Đồ án tốt nghiệp: Nghiên cứu thu nhận anthocyanin từ phế liệu gạo đen và xác định hoạt tính kháng oxy hóa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU THU NHẬN ANTHOCYANIN TỪ PHẾ LIỆU GẠO ĐEN VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN LỆ HÀ

Sinh viên thực hiện

:

LÊ TRÍ KIỂNG

MSSV: 1151110478 Lớp: 11DSH05

TP. Hồ Chí Minh, 2015

Đồ án tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN

Là sinh viên năm năm cuối của Trường Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh,

nay được vinh dự làm đồ án tốt nghiệp để hoàn tất chương trình học của mình. Tôi

cam đoan đây là nghiên cứu do tôi tiến hành tại phòng thí nghiệm Khoa Công nghê

Sinh học-Thực phẩm-Môi trường, Trường Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh.

Những số liệu trong bài hoàn toàn trung thực chưa từng có ai công bố.

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2015

Sinh viên thực hiện

Lê Trí Kiểng

Đồ án tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN

Tận đáy lòng con xin gửi vạn lời cảm ơn đến cha mẹ, cha mẹ đã gian lao nuôi

dạy con thành người và là người thầy đầu đời của con. Cha mẹ luôn là chỗ dựa vững

chắc nhất của con, là người giúp con đứng vững sau mỗi lần vấp ngã, là nguồn động

viên, động lực để con tiếp tục phấn đấu trong cuộc sống.

Với lòng biết ơn sâu sắc. Em xin chân thành cảm ơn toàn thể quý Thầy Cô

Khoa Công nghệ sinh học-Thực phẩm-Môi trường, cùng toàn thể Thầy Cô Trường

Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giảng dạy và truyền đạt cho em

những kiến thức quý báo về cơ sở ngành cũng như chuyên ngành từ ngày em bước

chân vào giảng đường đại học.

Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn TS.Nguyễn Lệ Hà, người thầy đáng kính,

đã luôn tận tình chỉ dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành phần thực

nghiệm của đồ án.

Em xin chân thành cảm ơn thầy Huỳnh Văn Thành và thầy Nguyễn Trung

Dũng đã tạo điều kiện thuận lợi cho em thực hiện đồ án tại phòng thí nghiệm Khoa

Công nghệ sinh học-Thực phẩm-Môi trường, Trường Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí

Minh.

Cảm ơn tất cả các bạn lớp 11DSH05 đã luôn khích lệ, động viên và giúp đỡ

mình trong suốt quá trình học tập tại trường và trong quá trình làm đồ án tốt nghiệp.

Xin chân thành cảm ơn!

TP. Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2015

SVTH: Lê Trí Kiểng

Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ______________________________________ v

DANH MỤC CÁC BẢNG _____________________________________________vi

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH _______________ vii

MỞ ĐẦU __________________________________________________________ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN ____________________________________________ 7

1.1 Gạo đen. _________________________________________________________ 7

1.1.1 Khái niệm ______________________________________________________ 7

1.1.2 Thành phần hóa học ______________________________________________ 7

1.2 Anthocyanin. _____________________________________________________ 8

1.2.1 Giới thiệu chung _________________________________________________ 8

1.2.2 Cấu trúc phân tử _________________________________________________ 8

1.2.3 Tính chất, đặc điểm. _____________________________________________ 12

1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến màu sắc và độ bền của anthocyanin. ____________ 13

1.2.4.1 Cấu trúc _____________________________________________________ 13

a) Cấu trúc chuyển hóa trong môi trường lỏng. _____________________________ 13

b) Cấu trúc hóa học __________________________________________________ 15

1.2.4.2 pH _________________________________________________________ 17

1.2.4.3 Nhiệt độ. ____________________________________________________ 18

1.2.4.4 Oxy. ________________________________________________________ 19

1.2.4.5 Enzyme _____________________________________________________ 20

1.2.4.6 Ánh sáng. ____________________________________________________ 21

1.2.4.7 Đường và các sản phẩm biến tính của chúng _________________________ 21

1.2.4.8 Các ion kim loại. ______________________________________________ 22

Đồ án tốt nghiệp

1.2.4.9 Sulfurdioxide (SO2) ____________________________________________ 23

1.2.4.10 Acid ascorbic ________________________________________________ 24

1.2.5 Sự phân bố của anthocyanin. ______________________________________ 25

1.2.6 Các anthocyanin đã được thương mại hóa ____________________________ 27

1.2.7 Ứng dụng của anthocyanin. _______________________________________ 27

1.3 Các thành tựu đạt được. ____________________________________________ 28

1.3.1 Phương pháp tách chiết anthocyanin_________________________________ 28

1.3.2 Phương pháp tách chiết anthocyanin từ quả dâu Hội An _________________ 28

1.3.3 Phương pháp tách chiết anthocyanin từ bắp cải tím. _____________________ 29

1.3.4 Phương pháp tách chiết anthocyanin từ gạo đen. _______________________ 30

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP. ____________________________ 31

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu. ____________________________________ 31

2.1.1 Thời gian. _____________________________________________________ 31

2.1.2 Địa điểm. _____________________________________________________ 31

2.2 Nguyên liệu– thiết bị - hoá chất. _____________________________________ 31

2.2.1 Nguồn gạo đen. _________________________________________________ 31

2.2.2 Một số hóa chất sử dụng trong nghiên cứu ___________________________ 31

2.2.3 Một số dụng cụ và thiết bị chủ yếu dùng trong nghiên cứu________________ 32

2.2.3.1 Dụng cụ._____________________________________________________ 32

2.2.3.2 Thiết bị. _____________________________________________________ 32

2.3 Phương pháp nghiên cứu. __________________________________________ 33

2.3.1 Thí nghiệm 1: Xác định độ ẩm ban đầu của nguyên liệu. _________________ 34

2.3.2 Thí nghiệm 2: Xác định bước sóng hấp thu cực đại của anthocyanin từ mẫu gạo

đen _______________________________________________________________ 34

Đồ án tốt nghiệp

2.3.3 Thí nghiệm 3: Xác định ảnh hưởng của kích thước hạt đến hiệu quả trích ly

anthocyanin từ gạo đen. _______________________________________________ 35

2.3.4 Thí nghiệm 4: Xác định ảnh hưởng của xử lý nhiệt sơ bộ cho nguyên liệu đến quá

trình trích ly anthocyanin từ gạo đen. ____________________________________ 37

2.3.5 Thí nghiệm 5: Xác định của tỷ lệ HCl trong pha chế dung môi để trích ly

anthocyanin từ gạo đen. _______________________________________________ 39

2.3.6 Thí nghiệm 6: Xác định nhiệt độ thích hợp để trích ly anthocyanin từ gạo đen. 41

2.3.7 Thí nghiệm 7: Xác định thời gian thích hợp trích ly anthocyanin từ gạo đen. _ 43

2.3.8 Thí nghiệm 8: Xác định hoạt tính kháng oxy của anthocyanin. ____________ 45

2.3.9 Thí nghiệm 9: Xác định thông số cho quá trình cô quay thu nhận dịch chiết

anthocyanin cô đặc. __________________________________________________ 46

2.4 Các phương pháp phân tích sử dụng trong nghiên cứu ____________________ 47

2.5 Các phương pháp thống kê và xử lý số liệu _____________________________ 47

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN _______________________________ 48

3.1 Thí nghiệm 1: Xác định độ ẩm ban đầu của nguyên liệu. __________________ 48

3.2 Thí nghiệm 2: Xác định bước sóng hấp thu cực đại của anthocyanin từ mẫu gạo đen

__________________________________________________________________ 48

3.3 Thí nghiệm 3: Xác định ảnh hưởng của kích thước hạt đến hiệu quả trích ly

anthocyanin từ gạo đen. _______________________________________________ 49

3.4 Thí nghiệm 4: Xác định ảnh hưởng của chế độ xử lý nhiệt sơ bộ cho nguyên liệu đến

quá trình trích ly anthocyanin từ gạo đen. _________________________________ 50

3.5 Thí nghiệm 5: Xác định của tỷ lệ HCl trong pha chế dung môi để trích ly anthocyanin

từ gạo đen. _________________________________________________________ 52

3.6 Thí nghiệm 6: Xác định nhiệt độ thích hợp để trích ly anthocyanin từ gạo đen. _ 53

3.7 Thí nghiệm 7: Xác định thời gian thích hợp trích ly anthocyanin từ gạo đen. ___ 55

iii

Đồ án tốt nghiệp

3.8 Thí nghiệm 8: Xác định hoạt tính kháng oxy của anthocyanin. ______________ 56

3.9 Thí nghiệm 9: Xác định thông số cho quá trình cô quay thu nhận dịch chiết

anthocyanin cô đặc. __________________________________________________ 58

KẾT LUẬN- KIẾN NGHỊ ___________________________________________ 64

TÀI LIỆU THAM KHẢO ____________________________________________ 69

PHỤ LỤC A PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CƯU

___________________________________________________________________ 1

PHỤ LỤC B SỐ LIỆU THÍ NGHIỆM. _________________________________ 11

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl).

EtOH (Ethanol)

IC50 (Effective concentration of 50%).

MeOH (Methanol)

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Thành phần hóa học của gạo đen. ............................................................... 7

Bảng 1.2. Các nhóm anthocyanin hiện có trong tự nhiên. ........................................ 10

Bảng 1.3. Một số anthocyanin phổ biến. ................................................................... 11

Bảng 1.4. Bảng các anthocyanin có nguồn gốc thực vật .......................................... 26

Bảng 3.1. Xác định độ ẩm nguyên liệu. .................................................................... 48

Bảng 3.2. So sánh giá trị IC50 của Ascorbic acid và anthocyanin. .......................... 57

Bảng 3.3. Kết quả khả năng kháng DPPH của anthocyanin theo thời gian cô quay.

..................................................................................................................................... 61

Bảng 3.4. Đánh giá sơ bộ cảm quan của dịch chiết anthocynin ............................... 67

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH

Hình 1.1. Gạo đen ........................................................................................................ 7

Hình 1.2. Cation Flavylium (R1 và R2 là OH, H hoặc OCH3, R3 là glucosyl hoặc H,

R4 là OH hoặc glucosyl) ............................................................................................... 9

Hình 1.3. Sự đổi màu của anthocyanin ở các pH khác nhau. ................................... 12

Hình 1.4. Sơ đồ cấu trúc anthocyanin chuyển hóa trong nước. ................................ 14

Hình 1.5. Sơ đồ sự biến tính của anthocyanin 3,5-diglucoside tại pH 3,7 ............... 18

Hình 1.6. Sự biến tính anthocyanin với phản ứng oxy hóa catechol. ....................... 20

Hình 1.7. Phản ứng ngưng tụ của A: Cyanidin và furural; B: Cyanidin ketobase và

furural ......................................................................................................................... 22

Hình 1.8. Sơ đồ Jurd đối với phản ứng thuận nghịch giữa SO2 và anthocyanin. ..... 23

Hình 1.9. Sự chuyển hóa malvin thành malvone bởi H2O2 tạo thành từ sự oxy hóa

Ascorbic acid .............................................................................................................. 24

Hình 1.10. Fla-2-ene được tạo thành từ phản ứng giữa Ascorbic acid và anthocyanin.

..................................................................................................................................... 25

Hình 1.11. Quy trình tách chiết anthocyanin từ bắp cải tím. .................................... 30

Hình 2.1. Sơ đồ quy trình tóm tắt nội dung thí nghiệm ............................................ 33

Hình 2.2. Quy trình trích ly anthocyanin dự kiến .................................................... 34

Hình 2.3. Bố trí thí nghiệm xác định kích thước nguyên liệu cho quá trình trích ly

anthocyanin từ gạo đen............................................................................................... 36

Hình 2.4. Bố trí thí nghiệm xác định chế độ xử lý nhiệt sơ bộ cho nguyên liệu ...... 38

Hình 2.5. Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ HCl trong pha chế dung môi để trích ly

anthocyanin từ gạo đen............................................................................................... 40

Hình 2.6. Bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ thích hợp để trích ly anthocyanin từ

gạo đen ........................................................................................................................ 42

Hình 2.7. Bố trí thí nghiệm xác định thời gian trích ly anthocyanin từ gạo đen ...... 44

Hình 3.1. Quét quang phổ mẫu anthocyanin từ bước sóng 400-700nm trong dung môi

EtOH:0,1N HCl (85:15, v:v). ..................................................................................... 48

vii

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.2. Ảnh hưởng của kích thước hạt nguyên liệu đến hàm lưởng anthocyanin từ

dịch chiết. .................................................................................................................... 49

Hình 3.3. Ảnh hưởng của chế độ xử lý nhiệt cho nguyên liệu đến hàm lượng

anthocyanin từ dịch chiết. .......................................................................................... 50

Hình 3.4. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi EtOH:HCl 1% đến hàm lượng anthocyanin

từ dịch chiết. ............................................................................................................... 52

Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly đến hàm lượng anthocyanin

từ dịch chiết. ............................................................................................................... 53

Hình 3.6. Ảnh hưởng của thời gian trích ly đến nồng độ anhthocynin trong dịch chiết.

..................................................................................................................................... 55

Hình 3.7. Mối tương quan tuyến tính giữa % gốc tự do DPPH bị ức chế với Log[nồng

độ anthocyanin mg/ml]. .............................................................................................. 56

Hình 3.8. Mối tương quan tuyến tính giữa % gốc tự do DPPH bị ức chế với

Log[Ascorbic acid, µg/ml]. ........................................................................................ 57

Hình 3.9. Sự thay đổi nồng độ của anthocyanin trong dịch chiết bán thành phẩm theo

thời gian cô quay. ....................................................................................................... 58

Hình 3.10. Hiệu suất thu hồi anthocyanin trong quá trình cô quay dịch trích ly theo

thời gian. ..................................................................................................................... 59

Hình 3.11. Sự thay đổi về khối lượng của dịch chiết bán thành phẩm theo thời gian

cô quay. ....................................................................................................................... 59

Hình 3.12. Sự thay đổi về thể tích của dịch chiết bán thành phẩm theo thời gian cô

quay. ............................................................................................................................ 60

Hình 3.13. Ảnh hưởng của thời gian cô quay đến khả năng bắt gốc tự do DPPH của

dịch trích ly anthocyanin từ gạo đen. ......................................................................... 61

Hình 3.16. Sơ đồ quy trình trích ly anthocyanin từ gạo đen ..................................... 64

Hình 3.14. Dịch chiết anthocyanin trước cô quay. ................................................... 67

Hình 3.15. Dịch chiết sau cô đặc ............................................................................... 67

viii

Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài.

1.1 Đặt vấn đề.

Chất màu thực phẩm là một trong những phụ gia quan trọng, được sử dụng

không chỉ trong chế biến thực phẩm, mà cả trong công nghiệp mỹ phẩm, dược phẩm

và nhiều ngành công nghiệp khác… Nhu cầu về chất màu thực phẩm rất lớn và không

ngừng tăng lên trong những năm gần đây.

Do nước ta chưa sản xuất được, nên hầu hết các chất màu đều phải nhập từ

nước ngoài. Một số trường hợp, chất màu không rõ nguồn gốc hoặc không đạt tiêu

chuẩn gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe người tiêu dùng.

Trong đó, chất màu quan trọng và hiện diện ở hầu hết các loài thực vật là

anthocyanin. Mà gạo đen được xem là chứa anthocyanin với nồng độ tương đối cao.

Đây là nguồn cung cấp màu triển vọng, an toàn và sự tương tác với thực phẩm tạo ra

nhiều màu sắc đẹp mắt.

1.2 Lý do chọn đề tài.

Sử dụng tấm gạo đen làm nguồn trích ly anthocyanin bởi vì đây là phế liệu giá

thành rẻ, dễ bị hư hỏng do phần phôi gạo gãy chứa nhiều chất béo dễ bị oxy hóa.

Đây cũng là xu hướng đã và đang được Trung Quốc sử dụng anthocyanin như

một chất màu thực phẩm.

Hiện nay trong lĩnh vực thực phẩm, người ta sử dụng dịch uống Chlorophyll

như một thực phẩm chức năng có nhiều tác dụng tốt đối với sức khỏe. Nếu như đề tài

chứn mình được hoạt tính chống oxy hóa, để tạo dịch uống anthocyanin. Đây sẽ là

tiền đề cho dịch màu các thực phẩm khác nhau.

Những đặc tính quý báu của anthocyanin mà các chất màu hóa học, các chất

màu khác hình thành trong quá trình gia công kỹ thuật không có được, đã mở ra một

hướng nghiên cứu ứng dụng hợp chất màu anthocyanin lấy từ thiên nhiên vào trong

Đồ án tốt nghiệp

đời sống hằng ngày, đặc biệt trong công nghệ chế biên thực phẩm. Điều đó hoàn toàn

phù hợp với xu hướng hiện nay của các nước trên thế giới là nghiên cứu khai thác

chất màu từ thiên nhiên sử dụng trong thực phẩm, bởi vì chúng có tính an toàn cao

cho người sử dụng.

Vì thế đề tài nghiên cứu thu nhận anthocyanin từ phế liệu gạo đen và hoạt tính

chống oxy hóa có ý nghĩa quan trọng đối với việc phát triển kinh tế và xã hội nước

ta. Và đó cũng là lý do nhóm nghiên cứu chọn đề tài này để nghiên cứu.

2. Tình hình nghiên cứu.

Trong nước.

Huỳnh Thị Kim Cúc và cộng sự, Chiết tách anthocyanin từ quả dâu bằng nước

sunfured và một số đặc tính của chúng, tiến hành chiết anthocyanin thô với các dung

môi có nồng độ SO2 là 500ppm, 700ppm, 900ppm, 1100ppm và 1500ppm, bổ sung

1% HCl, nhiệt độ 30°C, thời gian chiết 30 phút. Kết quả thu được hàm lượng

anthocyanin khi nồng độ SO2 đạt 1100ppm là cao nhất.

Nguyễn Thị Lan, Lê Thị Lạc Quyên, nghiên cứu ảnh hưởng của hệ dung môi

đến khả năng chiết tách chất màu anthocyanin có độ màu cao từ dâu tây Hội An,

trường Đại Học Bách Khoa, Đại Học Đà Nẳng. Kết quả chọn được hệ dung môi tốt

cho quá trình chiết tách chất màu anthocyanin có độ màu cao từ quả dâu là ethanol -

nước - HC1, với tỷ lệ dung môi ethanol - nước là 1:1 (với 1 % HC1) để hàm lượng

anthocyanin thu được nhiều nhất.

Nguyễn Thị Phương Anh, Nguyễn Thị Lan, nghiên cứu ảnh hưởng của pH

đến màu anthocyanin từ bắp cải tím ứng dụng làm chất chỉ thị an toàn trong phân

tích hóa học và thực phẩm, tạp chí Khoa Học Đà Nẳng. Kết quả khẳng định màu

anthocyanin thay đổi từ đỏ đến xanh khi môi trường thay đổi từ acid sang kiềm.

Huỳnh Thị Kim Cúc và các cộng sự, xác định hàm lượng anthocyanin trong

một sổ nguyên liệu rau quả bằng phương pháp pH vi sai, tiến hành nghiên cứu xác

định được hàm lượng anthocyanin trong một số nguyên liệu rau quả thuộc khu vực

Đồ án tốt nghiệp

miền trung Việt Nam bằng phương pháp pH vi sai. Kết quả cho thấy một số nguyên

liệu có hàm lượng anthocyanin tương đối cao như: quả dâu ta 1,188 %; bắp cải tím

0,909%; lá tía tô 0,397%; trà đỏ 0,335%, vỏ nho 0,564%, vỏ cà tím 0,441%.

Trên thế giới.

Hàng năm theo ước tính tại các nước châu Âu khoảng 10000 tấn vỏ quả nho

được trích để thu được khoảng 50 tấn anthocyanin. Các phẩm màu gốc anthocyanin

có thể là dung dịch cô đặc hoặc dạng bột có chứa các phụ gia khác.

Chất nhuộm màu nói chung và chất nhuộm màu thực phẩm nói riêng đã được

người dân các nước trên thế giới sử dụng vào cuộc sống từ thời xa xưa. Một chất màu

được dùng cho thực phẩm nhất thiết phải hội đủ ba tiêu chuẩn về mặt y tế của chất

phụ gia thực phẩm:

+ Nhuộm thực phẩm thành màu theo mục đích, phù hợp với công nghệ chế

biến thực phẩm.

+ Không có độc tính (gồm cả độc tính cấp, bán cấp và trường diễn)

+ Không là nguyên nhân hoặc tác nhân gây bệnh.

Ngoài ra, do yêu cầu riêng của thực phẩm, các chất nhuộm màu dùng trong

lĩnh vực này không gây mùi lạ và làm thay đổi chất lượng thực phẩm.

Sử dụng các chất màu thực phẩm do có quan hệ trực tiếp đến sức khoẻ và tính

mạng con người. Vì vậy ở nhiều quốc gia và vùng lãnh thổ đã ban hành luật về sử

dụng chất màu trong thực phẩm. Trong các Bộ luật về chất màu thực phẩm, các chất

màu có nguồn gốc là sắc tố thực vật (chất màu tự nhiên) được quy định ưu tiên.

Tóm lại, hiện nay nghiên cứu chất màu thực phẩm trên thế giới được quan tâm

rất lớn ở nhiều quốc gia với nhiều hướng nghiên cứu mới. Trong các hướng nghiên

cứu đó, tìm kiếm và chiết tách chất màu từ thực vật vẫn được ưu tiên hàng đầu trong

các nghiên cứu. Trong đó bao gồm chất màu anthocyanin (E163) với những đặc tính

sinh học quý báu và an toàn cao. (Lưu Đàm Cư, 2005)

Đồ án tốt nghiệp

3. Mục đích nghiên cứu.

Xác định các thông số thích hợp cho quá trình trích ly chất màu anthocyanin

nhằm tách chiết tối đa anthocyanin từ nguyên liệu phù hợp cho mục đích ứng dụng

vào thực phẩm.

4. Nhiệm vụ nghiên cứu.

Để thực hiện mục đích nghiên cứu, nhóm nghiên cứu thực hiện các thí nghiệm

như sau:

- Xác định độ ẩm ban đầu của nguyên liệu.

- Xác định bước sóng hấp thu cực đại của anthocyanin từ gạo đen.

- Xác định ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến quá trình trích ly

anthocyanin.

- Xác định ảnh hưởng của xử lý nhiệt sơ bộ cho nguyên liệu đến quá trình trích

ly anthocyanin.

- Xác định tỷ lệ dung môi thích hợp cho quá trình trích ly anthocyanin.

- Xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình trích ly anthocyanin.

- Xác định thời gian thích hợp cho quá trình trích ly anthocyanin.

- Xác định hoạt tính kháng oxy hóa của anthocyanin.

- Xác định thông số cho quá trình cô quay thu nhận dịch chiết anthocyanin cô

đặc.

5. Phương pháp nghiên cứu.

- Phương pháp thu thập thông tin: Phương pháp nghiên cứu tài liệu làm cơ sở

bố trí thí nghiệm. Sử dụng phần mềm Endnote để tìm tài liệu.

- Thực hành trong phòng thí nghiệm.

Đồ án tốt nghiệp

- Kết quả được xử lý bằng phần mềm thống kê Stagraphics Plus 4.0

- Vẽ đồ thị bằng phần mềm excel 2013, GraphPad Prism.

6. Các kết quả đạt được của đề tài

Đã xác định được các thông số thích hợp cho quá trình trích ly chất màu

anthocyanin nhằm tách chiết tối đa anthocyanin từ nguyên liệu phù hợp cho mục đích

ứng dụng vào thực phẩm:

- Xác định được độ ẩm ban đầu của nguyên liệu là 11,26% ± 0,04.

- Xác định được bước sóng hấp thu cực đại của anthocyanin từ gạo đen là

λmax=535nm trong dung môi EtOH:HCl 1N.

- Kích thước nguyên liệu là 0,0098 inches cho hiệu quả trích ly anthocyanin

với hàm lượng cao nhất.

- Nguyên liệu ở điều kiện nhiệt độ phòng cho hiệu quả trích ly anthocyanin

với hàm lượng cao nhất.

- Xác định được tỷ lệ dung môi thích hợp cho quá trình trích ly anthocyanin là

EtOH:HCl 1% 95:5 (v:v).

- Xác định được nhiệt độ thích hợp cho quá trình trích ly anthocyanin là 55oC.

- Xác định thời gian thích hợp cho quá trình trích ly anthocyanin là 60 phút.

- Xác định được hoạt tính kháng oxy hóa của anthocyanin với giá trị IC50 =

636 (µg/ml).

- Xác định được các thông số cho quá trình cô quay thu nhận dịch chiết

anthocyanin cô đặc. Thời gian cô quay thích hợp là 15 phút. Nhiệt độ cô quay ở 40-

45oC. Nồng độ anthocyanin trong dịch chiết sau cô quay đạt 19,086 mg/ml. Thể tích

dịch sau cô quay còn lại 21,288 % so với thể tích ban đầu (100ml).

Đồ án tốt nghiệp

7. Kết cấu của đồ án.

Nội dung của báo cáo đồ án tốt nghiệp được sắp xếp theo thứ tự như sau:

Nội dung báo cáo gồm có 3 chương :

- Chương 1 : Tổng quan

- Chương 2 : Vật liệu và phương pháp

- Chương 3 : Kết quả, thảo luận

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Gạo đen.

1.1.1 Khái niệm

Gạo sẫm màu có 2 loại là gạo nếp (nếp cẩm) và gạo lứt huyết rồng. Gạo đen

khác với gạo lứt (brown rice) và chứa lượng dưỡng chất lớn hơn. Lớp cám bên ngoài

chứa một lượng đáng kể vitamin E, có tác dụng tốt cho hệ thống miễn dịch và bảo vệ

các tế bào thoát khỏi sự hủy hoại của gốc tự do. Hơn nữa, theo nghiên cứu của Trung

tâm Nông nghiệp Đại học bang Louisiana tại Baton Rouge, gạo đen chứa nhiều chất

chống oxy hóa anthocyanin hơn các loại gạo khác.

Hình 1.1. Gạo đen

1.1.2 Thành phần hóa học

Bảng 1.1. Thành phần hóa học của gạo đen.

Thành phần Tỷ lệ %

Nước 14

Protein 8,2

Lipid 1,5

Glucid 74,9

Acid hữu cơ 0,6

Tro 0,8

Đồ án tốt nghiệp

1.2 Anthocyanin.

1.2.1 Giới thiệu chung

Các Anthocyanỉn hiện thuộc nhóm các chất màu tự nhiên tan trong nước lớn

nhất trong thế giới thực vật. Hiện diện hầu hết ở các thực vật bậc cao, chủ yếu ở lá,

hoa, rễ thân. Thường được tìm thấy ở các tế bào bên ngoài. Thuật ngữ anthocyanin

bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp, trong đó Anthocyanin là sự kết hợp giữa Anthos - nghĩa

là hoa và Kysanesos - nghĩa là màu xanh. Tuy nhiên, không chỉ có màu xanh,

anthocyanin còn mang đến cho thực vật nhiều màu sắc rực rỡ khác như hồng, đỏ, cam

và các gam màu trung gian. Các anthocyanìn khi mất hết nhóm đường được gọi là

anthocyanidin hay aglycon. Mỗi anthocyanidin có thể bị glycosyl hóa acylate bởi các

loại đường và các acid khác tại các vị trí khác nhau. Vì thế lượng anthocyanin lớn

hơn anthocyanidin từ 15-20 lần. Chúng được sử dụng làm phụ gia thực phẩm với ký

hiệu là E613.

Anthocyanin tinh khiết ở dạng tinh thể hoặc vô định hình là hợp chất khá phân

cực nên tan tốt trong dung môi phân cực.

Anthocyanin hòa tan tốt trong nước và trong dịch bão hòa. Khi kết hợp với

info.net/uk/colour/anthocyanin.htm).

đường là cho phân tử anthocyanin hòa tan hơn. (http://www.food-

1.2.2 Cấu trúc phân tử

Anthocyanin là những glucoside do gốc đường glucose, glactose… kết hợp

với gốc aglucon có màu (anthocyanidin). Aglucon của chúng có cấu trúc cơ bản được

mô tả trong hình 1. Các gốc đường có thể được gắn vào vị trí 3, 5, 7; thường được

gắn vào vị trí 3 và 5 còn vị trí 7 rất ít. Phân tử anthocyanin gắn vào vị trí 3 gọi là

monoglycoside, ở vị trí 3 và 5 gọi là diglycoside.

Anthocyanin là những hợp chất glycoside của anthocyanidin hiện có trong

thiên nhiên bao gồm các dẫn xuất polyhydro và polymethoxy của 2 -

phenylbenzopyrylium hoặc muối flavylium.

Đồ án tốt nghiệp

Sự khác nhau giữa các anthocyanin được xác định bởi sự khác nhau giữa số

lượng và vị trí của nhóm hydroxyl trong phân tử; mức độ methyl hóa của nhóm

hydroxyl; bản chất, vị trí của các nhóm đường gắn vào phân tử; bản chất số nhóm

acid mạch thắng hay mạch vòng gắn vào phân tử.

Hình 1.2. Cation Flavylium (R1 và R2 là OH, H hoặc OCH3, R3 là glucosyl

hoặc H, R4 là OH hoặc glucosyl)

Các aglucon của anthocyanin khác nhau chính là do các nhóm gắn vào vị trí

R1 và R2, thường là H, OH hoặc OCH3.

Các anthocyanin khi bị mất hết các nhóm đường được gọi là anthocyanidin

hay aglycone, mỗi anthocyanindin có thể bị glycosyl hóa và acyl hóa bởi các loại

đường và các acid khác nhau tại những vị trí khác nhau nên số lượng anthocyanin lớn

hơn 10-20 lần so với số lượng anthocyaninidin

Sự glycosyl hóa các anthocyanin có thể xảy ra ở vị trí 7, 3’, 4’, 5’ đối với nhóm

hydroxyl. Tuy nhiên, do án ngữ không gian nên sự glycosyl hóa không thể xảy ra ở

vị trí 3’ và 4’.

Căn cứ vào vị trí và số nhóm đường gắn vào anthocyanidin mà người ta phân

loại anthocyanin thành 18 nhóm trong đó có dạng thông dụng nhất là 3-monoside, 3-

bioside, 3,5-diglycoside và 3,7-diglycoside.

Các loại đường thông thường nhất liên kết với anthocyanidin là glucose, các

mono saccharide (rhamnose, galactose, xylose, arabinose), các disaccharide

Đồ án tốt nghiệp

(rutinose, sabubiose, sophorose, ít thông dụng hơn là lathyrose, gentiobiose hoặc

laminariobiose). Ngoài ra, các trisacchride cũng có thể liên kết với anthocyaninidin.

Bảng 1.2. Các nhóm anthocyanin hiện có trong tự nhiên.

Anthocyanidin R1

R2 R3

R4 R5

R6 R7

Apigeninidin

-H

-OH

-H

-OH

main colour orange

E- number

Aurantinidin

-H

-OH

orange

Capensinidin

- OH -H

-OH

bluish- red

Cyanidin

- OCH3 -OH

- OCH3 -H

- OCH3 -OH

-H

-OH magenta E163a

Delphinidin

-OH

-H

-OH

E163b

-OH

Europinidin

-OH

-H

-OH

Hirsutidin

- OCH3 -OH

-H

Luteolinidin

- OCH3 - OCH3 -OH

- OCH3 -H

- OH - OH - OH - OH - OH - OH -H

- OCH3 -OH

-OH

-H

purple, blue bluish red bluish- red orange

E163d

Pelargonidin

-H

-OH

-H

-OH

Malvidin

-OH

-H

-OH

orange, salmon purple

E163c

Peonidin

- OCH3 -H

-OH

-H

-OH magenta E163e

Petunidin

- OCH3 - OCH3 -OH

-OH

-H

-OH

purple

E163f

- OCH3 -OH

Pulchellidin

-OH

-H

-OH

-H

Rosinidin

- OCH3 -OH

-H

bluish- red red

- OH - OH - OH - OH - OH - OH -H

Triacetidin

- OCH3 -OH

-OH

-H

red

- OH - OH - OH - OH - OH - OH - OH - OH - OH - OH - OH - OH - OH - OH - OH

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.2 cho thấy sự methyl hóa các anthocyanin và những hợp chất glycoside

của chúng thường xảy ra ở vị trí C-3’ và C-5’, đôi khi cũng xảy ra ở vị trí C-5 và C-

7. Tuy nhiên thực tế cho thấy không có anthocyanin mà sự glycosyl hóa hoặc

methoxyl hoa xảy ra đồng thời ở các vị trí C-3, -5,-7 và -4’. Nhóm hydroxyl ở một

trong các vị trí C-5, C-7 hoặc C-4’ thì thích hợp cho việc hình thành cấu trúc

quinonoidal (anhydro) base.

Các anthocyanin thường bị acyl hóa bởi acid p-coumaric, cafeic, ferulic, hoặc

những acid sinapic, đôi khi anthocyanin cũng bị acyl hóa bới các acid như : p-

hydroxybenoic, malonic, hoặc acetic. Sự thay thế nhóm acyl thường xảy ra ở vị trí C-

3 của nhóm hydroxyl đối với đường.

Bảng 1.3. Một số anthocyanin phổ biến.

Anthocyanin Anthocyanidin Đường Có ở cây

Pelargonin Pelargonidin 2 glucose Cúc tây

Cianin Cynanindin 2 glucose Hoa hồng

Ceraxinanin Cynanindin Glucose, galactose Quả mận

Prunixianin Cynanindin Ramnoza, glucose Việt quất

Cẩm quỳ Idain Cyrinhindin 2 glucose

Mẫu đơn Delfin Peonidin 2 glucose

Nho Malvin Enidin glucose

Anh thảo Peonin Hirsutidin 2 glucose

Anthocyanin tính khiết ở dạng tinh thể hoặc vô định hình là hợp chất khá phân

cực nên tan tốt trong dung môi phân cực. Màu sắc của anthocyanin luôn thay đổi phụ

thuộc vào pH (hình 2), các chất màu có mặt và nhiều yếu tố khác. Tuy nhiên màu sắc

của anthocyanin thay đổi mạnh nhất phụ thuộc vào pH của môi trường. Thông thường

khi pH < 7 các anthocyanin có màu đỏ, khi pH > 7 thì có màu xanh. Ở pH = 1 các

anthocyanin thường ở dạng muối oxonium màu cam đến đỏ, ở pH 4 ± 5 chúng có thể

chuyển về dạng base cacbinol hay base chalcon không màu, ở pH = 7 ± 8 lại về dạng

base quinoidal anhydro màu xanh.

Đồ án tốt nghiệp

Anthocyanin có bước sóng hấp thụ trong miền nhìn thấy, khả năng hấp thụ

cực đại tại bước sóng 510 ± 540 nm. Độ hấp thụ là yếu tố liên quan mật thiết đến màu

sắc của các anthocyanin. Chúng phụ thuộc vào pH của dung dịch và nồng độ

anthocyanin: thường pH thuộc vùng acid mạnh có độ hấp thụ lớn, nồng độ

anthocyanin càng lớn độ hấp thụ càng mạnh.

Hình 1.3. Sự đổi màu của anthocyanin ở các pH khác nhau.

Trong các chất màu thực phẩm có nguồn gốc tự nhiên thì anthocyanin là họ

phổ biến nhất tồn tại trong hầu hết các thực vật bậc cao và tìm thấy được trong một

số loại rau, hoa, quả, hạt có màu từ đỏ đến tìm như: gạo đen, quả nho, quả dâu, bắp

cải tím, lá tía tô, hoa hibiscus, đậu đen, quả cà tím…

1.2.3 Tính chất, đặc điểm.

Màu của anthocyanin hoàn toàn thay đổi khi pH môi trường chuyển từ acid

sang base và giống như các chất chỉ thị acid-base (phenolphtalein, methyl đỏ, methyl

da cam).

Đồ án tốt nghiệp

Trong dung dịch acid, anthocyanin tồn tại dạng ở cation flavylium có màu đỏ.

Khi pH tăng dần, có sự tấn công của nước vào vòng pyran C, anthocyanin chuyển

dần sang dạng base carbinol và chalcone không màu. Đây chính là quá trình hydrat

hóa, yếu tố chính tạo nên sự bạc màu của dung dịch màu-nước. trong dung dịch base,

có sự dịch chuyển của H+ từ -OH trên vòng B, anthocyanin chuyển sang dạng anion

có màu xanh. Khi pH môi trường càng cao, ion H+ trogn nhóm –OH còn lại bị phân

hủy và khi ấy điện tử không còn, màu xanh trở nên xanh hơn bởi vì ánh sáng hấp phụ

trở thành đỏ hơn. Trong môi trường trung tính, cả hai dạng cùng tồn tại nên dung dịch

có màu tím.

1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến màu sắc và độ bền của anthocyanin.

So với đa số các chất màu thiên nhiên, anthocyanin là chất màu có độ bền kém

hơn, nó chỉ thể hiện tính bền trong môi trường acid. Ngoài ra, nó có thể phân hủy tạo

thành dạng không màu và sản phẩm cuối cùng của sự phân hủy có dạng màu nâu cộng

với những sản phấm không tan.

Sự phân hủy anthocyanin có thể xảy ra trong quá trình trích ly và tinh chế

chúng, đồng thời sự phân hủy này còn xảy ra trong quá trình xử lý và bảo quản các

sản phấm thực phẩm.

Độ bền của các anthocyanin phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: cấu trúc hóa học

của anthocyanin, pH, nhiệt độ, sự có mặt của copigment, ion kim loại, oxy, acid

ascorbic, SO2, ánh sáng, enzyme, đường và các sản phấm biến tính của chúng. Vì

vậy, nghiên cứu các yếu tổ ảnh hưởng đến độ bền của anthocyanin là điều cần thiết

trước khi ứng dụng nó như một chất màu thực phẩm.

1.2.4.1 Cấu trúc

a) Cấu trúc chuyển hóa trong môi trường lỏng.

Trong môi trường nước các anthocyanin tự nhiên giống như chất chỉ thị pH.

Đỏ ở pH thấp, đỏ xanh ở pH trung tính, và không màu ở pH cao.

Đồ án tốt nghiệp

Tại pH đã cho, tồn tại một cân bằng giữa 4 cấu trúc của anthocyanin và

aglycone: quinonoidal (anhydro) bazo (A) màu xanh, cation flavylium (AH+) màu

đỏ, carbinol pseudobase (B), và chalcone (C) không màu.

Hình 1.4. Sơ đồ cấu trúc anthocyanin chuyển hóa trong nước.

Khi pH < 2.0, các anthocyanin tồn tại chủ yếu dạng cation flavylium màu đỏ

(R3=0-đường) hoặc màu vàng (R3 = H).Khi pH tăng, sự mất proton xảy ra nhanh

thành dạng quinononidal màu xanh dương hoặc màu đỏ. Dạng quinonoidal thường

tồn tại như một hỗn hợp vì pKa của nhóm OH ở vị trí 4’,7 và 5 (nếu có) là tương tự.

Khi để yên, sự chuyển hóa hơn nữa sẽ xảy ra đó là sự tách nước của cation flavylium

cho dạng carbinol không màu hay pseudobase (hemiacetal), Dạng này cân bằng với

dạng chalcone vòng mở không màu.

Cis (CE) và trans-chalcone (Cz) được tạo thành từ carbinol pseudobase bởi

phản ứng mở vòng nhanh và isomer hóa chậm. Cả 2 chalcone bình thường bởi chung

có nhóm chức carbonyl ở cạnh vòng B, trong đó chalcone bình thường có nhóm

carbonyl ớ kế cận vòng A.

Dạng quinonoidal base được tạo thành thông thường ở pH > 3. Cation

flavylium tương đối bền ở môi trường acid (như pH < 3). Trong môi trường trung

Đồ án tốt nghiệp

tính hay acid yếu, anthocyanin tồn tại chủ yếu ớ các dạng không màu. Vì vậy, sự ổn

định của các dạng mang màu, đặc biệt là dạng quinonoidal base, một phần là do sự

xuất hiện của các gốc acid gắn vào phân tử đường, hay còn gọi là sự co-pigment hóa

nội phân tử. Sở dĩ sự co-pigment hóa nội phân tử giúp tăng độ bền của phân tử

anthocyanin là do sự xếp chồng của vòng thơm trong gốc acid với vòng pyrylium của

phân tử anthocyanin, giảm bớt khả năng bị các phân tử nước tấn công hình thành các

hợp chất carbinol, chalcone không màu. Ngoài ra, hiệu ứng copiment hóa ngoại phân

tử cũng có thể giúp làm bền các cấu trúc quinoldal base hay ion flavylium do sự có

mặt của những phức chất không màu, như các flavone, flavonol. Trong quá trình xử

lý nhiệt và ánh sáng, quá trình co-pịgment hóa ngoại phân tử giữ vai trò quan trọng,

ngăn chặn sự mất màu có thể xảy ra. Cơ chế phân hủy do nhiệt nói chung do chuyển

hóa thuận nghịch của các ion flavylium thành các dạng chalcone. Chalcone là chất

trung gian trong cả hai quá trình phân hủy do nhiệt và ánh sáng của anthocyanin.

Theo các nghiên cứu gần đây (Davis và cộng sự, 1983; Mazza và Brouiỉìard,1990)

hiệu ứng co-pigment hóa chính là cơ chế làm bền màu chính của anthocyanin trong

thực vât do nó làm giảm tỉ lệ giữa dạng không mang màu (chalcone) và dạng mang

màu thông qua việc tạo phức với dạng mang màu, ngăn chặn quá trình chuyển hóa từ

dạng mang màu sang dạng không mang màu.

Trong dung dịch, anthocyanin dạng không acyl hóa hay acyl hóa một đơn vị

đóng vai trò như một chất chỉ thị pH, tồn tại ở dạng acid hay base tùy thuộc vào giá

trị pH. Ở pH acid (pH < 3), dung dịch anthocyanin cho màu đỏ đậm. Khi pH tăng,

màu sắc của dung dịch sẽ nhạt dần và chuyển sang không màu và cuối cùng có màu

tím hay xanh dương ở pH cao (pH > 6).

b) Cấu trúc hóa học

Các pigment anthocyanin thường có độ bền thấp trong tế bào sống của chúng.

Như đã trình bày ở trên, độ bền của các anthocyanin phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố:

Cấu trúc hóa học của anthocyaninm, pH, nhiệt độ, sự có mặt của co-pigment, ion kim

loại, oxy, acid ascorbic, S02, ánh sáng, enzyme, đường và các sản phẩm biến tính của

chúng.

Đồ án tốt nghiệp

Độ bền màu và cường độ màu của các anthocyanin phụ thuộc vào vị trí và số

lượng của các nhóm hydroxyl, methoxyl, đường và các đường được acyl hóa. Khi số

nhóm hydroxyl trong vòng B tăng, cực đại hấp thụ ở vùng thấy được dịch chuyển về

phía có bước sóng dài hơn và màu thay đổi từ cam đến xanh dương.

Ví dụ: bước sóng hấp thụ cực đại trong dung dịch HCL 0,01% MeOH là 535

nm (cam) đối với pelgonidin, 535 nm (đỏ cam) đối với cyaniding, 545 nm (đỏ xanh)

đối với dephinidin.các nhóm methoxyl thay thế các nhóm hydroxyl cho kết quả ngược

lại. Nhóm hydroxyl tại vị trí C-3 đặc biệt có ý nghĩa quan trọng vì nó dịch chuyển từ

màu cam vàng đến màu đỏ nhưng 3 - deoxyanthocyanin : luteolinidin và tricetinidin

có màu vàng; 3 - deoxyanthocyanidin bền hơn các anthocyanidin khác (Mazza và

Brouillard, 1987; Iacobucci và Sueny, 1983).

Sự có mặt của nhóm hydroxyl tại vị trí C-5 và nhóm thế ở vị trí C-4, cả 2 bền

hóa dạng có màu thông qua sự ngăn cản các phản ứng hydrat hóa dẫn đến dạng không

màu.

Khi mức độ hydroxyl hóa các aglycone tăng, tính bền của các anthocyanin sẽ

giảm. Tuy nhiên khi tăng sự methoxyl hóa,sẽ thu được kết quả ngược lại.

Ví dụ: sự có mặt của nhóm OH ở vị trí 4’ và 7 trong phân tử làm bền hóa đáng

kể các pigment, trong khi đó, sự methoxyl hóa có nhóm hydroxyl này làm giảm độ

bền.

Các anthocyanin được glycosyl hóa và acyl hóa sẽ cho dạng màu xanh. Sự

glycol hóa những nhóm OH tự do làm tăng tính bền của anthocyanin. Vì vậy, các

diglucoside bền hơn các monoglusidc của cùng một anthocyanin.

Ví dụ: thời gian bán sống (giảm 50% độ hấp thu tại bước sóng hấp thu cực đại)

của các cianidin 3 - utinoside là 65 ngày tại nhiệt độ phòng trong dung dịch acid citric

0,01M, pH = 2,8. Trong khi đó anthocyanidin tự do trong cùng điều kiện có thời gian

bán sống chỉ có 12h.

Đồ án tốt nghiệp

Anthocianin có chứa 2 hay nhiều nhóm acyl (như tematin, platyconin,

cinerarrin, gntiodenphin và zebrrinin) là bền trong môi trường trung tính hoặc acid

yếu do lien kết hydro giữa các nhóm hydroxyl của các nhân phenolic trong

anthocyanin và acid vòng thơm. Brouillard (1981-1982) và Goto cùng với cộng

viên(1982-1983) khảo sát rằng các anthocianin diacylate hóa được bền hóa bởi sự

liên kết chặt nhờ sự tương tác giữa vòng anthocyanin và 2 nhóm acyl vòng thơm.

1.2.4.2 pH

Trong môi trường nước, pH có ảnh hưởng đáng kể lên màu sắc của

anthocyanin (Brouillard 1984,Mzza và Brouillard 1987). Cấu trúc, độ bền màu, màu

sắc của anthocyanin thay đổi theo sự thay đối của pH. Sự thay đổi cấu trúc của

anthocyanin khi pH thay đổi đã được đề cập trong phần cấu trúc chuyển hóa.

Ở pH < 2.0, dung dịch anthocyanin có màu hầu như đỏ (R3 = O-đường) hoặc

vàng (R3 = H). Khi tăng pH của dung dịch, màu của các anthocyanin nhạt dần. Khi

pH trong khoảng 4.0-6.0, hầu hết các anthocyanin đều có dạng không màu. Nếu tiếp

tục tăng pH, dung dịch sẽ có màu tím hoặc xanh dương và màu này có thể chuyển

sang màu vàng nếu để yên hoặc xử lý nhiệt.

Sự biến tính của các anthocyanin tăng mãnh liệt với sự tăng của pH trong môi

trường có oxy.

Chẳng hạn : rubrobraxinin cloma là các anthocyanin của bắp cải tím là một

triglucozit của xianidin.

Khi: pH = 2,4 - 4,0 có màu đỏ thắm.

pH = 4 - 6 thì có màu tím.

pH = 6 thì có màu xanh lam.

pH là kiềm thì có màu xanh lá cây.

Đồ án tốt nghiệp

1.2.4.3 Nhiệt độ.

Hầu hết, các phản ứng hóa học liên quan đến độ bền anthocyanin và tốc độ

phân hủy chúng đều phụ thuộc vào nhiệt độ. Sự tăng theo hàm số logarit của các

anthocyanin ứng với sự phân hủy anthocyanin ứng với sự tăng đại số của nhiệt độ.

Tính bền nhiệt của các anthocyanin phụ thuộc vào cấu trúc của chúng, pH, sự có mặt

của oxy và sự tác động qua lại giữa các thành phần.

Hình 1.5. Sơ đồ sự biến tính của anthocyanin 3,5-diglucoside tại pH 3,7

Khi một cấu trúc của anthocyanin bền với sự gia tăng của pH thì nó cũng bền

với sự gia tăng của nhiệt độ. Sự hydroxyl hóa các aglycone làm giảm tính bền của

anthocyanin, trong khi sự methoxyl hóa, glycosyl hóa, acyl hóa sẽ cho kết quả ngược

lại.

Ví dụ: anthocyanin 3-glycoside có độ bền nhiệt lớn nhất tại pH = 1.8 - 2.0 với

sự có mặt của oxy trong khi anthocyanidin 3,5-diglycoside có độ bền nhiệt lớn nhất

tại pH = 4.0 - 5.0.

Cơ chế của sự phân hủy nhiệt xảy ra không những phụ thuộc vào nhiệt độ mà

còn phụ thuộc vào bản thân anthocyanin đó.

Drazdina cho rằng coumarin glycoside là sản phẩm phân hủy phổ biến của

anthocyanin 3,5 - diglycoside và cơ chế của sự phân hủy là: đầu tiên, cation flavylium

chuyển thành dạng quinonidal base, tiếp theo là hình thành nhiều dạng sản phẩm trung

gian và cuối cùng thu được dẫn xuất coumarin và thành phần tương ứng với vòng B

Đồ án tốt nghiệp

của anthocyanidin. Sự biến tính này không những được xúc tiến bởi nhiệt độ mà còn

bị ảnh hưởng bởi oxy.

Anthocyanidin 3-glycoside thì không hình thành những dẫn xuất coumrin mà

bước đầu tiên của sự phân hủy bao gồm sự chuyển hóa của dạng carbinol pseudobase

không màu, sau đó là sự mở vòng pyrylium để hình thành dạng chalcone trước khi

thủy phân liên kết glycoside.

Adams cho rằng, các anthocyanidin 3-glycoside khi được nung nóng ở pH =

2.0-4.0 đầu tiên sẽ bị thủy phân liên kết glycoside (ở 100°C) sau đó là sự biến đổi

aglycone thành chalcone. Sự biến tính hơn nữa dẫn đến hình thành dạng sản phấm

màu nâu đặc biệt là với sự có mặt của oxy.

Khi đun nóng lâu dài các anthocyanin có thể bị phân huỷ và mất màu, đặc biệt

là các anthocyanin của dây tây, anh đào, củ cải. Ngược lại các anthocyanin của phúc

bồn tử đen cũng trong điều kiện đó lại không bị thay đổi. Nhìn chung khi gia nhiệt,

các chất màu đỏ dễ dàng bị phân huỷ, còn các chất màu vàng thì khó hơn.

1.2.4.4 Oxy.

Oxy và nhiệt độ được xem là những tác nhân đặc trưng xúc tiến sự phân hủy

của anthocyanin, từ đó sinh ra những dạng sản phẩm không màu hoặc màu nâu. Sự

kết tủa và đóng váng trong nước trái cây có thể gây ra từ sự oxy hóa trực tiếp dạng

carbinol pseudobase.

Oxy hóa mãnh liệt các anthocyanin khi nung nóng. Oxy và nhiệt độ là những

tác nhân xúc tiến đăc biệt nhất trong nước ép của blueberry, cherry (anh đào), currant,

nho, raspberry và dâu.

Lượng anthocyanin còn lại của dâu sẽ lớn hơn khi đóng chai dưới điều kiện

chân không hoặc nitrogen (Baravingas và Cain, 1965). Độ bền của các pigment của

nho, được sử dụng như là chất màu ở nước giải khát được tăng lên khi đóng hộp với

nitrogen.

Đồ án tốt nghiệp

1.2.4.5 Enzyme

Nhiều enzyme nội sinh trong tế bào của cây có khả năng làm mất màu

anthocyanin. Những enzyme này được gọi chung là anthocyanase. Dựa vào đặc tính

của các enzyme mà người ta phân làm 2 nhóm: Glycosidase và polyphenol oxidase

(PPO). Các enzyme này thu được từ nấm (fugal).

+Glycosidase: là enzyme thủy phân liên kết glycoside của anthocyanin tạo ra

đường tự do và aglycone này kém bền hơn rất nhiều và mất màu rất nhanh khi có mặt

của catecol (Huang 1955).

+Polyphenol oxidase (PPO): tác dụng lên anthocyanin với sự có mặt của o-

diphenol thông qua cơ chế oxy hóa kết hợp (h 6-6). Theo Gromeck và Markakis, sự

thêm vào glycosidase và PPO xúc tác cho quá trình peroxide hóa phân hủy

anthocyanin.

Hình 1.6. Sự biến tính anthocyanin với phản ứng oxy hóa catechol.

Peng và Markakis đã đề nghị một cơ chế mà trong đó o-quinine được tạo thành

bởi sự oxy hóa anthocyanin (H-17). Blom phân lập được enzyme anthocyanin -

glycosidase từ Aspergillus niger và chỉ ra ảnh hưởng của nó trong quá trình thủy phân

liên kết glycoside của anthocyanin. PPO là enzyme có ảnh hưởng yếu lên anthocyanin

dạng quinonoidal base dễ bị thủy phân bởi PPO hơn dạng cation flavylium. Tốc độ

Đồ án tốt nghiệp

phân hủy bởi PPO phụ thuộc vào sự thay thế mô hình của vòng B và mức độ glycosyl

hóa.

1.2.4.6 Ánh sáng.

Các anthocyanin thường không bền khi tiếp xúc với tia tử ngoại, ánh sáng thấy

được và các nguồn phóng xạ khác. Ánh sáng có 2 ảnh hưởng đến anthocyanin:

- tăng cường cho quá trình sinh tổng hợp.

- xúc tiến sự biến tính của chúng.

Những quả táo giống đỏ sẽ không chín đỏ mà xanh trong bóng tối (Siegenman,

1964 ). Vanburen và cộng sự (1948) tường trình rằng các diglycoside được acyl hóa

và methyl hóa là các diglycoside không bị acyl hóa là ít bền hơn và monoglycoside

là kém bền nhất, Palamidis và Markakis (1975) đã tìm thấy rằng ánh sáng thúc đẩy

quá trình phân hủy anthocyanin trong nước giải khát có C02 được phối màu với

anthocyanin từ xác nho. Macccarone và cộng sự đã nghiên cứu sự quang hóa của

anthocyanin và chỉ ra rằng, anthocyanin diglycosyl hóa tại vị trí C-3 và C-5 là bền

hơn các anthocyanin mono glycoyl hóa tại vị trí C-3 đồng thời chúng bền hơn so với

các aglycone tương ứng.

1.2.4.7 Đường và các sản phẩm biến tính của chúng

Ở nồng độ 100 ppm, đường và các sản phẩm phân hủy của chúng có tác dụng

thúc đẩy sự phân hủy các anthocyanin. Fructose, arabinose, lactose và sorbose có khả

năng phân hủy anthocyanin mạnh hơn glucose, sucrose,và maltose. Tốc độ phân hủy

của anthocyanin liên quan đến tốc độ phân hủy của đường. Các sản phẩm phân hủy

của đường gồm có: furfural, 5-hydroxymethyl furfural và acctaldehydc thude từ phản

ứng Mailard hoặc từ sự oxy hóa của acid ascorbic, polyuronic hoặc ở bản thân các

anthocyanin. Những sản phẩm phân hủy này dễ dàng ngưng tụ với các anthocyanin

hình thành những hợp chất phức tạp có màu nâu sẫm. Sự phân hủy anthocyanin với

sự có mặt của furfural và HMF trực tiếp phụ thuộc vào nhiệt độ và rõ nét nhất là trong

Đồ án tốt nghiệp

nước trái cây sự có mặt của oxy làm tăng thêm hiệu quả phân hủy của tất cả các loại

đường và các dẫn xuất của chúng.

Hình 1.7. Phản ứng ngưng tụ của A: Cyanidin và furural; B: Cyanidin

ketobase và furural

1.2.4.8 Các ion kim loại.

Một số ion kim loại đa hóa trị có thể tương tác với các anthocyanin có nhóm

OH ở vị trí ortho gây ra hiệu ứng sâu màu (bathocromic). Hiện tượng này xảy ra khi

kim loại tiếp xúc với anthocyanin trong quá trình chế biến rau quả hoặc sự cho thêm

các muối kim loại vào trong thực phẩm.

Sistrunk và Cash đã chứng minh rằng có thể bền hóa màu của dịch trích dâu

bằng cách thêm vào đó muối thiếc. Francis (1977) công bố rằng, các ion Ca, Fe, Al

tạo thêm sự bảo vệ cho anthocyanin của nước ép trái việt quất (cranberry ), nhưng sự

biến đổi màu xảy ra là do sự tạo phức giữa ion kim loại và tannin, kết quả sau cùng

là không có lợi.

Trong công nghiệp đồ hộp, sự mất màu của những trái cây có chứa

anthocyanin là do có phản ứng với thiếc của đổ hộp (Culpepper và Caldwell, 1972).

Trong phản ứng với thiếc, anthocyanin đóng vai trò như chất khử cực catod hoặc

Đồ án tốt nghiệp

anod. Chất khử cực catod có thể bị khử bởi hydro mới sinh từ phản ứng giữa kim loại

và acid, còn chất khử cực anod thường là các anthocyanin có ít nhất 2 nhóm hydroxyl

ở vị trí ortho.

1.2.4.9 Sulfurdioxide (SO2)

Các anthocyanin thường bị mất màu khi có mặt của SO2. Hiện tượng này

thường xảy ra trong quá trình xử lý các sản phẩm thựcphẩm có chứa anthocyanin

bằng SO2. Quá trình khử này có thể là thuận nghịch hoặc bất thuận nghịch. Trái cây

và nước quả được xử lý bằng một lượng trung bình SO2 (500-2000 ppm), làm mất

màu các anthocyanin của chúng trước khi chế biến, hơn nữa, chúng được desulfit hóa

và màu anthocyanin được phục hồi. Jurd đã đề nghị sơ đồ phản ứng thuận nghịch

giữa SO2 và anthocyanin trong đó, dạng có màu flavylium phản ứng với ion

bisulphate tạo thành chromene - 2 - (hoặc 4 ) - sulphonic acid.

Hình 1.8. Sơ đồ Jurd đối với phản ứng thuận nghịch giữa SO2 và

anthocyanin.

SO2 ở nồng độ rất thấp (khoảng 30 ppm) có thể ức chế sự biến tính do enzyme

của anthocyanin trong quả anh đào nhưng không làm mất màu chúng (Goodman và

Markakis, 1965 ). Sự tẩy màu bất thuận nghịch xảy ra trong quá trình tẩy quả với

lượng lớn SO2 (0.8 - 1.5% ) và soda (0.4 - 1.0%) được dùng trong quá trình tẩy quả.

Phản ứng bất thuận nghịch này chưa được biết hoàn toàn.

Đồ án tốt nghiệp

1.2.4.10 Acid ascorbic

Nhiều nhà khảo sát (Beatic và cộng sự 1943; Pederson và cộng sự 1947;

Kertesz 1952; Meschter 1953; Markakis và cộng sự 1957; Starr và Francis 1968) quan

sát sự biến mất đồng thời của acid ascorbic và anthocyanin trong nước trái cây tồn

trữ và đề nghị một tương tác có thế có giữa 2 hợp chất này. Acid ascorbic hiện diện

trong hầu hết các sản phẩm trái cây, vitamin này bị oxy hóa tạo thành H2O2 và chính

H2O2 làm mất màu anthocyanin.

Hình 1.9. Sự chuyển hóa malvin thành malvone bởi H2O2 tạo thành từ sự

oxy hóa Ascorbic acid

Shrikhande và Francis đã tìm thấy rằng các ion đồng xúc tiến và các flavonoid

làm giảm sự phân hủy của cả hai acid ascorbic và anthocyanin. Những sản phẩm

không màu ( hình 1.10 ). Acid dehyroascorbic cũng có thể làm mất màu anthocyanin

nhưng tại tốc độ thấp hơn acid ascorbic.

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.10. Fla-2-ene được tạo thành từ phản ứng giữa Ascorbic acid và

anthocyanin.

1.2.5 Sự phân bố của anthocyanin.

Anthocyanin tập trung ở những cây hạt kín và những loài ra hoa, phần lớn nằm

ở hoa và quả, ngoài ra cũng có ở lá và rễ. Trong những loại thưc vật này, anthocyanỉn

được tìm thấy chủ yếu ở các lóp tế bào nằm bên ngoài như biểu bì.

Các hợp chất anthocyanin xuất hiện rộng rãi trong khoảng ít nhất 27 họ, 73

loài và trong vô số giống thực vật sử dụng làm thực vật (Bridle và Timberỉake, 1996).

Các họ thực vật như vitaceae (nho) và rosaceae (cherry, dâu tây, mâm xôi, táo...) là

các nguồn anthocyanin chủ yếu. Bên cạnh đó còn có các họ thực vật khác như

solanceae (cà tím), saxifragaceae (quả lý đỏ và đen), ericaceae (quả việt quốc) và

brassicaceae (bắp cải tím). Các loại anthocyanin phô biến nhất là các glucoside của

cyanidin, kế đến là pelargonidin, peonidin và delphinidin, sau đó petuidin và

maldivin. số lượng các 3-glucoside nhiều gấp 2,5 lần các 3,5-glucoside. Loại

anthocyamn hay gặp nhất chính là Cyaidin-3-glucoside.

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 1.4. Bảng các anthocyanin có nguồn gốc thực vật

Tên thực vật Tên thông

Loại Anthocyanin

Allium cepa

thưòng Củ hành tím

Brassica oleraea

Bắp cải tím (red cabbage)

Fragaria spp Dâu tây

Cy-3-glucoside, 3-galactoside, 3- diglucoside và 3- laminarriobiosidc, Pn-3-glucoside Cy-3-sophoroside-5-glucoside cacyl hóa với malonoyl, p-coumaroyl, di- p-coumarol,feruloyl, diferuloyl, sinapoyl và disinapoyl Pg và Cy-3-glucoside

(strawberry) Đậu nành (vỏ)

Cy và Dp-3-glucoside

Hoa bụt dấm

Cy, Pn, mono- và biosides

Củ cải đỏ (rễ)

Nho

Glycine maxima Hibicus sabdariffa L Raphanus sativus Vitis spp

Pg và Cy-3-sophoroside-5-glucoside acyl hóa với p- coumaroyl, feruloyl, caffeoyl. Cy, Pn, Dp, Pt và Mv mono và diglucoside; dạng tự do và dạng acyl hóa

Đồ án tốt nghiệp

Cy = cyanidin, Pg= pelagorindin, Pn= peonidin, Dp= delphinidin, Pt = petunidin, Mv= malvidin.

1.2.6 Các anthocyanin đã được thương mại hóa

Encolor liqid DS (công ty Reggianna, Antociani, Italy) là dịch trích vỏ nho cô

đặc.

Redberry liqid 88-01 được sản xuất bởi công ty Gillette Food Inc, là dịch trích

quả của alderberry, blackberry, blueberry, blackcurrant.

Sambucus NR 54 được sản xuất bởi công ty Gilette Food Inc, là dịch trích

anthocyanin từ elderberry.

San Red Liqid RC-EX được sản xuất bởi công ty San Ei Chemical Industries

( Nhật) là dịch cô đặc từ bắp cải đỏ mà chúng chứa anthocyanin diacyl hóa.

Powdered San Red PC được sản xuất bởi công ty San Ei Chemical Industries

là bột sấy khô của dịch tr ích từ bắp cải đỏ.

Powdered San Red PC được sản xuất bởi công ty San Ei Chemical Industries

là bột sấy khô của dịch trích từ bắp cải tím.

1.2.7 Ứng dụng của anthocyanin.

Anthocyanin được dùng như chất màu thực phẩm với tính an toàn cao và màu

sắc đa dạng đẹp mắt.

Khả năng chống oxy hóa cao nên được sử dụng để chổng lão hóa, hoặc chống

oxy hóa các sản phẩm thực phẩm, chổng viêm, chổng các tia phóng xạ...

Hạn chế sự suy giảm sức đề kháng, sự phát triên của các tế bào ung thư.

Athocyanin còn có vai trò thu hút côn trùng giúp cho sự thụ phấn của cây diễn

ra tốt hơn.

Do đặc tính thay đổi màu theo pH, anthocyanin có thể sử dụng như một chất

chỉ thị:

pH 1-3: màu đỏ pH 7: tím pH 10-12: xanh lá cây

pH 4: màu hồng pH 8: xanh dương pH >12: xanh lá mạ

pH 5: hồng tím pH 9: xanh lá + xanh dương

Đồ án tốt nghiệp

Xác định hàn the

Mặc dù dung dịch mẫu có chứa hàn the (pH 9.5), nhưng khi cho anthocyanin

vào dung dịch mẫu, dung dịch không chuyển sang màu xanh mà chuyển sang màu

xám. Nguyên nhân là do hàn the (Natri borate) phản ứng với nhóm ortho hydroxy

trong vòng thơm của anthocyanin tạo thành muối borate. (Nguyễn Thị Phương Anh,

Nguyễn Thị Lan, 2007)

Ngoài tác dụng là chất màu thiên nhiên được sử dụng khá an toàn trong thực

phẩm, tạo ra nhiều màu sắc hấp dẫn cho mỗi sản phẩm, anthocyanin còn là hợp chất

có nhiều đặc tính sinh học quý như: khả năng chống oxy hóa cao nên được sử dụng

để chống lão hóa, hoặc chống oxy hóa các sản phẩm thực phẩm, hạn chế sự suy giảm

sức đề kháng; có tác dụng làm bền thành mạch, chống viêm, hạn chế sự phát triển

của các tế bào ung thư; tác dụng chống các tia phóng xạ.

Những đặc tính quý báu của anthocyanin mà các chất màu hóa học, các chất

màu khác hình thành trong quá trình gia công kỹ thuật không có được đã mở ra một

hướng nghiên cứu ứng dụng hợp chất màu anthocyanin lấy từ thiên nhiên vào trong

đời sống hằng ngày, đặc biệt trong công nghệ chế biên thực phẩm. Điều đó hoàn toàn

phù hợp với xu hướng hiện nay của các nước trên thế giới là nghiên cứu khai thác

chất màu từ thiên nhiên sử dụng trong thực phẩm, bởi vì chúng có tính an toàn cao

cho người sử dụng.

1.3 Các thành tựu đạt được.

1.3.1 Phương pháp tách chiết anthocyanin

1.3.2 Phương pháp tách chiết anthocyanin từ quả dâu Hội An

Qua nhiều nghiên cứu cho rằng với mỗi dung môi khác nhau thì khả năng chiết

tách không giống nhau, tuy có nhiều phương pháp chiết tách anthocyanin từ rau quả

nhưng chưa có một kết luận cụ thể khẳng định loại dung môi nào là tốt nhất cho một

quy trình chiết tách. Trong quả dâu, anthocyanin được phân bố ở tế bào, với bản chất

là một hợp chất thiên nhiên khá phân cực, anthocyanin hòa tan trong dung môi phân

Đồ án tốt nghiệp

cực. Dưới đây là 5 hệ dung môi thường dùng để tách chiết các hợp chất thiên nhiên

khá phân cực:

+ Methanol - nước - HCl (tỷ lệ 1:1,1% HCl).

+ Ethanol - nước - HCl (tỷ lệ 1:1,1% HCl).

+ Nước - HCl (1%).

+ Nước - formic acid (5%).

+ Nước - acetic acid (5%)

Hệ dung môi ethanol - nước – HCl tỷ lệ 1:1 (với 1% HCl) cho hàm lượng

anthocyanin lớn và độ màu tương đối cao. Hơn nữa ethanol ít độc hơn so với

methanol và là dung môi thông dụng, rẻ tiền, dễ kiếm. Đó cũng là lý do nhóm nghiên

cứu chọn hệ dung môi ethanol - nước - HCl trong quy trình công nghệ chiết tách và

làm sạch anthocyanin thô. Hệ dung môi này cũng có thể dùng để tách chất màu

anthocyanin từ các loại rau quả tương tự. (Nguyễn Thị Lan, 2010)

1.3.3 Phương pháp tách chiết anthocyanin từ bắp cải tím.

Sắc tố chính được chiết xuất từ bắp cải tím đó là cyanidin 3,5-diglucoside của

hệ màu anthocyanin và có màu sắc thay đổi rõ rệt theo pH môi trường. Trong môi

trường acid nó có màu đó bền và khi môi trường chuyển sang base màu của nó chuyển

sang xanh và ổn định trong thời gian dài. đây là đặc tính rất khác so với các

anthocyanin của một số nguyên liệu khác (màu thay đổi liên tục tại pH kiềm) như lá

tía tô, quả dâu…

Bằng phương pháp tối ưu hoá thực nghiệm trong quá trình chiết tách, đã xác

định được hàm lượng Anthocyanin trong bắp cải tím Đà Lạt chiếm khoảng 1,11%.

Tuy nhiên, việc sản xuất bắp cải tím ở khu vực nhiệt đới và á nhiệt đới còn ở

mức hạn chế vì bắp cải tím thích họp với những vùng núi cao hoặc nơi có mùa đông

lạnh.

Đồ án tốt nghiệp

Nguyên Liệu

Rửa sạch/để ráo

Nghiền nhỏ

Xử lý

Ngâm trong dung môi

Trích ly

Dịch trích

Phân tích

Hình 1.11. Quy trình tách chiết anthocyanin từ bắp cải tím.

1.3.4 Phương pháp tách chiết anthocyanin từ gạo đen.

-Phương pháp sử dụng dung môi EtOH:HCl 1% tỉ lệ 85:15 (v:v). (Azza

A.Abou-Arab, Ferial M.Abu-Salem and Esmat A.bou Arrab, 2011).

-Phương pháp sử dụng dung môi kết hợp sóng siêu âm tăng hiệu quả trích ly.

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP.

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu.

2.1.1 Thời gian.

Từ 25/05/2015 đến 16/08/2015.

2.1.2 Địa điểm.

Phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học trường Đại học Công nghệ Thành phố

Hồ Chí Minh.

2.2 Nguyên liệu– thiết bị - hoá chất.

2.2.1 Nguồn gạo đen.

Nguyên liệu gạo đen được sử dụng trong nghiên cứu là tấm gạo đen “Hoa Sữa”

của công ty Viễn Phú. Tấm gạo được đóng bao hút chân không và bảo quản ở nhiệt

độ phòng cho đến khi sử dụng.

Có nhiều nguyên liệu chứa anthocyanin, nhưng trong đề tài nhóm nghiên cứu

chọn gạo đen làm nguồn thu nhận Anthocyanin. Vì gạo đen là nguồn nguyên liệu

chứa nhiều anthocyanin hơn các loại nguyên liệu khác. (Zhaohua Hou, 2013).

2.2.2 Một số hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

Sử dụng một số hóa chất chuẩn trong phân tích hãng Merck, Sigma.

Ethanol 96o. HCl.

Ethanol tuyệt đối. DPPH.

KCl. Ascorbic acid.

DMSO CH3COONa.3H2O.

Đồ án tốt nghiệp

2.2.3 Một số dụng cụ và thiết bị chủ yếu dùng trong nghiên cứu

2.2.3.1 Dụng cụ.

- Ống nghiệm. - Bình tam giác.

- Đũa thủy tinh. - Pipet.

- Nhiệt kế. - Giấy lọc.

- Rây Ø 0.0098 và 0.346 inches. - Ống ly tâm.

2.2.3.2 Thiết bị.

- Cân phân tích. - Bể điều nhiệt.

- Máy cô quay. - Máy quét quang phổ.

- Máy ly tâm. - Máy xay nghiền.

Đồ án tốt nghiệp

2.3 Phương pháp nghiên cứu.

Nghiên cứu sử dụng phương pháp thực nghiệm. Các nội dung chủ yếu được

thực hiện như sơ đồ hình 2.1. Quy trình trích ly anthocyanin dự kiến như sơ đồ hình

Gạo đen

Xác định độ ẩm ban đầu của nguyên liệu

2.1

Xác định bước sóng hấp thu cực đại của anthocyanin

Xác định ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến quá trình trích ly anthocyanin từ gạo đen.

Xác định ảnh hưởng của xử lý nhiệt sơ bộ cho nguyên liệu đến quá trình trích ly anthocyanin từ gạo đen

Xác định tỷ lệ HCl để pha dung môi tối ưu cho quá trình trích ly anthocyanin từ gạo đen

Xác định nhiệt độ tối ưu cho quá trình trích ly anthocyanin từ gạo đen

Xác định thời gian tối ưu cho quá trình trích ly anthocyanin từ gạo đen

Xác định hoạt tính kháng oxy hóa của anthocyanin.

Xác định thông số cho quá trình cô quay thu nhận dịch chiết anthocyanin cô đặc.

Hình 2.1. Sơ đồ quy trình tóm tắt nội dung thí nghiệm

Đồ án tốt nghiệp

Nhiệt độ 60oC

EtOH:HCl 1%

Thời gian 60 p

Trích ly

Gạo đen

85:15 v:v

TL 1:20 (w:v)

Dung môi

4000 rpm

ggggg

15 phút

Ly tâm Cặn

Thu dịch

Lọc

Định mức

Định lượng anthocyanin

Xác định các thông số tối ưu

Hình 2.2. Quy trình trích ly anthocyanin dự kiến

2.3.1 Thí nghiệm 1: Xác định độ ẩm ban đầu của nguyên liệu.

Xác định độ ẩm ban đầu của nguyên liệu tấm gạo đen bằng phương pháp sấy

đến khối lượng không đổi (còn gọi là phương pháp nhiệt).

2.3.2 Thí nghiệm 2: Xác định bước sóng hấp thu cực đại của

anthocyanin từ mẫu gạo đen

Mục đích thí nghiệm: Xác định bước sóng λmax của mẫu trong dung môi

EtOH:HCl 0,1N (85:15,v:v). Chọn độ pha loãng thích hợp để thực hiện pha loãng

mẫu ở các thí nghiệm tiếp theo.

Đồ án tốt nghiệp

Chuẩn bị thí nghiệm:

- Anthocyanin trong dịch trích ly từ gạo đen.

- Ta pha loãng mẫu với độ pha loãng lần lượt từ n=10,20,30 bằng EtOH : HCl

0,1N (85:15,v:v). Trong vùng bước sóng từ 400 - 700nm.

Chỉ tiêu theo dõi: Phổ hấp thu của dịch trích ly. Xác định λ max.

2.3.3 Thí nghiệm 3: Xác định ảnh hưởng của kích thước hạt đến hiệu

quả trích ly anthocyanin từ gạo đen.

Mục đích thí nghiệm: Tìm ra kích thước hạt của gạo đen cho hiệu quả trích

ly cao nhất.

Chuẩn bị thí nghiệm:

- Chuẩn bị gạo đen với các kích thước hạt: nguyên hạt, xay và rây đến 0,0098

và 0.346 inches.

Sơ đồ bố trí thí nghiệm:

Thí nghiệm với 1 yếu tố và 3 lần lặp lại. Yếu tố thí nghiệm là kích thước hạt.

Tổng số nghiệm thức là 3:

+ Nguyên hạt

+ Xay và rây đến kích thước 0.0098 inches

+ Xay và rây đến kích thước 0.346 inches

Đồ án tốt nghiệp

Gạo đen

Nghiền nhỏ

ggggg

Nhiệt độ 60oC

EtOH:HCl 1%

Thời gian 60 p

0,346 inches 0,0098 inches Nguyên hạt

85:15 v:v

TL 1:20 (w:v)

Trích ly Dung môi

4000 rpm

ggggg

15 phút

Thu dịch

Ly tâm Cặn

Lọc

Định mức

Định lượng anthocyanin

Chọn kích thước tối ưu

Hình 2.3. Bố trí thí nghiệm xác định kích thước nguyên liệu cho quá trình trích

ly anthocyanin từ gạo đen.

Đồ án tốt nghiệp

Chỉ tiêu theo dõi: hàm lượng anthocyanin.

2.3.4 Thí nghiệm 4: Xác định ảnh hưởng của xử lý nhiệt sơ bộ cho

nguyên liệu đến quá trình trích ly anthocyanin từ gạo đen.

Mục đích thí nghiệm: So sánh và chọn ra nhiệt độ xử lý nguyên liệu cho hiệu

quả thu hồi anthocyanin cao nhất.

Chuẩn bị thí nghiệm:

-Mẫu gạo đen đã nghiền sẵn đến kích thước được lựa chọn từ thí nghiệm 1.

-Chuẩn bị hệ dung môi Ethanol: HCl 1% (85:15, v/v).

-Tỷ lệ nguyên liệu : dung môi trích ly là 1:20 (w/v).

-Tỷ lệ nguyên liệu : nước để nấu cách thủy là 1:1,5 (w/v).

-Sau giai đoạn xử lý này, các bước tiến hành như sơ đồ hình 2.4

Sơ đồ bố trí thí nghiệm:

Yếu tố thí nghiệm là nhiệt độ xử lý nguyên liệu. Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần.

Bao gồm:

- Nguyên liệu không qua xử lý nhiệt.

- Nguyên liệu được nấu cách thủy ở 80oC/5 phút.

- Nguyên liệu được nấu cách thủy ở 90oC/5 phút.

Đồ án tốt nghiệp

0,0098

Gạo đen

inches

Nghiền nhỏ

ggggg

Xử lý nhiệt

ggggg

80oC/5p 90oC/5p

Nhiệt độ 60oC

EtOH:HCl 1%

Thời gian 60 p

Nhiệt độ phòng/5p ggggg ggggg

85:15 v:v

TL 1:20 (w:v)

Trích ly Dung môi

4000 rpm

ggggg

15 phút

Ly tâm Cặn

Thu dịch

Lọc

Định mức

Định lượng Anthocyanin

Chọn chế độ xử lý nhiệt

Hình 2.4. Bố trí thí nghiệm xác định chế độ xử lý nhiệt sơ bộ cho nguyên liệu

Đồ án tốt nghiệp

Chỉ tiêu theo dõi: hàm lượng anthocyanin bằng phương pháp pH vi sai.

2.3.5 Thí nghiệm 5: Xác định của tỷ lệ HCl trong pha chế dung môi để

trích ly anthocyanin từ gạo đen.

Mục đích thí nghiệm: Khảo sát và tìm ra tỷ lệ dung môi thích hợp cho hiệu

quả trích ly anthocyanin cao nhất.

Chuẩn bị thí nghiệm:

Thí nghiệm 3 được tiến hành trên cơ sở thí nghiệm 1 và 2 sau khi chọn ra được

kích thước hạt và nhiệt độ xử lý nguyên liệu.

Tỷ lệ nguyên liệu : dung môi trích ly là 1:20 (w/v).

Sơ đồ bố trí thí nghiệm:

Thí nghiệm với 1 yếu tố là tỷ lệ dung môi. Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần.

Khảo sát 6 tỷ lệ dung môi Ethanol:HCl 1% (v/v) như hình 2.5

Đồ án tốt nghiệp

Gạo đen

TL 80:20

0,0098

inches

Nghiền nhỏ TL 85:15

Nhiệt độ 60oC

Thời gian 60 p

TL 1:20 (w:v)

4000 rpm

ggggg TL 90:10 Trích ly Dung môi TL 95:5 ggggg

15 phút

Ly tâm TL 98:2 Cặn

TL 99:1

Thu dịch

Lọc

Định mức

Định lượng Anthocyanin

Chọn tỷ lệ HCl tối ưu

Hình 2.5. Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ HCl trong pha chế dung môi để

trích ly anthocyanin từ gạo đen.

Đồ án tốt nghiệp

Chỉ tiêu theo dõi: hàm lượng anthocyanin.

2.3.6 Thí nghiệm 6: Xác định nhiệt độ thích hợp để trích ly

anthocyanin từ gạo đen.

Mục đích thí nghiệm: Tìm ra nhiệt độ tối ưu cho hiệu quả trích ly anthocyanin

cao nhất.

Chuẩn bị thí nghiệm:

- Thí nghiệm 4 được tiến hành trên cơ sở thí nghiệm 1, 2 và 3. Sau khi chọn ra

được kích thước hạt, nhiệt độ xử lý nguyên liệu và tỷ lệ HCl để pha chế dung môi

thích hợp.

- Tỷ lệ nguyên liệu : dung môi trích ly là 1:20 (w/v).

Sơ đồ bố trí thí nghiệm:

Khảo sát 5 điểm nhiệt độ như sơ đồ hình 2.6

Gạo đen

0,0098

Đồ án tốt nghiệp

inches

50 oC Nghiền

Thời gian 60 p

EtOH:HCl 1%

55oC

TL 1:20 (w:v)

95:5, v:V

Trích ly Dung môi 60oC

4000rpm

15 phút

ggggg 65oC Ly tâm Cặn 70oC

Thu dịch

Lọc

Định mức

Định lượng Anthocyanin

Chọn nhiệt độ trích ly

Hình 2.6. Bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ thích hợp để trích ly

anthocyanin từ gạo đen

Đồ án tốt nghiệp

Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng anthocyanin.

2.3.7 Thí nghiệm 7: Xác định thời gian thích hợp trích ly anthocyanin

từ gạo đen.

Mục đích thí nghiệm: Tìm ra thời gian trích ly anthocyanin mang lại hiệu quả

cao nhất.

Chuẩn bị thí nghiệm:

- Thí nghiệm 5 được tiến hành trên cơ sở thí nghiệm 1, 2, 3 và 4. Sau khi chọn

ra được kích thước hạt, nhiệt độ xử lý nguyên liệu, tỷ lệ dung môi thích hợp và nhiệt

độ trích ly thích hợp.

- Tỷ lệ nguyên liệu : dung môi trích ly là 1:20 (w/v).

Sơ đồ bố trí thí nghiệm:

Khảo sát 5 khoảng thời gian như hình 2.7

Đồ án tốt nghiệp

0,0098

50 phút

Gạo đen

inches

Nghiền

Nhiệt độ 55oC

EtOH:HCl 1%

55 phút

TL 1:20 (w:v)

95:5, v:V

Trích ly Dung môi 60 phút

4000rpm

Ly tâm

ggggg 65 phút

15 phút

Cặn 70 phút

Thu dịch

Lọc

Định mức

Định lượng Anthocyanin

Chọn thời gian trích ly

Hình 2.7. Bố trí thí nghiệm xác định thời gian trích ly anthocyanin từ gạo đen

Đồ án tốt nghiệp

Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng anthocyanin.

2.3.8 Thí nghiệm 8: Xác định hoạt tính kháng oxy của anthocyanin.

Mục đích thí nghiệm: Xác định khả năng bắt gốc tự do DPPH và lập đường

chuẩn xác định giá trị IC50 của anthocyanin và Ascorbic acid.

Chuẩn bị thí nghiệm:

Dịch trích ly anthocyanin từ gạo đen trong 24h bảo quản ở 4oC.

Tỷ lệ mẫu:dung môi trích ly là: 1:2 (w/v).

Bố trí thí nghiệm:

Bắt gốc tự do DPPH tiến hành theo S.D.Sanja et al. (2009).

Lấy lần lượt 100 µl, 120 µl, 140 µl, 160 µl, 180 µl, 200 µl dịch trích ly vào 6

ống nghiệm. Thêm đến 3000 µl bằng EtOH 100%. Rồi bổ sung 150 µl DPPH vào

từng ống nghiệm làm dung dịch mẫu (mẫu). Để trong tối 15 phút, nhiệt độ phòng.

Đem đo phổ hấp thu ngay ở bước sóng 516nm. Lấy EtOH 100% để làm mẫu trắng.

Lấy 150 µl DPPH thêm 2850 µl EtOH 100% đo phổ hấp thu ngay ở bước sóng

516nm (Blank). Lấy EtOH 100% để làm mẫu trắng.

Lấy 150 µl vitC (100µg/ml) thêm 2850 µl EtOH 100% đo phổ hấp thu sau 15

phút (trong tối, nhiệt độ phòng) ở bước sóng 516nm (Blank). Lấy EtOH 100% để làm

mẫu trắng.

Tiến hành thí nghiệm:

- Xác định nồng độ anthocyanin trong dịch trích sau khi pha loãng 10 lần.

- Pha loãng mẫu thành dãy các nồng độ khác nhau, cho phản ứng với DPPH ở

nhiệt độ phòng, trong tối, 15-30 phút rồi tiến hành đo OD tại 516nm. Sử dụng chất

đối chứng là Ascorbic acid (100µg/ml).

Đồ án tốt nghiệp

Chỉ tiêu theo dõi:

Đo độ hấp thu màu của lượng DPPH còn lại sau khi phản khi với anthocyanin

ở bước sóng 516nm.

Nồng độ anthocyanin được xác định bằng phương pháp pH vi sai.

2.3.9 Thí nghiệm 9: Xác định thông số cho quá trình cô quay thu nhận

dịch chiết anthocyanin cô đặc.

Mục đích thí nghiệm: Xác định thời gian cô quay. Cô quay đến thể tích bao

nhiêu là tối ưu nhất. Đồng thời xác định hàm lượng anthocyanin sau khi cô quay.

Chuẩn bị thí nghiệm:

- 700 ml dịch trích ly anthocyanin từ gạo đen trong 24h bảo quản ở 4oC.

- Tỷ lệ mẫu:dung môi trích ly là: 1:20 (w/v).

Tiến hành thí nghiệm:

-Cân khối lượng bình cô quay khô, m.

-Cân lại khối lượng bình sau khi cho 100mL mẫu vào, m0.

-Tiến hành cô quay lần lượt 6 bình chứa dịch trích ly cùng thể tích là 100ml.

-Nhiệt độ cô quay là 40oC.

-Cân lại khối lượng các bình 3 phút, bình 6 phút, bình 9 phút, bình 12 phút,

bình 15 phút, bình 18 phút cô quay ta được khối lượng mo, m3, m6, m9, m12, m15, m18.

Sau đó định mức lại 100 (ml) mẫu đem xác định hàm lượng anthocyanin và hoạt tính

kháng oxy hóa.

Chỉ tiêu theo dõi:

Hoạt tính oxy hóa: Đo độ hấp thu màu của lượng DPPH còn lại sau khi phản

khi với anthocyanin ở bước sóng 516nm.

Nồng độ anthocyanin được xác định bằng phương pháp pH vi sai.

Đồ án tốt nghiệp

Thể tích dịch dịch trích ly còn lại xác định bằng tỷ lệ khối lượng mẫu trước và

sau cô quay.

2.4 Các phương pháp phân tích sử dụng trong nghiên cứu

- Định lượng anthocyanin bằng phương pháp pH vi sai.

- Thử hoạt tính kháng oxy hóa và xác định giá trị IC50 của anthocyanin bằng

phương pháp bắt gốc tự do DPPH.

- Phương pháp xác định độ ẩm tương đối của nguyên liệu.

2.5 Các phương pháp thống kê và xử lý số liệu

- Vẽ biểu đồ, đồ thị bằng phần mềm Excel 2013.

- Kết quả trong nghiên cứu này là giá trị trung bình và độ lệch chuẩn của 3 lần

lặp lại. Dữ liệu được phân tích ANOVA bằng phần mềm Statgraphic Plus 4.0. Sự

khác biệt giữa các mẫu là có ý nghĩa về mặt thống kê khi giá trị p < 0,05.

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Thí nghiệm 1: Xác định độ ẩm ban đầu của nguyên liệu.

Bảng 3.1. Xác định độ ẩm nguyên liệu.

Wtb(%)

11.26 ±0.04

Mo 23.3413 22.5903 22.3819

M1 28.3450 27.5935 27.3835

M2 27.838 27.089 26.876

W(%) 11.27 11.21 11.29

Coc 1 Coc 2 Coc 3

Độ ẩm cho thấy điều kiện bảo quản nguyên liệu tốt. Chống được nấm mốc các

hư tổn khác ảnh hưởng đến hàm lượng và khả năng kháng oxy hóa của anthocyanin.

Nguyên liệu có độ ẩm tương đối trung bình là 11,26% ± 0,04.

3.2 Thí nghiệm 2: Xác định bước sóng hấp thu cực đại của anthocyanin

từ mẫu gạo đen

Hình 3.1. Quét quang phổ mẫu anthocyanin từ bước sóng 400-700nm trong

dung môi EtOH:0,1N HCl (85:15, v:v).

Do anthocyanin tồn tại dưới nhiều dạng khác nhau, tương ứng với mỗi dạng

cấu hình sẽ có bước sóng hấp thu cực đại khác nhau. Vì thế cần phải xác định λmax

Đồ án tốt nghiệp

để có thể định lượng được anthocyanin bằng phương pháp pH vi sai cũng như xác

định bằng các phương pháp đo quang khác.

Giá trị λmax=535nm lớn hơn khi so sánh với λmax của khoai lang tím là 529nm.

Cho thấy thành phần anthocyanin trong khoai lang tím khác với gạo đen. (Trần Thị

Ánh Ngọc, 2011)

Kết quả trên, có thể dự đoán được thành phần anthocyanin trong dịch trích ly

gạo đen có thể là: Cyd-3-ara, Cyd-3-gal. (John Wiley, 2005).

Kết quả cũng phù hợp với nghiên cứu của Fuleki và Francis (1965), Sakamura

và Francis (1961) trong dung môi EtOH:HCl 1N (85:15, v:v) xác định được

λmax=535nm với thành phần anthocyanin là Cyd-3-gal.

Xác định được bước sóng hấp thu cực đại của anthocyanin là λmax=535nm.

Mẫu cho phổ hấp thu rõ và cao nhất khi pha loãng 10 lần.

3.3 Thí nghiệm 3: Xác định ảnh hưởng của kích thước hạt đến hiệu quả

8.000

7.323

7.000

6.000

5.214

trích ly anthocyanin từ gạo đen.

i

5.000

4.082

4.000

L m / g m n n a y c o h t n a

3.000

g n ợ ư

l

2.000

m à H

1.000

0.000

Nguyên Hạt

0,394 inches

0,0098 inches

Kích thước hạt nguyên liệu, inches

Hình 3.2. Ảnh hưởng của kích thước hạt nguyên liệu đến hàm lưởng

anthocyanin từ dịch chiết.

Đồ án tốt nghiệp

Ở kích thước hạt nhỏ nhất là 0,0098 inches cho hiệu quả trích ly anthocyanin

với hàm lượng cao nhất là 7,323 ± 0,202 mg/ml.

Ta thấy sự sai khác có ý nghĩa giữa hàm lượng anthocyanin trích ly từ 3 kích

thước hạt trong thí nghiệm.

- Hàm lượng anthocyanin tăng dần theo chiều giảm kích thước hạt nguyên

liệu. Có nghĩa là hạt nguyên liệu có kích thước càng nhỏ thì khả năng trích ly của

dung môi càng tốt.

- Do anthocyanin nằm trong tế bào hiện diện ở lớp cám của hạt nguyên liệu.

Vì thế nghiền nhỏ kích thước hạt đóng vai trò tác nhân phá vỡ tế bào, tạo điều kiện

cho sự khuếch tán anthocyanin vào dung môi tốt hơn.

Chọn kích thước hạt nguyên liệu dùng để trích ly anthocyanin trong các thí

nghiệm tiếp theo là 0,0098 inches.

3.4 Thí nghiệm 4: Xác định ảnh hưởng của chế độ xử lý nhiệt sơ bộ cho

8.000

7.324

7.500

7.000

/ g m

6.500

6.000

5.500

n n y a c o h t n a

5.000

4.500

g n ợ ư

3.653

4.000

3.382

m à H

3.500

3.000

90oC/5p

Nhiet do phong

80oC/5p

Nhiệt độ, oC

nguyên liệu đến quá trình trích ly anthocyanin từ gạo đen.

Hình 3.3. Ảnh hưởng của chế độ xử lý nhiệt cho nguyên liệu đến hàm lượng

anthocyanin từ dịch chiết.

Đồ án tốt nghiệp

Kết quả thí nghiệm cho thấy rằng, đối với việc trích ly từ nguyên liệu có xử lý

nhiệt trước ở 80oC và 90 oC, thì dịch chiết đó có hàm lượng anthocyanin là rất thấp.

Và kết quả hoàn toàn khác khi trích ly từ nguyên liệu thô không qua xử lý nhiệt.

Nguyên nhân của sự khác biệt này có thể là do sự hồ hóa của tinh bột gạo đã

làm cho quá trình khuếch tán của anthocyanin ra dịch chiết khó khăn hơn

So sánh với nghiên cứu thu nhận anthocyanin từ khoai lang tím cho thấy:

- Ở khoai lang tím, xử lý nhiệt nguyên liệu để hồ hóa tinh bột làm tăng hiệu

quả cho quá trình trích ly anthocyanin (Hoàng Thị Lệ Hằng, 2014).

- Tuy nhiên, từ kết quả thí nghiệm ở gạo đen cho thấy, việc xử lý nhiệt tương

tự không những tốn thời gian và công sức mà còn làm giảm đáng kể hàm lượng

anthocyanin so với việc không cần xử lý nhiệt sơ bộ cho nguyên liệu.

Nguyên nhân có thể là do cấu tạo tế bào của 2 nguyên liệu không giống nhau,

thành phần anthocyanidin có thể không giống nhau.

Bên cạnh đó việc tách chiết anthocyanin từ các nguồn khác nhau đã được thực

hiện nhiều nơi rải rác trên thế giới cũng ghi nhận rằng là người ta thường tách chiết

từ nguyên liệu gạo không qua xử lý nhiệt.

Ta thấy nguyên liệu gạo đen không cần xử lý nhiệt và bảo quản ở điều kiện

nhiệt độ phòng cho hiệu quả trích ly anthocyanin cao nhất.

Đồ án tốt nghiệp

3.5 Thí nghiệm 5: Xác định của tỷ lệ HCl trong pha chế dung môi để

12.92

) L

M / G M

(

7.848

6.826

3.173

2.923

N N A Y C O H T N A G N Ợ Ư L

2.108

M À H

80:20

85:15

90:10

95:5

98:2

99:1

TỶ LỆ DUNG MÔI ETOH:HCL1% (V:V)

trích ly anthocyanin từ gạo đen.

Hình 3.4. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi EtOH:HCl 1% đến hàm lượng

anthocyanin từ dịch chiết.

Anthocyanin là hợp chất phân cực, nên tan tốt trong nước đặc biệt là tan tốt

trong MeOH, nhưng vì mục tiêu của đồ án để ứng dụng trong thực phẩm nên không

thể sử dụng MeOH do tính độc hại của nó. Thay vào đó hệ dung môi EtOH - nước -

HCl cho hàm lượng anthocyanin lớn và độ màu tương đối cao. Hơn nữa EtOH ít độc

hơn so với MeOH và là dung môi thông dụng, rẻ tiền, dễ kiếm và dễ bay hơi thu hồi

dung môi khi cô đặc dịch chiết.

Sự khác nhau về hàm lượng anthocyanin trích ly được khi sử dụng dung môi

với tỷ lệ 95:5 so với các tỷ lệ còn lại là có ý nghĩa thống kê. Thực nghiệm cho thấy

rằng, cùng với lượng nguyên liệu ban đầu, sự khuyếch tán của chất màu anthocyanin

ra dung môi tăng dần khi tăng tỷ lệ thể tích EtOH và giảm tỷ lệ thể tích HCl 1% trong

hệ dung môi, đạt giá trị cực đại ở tỷ lệ dung môi EtOH:HCl 1% là 95:5 (v:v), sau đó

giảm xuống. Khi sử dụng hệ dung môi với tỷ lệ khác nhau dẫn đến ái lực giữa

anthocyanin và từng hệ dung môi cũng khác nhau. Điều đó dẫn đến việc nồng độ

Đồ án tốt nghiệp

anthocyanin trong dịch trích ly sẽ khác nhau đối với dung môi với tỷ lệ khác nhau.

Trong thí nghiệm này, dung môi có tỷ lệ 95:5 (v:v) có khả năng trích ly anthocyanin

cực đại (12,92 mg/ml), có sự khác biệt rõ rệt, vượt xa so với các tỷ lệ còn lại; hơn thế

nữa dung môi này rẻ tiền, nên việc tăng dung môi EtOH trong tỷ lệ trên là hoàn toàn

phù hợp và khả thi.

Hệ dung môi EtOH:HCl 1% có tỷ lệ 95:5 (v:v) cho hiệu quả trích ly

anthocyanin là cao nhất.

3.6 Thí nghiệm 6: Xác định nhiệt độ thích hợp để trích ly anthocyanin từ

8.405

L m

7.31

5.543

4.279

4.237

/ g m n n a y c o h t n a

g n ợ ư

m à H

50oC

55oC

60oC

65oC

70oC

Nhiet do oC

gạo đen.

Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly đến hàm lượng

anthocyanin từ dịch chiết.

Nhiệt độ là một trong các yếu tố làm biến tính và mất màu chủ yếu ở

anthocyanin. Nhiệt độ càng cao, khả năng bị oxy hóa và mất màu của anthocyanin

tăng dần. Tuy nhiên, trong quá trình trích ly, nhiệt độ lại đóng vai trò khá quan trọng

do nhiệt độ ảnh hưởng đến khả năng hoạt động, sự tương tác, khuếch tán và ái lực

của dung môi đối với anthocyanin. Từ kết quả thực nghiệm ta thấy rằng: Theo chiều

tăng của nhiệt độ, hàm lượng anthocyanin trong dịch trích tăng đến khi đạt giá trị cực

đại sau đó bắt đầu giảm dần.

Đồ án tốt nghiệp

Ở nhiệt độ trích ly ở 50oC, quá trình diễn ra chậm do tốc độ khuếch tán của

anthocyanin thấp. Nên hàm lượng anthocyanin thu được còn thấp.

Ở nhiệt độ 55oC, hàm lượng anthocyanin trích ly được là cao nhất. Có sự khác

biệt mang ý nghĩa thống kê về hàm lượng anthocyanin giữa nguyên liệu được trích ly

ở 55oC và các thang nhiệt độ còn lại. Ở điều kiện nhiệt độ này, dung môi EtOH:HCl

1% có tốc độ khuếch tán cao. Anthocyanin trong dịch trích ít bị biến tính và tốc độ

khuếch tán của anthocyanin vào dung môi lớn hơn tốc độ phân hủy của anthocyanin

gây ra bởi các tác nhân khác.

Ở nhiệt độ quá 60oC, phản ứng phân hủy anthocyanin diễn ra nhanh hơn tốc

độ khuếch tán của anthocyanin vào dung môi. Anthocyanin trong dịch trích bị oxy

hóa mạnh. Hạt tinh bột bắt đầu biến đổi về cấu trúc. Vì thế hàm lượng anthocyanin

trong dịch trích ly bắt đầu giảm.

Trong khoảng nhiệt độ 65-70oC, cấu trúc hạt tinh bột bị biến đổi, diễn ra quá

trình hồ hóa, làm cản trở sự khuếch tán của anthocyanin vào dung môi, dẫn đến việc

làm giảm đáng kể tốc độ khuếch tán. Đồng thời ở nhiệt độ này, sự phá hủy cấu trúc

anthocyanin diễn ra mạnh hơn. Trong trường hợp này nhiệt độ còn là tác nhân cộng

hưởng với oxy trong không khí làm anthocyanin bị oxy hóa một cách mạnh mẽ.

Ở nhiệt độ 55oC, hàm lượng anthocyanin trích ly được là cao nhất. Ta chọn

nhiệt độ này để tiến hành trích ly anthocyanin ở các thí nghiệm sau.

Đồ án tốt nghiệp

3.7 Thí nghiệm 7: Xác định thời gian thích hợp trích ly anthocyanin từ

13.322

7.57

6.03

5.307

4.56

M / G M N N A Y C O H T N A G N Ợ Ư L

M À H

5 0 P H Ú T

5 5 P H Ú T

6 0 P H Ú T

6 5 P H Ú T

7 0 P H Ú T

THỜI GIAN TRÍCH LY (PHÚT)

gạo đen.

Hình 3.6. Ảnh hưởng của thời gian trích ly đến nồng độ anhthocynin trong

dịch chiết.

Từ thực nghiệm cho thấy, hàm lượng anthocyanin tăng dần theo thời gian trích

ly đến khi đạt giá trị cực đại, sau đó giảm xuống.

Nguyên nhân hàm lượng anthocyanin trong thời gian đầu (từ 50 đến 60 phút

đầu tiên) tăng lên là do: thực chất của quá trình trích ly anthocyanin từ gạo đen đó là

quá trình khuếch tán. Vì thế hàm lượng anthocynin trong dịch trích sẽ tăng dần theo

thời gian. Sự khuếch tán diễn ra do sự chênh lệch về gradient nồng độ, anthocyanin

trong nguyên liệu có nồng độ cao hơn trong dung môi, theo chiều gradient thì

anthocyanin sẽ bị khuếch tán vào dung môi và hàm lượng anthocyanin trong dịch

trích sẽ tăng theo thời gian đến khi gradient nồng độ cân bằng.

Ở thời gian trích ly là 65 phút và 70 phút thì hàm lượng anthocyanin lại giảm

mạnh so với thời gian trích ly là 60 phút. Nguyên nhân là do lúc đầu gradient nồng

độ lớn, tức là anthocyanin sẽ đi ra dung môi nhiều. Ở thời gian này, chênh lệch về

gradient nồng độ gần như cân bằng, quá trình khuếch tán này gần như dừng lại. Đồng

thời anthocyanin là chất có tính kháng oxy hóa mạnh. Ở điều kiện nhiệt độ 55oC, thời

Đồ án tốt nghiệp

gian trích ly trong dung môi càng lâu thì hàm lượng anthocyanin trong dịch chiết càng

giảm do bị oxy hóa.

Ở thời gian 60 phút, đủ thời gian cho quá trình khuếch tán xảy ra đến khi

gradient nồng độ cân bằng, đủ để hàm lượng anthocyanin không bị giảm do tác nhân

oxy hóa và nhiệt độ cao. Cho nên hàm lượng anthocyanin thu được từ dịch trích ly là

cao nhất.

Thời gian trích ly là 60 phút cho hàm lượng anthocyanin là cao nhất. Ta chọn

thời gian trích ly là 60 phút để tiến hành các thí nghiệm sau.

120.000

y = 64.182x + 62.614 R² = 0.9699

100.000

80.000

60.000

40.000

H P P D ế h c c Ứ %

20.000

0.000

-1.5

-1

-0.5

0.5

-20.000

Log[anthocyanin, mg/ml]

3.8 Thí nghiệm 8: Xác định hoạt tính kháng oxy của anthocyanin.

Hình 3.7. Mối tương quan tuyến tính giữa % gốc tự do DPPH bị ức chế với

Log[nồng độ anthocyanin mg/ml].

100

y = 104.07x - 81.602 R² = 1

H P P D ế h c c Ứ %

0.2

0.4

0.6

0.8

1.2

1.4

1.6

1.8

Log[Ascorbic acid,µg/ml]

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.8. Mối tương quan tuyến tính giữa % gốc tự do DPPH bị ức chế với

Log[Ascorbic acid, µg/ml].

Bảng 3.2. So sánh giá trị IC50 của Ascorbic acid và anthocyanin.

Mẫu Giá trị IC50 với chất oxy hóa DPPH

Dịch trích ly anthocyanin gạo đen 636 µg/ml

Ascorbic acid 18,145 µg/ml

Trong thí nghiệm này, giá trị IC50 của dịch trích ly anthocyanin từ gạo đen

cao hơn chất chuẩn đối chứng gấp 35 lần. Cho thấy, khả năng kháng oxy hóa của

anthocyanin ở thí nghiệm này còn thấp.

Do chưa có chất chuẩn để lập đường chuẩn nồng độ anthocyanin vì thế hàm

lượng anthocyanin được xác định dựa trên phương pháp pH vi sai chỉ mang tính tương

đối.

Thực tế nếu định lượng anthocyanin bằng phương pháp lập đường chuẩn với

quercetin thì hàm lượng anthocyanin trong mẫu phân tích có thể cao hơn 46,200 ±

0,964 (mg/mL). (Suhad s. Humadi1, Viorica Istudor, 2009).

Hàm lượng anthocyanin trong dịch trích ly cô đặc là: 46,200 ± 0,964 (mg/mL).

Đồ án tốt nghiệp

Giá trị IC50 của anthocyanin khi sử dụng phương pháp bắt gốc tự do DPPH

là IC50=636 (µg/mL). Và của chất chuẩn Ascorbic acid là IC50=18,145µg/ml.

3.9 Thí nghiệm 9: Xác định thông số cho quá trình cô quay thu nhận

26.795

/ g m

19.086

n n a y c o h t n a

10.265

g n ợ ư

8.136

7.062

5.742

m à H

4.62

0 phút

3 phút

6 phút

9 phút

12 phút

15 phút

18 phút

Thời gian

dịch chiết anthocyanin cô đặc.

Hình 3.9. Sự thay đổi nồng độ của anthocyanin trong dịch chiết bán thành

phẩm theo thời gian cô quay.

Hàm lượng anthocyanin tăng theo thời gian cô quay. Cô quay càng lâu thì dịch

chiết càng đặc.

110

100

% n n a y c o h t n a

ồ h u h t t ấ u s u ệ H

0 phút

3 phút

6 phút

9 phút

12 phút

15 phút

18 phút

Thời gian cô quay, phút

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.10. Hiệu suất thu hồi anthocyanin trong quá trình cô quay dịch trích ly theo

90.000

81.871

80.000

65.091

y = 0.4365x2 - 15.168x + 95.176 R² = 0.9925

70.000

60.000

50.989

43.685

50.000

40.000

32.853

g , y a u q ô c h c ị d g n ợ ư

30.000

l i

17.429

20.000

ố h K

10.715

10.000

0.000

0 phút

3 phút

6 phút

9 phút

12 phút

15 phút

18 phút

Thời gian cô quay, phút

thời gian.

Hình 3.11. Sự thay đổi về khối lượng của dịch chiết bán thành phẩm theo

thời gian cô quay.

Khối lượng của dịch cô quay còn lại giảm liên tục theo thời gian cô quay, tuân

theo quy luật của hàm đa thức bậc 2:

Đồ án tốt nghiệp

y = 0.4365x2 - 15.168x + 95.176 với R² = 0.9925

Từ đó, dựa vào thời gian cô quay, ta có thể xác định được tương đối chính xác

khối lượng dịch còn lại sau cô quay là bao nhiêu gam. Với hệ số tương quan R² =

120.000

100.000

79.504

80.000

62.279

53.358

60.000

40.127

40.000

21.288

L m y a u q ô c h c ị d h c í t ể h T

13.088

20.000

0.000

0 phút

3 phút

6 phút

9 phút

12 phút

15 phút

18 phút

Thời gian, phút

0.9925.

Hình 3.12. Sự thay đổi về thể tích của dịch chiết bán thành phẩm theo thời

gian cô quay.

Từ 100 mL dịch, sau thời gian cô quay là 18 phút/40oC, giảm còn 13.088 mL

(giảm 7,64 lần).

49.568

49.535

49.402

49.07

48.008

45.817

H P P D ế h c c Ứ %

39.177

0 phút

3 phút

6 phút

9 phút

12 phút

15 phút

18 phút

Thời gian cô quay, phút

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.13. Ảnh hưởng của thời gian cô quay đến khả năng bắt gốc tự do

DPPH của dịch trích ly anthocyanin từ gạo đen.

Bảng 3.3. Kết quả khả năng kháng DPPH của anthocyanin theo thời gian cô quay.

Thời gian cô quay (phút) 0 phút 3 phút 6 phút 9 phút 12 phút 15 phút 18 phút

Qtb (%) ± SD 49.568 ± 0.527a 49.402 ± 0.399a 49.535 ± 0.305a 49.070 ± 0.304a 48.008 ± 0.398b 45.817 ± 1.212c 39.177 ± 0.414d

Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột có chỉ số mũ khác nhau thì khác

nhau ở mức ý nghĩa α = 0,05.

Khả năng bắt gốc tự do DPPH giảm theo thời gian cô quay. Ở cùng nồng độ

4,62 mg/ml, khả năng bắt gốc tự do của dịch trích ly giảm 10% so với lúc trước khi

cô quay.

Từ đồ thị hình 3.10, hiệu suất thu hồi anthocyanin giảm theo thời gian cô quay.

Nguyên nhân do anthocyanin là chất có hoạt tính kháng oxy hóa, nên thời gian cô

quay 18 phút ở 40-45oC làm một phần anthocyanin bị oxy hóa, vì thế hàm lượng giảm

14% so với ban đầu.

Đồ án tốt nghiệp

Từ đồ thị 3.13 và bảng 3.3 cho thấy:

- Sau 15 phút cô quay, khả năng kháng DPPH của anthocyanin trong dịch trích

ly giảm 4,8% so với dịch trích ly ban đầu.

- Sau 18 phút cô quay, khả năng kháng DPPH của anthocyanin trong dịch trích

ly giảm 6,7% so với dịch trích ly ban đầu.

Khi thời gian cô quay tăng lên thì dịch chiết bán thành phẩm cũng đồng thời

đặc hơn, có nghĩa là hàm lượng anthocyanin trong mỗi 1 ml của dịch chiết đã được

cô đặc sẽ tăng dần; điều này xảy ra là do sự giảm của thẻ tích trong thời gian cô quay.

(Hình 3.9 và 3.12). Trong thí nghiệm này thì khi dừng ở 18 phút, lúc đó dịch cô quay

đã đặc đến 7,64 lần. Tương ứng với hiệu suất thu hồi giảm đến 76% và khả năng

kháng oxy hóa đạt 39,18%.

Nguyên nhân làm hoạt tính kháng DPPH của dịch trích ly giảm:

Oxy và nhiệt độ được xem là những tác nhân đặc trưng xúc tiến sự phân hủy

của anthocyanin, từ đó sinh ra những dạng sản phẩm không màu hoặc màu nâu. Sự

kết tủa và đóng váng có thể gây ra từ sự oxy hóa trực tiếp dạng carbinol pseudobase.

Oxy sẽ hóa mãnh liệt các anthocyanin khi nung nóng. Cơ chế của sự phân hủy nhiệt

xảy ra không những phụ thuộc vào nhiệt độ mà còn phụ thuộc vào bản thân

anthocyanin đó.

Đồ án tốt nghiệp

Để thu được dịch chiết có các tiêu chí sau:

- chứa ít dung môi.

- dịch chiết cô đặc có nồng độ athocyanin cao

- hoạt tính kháng oxy hóa tốt.

Nhóm nghiên cứu đề xuất chọn thông số cho quá trình cô quay dịch trích ly có

thể tích 100mL tương đương 81,817 g, nồng độ 4,620 (mg/ml):

- thời gian cô quay là 15 phút.

- cô quay đến thể tích cuối cùng là 21,288 ml (hoặc khối lượng 17,429g).

- cô quay đến nồng độ là 19,086 (mg/ml).

- hiệu suất thu hồi anthocyanin dựa trên hàm lương đạt 88%.

- hoạt tính kháng oxy hóa của dịch chiết cô đặc đạt 45,817%. (giảm 8% so với

dịch chiết ban đầu)

Đồ án tốt nghiệp

KẾT LUẬN- KIẾN NGHỊ

1. Kết Luận

a. Trong quá trình nghiên cứu đã xây dựng được quy trình trích ly

anthocyanin theo quy trình sau:

Nhiệt độ 55oC

EtOH:HCl 1%

Thời gian 60 p

Trích ly

Gạo đen

95:5 v:v

TL 1:20 (w:v)

Dung môi

4000 rpm

ggggg

15 phút

Ly tâm Cặn

Thu dịch

Lọc

Định mức

Dịch chiết Anthocyanin

Hình 3.14. Sơ đồ quy trình trích ly anthocyanin từ gạo đen

Đã xác định được các thông số thích hợp cho quá trình trích ly chất màu

anthocyanin nhằm tách chiết tối đa anthocyanin từ nguyên liệu phù hợp cho mục đích

ứng dụng vào thực phẩm:

- Xác định được độ ẩm ban đầu của nguyên liệu là 11,26% ± 0,04.

Đồ án tốt nghiệp

- Xác định được bước sóng hấp thu cực đại của anthocyanin từ gạo đen là

λmax=535nm trong dung môi EtOH:HCl 1N.

- Kích thước nguyên liệu là 0,0098 inches cho hiệu quả trích ly anthocyanin

với hàm lượng cao nhất.

- Nguyên liệu ở điều kiện nhiệt độ phòng cho hiệu quả trích ly anthocyanin

với hàm lượng cao nhất mà không cần xử lý nhiệt sơ bộ.

- Xác định được tỷ lệ HCl pha chế dung môi thích hợp cho quá trình trích ly

anthocyanin là EtOH:HCl 1% 95:5 (v:v).

- Xác định được nhiệt độ tối ưu cho quá trình trích ly anthocyanin là 55oC.

- Xác định thời gian tối ưu cho quá trình trích ly anthocyanin là 60 phút.

- Xác định được khả năng bắt gốc tự do DPPH của anthocyanin với giá trị

IC50 = 636 (µg/ml).

- Nhóm nghiên cứu đề xuất chọn thông số cho quá trình cô quay dịch trích ly

có thể tích 100mL tương đương 81,817 g, nồng độ 4,620 (mg/ml):

+Thời gian cô quay là 15 phút.

+Cô quay đến thể tích cuối cùng là 21,288 ml (hoặc khối lượng 19,068g).

+Nồng độ anthocynin trong dịch chiết bán thành phẩm là 19,086 (mg/ml).

+Hiệu suất thu hồi anthocyanin dựa trên hàm lương đạt 88%.

+Hoạt tính kháng oxy hóa của dịch chiết cô đặc đạt 45,817%. (giảm 8% so với

dịch chiết ban đầu).

Đồ án tốt nghiệp

b. Đánh giá cảm quan của dịch chiết.

Bảng 3.4. Đánh giá sơ bộ cảm quan của dịch chiết anthocynin

DỊCH CHIẾT MÀU MÙI TRẠNG

SẮC THÁI

Đỏ tươi Mùi cồn Trong, không

nặng bị vẫn đục,

không kết cặn

Hình 3.15. Dịch chiết anthocyanin trước cô quay.

Đỏ đậm Mùi cồn

nhẹ

Hình 3.16. Dịch chiết sau cô đặc

Đồ án tốt nghiệp

2. Kiến Nghị

Khảo sát ảnh hưởng của kích thước hạt nguyên liệu đến hàm lượng

anthocyanin ở kích thước nhỏ hơn 0,0098 inches.

Cần phải chuẩn bị các điều kiện về nhiệt độ thật tốt trước khi làm thí nghiệm

để đảm bảo rằng dịch cô quay đạt đúng nhiệt độ dự kiến sẽ cô quay.

Xác định lại giá trị IC50 của anthocyanin trong dịch trích ly và chất chuẩn

Ascorbic acid.

Đồ án tốt nghiệp

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Tài liệu tiếng việt.

1. Huỳnh thị Kim Cúc, Lê Văn Hoàng, Lê thị Lệ Hường (2010). Chiết

anthocyanin từ quả dâu bằng nước sulfured và một số đặc tính của chúng.

Trường CĐ LT – TP và ĐH Đà Nẵng

2. Hoàng Thị Lệ Hằng (2014), Nghiên cứu sử dụng enzyme trong quá trình chuẩn

bị dịch lên men lactic từ bột khoai lang tím.

3. Lưu Đàm Cư (2005). Nghiên cứu chiết tách chất nhuộm màu thực phẩm từ

kinh nghiệm sử dụng thực vật của đồng bào dân tộc thiểu số.

4. Nguyễn Thị Lan và Lê Thị Lạc Quyên (2004), Nghiên cứu ảnh hưởng của hệ

dung môi đến khả năng chiết tách chất màu anthocyanin có độ màu cao từ quả

dâu Hội An. Tạp chí khoa học công nghệ, Đại học Đà Nẵng. Số 2 (6)/2009.

5. Nguyễn Thị Thanh Tuyền (2014), Nghiên cứu tách chiết và khả năng kháng

oxy hóa của anthocyanin từ phế phẩm gạo đen.

6. Nguyễn Thọ. Các phương pháp xác định tính chất lý hoá cơ bản của nguyên

liệu trong công nghệ thực phẩm.

7. Nguyễn Thị Phương Anh, Nguyễn Thị Lan, (2007). Nghiên cứu ảnh hưởng

của pH đến màu của anthocyanin từ bắp cải tím ứng dụng làm chất chỉ thị an

toàn trong phân tích thực phẩm và hoá học. Tạp chí Khoa học và Công nghệ

Đại học Đà Nẵng.Số:3(20)/2007.

8. Trần Thị Ánh Ngọc (2011). Nghiên cứu thành phần của chất màu anthocyanin

chiết từ khoai lang tím.

Đồ án tốt nghiệp

2. Tài liệu tiếng Anh.

1. AOAC (2006). Total Monomeric Anthocyanin Pigment Content of Fruit

Juices, Beverages, Natural Colorants, and Wines. AOAC Official Method.

2. Azza A.Abou-Arab, Ferial M.Abu-Salem and Esmat A.bou Arrab (2011).

Physico-chemical properties of natural pigments (anthocyanin) extracted

from Roselle calyces (Hibiscus subdariffa). Department of food technology,

national research centre, Dokki, Cairo, Egypt.

3. Giusti. M. M and Wrolstad, R. E. (2001). Characterization and Measurement

of Anthocyanin by UV-Visible Spectroscopy. Current Protocols in Food

Analytical Chemistry.

4. John Wiley (2005). Handbook of Food Analytical Chemistry: Pigments,

Colorants, Flavors, Texture, anh biocative food components.

5. Nguyen Ngoc Mai Trinh, Nguyen Manh Duc, Phan Van Hung (2014),

Antioxidant capacity and amylase inhibitory from fresh asiatic pennywort

(Centella asiatica).

6. Oliver-Hoyo, M. Allen, D. Solomon, S. Brook, V. Ciraolo, J. Daly, and

Jackson. (2001). Qualitative analysis of fourteen white solids and two mixtures

using household chemicals. Journal of chemical education 78, 1475-1478.

7. Rodriguez-Saona, L.E and Wrolstad, R.E (2001). Extraction, Isolation, and

Purification of Anthocyanins. Current Protocols in Food Analytical

Chemistry.

8. Suhad s. Humadi, viorica istudor (2009). Quantitative analysis of bio- active

compounds in hibiscus sabdariffa l. extracts. II. quantitative analysis and

biological activities of anthocyanins.

9. S.D.SANJA (2009). Characterization and evaluation of antioxidant activity

of portulaca oleracea.

10. Zhaohua Hou (2013). Identification of anthocyanins isolated from black rice

(Oryza sativa L.) and their degradation kinetics.

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC A PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SỬ DỤNG TRONG

NGHIÊN CƯU

1) Phương pháp trích ly anthocyanin.

- Anthocyanin từ gạo đen được trích ly bằng cách nghiền nhỏ hạt nguyên liệu

đến kích thước 0.0098 inches.

- Phương pháp sử dụng dung môi EtOH:HCl 1% tỉ lệ 85:15 (v:v). (Nguyễn

Thị Thanh Tuyền, 2014).

- Tỷ lệ nguyên liệu: dung môi là 85:15 (v:v).

- Thời gian trích ly là 60 phút.

- Nhiệt độ trích ly là 60oC.

- Số lần trích ly là 1 lần.

2) Phương pháp pH vi sai.

Xác định hàm lượng anthocyanin thô

- Tại pH = 1 các anthocyanin tồn tại ở dạng oxonium hoặc flavylium có độ

hấp thụ cực đại.

- Tại pH = 4,5 chúng ở dạng carbinol không màu.

Đo độ hấp thụ cực đại của 2 mẫu ở pH = 1 và pH = 4,5 tại bước sóng của độ

hấp thụ cực đại 515 nm, so với độ hấp thụ tại bước sóng 700 nm (độ đục của mẫu).

(Suhad s. Humadi1, Viorica Istudor , 2009).

Anthocyanin toàn phần (a, mg/ml) =

Trong đó:

A: mật độ quang (độ hấp thu của anthocyanin).

A = (Amax - A700)pH1 - (Amax - A700)pH4,5

Đồ án tốt nghiệp

Với:

Amax(pH=1): độ hấp thu cực đại tại bước sóng λmax nm.

A700(pH=4,5): độ hấp thu cực đại tại bước sóng 700 nm.

MW: khối lượng phân tử của anthocyanin không kể ion Cl- hay nước tinh thể

hóa là 449,2 g/mol.

DF: hệ số pha loãng.

: độ hấp thụ phân tử là 26900. L · mol–1 · cm–1

l: chiều dày cuvet, 1 cm.

103 chuyển đổi từ g sang mg.

3) Phương pháp DPPH

Nguyên tắc: DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) là một gốc tự do bền,

dung dịch có màu tím, bước sóng cực đại hấp thu tại 515-517nm. Các chất có khả

năng kháng oxy hóa sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ

hấp thu tại bước sóng cực đại, màu của dung dịch phản ứng sẽ nhạt dần, tím chuyển

sang vàng nhạt. Ascorbic acid được sử dụng làm chất đối chiếu.

Phương pháp tiến hành xác định giá trị IC50

Thực hiện với mẫu thử

DPPH hòa tan trong dung môi methanol ở nồng độ 6mM

Hòa tan mẫu trong DMSO ở 8 nồng độ khác nhau

Cho 100µl dung dịch DPPH nồng độ 6mM vào 2800µl methanol, sau đó bổ

sung 100µl mẫu thử (thực hiện lần lượt cho từng nồng độ)

Dung dịch được lắc đều, thực hiện phản ứng ở điều kiện nhiệt độ phòng trong

thời gian 30 phút, rồi đem mẫu đo độ hấp thu ở bước sóng  = 516 nm.

Đồ án tốt nghiệp

Mỗi nồng độ mẫu được thử nghiệm lặp lại 3 lần để tính giá trị trung bình

Thực hiện với mẫu đối chiếu và mẫu trắng

Hòa tan ascorbic acid (Ascorbic acid) trong DMSO ở 8 nồng độ khác nhau.

Mẫu đối chiếu (ascrorbic acid): cho 100µl dung dịch DPPH nồng độ 6mM vào

2800µl methanol, sau đó bổ sung 100µl dung dịch ascorbic acid

Mẫu trắng: cho 100µl DMSO vào 2900µl methanol.

Cả hai dung dịch được lắc đều, thực hiện phản ứng ở điều kiện nhiệt độ phòng

trong thời gian 30 phút, rồi đem mẫu đo độ hấp thu ở bước sóng  = 516 nm.

Mỗi nồng độ chất đối chiếu được thử nghiệm lặp lại 3 lần để tính giá trị trung

bình.

Kết quả tính toán

Phần trăm bắt gốc tự do DPPH của chất nghiên cứu được tính theo công thức

Q(%) = [1 − ] x100 (A − Ac) (A0 − Ac)

Trong đó:

A là độ hấp thu của dung dịch chứa mẫu thử

A0 là độ hấp thu của DPPH khi không có mẫu thử

Ac là độ hấp thu của dung dịch chứa chất đối chiếu

Giá trị IC50 được tính bằng phần mềm GraphPad Prism thông qua đường chuẩn

phần trăm ức chế (đường chuẩn được xây dựng từ 9 nồng độ khác nhau).

Đồ án tốt nghiệp

4) IC50 và cách xác định

Định nghĩa: IC50 (Effective concentration of 50%) là một giá trị dùng để đánh

giá khả năng ức chế mạnh hoặc yếu của mẫu khảo sát. IC50 được định nghĩa là nồng

độ của mẫu mà tại đó nó có thể ức chế 50% gốc tự do, hoặc tế bào, hoặc enzyme,

mẫu có hoạt tính càng cao thì giá trị IC50 sẽ càng thấp.

Cách xác định IC50:

- Tiến hành khảo sát hoạt tính của mẫu ở nhiều nồng độ khác nhau.

- Với những mẫu có hoạt tính biến thiên tuyến tính với nồng độ, chúng ta vẽ

một đường thẳng y = ax+b qua tất cả các điểm (với y là % ức chế, x là nồng độ).

- Với những mẫu có hoạt tính không biến thiên tuyến tính với nồng độ, một

cách gần đúng, ta chọn 2 nồng độ ức chế trên và dưới 50% và vẽ đường thẳng y=ax+b

qua 2 điểm này.

- Từ phương trình trên, cho y = 50 ta sẽ suy ra giá trị x chính là IC50.

5) Phương pháp xử lý số liệu thống kê.

Phần mềm thống kê Statgraphic Plus 4.0, Excel 2015, GraphPad Prism.

Kết quả trong nghiên cứu này là giá trị trung bình và độ lệch chuẩn của 3 lần

lặp lại. Dữ liệu được phân tích ANOVA bằng phần mềm Statgraphic. Sự khác biệt

giữa các mẫu là có ý nghĩa về mặt thống kê khi giá trị p < 0,05.

6) Chuẩn bị dung dịch đệm pH

a) Pha 0,025M KCl buffer, pH 1.0

Cân 1,86g KCl cho vào becher 1 lít, thêm nước cất đến 980ml. Đo pH và chỉnh

về pH 1.0 bằng HCl (khoảng 6,3ml). Sau đó cho vào bình định mức 1 lít bằng nước

cất.

Đồ án tốt nghiệp

a) Pha 0,4M CH3COONa buffer pH4.5

Cân 54,43g CH3COONa.3H2O cho vào becher 1 lít thêm nước cất khoảng

960ml

Đo và chỉnh pH 4.5 bằng HCl (khoảng 20ml) và định mức bằng nước cất.

a) Pha HCl 1% từ HClđđ 37% (d ~ 1,19g/ml)

10ml dd HClđđ + 430ml nước cất.

7) Xác định độ ẩm nguyên liệu.

Mục đích thí nghiệm: Xác định độ ẩm nguyên liệu.

Phương pháp sấy đến khối lượng không đổi (còn gọi là phương pháp nhiệt).

Phương pháp này được coi là phương pháp tiêu chuẩn.

Dụng cụ thí nghiệm:

- Cốc thuỷ tinh hay hộp kim loại đựng mẫu.

- Máy nghiền hoặc cối nghiền, đũa thuỷ tinh

- Tủ sấy, bình hút ẩm.

- Cân phân tích hoặc cân điện tử, chính xác ±0,001gam.

Tiến hành thí nghiệm:

- Xử lý nguyên liệu: nghiền nhỏ nguyên liệu.

- Dùng cân phân tích hoặc cân điện tử cân chính xác 5 gam mẫu đã xử lý ở

trên cho vào hộp hoặc cốc sạch, khô đã biết khối lượng trước (tức là sau khi rửa, sấy

khô, để nguội đến nhiệt độ phòng, cân).

- Dùng đũa thuỷ tinh san đều lượng mẫu ở hộp đựng mẫu để ẩm bốc hơi nhanh

và đều.

Đồ án tốt nghiệp

- Đưa mẫu vào tủ sấy để lấy ở nhiệt độ 105oC đến khối lượng không đổi. Sau

khi sấy, lấy mẫu ra cho vào bình hút ẩm để làm nguội, cân. tiếp tục sấy đến khối

lượng không đổi, nghĩa là: sấy lại, làm nguội và cân. Khi kết quả giữa hai lần cân

cuối cùng có sai số ±0,5 % là coi như khối lượng không đổi.

Chỉ tiêu theo dõi: Khối lượng nguyên liệu tính bằng g.

Tính kết quả thí nghiệm:

Nếu gọi:

G1 : Khối lượng hộp và nguyên liệu trước khi sấy, g.

Go : Khối lượng hộp không, g

G2 : Khối lượng hộp và mẫu sau khi sấy, g

G : Khối lượng mẫu cần xác định, g.

G = G1 - Go

Độ ẩm tương đối ω hay độ ẩm nguyên liệu được xác định theo biểu thức sau,

𝐺1−𝐺2

tính bằng %:

𝐺

ω = 𝑥100 %

8) Thí nghiệm 2: Xác định bước sóng hấp thu cực đại của anthocyanin

từ mẫu gạo đen

9) Thí nghiệm 3: Xác định ảnh hưởng của kích thước hạt đến hiệu

quả trích ly anthocyanin từ gạo đen.

Cân 5g nguyên liệu gạo đen vào chai thủy tinh. Thêm 100ml dung môi

Ethanol:HCl (1%) vào chai thủy tinh. Đặt chai thủy tinh vào bể điều nhiệt 600C trong

Đồ án tốt nghiệp

60 phút. Sau đó, lấy dịch trích ly đem ly tâm (4000 vòng/15 phút). Lọc dịch trích

bằng giấy lọc, thu dịch bỏ cặn. Định mức bằng dung môi Ethanol:HCl (1%) đến

100ml, để yên dung dịch trong 15 phút. Hút dịch đã định mức vào 2 ống nghiệm mỗi

ống 1ml, hút tiếp 9ml đệm pH = 1 vào ống nghiệm thứ nhất và 9ml đệm pH = 4,5 vào

ống nghiệm còn lại. Lắc đều rồi để yên 15 phút cho ổn định dung dịch. Sau đó, đo

quang phổ ở 2 bước sóng 535nm và 700nm. Dùng nước cất làm mẫu trắng. Ghi nhận

kết quả và tính toán hàm lượng anthocyanin của mỗi nghiệm thức.

Chỉ tiêu theo dõi: tính toán hàm lượng anthocyanin theo công thức pH vi sai.

10) Thí nghiệm 4: Xác định ảnh hưởng của xử lý nhiệt sơ bộ cho

nguyên liệu đến quá trình trích ly anthocyanin từ gạo đen

Cân 5g gạo đen vào 3 chai thủy tinh. Chai thứ nhất : không xử lý nhiệt; Chai

thứ 2 : xử lý nhiệt ở 800C/5 phút, để nguội; Chai thứ 3 : xử lý nhiệt ở 900C/5 phút, để

nguội. Thêm 100ml dung môi Ethanol:HCl(1%) vào các chai thủy tinh. Đặt chai thủy

tinh vào bể điều nhiệt 600C trong 60 phút. Sau đó, lấy dịch trích ly đem ly tâm (4000

vòng, 15 phút). Lọc dịch trích bằng giấy lọc, thu dịch bỏ cặn. Định mức bằng dung

môi Ethanol:HCl (1%) đến 100ml, để yên dung dịch trong 15 phút. Hút dịch đã định

mức lần lượt vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1ml, hút tiếp 9ml đệm pH = 1 vào ống

nghiệm thứ nhất và 9ml đệm pH = 4,5 vào ống nghiệm còn lại. Lắc đều rồi để yên 15

phút cho ổn định dung dịch. Sau đó, đo quang phổ ở 2 bước sóng 535nm và 700nm.

Lấy nước cất làm mẫu trắng. Ghi nhận kết quả và tính toán hàm lượng anthocyanin

của mỗi nghiệm thức.

Chỉ tiêu theo dõi: tính toán hàm lượng anthocyanin theo công thức pH vi sai.

11) Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của tỷ lệ HCl trong pha chế dung môi để

trích ly anthocyanin từ gạo đen.

Cân 5g gạo đen vào 6 chai thủy tinh. Thêm 100ml dung môi ethanol:HCl (1%)

với các tỷ lệ khác nhau vào các chai thủy tinh. Đặt chai thủy tinh vào bể điều nhiệt

600C trong 60 phút. Sau đó, lấy dịch trích ly đem ly tâm (4000 vòng, 15 phút). Lọc

Đồ án tốt nghiệp

dịch trích bằng giấy lọc, thu dịch bỏ cặn. Định mức bằng dung môi Ethanol:HCl (1%)

cùng tỷ lệ như trên đến 100ml, để yên dung dịch trong 15 phút. Hút dịch đã định mức

lần lượt vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1ml, hút tiếp 9ml đệm pH = 1 vào ống nghiệm

thứ nhất và 9ml đệm pH = 4,5 vào ống nghiệm còn lại. Lắc đều rồi để yên 15 phút

cho ổn định dung dịch. Sau đó, đo quang phổ ở 2 bước sóng 535nm và 700nm. Lấy

nước cất làm mẫu trắng. Ghi nhận kết quả và tính toán hàm lượng anthocyanin của

mỗi nghiệm thức.

Chỉ tiêu theo dõi: tính toán hàm lượng anthocyanin theo công thức pH vi sai.

12) Thí nghiệm 6: Xác định nhiệt độ thích hợp trích ly anthocyanin từ

gạo đen.

Cân 5g gạo đen vào 5 chai thủy tinh. Thêm 100ml dung môi ethanol:HCl (1%)

vào các chai thủy tinh. Đặt chai thủy tinh vào các bể điều nhiệt với các nhiệt độ khác

nhau trong 60 phút. Sau đó, lấy dịch trích ly đem ly tâm (4000 vòng, 15 phút). Lọc

dịch trích bằng giấy lọc, thu dịch bỏ cặn. Định mức bằng dung môi Ethanol:HCl (1%)

đến 100ml, để yên dung dịch trong 15 phút. Hút dịch đã định mức lần lượt vào 2 ống

nghiệm mỗi ống 1ml, hút tiếp 9ml đệm pH = 1 vào ống nghiệm thứ nhất và 9ml đệm

pH = 4,5 vào ống nghiệm còn lại. Lắc đều rồi để yên 15 phút cho ổn định dung dịch.

Sau đó, đo quang phổ ở 2 bước sóng 535nm và 700nm. Nước cất sử dụng làm mẫu

trắng. Ghi nhận kết quả và tính toán hàm lượng anthocyanin của mỗi nghiệm thức.

Chỉ tiêu theo dõi: tính toán hàm lượng anthocyanin theo công thức pH vi sai.

13) Thí nghiệm 7: Xác định thời gian thích hợp trích ly anthocyanin từ

gạo đen.

Cân 5g gạo đen vào 5 chai thủy tinh. Thêm 25ml dung môi ethanol:HCl (1%)

vào các chai thủy tinh. Đặt chai thủy tinh vào các bể điều nhiệt với các thời gian khác

nhau. Sau đó, lấy dịch trích ly đem ly tâm (4000 vòng, 15 phút). Lọc dịch trích bằng

giấy lọc, thu dịch bỏ cặn. Định mức bằng dung môi Ethanol:HCl (1%) đến 100ml, để

yên dung dịch trong 15 phút. Hút dịch đã định mức lần lượt vào 2 ống nghiệm mỗi

Đồ án tốt nghiệp

ống 1ml, hút tiếp 9ml đệm pH = 1 vào ống nghiệm thứ nhất và 9ml đệm pH = 4,5 vào

ống nghiệm còn lại. Lắc đều rồi để yên 15 phút cho ổn định dung dịch. Sau đó, đo

quang phổ ở 2 bước sóng 535nm và 700nm. Nước cất được sử dụng như mẫu trắng.

Ghi nhận kết quả và tính toán hàm lượng anthocyanin của mỗi nghiệm thức.

Chỉ tiêu theo dõi: tính toán hàm lượng anthocyanin theo công thức pH vi sai.

14) Thí nghiệm 8: Xác định hoạt tính kháng oxy của anthocyanin.

Bắt gốc tự do DPPH tiến hành theo S.D.Sanjaet al. (2009).

Lấy lần lượt 100 µl, 120 µl, 140 µl, 160 µl, 180 µl, 200 µl dịch trích ly vào 6

ống nghiệm. Thêm đến 3000 µl bằngEtOH 100%. Rồi bổ sung 150 µl DPPH vào

từng ống nghiệm làm dung dịch mẫu (mẫu). Để trong tối 15 phút, nhiệt độ phòng.

Đem đo phổ hấp thu ngay ở bước sóng 516nm. Lấy EtOH 100% để làm mẫu trắng.

Lấy 150 µl DPPH thêm 2850 µl EtOH 100% đo phổ hấp thu ngay ở bước sóng

516nm (Blank). Lấy EtOH 100% để làm mẫu trắng.

Lấy 150 µl vitC (100µg/ml) thêm 2850 µl EtOH 100% đo phổ hấp thu sau 15

phút (trong tối, nhiệt độ phòng) ở bước sóng 516nm (Blank). Lấy EtOH 100% để làm

mẫu trắng.

Tiến hành thí nghiệm:

-Xác định nồng độ anthocyanin trong dịch trích sau khi pha loãng 10 lần.

-Pha loãng mẫu thành dãy các nồng độ khác nhau, cho phản ứng với DPPH ở

nhiệt độ phòng, trong tối, 15-30 phút rồi tiến hành đo OD tại 516nm. Sử dụng chất

đối chứng là Ascorbic acid (100µg/ml).

Chỉ tiêu theo dõi:

Đo độ hấp thu màu của lượng DPPH còn lại sau khi phản khi với anthocyanin

ở bước sóng 516nm.

Nồng độ anthocyanin được xác định bằng phương pháp pH vi sai.

Đồ án tốt nghiệp

15) Thí nghiệm 9: Xác định thông số cho quá trình cô quay thu nhận

dịch chiết anthocyanin cô đặc.

-700 ml dịch trích ly anthocyanin từ gạo đen trong 24h bảo quản ở 4oC.

-Tỷ lệ mẫu:dung môi trích ly là: 1:20 (w/v).

Tiến hành thí nghiệm:

-Cân khối lượng bình cô quay khô, m.

-Cân lại khối lượng bình sau khi cho 100mL mẫu vào, m0.

-Tiến hành cô quay lần lượt 6 bình chứa dịch trích ly cùng thể tích là 100ml.

-Nhiệt độ cô quay là 40-45oC.

-Cân lại khối lượng các bình 3 phút, bình 6 phút, bình 9 phút, bình 12 phút,

bình 15 phút, bình 18 phút cô quay ta được khối lượng mo, m3, m6, m9, m12, m15, m18.

Sau đó định mức lại 100 (ml) mẫu đem xác định hàm lượng anthocyanin và hoạt tính

kháng oxy hóa.

Chỉ tiêu theo dõi:

Hoạt tính oxy hóa: Đo độ hấp thu màu của lượng DPPH còn lại sau khi phản

khi với anthocyanin ở bước sóng 516nm.

Nồng độ anthocyanin được xác định bằng phương pháp pH vi sai.

Thể tích dịch dịch trích ly còn lại xác định bằng tỷ lệ khối lượng mẫu trước và

sau cô quay.

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC B SỐ LIỆU THÍ NGHIỆM.

1. Thí nghiệm 1:

Hình 1 Quang phổ mẫu anthocyanin từ bước sóng 400-700nm trong dung

môi EtOH:0,1N HCl (85:15, v:v).

2. Thí nghiệm 2:

Bảng 1 số liệu OD đo được từ thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng kích thước hạt đến

hiệu quả trích ly anthocyanin từ gạo đen.

Dạng mẫu

pH45

A

a (mg/L)

Nguyên hạt

TB (mg/L) 4,082 ±0,494

7,323 ±0,202

Kích thước hạt 0.0098 inches

pH1 535mn 700nm 535nm 700nm 0.073 0.073 0.072 0.077 0.075 0.072 0.074 0.073 0.071 0.128 0.130 0.127 0.129 0.133

0.026 0.027 0.028 0.022 0.024 0.031 0.024 0.025 0.022 0.035 0.035 0.037 0.035 0.032

0.050 0.050 0.051 0.048 0.049 0.045 0.052 0.047 0.045 0.073 0.074 0.070 0.069 0.076

0.028 0.026 0.027 0.025 0.023 0.029 0.021 0.025 0.028 0.048 0.048 0.049 0.050 0.046

Hệ số pha loãng 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10

0.021 3,507 0.024 4,008 0.022 3,674 0.026 4,342 0.027 4,509 0.029 4,843 0.025 4,175 0.026 4,342 0.020 3,340 0.042 7,014 0.043 7,181 0.045 7,514 0.045 7,514 0.043 7,181

5,214 ±0,764

Đồ án tốt nghiệp

Kích thước hạt 0,394 inches

0.128 0.130 0.089 0.087 0.090 0.086 0.091 0.085 0.088 0.092 0.087

0.049 0.048 0.015 0.017 0.019 0.016 0.018 0.020 0.019 0.017 0.014

0.072 0.073 0.062 0.065 0.073 0.071 0.067 0.066 0.069 0.068 0.072

0.037 0.036 0.023 0.029 0.032 0.025 0.031 0.028 0.027 0.029 0.030

10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10

0.044 7,348 0.045 7,514 0.035 5,845 0.034 5,678 0.030 5,010 0.024 4,008 0.037 6,179 0.027 4,509 0.027 4,509 0.036 6,012 0.031 5,177

Nguyen Hat 0,394 inches 0,0098 inches

Count 9 9 7

Mean 4.08222 5.21411 7.32371

Homogeneous Groups X X X

Bảng 2. Multiple Range Tests Method: 95.0 percent LSD

3. Thí nghiệm 3

Bảng 3. số liệu OD của thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ xử lý hạt nguyên

liệu đến hiệu quả trích ly anthocyanin từ gạo đen.

Dạng mẫu

Hệ số pha loãng

A

pH1 535mn

700nm

a (mg/L)

Hạt 0.0098 inches nấu ở 80oC/5p

pH45 535n m 0.071 0.070 0.072 0.069 0.073 0.070 0.075 0.069

700n m 0.019 0.020 0.020 0.022 0.021 0.024 0.019 0.023

0.082 0.082 0.084 0.080 0.085 0.079 0.083 0.082

10 10 10 10 10 10 10 10

0.033 0.032 0.033 0.030 0.031 0.033 0.034 0.029

0.025 4,175 0.024 4,008 0.025 4,175 0.019 3,173 0.022 3,674 0.018 3,006 0.023 3,841 0.019 3,173

Hạt 0.0098 inches nấu ở 90oC/5p

TB (mg/L) 3,653 ±0,476 3,382 ±0,306

0.042 0.041 0.042 0.040 0.043 0.039 0.044 0.040

0.011 0.011 0.012 0.013 0.010 0.009 0.012 0.014

0.056 0.057 0.055 0.054 0.057 0.053 0.058 0.060

10 10 10 10 10 10 10 10

0.017 0.017 0.018 0.016 0.019 0.015 0.018 0.015

0.020 3,340 0.022 3,674 0.019 3,173 0.017 2,839 0.023 3,841 0.020 3,340 0.020 3,340 0.021 3,507

Đồ án tốt nghiệp

Hạt 0.0098 inches Giữ ở nhiệt độ phòng

0.128 0.130 0.127 0.129 0.133 0.128 0.130

0.048 0.048 0.049 0.050 0.046 0.049 0.048

0.073 0.074 0.070 0.069 0.076 0.072 0.073

0.035 0.035 0.037 0.035 0.032 0.037 0.036

10 10 10 10 10 10 10

0.042 7,014 0.043 7,181 0.045 7,514 0.045 7,514 0.043 7,181 0.044 7,348 0.045 7,514

7,324 ±0,202

Bảng 4. Multiple Range Tests

Homogeneous Groups X X X

90oC/5p 80oC/5p Nhiet do phong

Count 8 8 7

Mean 3.38175 3.65313 7.32371

Method: 95.0 percent LSD

4. Thí nghiệm 4

Bảng 5. giá trị OD cùa thí nghiệm tối ưu hóa tỉ lệ dung môi EtOH:HCl 1% trong

việc trích ly anthocyanin từ gạo đen.

pH45

n

A

a (mg/L) TB (mg/L)

TLDM V:v 80:20

3.173 ± 0.167

85:15

6.826 ± 0.815

pH1 535mn 700nm 535nm 700nm 0.270 0.260 0.263 0.267 0.265 0.269 0.268 0.313 0.309 0.301 0.307 0.312 0.311 0.308

0.081 0.077 0.078 0.080 0.076 0.081 0.082 0.121 0.134 0.133 0.124 0.130 0.128 0.132

0.490 0.481 0.485 0.487 0.488 0.489 0.486 0.488 0.479 0.480 0.481 0.487 0.485 0.482

0.321 0.318 0.319 0.320 0.317 0.319 0.318 0.335 0.340 0.351 0.342 0.350 0.349 0.350

10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10

0.020 0.020 0.019 0.020 0.018 0.018 0.018 0.039 0.036 0.039 0.044 0.045 0.047 0.044

3,340 3,340 3,173 3,340 3,006 3,006 3,006 6,513 6,012 6,513 7,348 7,514 7,848 7,348

Đồ án tốt nghiệp

90:10

7.848 ± 0.298

95:5

12.92 ± 1.256

98:2

2.923 ± 0.919

99:1

2.108 ± 0.378

0.306 0.302 0.276 0.318 0.311 0.315 0.305 0.432 0.433 0.439 0.434 0.438 0.430 0.435 0.437 0.272 0.276 0.288 0.279 0.280 0.285 0.283 0.273 0.213 0.209 0.215 0.211 0.215 0.208 0.212 0.214

0.125 0.124 0.110 0.136 0.133 0.130 0.121 0.234 0.238 0.261 0.250 0.249 0.241 0.257 0.245 0.124 0.119 0.116 0.122 0.117 0.121 0.118 0.120 0.121 0.134 0.113 0.130 0.129 0.131 0.118 0.128

0.338 0.325 0.346 0.349 0.329 0.344 0.326 0.345 0.349 0.357 0.346 0.355 0.348 0.353 0.344 0.125 0.126 0.121 0.123 0.127 0.124 0.121 0.119 0.129 0.140 0.130 0.133 0.139 0.134 0.138 0.137

10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10

0.486 0.456 0.464 0.487 0.458 0.483 0.462 0.464 0.458 0.458 0.462 0.457 0.461 0.465 0.456 0.256 0.264 0.277 0.259 0.271 0.261 0.274 0.263 0.208 0.199 0.218 0.204 0.214 0.201 0.217 0.211

0.033 0.047 0.048 0.044 0.049 0.046 0.048 0.079 0.086 0.077 0.068 0.087 0.076 0.066 0.080 0.017 0.019 0.016 0.021 0.019 0.027 0.012 0.009 0.013 0.016 0.014 0.010 0.011 0.010 0.015 0.012

5,511 7,848 8,015 7,348 8,182 7,681 8,015 13,192 14,361 12,858 11,355 14,528 12,691 11,021 13,359 2,839 3,173 2,672 3,507 3,173 4,509 2,004 1,503 2,171 2,672 2,338 1,670 1,837 1,670 2,505 2,004

Đồ án tốt nghiệp

Homogeneous Groups X X X X X X

Mean 2.10838 2.9225 3.173 6.82587 7.84817 12.9206

Bảng 6. Multiple Range Tests Method: 95.0 percent LSD 99:1 98:2 80:20 85:15 90:10 95:5

Count 8 8 7 8 6 8

5. Thí nghiệm 5

Bảng 7. giá trị OD của thí nghiệm tối ưu hóa nhiệt độ trích ly anthocyanin từ gạo đen.

A

pH45 535n m

700n m

a (mg/L)

Nhiệt độ trích ly (oC) 50

pH1 535m n 0.065

700n m 0.029 0.041 0.035

Hệ số pha loãng 10

5.010

0.069

0.029 0.045 0.039

5.628

0.074

0.030 0.048 0.038

5.678

0.072

0.025 0.042 0.034

6.513

0.067

0.027 0.047 0.039

TB (mg/L) 5.543 ±0.676

5.344

0.073

0.030 0.040 0.033

6.012

0.065

0.028 0.046 0.037

4.676

0.071

0.024 0.050 0.031

4.676

0.070

0.031 0.041 0.040

6.346

55

0.133

0.046 0.071 0.035

8.516

0.129

0.048 0.070 0.037

8.015

0.131

0.044 0.069 0.031

8.182

0.134

0.045 0.072 0.036

8.850

0.128

0.046 0.068 0.033

8.405 ±0.391

0.03 0 0.03 4 0.03 4 0.03 9 0.03 2 0.03 6 0.02 8 0.02 8 0.03 8 0.05 1 0.04 8 0.04 9 0.05 3 0.04 7

7.848

0.132

0.050 0.067 0.035

8.349

0.129

0.045 0.073 0.038

8.182

0.133

0.042 0.067 0.030

9.017

0.130

0.041 0.069 0.032

8.683

Đồ án tốt nghiệp

60

0.121

0.045 0.069 0.039

7.681

0.125

0.049 0.070 0.038

7.348

0.123

0.047 0.067 0.036

7.514

0.120

0.046 0.071 0.035

6.346

0.124

0.044 0.068 0.037

7.310 ±0.866

8.182

0.127

0.050 0.065 0.040

8.683

0.119

0.048 0.072 0.038

6.179

0.126

0.043 0.069 0.031

7.514

0.121

0.051 0.070 0.038

6.346

65

0.087

0.018 0.059 0.019

4.843

0.088

0.020 0.064 0.024

4.676

0.090

0.021 0.069 0.026

4.342

0.086

0.019 0.063 0.020

4.008

4.237 ±0.585

0.083

0.021 0.067 0.025

3.340

0.087

0.016 0.066 0.019

4.008

0.089

0.022 0.059 0.022

5.010

0.085

0.018 0.068 0.023

3.674

70

0.069

0.025 0.049 0.030

4.175

0.070

0.023 0.051 0.028

4.279 ±0.741

0.05 0 0.04 9 0.05 4 0.05 2 0.04 6 0.04 4 0.04 5 0.03 8 0.04 9 0.05 2 0.03 7 0.04 5 0.03 8 0.02 9 0.02 8 0.02 6 0.02 4 0.02 0 0.02 4 0.03 0 0.02 2 0.02 5 0.02 4

4.008

0.072

0.029 0.046 0.029

4.342

0.071

0.027 0.047 0.031

4.676

0.067

0.022 0.050 0.027

3.674

0.073

0.030 0.045 0.033

5.177

0.069

0.024 0.048 0.034

5.177

0.072

0.031 0.051 0.028

0.02 6 0.02 8 0.02 2 0.03 1 0.03 1 0.01 8

3.006

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 8. Multiple Range Tests

Count

NhietDoTrichLy_65 8 NhietDoTrichLy_70 8 NhietDoTrichLy_50 9 NhietDoTrichLy_60 9 NhietDoTrichLy_55 9

Mean 4.23762 4.27937 5.54256 7.31033 8.40467

Homogeneous Groups X X X X X

Method: 95.0 percent LSD

6. Thí nghiệm 6

Bảng 9. giá trị OD của thí nghiệm tối ưu hóa thời gian trích ly anthocyanin từ gạo

đen.

A

a (mg/L)

TB (mg/L)

Hệ số pha loãng

700n m

Thời gian trích ly (phút) 50

pH1 pH45 535m 535n m n 0.075 0.031 0.042 0.035 10

6.179

5.307 ±0.859

0.069 0.028 0.039 0.028 10

5.010

0.061 0.030 0.036 0.037 10

5.344

0.071 0.027 0.041 0.029 10

5.344

0.03 7 0.03 0 0.03 2 0.03 2

0.068 0.029 0.037 0.031 10

5.511

0.063 0.031 0.042 0.033 10

3.841

0.069 0.033 0.036 0.036 10

6.012

0.073 0.025 0.038 0.028 10

6.346

0.065 0.030 0.042 0.032 10

4.175

Đồ án tốt nghiệp

55

0.131 0.050 0.076 0.039 10

7.348

7.570 ±0.783

0.127 0.050 0.069 0.035 10

7.181

0.135 0.052 0.072 0.038 10

8.182

0.129 0.051 0.073 0.034 10

6.513

0.132 0.048 0.078 0.037 10

7.181

0.128 0.053 0.071 0.040 10

7.348

0.130 0.049 0.075 0.036 10

7.014

0.134 0.052 0.073 0.041 10

8.349

0.136 0.047 0.069 0.034 10

9.017

12.524

60

0.135 0.040 0.055 0.035 10

13.322 ±1.097

0.136 0.039 0.051 0.036 10

13.693

0.139 0.043 0.056 0.036 10

12.691

0.138 0.039 0.052 0.034 10

13.526

0.131 0.042 0.055 0.037 10

11.856

0.140 0.037 0.049 0.033 10

14.528

0.137 0.035 0.053 0.040 10

14.862

0.136 0.040 0.050 0.039 10

14.194

0.133 0.038 0.057 0.034 10

12.023

0.03 3 0.02 3 0.03 6 0.03 8 0.02 5 0.04 4 0.04 3 0.04 9 0.03 9 0.04 3 0.04 4 0.04 2 0.05 0 0.05 4 0.07 5 0.08 2 0.07 6 0.08 1 0.07 1 0.08 7 0.08 9 0.08 5 0.07 2

Đồ án tốt nghiệp

65

0.095 0.020 0.060 0.021 10

6.012

6.030 ±0.877

0.090 0.018 0.063 0.031 10

6.680

0.090 0.023 0.070 0.036 10

5.511

0.091 0.019 0.062 0.022 10

5.344

0.093 0.021 0.065 0.029 10

6.012

0.096 0.017 0.069 0.033 10

7.181

0.092 0.022 0.061 0.026 10

5.845

0.095 0.019 0.063 0.030 10

7.181

0.097 0.023 0.071 0.024 10

4.509

3.841

70

0.063 0.022 0.044 0.026 10

4.56 ±0.678

0.071 0.021 0.050 0.029 10

4.843

0.065 0.027 0.041 0.031 10

4.676

0.069 0.023 0.046 0.027 10

4.509

0.064 0.026 0.049 0.032 10

3.507

0.070 0.022 0.042 0.024 10

5.010

0.067 0.020 0.045 0.028 10

5.010

0.072 0.025 0.043 0.030 10

5.678

0.065 0.019 0.051 0.029 10

4.008

0.03 6 0.04 0 0.03 3 0.03 2 0.03 6 0.04 3 0.03 5 0.04 3 0.02 7 0.02 3 0.02 9 0.02 8 0.02 7 0.02 1 0.03 0 0.03 0 0.03 4 0.02 4

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 10. Multiple Range Tests

TgianTLy_70 TgianTLy_50 TgianTLy_65 TgianTLy_55 TgianTLy_60

Mean 4.56467 5.30689 6.03056 7.57033 13.3219

Homogeneous Groups X XX X X X

Count 9 9 9 9 9 7. Thí nghiệm 7

Method: 95.0 percent LSD

Bảng 11. giá trị khối lượng nguyên liệu trước và sau khi sấy đên khối lượng không

đổi.

Wtb(%)

11.26 ±0.04

Coc 1 Coc 2 Coc 3

Mo 23.3413 22.5903 22.3819

M1 28.345 27.5935 27.3835

M2 27.838 27.089 26.876

W(%) 11.27 11.21 11.29

8. Thí nghiệm 8

Bảng 12. OD xác định hàm lượng anthocyanin để xác định giá trị IC50 của mẫu.

DF A

a (mg/mL) a TB (mg/mL)

46.200 ±0,964

pH1 535nm 0.649 0.647 0.652

0.969 0.972 0.970

700nm 0.678 0.683 0.679

100 0.027 45.087 100 0.028 46.757 100 0.028 46.757

pH4,5 700nm 535nm 0.331 0.330 0.333

Bảng 13. giá trị OD tại λ=516nm xác định hoạt tính kháng DPPH của anthocyanin

Lần 3 Trung bình 2.148 0.066 Q3

2.148 0.067 Qtb

Lần 1 2.153 0.068 A1 0.083 0.127 0.312 0.825

Lần 2 2.142 0.067 Q1 99.231 97.116 88.225 63.569

logCo Q2 99.279 99.135 99.215 0.6646 96.828 96.588 96.844 0.4886 87.792 87.393 87.804 0.1875 63.329 63.473 63.457 0.0114

A2 0.082 0.133 0.321 0.830

A3 0.085 0.138 0.329 0.827

Blank Vitamine C DF Co 0.1000 4.62 0.0667 3.08 0.0333 1.54 0.0222 1.026 7 0.77 0.513

0.0167 0.0111

0.996 1.335

1.001 1.315

1.006 1.325

55.351 39.058

55.111 54.870 55.111 40.019 39.539 39.539

-0.114 -0.29

0.0083 0.0067 0.0056

1.535 1.624 1.702

1.533 1.608 1.701

1.531 1.615 1.698

29.446 25.168 21.419

29.542 29.638 29.542 25.937 25.601 25.569 21.467 21.612 21.500

-0.415 -0.511 -0.591

0.0033 0.0022

1.872 2.053

1.863 2.045

1.871 2.049

13.249 4.550

13.682 13.297 13.409 4.742 4.742 4.934

-0.812 -0.989

Đồ án tốt nghiệp

0.385 0.308 0.256 7 0.154 0.102 67

Phần trăm bắt gốc tự do DPPH của chất nghiên cứu được tính theo công thức

Q(%) = [1 − ] x100 (A − Ac) (A0 − Ac)

Trong đó:

A là độ hấp thu của dung dịch chứa mẫu thử

A0 là độ hấp thu của DPPH khi không có mẫu thử

Ac là độ hấp thu của dung dịch chứa chất đối chiếu

Q là % gốc tự do bị ức chế.

Bảng 14. giá trị OD xác định hoạt tính kháng DPPH của Ascorbic acid

Lần 1 1.642

Lần 2 1.657 A3

Lần 3 1.598 Q2

Trung bình 1.632 Qtb

Blank Co (µg/ml) A1 100.000 50.000 10.000 5.000 1.000 0.500 0.100 0.050

logCo 0.064 0.070 0.070 96.079 95.712 95.712 95.834 2.000 0.080 0.078 0.077 95.099 95.222 95.283 95.201 1.699 1.272 1.271 1.254 22.075 22.136 23.177 22.463 1.000 12.212 11.354 0.699 1.434 1.474 1.433 12.150 9.700 1.467 1.432 1.467 10.129 12.273 10.129 10.843 0.000 -0.301 1.483 1.497 1.432 9.148 -1.000 1.512 1.650 1.548 7.372 -1.301 1.573 1.577 1.550 3.635

8.291 -1.082 5.166 5.044 3.390

12.273 9.904 3.819 4.023

Đồ án tốt nghiệp

9. Thí nghiệm 9

Bảng15. khối lượng và thể tích dịch trước và sau cô quay

Khối lượng cốc và dịch cô quay (g) Khối lượng dịch còn lại (g) Thể tích

- 81.871 65.091 50.989 43.685 32.853 17.429 10.715

dịch còn lại (ml) - 100.00 79.50 62.28 53.36 40.13 21.29 13.09

m 114.012 mo 195.883 m3 179.103 m6 165.001 m9 157.697 m12 146.864 m15 131.440 m18 124.727

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 16. giá trị OD hàm lượng anthocyanin trong dịch trước và sau cô quay

pH4,5

DF A

a (mg/mL) a TB (mg/mL)

Thời gian

pH1 535nm 700nm 535nm 700nm

0 phút

4.620±0.096

3 phút

5.742±0.321

6 phút

7.062±0.409

9 phút

8.136±0.313

10.265±0.636

19.086±1.198

26.795±1.276

0.649 0.647 0.652 0.648 0.647 0.649 0.642 0.643 0.643 0.639 0.641 0.639 12 phút 0.637 0.639 0.638 15 phút 0.635 0.634 0.636 18 phút 0.635 0.637 0.638

0.331 0.330 0.333 0.329 0.329 0.330 0.325 0.329 0.328 0.325 0.328 0.327 0.323 0.321 0.326 0.316 0.315 0.319 0.316 0.313 0.317

Hệ số pha loãng 1.00 1.00 1.00 1.26 1.26 1.26 1.61 1.61 1.61 1.87 1.87 1.87 2.49 2.49 2.49 4.70 4.70 4.70 7.64 7.64 7.64

0.969 0.972 0.970 0.969 0.970 0.972 0.964 0.962 0.968 0.965 0.967 0.966 0.961 0.967 0.963 0.949 0.956 0.952 0.949 0.947 0.949

0.678 0.683 0.679 0.679 0.678 0.680 0.673 0.676 0.678 0.677 0.681 0.679 0.670 0.675 0.676 0.656 0.660 0.659 0.650 0.645 0.649

10 0.027 4.509 10 0.028 4.676 10 0.028 4.676 10 0.029 6.092 10 0.026 5.462 10 0.027 5.672 10 0.026 6.973 10 0.028 7.509 10 0.025 6.705 10 0.026 8.136 10 0.027 8.449 10 0.025 7.823 10 0.023 9.571 10 0.026 10.820 10 0.025 10.403 10 0.026 20.393 10 0.023 18.040 10 0.024 18.824 10 0.020 25.519 10 0.022 28.071 10 0.021 26.795

Bảng 17. OD về hiệu suất thu hồi anthocyanin trong dịch trích ly sau cô quay.

A

a (mg/mL)

Thời gian

D F

a TB (mg/mL)

pH1 534n m

700n m

pH4,5 534n m

700n m

0 phút

Hiệu suất thu hồi % 100

4.620 ±0.096

3 phút

4.564 ±0.255

6 phút

4.397 ± 0.255

0.649 0.331 0.969 0.678 10 0.027 0.647 0.330 0.972 0.683 10 0.028 0.652 0.333 0.970 0.679 10 0.028 0.648 0.329 0.969 0.679 10 0.029 0.647 0.329 0.970 0.678 10 0.026 0.649 0.330 0.972 0.680 10 0.027 0.642 0.325 0.964 0.673 10 0.026 0.643 0.329 0.962 0.676 10 0.028

4.509 4.676 4.676 4.843 4.342 4.509 4.342 4.676

Đồ án tốt nghiệp

9 phút

4.342 ±0.167

12 phút

4.119 ± 0.255

15 phút

4.063 0.255

18 phút

3.507 ± 0.167

0.643 0.328 0.968 0.678 10 0.025 0.639 0.325 0.965 0.677 10 0.026 0.641 0.328 0.967 0.681 10 0.027 0.639 0.327 0.966 0.679 10 0.025 0.637 0.323 0.961 0.670 10 0.023 0.639 0.321 0.967 0.675 10 0.026 0.638 0.326 0.963 0.676 10 0.025 0.635 0.316 0.949 0.656 10 0.026 0.634 0.315 0.956 0.660 10 0.023 0.636 0.319 0.952 0.659 10 0.024 0.635 0.316 0.949 0.650 10 0.020 0.637 0.313 0.947 0.645 10 0.022 0.638 0.317 0.949 0.649 10 0.021

4.175 4.342 4.509 4.175 3.841 4.342 4.175 4.342 3.841 4.008 3.340 3.674 3.507

Count 3 3 3 3 3 3 3

Mean 4.62033 5.742 7.06233 8.136 10.2647 19.0857 32.7497

Homogeneous Groups X X X X X X X

Bảng 18. Multiple Range Tests Method: 95.0 percent LSD 0 phút 3 phút 6 phút 9 phút 12 phút 15 phút 18 phút

Bảng 19. OD về khảo sát khả năng kháng DPPH của dịch trích ly anthocyanin từ gạo

đen trước và sau cô quay

Lần 1 0.612 0.118

Lần 2 0.633 0.12

Lần 3 0.626 0.066

Trung bình 0.624 0.122

Co (mg/ml) A1

%Q1 %Q2 %Q3

Qtb (%)±SD

Blank Vitamine C Thời gian cô quay (p) 0 phút 3 phút 6 phút 9 phút

4.620±0.096 0.373 0.378 0.374 49.967 48.970 49.767 49.568±0.527 4.564±0.255 0.374 0.378 0.376 49.801 49.004 49.402 49.402±0.399 4.397±0.255 0.375 0.377 0.374 49.602 49.203 49.801 49.535±0.305 4.342±0.167 0.379 0.378 0.376 48.805 49.004 49.402 49.070±0.304

Đồ án tốt nghiệp

12 phút 15 phút 18 phút

4.119±0.255 0.385 0.381 0.383 47.610 48.406 48.008 48.008±0.398 3.618±0.420 0.398 0.387 0.397 45.020 47.211 45.219 45.817±1.212 3.340±0.167 0.425 0.429 0.428 39.641 38.845 39.044 39.177±0.414

Bảng 20. Multiple Range Tests

Count 3 3 3 3 3 3 3

Homogeneous Groups X X X X X X X

18 phút 15 phút 12 phút 9 phút 6 phút 3 phút 0 phút

Method: 95.0 percent LSD Mean 39.1767 45.8167 48.008 49.0703 49.4023 49.5353 49.568