Vietnam J. Agri. Sci. 2025, Vol. 23, No. 4: 431-441
Tp cKhoa hc Nông nghip Vit Nam 2025, 23(4): 431-441
www.vnua.edu.vn
431
PHÂN LP VÀ TUYN CHN CÁC CHNG VI KHUN LACTIC
CÓ KH NĂNG ĐỐI KHÁNG VI MT S VI KHUN GÂY BNH THƯỜNG GP TRÊN VT NUÔI
Nguyễn Văn Thắng, Phm Thu Linh, Hoàng Minh Đức,
Trn Th Khánh Hoà, Nguyn Th Lan, Cam Th Thu Hà, Hoàng Minh Sơn*
Khoa Thú y, Hc vin Nông nghip Vit Nam
*Tác gi liên h: hson@vnua.edu.vn
Ngày nhn bài: 24.11.2024 Ngày chp nhận đăng: 18.04.2025
TÓM TT
Probiotic là gii pháp thay thế kháng sinh tiềm năng để ci thiện năng suất và kim soát các bnh truyn nhim
trên vt nuôi. Nghiên cứu được thc hin nhm mục đích phân lp các chng vi khun lactic (LAB) kh năng đi
kháng mnh vi mt s vi khun gây bnh ph biến trong chăn nuôi. Tng cng 33 chủng LAB đã đưc phân lp t
100 mu rut rut ln. Trong đó, 5 chng phân lp th hin hoạt tính đối kháng mnh nht vi 5 mm bnh
đưc kim tra (S. Typhimurium, S. Gallinarum, E. coli K88, S. aureus C. perfringens) được xác định thuc các loài
Pediococcus pentosaceus, Levilactobacillus brevis, Lactiplantibacillus plantarum da trên k thut khi ph MALDI
TOF. c chủng LAB được la chn không gây dung huyết, không sn sinh enzyme DNase, tính đ kháng cao
vi acid mui mt. T l t kết dính ca các chng LAB phân lập đều trên 40% mức độ đồng kết dính ca
chúng vi các mm bệnh dao động trong khong 24,39% đến 45,17%. Đc bit, tt c các chng LAB phân lập đều
được xác định là các chủng đa kháng, với t l kháng cao nht đối vi ampicillin, erythromycin tetracycline. Nhìn
chung, 5 chủng LAB được tuyn chn trong nghiên cu này nhng chng tiềm năng để sn xut chế phm sinh
hc phòng bnh cho vt nuôi.
T khóa: Vi khuẩn lactic, đối kháng, prebiotic, mm bnh.
Isolation and Selection of Lactic Acid Bacteria Antagonistic
to Common Pathogenic Bacteria in Livestock
ABSTRACT
Probiotics are known as a promising alternative to antibiotics in improving productivity and controlling infectious
diseases in livestock. The study was conducted to isolate lactic acid bacteria (LAB) with strong antagonism against
some common pathogenic bacteria in livestock. A total of 33 LAB strains were isolated from 100 chicken and pig
intestine samples. Among them, 5 isolates showing strong antagonistic activity against 5 pathogenic bacteria tested
(S. Typhimurium, S. Gallinarum, E. coli K88, S. aureus, and C. perfringens) were identified as Pediococcus
pentosaceus, Levilactobacillus brevis, Lactiplantibacillus plantarum using MALDI TOF. The LAB isolates in this study
were non-hemolytic, negative for DNase production, and highly resistant to acid and bile salt. The auto-aggregation
rates of the LAB isolates were all over 40% and the rates of co-aggregation of them to the pathogens ranged from
24.39% to 45.17%. In particular, all LAB isolates were determined as multi-resistant with the highest resistant rates to
ampicillin, erythromycin, and tetracycline. Overall, the 5 selected LAB isolates are potential strains for the production
of probiotics for preventing diseases of home animals.
Keywords: Lactic acid bacteria, antagonism, probiotics, pathogens.
1. ĐT VN Đ
Kháng sinh được s dụng thường xuyên
trong chën nuôi với mục đích kích thích sinh
trưởng phòng bnh dén đến s gia tëng vi
khuèn kháng kháng sinh, täo ra thách thc ln
đối với ngành chën nuôi (Malik & cs., 2023).
Trong đò, các loäi vi khuèn gây bnh ph biến
Phân lp và tuyn chn các chng vi khun lactic có kh năng đối kháng vi mt s vi khun gây bnh thường gp
trên vt nuôi
432
trên vêt nuôi như Salmonella Typhimurium,
Salmonella Gallinarum, Escherichia coli K88,
Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens
dæn tr n đa kháng, dén đến tình träng khó
khën trong việc la chọn kháng sinh điều trð
gây thit häi kinh tế đáng kể (Xu & cs., 2022).
Bên cänh đò, các quy đðnh nhìm hän chế s
dụng kháng sinh trong chën nuôi đã đưc
ban hành thc hin nhiu quc gia
(García-Vela & cs., 2023). Chính vì vêy, vic tìm
kiếm giâi pháp thay thế kháng sinh phòng bnh
trên vêt nuôi đang được quan tâm trong bi
cânh hin nay.
S dng chế phèm sinh hc thay thế kháng
sinh nhìm tëng nëng suçt kim soát mæm
bệnh đang xu hướng ca nền chën nuôi hiện
đäi (Arsène & cs., 2021). Trong đò, nhòm
probiotic ph biến nhçt vi khuèn lactic
(Lactic acid bacteria - LAB), thuc h vi sinh
vêt đường tiêu hòa thường đưc ng dng
trong sân xuçt chế phèm sinh học. LAB đäi din
cho nhóm vi khuèn Gram dương, không sinh
bào t, sân phèm chính của quá trình trao đổi
chçt là acid lactic. Tùy thuc vào chi loài, vi
khuèn lactic lên men đường chî täo ra acid lactic
hoc acid lactic và các chçt khác (Jackson,
2014). Bên cänh đò, LAB còn sân xuçt
bacteriocin (peptide kháng khuèn) tác dng
c chế nhiu mæm bnh. Các chi ca LAB ph
biến nhçt bao gm Lactobacillus, Pediococcus...,
phæn lớn được công nhên an toàn thường
xuyên được tìm thçy trong đường tiêu a ca
động vêt (Mozzi, 2016). Các nghiên cứu trước
đåy đã cho thçy đc tính probiotic ca các chng
LAB phân lêp t rut gà ln. Nghiên cu ca
Balasingham & cs. (2017) cho rìng các chng
LAB phân lêp t rut ln khâ nëng thích
nghi tốt trong điu kiện đường tiêu a, tëng
ng sức đề kháng và sinh trưng đàn lợn.
Theo Li & cs. (2024), trong s 44 chng LAB
phân lêp t rut thì 3 chng th hin hoät
tính đối kháng mänh vi S. aureus, Listeria
monocytogenes, E. coli Salmonella cholerae;
đưc chng minh ng c viên probiotic đæy
ha hn s dng làm ph gia thức ën để tëng
nëng suçt kim soát mæm bnh gia cæm.
LAB đòng vai trñ kim soát mæm bnh câi
thin sc khóe đường rut vêt nuôi. Do đò,
LAB được coi là chng tim nëng trong n xuçt
chế phèm sinh hc, đòng gòp tích cực vào s
phát trin của ngành chën nuôi. Mc dù vêy, täi
Vit Nam có rçt ít nghiên cu v khâ nëng kim
soát các mæm bnh ca LAB trên vêt nuôi.
Xuçt phát t thc tin trên, nghiên cu
đưc tiến hành vi mục đích phån lêp và tuyn
chn các chng LAB t rut rut ln
khâ nëng đối kháng vi mæm bnh nhìm ng
dng trong sân xuçt chế phèm sinh hc thay thế
kháng sinh phñng và điu trð bnh cho vêt nuôi.
2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CU
2.1. Vt liu
- Méu nghiên cu: 50 méu rut gà 50
méu rut ln thu thêp täi các ch thuc huyn
Gia Lâm, Hà Ni.
- Môi trường, hóa chçt: De Man-Rogosa-
Sharpe (MRS) agar, MRS broth, Blood agar,
Deoxyribonuclease (DNase) agar, Mueller
Hinton Broth (MHB), Mueller Hinton agar
(MHA), Brain Heart Infusion (BHI) broth,
Tryptose Sulfite Cycloserine (TSC) agar, Bt
agar, thuc nhum Gram, mui mêt, NaOH,
HCl, H2O2, kháng sinh bt.
- Các chng vi khuèn: S. Typhimurium,
S. Gallinarum, E. coli K88, S. aureus,
C. perfringens đã đưc phân lêp và gi ging täi
phòng nghiên cu.
- Đða điểm: Méu được phân tích täi Phòng
Nghiên cu Vi sinh vêt Thú y, Trung tâm
Nghiên cu Xuçt síc và Đi mi sáng täo, Hc
vin Nông nghip Vit Nam.
- Thi gian: T tháng 1 đến tháng 9
nëm 2024.
2.2. Phương pháp nghiên cu
2.2.1. Thu thp mu
Các méu rut (phæn ruột non) được thu
thêp theo TCVN 5522:1991. C th, 50 méu
rut 50 méu rut ln đưc thu thêp ngéu
nhiên täi các ch thuc huyn Gia Lâm, Ni.
Méu được đng trong túi chuyên dng trùng,
Nguyễn Văn Thắng, Phm Thu Linh, Hoàng Minh Đức,
Trn Th Khánh Hoà, Nguyn Th Lan, Cam Th Thu Hà, Hoàng Minh Sơn
433
bâo quân länh được vên chuyn v phòng thí
nghiệm để tiến hành phân tích trong vòng 24h.
2.2.2. Phân lp vi khun lactic
Méu rut (25g) được đồng nhçt vi canh
thang MRS (225ml) bìng máy dêp méu vi tc
độ 230rpm trong 2 phút ria cçy lên môi
trường thäch MRS, 37C trong 24-48h.
Khuèn läc điển hình ca LAB trên thäch MRS
hình thái tròn, gn, màu tríng sa hoc màu
kem đưc la chọn để nhum Gram kim tra
đặc tính sinh hóa. Các chng hình thái
khuèn läc điển hình trên thäch MRS, Gram
dương, tế bào hình gêy hoc hình cæu, không
sinh bào tử, catalase åm tính được coi LAB
giâ đðnh, sau đò đưc bâo quân trong glycerol
20% -70C.
2.2.3. Đánh giá kh năng đối kháng
ca LAB
Hoät tính kháng khuèn của LAB được xác
đðnh bìng phương pháp khuếch tán giếng thäch
da trên tâ ca Kumar & Kumar (2015)
hiu chînh: canh khuèn LAB đưc ly tâm
(6.000 × g, 4C, 20 phút) lc qua màng lc
0,22µm đ thu dðch ni không tế bào (cell free
supernatant - CFS). Mt phæn dðch CFS được
trung hña đến pH 6,5 bìng dung dðch NaOH
0,1N (nCFS). Canh khuèn ca S. Typhimurium,
S. Gallinarum, E. coli K88, S. aureus
(107 CFU/ml) đưc trn vi thäch mm BHI
0,8% agar đổ đu lên b mặt đïa thäch MHA.
Đối vi canh khuèn C. perfringens (107 CFU/ml)
s dng 2 lp thäch TSC đ đâm bâo điều kin
yếm khí. Sau 6h 37C, tiến hành đc các ô
giếng vi đường kính 5mm trên b mặt đïa
thäch đ nhó dðch ni CFS nCFS
(50 µl/giếng) ca các chủng LAB. Đïa đưc gi
länh 4C trong 2-3h đ các hoät chçt khuếch
tán vào thäch, sau đò 37C trong 18h. Mc
độ đối kháng ca LAB vi mæm bệnh được phân
loäi dựa trên kích thước đường kính vòng
khuèn: 6-8mm (+), 10-12mm (++), > 12mm
(+++) hoc không täo vòng vô khuèn (-). Các
chng khâ nëng đối kháng mänh vi 5 loäi
mæm bệnh đưc la chn đðnh danh bìng k
thuêt khi ph MALDI TOF.
2.2.4. Kim tra mc độ an toàn ca LAB
Tính an toàn ca các chng LAB được đánh
giá thông qua khâ nëng gåy dung huyết sân
sinh enzyme Dnase theo phương pháp tâ bi
Bazireh & cs. (2020) Shuhadha & cs. (2017).
Các chủng LAB được ria cçy lên thäch máu
(cha 5% hng cæu cu) thäch DNase,
37C trong 24h. Kết quâ được xác đðnh da trên
s xuçt hin quæng hoc không xuçt hin quæng
xung quanh khuèn läc tương ng vi đặc tính
gây dung huyết (α-hemolysis, β-hemolysis) hoc
không gây dung huyết (-hemolysis) ca LAB.
Kết quâ dương tính vi DNase khi quan sát
thçy vùng màu hng nhät hoc trong sut xung
quanh khuèn läc.
2.2.5. Đánh giá tính ổn định ca LAB
Tính ổn đðnh ca các chủng LAB được đánh
giá thông qua khâ nëng tồn täi trong môi trường
b sung mui mêt acid theo phương pháp
tâ bi Ramos & cs. (2013): cçy chuyn canh
khuèn LAB læn lượt vào các ng cha i
trường Phosphate Buffered Saline (PBS) b
sung mui mêt 0,3% PBS được điều chînh
đến giá trð pH 3,0. Tiến hành đðnh lượng LAB có
trong hn dðch trước sau khi 3h trên thäch
MRS. T l sng sót ca trong môi trường mui
mêt và pH được xác đðnh như sau:
T l sng sót (%) = (S ng LAB sau khi
3h/S ợng LAB trưc khi ) × 100.
2.2.6. Đánh giá khả năng kết dính ca LAB
Khâ nëng tự kết dính đồng kết dính ca
các chủng LAB được đánh giá phương pháp
tâ bi Yadav & cs. (2016) thông qua gtrð OD
(Optical Density) ca canh khuèn bìng máy
quang ph đðnh lượng vi khuèn IMPLEN
OD600 DiluPhotomete.
Phương pháp đánh giá khâ nëng tự kết
dính: Canh khuèn LAB được ly tâm (6.000 ×g,
4C, 20 phút) bó dðch ni gi läi các tế bào vi
khuèn, sau đò được ra tái huyn phù trong
môi trường đệm PBS, điều chînh đến OD600 = 0,5
(OD ban đæu). Sau 1h 37C, 1ml dðch ni
phía trên được đo giá trð OD600 (OD cui).
Phương pháp đánh giá khâ nëng đồng kết
dính: Canh khuèn ca vi khuèn gây bnh được
ly tâm bó dðch ni, ra tái huyn phù vi
Phân lp và tuyn chn các chng vi khun lactic có kh năng đối kháng vi mt s vi khun gây bnh thường gp
trên vt nuôi
434
dung dðch đệm PBS, điều chînh đến OD600 = 0,5
(OD ban đæu). Đồng nhçt huyn phù ca các
chng LAB (1ml) huyn phù vi khuèn gây
bnh (1ml) vi t l 1:1 và 37C trong 1h.
Sau , 1ml dðch nổi phía trên được đo giá trð
OD600 (OD cui).
T l tế bào kết dính (%) = [(OD ban đæu
OD cuối)/OD ban đæu] × 100.
2.2.7. Kim tra tính mn cm vi kháng
sinh ca LAB
Tính mén câm vi kháng sinh ca LAB
được xác đðnh bìng phương pháp pha loãng
trong canh thang da trên s phát trin ca vi
khuèn trong i trưng MHB cha kháng
sinh các nồng độ khác nhau. Các kháng sinh
đưc la chn (ampicillin, kanamycin,
gentamicin, erythromycin, clindamycin,
tetracycline, chloramphenicol) giá trð đim
nhäy câm gii hän ca vi khuèn lactic theo
ng dén của quan An toàn thực phèm
châu Âu EFSA (2018).
2.2.8. X lý s liu
S liu đưc x bìng kiểm đðnh t trong
phæn mm Microsoft Excel 2021 đ đánh gsự
sai khác gia các giá trð. Giá trð P <0,05 được coi
là s khác biệt cò ý nghïa thống kê.
3. KT QU THO LUN
3.1. Kết qu phân lp vi khun lactic
Tng cng 33 chng vi khuèn lactic được
phân lêp t 100 méu ruột, trong đò 18 chng t
rut ln 15 chng t ruột gà. Để tránh trùng
lp, vi mt méu dương tính chî gi ging mt
chng LAB. Tçt câ các chng LAB phân lêp
đưc hình thái khuèn läc đặc trưng trên
thäch MRS (Hình 1), Gram dương, hình cæu
hoc gêy (Hình 2) và âm tính vi catalase
(Hình 3). Kết quâ nghiên cứu đã chứng minh
rut ln rut th ngun cha vi
khuèn lactic tiềm nëng.
3.2. Kh năng đối kháng ca các chng
LAB phân lập được vi vi khun gây bnh
Kết quâ ghi nhên 5/33 chng LAB phân lêp
đưc hoät tính kháng khuèn mänh vi 5
chng vi khuèn gây bnh ph biến trong chën
nuôi (S. Typimurium, S. Gallinarum, E. coli
K88, S. aureus, C. perfringens) (Bâng 2). Các
chủng LAB này đu täo vòng khuèn vi
đưng kính lớn hơn 12mm đối vi vi khuèn S.
aureus C. perfringens. Trong khi đò, 2 3
chng LAB täo ra vòng vô khuèn tương ứng vi d
> 12mm d = 10-12mm đối vi vi khuèn S.
Typhimurium. Kết quâ ơng tự đưc ghi nhên
khi kim tra tính đi kháng vi vi khuèn E. coli.
Ngoài ra, 4/5 chng LAB th hiện tính đối
kháng cao vi S. Gallinarum (d > 12mm) 1/5
chng tính đối kháng trung bình vi đường
kính ng khuèn t 10-12mm. Tuy nhiên,
khi dðch nổi CFS được trung hòa pH 6,5
(nCFS), hoät tính đi kháng này giâm đáng kể;
đặc bit vi S. Typhimurium, S. Gallinarum và
E. coli K88. Điều này, cho thçy tác đng kháng
khuèn ràng ca pH, c th acid hữu .
LAB sân xuçt acid hữu làm giâm độ pH
của i trường thông qua quá trình n men,
tác dng c chế s phát trin ca nhiu loài vi
khuèn gây bnh. Acid hữu do LAB tiết ra
thçm qua thành tế bào vi khuèn làm acid hóa tế
bào chçt, giâm pH ni bào phá hy các
enzyme làm gián đoän các chức nëng của tế bào
vi khuèn, do chế này phæn ln vi khuèn
gây bnh không tn täi được trong i trưng
pH acid (Cervantes-Elizarrarás & cs., 2019).
Bên cänh đò, LAB sân xuçt chçt kháng khuèn
khác không phâi acid như bacteriocin giúp tëng
ng c chế s phát trin ca mæm bnh.
Bacteriocin được coi như khí sinh học vi
hoät tính mänh c chế hæu hết vi khuèn
Gram dương, tuy nhiên chî tác động đến mt s
vi khuèn Gram âm (Chen & cs., 2022). vêy,
khâ nëng kháng khuèn vén được duy trì sau khi
dðch CFS được trung hòa, chng minh hoät động
c chế không chî ph thuc vào acid hu cơ/pH
cñn liên quan đến các chçt kháng khuèn
khác như bacteriocin (De Giani & cs., 2019).
Điu này lý giâi dðch ni nCFS ca 5 chng LAB
vén th hin hoät động đi kháng vi vi khuèn
Gram dương (S. aureus và C. perfringen) trong
nghiên cu này. Đặc bit, 3/5 và 1/5 méu nCFS
læn lượt täo vùng c chế với đường kính
10-12mm đối vi S. aureusC. perfringens.
Nguyễn Văn Thắng, Phm Thu Linh, Hoàng Minh Đức,
Trn Th Khánh Hoà, Nguyn Th Lan, Cam Th Thu Hà, Hoàng Minh Sơn
435
Bng 1. Các kháng sinh và giá tr đim nhy cm gii hn (mg/l)
Kháng sinh
Ký hiệu
Pediococcus spp.
L. brevis
L. plantarum
Ampicillin
AMP
4
2
2
Kanamycin
KAN
64
64
64
Gentamicin
GEN
16
16
16
Clindamycin
CLI
1
4
4
Erythromycin
ERY
1
1
1
Tetracycline
TET
8
8
32
Chloramphenicol
CHL
4
4
8
Hình 1. Hình thái khun lc ca LAB phân lp trên thch MRS
Hình 2. Hình thái ca các chng LAB dưới vt kính du 100X
(Vi khuèn Gram dươngt màu tím, hình cæu (A) hoc hình que (B, C))
Hình 3. Phn ng catalase ca vi khun lactic
A
B
C