Nghiên cứu enzyme: Đề tài [mô tả/định tính - ví dụ: mới nhất, chuyên sâu]

Ờ Ở Ầ L I M Đ U

ơ ể ố ề ầ ư ọ ả ứ ầ ả ọ H u nh m i ph n ng hóa h c trong c th s ng đ u c n ph i có vai trò xúc tác

ữ ứ ề ấ ậ ọ ủ c a enzyme – ch t xúc tác sinh h c. Chính vì v y, nh ng nghiên c u v enzyme đã thu hút

ọ ở ủ ề ự ằ ự s quan tâm c a nhi u nhà khoa h c các lĩnh v c liên quan khác nh m tìm ra đ ượ c

ữ ụ ủ ứ ề ệ ỗ nh ng công d ng khác nhau c a m i enzyme. Nghiên c u v công ngh enzyme đã đ ượ c

ế ề ả ư ử ụ ổ ể ả ủ ạ ủ ấ ở ti n hành b i nhi u tác gi nh s d ng ph t ng c a lò m đ s n xu t pancrease,

ạ ể ả ử ụ ữ ử ệ ầ ấ pepsin, tripsin, s d ng m m m đ s n xu t amylase. Đã có nh ng th nghi m công

ư ả ệ ấ ừ ị ằ ằ ằ ộ ộ ngh nh s n xu t amino acid t nh ng t m b ng protease, b t protein th t b ng enzyme

ừ ỏ ứ bromelain t v d a….

ộ ố ệ ễ ấ ố ớ ứ ự ọ Nghiên c u enzyme còn có ý nghĩa th c ti n r t quan tr ng, đ i v i m t s b nh,

ệ ặ ố ấ ẳ ệ ề ể ế ộ ặ đ c bi t là b nh mang tính di truy n, có th do thi u hay m t h n m t ho c s enzyme

ệ ườ ể ấ ạ ề trong các mô, các đi u ki n không bình th ư ừ ệ ng cũng có th xu t hi n do ho t tính d th a

ộ ố ộ ố ủ ệ ặ ạ ế ị ủ c a m t s enzyme đ c hi u. Do đó xác đ nh ho t tính c a m t s enzyme trong huy t

ệ ệ ầ ặ ấ ẩ ồ ọ ươ t ng, h ng c u ho c trong các mô là r t quan tr ng trong vi c ch n đoán b nh. Enzyme

ở ụ ự ế ữ ả ọ ọ đã tr thành các công c th c t quan tr ng không nh ng trong y h c mà c trong công

ố ớ ướ ế ế ự ệ ẩ ọ ồ ừ ự ậ ngh hóa h c, trong ch bi n th c ph m… Đ i v i n c ta ngu n enzyme t th c v t có

ệ ấ ứ ủ ể ọ ớ ồ tri n v ng l n vì ngu n nghiên li u r t phong phú (d a, đu đ ,… ). Trong quá trình ch ế

ỉ ử ụ ả ứ ứ ủ ế ầ ầ ộ ạ ụ ẩ ộ bi n d a đóng h p ch s d ng m t ph n c a qu d a, ph n còn l ế i là ph ph m. N u

ượ ấ ữ ơ ể ả ừ ế ể ễ ẩ ồ ụ ậ t n d ng đ c ngu n ph ph m thì v a có th gi m thi u ch t h u c gây ô nhi m môi

ườ ấ ả ể ả ừ ẩ ừ ứ tr ng v a có th s n xu t s n ph m enzyme bromelain có t cây d a. Enzyme bromelain

ủ ả ơ ấ ự ể ạ có ba ho t tính khác nhau: peptidase, amidase, esterase có th phân h y c c ch t t nhiên

ợ ị ế ẫ ơ ấ ổ l n c ch t t ng h p, chúng có giá tr kinh t cao.

Ụ

M C L C

Ụ DANH M C HÌNH

Ả

Ụ DANH M C B NG

ƯƠ

Ổ

CH

NG 1: T NG QUAN

ệ

ặ

ồ Đ c đi m ngu n nguyên li u:

1.1. ứ

ể ệ

ả ố ở ớ ồ ỹ D a là cây ăn qu nhi t đ i, có ngu n g c Nam M (Brazil, Argentina,

ệ ở ữ ể ẫ ấ Paraguay), hi n ề nh ng vùng này v n có th tìm th y nhi u

ứ ạ ố gi ng d a hoang d i.

ế ớ ệ ứ ượ ầ ồ Hi n nay trên th gi i, cây d a đ c tr ng h u h t ế ở

ướ ư ề ơ ồ các n c tr ừ ở Châu Âu. Các n i tr ng nhi u nh là: Hawaii,

Ở ướ ồ ừ ắ Brazil, Philipines, Thailand… n ứ c ta, d a tr ng t ế B c đ n

ả ướ ệ ồ ả Nam, di n tích tr ng c n c kho ng 40.000 ha v i s n l ớ ả ượ ng

ả ở ự ỉ ấ kho ng 500.000 t n, trong đó 90% khu v c phía Nam. Các t nh

ề ở ồ ề ề ề ắ ứ tr ng d a nhi u mi n Nam là Kiên Giang, Ti n Giang, Cà Mau…mi n B c có Thanh

ề ệ ả ọ Hóa, Tuyên Quang, Phú Th …mi n Trung có Ngh An, Qu ng Nam…

ế ớ ứ ả ố ượ Trên th gi i có kho ng 6070 gi ng d a và đ c chia thành 7 nhóm, trong đó có 3

ổ ế ồ nhóm tr ng ph bi n là nhóm Cayenne, nhóm Queen và nhóm Spanish.

ổ ế ế ớ ứ ấ ồ ế Nhóm Cayenne là nhóm d a tr ng ph bi n nh t trên th gi ả i, chi m kho ng

ớ ồ ở ộ ố ư ệ ơ ồ ệ 80% di n tích. Ở ướ n c ta m i tr ng m t s ít n i nh Vĩnh Phúc, Ngh An, Lâm Đ ng.

ả ớ ứ ấ ẳ ả ộ ị ề ắ D a thu c nhóm này có qu l n nh t, m t ph ng và nông. Th t qu kém vàng, nhi u

ướ ơ ứ ọ n ơ c, ít ng t và kém th m h n d a Queen.

ứ ứ ứ ứ ậ ọ ồ Nhóm Queen còn g i là d a Hoàng H u, d a hoa, d a tây. Đây là nhóm d a tr ng

ổ ế ứ ứ ệ ớ ố ố ở ph bi n nh t ấ ở ướ n c ta hi n nay, v i các gi ng d a tây, gi ng d a Na Hoa ắ phía B c,

ố ở ử ằ ồ ọ ỉ các gi ng Queen Long An, Kiên Giang các t nh Đ ng b ng sông C u Long (còn g i là

ả ươ ứ ặ ơ ộ ắ ồ ố ỏ ả ị khóm ho c th m). D a thu c nhóm này có qu t ng đ i nh , m t l i. Th t qu vàng

ươ ấ ượ ơ ọ ị ậ đ m, giòn, h ng th m, v chua và ng t lâu. Nhóm này có ch t l ấ ng cao nh t, trên th ế

ớ ườ ể ươ gi i th ng dùng đ ăn t i.

ứ ứ ọ ượ Nhóm Spanish còn g i là d a Tây Ban Nha, d a ta. Nhóm này đ ồ c tr ng ở

ả ứ ứ ắ ả ộ ớ ơ ị Thailand, Cuba… Qu d a thu c nhóm này l n h n d a Queen, m t sâu. Th t qu vàng

ỗ ắ ư ề ạ ơ ị ướ ứ ơ nh t, có ch tr ng, v chua ít th m nh ng nhi u n ị ứ c h n d a hoa. D a nhóm này ch u

ể ậ ậ ượ ườ ấ ượ ể bóng râm, ít d p nát khi v n chuy n và hàm l ng đ ng th p nên không đ c phát tri n.

1.2. Enzyme: ế

ự ả ấ ổ ơ ể ố Trong c th s ng (các t ổ bào) luôn luôn x y ra quá trình trao đ i ch t. S trao đ i

ừ ấ ạ ự ố ồ ạ ấ ộ ch t mà ng ng l ẽ i thì s s ng s không còn t n t ậ ổ ủ i. Quá trình trao đ i c a m t ch t là t p

ả ứ ề ấ ọ ợ ứ ạ ợ ủ ấ h p c a r t nhi u các ph n ng hóa h c ph c t p. Enzyme là h p ch t protein xúc tác cho

ả ứ ả ứ ệ ả ặ ọ ọ ấ các ph n ng hóa h c đó. Chúng có kh năng xúc tác đ c hi u các ph n ng hóa h c nh t

ề ả ả ả ộ ướ ớ ố ấ ị ả ứ ị đ nh và đ m b o cho các ph n ng x y ra theo m t chi u h ng nh t đ nh v i t c đ ộ

ơ ể ố ị nh p nhàng trong c th s ng.

ENZYME = XÚC TÁC SINH H CỌ

ặ ả ệ ườ ạ ấ ơ ớ Chúng có kh năng xúc tác đ c bi t, th ề ng là m nh h n nhi u so v i các ch t xúc

ố ớ ơ ấ ụ ủ ệ ặ ổ ợ tác t ng h p. Tác d ng xúc tác c a chúng mang tính đ c hi u đ i v i c ch t, làm tăng

ả ứ ể ố ả ộ ọ ườ ướ ề đáng k t c đ các ph n ng hóa h c x y ra trong môi tr ng n ệ c trong các đi u ki n

ệ ộ nhi ợ t đ và pH thích h p

ạ ế ế ầ ủ ơ ể ố ữ Enzyme có trong h u h t các lo i t bào c a c th s ng. Chính do nh ng tác nhân

ồ ố ọ ượ ấ ọ xúc tác có ngu n g c sinh h c nên enzyme còn đ ọ c g i là các ch t xúc tác sinh h c

ằ ệ ớ ấ ọ (biocatalysators) nh m phân bi t v i các ch t xúc tác hóa h c.

ấ ọ ọ ỉ Chúng là ch t xúc tác sinh h c không ch có vai trò quan tr ng trong quá trình sinh

ưở ể ủ ậ ọ ữ ấ ọ tr ng, phát tri n c a m i sinh v t mà nó còn gi ự vai trò r t quan tr ng trong các lĩnh v c

ế ế ư ự ệ ệ ẩ ậ ỹ khác nh : công ngh ch bi n th c ph m, trong k thu t phân tích, trong công ngh gen

ệ ả ườ ệ ọ ớ ứ ấ ượ ụ ả vào b o v môi tr ặ ng, đ c bi t là trong y h c v i ng d ng s n xu t d ẩ c ph m.

ệ ườ ừ ồ ơ ả Hi n nay ng i ta khai thác enzyme t ba ngu n c b n:

ậ ồ ộ Ngu n đ ng v t.

ự ậ ồ Ngu n th c v t.

ậ ồ Ngu n vi sinh v t.

1.2.1. Phân lo i:ạ

ớ ượ ề ệ ấ Ngày nay ngày càng nhi u enzyme m i đ ọ ể ố c phát hi n, và đ th ng nh t tên g i

ườ ấ ả ạ enzyme ng i ta đã phân t t c enzyme làm 6 lo i:

ả ứ ử Oxidoreductase: là nhóm enzyme xúc tác cho ph n ng oxy hoá kh .

ả ứ ị ộ ể ố Transferase: là nhóm enzyme xúc tác ph n ng chuy n v m t nhóm (g c)

ừ ấ ấ nào đó t ch t này sang ch t khác.

ả ứ ả ứ ủ ắ Hydrolase: là nhóm enzyme xúc tác cho ph n ng th y phân (ph n ng c t

ủ ướ ự có s tham gia c a n c).

ắ ộ Lyase: là nhóm các enzyme xúc tác quá trình phân c t m t nhóm nào đó ra

ỏ ợ ủ ướ ự ấ kh i h p ch t mà không có s tham gia c a n c.

ự ồ ể ạ ồ Izomerase: là nhóm enzyme xúc tác s đ ng phân hoá, chuy n d ng đ ng

ạ ồ phân này sang d ng đ ng phân khác.

ấ ữ ơ ự ổ ợ ờ ượ ng Ligase: là nhóm enzyme xúc tác s t ng h p ch t h u c nh năng l

ấ ươ ATP và các ch t t ng t ự .

ề

ổ

1.2.2. T ng quan v protease:

ủ ế Nhóm enzyme protease ( peptit – hidrolase 3.4) xúc tác quá trình th y phân liên k t

ử ế ẩ ố peptit ( CONH)n trong phân t ả protein, polypeptitde đ n s n ph m cu i cùng là axit

ủ ề ể ế ả ậ amin. Ngoài ra, nhi u protease cũng có kh năng th y phân liên k t este và v n chuy n axit

amin.

ầ ế ậ ố ứ ề ạ ừ ứ Protease c n thi ấ t cho các sinh v t s ng, r t đa d ng v ch c năng t m c đ t ộ ế

ế ơ ể ơ ượ ố ộ ố ượ ề ừ ậ bào, c quan đ n c th nên đ c phân b r ng rãi trên nhi u đ i t ng t vi sinh v t ( vi

ủ ứ ự ế ạ ậ ậ ẩ ấ ộ ớ khu n, n m, virus) đ n th c v t ( đu đ , d a…) và đ ng v t ( gan, d dày…). So v i

ữ ự ể ậ ậ ặ ậ ộ ệ protease đ ng v t và th c v t, protease vi sinh v t có nh ng đ c đi m khác bi t. Tr ướ c

ộ ệ ố ứ ạ ề ậ ấ ồ ố ấ ế ệ h t h protease vi sinh v t là m t h th ng r t ph c t p bao g m nhi u enzyme r t gi ng

ề ấ ố ượ ạ ử ể ấ ướ ạ nhau v c u trúc, kh i l ng và hình d ng phân t nên r t có th tách ra d i d ng tinh

ể ồ ấ th đ ng nh t.

ứ ệ ồ ề ậ Cũng do là ph c h g m nhi u enzyme khác nhau nên protease vi sinh v t th ườ ng

ủ ệ ặ ẩ ả ộ ệ ể ạ có tính đ c hi u r ng rãi cho s n ph m th y phân tri t đ và đa d ng Bromelain là

ả ứ ề ả ộ ố proteinenzyme có nhi u trong qu d a và có m t ít trong qu chu i, enzyme này đ ượ c

ệ ừ ữ ế ỉ ớ ượ ư ứ ừ ữ ế ỷ phát hi n t gi a th k 19 nh ng m i đ c nghiên c u t gi a th k 20. Ở ướ n c ta

ứ ề ượ ắ ầ ừ ữ nghiên c u v bromelain đ c b t đ u t nh ng năm 1968 1970

1.3. Enzyme Bromelain:

ự ậ ố ượ . Bromelain là nhóm protease th c v t có mã s EC3.4.22.33 đ c thu nh n t ậ ừ ọ h

ặ ệ ừ ứ Ở ỗ ộ ậ bromeliaceae, đ c bi t là t thân và trái d a. m i b ph n khác nhau thì bromelain có

ố ư ấ ạ ự pH t i u khác nhau và c u t o cũng có s khác nhau.

ứ ề ấ ả ộ ư Bromelain có trong toàn b cây d a, nh ng nhi u nh t là trong qu . Bromelain là

ế ả ắ ộ ử nhóm endoprotease có kh năng phân c t các liên k t peptide n i phân t protein đ ể

ể ử ỏ ọ ạ chuy n phân t protein thành các đo n nh g i là các peptide.

ủ ế ủ ứ ủ ầ ả Thành ph n ch y u c a bromelain có ch a nhóm sulfurhydryl th y gi i protein.

ế ứ ủ ạ ạ Khi chi t tách và tinh s ch phân đo n có ch a nhóm sulfurhydryl c a bromelain thì thu

ượ ủ ệ ộ đ c m t enzyme th y phân protein hi u qu ả in vitro.

ọ

ấ ạ 1.3.1. C u t o hoá h c: ư ộ

ự ậ ớ Bromelain thân là m t protease nh ng nó khác v i các protease th c v t khác nh ư

ở ỗ ộ ỗ ử ồ papain, ficin ch nó là m t glycoprotein, m i phân t có glycan g m 3 manose, 2

glucosamine, 1 xylose, và 1 fructose.

2 là

ứ ậ ầ ủ Các nghiên c u ghi nh n, polypeptide c a bromelain thân có acid amin đ u –NH

2 là

ầ ả ầ ớ ố valine và đ u carboxyl là glycine; còn đ i v i bromelain qu , acid amin đ u –NH

OH Fructose

Maltose

CH OH2

CH2

Maltose

Glucofamine CH OH2

Maltose

CH OH2

NHCONH3

NHCOCH2

C C H N

NHCONH3

Xylose

alanine.

ủ ấ ợ Hình 1.1: C u trúc s i hydrate carbon c a bromelain

ấ

1.3.2. C u trúc không gian: ậ

ấ ủ ậ ấ ắ Murachi và Busan phân tích c u trúc b c 1 c a bromelain và nh n th y cách s p

ử ư ế x p amino acid trong phân t bromelain nh sau:

ứ ạ ộ ộ ợ Bromelain là m t protease trong tâm ho t đ ng có ch a cysteine và hai s i

ế ớ ằ ầ ố ử ạ ầ polypeptide liên k t v i nhau b ng c u n i S – S . Phân t có d ng hình c u do có cách

ứ ạ ế ắ s p x p ph c t p.

ử ủ ế ứ Trong phân t bromelain thân có ch a nhóm sulfurhydryl có vai trò ch y u trong

ạ ỗ ử ấ ả ầ ố ho t tính xúc tác và trong m i phân t có t t c 5 c u n i disulfite. Ngoài ra, trong phân t ử

ẽ ủ ấ còn có các ion Zn 2+ có l có vai trò trong duy trì c u trúc không gian c a enzyme.

ấ ậ

1.3.3. Tính ch t v t lí: ự

ộ ủ ứ ề ậ ấ Murachi và c ng s năm 1964 đã nghiên c u v tính ch t v t lý c a enzyme

ừ ư ứ ấ bromelain trích t thân cây d a và th y nh sau:

ữ

ủ

ả

ấ ậ B ng . Nh ng tính ch t v t lý c a bromelain thân.

Ký hi uệ ố ệ S li u Tính ch tấ

ắ ằ S (s) 2.73 ố H ng s sa l ng

ố ế ằ D (cm2 / s) 7.77 x 10 7 H ng s khu ch tán

ể ầ V (ml/g) 0.743 Th tích riêng ph n

ộ ớ [ I ] (dl/g) 0.039 Đ nh t bên trong

ỷ ố f / fo 1.26 T s ma sát

ể ệ pI 9.55 ẳ Đi m đ ng đi n

ự ấ ở A1%cm 280nm 20.1 S h p thu

32.000 *

ượ ử 32.100 ** ọ Tr ng l ng phân t

35.500 ***

* : Tính b ng ph

ằ ươ ế ắ ng pháp sa l ng khu ch tán

** : Tính t

ừ ằ ắ ộ ớ ố h ng s sa l ng và đ nh t bên trong

*** : Tính b ng ph

ằ ươ ng pháp Archibald

ủ

1.3.4. Ho t tính c a bromelain:

ạ

ả

ạ 1.3.4.a.i.1.

Ho t tính phân gi

ạ ạ Bromelain có 3 ho t tính: peptidase, amidase và esterase, ho t tính esterase ở

ộ ọ ơ ủ bromelain h n papain trong đu đ và ficin trong cây thu c h Sung.

ả ả ơ ấ ự ủ Kh năng phân gi i các c ch t t nhiên c a bromelain.

ả

ạ

ả

ủ

B ng . Ho t tính phân gi

i casein c a bromelain.

ạ ả Ho t tính phân gi i casein ( UI/mg) ơ ấ C ch t

Bromelain Bromelain Bromelain ả thân qu xanh ả qu chín

7.4 4.0 3.0 Casein

ố ớ ơ ấ ạ ả ủ Đ i v i c ch t là casein, ho t tính phân gi ơ i c a bromelain thân cao h n

ả ả trong qu xanh và qu chín.

ả ả ạ ủ ơ ấ Kh năng phân gi i các c ch t nhân t o c a bromelain.

ả

ạ

ả

ủ

B ng . Ho t tính phân gi

i BenzoylLArginine amide (BAA) c a bromelain.

ạ ả Ho t tính phân gi i BAA ( UI/mg) ơ ấ C ch t

Bromelain Bromelain Bromelian ả thân qu xanh ả qu chín

3.7 9.1 7.2 BAA

ả ấ ả ạ ả Qua b ng trên ta th y bromelain qu xanh có ho t tính phân gi ơ i BAA cao h n

ế

ố ả

ưở

ế

ạ

1.3.4.a.i.2.

Các y u t

nh h

ng đ n ho t tính

bromelain:

ả bromelain thân và qu chín.

ị ả ư ấ ạ ố ưở ở ọ Gi ng nh các lo i ch t sinh h c khác, bromelain cũng b nh h ế ng b i các y u

ư ơ ộ ơ ấ ấ ồ ộ ồ ệ ộ ạ ố t nh : c ch t, n ng đ c ch t, n ng đ enzyme, nhi t đ , pH, ion kim lo i, m t s ộ ố

ứ ươ ươ ạ ươ ế nhóm ch c, ph ng pháp ly trích, ph ng pháp tinh s ch, ph ng pháp tinh khi t...

ế ố ệ ộ ạ ộ ả ứ ủ ợ Các y u t ư nh nhi t đ , pH thích h p cho ho t đ ng c a các ph n ng xúc tác

ộ ẫ ế ố ụ ụ ộ ổ ị ủ c a bromelain không n đ nh mà ph thu c l n nhau và ph thu c vào các y u t khác

ư ả ặ ủ ấ ơ ộ ơ ự ấ ấ ấ ồ ộ ạ ồ nh : b n ch t c ch t, n ng đ c ch t, n ng đ enzyme, s có m t c a các ch t ho t

hóa…

ưở ế ố ấ ả ọ ưở ế ạ  nh h Ả ủ ng c a pH : pH là y u t quan tr ng nh t nh h ng đ n ho t tính

ủ ố ủ ổ ỳ ị xúc tác c a enzyme, pH t ộ i thích c a bromelain không n đ nh mà tu thu c

ệ ộ ả ứ ộ ơ ấ ấ ả ờ ồ ộ vào nhi t đ , th i gian ph n ng, b n ch t và n ng đ c ch t, đ tinh

ụ ế ậ ế ạ s ch enzyme…Ví d : Khi thu th p bromelain thân, n u dùng tác nhân k t

4)2SO4 thì enzyme có ho t tính cao nh t

ấ ở ạ ổ ị ở ủ t a là (NH pH = 4.8, n đ nh pH

ượ ạ ầ ạ ộ = 4.6 5.4. Bromelain đã đ c tinh s ch m t ph n có ho t tính cao nh t ấ ở

ºC. Bromelain

ổ ị ở ớ ệ ộ pH = 6.0 và pH = 8.0, n đ nh pH = 3.5 – 5.6 v i nhi t đ 63

ộ ộ ố ơ ấ ấ ộ ỳ có biên đ pH r ng (3 10), t t nh t là pH = 5 – 8 tu thu c vào c ch t.

ưở ở ơ ạ ơ ữ  nh h Ả ng b i c ch t: ấ ấ trên nh ng lo i c ch t khác nhau, bromelain có

ế ả ấ ạ ơ ho t tính khác nhau. N u c ch t là hemoglobin thì kh năng phân gi ả ủ i c a

ế ạ ấ ấ ạ ơ ơ ầ bromelain m nh h n papain g p 4 l n, n u c ch t là casein thì ho t tính

ươ ự ư ơ ấ ổ ố ớ ư ợ ủ c a bromelain t ng t nh papain. Đ i v i các c ch t t ng h p nh BAA

(BenzoylLArginine amide), BAEE (BenzoylLArginine ethyl ester) thì khả

ỷ ả ủ ế ơ năng thu gi i c a bromelain y u h n papain.

ưở ệ ộ ủ ả ứ ị ả  nh h Ả ở ng b i nhi ệ ộ nhi t đ : t đ c a ph n ng xúc tác ch u nh h ưở ng

ế ố ụ ờ ệ ộ ẽ ề ở b i nhi u y u t : th i gian tác d ng càng dài thì nhi ề ả t đ s ít nhi u nh

ưở ộ ơ ủ ế ấ ạ ạ ồ ồ h ng đ n ho t tính c a enzyme, n ng đ c ch t, d ng t n t ạ ủ i c a

ụ Ở ị ế ả ứ ệ ộ enzyme. Ví d : d ch chi t qu d a (pH = 3.5) khi tăng nhi ế t đ lên đ n

ư ế ẫ ạ 60ºC thì bromelain v n còn ho t tính nh ng n u tăng cao quá thì bromelain

ạ Ở ữ ạ ố ẽ ấ s m t ho t tính. 5ºC, pH = 4 10 thì enzyme gi ho t tính t i đa trên

Ở ạ casein trong 24h. ấ 55ºC, pH = 6.1 thì enzyme m t 50% ho t tính trong vòng

20 phút.

ưở ạ ả ở ưở  nh h Ả ng b i các ion kim lo i ạ : các ion kim lo i có nh h ạ ế ng đ n ho t

ạ ộ ủ ủ ắ tính c a enzyme do chúng g n vào các trung tâm ho t đ ng c a enzyme.

ả ạ ẳ ố ỷ ưở ủ ế ạ Ch ng h n mu i thu ngân có nh h ng đ n ho t tính c a enzyme

ứ ộ ộ ủ ố ồ ộ ỳ bromelain và m c đ kìm hãm tu thu c vào n ng đ c a mu i.

ƯƠ

Ậ

Ệ

ƯƠ

CH

NG 2: V T LI U VÀ PH

NG PHÁP

ứ

ươ

ng pháp nghiên c u:

2.1. Ph 2.1.a.1. Nguyên li u:ệ ị

ả ứ ầ ỏ ả ứ V qu d a, 1 ph n th t qu d a

2.1.a.2.

Hóa ch t:ấ

ồ ấ ể ủ Hóa ch t đ t a: C n 96

ệ ị Dung d ch đ m phosphate : NaH2PO4.12H2O, NaH2PO4.

ấ ị ượ ử Hóa ch t xác đ nh hàm l ố ng protein: thu c th anson =.

ạ ấ ị Hóa ch t xác đ nh ho t tính enzyme.

ấ ể ố ị Hóa ch t đ c đ nh enzyme:

ệ Đ m phosphate 0.1 M pH 7

CaCl2 0.02 M

Acid acetic 1%

Thi

ế ị t b :

2.1.a.3. ổ

Máy quang ph UVVis

Máy ly tâm.

ỏ ứ Máy xay v d a.

Máy đo PH.

Cân phân tích.

Ố ệ ng nghi m

Bình tam giác.

ấ ọ Gi y l c.

ủ Pipet th y tinh: 1ml, 2ml, 5ml, 10ml.

Pipet man các lo i.ạ

ạ ầ Đ u típ các lo i.

ủ ố C c th y tinh 100ml, 250ml.

ệ ự ố Giá đ ng ng nghi m

Ố ng đong 50ml, 100ml, 500ml

ơ ồ

ố

2.1.a.4.

S đ kh i:

ế

2.1.a.5.

Thuy t minh quy trình

ỏ ứ ậ ừ ơ ở ư ươ ệ ề ạ V d a sau khi thu nh n t các c s đ a đ c v phòng thí nghi m. T i đây, v ỏ

ề ặ ọ ượ ị ọ ọ ị ứ ượ d a đ c xay ho c nghi n nát. Sau đó, đem đi l c thu đ c d ch l c và mang d ch l c này

ạ ỏ ặ ấ ị ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút. Sau khi ly tâm lo i b c n và thu l y d ch.

0 theo 3 t

ạ ủ ằ ồ ị ỷ ệ ị ẫ ầ Sau đó, t o t a cho 1 ph n d ch này b ng c n 96 d ch m u: ancol là l

0 đã đ

ị 1:3; 1:4; 1:5. Cho dung d ch enzyme vào bình tam giác. Cho t ừ ừ ượ l t ồ ng c n 96 cượ

ể ủ ạ ề ạ ấ ở ứ ị làm l nh vào bình tam giác ch a d ch enzyme. Khu y đ u. Đ t l nh 40 phút nhi ệ ộ t đ

ủ ấ ị ị 5 0C. L y d ch đem ly tâm 5000 vòng/phút trong 20 phút. Thu t a. Hòa trong 2ml dung d ch

ạ ằ ấ ẫ ị ươ ệ đ m phosphate 0.1 M pH 7. L y m u đi xác đ nh ho t tính b ng ph ả ng pháp Anson c i

ế ị ượ ằ ươ ti n và đ nh l ng enzyme b ng ph ng pháp Biuret.

ế ị ượ ủ ấ ả ị ả ị Sau khi có k t qu đ nh tính và đ nh l ng, ta t a t t c d ch theo t ỷ ệ l cho

ự ệ ấ ả ự ư ế k t qu cao nh t và th c hi n các b ướ ươ c t ng t nh trên.

ạ ắ ọ ượ ế Ch y s c ký l c gel enzyme thô và thu đ c enzyme tinh khi t.

ả ọ ế ể ằ ươ ệ Ki m tra k t qu l c gel b ng ph ng pháp đi n di.

2.2. ng pháp thí nghi m:

ệ ạ

ươ Ph 2.2.a.1.

ằ

ị

Kh o sát ho t tính enzyme bromelain ươ ng

ả ạ ả ế

(Xác đ nh ho t tính enzym Bromelain b ng ph pháp Anson c i ti n):

2.2.1.a.i.1.

Nguyên t c: ắ

ươ ự ủ ự ằ Ph ng pháp này d a trên s th y phân protein casein b ng enzym Bromelin có

ế ủ ị ủ ư ứ ế ạ ị trong d ch nghiên c u, ti p đó làm vô ho t enzym và k t t a protein ch a b th y phân

ị ị ượ ả ẩ ượ ạ ằ b ng dung d ch acid trichloracetic. Đ nh l ng s n ph m đ ả ứ c t o thành trong ph n ng

ẩ ủ ả ứ ồ ị ự ủ ằ ố ớ ử th y phân b ng ph n ng màu v i thu c th Folin. D a vào đ th chu n c a Tyrosin đ ể

ụ

D ngụ c và hóa ch t: ấ

2.2.1.a.i.2. ụ

ượ ạ ả ẩ tính l ng s n ph m do enzym xúc tác t o nên.

 D ng cụ

Ố ệ ng nghi m

Pipet 1ml, 2ml, 3ml, 5ml, 10ml

Máy quang phổ

Becher 50ml, 250ml, 500ml

Bình tia

Hóa ch tấ



ị Dung d ch Casein 1%

ị Dung d ch TCA 5%

ị Dung d ch NaOH 0,5N

ử ố Thu c th Folin

ị Dung d ch HCl 0,2N

ị ườ

ẩ

2.2.1.a.i.3.

ẩ Chu n b đ

ng chu n Tyrosin :

ẩ ị ị Dung d ch Tyrosin chu n 1 mM/l trong dung d ch HCl 0,2N

ướ ự

ườ

ẩ

B ng .ả

Các b

c d ng đ

ng chu n Tyrosin

Ố ệ ng nghi m

2 3 4 5 1 6 Dung ị d ch hóa ch tấ

0,2 0,4 0,6 0,8 0 1,0

Dung d chị Tyrosin chu nẩ (ml)

0,2 0,4 0,6 0,8 0 1,0

ngượ L Tyrosin ngươ t ứ ng (µM)

5,0 4,8 4,6 4,4 4,2 4,0 ị

Dung d ch HCl 0,2N (ml)

10 10 10 10 10 10

Dung d chị NaOH 0,5N (ml)

3 3 3 3 3 3

Thu cố ử th Folin (ml)

ạ ắ L c m nh, sau 10 phút đo OD ở ướ b c sóng 660nm

Ố ử ố ố ố ạ ệ ố ng s 1 là ng th không (TK), các ng còn l i là ng thí nghi m (TN). V ẽ

ươ

ế

2.2.1.a.i.4.

ng pháp ti n hành:

ườ ẩ ươ ữ ượ đ ng chu n Tyrosin t ng quan gi a l ng Tyrosin (µM) và ΔOD (ΔOD = ODTN – ODTK).

ử ậ ử ế ệ ấ ạ ố ố ố L y 6 ng nghi m s ch, khô, ti n hành làm 3 ng th th t, 3 ng th không

ướ

ị ẫ

ể

ẩ

ạ

B ng .ả

Các b

c chu n b m u enzym đ đo ho t tính

Ố ệ ị ng nghi m ấ Dung d ch hóa ch t ử ị ử ậ Th th t 5 Th không 5

ị

ị 0 1 10 1

oC trong 20 phút

Dung d ch Casein 1% (ml) Dung d ch TCA 5% (ml) ẫ Dung d ch enzym m u (ml) ắ ề ữ ở L c đ u và gi ị 0 Dung d ch TCA 5% (ml) ể 35,5 10 ọ ấ ị Đ yên 30 phút, l c l y d ch trong

ọ ủ ố ứ ệ ấ ấ ố ớ ố ị ử ậ L y 2 ng nghi m m i khác, cho vào ng th nh t 5ml d ch l c c a ng th th t

ử ứ ố ố ọ ị và cho vào ng th hai 5ml d ch l c cùa ng th không.

ế ụ ỗ ố ử ạ ắ ố Ti p t c thêm vào m i ng 10ml NaOH 0,5N và 3ml thu c th Folin, l c m nh, sau

ồ ị 10 phút đo OD ở ướ b c sóng 660nm. Tính ΔOD = OD ẩ ự TT – ODTK, sau đó d a vào đ th chu n

ế

2.2.1.a.i.5.

ả 2.2.1.5 Tính k t qu :

ượ ố suy ra đ c s µM Tyrosin.

ơ ị ị ộ ơ ượ ố ể ị m t đ n v Anson là l ng enzym t ề i thi u trong đi u Đ nh nghĩa đ n v Anson:

ủ ệ ệ ạ ẩ ả ki n thí nghi m (35,50C: pH 7,6 …) th y phân Casein trong 1 phút t o thành s n ph m hòa

ả ứ ộ ấ ử ớ ố tan trong TCA, ph n ng v i thu c th Folin cho ta đ h p thu OD ở ướ b c sóng 660nm

ớ ườ ẩ ươ ứ t ng ng v i 1µM Tyrosin trong đ ng chu n.

Hđ Protease = (UI/g)

ạ ộ ố ượ ớ ơ ị V i: Hđ Protease : ho t đ enzym protease trên 1 đ n v kh i l ng (UI/g)

ử ậ ặ ố ử ể ổ ợ ỗ ố V : t ng th tích h n h p trong ng th th t ho c ng th không (ml)

ể ọ ị v : th tích d ch l c đem phân tích (ml)

ờ ủ t : th i gian th y phân (phút)

ố ượ ạ ẫ ị m : kh i l ng m u enzym đem đi xác đ nh ho t tính (g)

ộ L: đ pha loãng enzym

ượ ẩ µM Tyrosin: l ng µM Tyrosin trong v (ml) suy ra t ừ ườ đ ng chu n

ươ

ằ

ươ

ị Đ nh l

ng enzyme b ng ph

ng pháp

2.2.a.2. Biuret:

2.2.2.a.i.1.

Nguyên t c:ắ

2+ trong môi tr

ả ứ ự ữ ạ ườ ề ạ D a vào ph n ng t o màu gi a protein và Cu ả ng ki m t o ph n

ứ ự ạ ở ướ ộ ấ ườ ộ ng màu xanh tím có đ h p thu c c đ i b c sóng 540nm. C ng đ màu t ỷ ệ l ậ thu n

ố ượ ế ỗ ớ ượ v i l ng Cu và s l ng liên k t peptide trong chu i polypeptide.

ả ứ Hình . Ph n ng Biuret.

ụ

ấ

D ng c và hóa ch t:

2.2.2.a.i.2. ụ

Ố

ệ

 D ng cụ

ng nghi m

Pipet 1ml, 2ml, 3ml, 5ml, 10ml

Máy quang phổ

Becher 50ml, 250ml, 500ml

Bình tia

ẩ

ị

 Hóa ch tấ

ử

ố

Dung d ch albumin chu n 1%

Thu c th Biuret:

 CuSO4

ướ ấ  N c c t

ế

Ti n hành:

 Tartrat Kilium và Natrium

2.2.2.a.i.3. Chu nẩ b thu c th Biuret:

ử ố ị

Cân chính xác CuSO4 :

1,5g

Tartrat Kilium và Natrium: 6g

ướ ấ N c c t:

500ml

ứ ế ắ ị Cho vào bình l c cho tan hoàn toàn và đ nh m c đ n 1000ml.

ậ ẩ ồ ị L p đ th chu n:

ố ừ ệ ấ ố ư ả ế ấ L y 6 ng nghi m đánh s t 1 đ n 7 và cho vào đó các ch t nh b ng sau:

ậ ườ

ả

B ng . L p đ

ẩ ng chu n Biuret.

1 2 3 4 5 6 7 ệ ộ ng nghi m ồ 0 0 2 4 6 8 10

1 1 1 1 1 1 1

ố 4 4 4 4 4 4 Ố ẩ N ng đ protein chu n (mg/ml) ẩ ị Dung d ch protein chu n (ml) ử Thu c th Biuret (ml) 4

ắ ề ể L c đ u, đ 20 phút. Đo OD ở ướ b c sóng 540nm.

ẩ ị ẫ Chu n b m u đo Biuret:

ị ẫ

ả

ẩ

B ng . Chu n b m u đo Biuret.

ệ

ẫ ướ ấ c c t

ố 0 1ml n 4 1 1ml m uẫ 4 Ố ng nghi m ị Dung d ch m u ử Thu c th Biuret (ml) 2 1ml m uẫ 4

ả

2.2.2.a.i.4.

ế Tính k t qu :

ắ ề ể L c đ u, đ 20 phút. Đo OD ở ướ b c sóng 540nm.

ồ ị ệ ẩ ậ ố ừ ị ố ậ ộ ủ ủ L p đ th chu n c a các ng nghi m t ố 37 . Tr s m t đ quang c a các ng

ừ ậ ộ ủ ệ ằ ố ừ ở ừ ệ nghi m t 37 b ng m t đ quang c a các ng nghi m t 26 đã đo trên tr cho m t đ ậ ộ

ồ ị ể ủ ố ướ ậ ễ ự ế quang trung bình c a ng 1 và 2 ( B c sóng 540 nm). Sau đó l p đ th bi u di n s bi n

ậ ộ ủ ẩ ộ ồ thiên c a m t đ quang theo n ng đ protein chu n.

ươ ự ộ ấ ậ ự ủ ệ ằ ố T ng t , đ h p thu th t s c a protein trong ng nghi m b ng tr s m t đ ị ố ậ ộ

ủ ố ệ ừ ứ ế ố ố ườ quang c a ng nghi m tr cho ng đ i ch ng. Sau đó chi u vào đ ẩ ng chu n suy ra

ệ ẫ ượ l ng protein có trong m u thí nghi m.

ươ

ọ

2.2.a.3.

Ph

2.2.3.a.i.1.

ắ ng pháp s c kí l c gel: Nguyên t c:ắ

ạ ắ ỗ ỗ ỗ ỗ ượ Trong s c ký gel, pha tĩnh là m ng polymer có l r ng và các l r ng này đ c ph ủ

ề ấ ồ ợ ộ ọ ợ ượ ộ ỗ ầ đ y dung môi dùng làm pha đ ng. M t h n h p g m nhi u h p ch t có tr ng l ng phân

ể ượ ỳ ử t khác nhau cò th tách riêng đ c hay không là tu vào kích th ướ ỗ ỗ c l r ng. Các phân t ử

ướ ớ ơ ỗ ỗ ể ọ ỗ ỗ có kích th c l n h n l r ng, không th chui l t vào bên trong l r ng, nhanh chóng theo

ỏ ộ ủ ả ộ ử ượ ử dòng ch y c a pha đ ng đi ra kh i c t. các phân t ọ có tr ng l ng phân t (TLPT) nh ỏ

ầ ọ ẽ ỗ ỗ ằ ố ơ h n kích th ướ ỗ ỗ c l ầ r ng, s toàn ph n hay bán ph n l t vào l ồ r ng, tuy r ng cu i cùng r i

ỏ ộ ư ẽ ậ ả ễ ơ ả ộ cũng theo dòng ch y đi ra kh i c t nh ng s ch m tr ế h n. Dòng ch y pha đ ng khi n

ử ớ ể ỗ ỗ ủ ạ ộ các phân t l n không th chui vào l r ng c a m ng gel, nhanh chóng đi xuyên qua c t, ra

ỏ ộ ử ỏ ộ ơ ỏ kh i c t, trong khi phân t nh ra kh i c t lâu h n vì còn chui vào và đi ra kh i l ỏ ỗ ỗ r ng

ủ ỗ ộ ắ ư ậ ẫ ầ ợ ủ c a gel. Nh v y, các thành ph n khác nhau c a h n h p m u khi đi ngang qua c t s c ký

ỏ ộ ầ ượ ẽ ự ỏ ộ ướ ớ ử gel, s ra kh i c t l n l t theo trình t TLPT l n đi ra kh i c t tr c, phân t ỏ nh đi ra

ế

2.2.3.a.i.2.

Ti n hành

ỏ ộ kh i c t sau.

ự ả ắ ố ộ ụ ằ ồ ỷ ệ S c ký gel ph i th c hi n trong c t hình ng tr b ng thu tinh, g m các b ướ c

ạ ộ ồ ươ ở ệ ệ ở ạ Nh i gel vào c t: các h t gel tr ng n hi n di n ề d ng huy n phù trong

ề ộ ợ ượ ỉ dung môi phù h p cho vào c t. Huy n phù đ ậ ệ c ch nh sao cho th t s t

ư ễ ả ẫ ằ ộ ộ ằ nh ng khi rót v n ch y vào c t thành dòng d dàng. Cân b ng c t b ng

ả ộ ượ ả ể cách cho dung môi gi i ly ch y ngang qua c t, l ng dung môi có th tích

ẽ ủ ộ ằ ự ặ ể ể ầ ộ ộ ằ b ng 23 l n th tích c t. Ki m tra s ch t ch c a c t b ng cách cho m t

ử ườ ử ẫ ẫ ộ ượ ọ ượ l ầ ng m u th vào đ u c t. m u th th ng đ c ch n là dextran blue

ươ ể ượ ể ắ ườ 2000, có màu xanh d ng đ có th đ ằ c quan sát b ng m t th ự ng s di

ể ủ ẫ ộ chuy n c a m u trong c t.

ầ ẫ ẫ ầ ầ ắ ặ ộ ị ả Đ t m u c n s c ký lên đ u c t gel: dung d ch m u c n phân tách ph i

ượ ọ ữ ấ ợ ỏ ở ạ ặ ắ ẫ ị đ c l c b nh ng h p ch t còn d ng r n, c n. Dung d ch m u hoà tan

ầ ộ ư ắ ệ ặ ố ộ ị vào dung d ch đ m, đ t lên đ u c t gi ng nh s c ký c t.

ể ể ắ ả ỉ ử ụ ấ ơ ả ỹ Tri n khai s c ký gel: tri n khai gi ậ i ly r t đ n gi n, ch s d ng k thu t

ử ụ ạ ỗ ồ ộ ộ ợ ơ dung môi đ n n ng đ (nghĩa là s d ng m t lo i dung môi hay h n h p hai

ắ ầ ớ ế ả dung môi, khi b t đ u cho t i khi k t thúc quá trình gi ộ ỉ ứ ụ i ly ch s d ng m t

ạ ả ể ằ ấ ố ự ư lo i dung môi đó). Gi ọ i ly có th b ng tr ng l c nh ng r t t ử ụ t khi s d ng

ẩ ừ ầ ứ ộ ả ữ ọ ỗ ọ ỏ ơ b m đ y t đ u c t. h ng dung môi gi i ly trong nh ng l nh , m i l có

ỏ ộ ấ ị ứ ự ể ẽ ộ ấ m t th tích nh t đ nh. Các ch t tan s ra kh i c t theo th t ả TLPT gi m

d n.ầ

ươ

ệ

2.2.a.4.

Ph

ng pháp đi n di SDS PAGE

(Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide): Nguyên t c:ắ

2.2.4.a.i.1.

ự ự ể ả ử ệ ệ ườ D a vào s di chuy n c u các phân t mang đi n tích trong đi n tr ệ ng. Đi n di

ế ằ ử ệ ự ử protein trên gel ti n hành x lý gel b ng SDS. Phân t protein có đi n tích t ứ do ch a

ữ ế ử ượ ạ ở ể ệ ẳ nh ng nhóm acid và base. N u các phân t protein không đ c đ t đi m đ ng đi n thì

ướ ả ưở ủ ệ ườ ự ể d i nh h ng c a đi n tr ng ngoài, chúng di chuy n sang các c c. Các protein khác

ị ố ệ ự ế ố ủ ể ộ nhau có tr s đi n tích t ệ do khác nhau. Vì th , t c đ di chuy n c a chúng trong đi n

ườ ở ấ ị ữ ự ề ệ ề ệ ộ tr ng nh ng đi u ki n nh t đ nh v pH, l c ion và nhi t đ cũng khác nhau. Do đó,

ạ ợ ượ ộ ố ệ ữ ặ ỗ h n h p các lo i protein đ c tách ra thành m t s vùng riêng bi ạ t ho c nh ng phân đo n

ế

2.2.4.a.i.2.

Ti n hành:

riêng bi t.ệ

ệ ẩ ị Chu n b gel đi n di:

ườ ể ế ặ ứ ủ ấ Gel polyacrylamide th ầ ử ụ ng đ t đ ng, đ ch gel c n s d ng các t m th y tinh có

ể ạ ụ ế ấ k t c u chuyên d ng đ t o khuôn.

ử ạ ủ ấ ằ ướ ể ồ ạ ằ R a s ch các t m th y tinh b ng n c, đ khô r i lau l i b ng ethanol. Ráp các

ạ ướ ẫ ủ ẹ ả ấ ủ ấ t m th y tinh l i theo h ỡ ng d n c a hãng s n xu t và k p khuôn trên giá đ .

ư ả ệ ầ ớ ướ Pha gel đi n di v i thành ph n nh b ng d i đây:

ệ

ả

B ng . Cách pha gel đi n di.

Running gel 2,5ml Stacking gel 0,325ml

1,875ml 0,625ml 4X Stacking gel buffer (pH6.8)

3,125ml 25 5 Mono solution 4X Running gel buffer (pH8.8) H2O APS 10% TEMED 1,525ml 12,5 2

ụ ầ TEMED có tác d ng làm đông gel, là thành ph n pha vào sau cùng. Sau đó nh ẹ

ắ ẵ ừ ề ộ ổ ợ ỗ nhàng tr n đ u h n h p gel v a pha và đ vào khuôn kính đã l p s n.

ạ ổ ướ ớ ạ ướ ủ ớ Đ gel ch y tr i v ch d c t i c a khuôn kính. Thêm isopropanol lên trên l p gel

ủ ớ ụ ừ ẳ ạ ạ ổ ọ ợ ch y v a đ , isopropanol có tác d ng làm ph ng và hút b t khí c a l p gel ch y. Đ i

ả kho ng 30 phút cho gel đông.

ử ạ ằ ổ ớ ướ ấ ể R a s ch l p isopropanol đã đ vào gel b ng n ề ầ c c t nhi u l n. Đ khô.

ổ ớ ủ ẹ ắ ượ ể ạ ế Đ gel gom t i mép trên c a kính. Nh nhàng c m l c vào đ t o thành gi ng.

ầ ả Gel đông c n kho ng 15 phút.

ắ ộ ỏ ộ Au khi gel gom đông. Tháo b kính kh i khuôn kính. L p b kính có gel vào khung

ệ ự ệ ự ổ ệ ệ ầ đi n c c, đ đ m đi n di đ y bô khung đi n c c.

ị ẫ ẩ Chu n b m u:

ẫ ầ ệ ổ Hút m u c n đi n di 20vào tube 1,5ml có b sung 10 2X treatment buffer.

ủ ể ộ Đun sôi cách th y trong 5 phút, đ ngu i.

ệ Đi n di:

ấ ượ ẹ ừ ế ệ ẫ ơ ỏ Nh nhàng l y l ừ c ra kh i bô đi n di. B m t ng m u vào t ng gi ng v i l ớ ươ ng

ớ ượ ẩ là 20. Thang chu n là Protein Ladder v i l ng 1315.

ệ ổ ệ ế ệ ắ ớ ộ ị ườ ạ Đóng n p h p đi n di, ti n hành ch y đi n di v i dòng đi n n đ nh, th ng là

100200V trong 3090 phút.

ủ ế ầ ạ ỉ ị ắ ệ ố Sau khi v ch màu ch th xu ng g n đ n đáy c a gel, t ấ t đi n và l y gel ra.

ử ộ ộ Nhu m gel và r a nhu m:

ứ ấ ộ ộ ị Sau khi l y gel ra, cho gel vào h p ch a dung d ch nhu m protein (Staining

solution).

ẹ ấ ắ L c nh 10 30 phút cho Staining solution th m vào gel.

ử ử ể ị ị Chuy n gel sang dung d ch r a màu (Destaining solution). Thay dung d ch r a màu

ệ ế ế ề ầ ả ấ ố ớ ạ m i kho ng 15 phút/ l n cho đ n khi mi ng gel có màu trog su t và xu t hi n nhi u v ch

ơ xanh l trên gel.

ƯƠ

Ậ

Ế

CH

Ả NG 3: K T QU VÀ BÀN LU N

ằ

ồ

3.1. ố ượ

ệ ượ

ủ ủ

Thí nghi m 1: t a bromelain b ng c n 96 ế ủ ng k t t a thu đ

c sau khi t a: Kh i l

ố ượ

ế ủ

ượ ở ỉ ệ

B ng .ả

ng k t t a thu đ

3 t l

khác nhau.

Kh i l

1:3

T l

1:4

T l

1:5

T l

Ố ƯỢ

ỉ ệ 0,5

ỉ ệ 0,49

ỉ ệ 0,38

KH I L

NG (G)

ế

ả

ị

ượ

ẫ ượ

ể ệ

ả

ệ K t qu thí nghi m xác đ nh hàm l

ng Protein có trong m u đ

c th hi n qua b ng sau:

ệ ượ ằ ướ ấ Thí nghi m đ c set blank b ng n c c t.

ả

ượ

ẫ

ướ

ồ

B ng . Hàm l

ng Protein có trong m u tr

ủ ằ c và sau khi t a b ng c n 96o.

∆OD

C (mg/mL)

0,284 ± 0,021

6,184 ± 0,455

Ẫ M U BAN Đ UẦ

Ủ

Ẫ

M U T A

ỉ ệ t l ỉ ệ t l ỉ ệ t l

1:3 1:4 1:5

0,051 ± 0,051 0,041 ± 0,023 0,094 ± 0,001

1,112 ± 0,112 0,886 ± 0,511 2,050 ± 0,025

ẫ ượ

ế

ệ

ả

ạ

ị

ể ệ

ả

K t qu thí nghi m xác đ nh ho t tính enzyme có trong m u đ

c th hi n qua b ng sau:

ệ ượ ằ ướ ấ Thí nghi m đ c set blank b ng n c c t.

ẫ

ạ

ả

ướ

ủ

B ng . Ho t tính enzyme có trong m u tr

c và sau khi t a.

∆ODTT

∆ODTK

∆OD(TTTK)

µM

HO TẠ TÍNH (UI/g)

0,878 ± 0,088 0,453 ± 0,097 0,425 ± 0,017 0,304 ± 0,014 0,0486

ẫ M u ban đ uầ ỉ ệ ỉ ệ ỉ ệ

1:3 1:4 1:5

T l T l T l

0,041 ± 0,007 0,018 ± 0,001 0,171 ± 0,038 0,031 ± 0,040 0,028 ± 0,001 0,036 ± 0,001 0,011 ± 0,033 0,01 ± 0,001 0,136 ± 0,039 0,04 ± 0,028 0,057 ± 0,006 0,064 ± 0,032 1,386

ạ Tính toán ho t tính enzyme:

ạ

ẫ Ho t tính m u ban đ u

ầ = = 0,0486 UI/g

Trong đó:

= 0,0304

V = 16 mL

L = 200

t = 20 phút

m = 200 g

v = 5 mL

ẫ ủ ỉ ệ

ạ

Ho t tính m u t a t l

1:5

= = 1,386 UI/g

Trong đó:

= 0,064

V = 16 mL

L = 10

t = 20 phút

m = 0,1 g

v = 5 mL

Bàn lu n:ậ

ủ ở ế ủ ộ ồ Sau khi t a ệ ba n ng đ khác nhau, trích 0,1 g k t t a hoà vào 10 mL đ m

ị ượ ủ ượ ạ phosphate và xác đ nh hàm l ng Protein và ho t tính enzyme có trong t a đ c th hi n ể ệ ở

ả ả b ng 2 và b ng 3.

ả ử ế ạ ỉ ệ ứ ế ỏ K t qu th ho t tính ở ỉ ệ t l 1:3 và t l ả 1:4 ra k t qu âm, ch ng t enzyme đã b ị

ả ở ể ấ ả ạ ệ ộ ợ m t ho t tính. Nguyên nhân có th là do b o qu n nhi t đ không thích h p nên enzyme

ư ể ể ạ ị ấ b m t ho t tính. Đ có th so sánh đ a ra t l ỉ ệ ủ ố ư t a t i u, nhóm tính toán hàm l ượ ng

ượ

Kh i l

ủ ng t a

ng Protein ố ượ

ố ượ (g)

ủ ng t a

ư ủ protein có trong t a nh sau:

ỉ ệ ỉ ệ ỉ ệ

0,5 0,49 0,38

ng Protein Hàm l có trong 0,1 g t aủ (mg/ml) 1,112 0,886 2,050

Hàm l ổ có trong t ng kh i l (mg/ml) 5,556 4,341 7,791

T l T l T l

1:3 1:4 1:5

ừ ả ỉ ệ ế ả ượ ặ T b ng k t qu trên, t l 1:5 cho hàm l ố ấ ng Protein cao nh t m c dù có kh i

ế ủ ỉ ệ ấ ấ ượ l ng k t t a th p nh t, cho nên t l 1:5 là t l ỉ ệ ủ ố ư t a t i u.

ệ

ằ

3.2. ươ ng

ạ Thí nghi m 2: tinh s ch protein b ng ph ọ pháp l c gel. ượ ả

∆OD 0,017 0,104 0,19 0,167

c(mg/mL) 0,362 2,261 4,139 3,637

NGỐ 1 2 3 4

ể ệ ượ ả ọ ị ế ng Protein sau khi l c gel đ c th hi n qua b ng sau: K t qu xác đ nh hàm l

0,374 0,002 0,013 0,037

8,157 0,034 0,293 0,817

5 6 7 8

ế

ậ

K t lu n:

ọ ượ ứ ở ố ố Sau khi l c gel, hàm l ng Protein ch a ấ ng s 5 là cao nh t (8,157 mg/mL).

ƯƠ

Ậ

CH

Ế NG 4: K T LU N

0 ở

ủ ọ Ch n tác nhân t a là ancol etylic 96 các t ỷ ệ ố ư t i u là 1:3; 1:4; 1:5. l

ố ượ ư ủ ấ ở ỷ ệ Ở ỷ ệ t l 1:3, 1:4 thì kh i l ng t a là cao nh t, nh ng t l 1:5 thì hàm l ượ ng

ạ protein (2,050 ± 0,025 mg/mL) và ho t tính enzyme ( 1,386 UI/g) là cao nh t.ấ

ằ ạ ươ ọ ở ứ ạ Khi tinh s ch enzyme thô b ng ph ng pháp l c gel, phân đo n th 5, thu đ ượ c

ượ ấ ớ hàm l ng enzyme là l n nh t (8,157mg/mL).

ƯƠ

Ả

Ệ

CH

NG 5: TÀI LI U THAM KH O

ị ả

ế

ễ

ầ

ạ

ị

ộ ố ạ

ế ẩ

ủ

ứ

ồ

ọ

m t s ho t tính c a ch ph m Bromelain ch i ng n D a tây ( Ananas comosusL –

ậ

ọ

Group Quee).T p chí sinh h c, trang 3 – 9.

ứ

ượ

ấ ả

ệ

ố

ễ [2] Nguy n Đ c L

ng, 2004. Công ngh enzyme, nhà xu t b n ĐH Qu c Gia

TPHCM.

ươ

ủ

ễ

ậ

ị

ụ [3] Nguy n Văn Thành, Nguy n Minh Th y, D ng Th Di m Trang, t n d ng

ế

ẩ

ậ

ầ

ạ ph ph m khóm c u Đúc (H u Giang) cho quá trình trích ly enzyme bromelain, t p

ọ

ườ

ạ ọ

ầ

chí khoa h c tr

ơ ng đ i h c C n Th .

ứ

ề

ườ

ứ

ụ

[4] Lê Thanh Mai, 1997. Nghiên c u v Bromelain và con đ

ủ ng ng d ng c a

ế

ậ

ọ

ườ

ự

ọ

chúng, lu n văn phó ti n sĩ sinh h c. Tr

ng ĐH Khoa H c T Nhiên

ấ ả

ễ

ế

ễ

ắ

ọ

ụ [5] Nguy n Ti n Th ng, Nguy n Đình Huy, Hóa Sinh h c, nhà xu t b n giáo d c,

Hà N i.ộ

[1] Ph m Th Trân Châu, Phan Ti n Hòa, Nguy n Th B o, 1987. Thành ph n và

Đề tài: Nghiên cứu enzyme

Chủ đề:

Đồ án môn kỹ thuật y sinh

Ờ Ở Ầ L I M Đ U

Ụ

Ụ

M C L C

Ụ DANH M C HÌNH

Ả

Ụ DANH M C B NG

ƯƠ

Ổ

CH

NG 1: T NG QUAN

ệ

ặ

ồ Đ c đi m ngu n nguyên li u:

1.1. ứ

ể ệ

1.2.

Enzyme: ế

1.2.1. Phân lo i:ạ

ề

ổ

1.2.2. T ng quan v protease:

1.3.

Enzyme Bromelain:

ọ

ấ ạ 1.3.1. C u t o hoá h c: ư ộ

ấ

1.3.2. C u trúc không gian: ậ

ấ ậ

1.3.3. Tính ch t v t lí: ự

ữ

ủ

ả

ấ ậ B ng . Nh ng tính ch t v t lý c a bromelain thân.

ủ

1.3.4. Ho t tính c a bromelain:

ạ 1.3.4.a.i.1.

ả

ạ

ả

ủ

ả

ạ

ả

ủ

ƯƠ

Ậ

Ệ

ƯƠ

CH

NG 2: V T LI U VÀ PH

NG PHÁP

ứ

ươ

ng pháp nghiên c u:

2.1.

Ph 2.1.a.1. Nguyên li u:ệ ị

2.1.a.2.

Hóa ch t:ấ

Thi

ế ị t b :

2.1.a.3. ổ

ơ ồ

ố

2.1.a.4.

S đ kh i:

ế

2.1.a.5.

Thuy t minh quy trình

2.2.

ng pháp thí nghi m:

ệ ạ

ươ Ph 2.2.a.1.

ằ

ị

Kh o sát ho t tính enzyme bromelain ươ ng

ả ạ ả ế

ng pháp đi n di SDS PAGE