Nội dung của khóa luận gồm có: Xây dựng được biểu đồ thể hiện mối tương quan giữa giá trị OD và nồng độ tế bào tương ứng với từng giá trị OD; Xây dựng đường cong tăng trưởng của chủng L. plantarum NT1.5, xác định thời gian tăng trưởng tối ưu của vi khuẩn; Khảo sát nhiệt độ, pH tối ưu cho sự phát triển của chủng L. plantarum NT1.5.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP. HỒ CHÍ MINH
Tên đề tài:
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
CHUYÊN NGÀNH: VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ
GVHD: ThS. DƯƠNG NHẬT LINH
SVTH : TRẦN THỊ KIỀU
MSSV : 1053012348
Tp.Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2014
KHOÁ: 2010 – 2014
Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến:
Cô Dương Nhật Linh và thầy Nguyễn Văn Minh – giảng viên khoa Công nghệ
Sinh học Trường Đại Học Mở Tp Hồ chí Minh, cô thầy là người đã tận tình hướng dẫn,
tạo điều kiện, truyền đạt kiến thức để em có thể hoàn thành tốt đề tài.
Chân thành cảm ơn các thầy, cô khoa Công nghệ Sinh học trường Đại Học Mở
Tp Hồ Chí Minh đã tận tình giảng dạy, truyền đạt cho em những kiến thức cơ bản làm
nền tảng để em có thể hoàn thành đề tài.
Thầy Đan Duy Pháp, chị Võ Ngọc Yến Nhi, chị Phạm Thị Minh Trang, chị
Nguyễn Thị Mỹ Linh, anh Nguyễn Đạt Phi là người đã truyền đạt những kinh
nghiệm, động viên giúp đỡ em vượt qua những khó khăn trong thời gian thực hiện đề
tài.
Xin cảm ơn đến các anh/ chị, các bạn và các em Phòng thí nghiệm Công nghệ Vi
sinh đã giúp đỡ, động viên em trong thời gian qua.
Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đến Ba, Mẹ, gia đình đã luôn bên cạnh ủng hộ
tạo điều kiện tốt nhất cho con hoàn thành tốt việc học tập của mình.
Chân thành cảm ơn!
Bình Dương, ngày tháng năm 2014
TRẦN THỊ KIỀU
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 4
1.1. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN LACTIC ........................................................ 5
1.1.1. Giới thiệu ................................................................................................. 5
1.1.2. Con đường biến dưỡng của vi khuẩn lactic ........................................... 7
1.1.3. Tổng quan về Lactobacillus plantarum................................................... 8
1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC VỀ
LACTOBACILLUS ................................................................................................... 10
1.2.1. Các nghiên cứu trên thế giới ................................................................ 10
1.2.2. Các nghiên cứu trong nước .................................................................. 11
1.3. QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM .................................................................. 12
1.3.1. Phương pháp quy hoạch thực nghiệm ................................................. 12
1.3.2. Thí nghiệm sàng lọc .............................................................................. 14
1.3.3. Thí nghiệm tối ưu hóa ........................................................................... 16
1.4. PHẦN MỀM QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM MINITAB 16.2.0............... 20
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................... 23
2.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGIÊN CỨU .................................................. 24
2.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU............................................................................ 24
2.2.1. Đối tượng nghiên cứu ........................................................................... 24
2.2.2. Môi trường – hóa chất .......................................................................... 24
2.2.3. Dụng cụ ................................................................................................. 24
2.2.4. Trang thiết bị ........................................................................................ 24
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................. 25
2.3.1. Hoạt hóa chủng ..................................................................................... 25
2.3.3. Xây dựng đường cong tăng trưởng của L. plantarum NT 1.5 ............. 26
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.3.4. Khảo sát nhiệt độ, pH thích hợp cho sự tăng trưởng của L. plantarum
NT1.5 ............................................................................................................... 27
2.3.5. Sàng lọc các yếu tố dinh dưỡng ............................................................ 28
2.3.6. Thiết kế thí nghiệm tìm yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men tăng
sinh khối theo thiết kế Plackett- Burman ................................................................ 30
2.3.7. Thí nghiệm khởi đầu ............................................................................. 32
2.3.8. Tìm khoảng tối ưu của các yếu tố ảnh hưởng chính bằng phương
pháp leo dốc .............................................................................................................. 32
2.3.9. Thí nghiệm bề mặt chỉ tiêu xác định giá trị tối ưu của các yếu tố ảnh
hưởng chính. ............................................................................................................. 33
2.3.10. Xác định thời gian tăng trưởng của chủng L. plantarum NT1.5 trên
môi trường tối ưu...................................................................................................... 33
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................................ 34
3.1 KẾT QUẢ XÂY DỰNG ĐƯỜNG TƯƠNG QUAN GIỮA MẬT ĐỘ TẾ
BÀO VI KHUẨN VÀ GIÁ TRỊ OD610 ..................................................................... 35
3.2 KẾT QUẢ XÂY DỰNG ĐƯỜNG CONG TĂNG TRƯỞNG CỦA L.
PLANTARUM NT 1.5 ............................................................................................... 36
3.3 KẾT QUẢ KHẢO SÁT NHIỆT ĐỘ, pH THÍCH HỢP CHO SỰ TĂNG
TRƯỞNG CỦA L. PLANTARUM NT1.5. ............................................................... 38
3.4 KẾT QUẢ SÀNG LỌC YẾU TỐ DINH DƯỠNG ....................................... 39
3.4.1. Nguồn nitơ ............................................................................................. 39
3.4.2. Nguồn cacbon ........................................................................................ 41
3.4.3. Nguồn khoáng ....................................................................................... 42
3.5 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG CHÍNH THEO
THIẾT KẾ THÍ NGHIỆM PLACKETT- BURMAN ............................................. 44
3.6 KẾT QUẢ THIẾT KẾ THÍ NGHIỆM KHỞI ĐẦU .................................... 48
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
3.7 KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM LEO DỐC .......................................................... 50
3.8 KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM BOX-BEHNKEN ............................................... 52
3.9. KẾT QUẢ KHẢO SÁT SỰ TĂNG TRƯỞNG CỦA L. PLANTARUM NT1.5
TRÊN MÔI TRƯỜNG TỐI ƯU .............................................................................. 57
4.1 KẾT LUẬN .................................................................................................... 61
4.2 KIẾN NGHỊ ................................................................................................... 62
TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 63
PHỤ LỤC ................................................................................................................. 68
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
ANOVA One-way analysis of variance
CFU Colony forming unit
Cs. Cộng sự
L. plantarum Lactobacillus plantarum
MRS Deman, Rogosa and Sharpe
Nm nanomet
OD Optical Density
P-B Plackett-Burman
WHO World Health Organization
BSH Bile salt hydrolase
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1 Streptococcus ...................................................................................... 6
Hình 1.2 Lactobacillus ........................................................................................ 6
Hình 1.3 Lactobacillus plantarum dưới kính hiển vi điện tử (Reichelt J., 2013)
............................................................................................................................. 9
Hình 1.6 Hộp đen trong hệ thống điều khiển một quá trình. ......................... 13
Hình 1.8 Ma trận bố trí thí nghiệm theo thiết kế Box – Behnken (Box và
Behnken, 1960) ................................................................................................. 20
Hình 1.9 Giao diện phần mềm Minitab 16.2.0 ................................................ 22
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Các nguồn nitơ khảo sát .................................................................. 28
Bảng 2.2. Các nguồn cacbon khảo sát ............................................................. 29
Bảng 2.3. Các nguồn khoáng khảo sát ............................................................ 30
Bảng 3.1: Giá trị đo OD610 và mật độ tế bào (Log(N/mL) .............................. 35
Bảng 3.2. Giá trị OD610 theo thời gian ............................................................. 36
Bảng 3.3. Mật độ tế bào Lactobacillus plantarum NT1.5 (Log (N/ mL)) tại mỗi
giá trị nhiệt độ và độ pH khảo sát ................................................................... 38
Bảng 3.4. Giá trị log (N/ mL) của các nguồn nitơ khảo sát ............................ 40
Bảng 3.5. Giá trị log (N/ mL) của các nguồn cacbon khảo sát ....................... 41
Bảng 3.6. Giá trị log (N/ mL) của các nguồn muối khoáng khảo sát ............. 43
Bảng 3.7. Mức ảnh hưởng của từng yếu tố ..................................................... 44
Bảng 3.8: Kết quả thí nghiệm Plackett- Burman ........................................... 45
Bảng 3.10 Bảng tính toán bước chuyển động của các yếu tố ảnh hưởng chính
........................................................................................................................... 50
Bảng 3.11 Kết quả thí nghiệm leo dốc ............................................................. 51
Bảng 3.12 Bảng giá trị các biến số thí nghiệm Box-Behnken ......................... 53
Bảng 3.13 Bảng biến số các giá trị thí nghiệm Box-Behnken ......................... 53
Bảng 3.14 Kết quả giá trị tối ưu của các yếu tố .............................................. 56
Bảng 3.15 Giá trị OD theo thời gian ................................................................ 57
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
DANH MỤC ĐỒ THỊ
Đồ thị 3.4. Kết quả khảo sát nguồn nitơ .......................................................... 40
Đồ thị 3.5. Kết quả khảo sát nguồn Cacbon .................................................... 42
Đồ thị 3.6. Kết quả khảo sát nguồn muối khoáng ........................................... 43
Đồ thị 3.7. Đồ thị các ảnh hưởng chính (Main Effects Plot) ........................... 47
Đồ thị 3.1 Đồ thị đường mức biểu diễn mối quan hệ giữa mật độ tế bào với
các cặp biến khác nhau .................................................................................... 55
Đồ thị 3.2 Đồ thị bề mặt biểu diễn mối quan hệ giữa mật độ tế bào với các
cặp biến khác nhau .......................................................................................... 56
Đồ thị 3.9 Đường cong tăng trưởng của L. plantarum NT 1.5 theo thời gian
trên môi trường tối ưu ..................................................................................... 58
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Cholesterol trong máu tăng làm tăng nguy cơ bệnh tim và đột quỵ, một phần ba
bệnh tim thiếu máu cục bộ là do cholesterol cao. Nhìn chung, cholesterol tăng ước tính
gây ra 2,6 triệu ca tử vong (4,5% của tổng số) và 29,7 triệu người gánh hậu quả. Tổng
số cholesterol trong máu cao là nguyên nhân chính gây bệnh tật ở cả các nước phát triển
và đang phát triển như là một yếu tố nguy cơ bệnh tim thiếu máu cục bộ và đột quỵ
(WHO, 2013).
Việc giảm cholesterol là vấn đề rất quan trọng để ngăn ngừa bệnh tim mạch (Lim
và cs., 2004). Một trong những giải pháp đó là nghiên cứu vi khuẩn lactic vừa có hoạt
tính probiotic và vừa có hoạt tính làm giảm cholesterol là vấn đề thiết thực, được nhiều
nhà khoa học trên thế giới quan tâm và nghiên cứu.
Trong những năm gần đây có nhiều nghiên cứu chứng minh enzym thủy phân
muối mật (BSH) từ vi khuẩn lactic (Lactobacillus, Bifidobacterium, Enterococcus…)
có tác dụng làm giảm cholesterol (Lim, 2004; Liong, 2005). Ngoài ra, vi khuẩn lactic
còn có khả năng giảm cholesterol bằng cách hấp thu trực tiếp vào màng tế bào (Ziarno,
2007).
Ngày nay việc sản xuất thực phẩm chức năng chứa vi khuẩn probiotic như
Lactobacilli có tầm quan trọng ngày càng tăng. Những vi khuẩn này có tác dụng
kháng khuẩn, làm tăng giá trị cảm quan, dinh dưỡng và mang lại lợi ích sức khỏe cho
người tiêu dùng (Shahravy, 2012).
Vi khuẩn Lactobacillus plantarum NT1.5 đã được chứng minh có khả năng làm
giảm cholesterol thông qua việc hấp thụ cholesterol qua màng tế bào và khả năng sinh
enzym BSH đồng thời có hoạt tính probiotic như: khả năng chịu pH dạ dày, kháng
muối mật, kháng khuẩn,… (Dương Nhật Linh, 2013). Vì vậy Lactobacillus plantarum
NT1.5 có thể được ứng dụng để sản xuất các chế phẩm probiotic có hoạt tính làm giảm
cholesterol.
Ngày nay, nhu cầu sử dụng thực phẩm lên men kết hợp với chế phẩm sinh học
ngày càng tăng. Để đáp ứng nhu cầu này, việc sản xuất lượng lớn sinh khối vi sinh vật
đang được quan tâm. Do đó, nghiên cứu phát triển môi trường nuôi cấy mới để tăng
cường sản xuất sinh khối có thể dẫn đến việc sản xuất probiotic có hiệu quả kinh tế hơn
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
(Shahravy, 2012).
Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài “Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy chủng
Lactobacillus plantarum NT1.5 bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm”.
Nội dung thực hiện:
Xây dựng được biểu đồ thể hiện mối tương quan giữa giá trị OD và nồng độ tế
bào tương ứng với từng giá trị OD.
Xây dựng đường cong tăng trưởng của chủng L. plantarum NT1.5, xác định thời
gian tăng trưởng tối ưu của vi khuẩn.
Khảo sát nhiệt độ, pH tối ưu cho sự phát triển của chủng L. plantarum NT1.5
Chọn lựa nguồn cacbon, nitơ và các nguồn khoáng.
Xác định các yếu tố ảnh hưởng chính đến quá trình tăng sinh khối của
Lactobacillus plantarum NT1.5 bằng thiết kế Plackett – Burman (P - B).
Xác định giá trị tối ưu của các thành phần dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy
bằng phương pháp Box-Behnken.
Nuôi cấy thử nghiệm.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN LACTIC
1.1.1. Giới thiệu
Vi khuẩn lactic acid (LAB) là nhóm vi khuẩn phổ biến trong tự nhiên được ứng
dụng trong nhiều ngành công nghiệp, là một chế phẩm sinh học an toàn cho con người
(David, 2013).
Theo khóa phân loại Bergey (2001), vi khuẩn lactic được sắp xếp:
Giới: Bacteria
Ngành: Firmicutes
Lớp: Bacilli
Bộ: Lactobacillales
Họ I: Lactobacillaceae
Giống I: Lactobacillus
Giống II: Pediococcus
Họ II: Enterococceae
Giống: Enterococcus
Họ III: Leuconoscaceae
Giống: Leuconostoc
Họ IV: Streptococcaceae
Giống I: Streptococcus
Giống II: Lactococcus
Vi khuẩn lactic là những vi khuẩn Gram dương, thường không di động, không
sinh bào tử, các phản ứng catalase âm, oxydase âm, nitratreductase âm. Những vi
khuẩn này có khả năng sinh tổng hợp nhiều hợp chất cần cho sự sống rất yếu, cho nên
chúng là những vi sinh vật khuyết dưỡng đối với nhiều loại acid amin, base nucleotic,
nhiều loại vitamin…, bình thường chúng không có cytochrome. Vì vậy, chúng được
xếp vào nhóm vi khuẩn kỵ khí tùy nghi, hoặc gọi là vi hiếu khí, có khả năng lên men
trong điều kiện vi hiếu khí cũng như kỵ khí.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
LAB có liên kết chặt chẽ với vi khuẩn có lợi trên niêm mạc ruột của người và
động vật. LAB bao gồm khoảng 20 chi trong đó chi Lactobacillus, Leuconostoc,
Pedicoccus và Streptococcus là những chi điển hình (Marcel, 2005).
Trong đó tế bào của chúng có dạng hình cầu như Streptococcus, Lactococcus,
Enterococcus, Leuconostoc, Pediococcus, hoặc hình que như Lactobacillus.
Hình 1.1 Streptococcus
a: Streptococcus dưới kính hiển vi điện tử
b: Streptococcus nhuộm Gram
Hình 1.2 Lactobacillus
a: Lactobacillus dưới KHV điện tử
b:Lactobacillus nhuộm Gram
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Bifidobacteria cũng được xem là một chi của lactic acid bacteria do có cùng đặc
điểm tiêu biểu và cách thức lên men đường.
1.1.2. Con đường biến dưỡng của vi khuẩn lactic
Sự phân loại giữa các chi của vi khuẩn lactic dựa trên hình thái, cách thức lên
men đường, sự phát triển ở những nhiệt độ khác nhau, cấu trúc của sản phẩm acid
lactic, khả năng chịu muối, chịu acid hoặc kiềm (Mascel, 2005).
LAB có hai con đường lên men đường chính (Mascel, 2005):
Glycolysis (Embden- Meyerhof- Parnas pathway): sản phẩm cuối cùng là acid
lactic hay còn gọi là con đường lên men lactic đồng hình.
Con đường 6- phosphogluconate/ phosphoketolase: sản phẩm của quá trình lên
men này ngoài acid lactic còn có ethanol, acetate và CO2 hay còn gọi là quá trình lên
men dị hình.
Dựa vào khả năng lên men đường người ta chia LAB thành LAB đồng hình và
LAB dị hình.
1.1.2.1 Lên men đồng hình
Vi khuẩn lactic lên men đồng hình gần như chuyển hóa hoàn toàn đường chúng
sử dụng thành acid lactic. Trong điều kiện thừa glucose và oxy hạn chế lên men đồng
hình 1 mol glucose theo con đường chuyển hóa EMB (Embden – Meyerhoff – Parnas)
tạo 2 mol pyruvate. Sự cân bằng oxi hóa khử trong tế bào được duy trì thông qua các
quá trình oxi hóa của NADH, song song đó là sự khử pyruvat thành acid lactic. Các
phản ứng diễn ra trong phần nền tế bào chất. Các enzym đặc trưng trong quá trình này
là aldolase và triozophosphateisomerase. Glucose không phải là đường duy nhất có thể
được sử dụng. Với hệ thống enzym thích hợp, các loại đường khác có thể được chuyển
đổi thành glucose hoặc một trong những chất trung gian trong quá trình như glucose-
6-phosphate (hoặc trong trường hợp đường pentose, ribulose-5-phosphate). Khả năng
sử dụng các loại đường khác nhau ở vi khuẩn lactic thay đổi theo loài. Đại diện cho
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
kiểu lên men này là các giống Lactococcus, Streptococcus,Petiococcus và
Lactobacillus nhóm I. (Desantis và cs., 1989)
1.1.2.2 Lên men dị hình
Lên men dị hình sử dụng con đường pentose phosphate, cách gọi khác là con
đường phosphoketolase pentose. Một phân tử glucose-6-phosphate ban đầu bị khử
hydro thành 6- phosphogloconate và sau đó khử nhóm carboxyl hình thành một phân tử
CO2. Kết quả là pentose -5- phosphate bị chia ra thành một glyceraldehyde phosphate
(GAP) và một phân tử acetyl phosphate. GAP sau đó được chuyển hóa thành lactate
như trong lên men đồng hình, với acetyl phosphate bị biến đổi thành ethanol qua chất
trung gian là acetyl – CoA và acetaldehyde. Về mặt lý thuyết, sản phẩm cuối cùng (bao
gồm ATP) được sản xuất có số lượng bằng với sản phẩm từ quá trình dị hóa một phân
tử glucose. Hai enzyme đặc trưng trong quá trình này là transketolase xúc tác chuyển
hóa nhóm ketol-2C và transaldolase xúc tác chuyển hóa nhóm 3C. Quá trình này xảy ra
trong cytosol. Các LAB lên men dị hình bắt buộc gồm Leuconostoc oenococcus,
Weissella và Lactobacillus nhóm III. (Desantis và cs., 1989)
1.1.3. Tổng quan về Lactobacillus plantarum
1.1.3.1. Phân loại
Theo Bergey và cộng sự, (1923) Lactobacillus plntarum được phân loại:
Giới (Kingdom): bacteria
Ngành (Division): Firmicutes
Lớp (Class): Bacilli
Bộ (Order): Lactobacillales
Họ (Family): Lactobacillaceae
Giống (Genus): Lactobacillus
Loài: L. Plantarum
1.1.3.2. Đặc điểm chung của vi khuẩn Lactobaciillus plantarum
Lactobacillus plantarum là một trong hơn 50 loài Lactobacillus. Lactobacillus
plantarum là vi khuẩn gram dương, catalase âm (Bujalence, 2006), hình trực không
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
sinh bào tử được tìm thấy trong hệ tiêu hóa của người và động vật. Vi khuẩn này lần
đầu tiên được tìm thấy trong nước bọt của con người. (Waugh và cs., 2009)
Lactobacillus plantarum là một loại vi khuẩn có khả năng thích nghi cao, nó có thể tồn tại ở phạm vi nhiệt độ rộng lớn (từ 1-600C) (Natural New, 2010), kị khí tùy
nghi. Trong chi Lactobacillus, L. Plantarum được xếp vào nhóm vi khuẩn lên men dị
hình, có thể sống trong nhiều môi trường như thịt, cá, sữa, các quá trình lên men thực
vật, thực vật và trong nhiều loại pho mát. (Kohajdová, 2012).
L. plantarum có nhiều điểm khác biệt so với các loài lactobacillus khác ở những
điểm sau:
- Có bộ gen tương đối lớn nên có thể thích ứng với nhiều điều kiện khác nhau
(Kleerebezem và cs., 2003)
- Có thể lên men nhiều loại đường.
-Thích nghi cao với điều kiện acid, chịu pH thấp (Daeschel và Nes 1995).
- Có thể chuyển hóa acid phenolic (Barthelmebs và cs., 2000; Barthelmebs và cs.,
2001), phân giải muối tanat nhờ hoạt động của enzyme tannase (Vaquero và cs., 2004).
Hình 1.3 Lactobacillus plantarum dưới kính hiển vi điện tử (Reichelt J., 2013)
1.1.3.3. Lợi ích của vi khuẩn L. plantarum
Lactobacillus plantarum có nhiều trong nước bọt và đường tiêu hóa của con
người. Nó thường được sử dụng trong các quá trình lên men thực phẩm và làm
probiotic. Các chế phẩm sinh học sử dụng L. plantarum ngày càng được công nhận trên
thị trường.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
L. plantarum có thể nâng cao tính toàn vẹn ruột, hoạt động trao đổi chất của các
tế bào đường ruột, kích thích phản ứng miễn dịch (Nissen và cs., 2009).
Giảm thiểu một số triệu chứng rối loạn tiêu hóa khi điều trị bằng kháng sinh
(Lonnermark và cs., 2009).
Theo nghiên cứu của nhóm Karlsson và cộng sự (2009) được tiến hành ở Thụy
Điển cho thấy uống trực tiếp L. plantarum có thể tăng tính đa dạng của hệ vi sinh vật ở
ruột kết.
Bảo vệ tế bào biểu mô khỏi sự gây hại của E. coli bằng cách thay đổi hình thái tế
bào chủ, giảm hình thành tổn thương, tăng sức đề kháng và khả năng thẩm thấu đơn
lớp phân tử (Qin và cs., 2009).
1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC VỀ
LACTOBACILLUS
Các nghiên cứu về vi khuẩn lactic đã và đang được triển khai rộng rãi trên toàn
thế giới, trong đó đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về Lactobacillus. Tuy nhiên ở
Việt Nam, số lượng các nghiên cứu về vi khuẩn lactic còn quá khiêm tốn và có rất ít
công trình nghiên cứu về tối ưu hóa môi trường nuôi cấy Lactobacillus. Phần lớn các
nghiên cứu về Lactobacillus ở trong nước chỉ là nghiên cứu cơ bản về nhóm vi khuẩn
này như ở mức phân lập và định danh, tuyển chọn giống có hoạt tính tốt để làm
probiotic.
1.2.1. Các nghiên cứu trên thế giới
Năm 2012, Hu và cộng sự đã công bố nghiên cứu về tối ưu hóa môi trường nuôi
cấy Lactobacillus plantarum YSQ khi sử dụng các sản phẩm nông nghiệp có giá thành
thấp như bột đậu nành, bột ngô, lúa mì và nước ép cà chua làm nguồn dinh dưỡng, từ
đó làm giảm giá thành sản phẩm khi lên men theo quy mô lớn.
Năm 2010, Magdalena và cộng sự đã công bố nghiên cứu về tối ưu hóa các yếu tố
dinh dưỡng như nguồn cacbon, nitơ, muối khoáng và các yếu tố tăng trưởng (vitamin
B, axit amin) khi dùng phương pháp bề mặt đáp ứng để tăng sinh khối vi khuẩn
Lactobacillus rhamnosus PEN.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Năm 2006, Altaf và cộng sự đã tối ưu hóa môi trường thu acid lactic cho chủng
Lactobacillus amylophilus GV6 bằng cách sử dụng các nguồn cacbon, nitơ rẻ tiền như:
bột bắp, bột đậu lăng đỏ thay thế cho pepton, glucose trong môi trường MRS bằng
phương pháp Plackett-Burman và đáp ứng bề mặt (RSM). Kết quả cho thấy
Lactobacillus amylophilus GV6 đạt được hiệu suất 78,4% và năng suất 96% (g acid
lactic/ g tinh bột được sử dụng).
Farooq và cộng sự (2012) đã sử dụng mật rỉ đường (phụ phẩm của quá trình sản
xuất đường mía) làm nguồn cacbon trong môi trường tối ưu thu sinh khối của vi khuẩn
Lactobacillus delbrueckii.
Năm 1995, Oh và cộng sự đã công bố nghiên cứu về các giá trị tối ưu của trypton,
cao nấm men, glucose, nhiệt độ nuôi cấy cho sự tăng trưởng của Lactobacillus casei
YIT 9018. Kết quả giá trị tối ưu của các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của L.casei
YIT 9018 như sau: trypton, 3,04%; cao nấm men, 0,892%; glucose, 1,58%; nhiệt độ nuôi cấy là 35oC.
Năm 2006, Zhong đã công bố nghiên cứu về tối ưu hóa môi trường nuôi cấy
Lactobacillus casei LC2W bằng phương pháp bề mặt đáp ứng để tăng cường sản xuất
exopolysaccharid. Kết quả tối ưu các điều kiện nuôi cấy để sản xuất exopolysaccharid:
nhiệt độ nuôi cấy là 32,5°C và thời gian nuôi là 26 giờ.
1.2.2. Các nghiên cứu trong nước
Năm 1996, Nguyễn Đăng Diệp và cộng sự đã công bố nghiên cứu về môi trường
nuôi vi khuẩn lactic tốt nhất. Môi trường đó là sữa gầy hoàn nguyên với thời gian lên
men tốt nhất là 18-20 giờ, bổ sung giống 2-3%.
Trong công bố nghiên cứu của Nguyễn Thị Hồng Hà và cộng sự năm 2003 đã sử
dụng hai chủng Bifidobacteria bifidum và Lactobacillus acidophilus để sản xuất chế
phẩm probiotic. Tìm ra được ba môi trường thích hợp nuôi cấy vi khuẩn Bifidobacteria
bifidum là môi trường thyoglycolat, môi trường nước chiết gan, môi trường nước chiết
thịt bò ở điều kiện nuôi cấy kỵ khí. Môi trường thích hợp cho L. acidophilus là môi
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
trường MRS, môi trường nước chiết cà chua, môi trường nước chiết giá, môi trường
nước thải của Công ty sữa Vinamilk.
1.3. QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM
Quy hoạch thực nghiệm là dạng nghiên cứu về mối quan hệ nguyên nhân – kết
quả. Trước hết, nhà nghiên cứu cần xác định các thông số (hay các biến) cần và có thể
quan tâm rồi đưa ra các chiến thuật làm thực nghiệm từ giai đoạn đầu đến giai đoạn kết
thúc của quá trình nghiên cứu đối tượng (từ nhận thông tin mô phỏng đến việc tạo ra
mô hình toán, xác định các điều kiện tối ưu), trong điều kiện đã hoặc chưa hiểu biết
đầy đủ về cơ chế của đối tượng. (Nguyễn Văn Dự và cs., 2011).
1.3.1. Phương pháp quy hoạch thực nghiệm
Quy hoạch thực nghiệm là cơ sở phương pháp luận của nghiên cứu thực nghiệm
hiện đại. Đó là phương pháp nghiên cứu mới, trong đó công cụ toán học giữ vai trò tích
cực. Cơ sở toán học nền tảng của lý thuyết qui hoạch thực nghiệm là toán học xác suất
thống kê với hai lĩnh vực quan trọng là phân tích phương sai và phân tích hồi qui
(Giang Thị Kim Liên, 2009).
1.3.1.1. Khái niệm
Quy hoạch thực nghiệm là tập hợp các tác động nhằm đưa ra chiến thuật làm thực
nghiệm từ giai đoạn đầu đến giai đoạn kết thúc của quá trình nghiên cứu đối tượng (từ
nhận thông tin mô phỏng đến việc tạo ra mô hình toán, xác định các điều kiện tối ưu),
trong điều kiện đã hoặc chưa hiểu biết đầy đủ về cơ chế của đối tượng (Giang Thị Kim
Liên, 2009).
1.3.1.2. Đối tượng
Là một quá trình hoặc hiện tượng nào đó có những tính chất, đặc điểm chưa biết
cần nghiên cứu. Người nghiên cứu có thể chưa hiểu biết đầy đủ về đối tượng, nhưng đã
có một số thông tin tiên nghiệm dù chỉ là sự liệt kê sơ lược những thông tin biến đổi,
ảnh hưởng đến tính chất đối tượng. Có thể hình dung chúng như một “hộp đen” trong
hệ thống điều khiển gồm các tín hiệu đầu vào và đầu ra (Giang Thị Kim Liên, 2009).
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Hình 1.6 Hộp đen trong hệ thống điều khiển một quá trình.
Các tín hiệu đầu vào được chia thành ba nhóm: (Giang Thị Kim Liên, 2009)
1) Các biến kiểm tra được và điều khiển được, mà người nghiên cứu có thể
điều chỉnh theo dự định, biểu diễn bằng vectơ:
Z = [Z1, Z2, ..., Zk]
2) Các biến kiểm tra được nhưng không điều khiển được, biểu diễn bằng
vectơ:
T = [T1, T2, ..., Th]
3) Các biến không kiểm tra được và không điều khiển được, biểu diễn bằng
vectơ:
E = [E1, E2, ..., Ef]
Các tín hiệu đầu ra dùng để đánh giá đối tượng là vectơ Y = (y1, y2,..., yq).
Chúng thường được gọi là các hàm mục tiêu. Biểu diễn hình học của hàm mục tiêu
được gọi là mặt đáp ứng (bề mặt biểu diễn). Phương pháp toán học trong xử lý số liệu
từ kế hoạch thực nghiệm là phương pháp thống kê. Vì vậy các mô hình biểu diễn hàm
mục tiêu chính là các mô hình thống kê thực nghiệm. Các mô hình này nhận được khi
có công tính nhiễu ngẫu nhiên.
1.3.1.3. Ưu điểm về quy hoạch thực nghiệm
Quy hoạch thực nghiệm đóng vai trò quan trọng trong khoa học kỹ thuật. Các mô
hình lý thuyết, giải thuật, quá trình mới luôn được kiểm nghiệm thực trước khi đem ra
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
ứng dụng. Hơn nữa, quy hoạch thực nghiệm còn có ý nghĩa bổ sung, hoàn chỉnh các
kết quả nghiên cứu sáng tạo lý thuyết đã được phát triển (Giang Thị Kim Liên, 2009).
Có thể nói, lý thuyết quy hoạch thực nghiệm từ khi ra đời đã thu hút sự quan tâm
và nhận được nhiều đóng góp hoàn thiện của các nhà khoa học. Những ưu điểm rõ rệt
của phương pháp này so với các thực nghiệm cổ điển là: (Giang Thị Kim Liên, 2009)
− Giảm đáng kể số lượng thí nghiệm cần thiết.
− Hàm lượng thông tin nhiều hơn rõ rệt, nhờ đánh giá được vai trò qua lại giữa
các yếu tố và ảnh hưởng của chúng đến hàm mục tiêu. Nhận được mô hình toán học
thống kê thực nghiệm theo các tiêu chuẩn thống kê, đánh giá được sai số của quá trình
thực nghiệm theo các tiêu chuẩn thống kê cho phép xét ảnh hưởng của các yếu tố với
mức độ tin cậy cần thiết.
− Cho phép xác định được điều kiện tối ưu đa yếu tố của đối tượng nghiên cứu
một cách khá chính xác bằng các công cụ toán học, thay cho cách giải gần đúng, tìm
tối ưu cục bộ như các thực nghiệm thụ động.
1.3.2. Thí nghiệm sàng lọc
Thí nghiệm sàng lọc là thí nghiệm được tiến hành nhằm các mục đích sau:
Xác định đâu là yếu tố ảnh hưởng chính đến đối tượng hay quá trình cần khảo sát.
Đáng giá mức độ ảnh hưởng của các yếu tố.
Đánh giá mức độ ảnh hưởng tương tác giữa các yếu tố.
Thí nghiệm sàng lọc thường khai thác các dạng thí nghiệm toàn phần 2 mức khi
số yếu tố thí nghiệm không lớn hoặc thiết kế thí nghiệm riêng phần hay thiết kế thí
nghiệm Plackett – Burman (P-B).
1.3.2.1. Sơ lược về thết kế thí nghiệm tìm các yếu tố ảnh hưởng của Plackett-
Mục đích của thiết kế
Burman
Đặc điểm của thiết kế
Xác định các “yếu tố quan trọng” ảnh hưởng đến quá trình mục tiêu.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Bắt nguồn từ ma trận đầy đủ (full - factorial matrices), sử dụng giả định rằng tất
cả các tương tác không có dấu hiệu liên quan đáng kể so với các yếu tố chính, thiết kế
Plackett – Burman dựa trên ma trận hai cấp cho mỗi yếu tố và sửa đổi nó để giảm thất
bại (Plackett và Burman, 1946).
Yếu tố tác động chính trong thiết kế Plackett - Burman thay thế tất cả các tương
tác của một ma trận đầy đủ. Tuy nhiên, điều này không có nghĩa là thông tin về sự
tương tác không thể được xác định từ thiết kế Plackett-Burman (Plackett và Burman,
1946).
Với một thiết kế Plackett - Burman gồm n thí nghiệm (với n là bội số của 4, n ≤
100, ngoại trừ n = 92 là chưa thể xác định) với số yếu tố k ≤ (n - 1).
Như vậy thiết kế Plackett – Burman là thiết kế tiết kiệm thời gian và số thí
nghiệm nhất với số yếu tố cần khảo sát là cao nhất. Thiết kế Plackett – Burman là một
thiết kế không thể thiếu khi đối tượng đang nghiên cứu chưa có nhiều thông tin về các
yếu tố có khả năng ảnh hưởng chính đã được khảo sát (Plackett và Burman, 1946).
Việc chọn các ma trận mà sẽ phụ thuộc vào số yếu tố thí nghiệm trên cộng với
các phương pháp lựa chọn để xác định sai số thí nghiệm.
Có nhiều cách để xác định sai số thí nghiệm như (Plackett và Burman, 1946):
- Chọn điểm trung tâm và cho một số thí nghiệm tại điểm đó.
- Lặp lại toàn bộ ma trận thí nghiệm.
Phân tích kết quả thí nghiệm
- Thực hiện nhiều phép đo độc lập trong tổ hợp.
Sau khi thử nghiệm được tiến hành, dữ liệu từ thí nghiệm được sử dụng để tính
toán các hiệu ứng và để xác định ý nghĩa thống kê của những hiệu ứng (Plackett và
Burman, 1946).
Để tính toán các hiệu ứng, nhập các giá trị trung bình vào ma trận. Sau đó, so
sánh sự khác biệt giữa các đáp ứng trung bình ở mức cao và đáp ứng trung bình ở mức
thấp. Các ảnh hưởng của yếu tố luôn luôn thay đổi trong các phản ứng khi đi từ cấp độ
thấp đến cấp độ cao. (Plackett và Burman, 1946)
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Xác định được mức độ để thiết lập các yếu tố phụ thuộc vào mục tiêu thử nghiệm
(Plackett và Burman, 1946):
Nếu mục đích là để tối đa hóa một phản ứng, tất cả các yếu tố có tác động tích
cực sẽ được thiết lập để hoạt động ở mức độ cao và tất cả các yếu tố có tác động tiêu
cực sẽ được thiết lập để hoạt động ở mức thấp.
Nếu mục tiêu là để giảm thiểu các phản ứng, tất cả các yếu tố có tác động tích cực
sẽ được thiết lập ở mức thấp và tất cả đều có một tác động tiêu cực sẽ được thiết lập ở
mức cao.
Nếu như ảnh hưởng của các yếu tố được kiểm tra có ý nghĩa thống kê thì yếu tố
đó là 1 yếu tố quan trọng…
1.3.3. Thí nghiệm tối ưu hóa
Một trong những mục đích chính của nghiên cứu thực nghiệm trong kĩ thuật là
tìm giá trị cực trị hay tìm vùng tối ưu cho một quá trình hay các điều kiện tối ưu để vận
hàng một hệ thống. Lớp các bài toán nghiên cứu thực nghiệm về vấn đề tối ưu thường
được biết đến với tên gọi “phương pháp bề mặt chỉ tiêu” (Response Surface Method –
RSM) nhằm mục đích (Nguyễn Văn Dự và cs., 2011):
Chỉ ra tập giá trị các biến đầu vào (điều kiện vận hành, thực thi) sao cho tạo ra
ứng xử của đối tượng nghiên cứu là tốt nhất.
Tìm kiếm các giá trị biến đầu vào nhằm đạt được các yêu cầu cụ thể về ứng xử
của đối tượng nghiên cứu.
Xác định các điều kiện vận hành mới nhằm đảm bảo cải thiện chất lượng hoạt
động của đối tượng so với tình trạng cũ.
Mô hình hóa quan hệ giữa đối tượng đầu vào và ứng xử của đối tượng nghiên
cứu, dùng làm cơ sở dự đoán hay điều khiển quá trình hay hệ thống.
Tiến trình tối ưu hóa RSM thường gồm 3 giai đoạn:
Giai đoạn : Thí nghiệm khởi đầu.
Giai đoạn 2: Leo dố tìm vùng cực trị.
Giai đoạn 3: Thí nghiệm bề mặt chỉ tiêu.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.3.3.1. Thí nghiệm khởi đầu
Sau khi tiến hành các thí nghiệm sàng lọc, ta cần loại bỏ bớt các biến có ảnh
hưởng không đáng kể đến hàm mục tiêu. Tiếp tục tiến hành một số thí nghiệm với các
biến còn lại, đồng thời bổ sung thêm một số điểm thí nghiệm trung tâm nhằm đánh giá
mức độ phù hợp (Lack-of-fit) của mô hình hồi quy bậc nhất đã xây dựng cho hàm mục
tiêu. Việc đánh giá như vậy được gọi là “kiểm định mức độ không phù hợp của mô
hình”. Giả thuyết thống kê được phát biểu như sau:
Giả thuyết đảo: Mô hình khớp với dữ liệu.
Giả thuyết chính: Mô hình không khớp với dữ liệu.
Để kiểm định về mức dộ phù hợp của mô hình mỗi biến trong một kế hoạch cần
nhận 3 mức giá trị.
Cũng như các phép kiểm định thống kê khác thông số quan trọng để chấp nhận
hay loại bỏ giả thuyết đảo là giá trị p (p-value). Lý thuyết tính toán thống kê chỉ ra như
sau:
Nếu giá trị p nhỏ hơn mức ý nghĩa α, ta loại bỏ giả thuyết đảo. Nghĩa là mô hình
xây dựng không khớp với dữ liệu.
Nếu giá trị p lớn hơn mức ý nghĩa α, mô hình đã dựng là phù hợp để mô tả dữ
liệu.
1.3.3.2. Leo dốc tìm vùng cực trị
Nếu kết quả thí nghiệm khởi đầu cho thấy có thể mô tả hàm mục tiêu bằng một
hàm hồi quy bậc nhất, điều đó chứng tỏ vùng thí nghiệm của ta còn ở xa vùng chứa cực
trị. (Nguyễn Văn Dự và cs., 2011).
Để tìm được vùng chứa cực trị, ta cần thay đổi giá trị các biến thí nghiệm và thực
hiện một chuỗi các thí nghiệm liên tiếp ứng với các giá trị mới của biến thí nghiệm để
theo dõi sự thay đổi của hàm mục tiêu. Các thí nghiệm này gọi là các thí nghiệm leo
dốc/ xuống dốc.
Để tiến nhanh đến vùng chứa cực trị của hàm mục tiêu, ta cần xác định đúng
hướng điều chỉnh giá trị các bước thí nghiệm.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Các bước xác định các thông số leo dốc:
Bước 1: Chọn trước một giá trị gia số cho một biến thí nghiệm xj nào đó. Thông
thường ta chọn biến dễ điều khiển nhất hoặc biến ứng với hệ số hồi quy có giá trị tuyệt
đối lớn nhất.
Bước 2: Xác định gia số các biến còn lại theo công thức:
Trong đó: – bước chuyển động được chọn của yếu tố
– bước chuyển động của yếu tố
, – những hệ số hồi quy của các yếu tố tương ứng
, – khoảng biến thiên của các yếu tố tương ứng
Bước 3: Tiến hành thí nghiệm.
Có thể tiến hành các thí nghiệm đơn hoặc lặp để giảm sai số, theo dõi kết quả
thay đổi của hàm mục tiêu. Giá trị hàm mục tiêu sẽ thể hiện sự cải thiện (tăng khi leo
dốc, giảm khi xuống dốc). Tiến hành các thí nghiệm cho đến khi hàm mục tiêu đổi
chiều.
1.3.3.3. Thí nghiệm bề mặt đáp ứng
Khi cần mô tả chính xác quan hệ giữa hàm mục tiêu và các biến thí nghiệm, ta
tiến hành kế hoạch thí nghiệm bề mặt chỉ tiêu. Mục đích của kế hoạch này là bổ sung
các điểm thí nghiệm nhằm có thể xây dựng mô hình bậc 2 mô tả hàm mục tiêu.
(Nguyễn Văn Dự và cs., 2011)
Mô hình bậc hai có dạng:
Với:
Y: Hàm mục tiêu
β0: Hệ số hồi quy
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
βi: Hệ số hồi quy bậc 1 mô tả ảnh hưởng của yếu tố Xi đối với Y
βii: Hệ số quy bậc 2 mô tả ảnh hưởng của yếu tố Xi đối với Y
βij: Hệ số hồi quy tương tác mô tả ảnh hưởng đồng thời hai nhân tố Xi và Xj đối
với Y.
Các bước tiến hành:
- Xây dựng kế hoạch thí nghiệm.
- Tiến hành các thí nghiệm và thu thập kết quả.
- Phân tích số liệu thí nghiệm; xây dựng mô hình hồi quy.
- Xác định điều kiện tối ưu hóa.
- Thực hiện các thí nghiệm kiểm định.
Có hai dạng kế hoạch thí nghiệm bề mặt chỉ tiêu: thiết kế dạng hỗn hợp tâm xoay
(CCD – Central Composite Design) và thiết kế Box – Behnken (Box – Behnken
Thiết kế Box-Behnken
Design).
Thiết kế Box-Behnken được hai tác giả Box và Behnken đề xuất năm 1960 với
mục đích thiết kế các thí nghiệm 3 mức nhằm xây dựng bề mặt chỉ tiêu. Thiết kế này
có tính chất tâm xoay hoặc gần như có tâm xoay. (Nguyễn Văn Dự và cs., 2011)
Số thí nghiệm được tính theo công thức: (Giang Thị Kim Liên., 2009)
N = 2k + 2k + n0
Trong đó: N: số thí nghiệm.
k: số yếu tố thí nghiệm.
n: số thí nghiệm tại tâm.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Hình 1.8 Ma trận bố trí thí nghiệm theo thiết kế Box – Behnken (Box và
Behnken, 1960)
Thiết kế Box-Behnken có những ưu điểm:
- Số lần thí nghiệm cho mỗi lần lặp ít.
- Không có điểm thí nghiệm nào vượt ra ngoài khoảng giữa 2 mức đã thiết lập
cho mỗi biến.
1.4. PHẦN MỀM QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM MINITAB 16.2.0
Các kết quả nghiên cứu cần được phân tích và xử lí để thông qua đó, chỉ ra các ý
nghĩa của bảng kết quả. Với sự trợ giúp của máy tính và các phần mềm chuyên dụng,
thiết kế thí nghiệm và xử lí số liệu thực nghiệm đã trở nên nhẹ nhàng và đơn giản hơn
rất nhiều (Nguyễn Văn Dự và cs., 2011).
Minitab là một phần mềm máy tính giúp ta hiểu biết thêm về thống kê và tiết
kiệm thời gian tính toán.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Phần mềm này ban đầu được thiết kế để phục vụ giảng dạy môn thống kê, sau đó
đã được phát triển thành công cụ phân tích và trình bày dữ liệu rất hiệu quả.
Giao diện của Minitab ở dạng đồ họa, với các menu và hộp thoại rất đơn giản và
dễ dùng, vận hành như một hộp đen, nhận dữ liệu đầu vào và phân tích, xử lý theo yêu
cầu của người sử dụng sau đó hiển thị kết quả thông qua các các cửa sổ (Nguyễn Văn
Dự và cs., 2011).
− Dữ liệu nhập vào có thể được nhận thông qua nhập liệu trực tiếp vào các cửa sổ
bảng tính hoặc lấy file dữ liệu của Minitab hoặc từ các ứng dụng bảng tính khác như
Excel hay Lotus thông qua chức năng sao chép – dán. Ngoài ra Minitab cũng nhận
nhấp liệu từ Session Window thông qua các ngôn ngữ nhập lệnh của Minitab.
− Kết quả sẽ là các kết quả bằng số, chữ và hình ảnh đồ thị thông qua các cửa sổ
Minitab.
− Các đồ thị mô tả thống kê của Minitab có hình thức trình bày rất rõ ràng, có thể
dễ dàng hiệu chỉnh theo ý muốn. Các đồ thị này cũng có thể kết xuất ra nhiều dạng ảnh
hiệu chỉnh được…
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Hình 1.9 Giao diện phần mềm Minitab 16.2.0
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGIÊN CỨU
- Thời gian: Từ tháng 11/2013 đến tháng 5/2014
- Địa điểm: Phòng thí nghiệm Công Nghệ Vi Sinh-Trường Đại học Mở Thành
phố Hồ Chí Minh.
2.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
2.2.1. Đối tượng nghiên cứu
Chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum NT1.5 được cung cấp từ Phòng thí
nghiệm Công nghệ Vi sinh–Trường Đại Học Mở Tp Hồ Chí Minh đã được chứng minh
có khả năng làm giảm cholesterol và khả năng làm probiotic (Dương Nhật Linh và cs.,
2013)
2.2.2. Môi trường – hóa chất
Môi trường MRS (Deman, Rogosa and Sharpe).
Môi trường MRSA. Cồn 96o, cồn 70o, H2SO4, NaOH, HCl.
Các loại đường: glucose, sucrose, maltose, mật rỉ đường, xylose, manitol.
Cao nấm men, pepton, bột đậu nành, bột bắp, amonium sulfate ((NH4)2SO4),
urê (H2NCONH2)
Các muối khoáng: NaCl, K2HPO4.3H2O, KH2SO4, MgSO4.7H2O, CaCl2,
MnSO4.4H2O, CaCO3,
Nước cất, nước muối sinh lý 0,85 %.
2.2.3. Dụng cụ
Đĩa petri, ống nghiệm, erlen, becher, pipette, pipettman, đầu típ các loại, , que
cấy, lam, lamer, đèn cồn, kính hiển vi, giấy đo pH.
2.2.4. Trang thiết bị
- Tủ cấy - Kính hiển vi
- Cân kỹ thuật - Tủ ấm CO2
- Nồi hấp tiệt trùng - Cân phân tích
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
- Máy đo pH - Tủ sấy
- Máy đo mật độ quang - Lò viba
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Hoạt hóa chủng Từ ống giữ chủng 20% glycerol/ -20o C, tiến hành hoạt hóa chủng Lactobacillus plantarum NT1.5 trên 5mL môi trường MRS (DeMan Rogosa and Sharpe) ủ ở 37oC /
24-48 giờ.
Từ ống môi trường lỏng đã hoạt hóa 24-48 giờ chúng tôi tiến hành cấy ria trên
môi trường MRSA (DeMan Rogosa and Sharpe agar), ủ ở 37oC, 5%CO2, 48 giờ.
Sau 48 giờ chọn những khuẩn lạc riêng lẻ, điển hình cấy trên môi trường thạch
đứng MRSA giữ chủng cho các thí nghiệm tiếp theo.
2.3.2. Xây dựng biểu đồ tương quan giữa giá trị OD và nồng độ tế bào.
2.3.2.1. Định lượng tế bào bằng phương pháp đo OD
Nguyên tắc
Khi một pha lỏng có nhiều phân tử không tan thì sẽ hình thành một hệ huyền phù
và có độ đục bởi các phần tử hiện diện trong môi trường lỏng làm cản ánh sáng, làm
phân tán chùm ánh sáng tới. Tế bào vi sinh vật là một thực thể nên khi hiện diện trong
môi trường cũng làm môi trường trở nên đục. Độ đục của huyền phù tỷ lệ với mật độ tế
bào. Trong một giới hạn của độ đục và mật độ tế bào, có thể xác lập được quan hệ tỷ lệ
tuyến tính giữa mật độ tế bào và độ đục. Do đó, có thể định lượng mật độ tế bào một
cách gián tiếp thông qua đo độ đục bằng cách so màu ở các bước sóng từ 550 – 610 nm
(Trần Linh Thước và cs., 2001).
Tiến hành pha loãng huyền dịch vi khuẩn bằng môi trường MRS sao cho thu
Thực hiện
Thực hiện định lượng tế bào bằng phương pháp đếm số lượng khuẩn lạc.
Các giá trị OD610 tương ứng được pha loãng và trải trên đĩa môi trường MRSA
được các huyền dịch có giá trị OD610: 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5.
ở các nồng độ đếm được.
Xây dựng đường tương quan giữa OD610 và mật độ tế bào tương ứng với các
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
huyền phù bằng phần mềm Excel của Microsoft.
2.3.2.2. Định lượng tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc
Phương pháp định lượng tế bào bằng cách đếm khuẩn lạc được tiến hành với các
Tại các nồng độ OD tến hành pha loãng bậc 10 như: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-
5,…
Trải 0,1 mL huyền phù sau pha loãng lên đĩa môi trường MRSA, mỗi nồng độ
bước sau: (Trần Linh Thước và cs., 2001)
Ủ 37oC/5% CO2, 24 -48 giờ.
Nhận diện khuẩn lạc đặc trưng và đếm số khuẩn lạc của chủng vi khuẩn
pha loãng trải 3 đĩa.
Lactobacillus plantarum NT 1.5 tại mỗi độ pha loãng: chọn độ pha loãng có số khuẩn
lạc phân bố hợp lý nhất và trong khoảng 25 – 250 khuẩn lạc/ đĩa, đếm số khuẩn lạc trên
Tính số lượng tế bào có trong 1 mL mẫu theo công thức sau:
cả 3 đĩa lặp lại trên cùng độ pha loãng.
Trong đó:
A: Mật độ tế bào (CFU/ mL)
N: Tổng số khuẩn lạc đếm được
ni: Số đĩa được đếm ở nồng độ pha loãng i
V: Số mL dịch mẫu cấy vào mỗi đĩa.
fi: nồng độ pha loãng có số khuẩn lạc được chọn đếm.
2.3.3. Xây dựng đường cong tăng trưởng của L. plantarum NT 1.5
2.3.3.1. Nguyên tắc
Sự tăng trưởng của vi sinh vật là sự gia tăng số lượng tế bào vi sinh vật trong
quần thể và tốc độ tăng trưởng là sự tăng trưởng của vi sinh vật trong một đơn vị thời
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
gian. Một quần thể vi sinh vật thường có những đặc trưng tăng trưởng riêng khi được
nuôi cấy trong một môi trường và điều kiện nhất định.
Động thái tăng trưởng của vi sinh vật bắt đầu từ một pha tiềm tàng (lag phase).
Sau đó, sự tăng trưởng bắt đầu và số lượng tế bào tăng lũy tiến, giai đoạn này gọi là
pha log (log phase). Theo thời gian, nguồn dinh dưỡng trong môi trường trở nên cạn
kiệt cùng với sự tích lũy của độc chất. Sự tăng trưởng dừng lại và đi vào pha ổn định
(stationary phase). Nếu tiếp tục nuôi cấy, các tế bào bắt đầu chết và đi vào pha suy tàn
(death phase). Mỗi loại vi khuẩn lại có đường cong tăng trưởng riêng, do đó cần phải
khảo sát đường cong tăng trưởng của chủng vi khuẩn đang quan tâm để xác định được
thời gian thu nhận sản phẩm thích hợp (Nguyễn Thành Đạt, 2011).
2.3.3.2. Thực hiện Điều chỉnh dịch khuẩn đã hoạt hoá đạt giá trị OD610 tương đương 108 tế
bào/mL, sau đó hút 2 mL dịch khuẩn cho vào erlen chứa 18 mL môi trường MRS. Nuôi dịch khuẩn ở 37oC/5% CO2.
Theo dõi sự tăng trưởng của vi sinh vật ở các mốc 0 giờ, 3 giờ, 6 giờ, 9 giờ, 12
giờ, 15 giờ, 18 giờ, 21 giờ, 24 giờ, 27 giờ, 30 giờ, 33 giờ, 36 giờ, 39 giờ, 42 giờ, 48 giờ
bằng cách đo OD610 để xác định mật độ tế bào sau mỗi thời gian nuôi cấy.
Sử dụng đường tương quan giữa mật độ tế bào và OD610 để xác định mật độ
tế bào tại các giá trị OD610 tương ứng tại mỗi thời điểm khảo sát.
Dựa vào những mốc thời gian và mật độ tế bào, xây dựng đường cong tăng
trưởng của vi sinh vật bằng phần mềm Excel của Microsoft.
2.3.4. Khảo sát nhiệt độ, pH thích hợp cho sự tăng trưởng của L. plantarum
Mục đích
NT1.5
Xác định được nhiệt độ và pH thích hợp thu được nhiều sinh khối vi khuẩn
Nguyên tắc
nhất.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật là kết quả của các phản ứng hóa học. Các
phản ứng này phụ thuộc chặt chẽ vào nhiệt độ, do đó yếu tố nhiệt độ ảnh hưởng sâu sắc
đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. Vùng sinh trưởng của vi sinh vật
là vùng giới hạn giữa nhiệt độ cực đại và nhiệt độ cực tiểu mà vùng này khác nhau giữa
các loài.
pH là đại lượng dùng để đo độ hoạt tính của ion H+ trong môi trường. pH ảnh hưởng đến hoạt động của vi sinh vật là do sự tác động qua lại giữa ion H+ và các
enzyme chứa trong thành tế bào và màng tế bào chất. Mỗi loài vi sinh vật chỉ thích hợp
Tiến hành Điều chỉnh dịch khuẩn đã hoạt hoá đạt giá trị OD tương đương 108 tế bào/mL, sau
sống trong khoảng pH nhất định. (Nguyễn Lân Dũng và cộng sự, 2000)
đó hút 1 mL dịch khuẩn vào 9 mL môi trường MRS được điều chỉnh ở các giá trị pH
lần lượt như sau: 4, 5, 6, 7, 8 (Bevilacqua và cs., 2008).
Nuôi ở các nhiệt độ: 30oC, 37oC, 40oC.
Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần.
Sau thời gian nuôi cấy, dịch khuẩn được đo OD610 và dựa vào đường tương quan
Kết quả
Số liệu được xử lý thống kê ANOVA bằng phần mềm Statgraphics Plus 3.0 và
để xác định mật độ tế bào.
Kết quả được trình bày dưới dạng: trung bình sai số chuẩn.
Excel của Microsoft.
2.3.5. Sàng lọc các yếu tố dinh dưỡng
2.3.5.1. Nguồn nitơ
Các nguồn nitơ được khảo sát là: bột bắp, bột đậu nành, pepton, (NH4)2SO4,
urê với nồng độ khảo sát được thể hiện trong bảng 2.1. (Han và cs., 2011; Altaf và
cs., 2006)
Bảng 2.1. Các nguồn nitơ khảo sát
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thành phần Nồng độ (g/L)
10 Pepton
15 Bột bắp
8 Bột đậu nành
5 (NH4)2SO4
3 H2NCONH2
Môi trường chọn lọc nguồn Nitơ tối ưu gồm có nguồn nitơ cần khảo sát, glucose
20 g/L và các thành phần còn lại của môi trường MRS như: tween 80, K2HPO4,
CH3CO2Na, MgSO4.7H2O, MnSO4.H2O.
2.3.5.2. Nguồn cacbon
Các nguồn cacbon được khảo sát là: succrose, maltose, lactose, glucose, mật rỉ
đường, bột bắp với khối lượng khảo sát được trình bày trong bảng 2.2. (Altaf và cs.,
2006; Farooq và cs., 2012; Han và cs., 2011; Magdalena và cs., 2010)
Bảng 2.2. Các nguồn cacbon khảo sát
Thành phần Khối lượng (g/L)
30 Bột bắp
20 Glucose
20 Maltose
20 Succrose
40 Mật rỉ đường
20 Lactose
Môi trường chọn lọc nguồn cacbon tối ưu gồm có nguồn nitơ tối ưu, nguồn
cacbon cần khảo sát và các thành phần còn lại của môi trường MRS: tween 80, MgSO4,
K2HPO4, CH3COONa, MnSO4.
2.3.5.3. Nguồn khoáng
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Khảo sát các nguồn khoáng: CaCl2, NaCl, CaCO3, MgSO4.7H2O, K2HPO4,
KH2PO4 với khối lượng được trình bày trong bảng 2.3.(Han và cs., 2011; Altaf và cs.,
2006)
Bảng 2.3. Các nguồn khoáng khảo sát
Thành phần Khối lượng (g/L)
0.5 K2HPO4
0.5 KH2PO4
0.5 CaCO3
NaCl 0.5
0.5 CaCl2
0.5 MgSO4.7H2O
Môi trường chọn lọc nguồn khoáng tối ưu bao gồm nguồn nitơ tối ưu (10 g/L),
Tiến hành Chủng L. plantarum NT 1.5 được tăng sinh trên môi trường MRS ở 37oC, 5%
nguồn cacbon tối ưu (20 g/L), và nguồn khoáng cần khảo sát.
CO2, 24 giờ.
Điều chỉnh dịch khuẩn về 108 tế bào/ mL sau đó bổ sung 1mL dịch khuẩn vào 20
mL môi trường khảo (pH, nhiệt độ theo kết quả mục 2.3.4.) trong khoảng thời gian
(theo kết quả mục 2.3.3), 5% CO2.
Sau thời gian nuôi cấy đo mật độ tế bào L. plantarum NT 1.5 bằng phương pháp
đo độ đục ở bước sóng 610 nm.
Các thử nghiệm được lặp lại 3 lần, kết quả được xử lý thống kê ANOVA một yếu
tố bằng phần mềm Statgraphics Plus 3.0 và phần mềm Excel. Kết quả được trình bày
dưới dạng trung bình ± sai số.
2.3.6. Thiết kế thí nghiệm tìm yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men
tăng sinh khối theo thiết kế Plackett- Burman
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Mục đích
Xác định các yếu tố quan trọng ảnh hưởng chính đến quá trình lên men thu
sinh khối của chủng vi khuẩn L. plantarum NT 1.5.
Thiết kế thí nghiệm Plackett – Burman
Thiết kế thí nghiệm theo ma trận Plackett – Burman với các yếu tố gồm có:
nguồn nitơ, cacbon và các nguồn khoáng đã được chọn ở mục 2.4.
Mỗi yếu tố được khảo sát ở 2 mức độ: mức độ cao (+1) và mức độ thấp (-1).
Thiết kế được bố trí dựa theo phương pháp qui hoạch thực nghiệm bằng phần
mềm thống kê Minitab 16.2.0 của Minitab Inc., USA để ước tính các giá trị t-value, p-
value và mức độ tin cậy.
Thực hiện :
Tăng sinh chủng L. plantarum trên 20 mL môi trường MRS ủ ở 37oC, 24-48
giờ.
Điều chỉnh dịch khuẩn đạt giá trị OD610 có mật độ tế bào khoảng 108 tế bào/mL.
Bổ sung 1 mL dịch khuẩn vào 20 mL môi trường khảo sát.
Nuôi vi khuẩn ở nhiệt độ khảo sát theo mục 2.3.4., 5% CO2. Sau thời gian nuôi
cấy dịch khuẩn được đo OD610 để xác định mật độ tế bào.
Mỗi nghiệm thức của thí nghiệm được thực hiện với 3 lần lặp lại.
Kết quả
Số liệu kết quả thí nghiệm được thống kê bằng phần mềm Minitab 16.2.0
Ảnh hưởng của các yếu tố đến sinh khối chủng vi khuẩn được mô tả qua
phương trình hồi quy bậc nhất:
Dựa vào phân tích hồi quy, nếu mức ý nghĩa đạt trên 95% (p < 0,05), thì yếu tố
đó được cho là có ảnh hưởng chính đến sự tăng sinh khối tế bào và với kết quả thu tiếp
tục thực hiện các thí nghiệm tiếp theo để xác định giá trị tối ưu cho sự gia tăng sinh
khối.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.7. Thí nghiệm khởi đầu Thiết kế thí nghiệm dạng đầy đủ 22, có bổ sung thêm điểm thí nghiệm trung tâm.
Mỗi yếu tố được khảo sát ở 3 cấp độ: mức độ cao (+1) và mức độ thấp (-1) và
mức trung tâm (0). Thiết kế được bố trí dựa theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm
bằng phần mềm thống kê Minitab 16.2.0 của Minitab Inc., USA. Thí nghiệm được lặp
lại 3 lần.
Tiến hành
Tương tự mục 2.3.6
2.3.8. Tìm khoảng tối ưu của các yếu tố ảnh hưởng chính bằng phương
pháp leo dốc
2.3.8.1. Thiết kế thí nghiệm
Nếu kết quả của bước khởi đầu cho thấy có thể mô tả hàm mục tiêu bằng một
hàm hồi quy bậc nhất, điều đó chứng tỏ vùng thí nghiệm khảo sát còn ở xa vùng cực
trị. Tiến hành các thí nghiệm leo dốc nhằm xác định vùng cực trị. Các thông số cho
phương pháp này được tính toán thông qua hệ số hồi quy từ phương trình hồi quy của
thí nghiệm khởi đầu.
Từ mức cơ sở của các yếu tố này và các hệ số hồi quy, các bước chuyển động sẽ
được tính như sau:
Chọn bước chuyển động ứng với yếu tố có giá trị tuyệt đối của hệ số hồi qui
lớn nhất và tính toán các bước chuyển động còn lại bằng các công thức:
Trong đó:
: Khoảng biến thiên.
: Hệ số hồi qui của yếu tố x1.
: Bước chuyển động của yếu tố x1.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Từ kết quả tính toán bước chuyển động của từng yếu tố ảnh hưởng, thí nghiệm
bắt đầu từ mức trung tâm của các yếu tố ảnh hưởng chính. (Nguyễn Văn Dự và cs.,
2011)
2.3.8.2. Tiến hành
Tương tự mục 2.3.6.
2.3.9. Thí nghiệm bề mặt chỉ tiêu xác định giá trị tối ưu của các yếu tố ảnh
hưởng chính.
Từ kết quả thí nghiêm leo dốc, tiến hành thiết kế thí nghiệm Box-Behnken để tìm
giá trị tối ưu của các yếu tố ảnh hưởng chính.
2.3.9.1. Thiết kế thí nghiệm
Mỗi yếu tố được khảo sát ở 3 mức độ: mức độ cao (+1), mức độ thấp (-1) và mức
độ trung tâm (0) dựa theo kết quả ở mục 2.3.8.
Thiết kế được bố trí dựa theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm bằng phần
mềm thống kê Minitab 16.2.0 của Minitab Inc., USA.
2.3.9.2. Tiến hành
Tương tự mục 2.3.6.
2.3.10. Xác định thời gian tăng trưởng của chủng L. plantarum NT1.5 trên
môi trường tối ưu
Sau khi xác định được môi trường và điều kiện nuôi cấy tối ưu cho sinh khối cao
nhất chúng tôi tiến hành kiểm định kết quả và khảo sát lại thời gian tăng trưởng tối ưu
nhất của chủng vi khuẩn trên môi tường khảo sát ở nhiệt độ theo mục 2.3.4, 5% CO2.
Phương pháp thực hiện tương tự mục 2.2.3.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
3.1 KẾT QUẢ XÂY DỰNG ĐƯỜNG TƯƠNG QUAN GIỮA MẬT
ĐỘ TẾ BÀO VI KHUẨN VÀ GIÁ TRỊ OD610
Để có được đường tương quan tuyến tính giữa OD610 và mật độ tế bào
Lactobacillus plantarum NT 1.5 trên môi trường MRS, chúng tôi tiến xác định mật
độ vi khuẩn ở những giá trị đo OD610 tương ứng. Kết quả xây dựng đường tương
quan giữa mật độ tế bào vi khuẩn và giá trị OD610 được trình bày trong bảng 3.1 và
đồ thị 3.1.
Bảng 3.1: Giá trị đo OD610 và mật độ tế bào (Log(N/mL)
0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 OD610nm
7,2.106 1,31.107 1,98.107 2,5.107 3,3.107 Số khuẩn lạc bình quân (CFU/ mL)
Log (N/ mL) 6,857 7,117 7,297 7,398 7,519
y = 1.603x + 6.7566 R² = 0.9617
log(N/mL)
7.600 7.500 7.400 7.300 7.200 7.100 7.000 6.900 6.800
0 0.2 0.4 0.6
Giá trị OD610
Đồ thị 3.1. Đường tương quan tuyến tính giữa OD610 và mật độ tế bào Lactobacillus plantarum NT 1.5 trên môi trường MRS
Qua khảo sát quá trình nuôi cấy của chủng L. plantarum NT 1.5 trong 24 giờ
được trình bày trên bảng và biểu đồ chúng tôi nhận thấy rằng mật độ tế bào của vi
khuẩn L. plantarum NT1.5 trong huyền phù tế bào tương quan tuyến tính với các
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
giá trị OD610nm từ 0,1 – 0,5 theo phương trình y = 1,603x + 6,7566 với mức độ tin
cậy 96,17%.
3.2 KẾT QUẢ XÂY DỰNG ĐƯỜNG CONG TĂNG TRƯỞNG CỦA
L. PLANTARUM NT 1.5
Dựa vào kết quả xây dựng đường tương quan giữa mật độ tế bào vi khuẩn và
giá trị OD610 chúng tôi tiến hành xây dựng đường cong tăng trưởng trưởng của
chủng Lactobacillus plantarum NT1.5. Sự tăng trưởng của chủng Lactobacillus
plantarum NT1.5 được theo dõi tại các thời điểm khảo sát bằng cách đo OD610 theo
những mốc thời gian nuôi cấy. Kết quả được trình bày trong bảng 3.2 và đồ thị 3.2.
Bảng 3.2. Giá trị OD610 theo thời gian
Thời gian (giờ) Log (N/mL) Giá trị OD610
0,023 ± 0,001 6,800 0
0,145 ± 0,000 6,990 3
0,369 ± 0,000 7349 6
0,625 ± 0,000 7,758 9
1,556 ± 0,003 9,250 12
1,944 ± 0,000 9,873 15
2,111 ± 0,000 10,141 18
2,084 ± 0,000 10,097 21
2,078 ± 0,000 10,088 24
2,070 ± 0,000 10,075 27
2,049 ± 0,000 10,041 30
2,036 ± 0,000 10,021 33
2,035 ± 0,000 10,019 36
2,013 ± 0,000 9,983 39
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
1,994 ± 0,000 9,952 42
1,993 ± 0,000 9,954 45
1,988 ± 0,000 9,944 48
1,971 ± 0,000 9,916 51
1,967 ± 0,000 9,910 54
1,935 ± 0,002 9,859 57
1,848 ± 0,000 9,719 60
1,806 ± 0,005 9,652 63
1,703 ± 0,000 9,486 66
1,615 ± 0,000 9,345 69
12.000
10.000
1,470 ± 0,016 9,114 72
8.000
6.000
4.000
2.000
0.000
h 0
h 3
h 6
h 9
h 7 2
h 0 6
h 6 6
h 2 1
h 5 1
h 8 1
h 1 2
h 4 2
h 0 3
h 3 3
h 6 3
h 9 3
h 2 4
h 5 4
h 8 4
h 1 5
h 4 5
h 7 5
h 3 6
h 9 6
h 2 7
Đồ thị 3.2. Đường cong tăng trưởng của L. plantarum NT 1.5 theo thời gian trên môi trường MRS
Dựa vào bảng kết quả giá trị OD (bảng 3.2) và đồ thị đường cong tăng trưởng
của L. plantarum NT 1.5 trên môi trường MRS (đồ thị 3.2) chúng tôi nhận thấy rằng
thời gian từ 0 giờ đến 6 giờ là thời gian vi khuẩn bước vào pha tiềm tàng (pha Lag)
thời gian này vi khuẩn tăng sinh rất ít (log có giá trị từ 6,800 đến 7,349). Từ 6 giờ
đến 18 giờ vi khuẩn tăng sinh mạnh nhất (log có giá trị từ 7,349 đến 10,141) đây là
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
thời gian thu được nhiều sinh khối vi khuẩn nhất. Vi khuẩn bước vào pha cân bằng
trong thời gian 18 đến 60 giờ (log có giá trị từ 10,141 đến 9,719). Sau 60 giờ vi
khuẩn rơi vào pha suy tàn.
Từ kết quả trên chúng tôi chọn 18 giờ (log = 10,141 N/ mL) là thời gian thích
hợp nhất để thu nhận sinh khối của L. plantarum NT 1.5.
3.3 KẾT QUẢ KHẢO SÁT NHIỆT ĐỘ, pH THÍCH HỢP CHO SỰ
TĂNG TRƯỞNG CỦA L. PLANTARUM NT1.5.
Từ kết quả xây dựng đường tương quan giữa mật độ tế bào vi khuẩn và giá trị
OD610, đường cong tăng trưởng trưởng chủng Lactobacillus plantarum NT 1.5,
chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy và pH môi trường đến
sự tăng trưởng của L. plantarum NT1.5. Kết quả được thể hiện bằng giá trị Log (N/
mL) của mỗi nhiệt độ tại pH tương ứng.
Kết quả khảo sát được trình bày trong bảng 3.3 và đồ thị 3.3.
Bảng 3.3. Mật độ tế bào Lactobacillus plantarum NT1.5 (Log (N/ mL)) tại mỗi giá trị nhiệt độ và độ pH khảo sát
pH = 4 pH = 5 pH = 6 pH = 7 pH = 8
9,990 ± 0,025 9,352± 0,129 30oC 7,605± 0,027 8,724± 0,174 9,782± 0,034
10,011 ± 0,014 9,677± 0,007 37oC 8,588± 0,167 9,389± 0,136 9,942± 0,020
9,183 ± 0,028 7,423± 0,114 40oC 7,173± 0,126 8,522± 0,061 8,821± 0,102
12
10
8
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
30oC
6
37oC
40oC
4
2
0
pH = 4
pH = 5
pH = 6
pH = 7
pH = 8
Đồ thị 3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ và độ pH lên sự tăng trưởng của Lactobacillus plantarum NT1.5
Dựa vào bảng 3.3 và đồ thị 3.3 chúng tôi thấy rằng tại pH=4 và 40oC
Lactobacillus plantarum NT1.5 tăng trưởng thấp nhất (Log =7,605±0,027) và cao nhất ở 37oC và pH 7 (log (N/mL) = 10,011 ± 0,001). Như vậy chúng tôi chọn pH=7 và nhiệt độ 37oC là điều kiện nuôi cấy thích hợp cho L.pantarum NT1.5 cho các thí
nghiệm tiếp theo.
3.4 KẾT QUẢ SÀNG LỌC YẾU TỐ DINH DƯỠNG
Từ những kết quả có được ở các thí nghiệm trước (xây dựng đường tương
quan giữa mật độ tế bào vi khuẩn và giá trị OD610, đường cong tăng trưởng trưởng ,
kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến sự tăng trưởng của L.
plantarum), chúng tôi tiến đến bước sàng lọc các yếu tố dinh dưỡng ảnh hưởng đến
sự sinh trưởng của chủng L. plantarum. Các nguồn dinh dưỡng khảo sát gồm có:
nguồn nitơ, nguồn cacbon, nguồn khoáng.
3.4.1. Nguồn nitơ
Chúng tôi tiến hành khảo sát các nguồn nitơ: pepton, bột đậu nành, bột bắp,
(NH4)2SO4, Urê với khói lượng mỗi nguồn được thể hiện trong bảng 2.1 (mục
2.3.5.1).
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
Ảnh hưởng của các nguồn nitơ khảo sát đến sinh trưởng của L. plantarum
NT1.5 được xác định thông qua giá trị Log (N/ mL). Kết quả thí nghiệm được thể
hiện trong bảng 3.4 và đồ thị 3.4.
Bảng 3.4. Giá trị log (N/ mL) của các nguồn nitơ khảo sát
Nguồn Nitơ Log (N/ mL) Mật độ (CFU/ mL)
7,193 ± 0,051c 1,5.107 Bột bắp
8,721 ± 0,164a 5,2.108 Pepton
7,644 ± 0,164b 4,4.107 Bột đậu nành
7,265 ± 0,021c 1,107 (NH4)2SO4
7,381 ± 0,012c 1.8.107 Urê
Trong cùng một cột các chỉ số có cùng mẫu tự không có sự khác biệt ở mức ý
10
9
8
7
nghĩa 5% qua phép thử Duncan.
6
5
4
3
2
1
0
bot bap
pepton
bột đậu nành (NH4)2SO4
URE
Đồ thị 3.4. Kết quả khảo sát nguồn nitơ
Theo kết quả thí nghiệm bảng 3.4 và biểu đồ 3.4 chúng tôi nhận thấy rằng:
Giữa các số liệu có sự khác biệt ý nghĩa với độ tin cậy p < 0,05 (phụ lục 2).
Trong các nguồn nitơ (hữu cơ và vô cơ) thì nguồn nitơ hữu cơ ảnh hưởng đến
mật độ vi khuẩn cao hơn các nguồn nitơ vô cơ. Pepton cho mật độ vi khuẩn cao
nhất (Log (N/ mL) = 8,721 ± 0,081), thấp nhất là bột bắp (Log (N/ mL) = 7,193 ±
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
0,008. Vì vậy, pepton được chọn là nguồn nitơ tốt nhất cho sản xuất sinh khối của
L. plantarum NT1.5.
3.4.2. Nguồn cacbon
Từ kết quả mục 3.4.1 chúng tôi tiếp tục khảo sát các nguồn cacbon. Môi
trường khảo sát gồm có pepton, các nguồn khoáng của môi trường MRS và các
nguồn cacbon cần khảo sat.
Các nguồn cacbon cần khảo sát là: succrose, maltose, glucose, lactose, mật rỉ
đường, bột bắp với khối lượng mỗi nguồn được trình bày trong bảng 2.2 (mục
2.5.3.2).
Ảnh hưởng của các nguồn cacbon khảo sát đến sự sinh trưởng của L.plantarun
NT1.5 được xác định thông qua giá trị Log (N/ mL). Kết quả thí nghiệm được trình
bày trong bảng 3.5 và biểu đồ 3.5.
Bảng 3.5. Giá trị log (N/ mL) của các nguồn cacbon khảo sát
Nguồn Cacbon Log (N/ mL) Mật độ (CFU/ mL)
8,586 ± 0,057c 3,9.108 Succrose
9,519 ± 0,007a 3,0.109 Maltose
9,155 ± 0,014b 10,5.109 Glucose
7,198 ± 0,020d 1,6.107 Lactose
9,252 ± 0,093b 1.8.109 Mật rỉ đường
6,912 ± 0,012e 8,2.106 Bột bắp
Trong cùng một cột các chỉ số có cùng mẫu tự không có sự khác biệt ở mức ý
nghĩa 5% qua phép thử Duncan.
10,000
9,000
8,000
7,000
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
6,000
5,000
4,000
3,000
2,000
1,000
0
succrose
maltose
glucose
lactose
bột bắp
mật rỉ đường
Đồ thị 3.5. Kết quả khảo sát nguồn Cacbon
Theo kết quả thí nghiệm bảng 3.5 và biểu đồ 3.5, chúng tôi thấy rằng:
- Giữa các số liệu có sự khác biệt ý nghĩa với độ tin cậy p < 0,05 (phụ lục 2).
- Các nguồn cacbon đều ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của vi khuẩn
L.plantarum NT1.5. Trong các nguồn cacbon thì maltose cho mật độ vi khuẩn cao
nhất (Log (N/ mL) = 9,519 ± 0,000). Glucose và mật rỉ đường ảnh hưởng đến khả
năng tăng trưởng của vi khuẩn ngang nhau (với giá trị Log (N/ mL) tương ứng là
9,155 ± 0,001 và 9,252 ± 0,026). Thấp nhất là bột bắp Log (N/ mL) = 6,912 ±
0,000.
Các nguồn cacbon maltose, glucose, mật rỉ đường đều có ảnh hưởng cao đến
khả năng tăng trưởng của vi khuẩn. Mặc dù maltose có ảnh hưởng cao hơn tuy
nhiên, xét về giá thành mật rỉ đường giúp tiết kiệm chi phí sản xuất hơn maltose và
glucose rất nhiều lần. Vì vậy, chúng tôi chọn mật rỉ đường là nguồn cacbon tốt nhất
cho sản xuất sinh khối L. plantarum NT1.5.
3.4.3. Nguồn khoáng
Từ kết quả mục 3.4.1 và 3.4.2 chúng tôi tiếp tục khảo sát ảnh hưởng của các
nguồn cacbon đến khă năng sinh trưởng của chủng vi khuẩn. Các nguồn khoáng
được khảo sát là: CaCO3, K2HPO4, MgSO4.7H2O, CaCl2, NaCl, KH2PO4 với khối
lượng mỗi nguồn được thể hiện trong bảng 2.3 (mục 2.3.5.3).
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
Ảnh hưởng của các nguồn muối khoáng khảo sát đến sự sinh trưởng của
L.plantarum NT1.5 được xác định thông qua giá trị Log (N/ mL). Kết quả thí
nghiệm được trình bày trong bảng 3.6 và biểu đồ 3.6.
Bảng 3.6. Giá trị log (N/ mL) của các nguồn muối khoáng khảo sát
Nguồn khoáng Log (N/ mL) Mật độ (CFU/ mL)
8,648 ± 0,305a 4,4.108 CaCO3
7,665 ± 0,121b 4,6.107 K2HPO4
9,348 ± 0,299a 2,0.109 MgSO4
8,659 ± 0,374a 4,6.108 CaCl2
9,070 ± 0,111a 1,2.109 NaCl
7,163 ± 0,152b 1,3.107 KH2PO4
Trong cùng một cột các chỉ số có cùng mẫu tự không có sự khác biệt ở mức ý
12
10
8
nghĩa 5% qua phép thử Duncan.
6
4
2
0
CaCO3 K2HPO4 MgSO4
CaCl2
NaCl
KH2PO4
Đồ thị 3.6. Kết quả khảo sát nguồn muối khoáng
Theo bảng kết quả 3.5 và biểu đồ 3.5, chúng tôi nhận thấy rằng:
Giữa các số liệu có sự khác biệt ý nghĩa với độ tin cậy p < 0,05.
Tất cả các nguồn khoáng khảo sát đều có ảnh hưởng tích cực đến sinh
trưởng của vi khuẩn. Trong đó, ảnh hưởng của CaCO3, MgSO4.7H2O, CaCl2, NaCl
đến mật độ tế vi khuẩn L. plantarum NT1.5 không có sự khác biệt ý nghĩa, giá trị
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
Log (N/ mL) của CaCO3, MgSO4.7H2O, CaCl2, NaCl lần lượt là 8,648 ± 0,279;
9,348 ± 0,269; 8,659 ± 0,420; 9.07 ± 0,037. KH2PO4 và K2HPO4 cho mật độ tế bào
thấp hơn với giá trị Log (N/ mL) = 7,163 ± 0,070; 7,665 ± 0,044. Như vậy, CaCO3,
MgSO4.7H2O, CaCl2, NaCl là các nguồn khoáng tốt nhất cho sinh trưởng của L.
plantarum NT1.5.
3.5 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG CHÍNH
THEO THIẾT KẾ THÍ NGHIỆM PLACKETT- BURMAN
Từ kết quả mục khảo sát các nguồn dinh dưỡng, chúng tôi xác định được các
yếu tố: pepton, mật rỉ đường, CaCO3, MgSO4.7H2O, CaCl2, NaCl có ảnh hưởng đến
khả năng sinh trưởng của chủng L. plantarum NT1.5. Để xác định được các yếu tố
có ảnh hưởng chính đến khả năng sinh trưởng của chủng vi khuẩn chúng tôi tiến
hành thí nghiệm xác định các yếu tố ảnh hưởng chính theo thiết kế thí nghiệm
Plackett-Burman (P-B).
Thiết kế thí nghiệm Plackett – Burman được thiết kế với 6 yếu tố (bảng 2.1)
gồm 20 thí nghiệm, lặp lại 3 lần được bố trí dựa theo phương pháp quy hoạch thực
nghiệm bằng phần mềm thống kê Minitab 16.2.0 của Minitab Inc., USA (bảng 3.7).
Mỗi yếu tố được xem xét ở 2 mức độ: (-1) cho mức độ thấp và (+1) cho mức
độ cao. Mức giá trị của các yếu tố khảo sát và kết quả phân tích hồi quy được trình
bày ở bảng 3.8.
Bảng 3.7. Mức ảnh hưởng của từng yếu tố
Giá trị mức yếu tố Mức ảnh Kí Yếu tố (g/ L) P Giá trị cao Giá trị thấp hưởng hiệu (+1) (-1)
15 5 0,8905 0,000 Pepton A
20 10 1,1509 0,000 Mật rỉ đường B
1,5 1 0,3968 0,000 NaCl C
1,5 1 0,5219 0,000 D CaCl2
1,5 1 0,0506 0,554 E CaCO3
0,2 0 0,7621 0,000 F MgSO4.7H2O
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
Bảng 3.8: Kết quả thí nghiệm Plackett- Burman
P-B
Pepton Mật rỉ đường -1 1 -1 -1 -1 -1 1 -1 1 -1 1 1 -1 -1 -1 -1 -1 1 1 1 -1 -1 -1 1 1 -1 -1 1 -1 1 -1 -1 NaCl CaCl2 CaCO3 MgSO4. 7H2O 1 -1 1 -1 -1 -1 1 1 -1 -1 1 -1 1 -1 -1 1 -1 -1 1 -1 1 -1 1 -1 -1 1 -1 1 1 -1 -1 1 -1 1 1 1 -1 -1 1 1 -1 -1 1 -1 -1 1 -1 1 -1 1 -1 -1 -1 1 -1 -1 1 1 1 1 1 1 1 -1 -1 -1 -1 1 1 -1 -1 1 -1 1 -1 1 1 -1 -1 -1 -1 1 1 1 1 1 1 -1 -1 -1 -1 -1 1 -1 1 -1 -1 1 -1 -1 1 1 1 -1 -1 1 1 -1 1 1 -1 -1 -1 -1 1 -1 1 -1 1 -1 1 -1 1 -1 1 1 -1 -1 6,344 8,702 5,734 7,869 6,392 5,943 7,055 6,221 8,286 6,408 7,061 7,686 6,808 7,408 5,952 5,739 5,943 9,157 7,055 7,664 6,808 7,864 6,815 8,254 8,739 5,764 7,446 7,061 7,238 8,719 7,879 6,350 Mật độ (CFU/mL) 2,2.106 5,0.108 5,4.105 7,4.107 2,5.106 8,8.105 1,1.107 1,7.106 1,9.108 2,6.106 1,2.107 4,9.107 6,4.106 2,6.107 9,0.105 5,5.105 8,8.105 1,4.109 1,1.107 4,6.107 6,4.106 7,3.107 6,5.106 1,8.108 5,5.108 5,8.105 2,8.107 1,2.107 1,7.107 5,2.108 7,6.107 2,2.106 1 1 -1 1 -1 -1 -1 -1 1 -1 -1 -1 1 1 -1 -1 -1 1 -1 -1 1 1 1 1 1 -1 1 -1 1 1 1 1
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
1 1 1 1 1 1 -1 1 1 -1 1 1 -1 1 1 -1 -1 -1 -1 1 1 -1 1 1 -1 1 1 -1 -1 1 -1 1 1 -1 1 1 1 -1 1 1 -1 -1 1 1 -1 -1 1 -1 1 1 -1 1 1 -1 1 -1 -1 -1 -1 1 1 1 1 -1 -1 -1 1 1 -1 1 1 1 1 -1 1 1 -1 -1 -1 -1 1 -1 -1 -1 -1 1 1 -1 -1 -1 1 -1 -1 -1 1 1 1 1 1 1 1 -1 -1 -1 -1 1 1 1 -1 1 -1 1 -1 1 1 -1 -1 1 1 -1 1 -1 -1 -1 -1 1 -1 1 -1 1 1 1 1 -1 1 1 1 1 1 -1 8,284 7,061 7,640 9,135 9,173 7,055 7,240 7,685 8,157 5,933 8,119 8,135 5,943 7,093 8,120 7,254 7,425 6,408 6,203 7,119 8,093 6,391 7,661 7,093 6,238 7,410 6,135 6,921 1,9.108 1,2.107 4,4.107 1,4.109 1,5.109 1,1.107 1,7.107 4,8.107 1,4.108 8,6.105 1,3.108 1,4.108 8,8.105 1,2.107 1,3.108 1,8.107 2,7.107 2,6.106 1,6.106 1,3.107 1,2.108 2,5.106 4,6.107 1,2.107 1,7.106 2,6.107 1,4.106 8,3.106 1 -1 1 1 1 -1 1 -1 1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 1 1 1 -1 -1 1 -1 1 -1 -1 1 1 -1
Theo kết quả thí nghiệm (bảng 3.7), các yếu tố pepton, mật rỉ đường, NaCl,
CaCl2, MgSO4.7H2O có mức độ ảnh hưởng cao vì vậy các yếu tố này ảnh hưởng
chính tới khả năng tăng sinh khối của L. plantarum NT 1.5. Trong đó, yếu tố mật rỉ
đường có mức ảnh hưởng cao nhất (mức ảnh hưởng là 1,1905) tiếp đến là pepton
(mức ảnh hưởng là 0,9305) đồng thời có p<0,05. Yếu tố MgSO4.7H2O có p<0,05 và
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
có mức ảnh hưởng (effect) âm có nghĩa là các yếu tố này làm tăng khả năng tạo sinh
khối khi ở nồng độ thấp và giảm khả năng tạo sinh khối khi ở nồng độ cao. Yếu tố
CaCO3 có p=0,214 (>0,05) vì vậy yếu tố này có mức ảnh hưởng rất yếu có thể loại
bỏ.
Đồng thời, với kết quả đánh giá mức độ ảnh hưởng của từng biến thí nghiệm ở
đồ thị các ảnh hưởng chính (đồ thị 3.7), đồ thị ứng với yếu tố mật rỉ đường và
pepton có độ dốc rất lớn chứng tỏ các biến này có ảnh hưởng mạnh nhất đến khả
năng tạo sinh khối của chủng L. plantarum NT1.5.
Đồ thị 3.7. Đồ thị các ảnh hưởng chính (Main Effects Plot)
Dựa theo đồ thị các ảnh hưởng được chuẩn hóa (Normal Plot of the
Standardized Effects) và đồ thị Pareto của các ảnh hưởng (Pareto Chart of the
Standardized Effects) (phụ lục 2) cũng cho thấy các yếu tố Pepton, Mật rỉ đường,
NaCl, CaCl2, MgSO4.7H2O nằm xa đường chuẩn nên các yếu tố này có ảnh hưởng
lớn đến khả năng tạo sinh khối của chủng L. plantarum NT 1.5.
Tương tự ở biểu đồ Pareto của các ảnh hưởng, các yếu tố này nằm bên phải
đường giới hạn nên nó có ảnh hưởng đáng kể đến khả năng tạo sinh khối của chủng
vi khuẩn thử nghiệm. Điều này phù hợp với kết luận rút ra từ việc phân tích đồ thị
các ảnh hưởng chính và đồ thị ảnh hưởng chuẩn hóa.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
Bảng 3.8 cho thấy khả năng tạo sinh khối của chủng L. plantarum NT 1.5 dao
động từ 5,734 – 9,173 N/ mL khi các yếu tố thay đổi.
Dựa vào bảng 2.4 (phụ lục 2) suy ra phương trình hồi quy mô tả ảnh hưởng
của các yếu tố có dạng:
Y = 7,2248 + 0,4652X1 + 0,5954X2 + 0,1784X3 + 0,2407X4 + 0,0453X5 -
0,3610X6
Trong đó, Y là hàm mục tiêu (CFU/mL), X1, X2, X3, X4, X5, X6 lần lượt là các
yếu tố pepton, mật rỉ đường, NaCl, CaCl2, CaCO3, MgSO4.7H2O. Theo mô hình hồi
quy, các biến pepton, mật rỉ đường, NaCl, CaCl2, MgSO4.7H2O có giá trị P<0,05
nên các biến này có ý nghĩa trong phương trình hồi quy. Biến CaCO3 có giá trị
P>0,05 do vậy có thể loại bỏ trong phương trình hồi quy. Suy ra phương rình hồi
quy có dạng:
Y = 7,2248 + 0,4652X1 + 0,5954X2 + 0,1784X3 + 0,2407X4 - 0,3610X6
Phân tích phương sai cho thấy, giá trị xác suất p ứng với ảnh hưởng chính
(Main Effects) <0,01 được thể hiện ở cột p có giá trị là 0,00 do đó ảnh hưởng của
các yếu tố có ý nghĩa thống kê. Nói cách khác các ảnh hưởng của các biến là đáng
kể.
3.6 KẾT QUẢ THIẾT KẾ THÍ NGHIỆM KHỞI ĐẦU
Từ kết quả thí nghiệm P-B, thí nghiệm khởi đầu được thiết kế với các yếu tố
ảnh hưởng chính: pepton, mật rỉ đường, CaCl2, NaCl, MgSO4.7H2O để đánh giá
mức độ phù hợp của mô hình hồi quy bậc nhất nhằm xác định giá trị khảo sát ở gần
vùng cực trị hay chưa. Mỗi yếu tố ảnh hưởng được khảo xác ở 3 mức độ: mức độ
thấp (-1), mức độ cao (+1), và mức độ trung tâm (0).
Thí nghiệm được thiết kế dạng đầy đủ với 37 thí nghiệm trong đó có 5 thí
nghiệm trung tâm được bố trí theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm bằng
chương trình thống kê Minitab 16.2.0 của Minitab Inc., USA.
Kết quả thiết kế thí nghiệm và thực nghiệm được trình bày trong bảng 3.9.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
Bảng 3.9 Thiết kế thí nghiệm khởi đầu và kết quả thí nghiệm
Mật độ CaCl2 NaCl MgSO4.7H2O Log
TT Pepton Mật rỉ đường -1 1 -1 -1 0 0 0 1 -1 1 1 1 -1 1 -1 1 -1 -1 -1 1 0 -1 1 -1 1 -1 -1 1 1 -1 1 -1 1 1 1 1 1 -1 0 0 0 -1 1 -1 1 1 1 1 -1 -1 1 -1 -1 1 0 -1 1 -1 -1 -1 -1 -1 1 1 1 1 -1 -1 -1 -1 1 1 0 0 0 -1 -1 1 -1 -1 1 1 1 -1 1 -1 -1 -1 0 -1 1 -1 1 1 1 1 1 -1 1 -1 -1 -1 1 1 -1 -1 0 0 0 -1 1 1 -1 -1 1 -1 1 1 1 -1 1 1 0 1 1 -1 1 -1 1 -1 1 -1 -1 -1 1 -1 -1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 -1 1 -1 1 -1 -1 1 1 1 -1 0 -1 1 -1 -1 -1 1 1 -1 -1 -1 1 1 -1 8,270 9,110 8,366 7,199 9,778 9,658 9,613 8,254 7,655 8,711 9,847 9,173 8,964 9,678 7,997 8,998 8,156 6,654 6,526 9,997 9,750 7,446 9,670 7,486 9,509 7,991 7,199 8,702 10,382 8,453 10,456 7,655 8,270 8,998 1,9.108 1,3.109 2,3.108 1,3.107 6,0.109 5,5.109 5,6.109 1,8.108 4,5.107 5,1.108 7,0.109 1,5.109 9,2.108 4,8.109 1,0.108 1,1.109 1,4.108 4,5.106 3,3.106 9,9.109 5,6.109 2,8.107 4,7.109 3,1.107 3,2.109 9,8.107 1,6.107 5,0.108 2,4.1010 2,8.108 2,9.1010 4,5.107 1,9.108 1,0.109 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
0 1 -1 0 1 1 0 -1 -1 0 -1 -1 9,578 9,446 8,964 3,8.109 2,8.109 9,2.108 0 -1 1 35 36 37
Từ bảng kết quả thu được (bảng 3.9) cho thấy giá trị Log (N/ mL) tăng lên so
với thí nghiệm P-B, thay đổi từ 7,199 đến 10,456 (N/ mL).
Theo kết quả mô hình phân tích hồi (phụ lục 2) quy ta thấy các yếu tố pepton,
mật rỉ đường, CaCl2, MgSO4.7H2O có giá trị p<0,05 chứng tỏ sự có mặt của các yếu
tố này là có ý nghĩa trong phương trình hồi quy. Yếu tố NaCl có giá trị p=0,202
(>0,05) chứng tỏ sự có mặt của NaCl là không có ý nghĩa.
Suy ra phương trình hối quy có dạng: y = 8,5692 + 0,4825x1 + 0,7578x2 +
0,2677x3 – 0,3811x5.
Trong đó y là hàm mục tiêu Log (N/ mL), x1,x2,x3,x5 lần lượt là các yếu tố
pepton, mật rỉ đường, CaCl2, MgSO4.7H2O.
Giá trị “Lack-of-fit” có p=0,822 (>0,05) Điều này có nghĩa là mô hình hồi quy
là phù hợp, giá trị vùng khảo sát còn ở xa vùng cực trị. Do đó tiếp tục chuyển sang
bước leo dốc tìm vùng chứa cực trị.
3.7 KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM LEO DỐC
Dựa vào kết quả thực nghiệm và mô hình hồi quy nhận được từ thí nghiệm
khởi đầu, những yếu tố có hệ số hồi quy âm, chứng tỏ khi nồng độ của các yếu tố
này ở mức cao trong vùng khảo sát thì sinh khối sẽ giảm. Vì vậy, cần giảm giá trị
khảo sát của các biến này cho mỗi bước leo dốc. Từ đó, bước chuyển động của các
yếu tố ảnh hưởng chính sẽ được tính toán và trình bày trong bảng 3.10.
Bảng 3.10 Bảng tính toán bước chuyển động của các yếu tố ảnh hưởng
chính
Pepton Mật rỉ CaCl2 MgSO4.7H2O Các chỉ tiêu (A) đường(B) (C) (G)
5 20 1,5 0,25 Gốc
7,5 7,5 1 0,05 Khoảng biến thiên
0,4825 0,7578 0,2677 -0.3811 Hệ số
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
3,61875 5,6835 0,2677 -0,019055
0,6367 0,0455 -0,00335 1 Bước chuyển động
Làm tròn bước chuyển 1 0,6 0,05 -0,003 động
Chọn bước chuyển động δB = 1và tính toán các bước chuyển động còn lại:
Bảng 3.11 Kết quả thí nghiệm leo dốc
STT Kí hiệu Yếu tố Log Mật độ
(N/ mL) (CFU/ Pepton Mật rỉ CaCl2 MgSO4.
mL) đường 7H2O
20 1,5 0,25 7,553 ± 0,380 5 1 Gốc
21 1,55 0,247 7,861 ± 0,024 5,6 2 Gốc + 1δ
22 1,6 0,244 7,941 ± 0,024 6,2 3 Gốc + 2δ
23 1,65 0,241 7,957 ± 0,024 6,8 4 Gốc + 3δ
24 1,7 0,238 8,021 ± 0,104 7,4 5 Gốc + 4δ
25 1,75 0,235 8,075 ± 0,078 8 6 Gốc + 5δ
26 1,8 0,232 8,109 ± 0,016 8,6 7 Gốc + 6δ
27 1,85 0,229 8,165 ± 0,104 9,2 8 Gốc + 7δ
28 1,9 0,226 8,189 ± 0,000 9,8 9 Gốc + 8δ
29 10,4 1,95 0,223 8.213 ± 0,184 10 Gốc + 9δ
30 2 0,22 8.262 ± 0,056 11 11 Gốc+10δ
31 2,05 0,217 8,390 ± 0,008 11,6 12 Gốc+11δ
32 2,1 0,214 8,406 ± 0,345 12,2 13 Gốc+12δ
33 2,15 0,211 8,414 ± 0,240 12,8 3,6.107 7,3.107 8,7.107 9,1.107 1,0.108 1,2.108 1,3.108 1,5.108 1,5.108 1,6.108 1,8.108 2,5.108 2,5.108 2,6.108 14 Gốc+13δ
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
13,4 2,2 0,208 8,917 ± 0,000 34 15 Gốc+14δ
14 2,25 0,205 9,037 ± 0,404 35 16 Gốc+15δ
14,6 36 2,3 0,202 10,574 ±0,449 17 Gốc+16δ
15,2 37 2,35 0,199 11,672 ± 0,120 8,3.108 1,1.109 3,7.1010 4,7.1011 18 Gốc+17δ
15,8 38 2,4 0,196 11,691 ± 0,139 19 Gốc+18δ
16,4 39 2,45 0,193 11,488 ± 0,192 20 Gốc+19δ
40 4,9.1011 3,1.1011 1,8.1010 17 2,5 0,19 10,263 ± 0,112 21 Gốc+20δ
17,6 41 2,55 0,187 9,489 ± 0,412 22 Gốc+21δ
18,2 42 2,6 0,184 8,949 ± 0,112 3,1.109 8,9.108 23 Gốc+22δ
Dựa vào giá trị Log (N/ ml) ở bảng 3.11 ta thấy giá trị log tăng dần từ thí
nghiệm 1 (Log = 7,553 ± 0,380) đến thí nghiệm 19 (Log = 11,691 ± 0,139) và bắt
đầu giảm ở thí nghiệm 20 (Log = 11,488 ± 0,192). Vì vậy khoảng giá trị tối ưu của
các yếu tố cho thí nghiệm tiếp theo là:
Pepton: 14,6 – 17 (g/ L).
Mật rỉ đường: 36- 40 (g/ L).
CaCl2: 2,3 – 2,5 (g/ L).
MgSO4.7H2O: 0,19 – 0, 202 (g/ L).
3.8 KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM BOX-BEHNKEN
Từ kết quả thí nghiệm khởi đầu và thí nghiệm leo dốc 4 yếu tố ảnh hưởng
chính đến khả năng sinh trưởng của chung L. plantarum NT1.5 là: pepton, mật rỉ
đường, CaCl2, MgSO4.7H2O sẽ được tiếp tục khảo sát để xác định giá trị tối ưu
bằng thí nghiệm Box-Behken.
Mỗi yếu tố được khảo sát ở 3 mức độ: cao (+1), thấp (-1) và mức độ trung tâm
(0).
Ma trận được thiết kế với 30 thí nghiệm trong đó có 6 thí nghiệm tại tâm. Mỗi
thí nghiệm được thiết kế theo nguyên tắc giữ 2 yếu tố tại tâm, thay đổi đồng thời 2
yếu tố còn lại. Các yếu tố được giữ tại tâm được thay đổi lần lượt để tạo ra 1 ma
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
trận không trùng nhau (ngoại trừ 6 thí nghiệm trung tâm). Giá trị các biến được xác
định dựa trên kết quả thí nghiệm leo dốc.
Giá trị các mức độ của các yếu tố và kết quả bố trí thí nghiệm được trình bày
trong bảng 3.12 và 3.13.
Bảng 3.12 Bảng giá trị các biến số thí nghiệm Box-Behnken
Giá trị từng mức độ (g/ L) Yếu tố -1 0 +1
14,6 A 15,8 17 Pepton
36 B 38 40 Mật rỉ đường
2,3 C 2,4 2,5 CaCl2
0,202 0,196 0,19 G MgSO4.7H2O
Bảng 3.13 Bảng biến số các giá trị thí nghiệm Box-Behnken
CaCl2 MgSO4.7H2O
STT Pepton Mật rỉ đường 0 1 0 Log (N/mL) 9,895 1 1
0 1 -1 9,941 0 2
1 -1 0 8,732 0 3
0 -1 0 7,958 1 4
0 0 -1 9,735 -1 5
1 1 0 10,801 0 6
-1 0 0 7,937 1 7
0 0 0 12,113 0 8
0 1 0 10,079 1 9
0 1 0 -1 10,771 10
0 -1 1 8,561 0 11
0 0 1 9,733 1 12
1 0 0 -1 10,594 13
0 1 1 10,636 0 14
0 0 0 12,073 0 Mật độ (CFU/ mL) 7,8.109 8,7.109 5,4.108 9,0.107 5,4.109 6,3.1010 8,6.107 1,2.1012 1,2.1010 5,9.1010 3,6.108 5,4.109 3,9.1010 4,3.1010 1,2.1012 15
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
0 0 1 -1 10,424 16
-1 0 -1 0 7,799 17
0 0 0 0 12,039 18
0 -1 -1 0 7,785 19
-1 0 0 -1 8,623 20
0 -1 0 -1 8,698 21
0 0 0 0 12,117 22
0 0 -1 1 9,045 23
0 0 0 0 12,039 24
-1 0 1 0 8,486 25
-1 -1 0 0 6,758 26
0 0 0 0 11,764 27
-1 1 0 0 8,834 28
1 0 1 0 10,459 29
1 0 -1 0 9,773 2,7.1010 6,3.107 1,1.1012 6,1.107 4,2.108 5,0.108 1,3.1012 1,1.109 1,1.1012 3,1.108 3,8.106 5,8.1011 6,8.108 2,9.1010 5,9.109 30
Phân tích kết quả hồi quy phương sai của mô hình ta thấy tất cả các yếu tố đều
có giá trị p<0,05. Trong đó yếu tố MgSO4.7H2O có hệ số hồi quy âm chứng tỏ sự có
mặt của yếu tố với khối lượng cao sẽ làm giảm khả năng tăng trưởng của vi khuẩn
và ngược lại với khối lượng thấp sẽ làm tăng khả năng tăng trưởng của vi khuẩn.
Phương trình hồi quy của mô hình: Y = 12,0242 + 0,9847A + 1,0475B + 0,3518D – 0,3498D – 1,6781A2 –
1,5702B2 – 1,2173C2 – 1,0780D2.
Trong đó A, B, C, D lần lượt là các yếu tố: pepton, mật rỉ đường, CaCl2,
MgSO4.7H2O.
Theo giá trị Lack-of-fit có p lớn hơn rất nhiều so với mức ý nghĩa α điều này
có nghĩa dạng mô hình rất khớp với dữ liêu.
Để biểu diễn trực quan về mối quan hệ giữa hàm mục tiêu với từng cặp biến
thí nghiệm có thể sử dụng đồ thị bề mặt chỉ tiêu (đồ thị bề mặt hoặc đồ thị đường
mức) được thể hiện ở đồ thị 3.1 và 3.2.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
Đồ thị 3.1 Đồ thị đường mức biểu diễn mối quan hệ giữa mật độ tế bào
với các cặp biến khác nhau
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
Đồ thị 3.2 Đồ thị bề mặt biểu diễn mối quan hệ giữa mật độ tế bào với các
cặp biến khác nhau
Kết quả giá trị tối ưu hóa của môi trường được trình bày trong bảng 3.7.3
Bảng 3.14 Kết quả giá trị tối ưu của các yếu tố
Theo bảng 3.14 giá trị tối ưu của các yếu tố ảnh hưởng lần lượt là:
Pepton: 16,1515 g/ L.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
Mật rỉ đường: 38,6667 g/ L.
CaCl2: 2,41515 g/ L.
MgSO4.7H2O: 0,195091 g/ L.
Như vậy, chúng tôi xác định được môi trường tối ưu để tăng sinh khối chủng
L.plantarum NT1.5 bao gồm các thành phần và có giá trị như sau:
Pepton: 16,15 g/ L
Mật rỉ đường 38,7 g/ L
CaCl2: 2,42 g/ L
MgSO4.7H2O: 0,2 g/ L
NaCl: 0,05 g/ L Nhiệt độ nuôi cấy: 37oC, pH=7.
3.9. KẾT QUẢ KHẢO SÁT SỰ TĂNG TRƯỞNG CỦA L. PLANTARUM
NT1.5 TRÊN MÔI TRƯỜNG TỐI ƯU
Sự tăng trưởng của chủng vi khuẩn L. plantarum NT1.5 trên môi trường tối ưu
được theo dõi dựa vào OD610 và giá trị Log (N/ mL). Kết quả được trình bày trong
bảng 3.15 và đồ thị 3.16.
Bảng 3.15 Giá trị OD theo thời gian
Thời gian (giờ) Giá trị OD Log (N/ mL) Mật độ (CFU/ mL)
0.023 6,793 ± 0,007 0
0.074 6,875 ± 0,021 3
0.165 7,021 ± 0,011 6
0.321 7,271 ± 0,038 9
0.477 7,521 ± 0,042 12
0.804 8,045 ± 0,089 15
1.252 8,764 ± 0,062 18
1.364 8,943 ± 0,018 21
1.674 9,439 ± 0,087 24
1.697 9,477 ± 0,031 27
1.828 9,686 ± 0,031 6,2.106 7,5.106 1,1.107 1,9.107 3,3.107 1,0.108 6,0.108 8,5.108 2,7.109 2,9.109 4,9.109 30
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
2.028 10,007 ± 0,077 33
1.9 9,802 ± 0,021 36
1.834 9,697 ± 0,094 39
1.24 8,744 ± 0.363 42
1.212 8,699 ± 0,455 45
12.000
10.000
0.912 8,219 ± 0,035 1,0.1010 6,3.109 5,0.109 5,5.108 5,0.108 1,7.108 48
8.000
6.000
4.000
2.000
0.000
Đồ thị 3.9 Đường cong tăng trưởng của L. plantarum NT 1.5 theo thời
gian trên môi trường tối ưu
Từ kết quả khảo sát khả năng tăng trưởng của chủng L. plantarum NT1.5,
nhận thấy trên môi trường tối ưu vi khuẩn cho sinh khối cao nhất tại 33 giờ, sinh khối đạt được Log = 10,007 ± 0,077 (N/ mL) khoảng 1.1010 tế bào / mL. Trên môi
trường MRS chủng đạt được sinh khối cao nhất tại 18 giờ, nồng độ sinh khối đạt được khoảng 1,3.1010 tế bào / mL (tương ứng với log (N/ mL)=10,141) (theo bảng
3.2, mục 3.2).
Trên môi trường tối ưu chủng L. plantarum NT1.5 đạt được mật độ sinh khối cao
nhất chậm hơn 15 giờ so với môi trường MRS với mật độ tế bào tương đương.
Điều này cho thấy các yếu tố trong thành phần môi trường tối ưu đã xác định được
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
có ảnh hưởng tích cực đến khả năng tăng trưởng của chủng Lactobacillus
plantarum NT 1.5.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
4.1 KẾT LUẬN
Sau thời gian thực hiện đề tài, với những kết quả thu được chúng tôi có kết
luận như sau:
Sự tương quan tuyến tính giữa giá trị OD610 và mật độ tế bào trên môi trường
MRS theo phương trình y = 1,603x + 6,7566 với mức độ tin cậy 96,17%.
Dựa vào đường cong tăng trưởng, xác định được thời gian thu sinh khối của L.
plantarum NT 1.5 trên môi trường MRS nhiều nhất là 24 giờ.
pH=7, 37oC là pH môi trường và nhiệt độ nuôi cấy thích hợp cho sự tăng
trưởng của L. plantarum NT1.5.
Từ các nguồn nitơ, cacbon, khoáng chọn được các yếu tố: pepton, mật rỉ
đường, CaCO3, MgSO4, CaCl2, NaCl ảnh hưởng đến khả năng tăng trưởng của vi
khuẩn Thí nghiệm sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng chính P-B, xác định được các yếu
tố chính ảnh hưởng đến khả năng tạo sinh khối của chủng là: Pepton, Mật rỉ đường,
MgSO4, CaCl2.
Xác định được khoảng tối ưu của các yếu tố ảnh hưởng chính bằng thí nghiệm
leo dốc tìm vùng cực trị là: Pepton: 14,6 – 17 (g/ L), Mật rỉ đường: 36- 40 (g/ L),
CaCl2: 2,3 – 2,5 (g/ L), MgSO4.7H2O: 0,19 – 0, 202 (g/ L).
Xác định được giá tri tối ưu của các yếu tố ảnh hưởng chính bằng phương
pháp Box-Behnken:
Pepton: 16,1515 g/ L
Mật rỉ đường: 38,6667 g/ L
CaCl2: 2,41515 g/ L
MgSO4.7H2O: 0,195091 g/ L
Xác định được thời gian tạo sinh khối nhiều nhất của chủng trên môi trường
tối ưu là 33 giờ.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
4.2 KIẾN NGHỊ
Với mục đích tối ưu hóa môi trường lên men L. plantarum NT 1.5 để thu
được sinh khối vi khuẩn nhiều nhất và có hiệu quả kinh tế cao. Chúng tôi đề nghị
thực hiện các bước nghiên cứu tiếp theo sau:
- Khảo sát các nguồn dinh dưỡng rẻ tiền thay thế các nguồn dinh dưỡng hiện
tại.
- Thử nghiệm môi trường tối ưu trên quy mô lớn.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
[1]. Nguyễn Tú Anh, Lê Thị Mỹ Linh, Nguyễn Văn Thanh (2003), “Khảo sát điều kiện
nuôi cấy thích hợp cho vi khuẩn Lactobacillus casei”, Tạp chí Y học TP. HCM,
Chuyên đề Dược, 7(4), Tr. 195-197.
[2]. Nguyễn Đăng Diệp, Bùi Hà Thanh, (1994-1996), "Nghiên cứu các thông số thích
hợp trong qui trình công nghệ lên men sản xuất chế phẩm vi khuẩn lactic", Tuyển
tập công tác nghiên cứu Viện Sinh Học Nhiệt Đới, NXB Nông Nghiệp.
[3]. Nguyễn Lân Dũng (1983), Thực tập Vi sinh vật học, NXB Đại học & Trung học
chuyên nghiệp, Hà Nội.
[4]. Nguyễn Văn Dự, Nguyễn Đăng Bình (2011), ” Quy hoạch thực nghiệm trong kỹ
thuật”, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật Hà Nội, Tr.9-26, 138-216.
[5]. Nguyễn Thành Đạt (2011), Cơ sở sinh học vi sinh vật tập 1, NXB Đại học Sư
Phạm
[6]. Nguyễn Thị Hồng Hà, Lê Thiên Minh, Nguyễn Thùy Châu (2003), “Nghiên cứu
công nghệ sản xuất chế phẩm vi khuẩn lactic probiotic”, Tuyển tập báo cáo tại
Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc năm 2003, Tr. 251-255.
[7]. Giang Thị Kim Liên (2009), Bài giảng Qui hoạch thực nghiệm (các phương
pháp thống kê và xử lý số liệu thực nghiệm), Trường Đại Học Đà Nẵng.
[8]. Mai Đàm Linh, Đỗ Minh Phương, Phạm Thị Tuyết, Kiều Hữu Ảnh, Nguyễn Thị
Giang (2008), “Đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn lactic phân lập trên
địa bàn thành phố Hà Nội”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên
và Công nghệ, 24, Tr.221-226.
[9]. Dương Nhật Linh, Nguyễn Văn Minh, Lê Thị Anh Thiện, Phạm Trần Phương
Dung, Phạm Thị Minh Trang, Trần Cát Đông (2013), “Sàng lọc vi khuẩn
lactic có hoạt tính giảm cholesterol”, Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc
khu vực phía Nam lần III “Công nghệ sinh học vì cuộc sống”, Tr. 151.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[10]. Nguyễn Đức Lượng và Cao Cường (2003), Thí nghiệm công nghệ sinh học tập
1- thí nghiệm hóa sinh học, Nhà xuất bản Đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh.
[11]. Nguyễn Văn Thành và Nguyễn Ngọc Trai (2012), phân lập và tuyển chọn vi
khuẩn Lactobacillus sp. có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ và
đốm đỏ trên cá tra”, Tạp chí Khoa học, Pp. 224-234
[12]. Trần Linh Thước, Nguyễn Đức Hoàng, Phan Thị Phương Trang, Phạm Thị
Hồng Tươi (2001), Thực tập vi sinh vật, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia
TP.HCM, Tr.15, 37, 39, 43.
[13]. Trần Linh Thước, Đặng Thị Phương Thảo, Đỗ Anh Tuấn, Cao Thị Ngọc Phượng,
Võ Cẩm Quy (2011), Thực tập vi sinh vật, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hồ
Chí Minh.
Tiếng Anh
[14]. Barthelmebs L., Divies C., and Cavin J. F. (2000), “Knockout of the p-coumarate
decarboxylase gene from Lactobacillus plantarum reveals the existence of two
othe inducible enzymatic activities involved in phenolic acid metabolism”, Appl.
Environ. Microbiol, 66: Pp. 3368-3375.
[15]. Barthelmebs, L., Divies, C. and Cavin, J-F. (2001), “Molecular characterization
of the phenolic acid metabolism in the lactic acid bacteria Lactobacillus
plantarum”, Lait, 81:Pp. 161-171.
[16]. Bevilacqua A., Corbo M. R., Mastromatteo M. and Sinigaglia M. (2008),
“Combined effects of pH, yeast extract, carbohydrates and di-ammonium
hydrogen citrate on the biomass production and acidifying ability of a probiotic
Lactobacillus plantarum strain, isolated from table olives, in a batch system”,
World J Microbiol Biotechnol, 24:Pp. 1721–1729.
[17]. Daeschel M. A. and Nes I. F. (1995), Lactobacillus plantarum: physiology,
genetics and applications in foods, in Food Biotechnology Microorganisms, New
York, chap. 21, Pp. 721-743.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[18]. David M. I., Weinert E., Kim C.S., Joseph M. M. and Sherri A. M. (2013),
“Natural Farming: Lactic Acid Bacteria”, College of Tropical Agriculture and
Human Resources”,
[19]. David D., Tryon V. V. and Dennis J. P. (1989), “Metabolism of Mollicutes: the
Embden-Meyerhof-Parnas Pathway and the Hexose Monophosphate Shunt”,
Journal of General Microbiology, Vol. 135, Pp.683-691.
[20]. FAO/WHO(2001), “Report of a joint FAO/WHO expert consultation on
evaluation of health and nutritional properties of probiotics in food including
powder milk with live lactic acid bacteria”, Co´rdoba, Argentina.
[21]. Farooq U., Anjum F. M., Zahoor T., Rahman S. U., Randhawa A., Ahmed A. and
Akram K. (2012), “Optimization of lactic acid production from cheap raw
material: sugarcane molasses”, Pak. J. Bot., 44(1):Pp.333-338.
[22]. Han B., Yu Z., Liu B., Ma Q. and Zhang R. (2011), “Optimization of bacteriocin
production by Lactobacillus plantarum YJG, isolated from the mucosa of the gut
of healthy chickens”, African Journal of Microbiology Research, Pp. 1147-1155.
[23]. Karlsson C., Ahrne S. and Molin G. ( 2009), “Probiotic therapy to men with
incipient arteriosclerosis initiates increased bacterial diversity in colon: a
randomized controlled trial”, Atherosclerosis
[24]. Kleerebezem M., Boekhorst J., Kranenburg R. V., Molenaar D., Kuipers O. P.,
Leer R., Tarchini R., Peters S. A., Sandbrink H. M., Fiers M. W. E. J., Stiekema
W., Lankhorst R. M. K., Bron P. A., Hoffer S. M., Groot M. N. N., Kerkhoven
R., Vries M., Ursing B., Vos W. M. and Siezen R. J. (2003), “Complete genome
sequence of Lactobacillus plantarum WCFS1”, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A,
100:Pp. 1990-1995.
[25]. Lim H. J., Kim S. Y. and Lee W. K. (2004), “Isolation of cholesterol-lowering
lactic acid bacteria from human intestine for probiotic use”, Veterinary Science.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[26]. Lonnermark E., Friman V. and Lappas G. (2009), “Intake of Lactobacillus
plantarum reduces certain gastrointestinal symptoms during treatment with
antibiotics”, J Clin Gastroenterol.
[27]. Marcel D. (2005), “Lactic Acid Bacteria: Microbiological and Functional
Aspects, Third Edition (Food Science and Technology)”, Library of congress
Cataloging-in- publication Data, ISBN 0-203- 02673 X Master e-book ISBN.
[28]. Nagarjun P. A., Rao R. S., Rajesham S. and Rao L. V. (2005), “Optimization of
Lactic Acid Production in SSF by Lactobacillus amylovorus NRRL B-4542
Using Taguchi Methodology”, The Journal of icrobiology, Pp. 38-43.
[29]. Muhamad Nor N., Mohamad R., Ling Foo H. and Rahim R. A. (2010),
Improvement of Folate Biosynthesis by Lactic Acid Bacteria Using Response
Surface Methodology”, Food Technol. Biotechnol, 48(2):Pp. 243–250.
[30]. Nissen L., Chingwaru W. and Sgorbati B. (2009 ), “Gut health promoting activity
of new putative probiotic/protective Lactobacillus spp. Strains: a functional study
in the small intestinal cell model”, Int J Food Microbiol, Pp. 288-94.
[31]. Ooi L. G. and Liong M. T. (2010), “Cholesterol-Lowering Effects of Probiotics
and Prebiotics: A Review of in Vivo and in Vitro Findings”, International
Journal of Molecular Sciences.
[32]. Plackett R. L. and Burman J. P. (1946), “The Design of Optimum Multifactorial
Experiments”, Biometrika, Pp. 305-325.
[33]. Qin H., Zhang Z. and Hang X. (2009), “L.plantarum prevents enteroinvasive
Escherichia coli-induced tight junction protein changes in intestinal epithelial
cells”, BMC MicrobioJ, Pp. 31;9;63.
[34]. Reichelt J. L. (2013), “The impact of Technical Exellence in Microbiology on the
results obtained with Silage Inoculants and Bacterial Biopesticcides”, Bacterial
Fermentation Pty Ltd.
[35]. Shahravy A., Tababdeh F., Bambai B., Zamanizadeh H. R. and Mizani M. (2012),
“Optimization of probiotiic Lactobicillus casei ATCC 334 production using date
TÀI LIỆU THAM KHẢO
powder as cacbon source”, Chemical Industry & Chemical Engineering Quarterl,
Pp. 273−282.
[36]. Tanaka H., Doesburg K., Iwasaki T. and Mierau I. (2006), “Bile salt hydrolase
and cholesterol removal effect by Bifidobacterium bifidum NRRL 1976”, World
Journal of Microbiology & Biotechnology.
[37]. Vamanu E. và cs. (2009), “Studies regarding the production of probiotic biomass
from Lactobacillus plantarum strains”, Archiva Zootechnica, Pp. 92-101.
[38]. Vaquero, I., Marcobal, A. and Muñoz, R. (2004), “Tannase activity by lactic acid
bacteria isolated from grape must and wine”, International Journal of Food
Microbiology , 96: Pp. 199-204.
[39]. Waugh A. W. G., Foshaug R., Macfarlane S., Doyle J., Churchili T. A., Sydora B.
C. and Fedorakr R. N. (2009), “Effect of Lactobacillus plantarum 299v treatment
in an animal model of irritable bowel syndrome”, Microbial Ecology in Health
and Disease, Pp. 33-37.
[40]. Ziarno M., Sekul E. and Lafraya A. A. (2007), “Cholesterol assimilation by
commercial yoghurt starter cultures”, Acta Sci. Pol., Technol. Aliment, Pp. 83-94.
Tài liệu web
[41]. Learn about the Importance of Good Bacteria, Part II: Lactobacillus Plantarum
(2010)
http://www.naturalnews.com/027845_probiotics_health.html##ixzz32e0f5rNg
[42].WHO(2013),
http://www.who.int/gho/ncd/risk_factors/cholesterol_text/en/index.html
PHỤ LỤC
PHỤ LỤC 1: MÔI TRƯỜNG
Thành phần môi trường MRS:
− Peptone 10 g
− Cao thịt 10 g
− Cao nấm men 5 g
− Glucose 20 g
− K2HPO4 2 g
− Natri acetate 5 g
− MgSO4.7H2O 0,2 g
− MnSO4.4H2O 0,2 g
− Tween 80 1 mL
− (NH4)citrate 2 g
− Nước 1000 mL
Thành phần môi trường MRSA: giống thành phần môi trường MRS
nhưng bổ sung thêm 20g agar.
PHỤ LỤC
PHỤ LỤC 2: BẢNG KẾT QUẢ
Bảng 2.1. Kết quả xử lí thống kê ANOVA một yếu tố khảo sát ảnh hưởng của
pH, nhiệt độ đến khả năng tăng trưởng của L. plantarum NT1.5
PHỤ LỤC
Bảng 2.1. Kết quả xử lí thống kê ANOVA một yếu tố của các nguồn Nitơ
khảo sát
PHỤ LỤC
Bảng 2.2.Kkết quả xử lí thống kê ANOVA một yếu tố của các nguồn Cacbon
khảo sát
PHỤ LỤC
Bảng 2.3. Kết quả xử lí thống kê ANOVA một yếu tố của các nguồn muối
khoáng khảo sát
PHỤ LỤC
Đồ thị 2.1: Đồ thị ảnh hưởng chuẩn hóa
PHỤ LỤC
Đồ thị 2.2. Pareto của các yếu tố ảnh hưởng
PHỤ LỤC
Bảng 2.4 Kết quả phân tích hồi quy phương sai cho thí nghiệm P-B
PHỤ LỤC
Bảng 2.5 Kết quả phân tích hồi quy phương sai của thí nghiệm khởi đầu.
PHỤ LỤC
Bảng 2.6 Kết quả phân tích hồi quy phương sai của thí nghiệm Box-Behnken
