NGHIÊN CỨU LẬP BẢN ĐỒ GEN CHỊU HẠN Ở LÚA VIỆT NAM
Lã Tuấn Nghĩa, Trần Đức Trung,
Chu Thị Thanh Hà
Summary
Mapping of genes conferring to the drought resistance in Vietnamese rice
Drought resistance is one of the most important agronomic traits of rice. Genetic analysis of
drought resistance in rice is to help in improving the effect of marker assisted breeding. In this
study, we carried out to identifying genes conferring the resistance to drought in Vietnamese using
an F
2
population derived from a cross between the two rice cultivars LC93-1 and Khang dan 18. 12
QTLs associated with the drought resistance were identified on chromosomes: 1, 3, 6, 8, 9 and 10.
These QTLs were named: qDroughtLDS-1-DT, qDroughtLDS-3-DT, qDroughtLDS-8-DT,
qDroughtLDS-9-DT, qDroughtLDS-10-DT relative to the Leaf Drying Score (LDS) and
qDroughtDLR-1-DT, qDroughtDLR-1-DT, qDroughtDLR-3-DT, qDroughtDLR-6-DT, qDroughtDLR-
8-DT, qDroughtDLR-9-DT và qDroughtDLR-10-DT relative to Day To Leaf Rolling (DLR). The
qDroughtLDS-9-DT and qDroughtDLR-9-DT had largest additive effects, the qDroughtLDS-1-DT,
qDroughtLDS-8-DT and qDroughtDLR-8-DT had favorable allele come from LC93-1 cultivar and
others come from Khang dan 18 cultivar.
Keywords: Gene maping; Drought resistance; QTLs.
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Chịu hạn là một đặc tính nông học quý
của bất cứ loài cây trồng nào, nhờ có khả
năng chịu hạn tốt mà cây trồng có thể
chống chịu được với điều kiện khô hạn kéo
dài của thời tiết. Đặc tính chịu hạn của lúa
đang được các nhà chọn tạo giống tập trung
khai thác nhằm tạo ra các giống lúa có khả
năng chịu hạn tốt trong các điều kiện khô
hạn. Muốn khai thác tốt được tính chịu hạn
thì cần phải phân tích lập bản đồ gen qui
định chúng.
Ở nước ta có rất nhiều giống lúa có
khả năng chịu hạn tốt (Tẻ mèo, Lộc Nghệ
An, Nếp nương, LC93-1, CH5, CH133,
CH3...), là vật liệu quí để khai thác nguồn
gen chịu hạn trong chọn tạo giống. Tuy
vậy, những nghiên cứu phân tích phân tử ở
mức độ ADN đối với nguồn gen chịu hạn
của lúa ở nước ta còn rất khiêm tốn và vẫn
chưa có công bố nào về lập bản đồ
gen/QTL của các giống lúa nói trên.
Trong nghiên cứu này chúng tôi đã lựa
chọn giống lúa LC93-1 là giống có khả
năng chịu hạn tốt, năng suất cao đang phổ
biến rộng trong sản xuất để lập bản đồ
gen/QTL quy định tính chịu hạn của giống,
nhằm góp phần khai thác có hiệu quả khả
năng phục vụ sản xuất.
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1. Vật liệu nghiên cứu
Các giống lúa LC 93-1 và Khang dân 18
dùng để lai với nhau tạo ra quần thể F2.
2. Phương pháp nghiên cứu
Qui trình của nghiên cứu gồm các bước
như sau: Tạo quần thể F2 từ tổ hợp lai giữa
giống lúa bố mẹ là Khang dân 18 (giống lúa
có khả năng chịu hạn kém) và giống LC93-1
(giống lúa có khả năng chịu hạn tốt). Sau
đó thiết kế thí nghiệm đánh giá khả năng
chịu hạn của các cây F2, bên cạnh đó sử
dụng chỉ thị phân tử SSR để nhận dạng
ADN giữa hai giống lúa bố mẹ để xác định
chỉ thị SSR cho đa hình và sử dụng chỉ thị
cho đa hình giữa hai giống lúa bố mẹ để
nhận dạng ADN ở các cây lúa F2. Dữ liệu
nhận dạng ADN và đánh giá chịu hạn của
các cây F2 được kết hợp để phân tích liên
kết xác định gen/QTL chịu hạn.
Trong quần thể F2 lấy 150 hạt đã
được trồng để kiểm tra tính chịu hạn và
thu mẫu tách để chiết ADN. Các cây lúa
bố, mẹ và F2 được bố trí thí nghiệm để
đánh giá chịu hạn vào vụ đông xuân năm
2006 với 3 lần nhắc lại theo thang điểm
của IRRI từ mức 0 đến 9.
Lá 4 tuần tuổi
của cây lúa bố, mẹ và F2 đã được thu để
tách chiết ADN theo phương pháp sử
dụng CTAB của Murray và Thompson
(1980). Nhận dạng ADN của lúa được tiến
hành theo phương pháp PCR sử dụng mồi
SSR của McCouch và ctv. (2002).
Dữ liệu về kiểu gen và kiểu hình được
sử dụng để xây dựng bản đồ liên kết di
truyền giữa các chỉ thị phân tử sử dụng
chương trình MAPMAKER/EXP ver 3.0.
Chương trình MAPMAKER/QTL ver.1.1
(Lincoln et al., 1993) được sử dụng để xác
định gen/QTL qui định tính chịu hạn ở lúa.
Những gen/QTL đã được xác định ở những
vùng có chỉ số LOD (log-likelihood) lớn
hơn 3.0. QTLs được đặt tên dựa trên đề
nghị của McCouch và ctv. (1997).
Chỉ tiêu nghiên cứu: Mức độ khô của lá
lúa hay độ cuốn lá lúa (LDS, leaf-drying
score) và thời gian (ngày) lá lúa cuốn hoàn
toàn (DLR, No. of days to leaf rolling)
trong điều kiện bị khô hạn.
III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
1. Đánh giá khả năng chịu hạn
Kết quả đánh giá khả năng chịu hạn của
các giống lúa đã cho thấy giống LC93-1
biểu hiện tính chịu hạn khá tốt, chỉ số LDS
sau 7 ngày tạo khô hạn là 1,33 và chỉ số
DLR là 18 ngày; trong khi đó giống Khang
dân 18 cho thấy chịu hạn kém với chỉ số
LDS là 6,33 và DLR là 10 ngày. Đối với
những cây lúa F2 có khả năng chịu hạn ở
các cấp độ khác nhau (Hình 1) và chỉ số
LDS từ 0,33 đến 7 và chỉ số DLR là 8,33
đến 21,67. Tần số các cây F2 với khả năng
chịu hạn được chỉ ra ở Hình 2.
Sau khi tạo hạn 7 ngày, số cây F2 có độ
cuốn lá như sau: 7 cây có mức độ cuốn lá từ
0,33 đến 1; 18 cây ở mức độ từ 1 đến 2; 27
cây ở mức độ từ 2 đến 3; 35 cây ở mức độ
từ 3 đến 4; 30 cây ở mức độ từ 4 đến 5; 17
cây ở mức độ cuốn lá từ 5 đến 6 và 14 cây
ở mức độ cuốn lá từ 6 đến 7 (Hình 2A). Số
cây F2 cuốn lá hoàn toàn sau khi tạo hạn
như sau: 9 cây cuốn lá hoàn toàn sau 8,33
đến 10 ngày; 14 cây sau 10 đến 12 ngày; 7
cây sau 12 đến 14 ngày; 38 cây sau 14 đến
16 ngày; 28 cây sau 16 đến 18 ngày; 19 cây
sau 18 đến 20 ngày và 13 cây sau 20 đến
21,67 ngày (Hình 2B). Như vậy với tần số
của các cây F2 ở cả hai trường hợp độ cuốn
lá (Hình 2A) và thời gian lá cuốn hoàn toàn
(Hình 2B) sau khi tạo khô hạn, cả hai đồ thị
trên đều có dạng phân bố hình chuông. Như
vậy kết quả thí nghiệm cho thấy khả năng
chịu hạn với cả hai chỉ số độ cuốn lá và thời
gian cuốn lá hoàn toàn là các tính trạng
định lượng do đa gen qui định.
Sau 14 ngày gây khô hạn Sau 21 ngày gây khô hạn
Hình 1. Hình ảnh cây lúa F2 sau khi bị gây khô hạn.
A: Độ cuốn của lá sau 7 ngày tạo khô hạn B: Thời gian (ngày) lá cuốn hoàn toàn
sau khi tạo khô hạn
Hình 2. Khả năng chịu hạn về chỉ số độ cuốn lá của các cây lúa F2
2. Xây dựng bản đồ liên kết
183 chỉ thị phân tử SSR phân bố trên 12
nhiễm sắc thể của lúa đã được sử dụng để
phân tích đa hình giữa 2 giống lúa LC93-1
và Khang dân 18 (Hình 2). 97 chỉ thị đã cho
đa hình giữa 2 giống lúa nói trên, chiếm tỷ lệ
khoảng 53%. 97 chỉ thị phân tử cho đa hình
giữa hai giống lúa đã được sử dụng để nhận
dạng ADN ở F2 (Hình 3) để xây dựng bản
đồ liên kết của các chỉ thị phân tử.
Bản đồ liên kết các chỉ thị phân tử SSR
phân bố trên 12 nhiễm sắc thể với tổng khoảng
cách là 993,2cM, khoảng cách trung bình giữa
các chỉ thị là 10,24cM, khoảng cách xa nhất
giữa hai chỉ thị là 29cM và gần nhất là 2,4cM
(Hình 4). Trật tự sắp xếp của các chỉ thị phân
tử SSR trên mỗi nhiễm sắc thể ở nghiên cứu
này cũng tương xứng với trật tự sắp xếp của
các chỉ thị SSR trên bản đồ liên kết ở lúa đã
được McCouch và ctv. (2002) và Chương
trình Genom lúa (RGP) công bố.
Các nhiễm sắc thể: Số 1 có số lượng
chỉ thị là 12, với khoảng cách là 100cM;
số 2 có số lượng chỉ thị là 7, với khoảng
cách là 58,3cM; số 3 có số lượng chỉ thị là
10, với khoảng cách là 127,4cM; số 4 có
số lượng chỉ thị là 9, với khoảng cách là
109,4cM; số 5 có số lượng chỉ thị là 7, với
khoảng cách là 90,3cM; số 6 có số lượng
chỉ thị là 10, với khoảng cách là 111,1cM;
số 7 có số lượng chỉ thị là 7, với khoảng
cách là 80,3cM; số 8 có số lượng chỉ thị là
6, với khoảng cách là 68,4cM; số 9 có số
lượng chỉ thị là 9, với khoảng cách là
67,7cM; số 10 có số lượng chỉ thị là 8, với
khoảng cách là 65,9cM; số 11 có số lượng
chỉ thị là 7, với khoảng cách là 76,5cM và
số 12 có số lượng chỉ thị là 5, với khoảng
cách là 37,9cM. Liên kết và trật tự sắp
xếp của các chỉ thị phân tử SSR được thể
hiện chi tiết trong bản đồ liên kết (Hình 4).
Số cây F2 Số cây F2
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Hình 3. )hận dạng AD) của giống lúa
Dự chiêm và CR203 bằng các cặp mồi SSR
khác nhau. Các cột 1, 3, 5, 7, 9, 11 là
giống Khang dân; các cột 2, 4, 6, 8, 10 và
12 là giống LC93-1.
Hình 4. )hận dạng AD) của những cây lúa
bố mẹ và F2 với mồi SSR cho đa hình giữa
hai giống lúa bố mẹ. Cột 1 là giống lúa
LC93-1, cột 2 là giống lúa Khang dân, các
cột còn lại từ 1 đến 13 là những cây lúa F2.
3. Phân tích xác định QTL
Kết quả phân tích đã xác định được 12
QTL liên quan đến độ cuốn lá và thời gian
lá cuốn hoàn toàn (Bảng 1 & 2, Hình 4). 5
QTL có chỉ số LOD lớn hơn 3 liên quan
đến độ cuốn của lá (Bảng 1). Các thông số:
Giá trị LOD, phần trăm tác động lên kiểu
hình, vị trí nhiễm sắc thể và chỉ thị SSR
biên (liên kết gần) của các QTL được thể
hiện trong Bảng 1. Các QTL được đặt tên:
qDroughtLDS-1-DT, qDroughtLDS-3-DT,
qDroughtLDS-8-DT, qDroughtLDS-9-DT,
qDroughtLDS-10-DT. Các QTL có chỉ số
LOD từ 3,36 đến 4,35 và đóng góp của
QTL lên khả năng chịu hạn (kiểu hình) từ
10,1% đến 12,7%. Trong số các QTL đã
được phát hiện, qDroughtLDS-9-DT có chỉ
số LOD là 4,14 và có phần trăm đóng góp
tới kiểu hình chiếm 12,9%, các chỉ số này
lớn hơn các QTL khác, như vậy nó có thể
được xem là QTL chính qui định tính chịu
hạn. Trong số 5 QTL: qDroughtLDS-1-DT
và qDroughtLDS-8-DT có allen làm tăng
khả năng chịu hạn đến từ giống lúa LC93-1
và các QTL còn lại có allen đến từ giống
lúa Khang dân 18 (Bảng 1).
7 QTL đã được phát hiện liên quan đến số
ngày cây lúa F2 cuốn lá hoàn toàn sau khi bị
tạo khô hạn (Bảng 2). Các QTL được đặt tên
là: qDroughtDLR-1-DT, qDroughtDLR-1-DT,
qDroughtDLR-3-DT, qDroughtDLR-6-DT,
qDroughtDLR-8-DT, qDroughtDLR-9-DT
và qDroughtDLR-10-DT cùng với chỉ số liên
quan được chỉ ra ở bảng 2. Trong số 7 QTL,
có 2 QTL nằm trên nhiễm sắc thể số 1, các
QTL còn lại nằm trên nhiễm săc thể số 3, 6,
8, 9 và 10. Chỉ có qDroughtDLR-8-DT có
giá trị AE là dương, như vậy allen tăng
thêm khả năng chịu hạn đến từ giống
LC93-1, các QTL còn lại đều có giá trị âm
và allen đến từ giống lúa Khang dân; như
vậy mặc dù có khả năng chịu hạn kém hơn
giống LC93-1 nhưng trong quần thể F2 có
sự tương tác allen thì các allen đến từ
giống Khang dân đã làm tăng khả năng
chịu hạn. qDroughtDLR-10-DT được phát
hiện trên nhiễm sắc thể số 9 có các chỉ số
gồm: AE, LOD và Var. exp. lớn nhất
tương ứng là: - 0,058; 6,13 và 17,4; đây là
QTL chính liên quan đến thời gian chịu
hạn (DLR).
Bảng 1. Các QTL được phát hiện liên quan đến độ cuốn lá (LDS)
QTL Chỉ thị SSR biên Nhiễm sắc thể AE
a
LOD Var. exp. (%)
b
qDroughtLDS-1-DT RM01201 - RM08148 1 0,008 3,36 10,1
qDroughtLDS-3-DT RM03441 - RM05140 3 - 0,017 3,41 11,9
qDroughtLDS-8-DT RM04955 - RM07013 8 0,030 3,59 11,0
qDroughtLDS-9-DT RM01896 - RM05657 9 - 0,154 4,14 12,9
qDroughtLDS-10-DT RM05352 - RM03123 10 - 0,087 4,35 12,7
a
Hiệu quả di truyền tăng thêm do sự tương tác giữa 2 allen của LC93-1 và Khang dân.
b
Đóng góp của QTL lên khả năng chịu hạn.
Bảng 2. Các QTL được phát hiện liên quan ngày cuốn lá hoàn toàn (DLR)
QTL Chỉ thị SSR biên Nhiễm sắc thể AE
a
LOD Var. exp. (%)
b
qDroughtDLR-1-DT RM01201 - RM08148 1 - 0,005 3,53 10,7
qDroughtDLR-1-DT RM03642 - RM03304 1 - 0,004 3,41 10,3
qDroughtDLR-3-DT RM03441 - RM05140 3 - 0,015 4,25 15,5
qDroughtDLR-6-DT RM06782 - RM06926 6 - 0,045 4,01 12,5
qDroughtDLR-8-DT RM01789 - RM04955 8 0,009 3,45 10,4
qDroughtDLR-9-DT RM04692 - RM06460 9 - 0,058 6,13 17,4
qDroughtDLR-10-DT RM05352 - RM03123 10 - 0,032 5,08 15,7
a
Hiệu quả di truyền tăng thêm do sự tương tác giữa 2 allen của LC93-1 và Khang dân.
b
Đóng góp của QTL lên khả năng chịu hạn.
Phân tích xác định QTL với các chỉ
số: Độ cuốn lá và thời gian lá cuốn hoàn
toàn đã xác định được 12 QTL trên các
nhiễm sắc thể số: 1, 3, 6, 8, 9 và 10. Chỉ
có nhiễm sắc thể số 6 có một QTL về
thời gian lá cuốn hoàn toàn, các nhiễm
sắc thể: 3, 8, 9 và 10 mỗi nhiễm sắc thể
có hai QTL một liên quan đến độ cuốn lá
và một liên quan đến ngày lá cuốn hoàn
toàn. Nhiễm sắc thể số 1 có 3 QTL. Các
cặp QTL về độ cuốn lá và thời gian lá
cuốn hoàn toàn: qDroughtLDS-1-DT và
qDroughtDLR-1-DT; qDroughtLDS-3-DT
và qDroughtDLR-3-DT; qDroughtLDS-10-DT
và qDroughtDLR-10-DT có cùng các chỉ
thị biên là: RM01201 - RM08148;
RM03441 - RM05140; RM05352 - RM03123,
như vậy các cặp QTL này có thể cùng vị trí tác
động lên khả năng chịu hạn về thời gian cuốn
lá hoàn toàn và độ cuốn lá. Hai QTL nằm trên
nhiễm sắc thể số 9 là: qDroughtLDS-9-DT (độ
cuốn lá) và qDroughtDLR-9-DT (thời gian
cuốn lá) có các chỉ số LOD và Var. exp. lớn
nhất và là hai QTL chính.