Hội thảo khoa học khoa Công nghệ thực phẩm 2018
NGHIÊN CỨU TỐI ĐIỀU KIỆN TRÍCH LY FUCOIDAN TỪ RONG SỤN
Đinh Thị Huyền1, Nguyễn Văn Nguyên Thịnh1,*, Hoàng Thị Ngọc Nhơn1
1 Khoa Công nghệ thực phẩm, trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm Thành phố Hồ Chí Minh
*Email: nguyenthinhdk96@gmail.com
Ngày nhận: 07/7/2018; Ngày chấp nhận: 12/7/2018
TÓM TẮT
Trong nghiên cứu này, phương pháp trích ly fucoidan từ rong sụn (Kappaphycus alvarezii) được trình
bày. Rong sụn trong nghiên cứu này là loại rong tươi (Đầm Môn-Khánh Hòa), được sấy khô tới độ ẩm
9.80% và sàng qua rây 1mm để đồng nhất kích thước. Sử dụng ethanol 80% để loại hợp chất màu và lipid.
Fucoidan từ rong sụn thu được bằng phương pháp trích ly với dung môi HCl, tỷ lệ dung môi 1/40 (w/v),
nhiệt độ trích ly 800C, thời gian trích ly 3 giờ và số lần trích ly là 1. Hàm lượng fucoidan sau khi trích ly
được xác định bằng phương pháp quang phổ UV-VIS cho thấy lượng fucoidan đạt 40.51±0.51µg/ml. Qua
quá trình khảo sát đơn yếu tố cho thấy dung môi, nhiệt độ và thời gian là 3 yếu tố ảnh hưởng lớn đến hàm
lượng fucoidan. Thực hiện tối ưu theo phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM), kết quả đạt được cho thấy khi
trích ly bằng HCl 1.39M trong thời gian 3.64 giờ ở nhiệt độ 85.10C thì hàm lượng fucoidan tối ưu đạt 47.88
µg/ml.
Từ khóa: Fucoidan, Kappaphycus alvarezii, HCl, tối ưu, RMS
1. GIỚI THIỆU
Fucoidan là hợp chất có chứa fucose polysaccharides (FCSPs), có mặt trong tảo biển và có nhiều chức
năng liên quan đến hoạt động sinh lý [1, 2]. Fucoidan có nhiều lợi ích về sức khỏe, chẳng hạn như được ứng
dụng cho thực phẩm chức năng, chống ung thư, miễn dịch, chống viêm, kháng virus, thuốc chống đông máu
và chất chống oxy hóa [1, 3, 4]. Rong biển được biết đến là nguồn fucoidan lớn nhất, nhưng ở nước ta nguồn
lợi này chưa được khai thác nhiều [5]. Phương pháp trích ly thường sử dụng được tiến hành theo các bước
tiền xử lý khác nhau, sử dụng dung môi cho quá trình trích ly, kết tủa, và sắc ký để tinh sạch fucoidan có
trong dịch trích. Tiền xử lý là cần thiết để loại bỏ chất diệp lục, mannitol, muối và các hợp chất nhỏ khác.
Hệ MeOH-CHCl3-H2O với tỉ lệ (4:2:1) [6] hoặc ethanol 80-85% là hai phương pháp thường được sử dụng
xử lý nguyên liệu trước khi trích ly [7]. Trích ly bằng dung môi là axit [6] hoặc nước nóng với nhiệt độ 60
−1000C [8] và CaCl2 đôi khi được sử dụng để kết tủa alginate trong quá trình chiết [9]. Theo các nghiên cứu
tách chiết fucoidan bằng dung dịch axit, chẳng hạn như HCl, sẽ cải thiện sản lượng fucoidan [10].
2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
Rong sụn tươi được thu nhận ở khu vực Đầm Môn-Khánh Hòa. Rong sụn thu nhận phải còn tươi, giòn,
1
Đinh Thị Huyền, Nguyễn Văn Nguyên Thịnh, Hoàng Thị Ngọc Nhơn
không bị bệnh. Sau thu hái, được vận chuyển trong ngày đến phòng thí nghiệm, tại đây được rửa sạch và
loại bỏ các tạp chất và đựng trong túi nilon bảo quản ở -50C.
Rong sụn khô, rong sụn muối: Được mua ở công ty Đại Hải Foods địa chỉ 19A Giải Phóng, phường 4,
quận Tân Bình, thành phố Hồ Chí Minh. Rong muối được rửa, loại sạch tạp chất.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Quy trình trích ly fucoidan từ rong sụn
Sơ đồ quá trình trích ly được mô tả như hình 2.1.
Rong nguyên liệu được xay/nghiền trước khi
được ngâm với cồn 80% trong 12 giờ nhằm loại
bỏ lipid và các hợp chất màu. Thực hiện lọc để
loại bỏ phần dịch thu lấy phần bã, bã được sấy ở
50℃ để loại bỏ toàn bộ cồn còn lại trước khi
trích ly fucoidan bằng dung môi. Sau quá trình
trích ly, lọc dịch chiết để thu nhận phần dịch
trong đem kết tủa protein bằng TCA (Axit
Tricloacetic) ở 40C trong 30 phút, ly tâm loại bỏ
tủa và thu dịch trong tiến hành định lượng.
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình trích ly fucoidan từ rong sụn
2.2.2. Khảo sát dạng nguyên liệu rong sụn trích ly fucoidan
Tiến hành cân 1g (tính theo hàm lượng chất khô) rong nguyên liệu, thực hiện trích ly như quy trình
(hình 2.1) để chọn dạng nguyên liệu thích hợp (rong tươi, rong muối, rong khô) và khoảng hàm ẩm của
nguyên liệu thích hợp cho quá trình trích ly fucoidan.
2.2.3. Khảo sát sự ảnh hưởng của dung môi đến quá trình trích ly fucoidan từ rong sụn
Cân 1 g mẫu rong nguyên liệu (kết quả mục 2.2.2), thực hiện trích ly fucoidan theo quy trình (hình 2.1)
với các dung môi được khảo sát: BaCl2, HCl 1M, nước cất hai lần. Sau khi chọn được dung môi thích hợp,
tiến hành khảo sát tỉ lệ nguyên liệu/dung môi (1/10, 1/20, 1/30, 1/40, 1/50, 1/60).
2.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian đến quá trình trích ly fucoidan từ rong sụn
Cân 1 g mẫu rong nguyên liệu (kết quả mục 2.2.2), thực hiện theo quy trình (hình 2.1) với loại dung
môi và tỉ lên nguyên liệu/dung môi (kết quả mục 2.2.3) trong các khoảng nhiệt độ được khảo sát (500C,
600C, 700C, 800C, 900C) và thời gian được khảo sát (1 giờ, 2 giờ, 3 giờ, 4 giờ và 5 giờ).
2.2.5. Tối ưu điều kiện trích ly fucoidan từ rong sụn
2
Nghiên cứu điều kiện trích ly tối ưu fucoidan từ rong sụn
Phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) được sử dụng để nghiên cứu sự ảnh hưởng của các điền kiện trích
ly thu nhận fucoidan. Mô hình tối ưu CCRD với 3 yếu tố (tỉ lệ nguyên liệu/dung môi, nhiệt độ và thời gian)
và 5 mức (±α, 0, ±1).
2.3. Phương pháp phân tích
Phương pháp xác định hàm lượng fucoidan bằng quang phổ
+ Thiết lập đường chuẩn: Chất chuẩn là fucoidan được sử dụng để xây dựng đường chuẩn với nồng độ
từ 10-100 μg/ml. Thêm 1ml dung dịch ở mỗi nồng độ vào các ống nghiệm. Các ống nghiệm được làm lạnh
ở nhiệt độ 40C (trong 2-3 phút). Thêm 4.5 ml axit sunfuric (85%). Các ống nghiệm được đậy nắp kín để
tránh bốc hơi và các ống được đặt trong bồn nước sôi, trong thời gian 10 phút. Các ống sau đó được làm
nguội dưới vòi nước, sau đó thêm 0.3 ml axit cysteine hydrochloric 0.1% vào ống nghiệm. Các ống nghiệm
được đặt trong bóng tối trong 2 giờ, sau đó đo độ hấp thụ trên quang phổ kế ở 390 nm và 430 nm. Mẫu trắng
được chuẩn bị bằng phương pháp tương tự.
+ Xác định hàm lượng fucoidan: Được thực hiện theo phương pháp lập đường chuẩn, thay chất chuẩn
bằng mẫu thí nghiệm.
2.4. Phương pháp xử lý số liệu
Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần, kết quả được xử lý với phần mềm Microsoft Excel 2013, sự khác
biệt và chọn các thông số phù hợp dựa trên kết quả phân tích của phần mềm IBM SPSS Statistics 20. Kết
quả được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± sai số. Xử lý số liệu tối ưu bằng JMP 10.
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Ảnh hưởng của dạng nguyên liệu và độ ẩm nguyên liệu đến trích ly fucoidan
Ảnh hưởng của dạng nguyên liệu đến hàm lượng fucoidan trích ly được thể hiện trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của dạng nguyên liệu
Lượng fucoidan trích ly được từ trong rong tươi (26.72 µg/ml) cao hơn trong rong muối (19.74µg/ml)
và rong khô (12.85 µg/ml). Vì vậy, rong tươi được chọn làm nguyên liệu cho quy trình trích ly fucoidan.
Ngoài ra, ở các mức hàm ẩm khác khau như 82.47% (rong tươi), 47.34% (rong sấy chưa hết ẩm) và 9.80%
(rong sấy khô) thì hàm lượng fucoidan thu được có sự khác nhau không đáng kể (bảng 3.1). Trong rong tươi
có các loài vi sinh vật khác nhau có thể hủy keo rong, vi sinh vật sẽ thâm nhập vào cây rong (khi rong chết)
để phá hủy tế bào của nó và phân hủy các hợp chất polysaccharide. Quá trình sấy làm giảm độ ẩm của
nguyên liệu, thuận lợi cho quá trình bảo quản. Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu cho rằng hàm lượng fucoidan
trong rong còn phụ thuộc vào thời gian thu hoạch [11, 12] nên trong nghiên cứu này, rong tươi được thu
hoạch với lượng lớn, sấy khô, bảo quản và được dùng trong suốt quá trình nghiên cứu.
Dạng nguyên liệu
Hàm lượng fucoidan (µg/ml)
Độ ẩm rong
Hàm lượng fucoidan (µg/ml)
Tươi
26.72 ± 0.48
82.49%
26.72 ± 0.48
Muối
19.74 ± 0.47
47.34%
26.45 ± 0.56
Khô
12.85 ± 0.40
9.80%
27.17 ± 0.35
3
Đinh Thị Huyền, Nguyễn Văn Nguyên Thịnh, Hoàng Thị Ngọc Nhơn
3.2. Ảnh hưởng của dung môi đến quá trình trích ly fucoidan từ rong sụn
Việc lựa chọn dung môi thích hợp để trích fucoidan rất quan trọng vì chúng đảm bảo rằng fucoidan
không bị biến tính. Theo các nghiên cứu trước đó [13-16] ba dung môi HCl 1M, BaCl2 và nước cất hai lần
được chọn để khảo sát trích ly cho kết quả được thể hiện ở hình 3.1.
(a) (b)
Hình 3.1. Ảnh hưởng loại dung môi (a), tỉ lệ dung môi (b) đến khả năng trích ly fucoidan
Hàm lượng fucoidan khi trích bằng HCl 1M (37.58µg/ml) cao hơn so với nước cất (26.99 µg/ml) và
BaCl2 (12.76 µg/ml). HCl có khả năng tách các chất trong dịch trích tốt, cải thiện được hiệu suất trích ly
fucoidan. Mặt khác trích ly fucoidan trong HCl nồng độ thấp ổn định hơn trong các dung môi khác, đảm
bảo tính toàn vẹn của cấu trúc fucoidan. Ngoài ra, khi sử dụng dung môi là nước ở nhiệt độ cao carragenan
cùng được trích ra tạo độ nhớt gây cản trở cho các quá trình phía sau. Như vậy, trong thí nghiệm này, HCl
được chọn làm dung môi trích ly sử dụng cho các thí nghiệm sau. Kết quả này tương tự với một số quy trình
đã được công bố như của tác giả [17].
Từ hình 3.1b cho thấy, ở giai đoạn đầu khi tăng thể tích dung môi trích thì lượng fucoidan trích được
tăng. Do khi sử dụng càng nhiều dung môi thì khả năng hòa tan của fucoidan vào dung môi càng lớn, dung
môi dễ dàng thẩm thấu vào nguyên liệu và hòa tan các cấu tử cần trích ly, tăng lượng dung môi làm tăng sự
chênh lệch nồng độ chất khô giúp quá trình khuếch tán hợp chất trong rong vào dung môi trích diễn ra dễ
dàng hơn. Tuy nhiên, ở một giới hạn nhất định nếu tăng lượng dung môi thì cấu tử cần hòa tan có thể tăng
nhưng không có ý nghĩa về mặt thống kê mà còn làm hao phí dung môi, đồng thời các cấu tử không mong
muốn như carrageenan sẽ hòa tan vào dịch chiết gây nhớt dịch chiết, cản trở quá trình tiếp theo. Như vậy,
trong thí nghiệm này, tỉ lệ nguyên liệu/dung môi được chọn là 1/40 (w/v).
3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến quá trình trích ly fucoidan từ rong sụn
(a) (b)
Hình 3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ (a) và thời gian (b) trích ly đến hàm lượng fucoidan
37.58
12.76
26.99
0
10
20
30
40
HCL 1M BaCl2 H20
Hàm lượng fucoidan
(µg/ml)
Loại dung môi
1/10 1/20 1/30 1/40 1/50 1/60
31.12 35.60 37.22 39.43
32.85
0
20
40
60
50 60 70 80 90
Hàm lượng fucoidan
(µg/ml)
Nhiệt độ (⁰C )
32.04
38.21 40.51 40.96 41.27
0
20
40
60
1 2 3 4 5
Hàm lượng fucoidan
(µg/ml)
Thời gian (giờ)
4
Nghiên cứu điều kiện trích ly tối ưu fucoidan từ rong sụn
Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian trích ly fucoidan từ rong sụn được thể hiện trong hình 3.2. Ở biểu
đồ 3.2a cho thấy hàm lượng fucoidan tăng dần khi tăng nhiệt độ từ 500C (33.12 µg/ml), đến và đạt cao nhất
ở 800C (39.42 µg/ml), bắt đầu giảm ở 900C (32.85 µg/ml). Khi tăng nhiệt độ sẽ thúc đẩy các quá trình trích
ly diễn ra nhanh hơn, cấu tử fucoidan được trích ra trong dịch trích tốt hơn. Tuy nhiên, khi nhiệt độ tăng lên
cao (từ 900C) thì carrageenan, agar có trong rong sụn bắt đầu được trích ly [18, 19], do tính chất nhớt cao
của hợp chất này nên cản trở việc hòa tan fucoidan vào trong dung dịch. Mặt khác, nhiệt độ cao sẽ thúc đẩy
các biến đổi hóa học của các thành phần trong nguyên liệu, ảnh hưởng tới chất lượng của fucoidan và độ
nhớt cao cũng gây nhiều khó khăn cho các công đoạn tinh sạch sau này.
Kết quả từ biểu đồ 3.2b cho thấy thời gian càng tăng thì lượng fucoidan thu được càng nhiều. Từ giờ
trích ly thứ 3, lượng fucoidan trích được có tăng nhưng rất chậm. Điều này là do thời gian trích ly càng dài,
sản phẩm thu nhận được càng tăng, nhưng khi đạt đến gần ngưỡng hiệu suất trích ly thì dù tăng thời gian,
lượng sản phẩm thu được tăng thêm không đáng kể mà còn tăng khả năng trích ly các hợp chất không mong
muốn khác có trong rong (như chất keo) làm cản trở quá trình lọc sau này, tiêu tốn năng lượng, thời gian
không cần thiết. Như vậy, nhiệt độ và thời gian thích hợp của quá trình trích ly fucoidan từ rong sụn là 800C
và 3 giờ.
3.4. Tối ưu quá trình trích ly fucoidan từ rong sụn
Qua quá trình khảo sát đơn yếu tố nhận thấy nồng độ dung môi, thời gian, nhiệt độ là ba yếu tố có ảnh
hưởng lớn đến hàm lượng fucoidan trong dịch trích, vì vậy tiến hành tối ưu 3 yếu tố trên. Kết quả của hàm
lượng fucoidan thu được từ các điều kiện tối ưu khác nhau: X1 (Nồng độ dung môi), X2 (Nhiệt độ), X3 (Thời
gian) được trình bày ở bảng mô hình hóa theo mô hình tâm phức hợp CCRD (bảng 3.2).
Bảng 3.2. Kết quả mô hình tối ưu hóa quá trình trích ly fucoidan
Thí
nghiệm
Biến chuẩn
Hàm lượng
fucoidan
(µg/ml)
Thí
nghiệm
Biến chuẩn
Hàm lượng
fucoidan
(µg/ml)
X1
X2
X3
X1
X2
X3
1
-1
-1
-1
25.61
11
0
-1.68
0
35.43
2
-1
-1
1
30.21
12
0
1.68
0
42.47
3
-1
1
-1
35.67
13
0
0
-1.68
36.78
4
-1
1
1
38.09
14
0
0
1.68
42.56
5
1
-1
-1
35.83
15
0
0
0
46.23
6
1
-1
1
38.71
16
0
0
0
45.41
7
1
1
-1
37.42
17
0
0
0
42.35
8
1
1
1
49.19
18
0
0
0
47.28
9
-1.68
0
0
40.46
19
0
0
0
42.46
10
1.68
0
0
43.57
20
0
0
0
47.62
Phân tích phương sai ANOVA được dùng để đánh giá mức độ phù hợp của mô hình tuyến tính, phần
5