báo cáo y học: "Nghiên cứu chế tạo bộ xét nghiệm elisa phát hiện nọc của bốn loài rắn độc thường gặp ở việt nam và ứng dụng chẩn đoán rắn độc cắn trên mô hình thực nghiệm"

Nghiên cứu chế tạo bộ xét nghiệm elisa phát hiện

nọc của bốn loài rắn độc thường gặp ở việt nam và

ứng dụng chẩn đoán rắn độc cắn trên mô hình thực

nghiệm

Đỗ Khắc Đại*

Đỗ Minh Trung*

Nguyễn Đặng Dũng*

Lê Văn Đông

Tóm tắt

Lần đầu tiên tại Việt Nam chúng tôi đã chế tạo

thành công bộ kít ELISA phát hiện được nọc của

bốn loài rắn độc thường gây tai nạn rắn cắn tại Việt

Nam: Lục xanh (Trimeresurus albolabris), Chàm

quạp (Calloselasma rhodostoma), Hổ đất (Naja

kaouthia) và Hổ chúa (Ophiophagus hannah). Xét

nghiệm có khả năng phát hiện nọc độc trong các loại

dịch sinh học khác nhau bao gồm máu toàn phần,

huyết thanh, huyến tương, nước tiểu và dung dịch

đệm với độ nhạy đạt mức nanogram. Trên mô hình

gây nhiễm độc nọc rắn thực nghiệm, xét nghiệm có

khả năng phát hiện nọc độc trong 20/20 (100%) số

mẫu máu chuột gây độc với liều 2 LD50 và 15/20

(75%) số mẫu máu chuột gây độc với liều 0,5 LD50

nọc độc của các loài rắn nghiên cứu. Không thấy có

phản ứng dương tính giả xuất hiện ở cả 5/5 mẫu

chứng âm. Kết quả cho thấy bộ xét nghiệm có khả

năng phát hiện nọc độc ở các đối tượng có nhiễm

nọc độc toàn thân và tại chỗ, có thể đem ra ứng dụng

thử nghiệm với các mẫu bệnh phẩm lấy từ người bị

rắn cắn.

* Từ khoá: Rắn độc cắn; Xét nghiệm ELISA; Kít

phát hiện nọc rắn.

Development of ELISA for detection of venoms of

the four common venomous snakes in vietnam

and application in experimental snakebite

diagnosis

Do Khac Dai

Do Minh Trung

Nguyen Dang Dung

Le Van Dong

SUMMARY

We have successfully, for the first time in Vietnam,

developed a snake venom detection kit for the

identification of venoms of the four common

venomous snakes in Vietnam viz. Green pit Viver

(Trimeresurus albolabris), Malayan pit Viper

(Calloselasma rhodostoma), common Cobra (Naja

kaouthia) and king Cobra (Ophiophagus hannah).

The kit can detect snake venom in different sample

types including whole blood, serum, plasma, urine

and sample buffer with the sensitivity of nanogram

levels. In the experimental envenoming model, the

kit can detect venom in 20/20 blood samples taken

from animal injected with 2 LD50 of the venoms;

15/20 blood samples taken from animal injected with

0.5 LD50 of the venoms; none of 5 negative control

show fault positive results. These data show that this

venom detection kit can detect venoms in

systemically as well as locally envenomed animals,

and can be potential in testing with snakebite human

samples.

* Key words: Snakebite; ELISA; Snake venom

detection kit.

* Học viện Quân y

Phản biện khoa học: TS. Hoàng Công Minh

vừa để ngăn ngừa các tổn Đặt Vấn đề

thương do nọc độc làm Rắn cắn là một tai nạn

ảnh hưởng đến chức thường gặp ở các nước

năng lao động và thẩm vùng nhiệt đới, tập trung

mỹ của nạn nhân sống ở các đối tượng bắt và

sót sau tai nạn [2, 10]. nuôi rắn, nông dân, công

nhân lâm trường, bộ đội ở nước ta, theo thống

thực hành huấn luyện và kê của Bệnh viện Chợ

tác chiến trong điều kiện Rẫy, Thành phố Hồ Chí

dã ngoại... Đây là một Minh, hàng năm có

cấp cứu cần phải được khoảng 600 - 1000 nạn

xử trí kịp thời, vừa để nhân bị rắn cắn đến cấp

cứu tính mạng nạn nhân, cứu và điều trị, trong đó

hay gặp nhất là: Lục xanh tại Bệnh viện Bạch Mai,

(Trimeresurus albolabris), Bệnh viện Chợ Rẫy,

Chàm quạp Bệnh viện Nhi đồng 1

(Calloselasma Thành phố Hồ Chí Minh,

rhodostoma), Hổ đất Khoa Cấp cứu rắn độc

(Naja kaouthia) và Hổ cắn thuộc Trại rắn Đồng

chúa (Ophiophagus Tâm, Quân khu 9. Tuy

hannah) [3, 4]. Hiện nay, nhiên, điều quan trọng

các cơ sở trong nước như trong cấp cứu và điều trị

Trung tâm chống độc cho những bệnh nhân bị

Quốc gia và Viện Vắcxin rắn độc cắn, đặc biệt là

Nha Trang, đã và đang khi dùng huyết thanh

tiến hành chế tạo các loại kháng nọc rắn đơn giá, là

huyết thanh kháng nọc cần xác định chính xác

rắn đơn giá chống lại nọc loài rắn đã cắn bệnh nhân

độc của từng loài rắn độc để xử trí cấp cứu đúng

kể trên và đang áp dụng cách và sử dụng đúng

vào điều trị trên lâm sàng loại kháng huyết thanh.

Xuất phát từ những vấn 1. Đối tượng và vật

đề nêu trên, chúng tôi liệu nghiên cứu.

tiến hành nghiên cứu này Bốn loại huyết thanh

nhằm mục tiêu: kháng nọc rắn đơn giá

- Nghiên cứu chế tạo của bốn loài rắn độc

bộ xét nghiệm ELISA gồm: Lục xanh, Chàm

phát hiện nọc của bốn quạp, Hổ đất và Hổ chúa

loài rắn độc thường gặp được chế tạo và xác định

ở Việt Nam. hiệu giá trong nghiên cứu

trước [1]. - Đánh giá khả năng

phát hiện nọc rắn độc ở Các hóa chất, sinh

mô hình gây độc thực phẩm bao gồm: kít tách

nghiệm trên động vật. chiết IgG bằng phương

pháp sắc ký ái lực với

protein A và kít định Đối tượng và phương

lượng protein bằng pháp nghiên cứu

phương pháp đo màu

(Bio-Rad, Hoa Kỳ); hạt phối chính thức cung

sepharose 4B hoạt hóa cấp.

bằng CNBr của hãng Chuột nhắt trắng (45

Armersham (Thụy con) khoẻ mạnh, trọng

Điển); các hóa chất lượng từ 18 - 22 gam do

DSMO, biotin-N- Ban cung cấp động vật

hydroxy- succinimide thí nghiệm, Học viện

ester, phức hợp avidin- Quân y cung cấp.

enzym peroxidase, cơ 2. Phương pháp

chất o- nghiên cứu.

phenylenediamine

* Tinh chế kháng thể:

(OPD), cơ chất

Kháng thể đặc hiệu với tetramethylbenzidine

nọc rắn của từng loài rắn (TMB) của hãng Sigma

được tách chiết và tinh (Hoa Kỳ). Các hóa chất

sạch từ huyết thanh thỏ thông thường còn lại đến

gây miễn dịch theo qui đạt tiêu chuẩn chất lượng

trình tinh chế 3 bước phân tích do nhà phân

phối hợp sắc ký ái lực phân tử kháng thể phản

với sắc ký miễn dịch: 1) ứng chéo giữa các loài

tách chiết IgG từ huyết rắn bằng phương pháp

thanh thỏ bằng sắc ký ái hấp phụ miễn dịch:

lực với cột protein A; 2) kháng thể kháng nọc rắn

tách chiết IgG đặc hiệu thu được ở bước 2 cho

nọc rắn từ chế phẩm IgG chạy lần lượt qua các cột

tổng số bằng sắc ký miễn chứa kháng nguyên nọc

dịch với cột kháng rắn của 3 loài còn lại.

nguyên protein nọc rắn: Sản phẩm thu được sau

dung dịch kháng thể IgG hấp phụ miễn dịch được

thu được từ huyết thanh coi là kháng thể đặc hiệu

thỏ (gây miễn dịch với loài rắn. Kiểm tra hoạt

từng kháng nguyên nọc tính của kháng thể thu

rắn) cho chạy qua cột sắc được sau tinh chế và khả

ký miễn dịch chứa kháng năng phản ứng chéo của

nguyên nọc rắn tương chế phẩm kháng thể đặc

ứng; và 3) loại bỏ các

hiệu loài bằng phương

pháp ELISA gián tiếp biotin được bảo quản ở - 200C đến khi sử dụng.

[1]. * Xét nghiệm ELISA

* Gắn biotin vào kháng phát hiện nọc rắn:

thể: Xây dựng xét nghiệm

Trộn dung dịch biotin theo nguyên tắc phản

(biotin-N-hydroxy- ứng ELISA kiểu

succinimide ester, 2 sandwich (hình 1a).

mg/ml trong DMSO) với Giếng gắn kháng thể

dung dịch kháng thể (1,0 được dùng ngay để xét

mg/ml nghiệm phát hiện nọc rắn trong NaHCO3

0,1M, pH = 8,3) theo tỷ hoặc bảo quản ở 4°C

lệ 1:8 về thể tích và ủ ở trong túi nilon gắn kín

nhiệt độ phòng 4 giờ. cho đến khi sử dụng.

Loại bỏ biotin còn dư * Kít ELISA chẩn đoán

bằng phương pháp sắc ký rắn độc cắn:

lọc gel. Kháng thể gắn

Sử dụng phiến ELISA

loại 6 giếng gắn trên các

giá đỡ để tiến hành chế

tạo bộ xét nghiệm. Trong (a)

đó, một giếng B làm

chứng dương, 1 giếng C

làm chứng âm và 4 giếng

còn lại dùng để chẩn

đoán phân biệt 4 loại nọc

độc rắn (hình 1b). Kháng

(b) thể đặc hiệu loài rắn gắn

lên các giếng tương ứng.

Qui trình xét nghiệm như Hình 1: Nguyên lý

sau: phản ứng ELISA (a) và

sơ đồ kit phát hiện nọc

rắn (b).

- Bước 1: chuẩn bị bộ các giếng. ủ 37oC trong

ELISA làm xét nghiệm 15 phút.

gắn trên giá đỡ. - Bước 5: rửa như

bước 3. - Bước 2: cho 100 ml

mẫu thử (máu toàn phần - Bước 6: thêm phức

có chống đông, huyết

tương, huyết thanh, nước hợp enzym avidin-HRP vào mối giếng. ủ 37oC

tiểu...) vào mỗi giếng từ trong 5 phút.

D đến G, hai giếng đối - Bước 7: rửa như

chứng cho dung dịch bước 3.

- Bước 8: thêm cơ

kháng nguyên chuẩn. ủ 37oC trong 15 phút.

chất màu. Mỗi giếng 100

- Bước 3: rửa 5 lần ml cơ chất OPD nồng độ

bằng dung dịch rửa PBS- 0,5 mg/ml có bổ sung

Tween. thêm 0,006% H2O2. Đọc

- Bước 4: đưa kháng kết quả sau 5 phút. Cơ

thể gắn biotin vào tất cả chất từ không màu

chuyển sang màu vàng. chứa nọc rắn tương ứng

Hoặc đo cường độ quang với kháng thể đặc hiệu

học ở bước sóng 450 nm loài rắn đã gắn trên giếng

và phân tích kết quả. đó.

Nhận định kết quả: xét - Có nhiều hơn 1 giếng

nghiệm được coi là có trong 4 giếng (từ D đến

giá trị khi giếng đối G) cho màu vàng hoặc

chứng dương cho màu xanh: giếng nào cho màu

vàng rõ, giếng đối chứng rõ nhất chứa nọc rắn

âm không lên màu hoặc tương ứng với kháng thể

có màu vàng nhạt. Kết đặc hiệu loài đã gắn trên

quả nhận định như sau: giếng đó.

- Chỉ 1 trong 4 giếng - Không có giếng nào

(D đến G) cho màu vàng (từ giếng D đến giếng G)

rõ rệt, còn các giếng khác lên mầu: có 2 khả năng.

không màu hoặc màu + Mẫu xét nghiệm có

nhạt: mẫu xét nghiệm đó nọc độc của 1 trong 4

loài rắn, nhưng nồng độ rắn Lục xanh, Chàm

quá thấp dưới ngưỡng quạp, Hổ đất và Hổ chúa

phát hiện của xét với nồng độ nọc tương

nghiệm. đương với 0,5 LD50 của

mỗi nọc rắn. Từ lô thứ + Mẫu xét nghiệm có

năm đến lô thứ tám tiêm chứa nọc độc của loài rắn

nọc độc tương ứng của nào đó, không thuộc 1

các loài rắn Lục xanh, trong 4 loài rắn đang

Chàm quạp, Hổ đất và nghiên cứu.

Hổ chúa với nồng độ nọc * Gây độc thực nghiệm

tương đương với 2 LD50 chuột nhắt trắng với nọc

của mỗi nọc rắn. Lô thứ rắn:

chín là chứng âm, tiêm

Chuột nhắt trắng được

dung dịch NaCl 0,9%.

chia thành 9 lô, mỗi lô 5

Pha nọc rắn trong NaCl

con. Từ lô thứ nhất đến

0,9% và tiêm vào mặt

lô thứ tư tiêm nọc độc

ngoài đùi sau bên phải

tương ứng của các loài

của chuột. 30 phút sau

khi tiêm, lấy máu chuột, định sự có mặt của nọc

sử dụng máu toàn phần độc.

hoặc huyết tương để xác

Kết quả nghiên cứu và bàn luận

1. Tinh chế kháng thể kháng nọc rắn đặc hiệu

loài rắn.

Kiểm tra tính đặc hiệu của mỗi chế phẩm kháng

thể đặc hiệu với từng loài rắn bằng phương pháp

ELISA. ủ các chế phẩm kháng thể đặc hiệu loài ở

các nồng độ khác nhau với nọc độc của loài rắn đã

dùng gây miễn dịch và nọc độc của các loài rắn còn

lại.

Hình 2: Kết quả đánh giá tính đặc hiệu loài rắn của

các chế phẩm kháng thể.

báo cáo y học: "Nghiên cứu chế tạo bộ xét nghiệm elisa phát hiện nọc của bốn loài rắn độc thường gặp ở việt nam và ứng dụng chẩn đoán rắn độc cắn trên mô hình thực nghiệm"

t¹p chÝ y - d îc häc qu©n sù sè 4-2009

Các chế phẩm kháng thể đặc hiệu loài rắn thu được

phản ứng rất mạnh với nọc độc tương ứng. Tại nồng

độ kháng thể cao trên 100 ng/ml vẫn có hiện tượng

phản ứng chéo cho kết quả dương tính. Tuy nhiên,

với các nồng độ này độ tương phản về mật độ quang

học giữa cặp phản ứng đặc hiệu với phản ứng chéo

rất lớn, cho phép coi các chế phẩm kháng thể thu

được là kháng thể đặc hiệu loài rắn.

2. Độ nhạy của xét nghiệm ELISA và khả năng

phát hiện nọc rắn trong các loại mẫu thử khác

nhau trên in vitro.

Độ nhạy của phản ứng ELISA nhận biết nọc độc

rắn đã được xác định với từng loại dịch cơ thể là máu

toàn phần, huyết tương, huyết thanh, nước tiểu và

dung dịch đệm PBS. Nọc độc với nồng độ được pha

loãng bậc hai trong các mẫu dịch sinh học kể trên của

người khỏe mạnh không bị rắn cắn hoặc pha trong

dung dịch đệm. Mỗi mẫu xét nghiệm tiến hành 3

t¹p chÝ y - d îc häc qu©n sù sè 4-2009

giếng song song (triplicate), sử dụng PBS làm đối

chứng âm. Xác định giá trị giới hạn bằng giá trị trung

bình cộng với 3 lần độ lệch chuẩn (mean + 3SD) của

độ hấp phụ quang từ các mẫu chứng âm.

Hình 3: Đường chuẩn biểu thị tương quan giữa

mật độ quang học của xét nghiệm ELISA nhận

biết nọc độc rắn ở các nồng độ khác nhau pha trong

dung dịch PBS 1%.

Bảng 1: Độ nhạy của phản ứng ELISA phát hiện

nọc của bốn loài rắn trộn trong các loại dịch sinh học

và dung dịch đệm khác nhau.

18

t¹p chÝ y - d îc häc qu©n sù sè 4-2009

Độ nhạy

(ng/ml)

Loại

mẫu

L

C

H

H

ục

hà

ổ

ổ

xa

m

đấ

ch

nh

qu

t

úa

ạp

3,2

3,

1,

1,

Máu

2

6

6

toàn

1,6

phần

0,

0,

0,

0,8

8

8

8

Huyết

1,6

tương

0,

0,

0,

0,