACAGTTTTTTTAATAATATTAATTACATCTTCATTCACTTTGTTGCTACCTGCA

ATAACCTCTGACGCCGAAGGGCCTGGATCTAGAGTTGCATCTTGTAGCTGATGCAA

ATGTCTATATGGGTGCTCTTCCATTTCATTGTTCCCCACGGTGCTGGCCGAAGCCCA

AGTAAGCCCTTGTGGAATGGCATTTGTAGTGTATCTGGAAGACTGTGACCTCATTT

GTGTTAGGGCTTGCACTGGTTTTCGTGATACAGTTGATTGAGGCACATGCCAGAAA

TCGATGTGATTCATGTTATACGCCTTCGATAGTATTTCAATCTTAGGGGACTTAAAT

GTTATTTCCGAGGACTGTTTTGCAGAGGACATTTTTAACTTTCCTTGCATCCTGCAG

AAGTGAACACCATTGATCACGTTAGTGTCGTCCACCCGGTACAGCACCCTCCATGG

GTTTGGGTCTTTGGGGGAGAAGTATGAGGATGAGTAGTAGTGTATATTGCAGTTGC

ACCCTATGGGTATTGTGAACTCAGCCTGCTTGGAGTCCCCTTCGAGCAACCTTGTG

TCGTGCATCTCTATGACCACATGGCCAGTTGCATTTCCAGGAACTTGGTTCCTGTAT

TGGAGGATTACGTGGTCAATCCTGAGACACTTTCCTAAAAGCATCGATAATTTTTG

GTCGACAGTTGATGGAAACAACAGAGTTACCTCTGTCTTTTCATTTGACAGCTGAA

ACTCAGTCCTAGCCGACGTCGTATAGGCAATATTGTTATTGCTGGATTCCATTATTG

AGTAAGCCATTAAAATAATAGTAATTCATCTTTTATAGACTTTTCAGAGTCTGTCA

GGATAGTGGAATGTGACTATTTGGGTCGTTGCCTTTAAATTCCACTATCTCAAAGC

ACCAGTGAGCGAAGTCCACGTATGTACTTGTACTGACAAGAGATAAGGTATATACT

TGGATGTGGTTCAGCCACGTCGCATAGTCGAAAATGGAAGACATCTGTCTTCCACT

AAATATTTTTGATATGTTTCGAAGTGTATTAATTTAATTAACAAGTAAATTAAACGT

TAGAAATAAATATATGTACTTCAGTACCACAAGTTAGGCGCTAATCTGGACAAGAT

ATTTGGCTCACCGAAAGAATTATTGGTTAAGCCTTATGAGTTGTCGTGTAATCGAC

AACCTAAACTAATATTTAACTGATCCAACAATCTAATTATGAGAAAACACACACAC

TTGAACATACTAATCTTGAGAAAATCAGGCCGCGCAGCGGCTATGTCCCCAAATTA

TTAAGTAATCCAGAAGTGCGAACCCCAATTTATTATATTCAAATCGAAAAGGACTT

ATATGTAATCTGTATCAGTTGAAGGTATTTAGTAGCTGTAGCTAATATTATTAAAG

TTAACAACATTAATGCAATATAATTATTGCATATTTGAAGAAAATAGGGTGAATTA

AAGTTTTAGAGAGAGAAAGTCTAGAGAGAAGGCAGAGCGATTGACCAGTCAATTA

91

GGTCCTCTCAAACTTGGCTATGCAATCGGGGAATGGGTCCTTACTTATAGTTGAGG

ACCTAAATGGCATTATTGTAATTTCTTAAAGAAATTCAAATTCCAAAAGCGGCCAT

CCGTATAATATT

>VNP698­A­cg

ACCGGATGGCCGCGATTTTTTTTCAAGTGGTCCCCGCACGCATGCCTGTCCAATCCT

GGCCACTCCTCAAAGCTTAATTATTTATGTGGTCCCCTATATAACTTAGTCTCCAAG

TACCCACATCAAAACATGTGGGATCCTTTACTAAACGAGTTTCCTGAAACCGTACA

TGGTTTTAGGTGTATGTTAGCTATTAAGTATTTGCAAGTAGTAGAAAATACATACT

CTCCCGATACACTAGGCTACGATCTAATACGTGATCTTATCCTGGTGATTCGTGCTA

GGGATTATGGCGAAGCGTCCCGCAGATATAGTCATTTCCACTCCCGCCTCGAAGGT

TCGTCGCCGTCTGAACTTCGACAGCCCATATCTCAGCCGTGCTGCTGCCCCCACTGT

CCTCGTCACAAACAAAAAGAGGTCGTGGGCCAATCGGCCCATGTACAGAAAGCCC

AGGATATACAGGATGTACAAAAGCCCTGATGTTCCGCGGGGCTGTGAAGGCCCAT

GTAAGGTCCAGTCCTATGAACAACGTCATGACGTAGCCCATGTAGGTAAGGTAA

TTTGTGTTTCAGATGTCACCCGAGGTAATGGGCTCACACATCGTGTTGGTAAGAGG

TTCTGTATCAAGTCCGTGTATGTGTTGGGCAAAATCTGGATGGATGAGAATATCAA

GACAAAGAACCATACTAATACGGTCATGTTCTTCTTAGTTCGTGATAGGAGACCAT

TTGGCACGCCACAGGATTTTGGGCAGGTGTTCAACATGTATGATAATGAGCCTAGT

ACTGCCACTGTGAAGAACGACAATAGAGATCGATTCCAAGTCCTTCGTCGTTTTCA

GGCAACTGTGACAGGTGGTCAATATGCAAGCAAGGAGCAAGCCATAGTTAGGAAA

TTCATGAAGGTGAACAACCATGTGACCTACAACCATCAAGAAGCTGCGAAGTATG

ACAACCACACGGAGAATGCCCTTTTATTGTATATGGCATGTACGCATGCCAGTAAT

CCAGTGTATGCGACCTTGAAGATCAGAATCTATTTCTATGATTCGGTTCAAAATTA

ATAAATATTGAATTTTATTATATCCGAAAGATGAGCATCTATTGTGCCCTCAAGTA

CATTGTACAATACATGTCTAATTGCTCTAATAACATTGTTGATGCTAATAACTCCTA

AACGGTCTAAATACTTTATACATTGGTATCTAAATACTCTTAAGAAACGCAAGGTC

TGAGGACGTAAACGAGTCCAGATTTGGCAGATTAGATGTCCCAACGCTTTCCTCAG

GTTGTAGTTGAACCGGATCTGCACTGTGATTATGTCGTGGTTCATCATGAATGGTCT

92

CTCGCGGTGGTGGGTTATGTTGAAATAGAGGGGATTGTTGACCGTCCAGATATACA

CGCCATTCTCTGCCTGAGCTGCAGTGATGCGTTCCCCTGTGCGTGAATCCATGGTTG

TGGCAACCTAGAGCGACGAAGTACGAACAACCACAAGGGAGATCAATTCTTCTCC

TTCTATTGGTCTTCTTGGCGATTCGGTGTTGCACCTTGATTGGTACCTGAGTAGAGT

GGGCCTTGGAGGGTGACGAAGATTGCATTCTTTAAAGCCCAATGTTTTAGTGCGGT

GTTCTTTTCCTCTTCCAAGAACTCTTTATAGCTGGAATGTGGTCCTGGATTGCAGAG

GAAGATAGTTGGAATCCCGCCTTTAATTTGGACCGGTTTCCCGTACTTGGTGTTGCT

TTGCCAGTCTCTTTGGGCCCCCATGAACTCTTTAAAGTGCTTTAGATAATGCGGATC

GACGTCATCAATGACGTTATACCAAGCAGCATTATTGAACACTTTAGGACTTAAGT

CTAAATGCCCACATAAGTAGTTATGTGGGCCCAACGACCTGGCCCACATTGTCTTC

CCTGTACGACTATCGCCCTCTAACACAATGCTTATCGGTCTTAATGGCCGCGCAGC

GGCACTAACAACGTTTCCGGCAACCCATTCATCAAGTTCCTCGGGAACTTGGTCAA

AAGAAGAAGACGAAAAAGGACAAACAAAAACCTCTAAAGGAGGTGCAAAAATCC

TATCTAAATTACTATGTAAATTATGAAACTGTAAAACAAAATCTTTGGGGGCCTTC

TCCTTTAATATATTGAGGGCCTCTGCTTTGGACCCTGAATTGATTGCCTCGGCATAT

GCGTCGTTGGCAGATCGGCAACCTCCTCTAGCTGATCTGCCATCGATCTGGAAAAC

TCCATGATCAAGCACGTCTCCGTCTTTCTCCATGTATGCTTTAACATCTGAAGAGCT

CTTAGCTCCCTGAATGTTTGGATGGAAATGTGCTGACCTGGTTGGGGATCTGAGGT

CGAAGAACCTTTGATTTTTGCATTGGAATTTACCTTGGAATTGGATGAGGACATGC

AAGTGAGGAGTCCCATCTTCGTGCAATTCCCTGCAAATCCTGATAAACAGTTTATT

TGTTGGTGTTTCTATGGCTTGAATTTGGGAAAGGGCCTCTTCTTTTGTGAGAGAGCA

GTGTGGGTATGTGAGGAAATAGTTTTTAGCATTTATTCTGAATTTGTTTGGAGGAG

CCATTGACCGGTCAATCGGTGTCTCTCAACTTGGGCTATGTAATTGGTGTCTGGGG

TCTTATTTATATGGAGACCCTAAATGGCATTATTGTAATTTCTTAAAGAAATTCAAA

TTCCAAAAGCGGCCATCCGTATAATATT

93

>VNP842

ACCGGATGGCCGCGATTTTTTTTACATGGTCCCCACCACTAACAAATGTTCTCCACT

TAGAACGCTCCCTCAAAGCCTATTTAATTCAAATCCATTATATATACTTGGTCCCCA

AGTACTCACTTTAAAATATGTGGGATCCTTTACTGAATGAGTTTCCCGAAACCGTA

CACGGTTTTAGGTGTATGTTAGCGATTAAATATTTGCAATTAGTAGAAAATACATA

CTCTCCTGATACATTAGGGTACGATTTGCTTCGTGATTTAATTTCAGTTATTCGTGC

TAAGGACTATGTCGAAGCGTCCCGCAGATATAGTCATTTCCACTCCCGCATCCAAG

GTGCGTCGCCGGCTGAATTTCGACAGCCCGTATGCCAGCCGTGCTGCTGCCCCCAC

TGTCCTCGTCACAAACAAAAGGAGGTCATGGGTGAATCGGCCCATGTACCGAAAG

CCCAGGATGTACAGAATGTACAAAAGCCCTGATGTTCCTCGAGGATGTGAAGGCC

CATGTAAGGTTCAGTCCTATGAACAGCGTCATGATGTAGCGCACGTAGGTAAAGT

CATTTGTGTGTCTGATGTTACTCGTGGTAACGGGTTGACTCATCGAGTGGGAAAGA

GGTTTTGTGTTAAGTCTGTTTATGTTTTGGGCAAGATATGGATGGATGAGAACATT

AAGACCAAGAATCACACTAATACTGTGATGTTTTTTTTAGTGCGTGATAGGAGACC

ATTTGGGACTCCACAGGATTTTGGTCAGGTGTTTAACATGTATGATAACGAGCCAA

GTACAGCCACGGTGAAGAACGACAACAGAGATCGCTTTCAAGTTCTACGGCGTTTT

CAGGCTACTGTTACTGGTGGTCAGTATGCAAGTAAGGAGCAAGCAATAGTTAGGA

AGTTTATGAAGGTGAACAACCATGTGACGTATAATCATCAAGAAGCTGCGAAGTA

TGACAATCACACAGAGAATGCTCTTTTGTTGTATATGGCATGTACTCATGCTAGTA

ATCCTGTGTATGCTACTTTGAAAATCAGAATCTATTTCTATGATTCTGTTCAGAATT

AATAAAGATTGAATTTTATTATATTTGAATGTGTTACATATTCTGTTTTTTCCAATA

CATCCCATAATACATGATCACATGCTCTAATTACATTGTTAATACTAATTACACCCA

AATTATCTAAATATTTCATACATTGAACCCTAAATACTCTTAAGAAACGCCAAGTC

TGAGGACGTAAACGAGTCCAGATCTGGAAGATTAGAAAACATTGGTGTATTCCCA

ACGCTTTCCTCAGGTTGTAATTGAATTGGACTTGTATTGTGATGATGTCGTTGTTCA

TCAGAAATGGTCTCTCGTCGTGGCTGATTATCTTGAAATATAGGGGATTTTTGACC

GTCCAGATATATACGCCACTCTCTGCTTGAGTTGCAGTGATAGCTTCCCCTGTGCG

AGAATCCATGATTGTGACAGCCTAGTGCAATGAAGTATGAACAACCACAAGGGAG

94

ATCAACTCTCCGTCTCCTCGTTGCTTTCTTGGCGTTGCGGTGTTGCACTTTGATAGG

AACCTGAGTAGAGTGCGCCTTGGAGGGTGACGAAGATCGCATTTTTTATTGCCCAG

TTTTTAAGTGCGCTGTTTTTATCTTCGTCCAAGAATTCTTTATAGCTTGAATTGG

GGCCGGGATTGCAGAGGAAGATAGTGGGAATTCCCCCTTTAATTTGAACGGGTTTT

CCGTACTTTGTGTTGCTTTGCCAGTCCCTTTGGGCCCCCATGAATTCTTTAAAATGC

TTTAGGTAGTGCGGATCAACGTCATCAATGACGTTGTACCAGGCATCATTATTGTA

TACCTTCGGACTCAAATCAAGATGACCACACAAATAATTATGTGGTCCTAATGACC

TAGCCCACATCGTCTTTCCCGTCCGACTATCGCCTTCGATAACTATACTTATCGGTC

TTAAAGGCCGCGCAGCGGCACTGACAACGTTCTCTGCAGCCCACTCTTCGAGTTCC

TCTGGAACTCGATCAAACGAAGAAGAAGAAAAAGGCGAAACATAAACCTCCATTG

GAGGAGTAAAAATCCTATCTAAATTATTATTTAAATTATGAAACTGTAAAACATAA

TCTTTAGGTGCCTTTTCCCTTAGTATATTGAGGGCCGAAGCTTTGGACCCTGAATTG

ATTGCCTCGGCATATGCGTCGTTGGCAGATTGGCAACCTCCTCTAGCCGATCTT

CCATCGATCTGGAAAAGTCCATGATCAAGCACGTCTCCGTCTTTGTCCATATAGGA

CTTGACATCTGTTGAGCTTTTAGCTGCCTGAATGTTCGGATGGAAATGTGCTGACCT

GCTTGGGGATATGAGATCGAAGAATCTTTGGTTTTTACATTGGAATTTCCCTTCGA

ATTGGATGAGAACATGCAGGTGAGGAGTTCCATCTTCGTGGAATTCTCTGCAGATG

CGGATAAATAGTTTATTTACTGGGGTTTCTAGGTTTTTAAGTTGGGAAAGTGCTTCT

TCTTTAGTGAGAGAGCAGTGTGGATATGTGAGGAAATAATTTTTGGCATTTATTCT

GAATTTATTAGGAGGAGCCATTGACTGGTCAATCGGTGTCTCATAAACTTGGCTAT

GCAATTGGTGTCTGGTGTCTTATTTATATGTGGACACCAAATGGCATTATCGTAATT

95

CCCAAAAGAAATTCAAAATTCAAATTGGTAAAGCGGCCATCCGTATAATATT