Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu các điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2

Ờ Ả Ơ L I C M  N

ả ơ ể ậ Đ  hoàn thành khóa lu n này, tôi xin chân thành c m  n Ban lãnh

ệ ệ ệ ề ạ ọ ệ   ạ đ o Vi n Công ngh  sinh h c Lâm nghi p đã cho phép và t o đi u ki n

ậ ợ ể ự ậ ạ ả ơ ệ ầ thu n l i đ  tôi th c t p t i Vi n. Tôi xin chân thành c m  n các th y, cô

ệ ệ ề ệ ậ ọ ạ   giáo trong Vi n Công ngh  sinh h c Lâm nghi p đã t n tình truy n đ t

ọ ậ ạ ườ ứ ế ố ớ ố ế ki n th c cho tôi trong su t 4 năm h c t p t i tr ứ   ng. V i v n ki n th c

ượ ề ả ế ọ ỉ đ c ti p thu trong quá trình h c không ch  là n n t ng cho quá trình nghiên

ố ể ệ ướ ứ ề c u đ  tài t t nghi p mà còn là hành trang quý báu đ  tôi b ộ   ờ c vào đ i m t

ữ ắ ự cách v ng ch c và t tin.

ượ ỏ ế ơ ế ắ Tôi xin đ c bày t lòng bi t  n sâu s c đ n TS. Vũ Kim Dung –

ệ ệ ả ậ ị ướ ướ gi ng viên Vi n CNSH Lâm nghi p đã t n tình đ nh h ng và h ẫ   ng d n

ậ ố ố ệ tôi trong su t quá trình hoàn thành khóa lu n t t nghi p.

ệ ố ầ Cu i cùng, tôi xin kính chúc các th y,  cô giáo trong Vi n Công ngh ệ

ệ ọ ườ ạ ọ ứ ệ ồ ỏ sinh h c Lâm nghi p, tr ạ   ng Đ i h c Lâm nghi p luôn d i dào s c kh e, đ t

ộ ố ư ự ề ệ ượ đ ứ   c nhi u thành công trong cu c s ng cũng nh  trong s  nghi p nghiên c u

ả ạ và gi ng d y.

ả ơ Tôi xin chân thành c m  n!

ướ ẫ ự ng d n

ạ ậ Giáo viên h     TS. Vũ Kim Dung ệ         Sinh viên th c hi n          Ph m Nh t Thành

Ụ Ụ M C L C

Ụ Ả DANH M C CÁC B NG

Ụ DANH M C CÁC HÌNH

Ặ Ấ Ề Đ T V N Đ

ề ạ ồ Enzyme   pectinase   bao   g m   nhi u   lo i   enzyme   khácnhaunh ư

ủ polygalacturonase, pectinesterase, pectolyase,… xúc tácth yphân các phân t ử

ạ ả ẩ ầ ượ pectin t o các s n ph m khác nhau. Ban đ u, enzyme này đ ệ   c phát hi n

ị ế ư ạ ạ ặ ố trong các d ch chi t trái cây nh  cà r t, cà chua hay đ i m ch. Đ c bi ệ   t

ả ể ế ủ ọ ườ ệ ph i k  đ n là phát hi n c a nhà khoa h c ng i Italia Enrico Fermi năm

ố ượ ố 1840 trên đ i t ng cà r t.

ớ ọ ượ ử ụ V i vai trò quan tr ng, pectinase đ ộ c s  d ng r ng rãi, đem l ạ ợ   i l i

ự ệ ệ ẩ ớ ẹ   ế ế ích khá l n trong công nghi p ch  bi n th c ph m và công nghi p nh .

ướ ủ ế ậ ừ ự ậ ậ ồ Tr c đây ngu n enzyme ch  y u thu nh n t ộ  th c v t và đ ng v t. Ngày

ườ ứ ồ ừ ậ nay, ng i ta đã nghiên c u tìm ra ngu n enzyme t vi sinh v t phong phú,

ạ ế ổ ậ ủ ộ ặ ể đa d ng và mang l ạ ợ i l i ích kinh t . M t đ c đi m n i b t c a pectinase là

ượ ớ ạ ự ẩ các enzyme này đ c dùng không gi ả   i h n trong th c ph m vì không  nh

ưở ế ứ ỏ ườ ư ể ễ ằ ấ h ng đ n s c kh e con ng i. B ng  u đi m là d  nuôi c y, sinh tr ưở   ng

ể ề ắ ộ ờ ậ   và phát tri n nhanh,cho nhi u enzyme trong m t th i gian ng n, vi sinh v t

ự ủ ệ ầ ấ ọ ớ ố   ả là l a ch n hàng đ u c a các nhà s n su t công nghi p v i mong mu n

ấ ả ự ả ả ấ ấ ấ gi m giá thành, tăng năng su t s n xu t lên cao nh t. S  s n xu t pectinase

ệ ượ ự ệ quy mô công nghi p đ c th c hi n ch  y u t ủ ế ừ Aspergillus niger(Yogesh,

2009).

ủ ề ơ ở ứ ề ệ ụ Trên c  s  đó, m c tiêu c a đ  tài “ Nghiên c u các đi u ki n thích

ợ ổ ợ ầ h p sinh t ng h p pectinase t ừ Aspergillus niger CF2”góp ph n nghiên

ưở ộ ố ế ố ủ ườ ứ ự ả c u s   nh h ng c a m t s  y u t môi tr ệ   ằ ng lên men nh m tăng hi u

ấ ợ ừ ụ ụ ổ su t quá trình lên men sinh t ng h p enzyme pectinase t đó ph c v  nhu

ấ ướ ạ ế ệ ầ ả c u s n xu t trong n c và mang l ị i giá tr  kinh t cho ngành công nghi p.

ƯƠ CH NG 1

Ổ Ứ Ấ Ề T NG QUAN V N Đ  NGHIÊN C U

ổ ề 1.1. T ng quan v  enzyme pectinase

ơ ấ 1.1.1. C  ch t pectin

ấ ợ ử ạ ẳ Pectin là h p ch t cao phân t m ch th ng, đ ượ ấ ạ ừ c c u t o t các acid

ồ ằ galacturonic b ng liên k t ế (cid:0) ­1,4 glucoside. Tùy ngu n pectin khác nhau mà

ố ượ ử pectin có kh i l ng phân t 80.000 (cid:0) 200.000 Da.

ướ ề ị Pectin tan trong n c ammoniac, dung d ch ki m, carbonatte natri,

glycerine nóng.

ự ị ị ể Các pectin t nhiên đ nh v  trong thành ph n ầ c a  ủ t ế bào có th  liên

ấ ể ạ ế ớ các c u trúc polysaccharide  k t v i và protein đ  t o thành các protopectin

ể ủ không tan. Chúng ta có th  phân h y các protopectin không tan trong t ế bào

thành các pectin tan trong n c ướ b ng ằ cách đun nóng pectin trong môi tr ngườ

ậ ạ ớ acid, vì v y các pectin ồ tan này không đ ng d ng v inhau.

ự ậ ồ ạ ướ Trong th c v t, pectin t n t i d ạ i ba d ng:

ủ ự

­ Pectin hòa tan: là ester methylic c a polygalacturonic acid, trong t

ủ ả ố ượ nhiên có kho ng 2/3 s  nhóm carboxyl c a polygalacturonic acid đ c ester

ằ ượ ẽ ạ ặ hóa b ng methanol. Pectin đ c ester hóa cao s  t o gel đ c trong dung

ị ườ ồ ộ ị d ch acid và trong dung d ch đ ng có n ng đ  65%. Enzyme pectinase tác

ố ượ ấ ợ ử ấ ộ đ ng lên các h p ch t pectin có kh i l ng phân t khác nhau và c u trúc

ơ ả ủ ạ ấ ọ ồ ọ hóa h c không đ ng d ng. C u trúc hóa h c c  b n c a pectin là (cid:0) ­D­

ẳ ạ ơ galacturonan hay (cid:0) ­D­galacturoglycan, m ch th ng có c u t o t ấ ạ ừ các đ n v ị

ế D­galactopyranosyluronic acid (liên k t theo ki u ể (cid:0) ­1,4). M t khác, m c đ ặ ứ ộ

ử oxy hóa trong các phân t polymer này cũng khác nhau, trong đó m t s ộ ố

ấ ị ở ị ộ   nh t đ nh các nhóm carboxyl b  ester hóa b i các nhóm methoxyl. Trong m t

ủ ả ườ ạ ẳ ợ ự ố ườ s  tr ng h p, ch ng h n trong pectin c  c i đ ữ   ng có s  ester hóa gi a

các nhóm carboxyl và các nhóm acetyl.

ầ ộ ỏ

­ Pectin  acid: là  polygalacturonic acid  có  m t  ph n  nh  các  nhóm

ượ ố ủ ằ carboxyl đ c ester hóa b ng methanol. Pectinate là mu i c a pectinic acid.

ả ộ ơ Pectic acid là polygalacturonic acid đã hoàn toàn gi ỏ i phóng kh i m t đ n v ị

ố ủ galacturonic acid. Pectate là mu i c a pectic acid.

ộ ứ ạ ả ướ c và có

­ Protopectin: t o đ  c ng cho qu  xanh, không tan trong n

ứ ạ ọ ử ấ ạ c u t o hóa h c ph c t p. Trong protopectin có các phân t pectin, các phân

2+, Mg2+  các g c phosphoric acid, acetic acid và

ử ố t cellulose và các ion Ca

ườ ị ủ ằ ả đ ng. Protopectin khi b  th y phân b ng acid thì gi i phóng ra pectin hòa

tan.

ệ 1.1.2. H  Enzyme Pectinase

ớ ệ 1.1.2.1. Gi i thi u enzyme pectinase

ự ủ ủ Enzyme pectinase là enzyme xúc tác s  phân h y c a các polymer

ủ ả ẩ pectin   và   s n   ph m   c a   quá   trình   này   là   acid   galacturonic,   galactose,

ượ ứ ụ arabinose, methanol,… đây là nhóm enzyme đ ộ c  ng d ng r ng rãi trong

ỉ ứ ự ủ ệ công nghi p ch  đ ng sau amylase và protease. S  phân h y pectin trong t ự

ườ ữ ả ậ ộ nhiên th ng x y ra khi trái cây chín.Nh ng enzyme này vì v y có m t vai

ế ứ ả ả ọ ả trò h t s c quan tr ng trong quá trình b o qu n trái cây và rau qu .

ử ủ ấ Hình 1.1: C u trúc phân t c a peptin

1.1.2.2. Phân lo iạ

ụ ủ ế ể ơ ạ Enzyme pectinase có th  phân lo i theo c  ch  tác d ng c a chúng

ư ả nh  b ng 1.1.

ự ủ ủ ­ Pectinesterase (PE): xúc tác s  th y phân c a các nhóm methyl

ườ ủ ấ ơ ester.   Enzyme   th ng   t n   công   vào   các   nhóm   ester   methyl   c a   đ n   v ị

ề ơ ằ ắ ị ị galaturonate n m k  đ n v  không b  ester hoá, phân c t các nhóm methoxy

ứ ạ ự ạ ặ    do, t o thành acid pectinic ho c (COOCH3) đ ng c nh các nhóm –COOH t

ồ acid pectic và methanol. Pectinesterase thu đ ượ ừ c t các ngu n khác nhau có

ố ư ườ ượ ạ ở ị giá tr  pH t i  u khác nhau. Pectinesterase th ng đ c ho t hoá b i các

ion Ca2+ và Mg2+.

ả ạ B ng 1.1: Phân lo i enzyme pectinase

3.

ả ứ Enzym(t ngườ ên th Ph n  ng xúc tác 1. STT 2. Enzym (tên  ệ ố ọ g i theo h  th ng) g i)ọ

Pectin­pectinhydrolase pectinesterase 1

ủ ế (cid:0) ­1,4­

2

Endopoly  galacturonase  (endo­PG) Poly­(cid:0) ­1,4  galacturonid­glycano  hydrolase­PG

ộ ậ ự ủ ế (cid:0) ­1,4­

3

Exopoly  galacturonase  (exo­PG) ứ Poly­(cid:0) ­1,4­D­ galacturonidgalacturo n­hydrolase

ủ ế (cid:0) ­1,4­

4

Endopolymetil­ galacturonase  (Endo­PMG) Poly­(cid:0) ­1,4­D­ galacturonidmetilester ­glycanohydrolase

ế (cid:0) ­1,4­

5 (cid:0) ­4,5 Exo­pectatliase  (exo­PKTE) Poly­(cid:0) ­1,4­D­ galacturonid  digalacturonoliase

ộ ậ ự ấ ị

6 ủ

Endopectatlias e (PETE) Poly­(cid:0) ­1,4­D­ galacturonid Pectin + H2O = n metanol +  pectic acid Th y phân liên k t  D­galacturonid trong  galacturonid không theo   nào m t tr t t Th y phân liên k t  D­galacturonid trong pectat,  ớ ự trong galacturonic v i s   ủ ạ đ t m ch c a acid  galacturonic Th y phân liên k t  D­galacturonid trong pectin  ộ ậ ự ấ    nh t không theo m t tr t t ị đ nh. ủ Th y phân liên k t  D­galacturonid trong pectat  ớ ự ạ v i s  t o thành  aciddegalacturonic không   nh t đ nh. theo m t tr t t ế (cid:0) ­1,4­ Th y phân liên k t  D­galacturonid trong pectat,

glicanoliase

ủ nh t đ nh ế (cid:0) ­1,4­

7 ố Endopectinlias e (Endo­PTE) ộ ậ ự ấ    nh t Poly­(cid:0) ­1,4­D­ galacturonid  metylester  glicanoliase ớ ự trong galacturonic v i s   ố ạ t o thành n i đôi không  ộ ậ ự ấ ị theo m t tr t t Th y phân liên k t  D­galacturonid trong pectin  ớ ự ạ v i s  t o thành n i đôi  không theo m t tr t t đ nhị

ọ

­ Polygalacturonase   (PG):  còn   có   tên   g i   khác   là   poly   1,4­

ự ắ ố galacturoniglucanohydrolase,   xúc   tác   s   phân   c t   các   m i   liên   k t ế (cid:0) ­1,4­

glycoside. Các exo­PG (exo­poly  (cid:0) ­1,4­D­galacturonide) galacturonohydrolase,

ắ ừ ầ ử phân c t t đ u không kh , và endo­PG (endo­ poly (cid:0) ­1,4­D­galacturonide)

ữ ấ ạ ơ ẫ glycanohydrolase   t n   công   ng u   nhiên   vào   gi a   m ch   c ấ     ch t.

ề ấ ử ộ ồ ườ ứ ệ Polygalacturonase là m t ph c h  enzyme g m có nhi u c u t và th ng có

ệ ặ ố ớ ơ ấ tính đ c hi u cao đ i v i c  ch t.

ắ ơ ị ự ­ Pectate lyase (PEL):  xúc tác s  phân c t các đ n v  galacturonate

ả ị không   không   b   ester   hóa.   C   hai   enzyme   exo­PEL   (exo­poly   (1,4­ (cid:0) ­D­

galacturonide)lyase)   và  endo­PEL  (endo­poly  (1,4­(cid:0) ­D­galacturonic)   lyase)

ượ ấ ấ ơ ề ồ ạ đ u t n t i. Pectate và pectin có l ng methoxyl th p là các c  ch t thích

ề ả ả ợ h p cho các enzyme này. Nói chung, c  hai enzyme này đ u có kho ng pH

2+ đ  ho t đ ng. Pectate

ằ ả ừ ề ầ ạ ộ ể ố t i đa n m trong kho ng t 8,0­11, đ u c n ion Ca

ượ ư ấ ở ẩ lyase không đ c tìm th y trong cây xanh, nh ng có ấ    vi khu n và n m.

ạ ấ ọ ộ Các enzyme VSV ngo i bào này đóng m t vai trò r t quan tr ng trong quá

ệ ở ự ự ủ ủ ậ ế trình gây b nh th c v t, gây ra s  phân h y mô c a thành t bào, làm

ự ậ ề ụ m m và làm m c mô th c v t.

Ngoài ra còn có: ­ Pectin­transeliminase (poly 1,4­(cid:0) ­galaturonid­methylesteglucanolise)

ụ là enzyme tác d ng lên pectin và pectinic acid.

­ Polygalactorunate­transeliminase (poly1,4­(cid:0)

­ galaturonid–

ụ glucanoliase) là enzyme tác d ng trên pectic acid và pectinic acid.

ự ắ ơ ị

­ Pectin lyase (PNL): xúc tác s  phân c t các đ n v  galacturonate đã

ấ ả ề ị b  ester hóa. T t c  các PNL đ u là endo­enzyme.

Ứ ụ ủ 1.1.2.3.  ng d ng c a enzyme pectinase

ự ả ẩ ườ ử ụ ế ấ ­ Trong   s n   xu t   th c   ph m,   ng ẩ   i   ta   s   d ng   các   ch   ph m

ế ườ ế ẩ ớ ạ pectinase du i d ng tinh khi t. Ng i ta không dùng ch  ph m d ướ ạ   i d ng

ườ ỉ ệ ế ấ ẩ ặ canh tr ố ấ ng n m m c s y khô. T  l ch  ph m pectinase cô đ c trên l ượ   ng

ế ế ệ ả ừ ế nguyên li u đem ch  bi n vào kho ng t 0,03­ 0,05 đ n 0,10%.

ấ ượ ấ ướ ả ả ­ Trong s n xu t r ư u vang, cũng nh  trong s n xu t n ả   c qu  và

ướ ố ượ ể ử ụ ề ộ các n c u ng không r ệ   u, đ u có th  s  d ng pectinase m t cách hi u

ụ ủ ả ờ ị ọ   qu . Nh  tác d ng c a pectinase mà các quá trình ép, làm trong và d ch l c

ả ấ ễ ấ ả ẩ ẳ ạ ư   ệ qu  r t d  dàng, do đó làm tăng hi u su t  s n ph m. Ch ng h n  đ a

ả ẽ ấ ướ ề ệ ả pectinase vào khâu nghi n qu , s  làm tăng hi u su t n c qu  sau khi ép

ớ ở ẽ ả ấ ị t i 15 – 25%. B i l khi có pectinase phân gi i các ch t pectinase mà d ch

ị ụ ữ ả ậ ố ọ ấ ễ qu  trong su t không b  đ c và l c r t d  dàng. Không nh ng v y, enzyme

ầ ế ượ ữ ấ pectinase còn góp ph n chi t rút đ ấ   c các ch t màu, tannin và nh ng ch t

ấ ượ ữ ẩ hoà tan n a, do đó làm tăng thêm ch t l ng thành ph m.

ấ ướ ượ ườ ườ ả ­ Trong s n xu t n ả c qu  và r u vang, ng i ta th ử ụ   ng s  d ng

ộ m t trong sáu nhóm enzyme sau:

ể ả ấ ướ ế ẩ ả ụ

(cid:0) Nhóm ch  ph m enzyme dùng đ  s n xu t n

ụ   c qu  đ c. M c

ử ụ ế ệ ẩ ấ đích s  d ng nhóm ch  ph m enzyme này là làm tăng hi u su t trích ly đ ể

ượ ả ẩ ợ ớ thu đ c lu ng s n ph m l n.

ể ả ấ ướ ế ẩ ả

(cid:0) Nhóm ch  ph m enzyme dùng đ  s n xu t n

c qu  trong, không

ử ụ ứ ụ ệ ấ ch a pectin. M c đích s  d ng nhóm này là làm tăng hi u su t trích ly và

ấ ả ộ ớ ỷ thu  phân hoàn toàn các ch t protein, pectin, làm gi m đ  nh t và làm tri ệ   t

ụ ướ tiêu nguyên nhân làm đ c n ả c qu .

ế ể ẩ ả ồ

(cid:0) Nhóm ch  ph m enzyme dùng đ  làm tăng kh  năng đ ng hoá

ướ ả ả ả ị ướ n c qu  và th t qu , làm tăng kh  năng trích ly n ả c qu .

ể ả ế ẩ ấ ẩ ả

(cid:0) Nhóm ch  ph m enzyme dùng đ  s n su t bán s n ph m r

ượ   u

ủ ệ ằ ả ẩ ấ vang nh m làm tăng hi u su t trích ly c a bán s n ph m.

ế ể ẩ ả

(cid:0) Nhóm ch  ph m enzyme dùng đ  ngăn c n quá trình oxy hoá và

ở ự ủ ể ế ể ả làm c n tr ậ  s  phát tri n c a vi sinh v t hi u khí phát tri n trong n ướ   c

ả ượ qu , trong r u vang.

ụ ế ẩ ố ạ

(cid:0) Nhóm   ch   ph m   enzyme   dùng   vào   m c   đích   ch ng   l

i   đ ườ   ng

ả ấ ẩ trong s n su t siro thành ph m.

ệ ử ụ ả ượ ẩ ế Vi c s  d ng các ch  ph m enzyme ph i đ c xem xét k  l ỹ ưỡ   ng

ơ ở ặ ử ệ ể ặ ầ ể   trên c  s  đ c đi m nguyên li u trái cây c n x  lý. Trong các đ c đi m

ườ ắ ự ế ể ề ặ ấ ủ c a trái cây, ng i ta quan tâm r t nhi u đ n đ c đi m màu s c t nhiên

ề ẩ ườ ệ ử ụ ợ ủ ả c a s n ph m.Trong nhi u tr ả ả   ng h p, vi c s  d ng enzyme ph i  đ m

ắ ự ặ ạ ữ ầ ắ ả b o gi ữ ượ  đ c màu s c t nhiên ban đ u ho c t o ra nh ng màu s c theoý

ả ứ ữ ể ề ằ ố mu n b ng cách đi u khi n nh ng ph n  ng enzyme. Theo màu s c t ắ ự

ượ ạ ạ nhiên, các lo i trái cây đ c chia làm hai lo i:

ạ ắ ố ưở

 Trái cây có màu nh t: táo, lê, nho tr ng, chu i, cam, xoài, b

i…

ứ ẫ ậ ỏ ề  Trái cây có màu s m do ch a nhi u antoxian: anh đào, m n đ , nho

ậ ỏ đ , m n đen, dâu…

ể ử ề ả ạ ườ ườ ử ụ

 Đ  x  lý qu  nghi n có màu nh t, ng

i ta th ộ   ng s  d ng m t

ạ lo t các enzyme sau:

ớ ủ ị ể ả ộ ả - Enzym endo­PmG đ  làm gi m đ  nh t c a d ch qu .

ệ ấ

- Enzyme PE làm tăng hi u su t trích ly

ư ắ ộ

- Enzyme khác nh  cellulose, hemicelluase, protease không b t bu c.

ướ ả 1.1.2.3.1. Làm trong n c qu

ệ ứ ụ ể ậ ướ ả ượ ­ Vi c  ng d ng pectinase đ  thu nh n n c qu  đ ầ   ụ c áp d ng l n

ụ ừ ế ệ ở ầ đ u tiên vào năm 1930. T  đó đ n nay vi c áp d ng enzyme này đã tr  nên

ổ ế ở ướ ế ớ ệ ậ ướ ấ r t ph  bi n ề  nhi u n c trên th  gi i. Vi c thu nh n n c qu  t ả ừ ướ   c  tr

ằ ươ ụ ủ ế ế đ n nay ch  y u b ng ph ả ng pháp ép. Syrup qu  nhanh đóng c c là do

ứ ượ ể ượ ch a 1 hàm l ng pectine  đáng k . Qua phân tích hàm l ng pectinase

ả ư ố trong 1 s  qu  nh  sau:

ơ •Syrup m : 0,107%

ậ •Syrup m n: 0,153%

ướ ậ •N c m n: 0,452%

ượ ụ ộ ớ L ả ị ng pectin này làm cho syrup qu  b  keo và đ c, có đ  nh t cao,

ả ấ ộ ượ ườ ư ọ nh t là khi qu  có đ  acid và hàm l ng đ ng cao nh  các l ai syrup k ể

trên

ể ử ụ ế ế ệ ướ ế ẩ ả

­ Đ  s  d ng vào vi c ch  bi n n

c qu  trong thì ch  ph m thì

ả pectinase   ph i   có   enzym   endo   và   exo­polygalacturonase,   enzym

ữ ừ ể ế ẩ ạ pectinestenase. Trong ch  ph m lo i này thì nh ng enzym v a k  trên là

ả ủ ữ ế ế ệ ẩ ị nh ng   enzym   quy t   đ nh   hi u   qu   c a   ch   ph m.   Vì   endo   và   exo­

ớ ủ ị ẽ ả ả ộ polygalacturonase s  làm gi m đ  nh t c a d ch qu , còn enzyme PE cũng

ủ ụ ủ ế ầ ẩ góp ph n vào tác d ng c a enzym này. Enzym proteinase c a ch  ph m s ẽ

ủ ỏ ỏ ỷ ế ự ế ả thu  phân v  protein c a v  nguyên sinh t bào, k t qu  là làm cho s  thoát

ặ ủ ả ễ ự ở ủ ị c a d ch qu  d  dàng. S  có m t c a cellulase và hemicellulase trong ch ế

ẩ ố ử ụ ư ắ ả ạ ộ ph m cũng t t nh ng không b t bu c. Khi s  d ng cho các lo i qu  nh ư

ế ẩ ượ táo, lê thì trong ch  ph m không đ c phép có enzyme pectinaseliminase và

ẽ ắ ố ỷ ế ệ ủ enzym này s  phân hu  protopectin v n g n các t bào riêng bi t c a mô

ả ạ ớ ớ ủ ủ ả ộ ị qu  l i v i nhau, do đó gây m n hoá mô qu , làm tăng đ  nh t c a d ch

ấ ị ế ệ ả ả ả ả qu  và k t qu  là làm gi m hi u su t d ch qu . Ng ượ ạ c l ử ụ   i, khi s  d ng

ả ọ ư ự ế ạ ẩ ặ cho các lo i qu  m ng nh  dâu tây thì s  có m t trong ch  ph m enzym

ạ ầ ế ủ ế PTE l i c n thi ẽ t vì enzym này s  làm m n hoá t ấ    bào làm cho tính ch t

ớ ủ ị ả ạ ả ố thoát n ướ ủ ế c c a t ộ  bào tăng lên còn đ  nh t c a d ch qu  l i gi m xu ng.

ố ớ ế ả ẩ Ngoài ra, đ i v i các ch  ph m pectinase dùng trong s n xu t n ấ ướ   c

ả ượ qu  trong cũng không đ c phép có các enzym oxidase (ascohatoxydase,

poliphenoloxydase).

ế ế ướ ả ị Trong ch  bi n n c qu  có th t thì các enzym PTE, hemicellulase và

ạ ủ ụ ữ ệ ế ả ị cellulase   l i   là   nh ng   enzym   quy t   đ nh   hi u   qu   tác   d ng   c a   ch ế

ụ ẫ ẩ ộ ph m.Trong   đó   vai   trò   d n   đ ng   là   enzym   PTE   có   tác   d ng   phân   hu ỷ

ủ ẽ ả ớ protopectin c a mô qu . Hemicellulase và cellulase s  cùng v i PTE làm

ể ủ ướ ộ ồ ế ả ẩ cho đ  đ ng th  c a n ứ   c qu  có màu sáng thì trong ch  ph m không ch a

ệ enzym oxi hoá, còn cho các nguyên li u có carotenoid và antoxian thì không

ứ ấ ỷ ch a enzym phá hu  các ch t này.

ể ượ ướ ả ườ ử ụ Đ   thu   đ c   n c   qu ,   trong   tr ợ ng   h p   có   s d ng   enzym

ườ ề ệ ả ả ỏ pectinase,   ng ề   i   ta   cũng   ph i   nghi n   nh   nguyên   li u   qu .   Bã   nghi n

ượ ử ằ ặ ớ nhanh đ c đem x  lý b ng enzym, sau đó m i đem ép ho c ly tâm. Trong

ườ ử ụ ợ ườ ỏ ớ ề ứ ố tr ng h p có s  d ng enzyme, ng i ta có thê nghi n nh  t i m c t i đa,

ậ ợ ợ ị ắ ụ ủ ẽ ố c t sao thu n l i cho tác d ng c a enzym mà không s  b  t c ngh n kênh

ả ị ẫ d n d ch qu  trong quá trình ép sau này.

ấ ị ể ệ ả ỉ Dùng pectinase không ch  làm tăng hi u su t d ch qu  mà còn đ  làm

ả ị ươ ử ụ ả ơ ệ ả trong d ch qu . Ph ng pháp s  d ng enzym có hi u qu  h n c . B i l ở ẽ

ủ ụ ủ ệ ờ ướ ả ẽ ị nh  tác d ng c a các enzyme mà các h  keo c a n c qu  s  b  phá hu ỷ

ư ế ằ ươ hoàn toàn. N u nh  khi làm trong b ng các ph ị ế   ng pháp khác pectin b  k t

ử ầ ộ ị ả ằ ủ t a m t ph n thì khi x  lý b ng pectinase, pectin b  phân gi i hoàn toàn

ấ thành các ch t hoà tan.

ươ ộ ượ ừ ế ẩ ớ V i ph ng pháp enzym, khi mang m t l ng th a ch  ph m s ẽ

ạ ừ ượ ườ ợ lo i tr  đ c tr ng h p làm trong không hoàn toàn.

ị ướ ả ượ ử ế ẩ ằ ườ D ch n c qu  đ c x  lý b ng ch  ph m pectinase th ng có v ị

ơ ướ ị ụ ơ hoàn toàn h n và ít có khuynh h ng b  đ c h n.

ả ướ ị ụ ủ Quá trình làm trong d ch qu  d i tác d ng c a pectinase có th ể

chia làm 3 giai đo n:ạ

ạ ị ượ ự ả ể ằ ộ ấ ổ + Giai đo n “b t  n đ nh hoá” đ ớ   c tiêu bi u b ng s  gi m đ  nh t

ắ ộ ườ ượ ọ ạ m t cách sâu s c và th ng đ ỡ c g i là tr ng thái “phá v ”

ắ ầ ừ ạ ế ạ ế ắ + Giai đo n “k t l ng” b t đ u t ỡ  tr ng thái “phá v ” và k t thúc khi

ế ủ k t t a hoàn toàn.

ạ ố ườ ượ ự ắ ằ ặ ị + Giai đo n cu i cùng th ng đ c xác đ nh b ng s  v ng m t các

ế ủ ở pectin k t t a b i ion canxi

ể ướ ử ụ ế ẩ ả ­ Đ  làm trong n c trong qu  nên s  d ng ch  ph m enzyme có

ạ ộ ườ ươ ho t  đ   1,950  đvhđ/1g  canh   tr ng   (theo   ph ặ   ng   pháp  Cu­pectat)   ho c

ườ ươ ướ ụ 0,768 đvhđ/1g canh tr ng (theo ph ủ   ng pháp so màu). D i tác d ng c a

ộ ượ ạ ừ ự ế pectinase, pectine ­ m t polysacharide đ c t o thành t ữ    s  liên k t gi a

ủ ạ ử ầ các m ch c a phân t acid galacturonic (C ượ   c ộ 6H10O7) mà m t ph n đã đ

ớ ượ ắ ỷ ị ị este hoá v i r u metylic (CH ế   ặ 3OH) b  phân hu  ho c b  phân c t liên k t

ệ ấ ử ệ glucozic. Pectine là 1 ch t đi n ly cao phân t (polime) mang đi n tích âm

ủ ề ạ ọ ử ự ắ ệ ế (­) d c theo chi u dài c a m ch phân t có s  s p x p các nhóm đi n tích

ấ ạ ướ ạ ẳ ỗ cùng d u (­COO­) nên m ch có xu h ề ặ ấ   ng du i th ng t o nên b  m t h p

ả ụ ụ ớ ướ ệ ộ ị ề   ứ ph  l n trong toàn b  dung d ch có ch a pectin. N c qu  đ c là h  huy n

ầ ử ị ả ướ ỏ ề ặ ớ phù trong đó ph n t th t qu  có kích th c nh , b  m t riêng l n và có

ượ ề ặ ấ ớ ữ ề ệ ộ ặ ọ năng l ng r t l n nên không b n v ng v  m t nhi t đ ng h c. M t khác,

ử ướ ụ ữ chúng là nh ng phân t ệ  tích đi n nên d ủ ự i tác d ng c a l c hút phân t ử

ế ạ ạ ữ ử ớ ễ ắ ố chúng liên k t l i t o thành nh ng phân t l n d  dàng l ng xu ng. Trong

ướ ặ ủ ả ự ấ ặ ệ ạ n ợ c qu , s  có m t c a h p ch t polyphenol (đ c bi t là tanin) t o nên

ặ ủ ế ủ ự ữ ẽ ớ v i pectine nh ng k t t a không tan v.v... S  có m t c a pectinase s  thúc

ị ậ ộ ơ ả ị ẩ đ y nhanh quá trình c  b n nêu trên. Xác đ nh giá tr  m t đ  quang OD

ộ ắ ờ ố (Optical Density) λở ị   ể  = 600 nm theo th i gian đ  so sánh t c đ  l ng th t

ả ữ ẫ qu  gi a các m u.

ế ả ướ ế ế ả ­ Trong t ủ  bào c a qu  n c chi m kho ng 90­95%. N u ta ch ỉ

ể ề ậ ỉ ượ ả ố nghi n sau đó ép thì ta ch  có th  thu nh n đ c kho ng 60­70% là t i đa.

ệ ẽ ề ấ ườ Khi ta cho pectinase vào, hi u su t ép s  tăng 15­30%. Nhi u tr ợ   ng h p,

ề ượ ế ệ ấ ế ẩ ế hi u su t ép tăng đ n 50%. Li u l ng ch  ph m enzyme tinh khi t cho

ặ ẩ ệ ộ ế vào là 0,03­ 0,05% ho c ch  ph m thô là 0,5 – 2%. Nhi t đ  duy trì cho quá

ờ ỷ ỷ ờ ả ị trình thu  phân là 43 – 45%.Th i gian thu  phân là 4 – 8 gi . D ch qu  thu

ượ ọ ẽ ố ơ ệ ẽ ằ ả ơ đ c b ng pectinase s  trong h n, kh  năng l c s  t t h n và hi u qu ả

ế ấ kinh t th y rõ.

ấ ượ ả 1.1.2.3.2. Trong s n xu t r u vang

ế ủ ạ ượ ệ ả ổ ị Giúp   c i   thi n   k t   t a   màu   và   n   đ nh   các   lo i   r ỏ   u   vang   đ .

ượ ạ ướ ổ Enzyme pectin đ c thêm vào các lo i trái cây tr c khi b  sung các men

ượ ấ ượ ả ỏ ể ả ệ ắ r u trong quá trình s n xu t r u vang đ  đ  c i thi n màu s c và đ ộ

ượ ỏ ượ ổ ắ ố ơ ụ đ c. R u vang đ  đ c b  sung enzym có màu s c t ạ   ớ t h n so v i các lo i

ượ ượ ạ ượ ữ ổ r u vang không đ c b  sung enzyme. Nh ng lo i r u này cũng cho

ấ ự ổ ạ ượ ơ ớ ớ ị ượ th y s   n đ nh l n h n so v i các lo i r u vang không đ ổ c b  sung

enzyme.

ộ ố ươ ấ ả 1.1.2.4. M t s  ph ng pháp s n xu t enzyme pectinase

ậ ố ồ 1.1.2.4.1. Ngu n g c thu nh n

ế ở ự ừ ậ ậ ườ ỉ ấ ộ

(cid:0) T  vi sinh v t: N u

th c v t ng ạ   i ta ch  th y có m t lo i

ở ậ ạ ấ ậ ộ enzyme thì vi sinh v t là m t lo i enzyme r t phong phú. Vi sinh v t phân

ả ặ ở ư ầ ệ ạ ấ ấ gi i pectine h u nh  có m t ẩ   ố  các đ i di n n m m c, n m men, vi khu n

nh :ư

ấ

 N m m c:

ố A.niger, A.oryase, A.terreus, A.saito, A.japonicus…

ấ

 N m men:

S.ellipsoideus, S.fragilis, S.ludwigii …

 Vi khu n: ẩ B.polymixa, B.felseneus, Clostridium roseum…

ươ 1.1.2.4.2. Ph ấ ề ặ ng pháp nuôi c y b  m t

ả ấ  Quy trình s n xu t

ế

 Thuy t minh quy trình:

ườ

(cid:0) Môi tr

ấ ng nuôi c y

ườ ầ ự ắ ồ Là môi tr ng r n, g m các thành ph n t nhiên: cám mì, cám g o,ạ

ả ậ ộ ươ ườ ngô   m nh,   b t   đ u   t ố ng…   pha   thêm   mu i   khoáng.   Môi   tr ắ   ng   r n

ườ ấ ặ ệ ươ ố ầ ủ th ng dùng nh t là cám, đ t bi t trong cám mì có t ng đ i đ y đ  các

ấ ưỡ ầ ẩ ấ ế ch t dinh d ẽ ạ ng và khi làm  m s  t o ra c u trúc c n thi ố   ấ t cho n m m c

ể ổ ữ ể ề ầ phát tri n, sinh ra nhi u enzyme. Có th  b  sung nh ng thành ph n giàu

ủ ả ườ ư ấ ả ứ ể ộ ố ượ pectin nh  bã c  c i đ ng, b t cà r t làm ch t c m  ng đ  thu đ c hàm

ượ ạ ầ ấ ổ l ể ạ   ng pectinase cao. Bên c nh đó, chúng ta c n b  sung thêm tr u đ  t o

ườ ố ể ủ ấ ự ậ môi tr ng thoáng khí t t, giúp cho s  phát tri n c a n m. V y môi tr ườ   ng

ể ấ ấ ồ ỉ ấ ả   hoàn ch nh đ  nuôi c y g m có: 70% cám mì + 23% tr u + 5% ch t c m

ứ ưỡ ạ ướ ầ ấ ấ ng + ch t dinh d ng khác (m m m , n ể c khoai tây… đ  cung c p thêm

ơ ườ ắ ầ ượ ồ ngu n   nit ,   photphat,   kali…).   Môi   tr ng   r n   c n   đ ế   ẩ c   làm   m   đ n

ộ ẩ ể ề ế ả ẩ ạ ạ   kho ng 60%, n u đ   m quá cao thì nhi u lo i vi khu n phát tri n gây t p

ộ ẩ ẽ ế ễ ấ ườ nhi m, n u đ   m quá th p s  làm môi tr ng nhanh khô, sinh bào t ử

m nh.ạ

ườ ố ượ ấ ng   đã   c y   m c   đ ặ c   đ t   vào

(cid:0) Nuôi   c y:ấ   Các   khay   có   môi   tr

ẵ phòng nuôi có s n các giá.

ụ ụ ườ ượ ử ụ ụ D ng   c   và   môi   tr ầ ng   c n   đ c   kh   trùng ở

(cid:0) D ng   c :

ễ ể ạ 1210C/1atm/30 phút đ  tránh t p nhi m.

ụ ộ ể ườ ượ ả ụ  Môi tr ng đ ỏ c tr i m ng ra các

(cid:0) Đ  ngu i, ph i vào d ng c : ố

ượ ớ ớ ể khay đã đ ộ ế   ả c thanh trùng v i l p dày kho ng 2 – 2,5cm và đ  ngu i đ n

ế ấ ố 300C thì ti n hành c y gi ng.

(cid:0) Gi ngố

ố ượ ấ ấ ườ ể N m m c đ c nhân và nuôi c y trong môi tr ng vô trùng đ  tránh

ễ ạ ố ượ ươ ề ặ nhi m t p. Gi ng đ c nhân theo ph ng pháp b  m t và cũng trên môi

ườ ệ ả ể ố ề ố tr ớ ng trên đ  gi ng quen v i đi u ki n s n xu t. ấ Khi nhân gi ng th ườ   ng

ế ề ấ ố ọ ể đ  cho n m m c m c già đ n khi sinh ra nhi u bào t ử bào t , ử ượ  đ c thu

ươ ử ỏ ườ ứ theo ph ng pháp tách bào t kh i môi tr ng và ch a trong các bình có

ỉ ệ ả ố ỗ ử ố nút kín. T  l nhân gi ng vào kho ng 0,2 – 2%. M i gam bào t m c có th ể

ườ ấ c y vào 10kg môi tr ng.

(cid:0) Nuôi c yấ

ườ ố ượ ặ Các khay có môi tr ấ ng đã c y m c đ ẵ   c đ t vào phòng nuôi có s n

ể ề ỉ ượ ệ ộ ộ ẩ ượ các giá. Phòng nuôi có th  đi u ch nh đ c nhi t đ , đ   m và đ ổ   c th i

0C. N u nhi ế

ệ ộ ố ố ợ ớ ệ ộ gió. Nhi t đ  thích h p v i đa s  m c là 30­32 ố   t đ  xu ng

0C thì n m m c phát tri n ch m, sinh bào t

ướ ể ấ ậ ố ử ế ờ d i 24 y u, th i gian nuôi

ư ậ ẽ ả ả ổ ợ ấ c y dài nh  v y s  làm gi m kh  năng sinh t ng h p enzyme.

ề ặ ấ ấ ờ ượ ố Quá trình nuôi c y n m m c trên b  m t môi tru ng đ c chia thành

3 giai đo n:ạ

ạ ả ờ ầ ữ ạ

(cid:0) Giai đo n 1: Kho ng 10 – 14 gi

đ u: giai đo n này có nh ng thay

ổ đ i sau:

ử ấ ắ ầ ữ ắ ặ

 Bào t

n m b t đ u hình thành có màu tr ng ho c màu s a.

ắ ầ ề ả ỏ

 B t đ u hình thành enzym, không đòi h i ph i thông khí nhi u ch

ỉ

ể ể ả ầ c n làm thoáng kho ng 2 – 3 th  tích không khí / th  tích phòng / gi ờ .

ườ ờ ạ ầ ưỡ ố  Kh i môi tr ng còn r i r c, các thành ph n dinh d ắ ầ   ng b t đ u

ự ổ có s  thay đ i.

ạ ả ờ ạ

(cid:0) Giai đo n 2: kéo dài kho ng 14 – 18 gi

ữ   : giai đo n này có nh ng

ổ thay đ i sau:

ợ ấ ể ể ấ ố ằ   ạ M c phát tri n nhanh, hô h p m nh, s i n m có th  quan sát b ng

ườ ầ ớ ơ ắ ắ m t th ng, lúc đ u là l p lông t màu tr ng – xám và ngày càng rõ, làm

ườ ế ạ ộ ẩ ườ ả ầ ấ môi   tr ng   k t   bánh   l i,   đ   m   môi   tr ng   gi m   d n.   Các   ch t   dinh

ưỡ ườ ụ ụ ể d ng trong môi tr ng tiêu hao nhanh đ  ph c v  cho các quá trình trao

ế ạ ố ỏ ườ ấ ổ đ i ch t trong t ấ  bào và gi ng hô h p m nh t a ra môi tr ng chung quanh

0  ­ 450C. Th i kì này

ờ ệ ộ ườ ờ 80 – 90kcal/gi . Làm nhi t đ  môi tr ng tăng lên 40

ạ ả ớ ể ể ờ ể ầ c n ph i thông khí m nh t i 60 th  tích khí/1th  tích phòng/gi đ  cung

ố ổ ườ ồ c p Oấ ả   ờ ng, đ ng th i làm gi m ở 2 cho m c th  và đu i CO ở 2 ra kh i môi tr

ệ ộ ồ ệ ộ ở ạ ầ nhi t đ  bu ng nuôi. Nhi ồ t đ  bu ng nuôi giai đo n này c n gi ữ ở 28 ­

ộ ẩ ả 300 C và đ   m trong phòng kho ng 90%.

ạ ượ ạ Các lo i enzyme đ c hình thành trong giai đo n này, pectinase đ ượ   c

ơ ấ ả ứ ề ấ hình thành nhi u nh t vì có c  ch t c m  ng.

ạ ả ờ

(cid:0) Giai đo n 3: kéo dài trong kho ng 10 – 20gi

ạ : giai đo n này có

ữ ế ổ nh ng bi n đ i

ộ ả ấ ế ứ ấ ầ ổ Quá trình trao đ i ch t y u d n vì do đó m c đ  gi m ch t dinh

ưỡ ẽ ạ ượ ệ ạ ả ả d ng   s ậ   ch m   l i.   L ng   nhi t   t o   ra   gi m,   kho ng   15   –

ờ ể ể 30kcal/kg/gi .Thông   khí   không   quá   20   –   25   th   tích   không   khí/th   tích

0C.

ờ ữ ệ ộ ồ ở phòng/gi , gi nhi t đ  bu ng nuôi duy trì 30

ủ ừ ặ ộ ố ờ ố Tùy thu c vào đ c tính sinh lí c a t ng gi ng m c, th i gian nuôi

ể ế ạ ể ượ ạ ố ấ c y có th  k t thúc t i đi m mà l ng enzyme t o thành t i đa, enzyme

ở ẫ ượ v n đ c hình thành ạ  giai đo n này.

ườ ấ ượ ấ ớ ộ ẩ ướ Môi tr ng sau khi nuôi c y đ c s y khô t i đ   m d i 12%,

ỏ ự ề ả ẩ ặ ấ ố ẩ   nghi n nh , đ ng trong các bao polyetylen ho c gi y ch ng  m. S n ph m

ế ẩ này là ch  ph m enzyme thô.

ậ 1.1.2.4.3. Thu nh n enzyme

ươ ậ a. Ph ng pháp thu nh n

ạ ả ộ ỗ ỏ ạ Có 2 lo i enzyme: n i bào và ngo i bào, m i enzyme đòi h i ph i có

ươ ậ ph ng pháp tách và thu nh n riêng:

ậ ế ạ ồ

(cid:0) Enzyme ngo i bào: (g m pectinase) do vi sinh v t ti

t ra trong môi

ườ ế ườ ướ tr ấ ng nuôi c y ngoài t bào, th ng hoà tan trong n ễ c do đó d  trích ly

và tinh s ch. ạ

ộ ượ ả ấ ế

(cid:0) Enzyme n i bào: là enzyme đ

c s n xu t ra bên trong t bào vi

ậ ượ ế ườ ữ ế sinh v t và không đ c ti t ra môi tr ng bên ngoài. Nh ng t bào vi sinh

ượ ấ ẽ ượ ỡ ế ụ ậ v t sau khi đ c nuôi c y s  đ c tách ra và phá v  t ủ    bào. M c đích c a

ệ ả ấ ộ ế ồ vi c này là gi i phóng toàn b  các ch t có trong t ộ   ả  bào g m c  enzyme n i

ỗ ợ ượ ẽ ữ ạ ấ ấ bào. H n h p thu đ c s  đem ly tâm tách t p ch t và nh ng ch t có phân

ẽ ượ ế ủ ằ ớ ồ ố t ử ượ  l ng l n; còn enzyme s  đ c k t t a b ng c n hay mu i. Enzyme sau

ẽ ượ ạ đó s  đ c đem tinh s ch.

ộ ạ

ễ

ế ế ỡ bào

ấ ầ ẫ ớ Enzyme n i bào Khó tách ỡ ả Ph i phá v  thành t ẫ ườ Th bào ủ   ớ ng l n chung v i các ch t khác c a Enzyme ngo i bào D  tách Không c n phá v  thành t Không l n chung v i các thành

ỡ ị ầ ộ ỉ ế t bào   sau   khi   b   phá   v   (acid   nucleic, ộ   ế ph n n i bào, n u có ch  là m t

ạ

ườ

ấ ỉ ề ữ ươ ạ ộ ng n i bào ự ề ữ ươ ễ ạ ch t nguyên sinh, lipid…) Ch  b n v ng trong môi tr Ph ệ   ng   pháp   tinh   s ch   khó   th c   hi n, vài enzyme ngo i bào khac ơ B n v ng h n Ph ng pháp tinh s ch d  và r ẻ

ứ ạ ệ quy trình công ngh  ph c t p, giá thành h nơ

đ tắ

ừ ườ + T  môi tr ấ ề ặ ng nuôi c y b  m t

ế

ừ

ườ

ườ

ướ

ị

ể Đ  chi

t rút enzyme t

môi tr

ắ ng r n ng

i ta dùng n

c, các dung d ch

ữ

ề

ế

ả

ố

ệ   ơ ồ mu i trung tính, các dung môi h u c  (c n, axeton). Nhi u k t qu  thí nghi m

ấ

ướ

ả ố

ụ

ế

ễ ượ

cho th y dùng n

c trong m c đích này có k t qu  t

t và d  đ

ộ c dùng r ng rãi

ả

ấ

ươ

ằ

ướ

ể

trong s n xu t. Theo ph

ế ng pháp khu ch tán b ng n

c có th  chi

ế ượ   c

t đ

ướ

ế

ứ

ạ

ấ

ượ l

ng enzyme trên 90 – 95% và trong n

c chi

t không ch a các t p ch t không

ườ

ế

ở

ệ ộ

ể

ễ

ướ tan. N c th

ng dùng khu ch tán

nhi

t đ  25 – 28

0C. Đ  tránh t p nhi m nên ạ

ướ

ộ

ị

ế

ượ

thêm vào n

ấ c m t ít focmalin hoăc ch t sát trùng khác. D ch chi

t thu đ

c có

ứ

ấ

ẫ

ượ

màu nâu s m, khá trong, ch a 10 – 15% ch t khô hòa tan và đ

ị   ạ c làm l nh k p

ố

ờ

th i xu ng 10 – 12

0C.

ươ

ế

ạ

ượ ử ụ

Ph

ng pháp tách chi

t và làm s ch enzyme đ

ấ   ộ c s  d ng r ng rãi nh t

ệ

ươ

ế ủ

ữ

ơ

hi n   nay   là   ph

ằ ng   pháp   k t   t a   enzyme   b ng   dung   môi   h u   c   (etanol,

ố ệ

ả

ằ

ủ   ữ ơ izopropanol và axeton). Các dung môi h u c  này làm gi m h ng s  đi n môi c a

ườ

ế ự

ệ ỉ ệ

ớ ằ

ố ệ

ị

môi tr

ư ng. Nh  ta đã bi

t, l c hút tĩnh đi n t  l

ngh ch v i h ng s  đi n môi.

ư

ấ

ậ

ấ

ử ấ

Vì v y, các enzyme, các ch t protein cũng nh  các ch t có phân t

th p trong h

ệ

ị

ướ

ắ

ố

dung d ch n

ữ ơ ẽ ủ c – dung môi h u c  s  t a và l ng xu ng.

ủ

ộ

ồ

ị

ướ

ụ

ộ

ồ

Đ  hòa tan c a enzyme vào dung d ch c n – n

c ph  thu c vào n ng đ

ộ

ệ ộ ự

ủ

ủ

ấ

ị

ồ c n, nhi

t đ , l c hút ion c a dung d ch và tính ch t protein c a enzyme. Đ

ể

ả ượ

ấ

ạ

ị

ạ

ố

ủ tránh m t ho t tính c a enzyme d ch ph i đ

c làm l nh xu ng 3 – 5

oC. Khi tr nộ

ế ủ ắ

ả

ấ

ạ

ố

ướ ầ

ph i khu y m nh, khi các enzyme k t t a, l ng xu ng d

i c n tách ly ngay.

ơ ồ ạ ừ ườ ấ Hình 1.2: S  đ  tinh s ch enzyme t canh tr ố ng n m m c

ừ ườ ấ ề + T  môi tr ng nuôi c y b  sâu

ươ ế

(cid:0) Ph

ng pháp hi u khí

ự ụ ườ ượ ắ ầ ự S  tích t enzyme trong môi tr ng đ ể   c b t đ u khi s  phát tri n

ậ ầ ạ ế ổ ị ườ ị ủ c a vi sinh v t g n đ t đ n pha  n đ nh, khi môi tr ạ   ng b  acid hoá m nh

ượ ơ ượ ử ụ ủ và khi l ng phospho vô c  đ c s  d ng hoàn toàn, pH c a môi tr ườ   ng

ườ ạ ừ ợ ố ấ nuôi c y th ng đ t t ố ớ ấ  6­7,2 là thích h p. Đ i v i n m m c, pH kìm hãm

ự ề ố ợ ỹ ị ự ổ s  t ng h p sinh kh i và s  tích lu  enzyme pectinase. Khi pH d ch v  phía

ự ạ ả ằ ố   ả acid, ngay c  khi pH n m trong kho ng 4.5­5.0, tuy s  t o thành sinh kh i

ị ả ưở ự ạ ư ị không b   nh h ng nh ng s  t o thành enzyme pectinase b  kìm hãm.

ậ ệ ợ ấ ể ấ ờ ổ ớ V t li u gieo c y có th  là s i n m 24, 32 và 48 gi tu i và v i hàm

ượ ừ ệ ậ ấ l ng t 2­10%. Đ i v i ợ   ố ớ A.niger  và  A.awamori, v t li u gieo c y là s i

ượ ủ ơ ộ ườ ưỡ ắ ầ ế ấ n m đ s  b  trong môi tr c ng dinh d ứ   ng cho đ n khi b t đ u n t

ử ờ ợ ấ nanh bào t , th i gian ủ ơ ộ ườ  s  b  th ng là 38­42 gi ờ ượ . L ng s i n m đem

ườ ấ ượ ấ ấ gieo c y th ng là 2%. Trong quá trình nuôi c y, hàm l ng các ch t hoà

ườ ừ ố tan trong môi tr ả ng gi m t 6% xu ng còn 1,5­1,8%.

ợ ấ ế ể ẩ ầ ỏ ườ Đ  thu ch  ph m khô, c n tách s i n m ra kh i canh tr ỏ ng l ng.

ặ ườ ỏ ượ ạ ấ Cô đ c chân không canh tr ế ng l ng đ n khi hàm l ng ch t khô đ t 5­8%

ế ị ấ ệ ấ ề ệ ộ ồ ấ r i s y khô trên thi t b  s y phun. Đi u ki n s y phun là nhi t đ  ch t t ấ ả   i

oC và đi ra đ t 60­70

oC. Th i gian l u c a ch

ệ ạ ư ủ ờ nhi ả ạ t đi vào ph i đ t 165­180 ế

ẩ ế ị ấ ả ph m enzyme trong thi t b  s y phun ph i không quá 7 giây và nhi ệ ộ  t đ

oC. Ch  ph m thu đ

ế ả ẩ ế ẩ ượ ầ ấ ch  ph m sau khi s y ph i không quá 40 ả   c c n ph i

ẩ ể đóng gói kín đ  tránh hút  m.

ươ ế

(cid:0) Ph

ng pháp y m khí

4)2HPO4 0.75%; KH2PO4 0.1%; CaCO3

ườ Môi tr ủ ả ng: bã c  c i 2%; (NH

ướ ế 0.3%; n c chi t ngô 0.5%

ả ổ ợ ộ   Clostridium pectinofermentants15 có kh  năng t ng h p pectinase m t

ẽ ở ưở ủ ưở ạ cách m nh m pha tăng tr ng c a quá trình sinh tr ồ   ng và tăng đ ng

ờ ớ ự ẽ ố ự ỹ ỹ ươ ứ ố th i v i s  tích lu  sinh kh i. S  tích lu  enzyme s  t i đa t ớ   ng  ng v i

ủ ự ổ ị ưở ờ ầ ủ pha  n đ nh c a s  sinh tr ng qua 55­60 gi , pH ban đ u c a môi tr ườ   ng

ưỡ ậ ệ ầ ấ ượ dinh d ng là 6.5­7.0. V t li u gieo c y ban đ u đ ẩ c chu n b ị ở ạ    tr ng

ườ ử ượ ấ ớ ượ ể thái canh tr ứ ng ch a bào t và đ c c y v i l ng 4% theo th  tích. Quá

oC.

ấ ượ ế ở ệ ộ trình nuôi c y đ c ti n hành nhi t đ  35

ể ượ ế ể ấ C.felsineum  cũng có th  đ c nuôi c y y m khí đ  thu pectinase.

ườ ồ ủ ả ầ Thành   ph n   môi   tr ng   g m   có:   lactose   2%;   pectin   c c i   1%;

(NH4)2HPO40,4%;   K2HPO4  0,7%;   KH2PO4  0,3%;   NaCl   0,1%;   MgSO4

3  0,5%;   d ch   n m   men   t

ế ạ ấ ị ự phân   0,05%; 0,025%;   FeSO4  d ng   v t;   CaCO

ascorbic acid 0,5%.

ể ế ế ẩ ừ ị ườ ằ Có th  ti n hành thu ch  ph m t ọ  d ch l c canh tr ng b ng cách

ữ ơ ặ ớ ớ ố ế   ế ủ k t t a enzyme v i dung môi h u c  ho c v i mu i ammonium sulfat. N u

ữ ơ ử ị ế   ủ ế ủ ằ k t t a b ng dung môi h u c , pH c a dung d ch đã x  lý là 6.5­6.8. N u

ế ủ ạ ạ ộ ể ế ủ ằ k t t a b ng 2­2,5 th  tích aceton thì ho t đ  enzyme trong k t t a đ t 93­

ạ ộ ầ ớ 95% so v i ho t đ  ban đ u.

ế ủ ẽ ằ ộ Khi k t t a ammonium sulfat có đ  bão hoà b ng 0,2 thì s  thu đ ượ   c

ỉ ứ ế ẩ ộ ch  ph m ch  ch a pectinesterase và pectintranseliminase, khi đ  bão hoà là

ẽ ượ ứ ế ẩ ỉ 0,9­1,0   thì   s thu   đ c   ch   ph m   ch   ch a   pectintrenseliminase   và

exopolygalacturonase.

ể ặ ủ 1.1.2.5. Đ c đi m c a enzyme pectinase

 Pectinesterase:

ồ ị ượ ừ c t các ngu n khác nhau có giá tr  pH t ố ư   i  u Pectinesterase thu đ

ố ư ủ ừ ế ấ ồ khác nhau: pH t i  u c a pectinesterase t ố  ngu n n m m c là 4,5 đ n 5,5

ạ ỏ ủ ế ẽ ẩ còn c a ch  ph m đã lo i b  enzyme polygalacturonase s  có pH t ố ư ừ  i  u t

ế ạ ố ư ủ ừ ự ậ ồ 2,0 đ n6,5. Trái l i pH t i  u c a pectinesterase t ngu n th c v t là t ừ    6

ế đ n 7,5 – 8.

0C. Từ

ệ ộ ố ư ủ ừ ấ ế ố Nhi t đ  t i  u c a pectinesterase t n m m c là 40 đ n 45

0C thì enzyme b  vô ho t, trong khi đó nhi

ạ ị ệ ộ ố ư ủ ế 55 đ n 62 i  u c a enzyme t đ  t

0C.

ừ ự ậ ơ ừ pectinesterase t th c v t cao h n: t 55 – 60

ể ậ ườ ấ Pectinesterase có th  nh n đ ượ ừ c t canh tr ng n m m c ố A.niger có

oC và từ

oC, pHopt= 4,5­5,5 và b  vô ho t

ệ ộ ố ư ạ ở ị nhi t đ  t i  u là 30 – 45 55­ 62

opt=7,5­8, to

opt= 55­60oC). Kh  năng ho t đ ng c a chúng ph

ự ạ ộ ủ ả ậ th c v t (pH ụ

ủ ứ ậ ộ ồ ộ ặ   thu c vào ngu n thu nh n, m c đ  ester hoá c a pectin. Ion natri và đ c

ệ ủ ư ẽ bi t   là   ion   canxi,   cũng   nh   chlorua   c a   Na,   K   và   Ca   s ạ   ho t   hóa

ừ ấ pectinesterase t n m m c ố Conithyrium diplodiella  và t ừ A.niger. Trái l iạ

ủ ị ắ   các cation hóa tr  3 và 4 (th y ngân nitrat, chì nitrat, nhôm sunfat và s t

ủ ụ ẽ clorua) s  kìm hãm tác d ng c a pectinesterase

 Polygalacturonase:

ơ ở ứ ề ế ề ầ H u h t các nghiên c u v  Polygalacturonase  đ u trên c  s  các

ậ ồ ườ ượ ấ ngu n vi sinh v t. Polygalacturonase th ng đ ầ   c tìm th y trong các ph n

ế ủ ệ ạ ạ ấ ẩ ẳ ư: ti t ngo i bào c a các loài n m và vi khu n gây b nh, ch ng h n nh

Saccharomyces   fragilis,   Asperigillus   niger,   Lactobacillus   plantarum,

Cochlibolus   carbonum,   neurosrora   crassa,  các   loàiAscomycete,   Rhizopus

arrchizus và Fusarium oxysrorum.

ố ư ụ ủ ộ pH t i  u c a các polygalacturonase cũng khác nhau, ph  thu c vào

ồ ơ ẳ ạ ấ ị ngu n   thu   và   c ch t.   Ch ng   h n   polygalacturonase   d ch   hóa

ụ ố ư (endopolygalacturonase) khi tác d ng trên acid pectinic thì pH t ằ   i  u n m

ả ừ ư ụ trong kho ng t 4,0 – 5,5. Cũng enzime đó nh ng khi tác d ng trên pectin

ạ ố ư ả ườ thì l i có pH t i  u trong kho ng 5,5 – 6. Còn polygalacturonase đ ng hóa

ụ ư ụ khi tác d ng trên pectin thì pH t ố ư ừ i  u t 3 – 4 nh ng khi tác d ng trên acid

ố ư ộ ở pectinic thì ph t ơ i  u cao h n m t ít vùng 4,4­ 6.

ề ữ ở ủ ế ừ Các polygalacturonase ch  y u b n v ng vùng pH t 4 – 6.

ườ ế ượ Polygalacturonase đ ng hóa ch  y u t ủ ế ừ A.niger n u đ ạ   c ho t hóa

ể ề ữ ủ ằ b ng th y ngân thì có th  b n v ng khi pH= 2,5.

ệ ộ ố ư ủ ằ ả ố ừ Nhi t đ  t i  u c a đa s  polygalacturonase n m trong kho ng t 40

ịệ ộ ả ườ ẽ ị ư ữ ề ­450C. Trong kho ng nh t đ  đó, chúng th ng b n v ng, nh ng s  b  vô

0C.

ạ ở ệ ộ ho t khi nhi t đ  50 và 55 ­ 65

ạ ộ ủ 1.1.2.6. Trung tâm ho t đ ng c a pectinase

ứ ề ắ ả   Enzyme pectinase ch a vùng có 8 – 10 vòng xo n kép v  phía ph i

ế ớ ơ ấ ạ ớ v i 2 vòng t o thành khe liên k t v i c  ch t.

ạ ộ ủ ứ Trung tâm ho t đ ng c a enzyme này ch a axit amin Aspartate và

ạ ộ ẽ ả ằ ầ ưở Lysine. Có 1 Histidine n m g n trung tâm ho t đ ng s   nh h ế   ng đ n

ủ ả kh  năng xúc tác c a enzyme.

ụ ứ ệ 1.1.2.7. Tình hình  ng d ng enzyme trong công nghi p trên th  gi ế ớ i

ủ ừ ể ệ ả T  khi phát hi n ra enzyme và kh  năng chuy n hóa c a enzyme loài

ườ ứ ụ ả ng ấ i đã tăng nhanh quá trình s n xu t và  ng d ng enzyme trong công

ố ượ ệ ố ượ ề ệ nghi p. S  l ng enzyme phát hi n ngày càng nhi u và s  l ng enzyme

ượ ứ ụ ề ệ đ c  ng d ng vào công nghi p cũng ngày càng nhi u. Các enzyme quan

ọ ượ ứ ụ ệ ộ ượ tr ng, đ c  ng d ng r ng rãi trong công nghi p đ ả   c trình bày qua b ng

sau:

ỉ ệ ứ ả ủ ụ ệ ạ B ng 1.2: T  l ng d ng c a các lo i enzyme trong công nghi p

ả ị ế ủ B ng 1.3: Giá tr  kinh t ạ  c a các lo i enzyme

ổ ề 1.1.3. T ng quan v  Aspergillus niger

ứ ị ử 1.1.3.1. L ch s  nghiên c u

ủ ề ượ ụ ứ ứ A.   niger  đã   là   ch   đ   đ c   nghiên   c u   và   ng   d ng   trong   công

ề ệ ỷ ượ ử ụ ể ậ nghi p trong nhi u th p k  qua. Năm 1919, A. niger đ c s  d ng đ  sinh

ấ ầ ả ấ ợ ọ ổ t ng h p citric acid và đánh d u t m quan tr ng trong s n xu t citric acid

ệ ổ trong quy mô công nghi p. Ngoài ra, ợ   ả A. niger còn có kh  năng sinh t ng h p

ể ừ ở acid gluconic, acid fumaric. Tuy nhiên, k  t năm 1960, A. niger đã tr  thành

ạ ậ ợ ộ ổ ồ ỹ ế ế   ngu n sinh t ng h p m t lo t các enzyme tham gia vào k  thu t ch  bi n

ự ệ ả ẩ ộ hoa qu , bánh và trong các ngành công ngh  tinh b t và th c ph m. Công

ể ả ụ ệ ệ ấ ả ử ụ   ngh  gen đã áp d ng thành công đ  c i thi n quy trình s n xu t và s  d ng

ư ộ ệ ố ệ ể ạ các ch ng ủ A. niger nh  m t h  th ng bi u hi n các protein ngo i lai. Các

ứ ạ ẩ ậ ỷ ạ ề nghiên c u đ y m nh trong th p k  qua đã mang l i nhi u thành công và

ẩ ả ớ các s n ph m m i (E. Shuster và cs,2002).

ấ ố ộ ổ ế A. niger là loài ph  bi n nh t trong chi Aspergillus, phân b  r ng rãi

ơ ấ ự ệ ả ở trên các c  ch t t ẩ  nhiên, trong các s n ph m nông công nghi p và ề    nhi u

ế ớ ệ ượ ử ụ vùng trên th  gi i. Hi n nay, A. niger  đ ủ ế c s  d ng ch  y u trong công

α ể ệ ả ấ ư nghi p   s n   xu t   enzyme   (đi n   hình   nh ­   amylase,   glucoamylase,

ế ế ự ệ ẩ pectinase, protease, cellulase), trong công nghi p ch  bi n th c ph m, công

ộ ố ữ ư ệ ả ấ ơ nghi p   s n   xu t   m t   s   acid   h u   c   nh   citric   acid,   acid   gluconic,…

(Pansear và cs,2010).

ể ặ ố 1.1.3.2. Đ c đi m, phân b

ạ ấ ổ ế ộ ộ A. niger là m t lo i n m s i ủ   ợ  và m t trong nh ng loài ph  bi n c a ữ

ệ ề ụ chi Aspergillus có nhi u công d ng trong công ngh  sinh h c, ọ  A. niger phát

oC, pH t

ể ở ệ ộ ố ư ừ tri n nhi t đ  t i  u 35–37 1,4–9 ,0.

ả ạ ơ ồ C  quan sinh s n c a ầ   ủ A. niger có d ng nh  hoa cúc, g m các ph n: ư

ử ể ừ ộ ế ườ ớ ơ bào t đính phát tri n t m t t bào có đ ơ   ng kính l n h n, màng dày h n

ệ ợ ấ ủ ậ ạ ọ ế ừ ế các đo n lân c n c a h  s i n m g i là t ố  bào g c. T  t ố ạ    bào g c t o

ầ ạ ợ ố ồ ớ ỉ thành s i cu ng không vách ngăn, kéo dài v i ph n đ nh ph ng to t o thành

ề ặ ế ầ ạ túi hình c u, không màu cho đ n vàng nh t. Xung quanh b  m t túi là các

̀ ́ ể ố ể ể ơ cu ng th  bình màu nâu, dài 10 (cid:0) 15 (cid:0) m la n i sinh ra cac th  bình. Th  bình

ộ ầ ặ ầ ử ượ ạ ố ế có m t t ng ho c hai t ng. Các bào t đính đ c t o thành n i ti p nhau

ỗ ướ ể ệ ố trong mi ng th  bình thành chu i h ng g c, không phân nhánh (bào t ử ở

ệ ử ể ấ ể ngay mi ng th  bình là bào t ệ  non nh t, càng xa mi ng th  bình là bào t ử

ử ầ ườ ườ ̀ càng gia. Bào t đính hình c u, th ẹ ng d t, đ ng kính 4 – 5 (cid:0) m nh ngư

̀ươ ̉ ơ ượ ệ ớ th ng nho h n (Onions và cs, 1981). Loài A. niger đ c phân bi t v i các

ố ở ử loài khác trong chi Aspergillus b i kh i bào t đính màu đen.

ấ ạ A. niger A, C u t o ệ ợ ấ A. niger B, H  s i n m

ấ ả Hình 1.3: Hình  nh n m Aspergillus niger

ể ặ ả ả ấ *Đ c đi m sinh hóa: A. niger : có kh  năng s n xu t các enzyme

ả ạ ổ + (cid:0) ­amylase: A. niger có kh  năng t ng h p ợ (cid:0) ­amylase ngo i bào đ ể

ộ ạ ủ ộ th y phân nhanh tinh b t t o dextrin và m t ít maltose và glucose.

ả ạ +   Protease:  A.   niger  có   kh   năng   t o   protease   và   polypeptidase.

ả ể Protease phân gi i protein thành polypeptid, pepton; peptidase chuy n hóa

ả ẩ các s n ph m trên thành acid amin.

ủ ế ả ạ + Cellulase:  A. niger có kh  năng t o cellulase, ch  y u là cellulase

Cl, cellulase Cx và (cid:0) ­glucosidase hay cellobiase.

ạ ả + Pectinase, Xylanase: A. niger có kh  năng t o pectinase, xylanase ở

oC, pH 5,6.

nhi ệ ộ ố t đ  t i thích 25

ạ ả ợ ạ Bên c nh đó, ổ A. niger  còn có kh  năng t ng h p hàng lo t enzyme

ư khác nh : lipase, mananase,...

ể ậ ấ ữ   *Phân b : ố A. niger là vi sinh v t hi u khí phát tri n trên các ch t h u ế

ể ượ ư ở ầ ấ ọ ơ ắ ơ c , do đó nó có th  đ c tìm th y g n nh kh p m i n i trong môi

ườ ứ ượ ấ ấ tr ấ ng   có   ch a   đ t.   Ngoài   ra, A.   niger  đ ả   c   tìm   th y   trong   ch t   th i,

ự ậ ữ ơ ệ ườ ờ ủ nguyên li u th c v t phân h y và phân h u c  trong môi tr ng ngoài tr i.

ượ ể ả ấ ấ ấ A. niger  đ ệ   ề c nuôi c y đ  s n xu t nhi u ch t trong công nghi p.

ủ ượ ử ụ ả ấ Các ch ng khác nhau c a ủ  A. niger cũng đ c s  d ng trong s n xu t citric

acid trên quy mô công nghi p.ệ

ế ố ả ưở ế ừ 1.1.3.3. Các y u t nh h ậ ng đ n thu nh n pectinase t A. niger

ị ượ ằ ự ổ ợ ọ Các nhà khoa h c đã xác đ nh đ c r ng s  t ng h p pectinase th ườ   ng

ờ ớ ồ ự ưở ả x y   ra   đ ng   th i   v i   s sinh   tr ng   c a ủ A.   niger.   Trong   khi   đó

ậ ị ạ ế ủ ủ ụ ứ ẩ ả pectinesterase b  ch m l i do tác d ng  c ch  c a các s n ph m th y phân

pectin (Maldonado M.C., 1998).

ườ ưỡ ồ ồ Môi tr ng dinh d ả   ng bao g m: ngu n carbon, nito, phospho…  nh

ưở ế ự ấ ớ ưở ủ h ng r t l n đ n s  sinh tr ậ ng c a vi sinh v t nói chung và A. niger nói

ườ ưỡ ả ưở ạ ộ ế riêng. Môi tr ng dinh d ng còn  nh h ng đ n ho t đ  enzyme và thành

ư ậ ự ế ầ ẩ ọ ườ ặ ph n enzyme trong ch  ph m. Nh  v y, l a ch n môi tr ng đ c hi u s ệ ẽ

ả ự ổ ợ ị ướ ả đ m b o s  t ng h p đ nh h ng enzyme.

Ả ưở ủ ơ ấ ả ứ ồ 1.1.3.4.   nh h ng c a c  ch t c m  ng và ngu n carbon

ư ể ệ ặ ả ặ ộ ạ H   pectinase   m t   m t   là   enzyme   b n   th ,   nh ng   m t   khác   l i   là

ả ứ ư ộ ế   ủ enzyme c m  ng nh  các enzyme th y phân khác. Do đó, m t trong các y u

ơ ấ ặ ủ ự ọ ọ ợ ổ ố t ệ    quan tr ng c a s  sinh t ng h p pectinase là ch n đúng c  ch t đ c hi u

cho A. niger.

ượ ổ ườ ẽ ả ứ ự ổ Pectin   đ c   b   sung   vào   môi   tr ng   s   c m   ng   s ợ     t ng   h p

ư ậ ự ặ ườ ưỡ pectinase. Nh  v y, s  có m t pectin trong môi tr ng dinh d ề   ng là đi u

ả ứ ể ệ ấ ắ ơ ộ ộ ố ộ ki n b t bu c. C  ch t pectin c m  ng có th  dùng b t cà r t, b t linh

ộ lăng, b t táo, cam,…

ượ ấ ồ Ch ng  ủ A. niger  đ c nuôi c y trên ngu n carbon khác nhau (pectin,

ộ ở ồ ạ ộ tinh b t, inulin, maltose, galactose n ng đ  2%, 4% và 6%) t o pectinase

ấ ườ cao nh t còn môi tr ng có monosaccharide và glycerin hoàn toàn không thu

ượ ổ ườ đ c enzyme này (Akhter N, 2011). B  sung glucose vào môi tr ng có

ệ ượ ẽ ế ự ổ ứ lactose và pectin s  gây hi n t ợ ng  c ch  s  t ng h p pectinase (Phutela

U, 2005).

ừ ớ ồ ườ V i ngu n carbon là saccharose khi có th a trong môi tr ng (>2%) s ẽ

ứ ế ự ổ ả ứ ợ ầ ư ằ c ch  s  t ng h p c m  ng pectinase. Cũng c n l u ý r ng t ỷ ệ ữ    gi a l

ặ ệ pectin và carbohydrate cũng có ý nghĩa, đ c bi t là các t ỷ ệ  l 1:2, 3:2 và 4:2

ườ ụ ố ưở ư th ng có tác d ng t ự t cho s  sinh tr ng c a ủ A. niger cũng nh  cho quá

ổ trình t ng h p ợ pectinase.

Ả ưở ủ ồ ơ 1.1.3.5.  nh h ng c a ngu n nit

ơ ự ấ ọ ổ ợ Nit cũng có vai trò r t quan tr ng trong s  sinh t ng h p pectinase

ồ ơ ướ ạ ố ậ ở b i vi sinh v t. Ngu n nit ơ ủ ế  vô c  ch  y u d ố   i d ng mu i nitrate và mu i

ử ụ ả ơ ệ amonium. Đ i v i ả   ố ớ A. niger  s  d ng sulphate amonia là hi u qu  h n c .

ử ụ ồ ơ ị ườ ị Khi s  d ng ngu n nit này, d ch canh tr ế ng b  acid hóa đ n pH 2,5 ­ 3,0.

Ở ự ố ơ pH này có s  tích lũy pectinase t t h n (Akhter N, 2011).

ế ự ổ ẽ ứ ủ ề ạ ố ợ   Tuy nhiên, mu i nitrate c a kim lo i ki m s   c ch  s  t ng h p

ưở ườ ủ pectinase. Khi sinh tr ng trên môi tr ố ng có thêm mu i nitrate c a kim

ụ ề ẽ ạ ả ơ ủ A. lo i ki m s  làm pH tăng 5,5 ­ 5,8 nên kh  năng tiêu th  nit nitrate c a

ẽ ả niger s  gi m.

ơ ữ ơ ị ố ợ ớ ạ Các d ng nit ồ    h u c  (d ch whey, pepton, cám…) ph i h p v i ngu n

ụ ơ ố ế ự ổ ợ nito vô c  có tác d ng t t đ n s  t ng h p pectinase(Phutela U, 2005).

ườ ả ố ưở ế ự ổ Trong môi tr ng có mu i amonium sulphate  nh h ợ   ng đ n s  t ng h p

ủ ể ừ ỷ ệ ố ủ EPG c a ch ng A. niger có th  tăng t 7 ­ 10%. T  l t ữ i thích gi a C và N

ự ổ ằ ợ ớ ạ ế cho s  t ng h p enzyme n m trong gi i h n 7:1 đ n 13:1.

Ả ưở ế ố ủ 1.1.3.6.   nh h ng c a các y u t khác

ố ả ơ ưở ế ự ổ ợ Các nguyên t vô c  có  nh h ở   ng đ n s  sinh t ng h p pectinase b i

ướ ạ A. niger  mà tr c tiên là tr ng thái sinh lý c a ủ A. niger. Nói chung hàm

ượ ườ ả ượ ơ l ng phospho trong môi tr ng ph i không đ c ít h n 8 ­ 10 mg. Khi s ử

ồ ơ ủ ề ầ ủ A. ụ d ng ngu n nit c a phosphate diamonium thì nhu c u v  phosphor c a

ượ ỏ ườ ổ ợ niger hoàn toàn đ c th a mãn. Môi tr ng t ng h p pectinase có t ỷ ệ ố   i  t l

ư ơ ủ ả ộ ữ u gi a nit và carbon, pectin và carbohydrate bã c  c i là 3 ­ 4%, b t ngô

0,5%, (NH4)2HP04 0,7%, MgS04 0,05%.

ế ố ủ ư ườ ưỡ ươ Các y u t khác nh  pH c a môi tr ng dinh d ng, ph ng pháp

ệ ộ ệ ề ấ ấ ờ ấ nuôi c y, nhi ả   ề t đ , th i gian nuôi c y và đi u ki n nuôi c y,… đ u có  nh

ưở ế ự ổ ợ h ng đ n s  t ng h p pectinase.

ự ưở ợ S  sinh tr ng c c đ i c a ự ổ ự ạ ủ A. niger và s  t ng h p polygalacturonase

oC, trong 2 ­ 5 ngày, còn polymethylesterase

ễ ở ề ệ ệ ộ di n ra đi u ki n nhi t đ  30

trong 5 ­ 7 ngày (Martos M.A., 2009).

ƯƠ CH NG 2

Ụ ƯƠ Ứ Ộ M C TIÊU, N I DUNG VÀ PH NG PHÁP NGHIÊN C U

ứ ụ 2.1. M c tiêu nghiên c u

ượ ự ả ưở ộ ố ế ố ế ủ ườ ị Xác đ nh đ c s   nh h ng c a m t s  y u t đ n môi tr ng và

ệ ề ổ ợ đi u ki n lên men sinh t ng h p pectinase t ừ ủ A. niger CF2. ch ng

ứ ộ 2.2. N i dung nghiên c u

ứ ả ưở ộ ố ế ố ế  Nghiên c u  nh h ng c a ủ m t s  y u t đ n quá trình lên men sinh

ợ ổ t ng h p pectinase t ừ ủ A. niger CF2: ch ng

ứ ả ưở ượ ­ Nghiên c u  nh h ng c a ủ hàm l ng pectin

ứ ả ưở ờ ­ Nghiên c u  nh h ng c a ủ th i gian lên men

ứ ả ưở ­ Nghiên c u  nh h ng c a ủ nhi t đệ ộ

ứ ả ưở ­ Nghiên c u  nh h ng c a ủ đ   mộ ẩ

ủ ặ ị  Xác đ nh đ c tính c a pectinase t ừ ủ A. niger CF2 ch ng

ậ ệ ứ 2.3. V t li u nghiên c u

ậ ệ 2.3.1. V t li u

ừ ộ ư ậ ủ ộ ố Ch ng ủ Aspergillus niger CF2t b  s u t p gi ng c a b  môn Công

ạ ọ ệ ệ ệ ngh  Vi sinh – Hóa sinh, Vi n công ngh  sinh h c, ệ   ọ Đ i h c Lâm Nghi p

ệ Vi t Nam.

2.3.2.Hóa ch tấ

ệ ấ ạ ộ Các hóa ch t dùng trong thí nghi m có đ  tinh s ch và ch t l ấ ượ   ng

ừ cao t các hãng uy tín :

3,5 – Dinitrosalisilic, Diagalacturonic acid, Mono galatacturonic acid,

ệ Pectin, Polygalacturonic  acid, Trigalacturonic acid, Butanol,  Đ m pH 4,5,

DNS…

2.3.3. Thi t bế ị

ộ ố ệ ế ị Trong quá trình thí nghi m, m t s  trang thi t b  và máy móc đã đ ượ   c

ạ ệ ệ ệ ọ ử ụ s  d ng t i Vi n Công ngh  sinh h c Lâm Nghi p nh : ư  Cân phân tích, n iồ

ủ ấ ủ ạ ể ữ ố ử ấ h p kh  trùng, t ậ  c y vi sinh v t vô trùng, t l nh đ  gi gi ng, t ủ ấ     m

ắ ổ ể ậ ấ ọ ệ nuôi c y vi sinh v t, kính hi n vi quang h c, máy l c  n nhi t, máy đo OD ,

ỏ ộ ố ụ ử ụ máy ly tâm nh  Micro Centrifuge II. Ngoài ra còn s  d ng m t s  d ng c ụ

ế ư ệ ố ầ c n thi t nh  đĩa petri, pipet, bình tam giác,  ng nghi m…

ườ ấ 2.3.4. Môi tr ng nuôi c y

ườ ạ ố ­ Môi tr ng ho t hóa và nhân gi ng

ườ +Môi tr ng Crapeck

Hàm l ngượ Hàm Thành ph nầ Thành ph nầ ng (g/l)

Saccharose Agar ướ ấ N c c t pH (g/l) 30 15 1000ml 6,0

ượ l 2,00 1,00 0,50 0,50 0,01 NaNO3 K2HPO4 MgSO4 KCl FeSO4

ườ ợ ổ ­ Môi tr ng lên men sinh t ng h p enzyme pectinase (%): cám

ấ ị ạ g o (70), tr u (20), pectin (8­16), d ch khoáng * 2 ml

4)SO4  (4),   KH2PO4  (2),   MgSO4.7H2O   (1),

ị *   D ch   khoáng   (g/L):   (NH

FeSO4.H2O (6,3.10­5), ZnSO4 (6,2.10­5), MnSO4 (1.10­6)

ươ ứ 2.3.5. Ph ng pháp nghiên c u

ạ ấ ố ữ ố ệ ủ 2.3.5.1. Ho t hóa ch ng n m m c và gi ố  gi ng trong  ng nghi m

ổ ườ ử ấ Đ  môi tr ử ụ ng Crapeck lên đĩa petri, s  d ng que c y đã kh  trùng

ể ấ ồ ử ấ ừ ố ệ ạ ằ b ng   c n   c y   chuy n   bào   t n m   t ằ     ng   nghi m   ra   đĩa   th ch   b ng

ươ ể ấ ấ ặ ủ ấ ph ng pháp c y ch m đi m.Sau đó đem đĩa đ t trong t m nuôi ở ề    đi u

oC trong 3 – 5 ngày.

ệ ệ ộ ki n nhi t đ  30

ủ ố 2.3.5.2. Nhân gi ng ch ng A. niger

ứ ườ S  d ng bình tam giác có dung tích 100ml ch a 20ml môi tr ng

ử ụ nhân gi ng.ố

ử ụ ể ấ ử ừ ể ấ ấ ạ S  d ng que c y đ  c y chuy n n m (bào t ) t trên đĩa th ch vào

ể ị ượ ử ằ trong bình tam giác (chú ý đo OD đ  xác đ nh l ng các bào t b ng nhau).

oC. Sau

ệ ườ ắ ở ở ệ ộ ề Nuôi trong đi u ki n môi tr ng l c 150 vòng/phút nhi t đ  30

ệ ợ ủ ủ ấ ậ ư 3 ngày nuôi c y, thu nh n h  s i (pellet) c a các ch ng A. niger đ a vào

lên men.

ệ ề ợ ổ ừ ấ 2.3.5.3.  Đi u ki n nuôi c y sinh t ng h p pectinase t A.niger

ượ ắ ườ ủ Ch ng A.niger  CF2   đ c   nuôi   l c   trong   môi   tr ng   Crapeck ở

ứ ơ ấ ấ ố 30oC.Sau 3 ngày, c p gi ng vào bình tam giác ch a c  ch t cám – tr u t ấ ỷ ệ l

6 bào t

ớ ỷ ệ ử ườ (7:2) v i t l 2.10 /g môi tr ng.

ượ ượ ở ồ ộ Hàm l ng pectin: đ ả c kh o sát các n ng đ  8, 12, 16% (w/w)

oC m u đ ẫ

ươ ớ ộ ẩ ứ ở ượ t ng  ng v i đ   m 50%, sau 3 ngày nuôi 30 c đánh giá

ạ ộ ho t đ  enzyme.

ộ ẩ ườ ượ ở ố Đ   m môi tr ng: đ ả c kh o sát các m c 50, 60, 70% (w/w) khi

ứ ủ ệ ườ nuôi ch ng thí nghi m trong bình 250ml ch a 16g môi tr ổ ng có b  sung

12% (w/w) pectin.

oC trong

ử ệ ố ệ ộ Nhi ệ ộ ượ t đ : đ ớ c th  nghi m v i các m c nhi t đ  24, 30, 37

ườ ộ ẩ ổ 16g môi tr ng b  sung 12% pectin và đ   m 60%.

ủ ờ ượ ề ệ Th i gian lên men: ch ng đ ợ   c lên men theo các đi u ki n thích h p

ẫ ả ờ ị tìm đ ượ ở c trên, đ nh kì các kho ng th i gian 3, 5 và 7 ngày, m u canh

ườ ượ ạ ộ ị tr ng đ c xác đ nh ho t đ  pectinase.

ứ ệ ề ệ ố ợ ổ   Các b  trí thí nghi m nghiên c u các đi u ki n thích h p sinh t ng

ượ ễ ở ả ể ợ h p Pectinase đ c bi u di n b ng 2.1.

ứ ệ ệ ề ả ố ợ B ng 2.1 B  trí thí nghi m nghiên c u các đi u ki n thích h p sinh

ợ ổ t ng h p Pectinase

ờ ST Hàm l ngượ Đ   mộ ẩ Nhi t đệ ộ Th i gian lên

(%) (oC) men (gi )ờ

60 30 72

pectin (%) 8 12 16 Hàm   l ngượ

T 1 2 3 4 5 pectin   thích 30 72 50 60 70 6

h pợ Hàm   l ngượ ộ Đ ẩ   m pectin   thích 72 7 8 9 24 30 37 thích h pợ

h pợ Hàm   l ngượ ộ ệ Đ ẩ   m Nhi t đ ộ pectin   thích 10 11 12 72 120 168 thích h pợ thích h pợ h pợ

ườ ướ ượ ổ Hình 2.1: Môi tr ng lên men tr c khi đ ị c b  sung d ch khoáng

ị 2.3.5.4. Thu d ch enzyme thô

ị ượ ế ệ ằ D ch enzyme đ c chi t tách b ng đ m phosphate pH 4,5 (t ỷ ệ  l chi ế   t

ườ ệ đ m: môi tr ắ ng nuôi là 7:1) trên máy l c 200 vòng/ phút trong 1 gi ờ ọ   , l c

ọ ằ ấ ọ ả ị qua v i màn sau đó l c b ng gi y l c Whatman No1. D ch sau khi l c đ ọ ượ   c

ổ ị ly tâm 10.000 vòng/ phút trong 20 phút 4ở oC và thu d ch n i (enzyme thô).

ế ủ ằ 2.3.5.5. K t t a enzyme b ng ethanol

oC) theo tỷ

ị ượ ổ ạ D ch enzyme sau khi ly tâm đ c s  sung ethanol l nh (0

ể ị ế ị ệ l ổ  1:3, đ  d ch  n đ nh 2 ti ng ở o – 4oC, sau đó ly tâm 10.000 vòng/ phút 0

ế ủ ị trong 5 phút 4ở oC. Hòa tan k t t a trong đ m pH 4,5 và xác đ nh ho t đ ệ ạ ộ

Pectinase.

ị ượ ườ 2.3.5.6. Đ nh l ng đ ử ằ ng kh  b ng DNS

ử ượ ườ ị ươ ủ Đ ng kh  đ c xác đ nh theo ph ng pháp c a Miller G.L (1959)

ắ ươ ả ứ ự ạ ữ   ơ ở ng pháp này d a trên c  s  ph n  ng t o màu gi a ­  Nguyên t c: ph

ườ ử ớ ườ ủ ử ố ộ đ ả   ng kh  v i thu c th  acid dinitro salisilic. C ng  đ  màu c a ph n

ứ ỉ ệ ộ ườ ậ ấ ị ử ộ ng t  l ớ ồ  thu n v i n ng đ  đ ạ ng kh  trong m t ph m vi nh t đ nh. Bi ế   t

ượ ậ ộ ủ ị ườ ồ ị ự ứ ử đ c m t đ  quang c a d ch đ ẩ   ng kh  nghiên c u, d a vào đ  th  chu n

ượ ườ ử ủ ị ứ monogalacturonan suy ra hàm l ng đ ng kh  c a d ch nghiên c u.

ậ ườ ẩ ẫ ế       ­   Cách   ti n   hành:   L p   đ ng   chu n:   pha   các   m u   đ ườ   ng

ả ứ ồ ồ ộ ị ị ớ   monogalacturonan có n ng đ  xác đ nh r i cho 200 µl d ch ph n  ng v i 1

ả ượ ử ế ố ờ ml thu c th  DNS trong th i gian 10 phút. K t qu  đ c đem đo m t đ ậ ộ

ừ ậ ượ ồ ị ể ố quang ở ướ  b c sóng 575nm. T  đó l p ra đ ễ c đ  th  bi u di n m i quan h ệ

ữ ượ ườ ậ ộ ẫ ớ gi a hàm l ng đ ng monogalacturonantrong m u v i m t đ  quang OD.

ự ế ả ườ ẩ ượ ể K t qu  xây d ng đ ng chu n monogalacturonan đ ễ c bi u di n trong

ồ ị ướ đ  th  d i đây:

ồ ị ườ ẩ Hình 2.2: Đ  th  đ ng chu n monogalacturonan

ừ ồ ị ể ượ ồ ộ ườ ẫ ừ ử T  đ  th  trên, có th  tính đ c n ng đ  đ ng kh  trong m u t giá

ị ậ ộ ươ tr  m t đ  quang theo ph ng trình sau:

x =  (mg/ml)

ượ

ườ

ẫ

Trongđó:   x: hàm l

ng đ

ng có trong m u (mg/ml)

ị ậ ộ

y: giá tr  m t đ  quang (OD)

ạ ộ ị 2.3.5.7. Xác đ nh ho t đ  Pectinase

ạ ộ ượ ấ ớ ơ ị Ho t   đ   Pectinase   đ ả ứ   c   xác   đ nh   v i   c   ch t   pectin.   Ph n   ng

ượ ự ớ ị enzyme đ ệ c th c hi n v i 180 µl dung d ch pectin 1% (w/v) và 20 µl dung

oC trong 10 phút.

ượ ớ ồ ộ ợ ở ị d ch enzyme (đ c pha loãng t i n ng đ  thích h p), 50

ả ứ ừ ằ ị ế   D ng ph n  ng b ng 1 ml dung d ch DNS và đun sôi trong 10 phút. Ti p

ả ứ ỗ ị ở ế đ n, li tâm h n d ch ph n  ng ạ    10.000 vòng/phút trong 1 phút (cho lo i

ộ ấ ế ự ặ c n n u có). Đo đ  h p th ụ ở ướ  b c sóng 575 nm. D a vào đ  th  đ ồ ị ườ   ng

ạ ộ ể ẩ ớ ố ị ử chu n acid galacturonic v i thu c th  DNS đ  xác đ nh ho t đ  enzyme.

ộ ơ ị ượ ầ ế ể ạ ộ M t đ n v  ho t đ  Pectinase là l ng enzyme c n thi t đ  xúc tác

ể ạ ờ chuy n hóa pectin t o thành 1 µmol acid galacturonic trong th i gian 1 phút

ở ữ ợ ủ ạ ộ ề ệ nh ng đi u ki n ho t đ ng thích h p c a enzyme.

ạ ộ ượ ứ ị Ho t đ  pectinase đ ằ c xác đ nh b ng công th c:

H =   (U/ml)

ượ ườ ử Trong đó:    X: hàm l ng đ ủ ng kh  sau th y phân (mg/ml)

ệ ố f: h  s  pha loãng

ổ ệ ố     1000: h  s  quy đ i

ố ượ ử 600: kh i l ng phân t pectin

ủ ờ t: th i gian th y phân (10 phút)

ủ ả ặ 2.3.5.8.  Kh o sát đ c tính c a Pectinase

ệ ộ ố ư ủ ượ ế ươ Nhi t đ  t i  u c a enzyme đ c ti n hành theo ph ng pháp xác

oC.

ạ ộ ở ệ ộ ả ừ ị đ nh ho t đ  Pectinase các nhi t đ  khác nhau trong kho ng t 30 – 70

ộ ề ể ả ệ ệ Đ  kh o sát đ  b n nhi t, enzyme đ ượ ủ c ị  trong dung d ch đ m citrate

oC).

́ ́ ở ̣ ̣ ̉ photphat 0,1M pH 4,5 cac nhiêt đô khac nhau (trong khoang t ̀ ư  30 ­ 70

́ ̃ ̃ ư ̀ ơ ờ ̉ ̣ ̣ Sau nh ng khoang th i gian 1 – 7 gi ́ , lây mâu xac đinh hoat đô ̣ Pectinase

̣ ̀ con lai.

́ ́ ưở ượ ở ̉ ̉ ̣ ̣ ̣ ̣ Anh h ng cua pH đên hoat tinh enzyme đ ́ c xac đinh ́    nhiêt đô tôi

́ ư ́ ơ ơ ượ ̉ ̣ ̣ u cua enzyme v i c  chât đ c pha trong dung dich đêm citrate photphat

̀ ́ ́ ́ ̣ ̉ ́ 0,1M co cac gia tri pH khac nhau năm trong khoang t ̀ ́ ̉  ư  pH 3,0 đên 7,0. Đê

oC v i dung dich đêm

́ ̀ ượ ̉ ở ́ơ ̉ ̣ ̣ ̣ ̀ khao sat đô bên pH, enzyme đ ̃ c pha loang va u 40

́ ́ ́ ́ ̃ ư ̀ ơ ờ ̣ ̉ trên co cac gia tri pH khac nhau, sau nh ng khoang th i gian 1 – 6 gi ́ , lây

̀ ́ ́ ̃ ́ ơ ơ ượ ̣ ̣ ̣ mâu xac đinh hoat đô ̣ Pectinase  con lai (v i c  chât đ c pha trong dung

̣ ̣ dich đêm pH 4,5).

́ ́ ́ ̀ ưở ượ ̉ ̉ ̣ Anh h ng cua ion đên hoat tinh enzyme đ ́ ̉  ư c nghiên c u băng cach u

2+, Fe2+, Mn2+  (nông đô cuôi 10

́ ́ ̀ ̣ ̣ ̣ ́ ơ dung dich enzyme v i cac ion kim loai Ca

oC trong 10 phut, sau đo ́

́ ở ̣ mM) trong đêm cictrate photphat 0,1M (pH 4,5) 50

́ ́ ̀ ̃ ̀ ̣ ̣ ̣ ̉ xac đinh hoat đô ́ ơ ̣ Pectinase con lai va so sanh v i mâu không bô sung ion kim

́ ư ố ̣ loai (đ i ch ng).

ươ ố ệ 2.3.5.9.  Ph ử ng pháp x  lý s  li u

ệ ượ ầ ặ ự ệ ế ả ớ Các thí nghi m đ ứ   c th c hi n v i 3 l n l p.Các k t qu  nghiên c u

ầ ặ ạ ủ là trung bình c a 3 l n l p l i.

ƯƠ Ứ Ế CH Ả NG 3.K T QU  NGHIÊN C U

ủ ấ ạ 3.1. Ho t hóa ch ng n m m c ố A.niger CF2

ờ ạ ườ A.niger  CF2 sau 72 gi ho t hóa trong môi tr ng Czapeck có hình

ệ ợ ử ư ử ậ thái h  s i và bào t nh  hình 3.1. Bào t hình tròn, màu nâu đ m, m t đ ậ ộ

ụ ạ ắ ệ ợ h  s i trung bình D=2­3cm có màu tr ng đ c, d ng hình tròn.

ấ Hình 3.1: A. niger sau 3 ngày nuôi c y trong t ủ ấ ở oC m 30

ế ố ả ả ưở ổ ế ả 3.2.    Kh o   sát   các   y u   t nh   h ợ   ng   đ n   kh   năng   sinh   t ng   h p

pectinase

ưở ủ ượ Ả 3.2.1.  nh h ng c a hàm l ng pectin

ứ ấ ơ ổ ợ   ả Pectin  đóng   vai   trò   là   c   ch t   c m   ng   cho   quá   trình   t ng   h p

ớ ươ ắ ượ ử ụ ượ pectinase. V i ph ng pháp lên men r n, l ng pectin s  d ng đ ả   c kh o

ả sát trong kho ng 8 – 16% (w/w). Sau 3 ngày nuôi, ho t đ ạ ộ pectinase  cao

ở ượ nh t đ t ấ ạ 2,231 U/g hàm l ng pectin 12% (w/w)  ( hình 3.2).

Ả ưở ạ ộ ủ ế Hình 3.2:  nh h ng c a pectin đ n ho t đ  pectinase

ứ ế ả ươ ứ ớ K t qu  nghiên c u cũng t ng  ng v i công b  c a ố ủ nhóm sinh viên

ộ ườ ườ ạ ọ ủ ầ ộ thu c Khoa Tài nguyên Môi tr ng, Tr ng Đ i h c Th  D u M t [1] .

ạ ộ ượ ấ Theo  báo cáo nghiên c u,ứ   ho t đ  enzyme thu đ c cao nh t trong môi

ườ ơ ấ ắ ổ tr ng r n có b  sung 12% c  ch t pectin.

ỗ ợ ượ ướ Hình 3.3: H n h p (enzyme thu đ c + pectin 1%) tr c khi đo OD

ứ ỗ ợ ồ ị ể ấ ố Có th  th y,  ng Efpendort ch a h n h p dung d ch g m enzyme thu

ượ ấ ồ ế ố ậ ố đ ượ ạ c t i hàm l ng pectin 12% có màu đ m nh t r i đ n  ng 16% và  ng

8% có màu sáng nh t. ấ

ưở Ả 3.2.2.  nh h ng c a đ   m ủ ộ ẩ môi tr ngườ

ộ ẩ ườ ả ưở ế ự ấ ớ Đ   m môi tr ầ ng ban đ u có  nh h ng r t l n đ n s  sinh tr ưở   ng

ể ủ ả ậ ắ ưở ớ ự và phát tri n c a vi sinh v t khi lên men r n, do đó  nh h ng t i s  sinh

ộ ẩ ủ ấ ợ ơ ườ ẽ ổ t ng h p các enzyme th y phân c  ch t. Đ   m môi tr ổ   ng s  thay đ i

ộ ẩ ứ ụ ệ ậ liên t c trong quá trình lên men, do v y vi c nghiên c u đ   m cho môi

ườ ấ ẽ ủ ượ ấ ọ ướ tr ộ ẩ ng r t quan tr ng. Đ   m th p s  không đ  l ng n ấ c cho n m sinh

ưở ượ ạ ộ ẩ ả ưở ự ự ế tr ng, ng i đ   m quá cao cũng  nh h c l ng tiêu c c đ n s  sinh

ưở ấ ở ộ ẩ ế ả ộ tr ng do đ  thoáng khí gi m. ả   K t qu  hình 3.4 cho th y đ   m 60%

ấ ạ ả ợ ổ ch ng ủ A.niger CF2 cho kh  năng sinh t ng h p pectinase cao nh t đ t 3,422

ẩ ị ượ ủ ị U/g. Giá tr  hàm  m 60% cũng đ c xác đ nh cho ch ng A.niger  CF2 khi

ườ nuôi trên môi tr ắ ng r n.

Ả ưở ủ ộ ẩ ế ừ ủ Hình 3.4:  nh h ng c a đ   m đ n pectinase t ch ng A.niger CF2

ự ủ ấ ộ Báo cáo c a Nazneen Akhter cùng c ng s  cũng cho th y ho t đ ạ ộ

ượ ấ ớ ẩ ị enzyme pectinase thu đ c cao nh t v i giá tr  hàm  m 60% [3]

ưở Ả 3.2.3.  nh h ủ ng c a  nhi ệ ộ t đ

ệ ộ ả ưở ể ủ ế ự ấ ớ ậ ỗ Nhi t đ   nh h ng r t l n đ n s  phát tri n c a vi sinh v t, m i vi

ể ậ ưở ụ ổ ợ sinh v t có th  sinh tr ộ   ng và sinh t ng h p enzyme m c tiêu trong m t

ặ ạ ạ ộ ủ ấ ố ấ ị ph m vi nh t đ nh. M c dù, A. niger  là ch ng n m m c ho t đ ng trong

oC nh ng qua nghiên c u tài li u cho

ệ ộ ư ấ ả ư ứ ệ vùng nhi t đ   a  m kho ng 20 – 40

ấ ệ ộ ủ ổ ợ th y nhi t đ  sinh t ng h p pectinase c a các ch ng ủ A. niger r t khác nhau. ấ

oC cho sinh t ng h p ợ

ủ ấ ộ ổ A. niger ự Bai ZH và c ng s  nuôi c y ch ng 30ở

oC cho nuôi c yấ

ự ạ ộ pectinase[2], trong khi đó Akhter N. và c ng s  l ọ i ch n 40

oC [4].

ự ộ A. niger IM­6 [3], Leda R Castilho và c ng s  nuôi c y ấ A. niger 35ở

ứ ả ưở ệ ộ ế ổ Nghiên c u  nh h ủ ng c a nhi ợ   t đ  đ n quá trình sinh t ng h p

oC.

ủ ượ ự ệ ả ủ enzyme c a ch ng A. niger  CF2 đ c th c hi n trong kho ng 24 ­ 37

oC A. niger CF2

ả ượ ế ể ệ ở ấ ở ệ ộ K t qu  đ c th  hi n hình 3.5 cho th y nhi t đ  30

ể ạ ấ ấ ợ ổ phát tri n m nh nh t và cũng sinh t ng h p pectinase cao nh t (5,4 U/g).

oC cho các nghiên c u ti p theo

ự ọ ệ ộ ấ ứ ế . Do đó l a ch n nhi t đ  nuôi c y 30

Ả ưở ệ ộ ạ ộ ế Hình 3.5:  nh h ủ ng c a nhi t đ  lên men đ n ho t đ  enzyme

ưở ủ ờ Ả 3.2.4.  nh h ng c a th i gian lên men

ả ờ ưở ả ấ ớ Th i gian lên men có  nh h ờ   ng l n trong s n xu t enzyme. Th i

ể ạ ấ ắ gian lên men đ  đ t ho t đ ả   ạ ộ pectinase cao nh t càng ng n thì chi phí s n

ế ấ ả ấ ủ ả xu t càng th p. K t qu  hình 3. ấ 6 cho th y ch ng A. niger CF2 có kh  năng

ờ ế ổ sinh t ng h p ợ pectinase cao nh t ấ 5,572 U/g sau 72 gi . K t qu  c a ả ủ Mukesh

ự ấ ộ ừ ủ Bacillus sp. MFW7 kumar D J. và c ng s  nuôi c y ch ng ủ A. niger t ch ng

ấ ọ cũng cho ho t đ ạ ộ pectinase cao nh t sau 72 gi ờ   ờ 8]. Do v y l a ch n th i ậ ự [

ấ ờ ể gian nuôi c y 72 gi ậ  đ  thu nh n enzyme A. niger CF2 [10][12]

Ả ưở ủ ờ ế ả Hình 3.6:  nh h ổ   ng c a th i gian lên men đ n kh  năng sinh t ng

ợ ủ h p pectinase c a A.niger CF2

ả ả ừ ế ấ ượ ẩ T  k t qu  kh o sát cho th y 3 thông s ố hàm l ng pectin, hàm  m và

ưở ớ ượ nhi ả t đệ ộ  nh h ng đáng k  đ n ạ ộ ể ế ho t đ  peptinase . V i hàm l ng pectin

ộ ẩ ượ 12%, đ   m 60% và nhi ệ ộ oC ho t đ t đ  30 ạ ộ pectinase thu đ ấ   c cao nh t sau 72

ờ gi lên men.

3 ngày 5 ngày 7 ngày

ườ Hình 3.7: Môi tr ng lên men thu enzyme pectinase sau 3,5 và 7 ngày

ể ấ ể ệ ợ ấ Ta có th  th y sau 3 ngày, h  s i n m phát tri n và ăn lan khá dày

ề ặ ơ ứ ứ ấ ớ ệ ợ   ặ đ c trên b  m t c  ch t tuy nhiên so v i ngày th  5, ngày th  7; h  s i

ấ ơ ư ộ ơ ơ ơ ấ n m an lan r ng h n, dày h n, đâm sâu vào c  ch t h n nh ng ho t đ ạ ộ

ở ứ ạ ứ ữ ề ấ enzyme ngày th  3 l ả   i cao nh t. Đi u đó ch ng minh qua nh ng hình  nh

ộ ậ ạ ở ỗ ự ệ ợ sau khi có s  chênh l ch đ  đ m nh t ị  h n h p dung d ch (enzyme thu

ượ đ c + pectin 1%):

ậ ơ ị ạ ơ ị 3 ngày – màu dung d ch đ m h n 5 ngày – màu dung d ch nh t h n

ỗ ợ ị ượ Hình 3.8: H n h p dung d ch (enzyme thu đ c + pectin 1%) sau 3, 5

ngày

ặ ừ ủ ủ 3.3. Đ c tính c a peptinase t ch ng A. niger CF2

ưở ộ ề ủ ế ạ Ả 3.3.1.  nh h ng c a pH đ n ho t tính và  đ  b n enzyme

ưở ệ ế ả ứ ấ ả ưở ả pH  nh h ng r t rõ r t đ n ph n  ng enzyme vì pH  nh h ế   ng đ n

ộ ề ủ ứ ộ ơ ấ ế ả ậ m c đ  ion hóa c  ch t và đ  b n c a enzyme. Vì v y, ti n hành kh o sát

ả ưở ủ ế nh h ạ ng c a pH đ n ho t tính pectinase c a ủ A. niger  CF2 qua đó xác

ượ ố ư ủ ị đ nh đ c pH t i  u c a enzyme.

ố ư ủ  pH t i  u c a pectinase t ừ A. niger CF2

ể ố ư ủ ủ ượ ị Đ  xác đ nh pH t i  u, pectinase c a ch ng A. niger CF2 đ ả   c ph n

ứ ượ ̣ ̣ ấ đ ớ ơ ng v i c  ch t ́ c pha trong dung dich đêm citrate photphat 0,1M co cać

̀ ́ ́ ́ ờ ̣ ̉ gia tri pH khac nhau năm trong khoang t ̀ ư  pH 3,0 đên 7,0 trong th i gian 10

ạ ộ ươ ố ố ủ ượ ệ ữ phút. M i quan h  gi a pH và ho t đ  t ng đ i c a enzyme thu đ c th ể

ệ ở hi n hình 14.

Ả ưở ủ ế ừ Hình 3.9:  nh h ạ ộ ng c a pH đ n ho t đ  enzyme pectinase t A.niger

CF2

ế ả ấ ừ A.niger CF2 K t qu  hình 3.9 cho th y enzyme pectinase t ủ  ch ng

ạ ộ ừ ượ ho t đ ng trung vùng pH t ạ ộ  4 – 5 và ho t đ  enzyme thu đ c cao nh t p ấ ử

Ở ủ ạ ố ự ổ pH = 5. pH này, ho t tính c a pectinase là t i đa và s  thay đ i pH cao

ạ ấ ạ ộ ể ộ ủ ề ấ ặ ơ ơ h n ho c th p h n đ u làm h  th p đáng k  đ  ho t đ ng c a enzyme.

ộ ố ả ủ ứ ặ M t s  tác gi khi nghiên c u đ c tính c a pectinase t ừ A. niger cũng tìm

ượ ả ạ ả ằ ợ ừ đ c d i pH thích h p cho ho t tính pectinase n m trong kho ng t 3,5 ­

ố ư 5,5 và pH t i  u là 4,5 – 5,5[04, 05,06,11].

ộ ề ị Xác đ nh đ  b n pH:

ộ ề ả ằ ủ ạ ­ Kh o sát đ  b n pH ho t tính pectinase b ng cách enzyme ở

ệ ị ừ ữ ả ờ 40oC trong dung d ch đ m pH t 3 – 7, sau nh ng kho ng th i gian khác

ạ ộ ấ ẫ ị ạ ớ ơ ấ ượ nhau, l y m u xác đ nh ho t đ  pectinase còn l i (v i c  ch t đ c pha

ệ ế ả ị ượ ể ệ ở trong dung d ch đ m pH = 4,5). K t qu  thu đ c th  hi n hình 3.10.

Ả ưở ủ ừ Hình 3.10: nh h ế ộ ề ủ ng c a pH đ n đ  b n c apectinase t A. nigerCF2

ế ả ấ ừ ủ K t qu  cho th y pectinase t ch ng ề A.niger CF2 b n trong vùng pH

oC trong đ m pH 4 ­ 5 ho t đ  enzyme v n còn gi

ạ ộ ệ ẫ 4 – 5. Sau 6 gi ờ ủ ở 40 ữ

ầ Ở ạ ộ ổ ị ớ ơ h n 60% so v i ban đ u [12] pH 6, 7 ho t đ  enzyme không  n đ nh và

ể ả gi m đáng k  sau 6 gi ờ .

ưở ệ ộ ế ộ ề ạ Ả 3.3.2.  nh h ủ ng c a nhi t đ  đ n ho t tính và đ  b n enzyme

ệ ộ ố ư ủ  Nhi i  u c a pectinase t t đ  t ừ A. niger CF2

ề ỗ ộ ị ệ ộ ố ư ở ạ M i enzyme đ u có m t giá tr  nhi t đ  t i  u mà ủ    đó ho t tính c a

ượ ể ệ ư ạ ấ ệ ộ ở nó đ c th  hi n m nh nh t cũng nh  có vùng nhi t đ  mà ạ  đó ho t tính

ị ả ưở ấ ọ ề ệ ủ ớ enzyme ít b   nh h ng nh t g i là vùng b n nhi ụ   t c a enzyme. V i m c

ị ượ ệ ộ ố ư ủ đích xác đ nh đ c nhi t đ  t i  u c a pectinase t ừ A. niger  CF2, d chị

oC.

ượ ữ ổ ệ ộ enzyme đ c gi n nhi ệ ạ t t i các nhi t đ  30 – 70

Ả ưở ệ ộ ế ừ Hình 3.11:  nh h ủ ng c a nhi ạ ộ t đ  đ n ho t đ  peptinase t A. niger

CF2

ế ả ả ưở ệ ộ ế ạ ả K t   qu   kh o   sát   nh   h ủ ng   c a   nhi ủ   t   đ   đ n   ho t   tính   c a

oC – 40oC, ho tạ

ấ pectinase t ừ ủ A. niger CF2 th y khi tăng nhi ch ng ệ ộ ừ t đ  t 30

oC. Khi nhi

oC, ho tạ

ạ ự ạ ạ ệ ộ ớ ơ ộ đ  enzyme tăng và đ t c c đ i t i 40 t đ  l n h n 40

ư ậ ả ấ ệ ộ ố ư ủ ộ đ  enzyme gi m r t nhanh. Nh  v y, nhi t đ  t i  u c a pectinase t ừ A.

oC) c a peptinase t

ơ ớ ệ ộ ố ư ủ niger CF2 là 40oC, cao h n so v i nhi t đ  t i  u (35 ừ

ằ ệ ộ ủ Bacillus sp. MFW7[8], b ng nhi t đ  c a pectinase t ử ụ   ừ A. niger  s  d ng

ồ ừ ỏ ngu n cacbon t v  cam[ 9].

ộ ề ệ  Đ  b n nhi t:

oC

ị ượ ữ ổ ệ ộ ở D ch enzyme đ c gi n nhi ệ ạ t t i các nhi t đ  30 – 70 pH 4,5

ạ ộ ứ ế ả ờ ị trong kho ng th i gian 5h, c  1h ti n hành xác đ nh ho t đ  enzyme

ể ễ ả ế và bi u di n k t qu  trên hình

Ả ưở ệ ộ ế ộ ề Hình 3.12:  nh h ủ ng c a nhi t đ  đ n đ  b n pectinase

ừ ủ t ch ng A.niger CF2

ế ả ả ấ ừ ả ủ K t qu  kh o sát cho th y pectinase t c  ch ng A.niger  CF2 là

ề ệ ệ ộ ạ ộ ủ enzyme không b n nhi t. Khi nhi ả   t đ  tăng ho t đ  c a pectinase gi m

oC ho t đ  c a ạ ộ ủ

ỉ ề ở ệ ộ ớ ơ ầ d n và enzyme ch  b n 30 ­ 50ºC. Khi nhi t đ  l n h n 50

ả ấ ờ ạ ộ ấ ấ enzyme gi m r t nhanh và sau 5 gi thì ho t đ  enzyme còn r t th p.

ưở ủ ạ Ả 3.3.3.  nh h ạ ế ng c a ion kim lo i  đ n ho t tính enzyme

ạ ồ ệ ổ ộ Enzyme đ ượ ủ c trong đ m có b  sung ion kim lo i n ng đ  10mM.

ạ ộ ế ễ ể ả ị Xác đ nh ho t đ  và bi u di n k t qu  trên hình 3.13:

Ả ưở ạ ộ ạ ế ủ Hình 3.13:  nh h ng c a tính ion kim lo i đ n ho t đ  enzyme

2+, Mn2+, Fe2+  không  nhả

ừ ế ấ T  k t qu ả hình 3.13  cho th y, các ion Ca

ưở ạ ộ ủ ế ề ư ạ h ng nhi u đ n ho t đ  c a pectinase t ừ A. niger CF2 nh ng l i có tác

ạ ộ ủ ế ụ ứ d ng  c ch  ho t đ  c a enzyme.

2+,  Ca2+

ự ủ ằ ộ Báo  cáo   c a  A.  Rasheedha  Banu  và  c ng  s  cho  r ng  Mg

ả ưở ạ ộ ế ự ứ ế ề không làm  nh h ạ   ng nhi u đ n ho t đ ng pectinase, làm  c ch  s  ho t

ủ ộ đ ng c a pectinase t ừ ủ Penicillium chrysogenum [7]. ch ng

ế ứ ộ ả ệ ị ưở ả K t qu  thu đ ượ ừ c t các thí nghi m xác đ nh m c đ   nh h ủ   ng c a

ệ ộ ạ ộ ủ ể ư ế ế nhi ậ   t đ , pH đ n ho t đ  c a enzyme pectinase ta có th  đ a ra k t lu n

ệ ườ ơ ả ố ư ủ ấ ề ề v  đi u ki n môi tr ng c  b n t ạ ộ i  u nh t cho ho t đ ng c a enzyme.

ạ ộ ố ấ ườ pH b ngằ Enzyme peptinase ho t đ ng t t nh t trong môi tr ơ ấ ng c  ch t có

oC, th i gian lên men là 72 gi

ở ệ ộ ờ ờ ườ 5, nhi t đ  là 30 và môi tr ng lên men có

ượ ề ệ hàm l ng pectin 12% enzyme này khá là b n nhi ờ t vì qua th i gian 2 gi ờ   ,

ạ ộ ượ ẫ ở ứ ho t đ  enzyme đo đ c v n m c cao.

ƯƠ Ậ Ế Ế CH Ị NG 4. K T LU N VÀ KI N NGH

ậ ế 4.1.  K t lu n

ứ ờ ượ ộ ố ế ả Sau th i gian nghiên c u, báo cáo đã rút đ c m t s  k t qu  sau:

ượ ệ ề ắ ợ ­ Tìm đ c đi u ki n lên men r n thích h p đ ể A.  niger  CF2  sinh

ổ t ng h p ợ pectinase (5,57 U/g t i ạ 30oC, pectin 12%, 72 giờ).

ị ượ ặ ­ Đã xác đ nh đ c đ c tính xúc tác c a ủ pectinase: b n ề ở pH 4­5, 30­

ố ư 50ºC và pH t i  u 5, nhi ệ ộ ố ư 40oC. t đ  t i  u

ị ế 4.2. Ki n ngh

ế ụ ệ ả ứ ề ưở ế ệ ấ ­ Ti p t c nghiên c u các đi u ki n  nh h ng khác đ n hi u su t

ạ lên men t o enzyme pectinase c a ủ A. niger CF2.

ứ ươ ạ ­ Nghiên c u ph ng pháp tinh s ch enzyme pectinase

ứ ứ ụ ủ ủ ­ Nghiên c u  ng d ng enzyme pectinase c a ch ng A.niger CF2 vào

ấ ướ ả ượ ể ỏ ả quá trình s n xu t n c qu , r u vang và bóc v  cam, quýt,... đ  có th ể

ụ ụ ự ệ ẩ . ph c v  cho ngành công nghi p th c ph m

Ả Ệ TÀI LI U THAM KH O

ễ ầ ọ ọ ị 1. Tr n Ng c Hùng, Nguy n Anh Dũng, Mai Th  Ng c Lan Thanh,

ứ ầ ậ ọ ị ừ ư Nghiên c u thu nh n pectinase t ấ    A.niger nuôi c y Tr n Th  Ng c Nh  –

ườ ứ ắ ưở ể ệ ả ỏ trên môi tr ng bán r n ch a cùi b i đ  nang cao hi u qu  bóc v  tiêu ­

ườ ủ ầ ộ Tr ng  ĐH Th  D u M t.

2. Akhter N., Morshed M.A., Uddin A., Begum F., Sultan T., Azad

K.A. (2011).  Producrion of pectinase by Aspergillus niger cultured in solid

state media. International Journal of Biosciences 1(1), pp. 33 ­ 42.

3. A. Rasheedha Banu, M. Kalpana Devi, G. R. Gnanaprabhal, B. V.

Pradeep and M. Palaniswamy ­ Production and characterization of pectinase

enzyme   from   Penicillium   chrysogenum   ­  Department   of   Microbiology,

Karpagam   University,   Coimbatore   ­   641   021,   Tamil   Nadu,   India

m.palaniswamy@gmail.com

4. Bai ZH, Zhang HX, Qi HY, Peng XW, Li BJ­Pectinase production

by Aspergillus niger using wastewater in solid state fermentation for eliciting

plant disease resistance­ Department of Environmental Bio­Technology, The

Research   Center   for   Eco­Environmental   Sciences,   Chinese   Academy   of

Sciences, P.O. Box 2871, Beijing 100085.

5. Hannan A., Bajwa R., Latif Z. (2009).  Status of Aspergillus niger

strains   for   pectinases   production   potential.   Pakistan   Journal   of

Phytopathology 21(1), pp. 77 ­ 82.

6. Ishtiaq   Ahmeda, , , Muhammad   Anjum   Ziaa, Muhammad   Azhar

Hussaina, Zain   Akramb, Muhammad   Tahir   Naveedc, Azin   Nowrouzid  –

Bioprocessing   of   citrus   waste   peel   for   induced   pectinase   production

by Aspergillus niger; its purification and characterization.

7. Leda   R   Castilhoa, , Ricardo   A   Medronhob, Tito   L.M   Alvesa  ­

Production and extraction of pectinases obtained by solid state fermentation

of agroindustrial residues with Aspergillus niger.

8. Maciel   M.H.C.,   Herculano   P.N.,   Porto   T.S.,   Teixeira   M.F.S.,

Moreira   K.A.,   Souza­Motta   C.M.   (2011).  Production   and   partial

characterization   of   pectinases   from   palm   by   Aspergillus   niger

URM4645.   African   Journal   of   Biotechnology   10(13),   pp.   2469   ­

2475.

9. Maldonado M.C., Saad A.M.S. (1998). Production of pectinesterase

and polygalacturonase by Aspergillus niger in submerged and solid

state systems. Journal of Industrial Micro biology & Biotechnology,

pp. 34­ 38.

10.  Martos   M.A.,   Vazquez   F.M.,   Benassi   F.O.,   Hours   R.A.   (2009).

Production   of   pectinase   by   A.   niger:   Influence   of   fermentation

conditions. Brazilian Archives of Biology and Technology 52(3), pp.

567 ­ 572.

11.  Mukesh   kumar   D   J1,*,   Saranya   G   M2   ,   Suresh   K2   ,   Andal

Priyadharshini   D2   ,   Rajakumar   R2   and   Kalaichelvan   PT1   1

­Production and Optimization of Pectinase from Bacillus sp. MFW7

using   Cassava   Waste­   Centre   for   Advanced   Studies   in   Botany,

University   of   Madras,   Guindy   Campus,   Chennai,   TN,   India

2A.V.V.M. Sri Pushpam College (Autonomous), Poondi, Thanjavur

District, TN, India

12. Nazneen Akhter1, M. Alam Morshed1,3*, Azim Uddin3 , Feroza

Begum2   ,   Tipu   Sultan1   ,   Abul   Kalam   Azad1   1­  Production   of

Pectinase   by   Aspergillus   niger   Cultured   in   Solid   State   Media­

Department of Biotechnology and Genetic Engineering, Faculty of

Applied Science and Technology.

13.  Obechukwu   C.   Ezike.   Sabinus   Oscar   O.   Eze.   Chukwunonso   A.

Nsude.   Ferdinand  C.   Chilaka   ­Production   of   Pectinases   from

Aspergillus niger using submerged fermentation with orange peels

as   carbon   source­ Department   of   Biochemistry,   University   of

Nigeria Nsukka)

14.   Phutela U., Dhuna V., Sandhu S., Chadha B.S. (2005).  Pectinase

and   polygalacturonase   production   by   a   thermophilic   Aspergillus

fumigatus   isolated   from   decomposting   orange   peels.   Brazilian

Journal of Microbiology 36, pp. 63 ­ 69.

15.  S. Mrudula and R. Anitharaj ­Pectianse Production in Solid State

Fermentation by Aspergillus niger Using Orange Peel as Substrate.