MỞ ĐẦ U
Cho tới nay đã có khoảng 2000 loại virus hại thực vật được phát hiện, trong đó có nhiều loài gây ảnh hưởng nghiêm trọng tới năng suất và chất lượng cây trồng. Để hạ n chế sự lây lan củ a virus thự c vậ t , nhữ ng biệ n phá p truyề n thố ng đang đượ c , phun áp dụng hi ện nay như loạ i bỏ nhữ ng cây bị bệ nh ngay khi mớ i phá t hiệ n thuố c diệ t môi giớ i truyề n bệ nh…t ỏ ra kém hiệ u quả l ại đò i hỏ i nhiề u thờ i gian ,
công sứ c và ả nh hưở ng xấ u tớ i môi trườ ng. Việ c tì m ra cá c biệ n pháp để ngăn chặn sự phá t triể n và lây lan củ a virus gây b ệnh trên thự c vậ t đang là mộ t vấ n đề đượ c quan tâm nghiên cứu. Sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học trong thời gian gần đây thúc đẩy nhiều nghiên cứu theo hướng tạo giống cây trồng có khả năng kháng virus gây hại bằng công nghệ gen, góp phần phát triển một xu thế mới trong công cuộc phòng chống bệnh hại thực vật.
Cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học, đã có nhiề u ứ ng dụ ng sinh họ c phân tử trong chọ n tạ o giố ng cây trồ ng khá ng virus , trong đó , công nghệ RNA interference (RNAi) tỏ ra là một giải pháp hữu hiệu nhất thông qua việc sử dụng
các vật liệu di truyền từ virus gây bệnh chuyển vào cây trồng tạo cây chuyển gen kháng chính virus đó với hiệu quả có thể lên tới 80-95%.
Ở Việt Nam gần đây đã có một số nghiên cứu theo hướng ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo giống cây trồng chuyển gen chống lại các bệnh do virus gây ra. Phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viện Công nghệ sinh học là nhóm nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam đã thành công trong việc ứng dụng kỹ thuật RNAi trên mô hình cây thuố c lá chuyển gen kháng virus khảm dưa chuột (CMV), kháng virus khảm thuốc lá (TMV) hoặc kháng đồng thời cả 2 loại virus trên. Nhằm tiếp tục phân tích các đặc tính di truyền của gen chuyển ở thế hệ sau, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề
1
tài: “Nghiên cứ u cá c phương phá p phân tí ch cây thuố c lá chuyể n gen khá ng bệ nh khả m lá thế hệ T1”
Chƣơng 1. TỔ NG QUAN TÀ I LIỆ U
1.1. Bệ nh virus thƣ̣ c vậ t
1.1.1. Giớ i thiệ u chung về bệ nh virus hạ i thƣ̣ c vậ t
Virus thực vật được phát hiện vào cuối thế kỉ 19 và đến đầu thế kỉ 20 có rất nhiều virus gây bệnh cho thực vật lần lượt được phát hiện như virus khảm thuốc lá, virus thoái hóa khoai tây, virus hại cà chua,… Virus thực vật gây hại nặng nề tới năng suất và chất lượng nông sản, mức độ thiệt hại có khi lên tới 100%. Theo ước tính thiệt hại hàng năm do bệnh virus gây ra trên thế giới vào khoảng 70 tỉ USD 2002). (Nguyễ n Văn Tỵ ,
Cho đến nay, với sự phát triển của sinh học và sự trợ giúp của trang thiết bị, phương tiện hiện đại, trên 4 ngàn loại virus đã được phát hiện, trong đó có hơn 2000 loài là virus hại thực vật.
Virus thự c vậ t là nhữ ng vi sinh vậ t vô cù ng nhỏ bé và có nhữ n g đặ c đi ểm :
(PGS.TS Vũ Triệ u Mẫ n và PGS.TS Lê Lương Tề , 2002)
Virus có cấ u tạ o rấ t đơn giả n : có hai phần chính là lõi axit nucleic và vỏ protein
Thông thườ ng virus thự c vậ t có vậ t chấ t di truyề n là RNA , mộ t số í t cò n lạ i c ó
vậ t chấ t di truyề n là DNA
Virus là vi sinh vậ t kí sinh ở mứ c độ tế bà o . Virus thự c vậ t có thể nhiễ m bệ nh
cho mộ t hay nhiề u loà i cây , và mỗi loài cây có thể nhiễm một hay nhiều loài virus
Virus thực vật cũng như virus động vật, sau khi xâm nhiễm vào tế bào chủ
chúng bắt đầu tác động đến sự trao đổi chất của tế bào, virus sử dụng vật chất của tế bào để tạo thành một số virus con mới. Do vậy cơ thể thực vật bị kiệt quệ dần dần, thoái hóa và suy tàn có khi bị chết. Khoảng thời gian từ lúc virus bắt đầu xâm nhiễm đến khi cây thoái hóa và chết phụ thuộc vào đặc điểm gây bệnh của các loài khác nhau và phụ thuộc vào từng loại cây cũng như sức chống chịu
2
của từng cây.
Virus không thể phòng chống, tiêu diệt bằng xử lí các chất hóa học như những
bệnh vi khuẩn, nấm và sâu bọ. Cách duy nhất để loại bỏ virus là phải loại bỏ những cây trồng bị bệnh.
1.1.2. Những thiệt hại của bệnh virus ở thực vật
Do virus có cấu trúc di truyền đơn giản, nên khả năng nhân lên và lây lan trong tế bào vật chủ rất nhanh chóng và gây ra biểu hiện bệnh trong thời gian ngắn. Tác hại lớn nhất của virus là làm cho cây bị thoái hoá, giảm sức sống, dần tàn lụi.
Thiệt hại quan trọng thứ hai của virus là ảnh hưởng tới phẩm chất của các sản phẩm nông nghiệp. Sản phẩm từ cây bị nhiễm virus thường có chất lượng kém xa so với cây trồng bình thường. Hạt lúa bị bệnh vàng lụi thường bị lép không cho thu hoạch, trong trường hợp được thu hoạch hạt thường rất nhỏ và hạt gạo bị đen, khi ăn có vị đắng. Khoai tây bị virus gây hại làm cho cây cằn cỗi, lá khảm loang lổ, củ khoai nhỏ, hàm lượng tinh bột và các chất dinh dưỡng đều thấp. Citrus tristeza virus hại cam quít rất nặng tại vùng bờ biển Địa Trung Hải, Trung Mỹ và Đông
Nam Á... Bệnh làm cho quả cam chín ép và rụng sớm, quả còn non đã úa vàng vỏ, nước cam nhạt không mùi vị.
Việt Nam có chiều dài gần 2.000 km, khí hậu nhiệt đới gió mùa do vậy cây trồng, thảm thực vật Việt Nam và hệ sinh vật ở nước ta rất phong phú. Đây là điều kiện để bệnh virus ở Việt Nam đa dạng về chủng loại lại dễ lây lan, gây thiệt hại nghiêm trọng tới sản xuất. Gây hại nghiêm trọng nhất có thể kể tới các virus gây bệnh trên cây lúa (bảng 1.1). Trong lịch sử trồng lúa ở nước ta đã xảy ra rất nhiều trận dịch lớn vào các năm 1910, 1920, 1940 -1945, 1964 -1969, 2006-2010
3
đã tiêu huỷ mấy chục vạn ha lúa, tốc độ lây lan rất nhanh. Cây lúa bị bệnh lúc đầu lá sẫm màu, sau đó cây lùn thấp lá xoè ngang, thâm lâu rễ đen, cây chết lụi nhanh chóng. Bệnh có thể xuất hiện từ một vài m2 sau đó lây lan ra hàng trăm, hàng nghìn ha. Làm cánh đồng lúa từ màu xanh biến thành màu nâu và chết lụi trong vòng 10 -15 ngày sau khi phát hiện bệnh. Gạo thu được từ lúa bị bệnh thường có màu sẫm, đắng không ăn được. Do đó, thiệt hại của bệnh có thể tính là 100% (1964 - 1968); đặc biệt dịch bệnh lúa lùn xoắn lá, lúa cỏ, lúa vàng lùn đã
phá hoại ở miền tây Nam bộ trên diện tích trên 500.000 ha (năm 2006 - 2007). Gần đây (2009-2010) virus gây bệnh lùn sọc đen trên lúa cũng đã xuất hiện ở một số tỉnh phía Bắc như Nam Định, Thái Bình,…(Bệ nh cây chuyên khoa - Vũ Triệu Mân ). Một số virus gây bệnh khác trên cây cà
chua, khoai tây, lạc, đậu tương (bảng 1.1),… cũng có thể làm ảnh hưởng đến 80% năng suấ t cây trồng.
Bảng 1.1. Một số loại virus gây bệnh trên cây lương thự c và hoa mà u
Cây chủ Bệnh Virus gây hại
Lúa Bệ nh và ng lá tungro Rice Tungro Sperical virus-RTSV
Bệ nh lú a cỏ Rice Grassy Stunt Virus- RGSV
Bệ nh lù n xoăn lá Rice Ragged Stunt Virus- RRSV
Bệ nh sọ c đen lù n Rice Black Streaked Drap Virus- RBSDV
Ngô Bệ nh khả m lá ngô Maize Mosaic Virus- MMV
Bệ nh khả m lù n ngô Maize Dawrf Mosaic Virus- MDMV
Cà chua Bệ nh xoăn và ng lá cà chua Tomato Yellow Leafcurl Virus- TYLV
Bệ nh đố m hé o cà chua Tomato Spotted Wilt Virus- TSWV
Bệ nh khả m lá cà chua Tomato Mosaic Virus- ToMV
Bệ nh virus Y khoai tây Potato Virus Y- PVY
Khoai tây Bệ nh virus A khoai tây Potato Virus A- PVA
Bệ nh virus X khoai tây Potato Virus X- PVX
Bệ nh virus S khoai tây Potato Virus S- PVS
Bệ nh virus M khoai tây Potato Virus M-PVM
Bệ nh cuố n lá khoai tây Potato Leafroll Virus- PLRV
Bệ nh khả m Aucuba Potato Aucuba Mosaic Virus- PAMV
Bệ nh khả m dưa chuộ t Cucumber Mosaic Virus- CMV
4
Dưa chuộ t
2.1.3 Biệ n phá p phò ng chố ng
Trên thế giới, nhiều biện pháp phòng trừ bệnh virus hại thực vật đã được áp dụng như loại bỏ nguồn bệnh, tiêu diệt côn trùng trung gian, diệt cỏ dại, luân canh cây trồng, dùng giống sạch bệnh hoặc giống chống bệnh, chịu bệnh. Dựa vào đặc điểm của từng loại virus gây hại và đặc tính cây trồng, người ta đã đề ra những
biện pháp phòng trừ cho từng nhóm bệnh theo khả năng truyền lan và sự tồn tại của nguồn bệnh.
2.1.3.1 Sử dụng giống cây trồ ng có khả năng kháng b ệnh virus Phương pháp này đem lại hiệu quả cao, không gây ô nhiễm môi trường và tạo được cây sạch bệnh. Tuy nhiên biệ n phá p g ặp nhiều hạn chế về số lượng giống kháng bệnh cũng như nguồn vật liệu di truyền kháng virus phục vụ cho cho công tác lai tạo giống. Hơn nữa, năng suất và chất lượng của giống kháng cũng là điều đáng lưu tâm vì rất khó tích hợp được nhiều phẩm chất trong một giống cây trồng.
2.1.3.2 Sử dụng hạ t, giống cây trồ ng sạch bệnh
Sử dụng nguồn vật liệu giống sạch bệnh được xem là biện pháp quan trọng nhất để hạn chế bệnh virus ở nhiều loại cây trồng. Có thể tạo nguồn hạt giống, củ, cây giống sạch bệnh bằng những biện pháp như xử lý củ/hạt bằng nhiệt hoặc hóa chất hoặc nhân giống in vitro tạo củ hoặc cây con sạch bệnh. Nhược điểm của biện pháp này là cá c loạ i cây trồ ng có thể bị nhiễ m virus trong quá trì nh canh tá c trên đồ ng ruộ ng.
2.1.3.3 Biệ n phá p canh tá c Luân canh và xen canh có thể giảm bớt thiệt hại do sâu bệnh gây ra so với
5
trồng thuần một loại cây trồng . Mặ t hạ n chế củ a biệ n phá p nà y là rấ t khó chọ n đượ c hệ thố ng luân canh và xen canh vừ a có hiệ u quả đố i vớ i mộ t số bệ nh quan trọng mà vẫn đem lại lợi ích cao về mặt kinh tế . Mùa vụ thích hợp giúp giảm thiệt hại do sâu bệnh gây ra mà còn giúp gia tăng năng suất rất đáng kể . Gieo trồng tránh mùa phát triển của côn trùng trung gian truyền bệnh (còn gọi là né bệnh) có thể hạn chế được một phần thiệt hại do virus gây ra.
2.1.3.4 Kiểm soát côn trùng trung gian truyền bệnh và loại bỏ các loại ký chủ trung gian nhƣ cỏ dại ,… Hiện nay phổ biến nhất là dung các loại thuốc trừ sâu và diệt cỏ để hạn chế các trung gian này. Tuy nhiên, nhiề u loạ i virus như TMV lây truyề n qua đườ ng cơ giớ i, virus lây lan trự c tiế p qua khí khổ ng hoặ c vế t thương
trên vậ t chủ . Hơn nữ a, việ c lạ m dụ ng thuố c trừ sâu có thể gây ô nhiễ m môi trườ ng, gây nguy hiể m cho nông dân và ngườ i tiêu dù ng . Bên cạ nh đó , virus có thể đượ c lây nhiễ m vớ i số lượ ng rấ t í t môi giớ i truyề n bệ nh , ví dụ: chỉ cần 1 con rầ y nâu / cây lú a đã có thể truyề n virus lù n lú a cỏ (RGSV).
2.1.3.5 Biện pháp công nghệ sinh học: Trong 15 năm qua một số virus đã có thể kiểm soát được thông qua biện pháp tạo cây trồng chuyển gen mang các gen hoặc đoạn gen có nguồn gốc từ chính các virus gây bệnh (Reddy el al., 2009). Các cấu trúc gen có nguồn gốc từ virus gây bệnh được sử dụng chuyển vào cây trồng để tạo tính kháng có thể là các loại khác nhau như: các cấu trúc của vius theo chiều
xuôi (sense) hay chiều ngược (antisense) (Boogaart et al., 1998), các cấu trúc dạng kẹp tóc (inverted repeats/hairpin) (Yin et al., 2005) và các miRNA nhân tạo có đích là các trình tự gen của virus gây bệnh (Niu et la., 2006; Qu và Fang, 2008). Thành công trong việc ứng dụng công nghệ sinh học trong tạo giống cây trồng kháng bệnh virus được đánh dấu bởi công bố của Beachy và cộng sự năm 1986 khi những cây thuốc lá chuyển gen mã hóa protein vỏ của TMV (cấu trúc dạng sense) đã biểu hiện tính kháng với virus này (Beachy, 1990; Register và Nelson, 1992). Sau đó Beachy và cộng sự đã phát triển những thí nghiệm của mình thành phương
pháp CP tạo cây trồng kháng virus. Phương pháp này đã được áp dụng tạo những dòng cây chuyển gen kháng nhiều loại virus gây bệnh trên thực vật hai lá mầm và sau đó là thực vật một lá mầm (xem tổng quan của Hull và Davies, 1992). Tuy vậy, các cây chuyển gen này chỉ kháng được duy nhất một chủng virus mang gen mã hóa protein vỏ mà nó chuyển vào. Điều này gây trở ngại trong việc phát triển các giống cây trồng kháng virus dựa trên phương pháp CP do độ đa dạng của virus thường khá cao (Scholthof et al., 1993). Tương tự như phương pháp CP, biểu hiện
6
gen mã hóa cho enzyme liên quan tới quá trình tự sao chép hoặc sao mã (các replicase) cũng có thể tạo các cây chuyển gen kháng virus. Cũng nghiên cứu trên
đối tượng TMV, Carr và cộng sự nhận thấy những dòng thuốc lá mang gen mã hóa cho replicase có khối lượng phân tử là 183kDa hoặc 54kDa có khả năng kháng TMV tốt hơn những dòng cây chuyển gen CP. Biểu hiện replicase của virus khoai tây X (potato virus X: PVX) hay virus khảm dưa chuột (cucumber mosaic virus:
CMV) chứng minh hiệu quả bảo vệ thực vật của phương pháp này (Braun và Hemenway, 1992; Anderson và cộng sự, 1992). Tuy vậy, tương tự như phương pháp CP, phương pháp bảo vệ qua trung gian gen replicase cũng chỉ có tác dụng trên từng chủng virus. Hơn nữa, gen mã hóa cho các replicase thường rất lớn, gây trở ngại khi biểu hiện trên thực vật. Nhằm khắc phục những hạn chế của cấu trúc “dạng sense”, các cấu trúc dạng antisense mang một đoạn DNA có trình tự bổ sung với RNA của virus có thể ức chế sự phiên mã với những trình tự RNA tương đồng đã được nghiên cứu và phát triển. Nhiều dòng thuốc lá, khoai tây, cà chua,…
kháng virus đã được tạo ra dựa trên kỹ thuật này.Việc sử dụng những đoạn DNA thay vì cả đoạn gen mã hóa đã làm những dòng cây chuyển gen có khả năng kháng với nhiều dòng virus thay vì chỉ một vài dòng nhất định (Boogart et al, 1998).
Cho tới những năm cuối thế kỷ 20, cấu trúc dạng kẹp tóc (ihpRNA) hay kỹ thuật RNAi được xem là một kỹ thuật hiện đại và hữu hiệu nhất trong việc chống lại các bệnh do virus gây ra ở thực vật. Năm 2004, Baulcombe đã công bố cơ chế hoạt động của siRNA và coi đó là một cơ chế quan trọng trong việc kháng lại virus ở thực vật. Các bước chính trong kỹ thuật này bao gồm: (1) thiết kế các vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi, (2) biến nạp vector chuyển mang cấu trúc RNAi
vào cây thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens làm bất hoạt các mRNA của virus gây bệnh, (3) sàng lọc các cây chuyển gen mang cấu trúc RNAi và kiểm tra tính kháng virus của các cây chuyển gen (Tenllado et al., 2004). Tính hiệu quả của kỹ thuật RNAi trong việc tạo cây trồng chuyển gen mã hoá protein của virus (gen mã hóa protein vỏ CP, enzyme phiên mã RdRp,…) có khả năng kháng lại chính virus đó đã được chứng minh bằng thực tế trong những nghiên cứu tạo cây trồng kháng các loại virus khác nhau như: Potato virus Y PVY (Waterhouse et al.,
7
1998; Smith et al., 2000), cucumber mosaic virus CMV (Kalantidis et al., 2002), Plum pox potyvirus PPV (di Nicola-Negri et al., 2005), Tobacco mosaic virus
TMV và Potato virus Y PVY (Sun et al., 2005), , Tomato yellow leaf curl virus TYLCV (Zrachya et al., 2007)Rice tungro bacilliform virus RTBV (Tyagi et al., 2008) African cassava mosaic virus ACMV (Vanderschuren et al., 2009 )… Trong những nghiên cứu này, cấu trúc RNAi có chứa trình tự gen của virus lặp lại đảo
chiều thường được sử dụng để chuyển vào cây và sẽ được biểu hiện thành RNA sợi đôi dạng kẹp tóc (hairpin RNA, hpRNA) trong cây chuyển gen từ đó kích thích cơ chế RNAi hoạt động khi có sự xâm nhập của virus vào cây. Người ta đã nhận thấy rằng khi vùng đệm của hpRNA được lặp lại với một trình tự intron (ihpRNA) thì kết quả ihpRNA tạo ra sự bất hoạt gen là cao nhất (Smith et al., 2000; Wesley et al., 2001). Năm 2007, Bonfim và cộng sự đã tạo ra được một dòng cây đậu chuyển gen kháng virus BGMV (Bean golden mosaic virus) với tính kháng lên đến 93%. Cũng năm này, Shinichiro Kamachi và cộng sự đã công bố kết quả tạo ra được một
số dòng thuốc lá chuyển gen CP trong cấu trúc ihpRNA có khả năng kháng cao với virus cucumber green mottle mosaic virus CGMMV đến thế hệ T2 (12/14 số cây kiểm tra) và những siRNA đã được phát hiện trong những dòng cây chuyển gen này. Nói chung, hầu hết các cây chuyển gen làm chậm sự tích lũy virus và làm chậm hoặc giảm nhẹ các triệu chứng bệnh (Gottula et al, 2009)
Cho đến nay đã có các loại cây trồng chuyển gen kháng bệnh virus được công nhận và trồng thương mại như: Đu đủ chuyển gen kháng bệnh đốm vòng (papaya ringspot virus, PRSV) đã được công nhận và trồng ở Mỹ, Trung Quốc, Philippine; Bí đao chuyển gen kháng ba loại vi rút Cucumber mosaic virus,
Watermelon mosaic virus, Zucchini yellow mosaic virus, đã được công nhận và trồng ở Mỹ; Ớt và cà chua chuyển gen kháng Cucumber mosaic virus, được công nhận và trồng ở Trung Quốc … Ngoài ra rất nhiều các loại cây trồng chuyển gen kháng bệnh virus khác đang trong giai đoạn khảo nghiệm để được công nhận là giống cây trồng thương mại như: Sắn chuyển gen kháng African cassava mosaic virus (Begomovirus); Ngô chuyển gen kháng Maize steak virus (Mastrevirus); Khoai tây chuyển gen kháng đồng thời 3 loại virus Potato virus X (Potexvirus),
8
Potato virus Y (Potyvirus), Potato leafroll virus (Polerovirus); Lúa chuyển gen kháng Rice Tungro viruses (Tungrovirus); Khoai lang chuyển gen kháng Sweet
potato feathery mottle virus (Potyvirus)…. (Reddy et al, 2009).
2.1.4. RNAi và cơ chế kháng bệnh bằng phƣơng pháp chuyển gen virus
RNAi là một cơ chế căn bản để kiểm soát chuỗi thông tin di truyền hay cách vô hiệu hoá hoạt động của các gen xác định do hai nhà khoa học Andrew Z. Fire và Craig C. Mello khám phá ra và công bố trên tạp chí Nature vào ngày 19/12/1998
RNAi (RNA interference) được coi như một phương thức miễn dịch tự nhiên giúp sinh vật chống lại sự xâm nhập của virus RNA bằng cách phân huỷ các trình tự nucleotide tương đồng của chúng. Nó làm trung gian kháng lại cả acid nucleic ngoại bào và nội bào, cũng nhờ điều khiển sự biểu hiện gen mã hóa protein. Nó được thực hiện khi có sự xuất hiện của phân tử RNA mạch kép trong cơ thể sinh vật gây nên ức chế sự biểu hiện gen của một loại trình tự đặc hiệu.
Hình 1.1: Cơ chế gây bất hoạt gen của RNAi
Cơ chế RNAi được bắt đầu bằng việc phân cắt phân tử RNA chuỗi kép (dsRNA) bởi enzyme Dicer - một trong những enzyme thuộc họ RNase III, tạo thành các phân tử RNA ức chế nhỏ (siRNA) có kích thước khoảng 21 - 26 nucleotide. Các siRNA này được giải xoắn và một mạch gắn kết với một phức hợp protein một cách chọn lọc gọi là phức hợp cảm ứng sự bất hoạt RNA (RISC –
9
RNA Induced Silencing Complex). Argonaute (protein Argonaute) trong RISC có
chứa RNase-H hoạt động nhờ một endonuclease sẽ tách siRNA thành những chuỗi RNA đơn, trong đó chỉ có một chuỗi đơn RNA có đầu 5‟ có lực bắt cặp base (base pairing) nhỏ nhất được chọn để tiếp tục đi vào phức hệ RISC. Sau đó, RISC sẽ thu nhận các phân tử phiên mã mRNA nội sinh của tế bào có trình tự tương đồng với
trình tự của chuỗi siRNA đang có mặt trong phức hệ bằng cách bắt cặp với các base theo nguyên tắc bổ sung. Khi đã được nhận diện các mRNA nhanh chóng bị cắt đứt ở khoảng giữa của chuỗi xoắn kép siRNA-mRNA và bị tiêu hủy bởi các RNA nuclease (Helicase) có trong RISC. Sợi RNA bị phân cắt, tiếp tục hình thành các siRNA. Quá trình tiếp diễn liên tục nhờ vậy sẽ phân hủy các bản mã sao hình thành, kết quả là ức chế biểu hiện của gen mong muốn.
2.1.5. Mộ t số thành tựu của cây trồng chuyển gen kháng virus ở Việt Nam
Virus là nguyên nhân gây hạ i tớ i nhiề u loạ i cây trồ ng trên thế giớ i cũ ng như ở Việ t Nam. Hầ u hế t cá c bệ nh thự c vậ t do virus gây ra cho tớ i nay chưa có thuố c đặ c trị, do vậy tạo giống cây trồng kháng bệnh virus là mục tiêu nhiều nghiên cứu tại nướ c ta. Từ năm 1999, phòng Công nghệ tế bào thực vật, việ n Công nghệ sinh họ c
phố i hợ p vớ i 5 nướ c trong khu vự c ASEAN tham gia và o chương trì nh nghiên cứ u phát triển cây đu đủ chuyển gen kháng virus đốm vòng (Papaya ringspot virus : PRSV) do tổ chứ c ISAAA (International Service for Acquisition of Agri -biotech Application) tài trợ. Trong khuôn khổ đề tà i nhó m thự c hiệ n đã phân lậ p đượ c g en CP củ a mộ t số chủ ng virus tạ i miề n Bắ c và Nam Trung Bộ . Gen CP đượ c sử dụ ng để thiết kế các cấu trúc chuyển gen vào cây đu đủ nhằm tạo cây chuyển gen kháng virus đố m vò ng . Mộ t số dò ng cây đu đủ chuyể n gen đã biể u hiệ n tính kháng virus sau khi thử nhiễ m bệ nh nhân tạ o (Lâm Đạ i Nhân, 2000; Lê Trầ n Bì nh, 2008)
Thờ i gian gần đây đã có một số nghiên cứu theo hướng ứng dụng kỹ thuật
10
RNAi trong tạo giống cây trồng chuyển gen chống lại các bệnh do virus gây ra. Phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viện Công nghệ sinh học do GS. Lê Trần Bình và TS. Chu Hoàng Hà đứng đầu là nhóm nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam đã thành . công trong việc ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo cây chuyển gen kháng virus tài cấp Viện KH &CN Việ t Nam đượ c tiế n hà nh Một trong những kết quả của đề
trong 2 năm 2007-2008: “Nghiên cứ u ứ ng dụ ng kỹ thuậ t RNAi trong tạ o giố ng cây trồ ng chuyể n gen khá ng bệ nh virus” là đã tạo được các cây thuốc lá chuyển gen kháng virus khảm dưa chuột (CMV), kháng virus khảm thuốc lá (TMV) và kháng đồng thời cả 2 loại virus trên.
Hình 1.2: Dòng thuốc lá T-CMV-49 biể u hiệ n khá ng bệ nh hoà n toà n và cây đố i
chứ ng WT2-1 sau 3 lầ n lây nhiễ m
Tiế p đó , đề tài cấp nhà nước “Nghiên cứu tạo giống cây ăn quả khá ng bệ nh virus phổ rộ ng bằ ng chuyể n gen đa đoạ n” (KC.04.03/06-10) đã thiế t kế thà nh công 2 đoạ n gen nhân tạ o mang đa đoạ n gen CP , Nib và HC -pro củ a PRSV gây bệnh đốm vòng trên cây đu đủ và 2 đoạ n gen đa đoạ n RdRp -CP-p20-p23 của virus tàn lụi (Citrus tristeza virus, CTV) và thiết kế thành công những cấu trúc RNAi mang các gen đa đoạn này . Thử nghiệ m tí nh khá ng vớ i cá c dò ng đu đủ và cam chuyể n
11
gen mang cấ u trúc RNAi trên cho thấy sự có mặt của vir us gây bệ nh trên cá c dò ng cây chuyể n gen nhưng không thấ y cây có biể u hiệ n bệ nh (Chu Hoà ng Hà , 2010).
Hình 1.3: Dòng đu đủ biể u hiệ n khá ng bệ nh hoà n toà n(hình A) và cây đối
chứ ng (hình B) sau 2 tháng lây nhiễm Đây là cơ sở quan trọng chứng tỏ khả năng làm chủ công nghệ RNAi của các nhà khoa họ c Việ t Nam và mở ra khả năng ứ ng dụ ng công nghệ RNAi đố i vớ i cá c đố i tượ ng cây trồ ng khá c.
2.2. Cây thuố c lá - mô hì nh nghiên cƣ́ u tạ o cây trồ ng chuyể n gen khá ng virus
2.2.1 Giớ i thiệ u chung về cây thuố c lá
Cây thuốc lá có tên khoa học là: Nicotiana sp; thuộc họ (Family) : Solanaceae
(họ cà), chi (Genus): Nicotiana, loài (Species): Nicotiana tabacum L.
Các nhà khoa học đã phân chia Nicotiana thành 3 chi phụ , 14 phân chi và 65 loài. Trong số 65 loài là cây bản địa Bắc và Nam Mỹ , 15 loài bản địa Australia trong đó loài N. tabacum thuộ c phân chi Genuinae là đượ c gieo trồ ng thương mạ i trên khắ p thế giớ i. Ở Việt Nam, cây thuốc lá đem lại hiệu quả kinh tế cao cho nông dân và thu nhập quốc gia. Theo thống kê của Tổng công ty thuốc lá Việt Nam
12
(Vinataba) trong 3 năm (2006-2008) tổng doanh thu đạt 47.656 tỷ đồng, nộp ngân sách nhà nước được 9.653 tỷ đồng, kim ngạch xuất khẩu đạt 192,136 triệu USD, việc làm của người lao động được đảm bảo, đời sống từng bước được nâng cao với thu nhập bình quân đầu người tăng 15,59%/ năm. Thuốc lá có giá trị kinh tế cao, ngoài việc tiêu dùng trong nước nó còn là mặt hàng xuất khẩu có giá trị. Ngoài ra,
cây thuố c lá cò n đượ c coi là mô hì nh để tiế n hà nh nhiề u nghiên cứ u sinh họ c cơ bản về chức năng , vai trò cũ ng như cơ chế hoạ t độ ng củ a cá c gen cũ ng như đượ c ứng dụng như sử dụ ng là m mô hì nh thử nghiệ m và phá t triể n nhữ ng nghiên cứ u biể u hiệ n cá c protein tá i tổ hợ p có giá trị.
2.2.2. Tình hình bệnh virus hại thuốc lá
Hiệ n nay, bệ nh virus là mộ t trong nhữ ng nguyên nhân làm gi ảm năng suấ t và chấ t lượ ng cây thu ốc lá nguyên liệu. Trong đó , virus khảm thuốc lá (TMV) và virus khảm dưa chuột (CMV) là hai virus gây bệnh phổ biến và nghiêm trọng nhất (Nguyễ n Văn Chí n và Nguyễ n Ngọ c Bí ch, Tổ ng công ty thuố c lá Việ t Nam).
Bệ nh khả m lá xuấ t hiệ n khá sớ m ngay sau khi cây phụ c hồ i ho àn toàn với tỷ lệ thấ p (2,3-5,2%) và tăng dần hoặc tăng nhanh sau 20-50 ngày tùy theo vùng , từ 18,5-26,5% thậ m chí lên tớ i 100% như ở xã Lâu Thượ ng, tỉnh Thái Nguyên; trong u là K 326. Thiệ t hạ i do đó giố ng thuố c lá rấ t mẫ n cả m vớ i TMV và CMV chủ yế (Nguyễ n Văn Chí n và virus gây ra ở cây thuố c lá lên đế n hà ng chụ c tỷ đồ ng Nguyễ n Ngọ c Bí ch, 2008)
Đối với bệnh do virus nói chung và bệnh khảm lá do hai virus TMV và CMV gây ra nó i riêng hiệ n vẫ n chưa có loại thuốc hóa học nào khả dĩ có thể phòng trị đượ c mộ t cá ch hữ u hiệ u , do đó cá c biệ n phá p phò ng bệ nh tố t nhấ t là sử dụ ng cá c
hạt giống sạch bệnh để trồng , không sử dụ ng cá c hạ t giố ng từ cá c ruộ ng trướ c đó đã bị bệnh nói trên để làm giống cho vụ sau . Thườ ng xuyên kiể m tra đồ ng ruộ ng để phát hiện và phun thuốc diệt trừ các loại côn trùng chích hút như bọ cách tơ , bọ phấ n, rệ p muộ i…bằ ng cá c loạ i thuố c trừ sâu để trá nh lây lan . Khi phá t hiệ n cá c triệ u chứ ng bệ nh trên đồ ng ruộ ng cầ n tậ p trung nhổ cây , đem ra khỏ i ruộ ng tiêu hủy để tránh lây lan.
2.2.3. Virus gây bệ nh khả m thuố c lá (Tobacco mosaic virus, TMV)
13
TMV thuộc loại Tobamovirus là một trong những virus gây hại trên thực vật được mô tả sớm nhất bởi Mayer (1886), Iwanowski (1892), Allard (1914) và Stanley (1935) (Kung and Yang, 1998).
TMV là virus hình que có chiều dài 300 A0, đường kính từ 150-170 A0 có cấu tạohình ống rỗng và protein sắp xếp cuộn xoắn xung quanh lõi trung tâm. TMV là virus đơn dương (ssRNA) có hình cuộn xoắn. Dạng que hoàn chỉnh của TMV có 2130 đơn vị hợp thành capsid (capsomeres), cứ 6 capsomer tạo thành
một vòng xoắn. (Stryer Lubert, 1988). Genome của TMV gồm 6400 nucleotide được chia thành 4 khung đọc mở (open reading frames- ORFs). RNA của TMV có cấu trúc mũ 7-methylguanosine ở cuối đầu 5‟ (Zamore et al., 2000), nối tiếp 68 nucleotide không mã hóa trợ giúp quá trình dịch mã (Gallie et al., 1987). Tiếp theo vùng này là hai vùng mã hóa cho các protein với kích thước tương ứng là 183kDa và 126 kDa (Goelet et al., 1982). Đây là protein có vai trò quan trọng trong quá trình sao chép của virus. Vùng mã hóa thứ 3 mã hoá cho protein cần thiết cho sự di chuyển qua gian bào của virus (Meishi et al., 1987) có khối lượng
phân tử khoảng 30 kDa. Protein vỏ (CP) có khối lượng phân tử 17,5kDa nằm trong vùng mã hóa thứ 4.
Vị trí của các ORF của hệ gen RNA được biểu thị bởi các hình chữ nhật. Kích thước của protein (kDa) tương ứng với các ORF trên được chỉ ra trong ngoặc. Vỏ protein với kích thước 17,5 kDa được mã hoá bởi ORF thứ 4. Các đặc điểm của hệ gen và các subgenomic được chú thích ở phía trên và bên dưới.
Hình 1.4. Cấu trúc TMV và tổ chức hệ gen (Chapman, 1998)
14
Gen CP của TMV theo sau vùng không dịch mã có chứa vài trình tự pseudoknot, trình tự này liên quan đến sự tăng cường dịch mã (Leather et al., 1993). Tại đầu 3‟ của hệ gen RNA mang cấu trúc giống RNA vận chuyển (tRNA) có thể được aminoacyl hóa. CP là protein cần thiết cho quá trình hình thành virion và có thể điều khiển sự lan truyền từ tế bào này sang tế bào khác của virus (Saito et al.,
1990; Kawakami et al., 2004). Vai trò của gen CP cũng cho phép sử dụng gen CP làm nguyên liệu cho tạo cây trồng chuyển gen kháng virus TMV bằng cơ chế bất hoạt RNA (RNA interference) (Yan et al., 2007)
TMV có thể gây bệnh ít nhất 199 loài trong 35 họ (Shew and Lucas,
1991) thực vật khác nhau nhưng nhiều nhất là trên cây thuốc lá. Khi cây bị bệ nh các lá non đều biến màu thành dạng khảm bao gồm các vùng xanh nhạt xanh đậm không đồ ng đề u xen lẫ n nhau , hình loang lổ như da ếch , hay cò n gọ i là dạ ng khảm. TMV được lan truyền bằng đường cơ giới do tiếp xúc virus thâm nhập vào các tế bào qua các vết thương và qua khí khổng lá, thân hoặc rễ. TMV rất bền như ở dạng kết tủa cồn, ở lá khô virus vẫn còn hoạt tính gây bệnh sau một năm. Trong nhiều trường hợp TMV phối hợp với virus X khoai tây (PVX) cùng gây hại trên cà chua gây ra bệnh đốm sọc đôi (double virus streak hay là Mixed virus
15
streak). Bệnh nặng làm đầu lá bị khô và ngọn cà chua bị chết (Gibbs, 1999).
Chƣơng 2. VẬ T LIỆ U VÀ PHƢƠNG PHÁ P NGHIÊN CƢ́ U
2.1 Vậ t liệ u
2.1.1. Vậ t liệ u thƣ̣ c vậ t:
Hạt thuố c lá Nicotiana tabacum L. (giống K326) thế hệ T1 chuyể n gen mang cấ u trúc TMV_RNAi do phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học cung cấp
2.1.2. Hóa chất, máy móc, thiế t bị
- Hóa chất: Yeast extract, Agarose, K2PO4, KH2PO4, SiC, HCl, NaOH, MgCl2, Etanol 70%, nướ c Javen, nướ c khử ion, kháng sinh kanamycin, Taq DNA polymerase và cá c hó a chấ t thông dụ ng khá c
- Máy móc, thiế t bị : Máy PCR System 9700 (Appied Biosystem, Mỹ), máy điện di Powerpac300 (Bio-Rad, Mỹ), máy soi DNA (Mini-transllumminatior, Bio-Rad, Mỹ), máy chụp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech, Thụy Điển), máy Vortex (Mimishaker, IKA, Đức), máy hút chân không Speed-Vac 110A (Savant, Mỹ),
máy ly tâm , cùng với các trang thiết bị khác của Phòng Công nghệ Tế bào Thực vậ t, Việ n Công nghệ Sinh họ c
2.2. Phƣơng phá p nghiên cứu
2.2.1. Khử trùng hạt thuốc lá
2.2.1.1. Khử trùng hạt bằng dung dịch Javel
Ngâm hạt trong cồn 70% khoảng 20‟‟, lắc nhẹ sau đó loại bỏ cồn bằng pippet khử trùng. Ngâm hạt trong dung dịch tẩy (Javel thương phẩm 10-30% có bổ
sung Tween20 0,05-0,1%) khoảng 20‟ có lắc nhẹ. Sau khi loại bỏ dung dịch tẩy bằng pippet, rửa hạt 4-5 lần bằng nước cất khử trùng.
16
2.2.1.2. Khử trùng hạt bằng khí Clo
Hạt thuốc lá được cho vào từng ống eppendorf, mở nắp và cho vào bình
Pyrex dung tí ch 250ml. Mở hé ¼ nắp bình Pyrex có chứa hạt thuốc lá và đặt bên cạnh cốc thủy tinh chứa 100ml dung dịch Javel. Dùng pipet thủy tinh hút lấy 3ml HCl đặc cho vào cốc thủy tinh đựng Javel để tạo khí Clo sau đó đậy kín bình khử
trùng và dán parafin. Sau 3-9h tháo parafin và mở hé ¼ nắ p bình khử trùng trong khoảng 2 phút để bay hết khí, sau đó vặn chặt nắp bình Pyrex và lấy ra ngoài. Mở nắp bình Pyrex trong box cấy 30 phút để bay hết khí và cấy hạt trên môi trường. 2.2.2. Phân tí ch sƣ̣ phân ly của gen chuyển Gieo hạt và đánh giá tỉ lệ kháng kanamycine
- Gieo hạt trên đĩa nhựa chứa môi trường MS - Sau khi cây con mọc cao khoảng 1cm thì chuyển sang bình tam giác 250ml
chứa môi trường MS + kanamycine 50mg/l. Mỗi dòng chuyển 80 cây và đặt
10 cây/ bình tam giác
- Sau 3-4 tuần quan sát, đánh giá số lượng cây sống sót trên môi trường có
kanamycine
2.2.3. Phân tích sự có mặt của gen chuyển bằng phƣơng pháp PCR
2.2.3.1. Tách ADN tổng số:
- Nghiền mẫu lá (khoảng 50 mg) trong ống eppendorf 2 ml bằng nitơ lỏng
- Thêm 500 l “Shorty Buffer” (0,2 M Tris-HCl pH9; 0,4 M LiCl; 25 mM
EDTA; 1% SDS và nước đề ion khử trùng )
- Ly tâm 13000 v/p
- Hút 350 l dịch nổi chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml có sẵn 350 l
isopropanol
- Đảo nhẹ và ly tâm 13000 v/p
- Loại dịch nổi, làm khô cặn
- Bổ sung 50-100 l nước đề ion khử trùng để hòa tan cặn.
17
- DNA được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 0,8%.
2.2.3.2. Phản ứng PCR
Phản ứng PCR được tiến hành với cặp mồi TMV-Fi/ TMV-Ri với trình tự như sau:
TMV-Fi: 5‟- CACCATGAAACCTTCACCACA-3‟
TMV-Ri: 5‟- CTAGGTCCAAACCAAACCAG-3‟
Bảng 2.1. Thành phần phản ứng PCR
STT Thành phần
Thể tích (µl)
1 Nước cất khử ion, khử trùng
10,1
2 Buffer PCR (NH+
2
4)
2
3 MgCl2
4 dNTPs
1,6
5 Primer – Fi
0,8
6 Primer – Ri
0,8
7 Taq polymerase
0,2
8 Template
2,5
Tổng
20
Bảng 2.2. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR
Bước Phản ứng Nhiệt độ (OC) Thời gian Chu kì
1 Biến tính 94 3 phút 1
2 Biến tính 94 1 phút
3 Gắn mồi 50 1 phút 25
4 Kéo dài chuỗi 72 1 phút
5 Hoàn tất kéo dài 72 10 phút 1
6 Kết thúc phản ứng 4 ∞
18
2.2.4. Phƣơng phá p lây nhiễ m virus nhân tạ o
Các cây chuyển gen sau khi trồng ngoài nhà lưới cao khoảng 10-30 cm đượ c kiể m tra tí nh khá ng virus nhân tạ o củ a Herbers và cá c cộ ng sự (1996) có cải tiến. Các bướ c tiế n hà nh như sau:
- Mẫu lá bị bệnh được nghiền trong đệm phosphat 100 mM (~1g mẫu lá trong
20 ml buffer) với pH = 7.
- Lá lây nhiễm được gây tổn thương nhẹ bằng SiC.
- Cho dịch virus lên phần lá đã gây xước, sau vài phút rửa lá bằng nước.
- 10-20 ngày sau khi lây nhiễm, triệu chứng sẽ xuất hiện trên cây.
- Có thể lây nhiễm thêm nếu sau khi lây nhiễm lần 1 không thấy bệnh biểu
hiện trên cây WT.
- Đánh giá kiểu hình của các cây lây nhiễm nhân tạo sau 10-20 ngày
2.2.5. Phƣơng phá p ELISA
-
Lấy 200 mg lá non (lá thứ 3 hoặc thứ 4 từ trên xuống) nghiền thành dịch đồng nhất với 2 ml đệm PBST (16 mM Na2HPO4, 3,9 mM Na H2PO4, 127 mM NaCl và 0,05 % Tween 20 (pH 7,2)) có chứa 0,1 % albumin bò (Sigma).
- Dịch nghiền được ly tâm ở 5000 v/p, 4 oC, 10 phút.
- Thu dịch nổi (gọi là kháng nguyên). Từ đĩa 96 giếng, bổ sung 200 l kháng
nguyên vào mỗi giếng và ủ 37 oC khoảng 1 h.
- Sau khi, rửa 3 lần với đệm PBST, kháng thể (IgG) kháng CMV, TMV và PVY được hòa tan vào đệm PBST theo tỷ lệ thích hợp, sẽ được bổ sung vào những giếng có kháng nguyên và ủ 37 oC trong 1 h.
- Đĩa được rửa lại 3 lần trước khi thêm 200 l alkaline phosphatse-kết hợp
19
đoạn F(ab‟)2 đã tinh sạch từ IgG thỏ hòa tan 1:2000 trong bệm PBST chứa 0,1 % albumin bò.
- Đĩa được ủ một lần nữa ở 37 oC trong 1 h. Sau khi rửa, đệm nền (10 % diethaolamine, 3 mM NaN3, pH 9,6) chứa 0,1 % disodium p-nitrophenyl phosphate, được bổ sung vào các giếng và ủ ở nhiệt độ phòng 30-40 phút.
- Giá trị OD được đo ở 405 nm bởi một microplate reader. Phản ứng màu được tạo ra bằng việc các mẫu kiểm tra được so sánh với giếng đối chứng âm đã biết.
- Một cây kiểm tra được xác định là dương tính khi giá trị OD trung bình lớn
20
hơn hai lần giá trị trung bình của đối chứng âm
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Nhằm ứng dụng công nghệ RNAi trong nghiên cứu tạo giống cây trồng kháng
virus tại Việt Nam, các nhà khoa học thuộc Viện Công nghệ Sinh học đã tiến hành
phân lập gen CP mã hóa cho protein vỏ của virus gây bệnh khảm lá (TMV), thiết
kế vector RNAi mang chính đoạn gen CP đó theo cả 2 chiều xuôi-ngược rồi
chuyển vào cây thuốc lá. Ở thế hệ ban đầu (T0) đã thu được 17dòng cây chuyển
gen có tính kháng TMV lớn hơn 90%. Tiếp tục phát triển những nghiên cứu trên,
đề tài đã tiến hành những nghiên cứu ở thế hệ T1 với mục đích:
- Phân tí ch sự phân ly củ a dò ng thuố c lá chuyể n gen TMV_RNAi ở thế hệ T1
- Phân tí ch khả năng khá ng virus củ a cá c dò ng thuố c lá chuyể n gen ở thế hệ T1
bằ ng phương phá p lây nhiễ m nhân tạ o
- Đá nh giá sự tồ n tạ i củ a TMV trong dò ng thuố c lá chuyể n gen bằ ng phương
pháp ELISA
3.1. Phƣơng pháp khử trùng hạt thuốc lá
17 dòng T0 có tính kháng virus cao được giữ lại trồng trong nhà lưới sau khoảng 4 tháng tiến hành thu hoạch hạt từ các dòng cây này và cho nảy mầm trong điều kiện in vitro phục vụ cho những phân tích tiếp theo. Khử trùng hạt thuốc lá trước khi đưa vào nuôi cấy in vitro gặp một số khó khăn sau:
- Hạt thu trong điều kiện nhà lưới mang nhiều nấm mốc
- Kích thước hạt nhỏ nên khó thao tác, rất dễ mất một lượng lớn hạt trong quá
trình khử trùng
21
Do vậy lựa chọn phương pháp khử trùng thích hợp cho hạt không bi nhiễm nấm mốc trở lại nhưng tỉ lệ nảy mầm cao là yêu cầu đầu tiên trong thí nghiệm của đề tài. Dung dịch Javel thương phẩm và khí clo được sử dụng như 2 loại chất tẩy rửa
khác nhau nhằm tìm kiếm phương pháp khử trùng cho tỉ lệ nhiễm thấp, tỉ lệ hạt nảy mầm cao đồng thời không tốn thời gian thao tác thí nghiệm.
Bảng 3.1 Hiệu quả khử trùng hạt thuốc lá
Phƣơng pháp
Tỉ lệ nảy mầm (%) Tỉ lệ nhiễm (%) Tổng thời gian khử trùng (h) Thời gian thao tác (h)
10%Javel /20ph 95 95 3 3
20%Javel /20ph 95 95 3 3
30%Javel /20ph 90 6 3.5 3.5
Khí Clo/3h 91 35 3.5 0.5
Khí Clo/6h 88 3 6.5 0.5
Khí Clo/9h 24 1 9.5 0.5
Tiến hành thử nghiệm khử trùng mỗi lô 100 hạt thuốc lá bằng các dung dịch Javel 10%, 20% và 30% trong 20 phút cho thấy dung dịch 10% và 20% Javel thương phẩm không thể khử trùng hạt thuốc lá, tỉ lệ nhiễm lại đạt tới hơn 90%. Dung dịch Javel 30% tỉ lệ nảy mầm hạt cao nhưng tỉ lệ mẫu bị nhiễm lại cũng giảm đáng kể (bảng 3.1). Thí nghiệm khử trùng bằng khí clo được tiến hành tương tự, 100 hạt
thuốc lá mỗi lô được đem vào khử trùng bằng luồng khí clo trong 3h, 6h và 9h. Đối với thời gian khử trùng khí Clo 3h hạt vẫn nảy mầm nhưng không diệt được nấm mốc, còn ở thời gian 9h nấm mốc không còn mọc trên môi trường nảy mầm nữa nhưng hiệu quả nảy mầm khá thấp, chỉ còn ít hơn 10%. Xử lí hạt bằng luồng khí clo trong 6h cho hiệu suất nảy mầm cao nhất với 88%, tỉ lệ hạt nhiễm lại thấp nhất (bảng 3.1). Cây con phát triển tốt sau khi khử trùng (hình 3.1). Như vậy, hạt thuốc lá có thể khử trùng hoàn toàn bằng dung dịch Javel 30% trong 15 phút hoặc luồng
22
khí clo trong 6h. Tuy nhiên, xử lí hat bằng khí clo có ưu thế về thời gian thao tác khi chỉ mất khoảng nửa tiếng (bảng 3.1) mà vẫn đảm bảo lượng hạt còn lại sau khử trùng tốt hơn.
A B
Hình 3.1: Hình ảnh hạt thuốc lá (A) và cây con (B) trên môi trường nảy mầm theo phương pháp khử trùng khí clo trong 6h.
3.2. Phân tích khả năng phân ly của gen chuyển
Trong qúa trình tái sinh cây chuyển gen, việc sử dụng các gen có khả năng chọn lọc đi kèm với gen đích là hết sức cần thiết nhằm tách ra được số lượng ít ỏi các tế
bào chuyển gen trong vô số các tế bào không mang gen chuyển. Các gen kháng các loại kháng sinh như kanamycine, hygromycine; kháng thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ hoặc mã hóa cho khả năng sử dụng một số loại đường như manose thường đươc sử dụng làm gen chọn lọc trong quá trình chuyển gen ở thực vật. Trong những nghiên cứu trước đây, vector RNAi TMV-CPi có bộ khung chứa gen nptII mã hóa cho gen kháng kanamycin đã được chuyển vào giống thuốc lá K326 và thu được những dòng cây T0 kháng virus. Kiểm tra bằng phương pháp PCR đã cho thấy những dòng T0 này mang cả gen nptII và gen đích TMV-CPi. Do vậy, đối với những
23
dòng cây ở thế hệ T1 tiếp theo, những dòng cây thuốc lá sinh trưởng được trên môi trường có kanamycine được coi là mang gen đích và có thể đánh giá khả năng di truyền ở thế hệ tiếp theo của gen đích thông qua hoạt động của gen nptII. Thí nghiệm đã được tiến hành bằng cách gieo các hạt của 17 dòng thuốc lá T1chuyển gen trên môi trường MS cơ bản có bổ sung 50mg/l kanamycine và đánh giá khả năng nảy mầm và phát triển cây sau 4 tuần. Kanamycine có vai trò ức chế hoạt
WT-2
TMV2.6
WT-1
động của ribosome trong tế bào thực vật, kiểu hình thường thấy của các cây mẫn cảm với kanamycine là vàng lá, rễ không phát triển và chết (hình 3.2).
Hình 3.2: Sàng lọc thuốc lá chuyển gen T1 RNAi TMV-CPi. TMV2.6: Cây thuốc lá chuyển gen T1 trên môi trường có Kan 50mg/l; WT-1: Cây thuốc lá không chuyển
gen trên môi trường có Kan 50mg/l; WT-2: Cây thuốc lá không chuyển gen trên môi trường không có Kan. Mũi tên chỉ hình ảnh một số cây không kháng kanamycine trên môi trường chọn lọc.
Trong các phương pháp được sử dụng hiện nay, chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumafaciens được coi là biện pháp dễ áp dụng với chi phí thấp mà lại rất hiệu quả. Do được thiết kế gắn vào đoạn Ti plasmid nên gen đích phần lớn sẽ được gắn vào genome của thực vật tại một hoặc vài điểm. Số điểm gắn này thường được định nghĩa là số lượng bản sao hay bản copy của gen đích. Nếu cây chuyển gen có 1 bản copy, gen đích sẽ được di truyền theo định luận Menđen theo tỷ lệ phân ly 3:1 và có khả năng chọn lọc những dòng cây đồng hơp tử của gen
đích ở thế hệ tiếp theo. Chọn lọc cây đồng hợp tử nhằm tạo cơ sở gen đích được di truyền và hoạt động một cách ổn định qua nhiều thế hệ là một trong những yêu cầu quan trọng trong nghiên cứu phát triển cây chuyển gen thành giống. Vì những lí do đó, trong nghiên cứu tiếp theo của đề tài đánh giá tỷ lệ phân ly của gen nptII trong 17 dòng cây chuyển gen RNAi TMV-CPi. Gieo 80 hạt của mỗi dòng cây trên môi trường có bổ sung 50mg/l kanamycine và đánh giá tỷ lệ cây kháng/cây mẫn cảm sau 4 tuần. Hai lô thí nghiệm đối chứng cũng được tiến hành song song. Lô thứ
24
nhất (WT-1) hạt thuốc lá K326 không chuyển gen được gieo trên môi trường MS có bổ sung 50mg/l kanamycine và lô thứ 2 (WT-2) hạt được gieo trên môi trường MS không có kháng sinh. Lô WT-1 vàng dần và chết sau 4 tuần ngược lại lô WT-2 cây con sinh trưởng và phát triển tốt. Những cây chuyển gen cũng có kiểu hình
tương tự WT-2 được đánh giá là kháng kanamycine còn kiểu hình tương tự WT-1 được coi là mẫn cảm (hình 3.1). Kết quả thu được có 4 dòng tỷ lệ cây kháng/cây mẫn cảm không rõ ràng (bảng 3.2); 2 dòng có tỷ lệ 2:1 và 9 dòng cây có tỷ lệ là 3:1
(bảng 3.2). Theo tính toán lý thuyết thống kê, nếu giá trị 2 quan sát bé hơn 3.84
(~p>=0.05) thì sự sai khác giữa giá trị quan sát và giá trị tính toán lý thuyết là không có ý nghĩa. (http://www2.lv.psu.edu/jxm57/irp/chisquar.html). Trong 9 dòng
cây có tỉ lệ 3:1 thu được, giá trị 2 nằm trong khoảng 0-1.6. Điều này có nghĩa là
giá trị quan sát phù hợp với giá trị tính toán dưới định luật Mendel.
Bảng 3.2: Kết quả phân tích tính kháng Kan của các cây thuốc lá chuyển gen T1 mang
cấu trúc RNAi TMV-CPi
TT Dòng cây Tổng số hạt Tỷ lệ 2 test Cây kháng Cây mẫn cảm
1 TMV2.3 80 69 11 - -
2 TMV2.4 80 80 0 - -
4 TMV2.6 80 65 15 3:1 1.667
5 TMV2.7 80 60 20 3:1 0
6 TMV2.10 80 59 21 3:1 0.067
7 TMV2.12 80 80 0 - -
8 TMV2.13 80 55 25 2:1 0.156
9 TMV2.15 80 51 29 2:1 0.306
10 TMV2.18 80 60 20 3:1 0
11 TMV2.22 80 58 22 3:1 0.267
25
12 TMV2.23 80 63 17 3:1 0.6
13 TMV2.29 80 17 3:1 0.6 63
14 TMV2.30 80 22 3:1 0.267 58
15 TMV2.31 80 22 3:1 0.267 58
16 TMV2.43 80 2 - - 78
17 TMV2.44 80 1 - - 79
3.3. Xác định gen chuyển trong các dòng thuốc lá chuyển gen ở thế hệ T1 bằng PCR
PCR là kỹ thuật phổ biến nhất để sàng lọc các dòng cây chuyển gen dương tính (Vikrant Nain, 2005). PCR sẽ kiểm tra sự tồn tại của gen chuyển trong genome thực vật chuyển gen. Trong nghiên cứu này, 9 dòng thuốc lá chuyển gen có sự phân ly tính kháng Kan theo tỷ lệ Mendel 3:1 sẽ tiếp tục được phân tích PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen chuyển TMV-Fi/TMV-Ri.
Để thực hiện phản ứng PCR, đầu tiên mẫu DNA tổng số từ các mẫu lá thuốc lá
chuyển gen T1 được tách chiết theo phương pháp của Accotto và cộng sự (2000).
Hình 3.3: DNA tổng số của một số dòng thuốc lá chuyển gen T1 mang gen virus TMV
Lá thuốc lá có rất nhiều nhựa nên có thể gây khó khăn trong việc tách chiết DNA. Tuy
26
nhiên, để khắc phục nhược điểm này, chúng tôi đã nghiền thật nhanh mẫu lá trong nitơ lỏng và bổ sung ngay đệm chiết, bước này được tiến hành nhanh làm cho các chất
polyphenol không kịp oxi hóa nên chất lượng DNA tổng số vẫn đảm bảo. Phương pháp của Accotto và cộng sự (2000) có đặc điểm là đơn giản, dễ thao tác, phù hợp với những thí nghiệm có số lượng mẫu nhiều nhưng vẫn đảm bảo chất lượng DNA cho phản ứng PCR. Kết quả điện di DNA tổng số của một số dòng thuốc lá chuyển gen trên
gel agarose 0,8% thể hiện trên hình 3.3 đã cho thấy chất lượng và hàm lượng DNA tổng số tương đối tốt, đảm bảo cho thí nghiệm PCR tiếp theo.
DNA tổng số của các dòng cây chuyển gen T1 đã được làm khuôn cho phản ứng PCR. Song song, plasmid mang cấu trúc RNAi TMV-CPi và nước cất deion cũng được sử dụng làm đối chứng dương và âm cho phản ứng. Với plasmid RNAi TMV-CPi chúng tôi đã nhân được một sản phẩm PCR có kích thước khoảng 300bp, tương đương với tính toán lý thuyết của đoạn TMV-CPi là 313bp. Đối chứng âm không xuất hiện băng sản phầm nào. 100% dòng kiểm tra cho sản phẩm PCR tương đương với đối chứng dương (Hình 3.4). Điều này chứng tỏ, cấu trúc chuyển gen RNAi TMV-CPi đã có mặt trong các cây chuyển gen T1.
Hình 3.4. Kiểm tra sự có mặt gen TMV-CPi trong một số dòng thuốc lá chuyển gen T1 bằng phương pháp PCR
WT1, WT2: cây không chuyển gen; (+): đối chứng dương; (-): đối chứng âm; TMV2.7, TMV2.18, TMV 2.6, TMV2.10, TMV2.22 : các dòng cây chuyển gen
27
3.4. Đánh giá tính kháng bệnh của các dòng thuốc lá chuyển gen T1 mang cấu trúc RNAi TMV-CPi bằng lây nhiễm nhân tạo virus
Điều quan trọng nhất của nghiên cứu này là chọn tạo được những dòng thuốc lá chuyển gen có khả năng kháng virus TMV ổn định. Vì vậy, để kiểm tra tính kháng, 20 cây thuốc lá chuyển gen T1 kháng Kan 50mg/l của mỗi dòng thuốc lá đã được sàng lọc trên môi trường kháng sinh cho tỷ lệ 3:1 và 10 cây đối chứng WT1
không chuyển gen đã được lây nhiễm nhân tạo virus TMV theo phương pháp của Herbers và cộng sự (1996). Sau khi lây nhiễm virus, các dòng thuốc lá được quan sát sự biểu hiện bệnh virus bằng cảm quan so sánh với cây WT2 không chuyển gen không lây nhiễm virus.
Bảng 3.3. Kết quả đá nh giá tí nh khá ng bệ nh qua lây nhi ễm nhân tạo virus TMV đố i vớ i các
dòng thuốc lá chuyển gen T1 mang cấ u trú c RNAi TMV -CPi và cây đối chứng WT
STT Cây T1 Ra cây nhà lƣới Bio- test Số cây kháng Số cây nhiễm bệnh Mức độ nhiễm bệnh
++ 1 TMV2.06 20 18 20 2
2 TMV2.07 20 20 20 0 -
3 TMV2.10 20 20 20 0 -
4 TMV2.18 20 20 20 0 -
5 TMV2.22 20 20 20 0 -
6 TMV2.23 20 20 20 0 -
7 TMV2.29 20 20 20 0 -
8 TMV2.30 20 20 20 0 -
28
9 TMV2.31 20 20 20 0 -
10 WT1 10 10 0 10 ++, +++
11 WT2 10 - 10 0 -
Ghi chú: (-): không nhiễm bệnh, (++) và (+++) lần lượt là mức độ biểu hiện bệnh trung bình và nặng.
Kết quả đánh giá tính kháng virus được thống kê trên bảng 3.3. Sau khi lây nhiễm, chỉ có 2/9 dòng/180 cây có biểu hiện nhiễm bệnh TMV ở mức độ nhiễm bệnh trung bình với các vết khảm loang lổ nhỏ trên khắp bề mặt 1 đến 2 lá non. 178 cây còn lại (99%) không có biểu hiện bệnh. Trong khi đó, cây WT1 có 10/10 cây có biểu hiện bệnh ở mức độ trung bình đến nặng, các vết khảm loang lổ to xuất hiện trên khắp bề mặt các lá non và cây còi cọc. Những cây chuyển gen có biểu hiện bệnh có
thể do cây mang gen chuyển dị hợp tử, nên vẫn kháng được trên môi trường sàng lọc Kan 50mg/l nhưng không kháng được virus. Còn những cây có biểu hiện kháng hoàn toàn là do mang gen chuyển đồng hợp tử.
T1TMV2.06-10
T1TMV2.06-6
WT1-1
Hình 3.5: Biểu hiện bệnh TMV sau khi lây nhiễm nhân tạo virus TMV lần 1
29
3.5. Xác định sự có mặt của phân tử virus trên các dòng thuốc lá chuyển gen sau khi lây nhiễm virus nhân tạo bằng ELISA
RNAi trong cây chuyển gen sẽ phân hủy RNA của virus xâm nhập dẫn tới không hình thành các phân tử virus mới hoặc hàm lượng phân tử virus sẽ bị giảm đáng kể. Để kiểm tra sự có mặt của phân tử TMV, 5 cây/dòng thuốc lá T1 có biểu hiện kháng hoàn toàn virus TMV sau lây nhiễm được lựa chọn ngẫu nhiên tham gia phản ứng ELISA.
Bảng 3.4. Kết quả kiểm tra ELISA các dòng thuốc lá T1 sau khi lây nhiễm TMV
Dòng
Giá trị OD
Dòng
Giá trị OD ở
Dòng thuốc
Giá trị OD ở
lá T1
thuốc lá T1
ở 405 nm sau 12 giờ
thuốc lá T1
405 nm sau 12 giờ
405 nm sau 12 giờ
OD KL
OD
KL
OD
KL
0.105
- TMV
TMV 2.31-
0.10
-
-
0.11
TMV
2.22-1
1
5
6
2.06-1
0.106
- TMV
TMV 2.31-
0.11
-
-
0.11
TMV
2.22-2
2
2
2
2.06-2
0.103
- TMV
TMV 2.31-
0.11
-
-
0.10
TMV
2.22-3
3
8
1
2.06-3
0.109
- TMV
TMV 2.31-
0.12
-
-
0.10
TMV
2.22-4
4
4
2
2.06-4
0.112
- TMV
TMV 2.31-
0.13
-
-
0.11
TMV
5
2
2.22-5
8
2.06-5
- WT2.1
-
0.117
0.12 2
- TMV 2.23-1
0.11 1
TMV 2.07-1
- WT2.2
-
0.103
0.11 2
- TMV 2.23-2
0.10 2
TMV 2.07-2
-
0.20
0.105
- TMV
- WT2.3
0.09
TMV
2
2.23-3
2
2.07-3
30
0.114
- WT2.4
-
TMV 2.07-4
- TMV 2.23-4
0.09 7
0.18 6
TMV
0.108
- TMV
- WT2.5
0.11
-
0.19
2.07-5
5
2.23-5
9
TMV
0.102
- TMV
-
0.11
2.10-1
3
2.29-1
TMV
0.112
- TMV
- WT1.1
0.14
+
1.40
2.10-2
1
2.29-2
9
TMV
0.118
- TMV
- WT1.2
0.12
+
1.38
2.10-3
5
2.29-3
5
TMV
0.098
- TMV
- WT1.3
0.10
+
1.07
2.10-4
3
2.29-4
5
TMV
0.112
- TMV
- WT1.4
0.11
+
1.27
2.10-5
6
2.29-5
1
TMV
0.114
- TMV
- WT1.5
0.09
+
1.93
2.18-1
6
2.30-1
6
TMV
0.11
0.105
- TMV
-
2.18-2
3
2.30-2
TMV
0.11
0.111
- TMV
Đ/c dương
1.14
-
+
2.18-3
2
2.30-3
8
TMV
0.11
0.089
- TMV
TB đ/c âm
0.09
-
-
2.18-4
9
2.30-4
2
TMV
0.12
-
0.114
- TMV
2x TB đ/c
0.18
2.18-5
4
2.30-5
âm
4
Ghi chú: (1) TB đ/c âm là trung bình giá trị OD của 4 mẫu đối chứng âm (cây khỏe không nhiễm TMV); (2) Các mẫu được phản ứng dương là mẫu có giá trị OD (optical density = mật độ quang) > 2 lần giá trị trung bình của đối chứng âm; (3) KL là kết luận; (-) âm tính, không có virus; (+) dương
31
tính, có mặt virus trên cây.
ELISA là phương pháp phát hiện nhanh sự có mặt của phân tử virus trên cây trồng dựa vào phản ứng ngưng kết giữa kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu cho virus. ELISA có khả năng phát hiện sự có mặt của virus trên cây ngay cả khi sự biểu hiện bệnh trên cây không thể phát hiện bằng cảm quan. Trong nghiên cứu này, khi giá trị OD405>0,184 thì phản ứng ELISA cho kết quả dương tính với màu vàng xuất hiện trên bản kiểm tra ELISA (Hình 3.5). Lượng virus càng cao thì màu vàng xuất hiện càng đậm.
Hình 3.6: Hình ảnh ELISA kiểm tra sự
có mặt của virus trên một số dòng thuốc
lá chuyển gen RNAi TMV-CPi ở thế hệ T1 có biểu hiện kháng bệnh hoàn toàn
sau ba lần lây nhiễm virus.
Phân tích ELISA được thống kê trên bảng và thể hiện trên hình đã cho thấy có 100% dòng thuốc lá chuyển gen kiểm tra ELISA đều cho OD405<0,184, chứng tỏ những dòng thuốc lá này không có mặt virus TMV trong cây hay sau khi lây nhiễm virus đã bị bất hoạt bằng cơ chế RNAi. Điều này cũng có nghĩa là hoạt động của cấu trúc RNAi TMV-CPi trong những dòng thuốc lá T1 là khá tốt.
Như vậy, có thể kết luận chúng tôi đã chọn được những dòng thuốc lá chuyển
gen thế hệ T1 mang cấu trúc RNAi TMV-CPi có khả năng kháng virus TMV.
32
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
1. Sử dụng khí Clo sau 6h thích hợp cho khử trùng hạt thuốc lá.
2. Chọn lọc được 9 dòng thuốc lá T1 có tỷ lệ phân ly 3:1 theo định luật Mendel.
3. Toàn bộ cây T1 phát triển trên môi trường có kanamycine đều mang gen chuyển.
4. 99% cây T1 đều có biểu hiện kháng virus TMV sau 1 lần lây nhiễm.
5. Những dòng thuốc lá T1 có biểu hiện kháng hoàn toàn đều cho kết quả âm tính khi
kiểm tra sự có mặt của virus bằng ELISA
ĐỀ NGHỊ
Để tiếp tục phát triển các kết quả nghiên cứu, chúng tôi đề xuất một số kiến nghị như sau:
1. Tiếp tục sàng lọc và chọn tạo được dòng thuốc lá chuyển gen ưu thế có khả năng kháng
TMV để tạo dòng thuần.
2. Sử dụng các cấu trúc RNAi thiết kế được để chuyển vào những giống cây trồng có giá trị khác (cây họ cà, họ bầu bí, họ đậu… ) đang chịu thiệt hại nặng nề bởi virus tương
ứng nhằm tạo ra những giống cây trồng có khả năng kháng bệnh virus.
33
Tài liệu tham khảo
Accotto GP, Navas-Castillo J, Noris E, Moriones E, Louro D (2000) Typing of Tomato yellow leaf curl viruses in
Europe. Eur J Plant Path 106: 179-186.
Vikrant Nain, Rajani Jaiswal, Monika Dalal, Bandarupalli Ramesh and Polumetla A. Kumar (2005) Polymerase chain reaction analysis of transgenic plants contaminated byAgrobacterium. Plant Molecular Biology Reporter 23(1): 59-65)
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
Chu Hoàng Hà (2010) Báo cáo tổng hợp kết quả khoa học công nghệ đề tài „Nghiên cứu tạo giống cây
ăn quả kháng bệnh virus phổ rộng bằng chuyển gen đa đoạn”, mã số KC.04.03/06-10
Lâm Đại Nhân (2000) Luận văn thạc sỹ sinh học “Thiết kế vector mang gen CP của virus đốm vòng Việt
Nam PRSV nhằm tạo cây chuyển gen kháng bệnh”
Lê Trần Bình (2008) Báo cáo tổng kết đề tài “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo giống
cây trồng chuyển gen kháng bệnh virus” (giai đoạn 2007-2008)
Lê Trần Bình (2006) Báo cáo tổng kết đề tài Báo cáo tổng kết đề tài “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật
RNAi trong tạo giống cây trồng chuyển gen kháng bệnh virus” (giai đoạn 2005-2006)
Lê Trần Bình (2009) Phát triển cây trồng chuyển gen ở Việt Nam, Nhà xuất bản khoa học và Công
nghệ
Nguyễn Văn Chín, Nguyễn Ngọc Bích (2008) Theo dõi tình hình sâu bệnh hại thuốc lá làm cơ sở dự báo và nghiên cứu biện pháp phòng trừ phục vụ sản xuất thuốc lá nguyên liệu” Báo cáo khoa học. Công ty TNHH Một thành viên Viện kinh tế kỹ thuật thuốc lá, Tổng công ty thuốc lá Việt Nam: http://ww.vinataba.com.vn
Phạm Thị Vân, Nguyễn Văn Bắc, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình (2008) Tạo cây thuốc lá kháng bệnh virus khảm dưa chuột bằng kỹ thuật RNAi. Tạp chí Công nghệ Sinh học 6 (4A): 679- 687
Vũ Triệu Mân (2007) Giáo trình bệnh cây chuyên khoa, chuyên ngành Bảo vệ thực vật. Trường ĐH
Nông Nghiệp I Hà Nội
TÀI LIỆU TIẾNG NƢỚC NGOÀI
Adai A, Johnson C, Mlotshwa S, Archer-Evans S, Manocha V, Vance V, Sundaresan V (2005)
Computational prediction of miRNAs in Arabidopsis thaliana.Genome Res. 15(1): 78-91
Aswath CR, Mo SY, Kim DH, Park SW (2006) Agrobacterium and biolistic transformation of onion using
non-antibiotic selection marker phosphomannose isomerase. Plant Cell Rep 5: 92–99
34
Banttari EE, Ellis PJ, Khurana SMP (1993) Management of diseases caused by viruses and viruslike
pathogens. Pages 127-133 in Rowe, R.C. ed. Potato health management. APS Press. St. Paul, MN
Bartel B, Bartel DP (2003) MicroRNAs: at the root of plant development? Plant Physiol. 132(2): 709-17
Bartel DP (2004) MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.Cell 116(2): 281-97
Bartel DP (2009) MicroRNAs: target recognition and regulatory functions.Cell 136(2): 215-33
Baulcombe D (2004) RNA silencing in plants. Nature 431(7006): 356-63
Baulcombe D (1996) Mechanisms of Pathogen-Derived Resistance to Viruses in Transgenic Plants. The
Plant Cell 8: 1833-1844
Beachy RN, Loesch-Fries S, Tumer NE (1990) Coat protein-mediated resistance against virus infection.
Annu Rev Phytopathol 28: 451-474
Beachy RN (1999) Coat-protein-mediated resistance to tobacco mosaic virus: discovery mechanisms and
exploitation. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B 354: 659-664
Bonfim K, Faria JC, Nogueira EO, Mendes EA, Aragão FJ (2007) RNAi-mediated resistance to Bean golden mosaic virus in genetically engineered common bean (Phaseolus vulgaris). Mol Plant Microbe Interact. 20(6): 717-26
Boscariol RL, Almeida WAB, Derbyshire MTVC, Mour˜ao Filho FAA, Mendes BMJ (2003) The use of the PMI/mannose selection system to recover transgenic sweet orange plants (Citrus sinensis L. Osbeck). Plant Cell Rep 22:122–128
Braun CJ, Hemenway CL (1992) Expression of amino-terminal portions or full-length viral replicase
genes in transgenic plants confers resistance to potato virus X infection. Plant Cell 4: 735-744
Brunt A. (1997) Plant Viruses Online: http://www.im.ac.cn/ vide/ descr837.htm
Carr JP, Marsh LE, Lomonossoff GP, Sekiya ME, Zaitlin M (1992) Resistance to tobacco mosaic virus induced by the 54-kDa gene sequence requires expression of the 54-kDa protein. Mol Plant-Microbe Interact 5: 397-404
Chicas A and Macino G (2001) Characteristic of post-transcriptional gene silencing. EMBO reports 111:
992-6
Collmer CH, Vogt VM, Zaitlin M (1983) H protein, a minor protein of TMV virions, contains sequences of
the viral coat protein. Virology 126: 429.
de Lange P, van Blokland R, Kooter JM, Mol JN (1995) Suppression of flavonoid flower pigmentation genes in Petunia hybrida by the introduction of antisense and sense genes. Curr Top Microbiol Immunol. 197: 57-75
35
di Nicola-Negri E, Brunetti A, Tavazza M, Ilardi V (2005) Hairpin RNA-mediated silencing of Plum pox virus P1 and HC-Pro genes for efficient and predictable resistance to the virus.Transgenic Res. 14(6): 989-94
Ecker JR, Davis RW (1986) Inhibition of gene expression in plant cells by expression of antisense RNA.
Proc Natl Acad Sci U S A. 83(15):5372-5376.
Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC (1998) Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391(6669): 806-11
Genus Nicotiana, http://www.uniprot.org/taxonomy/4085
Goelet P, Lomonossoff GP, Butler PJ, Akam ME, Gait MJ, Karn J (1982) Nucleotide sequence of tobacco
mosaic virus RNA. Proc Natl Acad Sci USA 79 (19): 5818-5822
Goldbach R, Bucher E, Prins M (2003) Resistance mechanisms to plant viruses: an overview. Virus Res.
92(2): 207-212
Goldback R and Wellink J (1996) Comoviruses: Molecular biology and replication, in The plant Viruses,
vol. 5 (Harrison B.D. and Murant A.F., eds.) Plenum, New York, pp 35-76
Goldberg NP (1999) Tomato Spotted Wilt Virus: http://www.cahe.nmsu.edu/ pubs/ _h/ h-242.html
Gottula J, Fuchs M (2009) Toward a quarter century of pathogen-derived resistance and practical
approaches to plant virus disease control. Adv Virus Res. 75:161-83
He L, Hannon GJ (2004) MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation.Nat Rev Genet. 4
(7): 522-31
He Z, Duan Z, Liang W, Chen F, Yao W, Liang H, Yue C, Sun Z, Chen F, Dai J (2006) Mannose selection
system used for cucumber transformation. Plant Cell Rep 25(9): 953–958
Hull R, Davies JW (1992) Approaches to nonconventional control of plant virus diseases. Crit Rev Plant
Sci 11: 17-33
Joersbo M, Donaldson I, Kreiberg J, Petersen SG, Brunstedt J, Okkels FT (1998) Analysis of mannose
selection used for transformation of sugar beet. Mol Breed 4:111–117
Jones-Rhoades MW, Bartel DP (2004) Computational identification of plant microRNAs and their
targets, including a stress-induced miRNA. Mol Cell. 14(6): 787-99
Jones-Rhoades MW, Bartel DP, Bartel B (2006) MicroRNAS and their regulatory roles in plants. Annu
Rev Plant Biol. 57:19-53
Kamachi S, Mochizuki A, Nishiguchi M, Tabei Y (2007) Transgenic Nicotiana benthamiana plants resistant to cucumber green mottle mosaic virus based on RNA silencing. Plant Cell Rep. 26(8): 1283-8
36
Kidner CA, Martienssen RA (2005) The developmental role of microRNA in plants. Curr Opin Plant
Biol. 8(1): 38-44
Kim JY, Jung M, Kim HS, Lee YH, Choi SH, Lim YP, Min BW, Yang SG, Harn CH (2002) A new selection
system for pepper regeneration by mannose. J Plant Biotechnol 4(3):129–134
Kormelink R, de Haan P, Peters D, Goldbach R (1992) Viral RNA synthesis in tomato spotted wilt virus-
infected Nicotiana rustica plants. Journal of General Virology (73): 687-693
Kormelink R (1994) Expression and Subcellular Location of the NSM Protein of Tomato Spotted Wilt
Virus (TSWV), a Putative Viral Movement Protein. Virology 200: 56-65
Lomonossoff GP (1995) Pathogen-derived resistance to plant viruses. Annu. Rev. Phytopathol. 33, 323-
343.
Meister G and Tuschl T (2004) Mechanism of gene silencing by double-stranded RNA. Nature 43: 343-
349
Mette MF, Aufsatz W, van der Winden J, Matzke MA, Matzke AJ (2000) Transcriptional silencing
and promoter methylation triggered by double-stranded RNA. EMBO J.19(19): 5194-201
Miles JS, and Guest JR (1984) Nucleotide sequence and transcriptional start point of the
phosphomannose isomerase gene (manA) of Escherichia coli. Gene 32: 41-48
Napoli C, Lemieux C, Jorgensen R (1990) Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes in trans. Plant Cell. 2(4): 279- 289.
Niu QW, Lin SS, Reyes JL, Chen KC, Wu HW, Yeh SD, Chua NH (2006) Expression of artificial microRNAs in transgenic Arabidopsis thaliana confers virus resistance. Nat Biotechnol. 24(11):1420- 8. Erratum in: Nat Biotechnol. 2007 25(2): 254.
O’Kennedy MM, Burger JT, Botha FC (2004) Pearl millet transformation system using the positive
selectable marker gene phosphomannose isomerase. Plant Cell Rep 22: 684–690
Pfleger
FL,
Zeyen
RJ
(2008)
Tomato-Tobacco
Mosaic
Virus
Disease.
http://www.extension.umn.edu/distribution/horticulture/DG1168.html
Poche LA (2002) Perique tobacco: Mystery and history
Qu J, Ye J, Fang R (2007) Artificial microRNA-mediated virus resistance in plants. J Virol. 81(12):
6690-9
Ramesh SA, Kaiser BN, Franks T, Collins G, Sedgley M (2006) Improved methods in Agrobacterium- mediated transformation of almond using positive (mannose/pmi) or negative (kanamycin resistance) selection-based protocols. Plant Cell Rep 25(8): 821–828
37
Reddy DV, Sudarshana MR, Fuchs M, Rao NC, Thottappilly G (2009) Genetically engineered virus- resistant plants in developing countries: current status and future prospects. Adv Virus Res. 75:185- 220
Register JCIII, Nelson RS (1992) Early events in plant virus infection: relationships with genetically
engineered protection and host gene resistance. Semin Virol 3: 441-451
Scholthof K-BG, Scholthof HB, Jackson AO (1993) Control of Plant virus diseases by Pathogen-
derived resistance in transgenic plants. Plant Physiol 102: 7-12
Schubert J, Matousek J, Mattern D (2004) Pathogen-derived resistance in potato to Potato virus Y-
aspects of stability and biosafety under field conditions. Virus Res. 100: 41-50.
Sigareva M, Spivey R, Willits MG, Kramer CM, Chang YF (2005) An efficient mannose selection protocol for tomato that has no adverse effect on the ploidy level of transgenic plants. Plant Cell Rep 23: 236–245
Smith NA, Singh SP, Wang MB, Stoutjesdijl PA, Green AG, Waterhouse PM (2000) Total silencing by
intron-spliced hairpin RNAs. Nature 407: 319-20
Sun ZN, Yin GH, Song YZ, An HL, Zhu CX, Wen FJ (2010) Bacterially Expressed Double-Stranded RNAs against Hot-Spot Sequences of Tobacco Mosaic Virus or Potato Virus Y Genome Have Different Ability to Protect Tobacco from Viral Infection. Appl Biochem Biotechnol. Epub ahead of print
Takeda A, Sugiyama K, Nagano H, Mori M, Kaido M, Mise K, Tsuda S, Okuno T (2002) Identification of
a novel RNA suppressor, NSs protein of Tomato spotted wilt virus. FEBS Letters 532: 75-79
Tenllado F, Llave C, Díaz-Ruíz J (2004) RNA interference as a new biotechnological tool for the
control of virus diseases in plants.Virus Res. 102(1): 85-96
Todd R, Tague GW (2001) Phosphomannose isomerase: a versatile selectable marker for Arabidopsis
thaliana germ-line transformation. Plant Mol Biol Rep 19: 307–319
Tyagi H, Rajasubramaniam S, Rajam MV, Dasgupta I (2008) RNA-interference in rice against Rice tungro bacilliform virus results in its decreased accumulation in inoculated rice plants. Transgenic Res. 17(5): 897-904
van den Boogaart T, Lomonossoff GP, Davies JW (1998) Can we explain RNA-mediated virus resistance
by homology-dependent gene silencing? MPMI (11) 7: 717-23
van der Krol AR, Mur LA, Beld M, Mol JN, Stuitje A (1990) Flavonoid genes in petunia: addition of a limited number of gene copies may lead to a suppression of gene expression.Plant Cell 2(4):291-9.
Vanderschuren H, Alder A, Zhang P, Gruissem W (2009) Dose-dependent RNAi-mediated
geminivirus resistance in the tropical root crop cassava. Plant Mol Biol. 70(3):265-72
Voinnet O (2001) RNA silencing as a plant immune system against viruses. Trends Genet. 17(8): 449-59
38
Volpe TA, Kidner C, Hall IM, Teng G, Grewal SI, Martienssen RA (2002) Regulation of heterochromatic silencing and histone H3 lysine-9 methylation by RNAi. Science. 297(5588):1833-7.
Wang AS, Evans RA, Altendorf PR, Hanten JA, Doyle MC, Rosichan JL (2000) A mannose selection system for production of fertile transgenic maize plants from protoplasts. Plant Cell Rep 19:654–660
Waterhouse PM, Graham MW, Wang MB (1998) Virus resistance and gene silencing in plants can be induced by simultaneous expression of sense and antisense RNA. Proc Natl Acad Sci USA 95(23):13959-64.
Wesley SV, Helliwell CA, Smith NA, Wang MB, Rouse DT, Liu Q, Gooding PS, Singh SP, Abbott D, Stoutjesdijk PA, Robinson SP, Gleave AP, Green AG, Waterhouse PM (2001) Construct design for efficient, effective and high-throughput gene silencing in plants. Plant J. 27(6): 581-90
Wright M, Dawson J, Dunder E, Suttie J, Reed J, Kramer C, Chang Y, Novitzky R, Wang H, Artim-Moore L (2001) Efficient biolistic transformation of maize and wheat using the phosphomannose isomerase gene, pmi as the selectable marker. Plant Cell Rep 20:429–436
Yin Y, Chory J, Baulcombe D (2005) RNAi in transgenic plants. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 26:
Unit 26.6.
Zhang P, Puonti-Kaerlas J (2000) PIG-mediated cassava transformation using positive and negative
selection. Plant Cell Rep 19:1041–1048
Zhu YJ, Agbayani R, McCafferty H, Albert HH, Moore PH (2005) Effective selection of transgenic papaya
plants with the PMI/Man selection system. Plant Cell Rep 24:426–432
Zilberman D, Cao X, Jacobsen SE (2003) ARGONAUTE4 control of locus-specific siRNA
accumulation and DNA and histone methylation.Science 299(5607):716-9.
Zitter TA and Daughtrey ML (1989) Tomato Spotted Wilt Virus Fact Sheet Page: 735.90
Zrachya A, Kumar PP, Ramakrishnan U, Levy Y, Loyter A, Arazi T, Lapidot M, Gafni Y (2007) Production of siRNA targeted against TYLCV coat protein transcripts leads to silencing of its expression and resistance to the virus. Transgenic Res. 16(3): 385-98
39
40
