Thử nghiệm LAL phát hiện Endotoxin (limulus amebocytes lysate)

Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau

THÖÛ NGHIEÄM LAL PHAÙT HIEÄN

ENDOTOXIN (limulus amebocytes lysate)

Muïc tieâu

• Hieåu ñöôïc nguyeân taéc cuûa thöû nghieäm LAL phaùt hieän endotoxin vaø caùc chæ ñònh aùp duïng ñeå

coù theå ñöa vaøo thaønh moät phöông tieän chaån ñoaùn vi sinh laâm saøng giuùp chaån ñoaùn phaùt

• Thöïc hieän ñöôïc xeùt nghieäm LAL vôùi keát quaû chính xaùc khoâng bò aâm tính hay döông tính

hieän nhanh nhieãm truøng trong moät soá tröôøng hôïp caàn thieát.

giaû nhôø bieát ñöôïc caùc ñoøi hoûi ñaëc bieät veà vaät lieäu khi tieán haønh laáy, chöùa beänh phaåm, cuõng

• Laøm ñöôïc thöû nghieäm LAL ñònh tính vaø ñònh löôïng moät caùch chính xaùc, khoâng sô soùt.

nhö khi tieán haønh laøm xeùt nghieäm.

Nguyeân taéc

Endotoxin laø lipopolysaccharide coù nguoàn goác töø vaùch teá baøo cuûa vi khuaån Gram [-], coù

moät tính chaát raát ñaëc tröng laø ly giaûi teá baøo amebocyte tuaàn hoaøn trong maùu con sam

(horseshoes = Limulus polyphemus). Dòch ly giaûi amebocytes seõ bò ñuïc ñi cuõng nhö bò ñoâng

laïi thaønh gel do ñoä nhôùt bò gia taêng, vaø ñoä ñuïc cuõng nhö ñoä ñoâng cöùng seõ tuøy thuoäc vaøo

löôïng endotoxin coù trong maãu thöû. Cô cheá cuûa hieän töôïng naøy thaät ra chöa roõ, coù theå gioáng

nhö hieän töôïng ñoâng maùu ôû ngöôøi trong ñoù coù hai quaù trình xaõy ra: (1) Endotoxin vôùi söï

hieän dieän cuûa ion calcium kích hoaït moät heä thoáng men tieàn ñoâng gioáng trypsin. (2) Heä

thoáng men bò kích hoaït naày seõ laøm bieán ñoåi chaát gaây ñoâng (coagulogen) baèng moät quaù trình

ly giaûi protein coù giôùi haïn ñeå saûn sinh ra caùc protein coù theå ñoâng ñaëc ñöôïc.

Ñeå ñoïc ñöôïc keát quaû cuûa thöû nghieäm LAL, coù theå coù hai phöông phaùp:

1. Phöông phaùp phaùt hieän dung dòch thöû nghieäm bò taêng ñoä nhôùt, keát quaû laø ñoä ñuïc taêng

leân vaø bò ñoâng ñaëc laïi (ñoïc baèng maét thöôøng, hay ñoïc baèng maùy ño ñoä ñuïc)

2. Phöông phaùp sinh maøu döïa treân nguyeân taéc protein bò ly giaûi seõ laøm moät protein khaùc

(coù maõ soá S-2423) trong dung dòch sinh maøu sinh ra maøu, ñoä ñaäm nhaït cuûa maøu seõ tuøy

136

Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau

thuoäc vaøo haøm löôïng endotoxin thöû nghieäm vaø chính nhôø vaäy coù theå ñònh löôïng ñöôïc

endotoxin.

Chæ ñònh aùp duïng

Thöû nghieäm LAL ñöôïc chæ ñònh ñeå phaùt hieän vaø ñònh löôïng endotoxin trong caùc maãu dòch

truyeàn hay thuoác tieâm trong saûn xuaát döôïc phaåm vì coù ñoä nhaïy cao hôn thöû nghieäm phaùt

hieän chí nhieät toá thöïc hieän treân thoû.

Thöû nghieäm LAL cuõng coù theå aùp duïng taïi caùc phoøng thí nghieäm vi sinh laâm saøng ñeå phaùt

hieän moät caùch giaùn tieáp nhieãm truøng vi khuaån Gram [-] trong caùc dòch khoâng taïp nhieãm cuûa

cô theå nhö : Dòch naõo tuyû, dòch maøng phoåi, dòch maät, dòch oå buïng. Phöông phaùp coù lôïi ñieåm

laø coù keát quaû nhanh chæ vaøi giôø sau khi göûi maãi ñi laøm xeùt nghieäm. Tuy nhieân phöông phaùp

naøy khoâng theå thay theá nuoâi caáy vì khoâng cho bieát vi khuaån gaây nhieãm truøng laø vi khuaån gì,

vaø khoâng theå cho bieát ñöôïc keát quaû khaùng sinh ñoà.

Ñeå coù theå coù keát quûa khoâng bò döông tính giaû vì maãu bò taïp nhieãm endotoxin trong laáy vaø

chöùa maãu, caùc vaät lieäu duøng ñeå laáy vaø chöùa maãu phaûi thaät söï tinh saïch vaø khoâng coù

endotoxin. Toát nhaát laø duøng caùc vaät lieäu baèng nhöïa polystyrene voâ truøng baèng gamma ñeå

chöùa maãu (loï voâ truøng naép ñoû cuûa coâng ty Nam Khoa), vaø laáy maãu baèng oáng chích thuyû tinh

voâ truøng (ñaõ xöû lyù nhö höôùng daãn ôû muïc tieáp theo). Ñeå keát quaû khoâng bò aâm tính giaû thì caùc

vaät lieäu ñeå laáy vaø chöùa maãu cuõng khoâng coù ñaëc tính haáp phuï endotoxin, nghóa laø chuùng ta

phaûi traùnh duøng caùc vaät lieäu baèng nhöïa polypropylene (nhöïa PP).

Chuaån bò vaät lieäu

Vaät lieäu thuûy tinh

Toát nhaát laø neân duøng caùc vaät lieäu thuûy tinh môùi. Vôùi caùc vaät lieäu thuûy tinh môùi, caàn boïc

giaáy nhoâm roài haáp khöû truøng 121oC trong 1 giôø, sau ñoù saáy khoâ 175oC trong 3 giôø.

Vôùi caùc vaät lieäu thuûy tinh ñaõ duøng roài, caàn phaûi ngaâm trong dung dòch 1% taåy kieàm, vd

dung dòch 1% E-TOXA-CLEAN (cid:226) cuûa Sigma (Catalog No. 210-3), thôøi gian ngaâm toát nhaát

laø qua ñeâm. Khi ngaâm coù theå duøng choåi ñeå chaø saïch. Sau khi ngaâm röûa 8-10 laàn döôùi voøi

nöôùc noùng ñang chaûy, sau ñoù röûa 5 laàn döôùi voøi nöôùc caát hay nöôùc khöû ion. Cuoái cuøng traùng

laïi moät laàn vôùi nöôùc ñaõ khöû endotoxin. Saáy khoâ duïng cuï trong tuû saáy, sau ñoù boïc giaáy nhoâm

roài khöû truøng gioáng nhö treân.

137

Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau

Vaät lieäu nhöïa

Chæ duøng caùc vaät lieäu nhöïa voâ truøng, khoâng nhieãm endotoxin ñeå pha caùc thuoác thöû. Chæ

duøng moät laàn, khoâng duøng laïi. ÔÛ ñaây chuùng toâi khuyeân duøng caùc pipette Pasteur nhöïa voâ

truøng, caùc ñaàu type nhöïa voâ truøng duøng trong caùc phoøng thí nghieäm thao taùc voâ truøng.

Rieâng vaät lieäu duøng pha gam chuaån endotoxin hay pha beänh phaåm thì caàn phaûi baèng

polystyrene chöù khoâng theå baèng polypropylene vì polypropylene haáp phuï ñöôïc endotoxin.

ÔÛ ñaây chuùng toâi khuyeân duøng caùc pipette voâ truøng coù chia ñoä, baèng polystyrene, voâ truøng

(loaïi ñoùng goùi rieâng leõ, duøng moät laàn ).

Tieán haønh thöû nghieäm

ÔÛ ñaây trình baøy phöông phaùp thöû nghieäm duøng thuoác thöû E-toxate cuûa Sigma. Phöông phaùp

naøy coù theå duøng vôùi soá löôïng maãu nhoû.

Pha gam endotoxin chuaån

Duøng micropipette vôùi tip voâ truøng vaø khoâng nhieãm endotoxin huùt moät theå tích nöôùc caát

khoâng nhieãm endotoxin (Sigma, catalog No 210-7) cho vaøo chai chöùa endotoxin ñoâng khoâ

(Sigma, catalog No 210-SE) ñeå ñaït noàng ñoä endotoxin 4000 EU/ml (n. ộ gốc). Vortex ñeå

troän ñeàu trong voøng ít nhaát 2 phuùt. Sau ñoù vortex theâm 3 laàn trong voøng 30 phuùt (moãi laàn

30 giaây, nghó 10 phuùt). Sau khi ñaõ pha, dung dòch endotoxin chuaån naày ñöôïc giöõ trong tuû

laïnh, beàn hôn 2 tuaàn neáu khoâng bò taïp nhieãm. Traùnh giöõ trong tuû ñoâng . Moãi laàn duøng thì

phaûi vortex troän ñeàu nhö treân.

Pha gam endotoxin chuaån trong tube polystyrene voâ truøng, khoâng nhieãm endotoxin, vaø coù

naép ñaäy. Neáu khoâng coù tube polystyrene thì phaûi duøng caùc tube thuûy tinh ñaõ khöû truøng vaø

khöû endotoxin. Pha nhö trình baøy trong baûng 6.

Cöù moãi ñoä pha loaõng, caàn phaûi vortex khoaûng 30-60 giaây tröôùc khi pha moät ñoä pha loaõng

keá. Baát cöù moät ñoä pha loaõng naøo neáu ñeå laâu quaù 30 phuùt thì phaûi vortex trôû laïi nhö treân

tröôùc khi duøng. Endotoxin vôùi noàng ñoä töø 400 EU/ml trôû leân thì coù theå beàn ñeán hôn 1 tuaàn

neáu giöõ trong tuû laïnh (khoâng giöõ ñoâng ñaù).

138

Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau

Baûng 6: Caùch pha dung dòch endotoxin chuaån

Nồng ñộ Ống số Theå tích dung dòch Endotoxin ñöôïc laáy Nöôùckhoâng

endotoxin endotoxin

1 0.2 ml n. ộ gốc 1.8 ml 400 EU

2 0.2 ml töø oáng 1 1.8 ml 40 EU

2 0.2 ml töø oáng 2 1.8 ml 4 EU

2 0.3 ml töø oáng 3 2.1 ml 0.5 EU

2 1 ml töø oáng 4 1 ml 0.25 EU

2 1 ml töø oáng 5 1 ml 0.125 EU

2 1 ml töø oáng 6 1 ml 0.06 EU

2 1 ml töø oáng 7 1 ml 0.03 EU

3 1 ml töø oáng 8 1 ml 0.015 EU

Tieán haønh thöû nghieäm

Tröôùc heát moãi maãu thöû nghieäm phaûi ñöôïc chænh pH ñaït töø 6-8 (thích hôïp nhaát laø 6.8 ñeán

7.5). Chænh pH vôùi dung dòch HCl 0.1M khoâng laãn endotoxin, vaø duøng giaáy thöû pH chöù

khoâng duøng pH keá.

Voå nheï chai chöùa E-TOXATE (Sigma, catalog No 210-20) xuoáng maët baøn ñeå E-TOXATE

khoâng dính treân naép cao su. Duøng micropipette vôùi tip voâ truøng vaø khoâng nhieãm endotoxin

huùt 2 ml nöôùc caát khoâng nhieãm endotoxin cho vaøo chai. Khoâng ñöôïc laéc maïnh, chæ laên troøn

chai ñeå hoøa tan. Ngay sau khi hoøa tan, cho loï vaøo trong ñaù baøo. Phaân phoái vaøo caùc tube

thuûy tinh voâ truøng ñaõ khöû endotoxin vaø coù ñaäy mieäng tube baèng giaáy nhoâm, moãi tube 0.1

ml. Caùc tube E-TOXATE naày phaûi luoân giöõ trong ñaù baøo. Dung dòch E-TOXATE ñaõ pha

xong neân ñöôïc duøng ngay trong ngaøy. Caùc tube dung dòch E-TOXATE chöa duøng thì phaûi

giöõ trong tuû ñoâng vaø khi ñoù ñoä nhaïy seõ giaûm ñi raát ít. Traùnh raõ ñoâng nhieàu laàn vì nhö vaäy

thì ñoä nhaïy seõ giaûm ñi raát nhanh.

Phöông phaùp ñònh löôïng : Ñoù laø tröôøng hôïp kieåm tra chaát löôïng phaùt hieän endotoxin trong

thuoác tieâm, dòch truyeàn; moãi maãu thöû nghieäm rieâng leõ phaûi duøng 6 tube E-TOXATE ñaùnh

139

Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau

soá töø 1 ñeán 6 vaø cho vaøo tube maãu thöû, chöùng [-], chöùng öùc cheá (ÖC), cuõng nhö caùc noàng

ñoä endotoxin chuaån theo höôùng daãn trình baøy trong baûng 7.

Phöông phaùp ñònh tính : Ñoù laø tröôøng hôïp phaùt hieän endotoxin trong caùc beänh phaåm nhö

maùu, huyeát thanh, dòch naõo tuyû, dòch maät...ñeå tìm baèng chöùng sôùm phaùt nhieän coù vi khuaån

Gram [-] trong maãu. Trong muïc ñích naøy, caùc maãu thöû phaûi laáy voâ truøng baèng caùc duïng cuï

khoâng chöùa endotoxin vaø khoâng coù tính chaát haáp phuï endotoxin. Moãi maãu thöû nghieäm

rieâng leõ phaûi duøng 4 tube E-TOXATE ñaùnh soá töø 1 ñeán 4 vaø cho vaøo tube maãu thöû, chöùng

[-], chöùng [+], chöùng öùc cheá (ÖC) theo höôùng daãn trình baøy baûng 8.

oC,

Sau ñoù, ñaäy mieäng tube laïi baèng giaáy nhoâm. UÛ ngay caùc tube trong maùy caùch thuûy 37

khoâng ñöôïc dao ñoäng oáng nghieäm trong suoát quaù trình uû vì nhö vaäy duø thöû nghieäm [+] thì

dung dòch trong tube cuõng khoâng theå ñoâng laïi ñöôïc maø chæ taêng ñoä nhôùt maø thoâi.

Baûng 7: Caùch chuaån bò caùc tube thöû nghieäm trong phöông phaùp ñònh löôïng

Tube Ñeå phaùt hieän Maãu thöû Nöôùc khoâng endotoxin Endotoxin chuaån

1 Endotoxin 0 ml 0.1 ml ddòch 0.03

0.03 EU/ml EU/ml

2 Endotoxin 0.06 EU/ml 0 ml 0.1 ml ddòch 0.06

EU/ml

3 Endotoxin 0.125 EU/ml 0 ml 0.1 ml ddòch 0.125

EU/ml

0.0 ml Chöùng [-] 0 ml 0.1 ml 4

0.01ml ddòch Chöùng ÖC 0.1 ml 0.0 ml 5

4EU/ml

0.0 ml Endotoxin 0.1 ml 0.0 ml 6

maãu thöû

140

Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau

Baûng 8: Caùch chuaån bò caùc tube thöû nghieäm trong phöông phaùp ñònh tính

Ñeå phaùt hieän Maãu thöû Nöôùc khoâng endotoxin Endotoxin chuaån Tube

Chöùng [+] 0 ml 0.1 ml ddòch 4 1

EU/ml

Chöùng [-] 0 ml 0.1 ml 0.0 ml 2

Chöùng ÖC 0.1 ml 0.0 ml 0.01ml ddòch 4 3

EU/ml

0.0 ml Endotoxin 0.1 ml 0.0 ml 4

maãu thöû

Ñoïc keát quaû

Sau khi uû 37oC trong moät giôø, caån thaän laáy töøng tube ra khoûi maùy caùch thuûy vaø nghieâng nheï

töø töø ñeán moät goùc 180 o, vöøa nghieâng vöøa quan saùt gel neáu ñaõ hình thaønh trong oáng nghieäm.

Keát quaû ñöôïc ñoïc laø [+] khi dung dòch trong oáng hoaøn toaøn thaønh gel cöùng cho pheùp

nghieâng hoaøn toaøn oáng nghieäm maø gel khoâng vôõ ra. Neáu khoâng coù gel cöùng thì keát quaû

phaûi ñoïc laø [-]. Löu yù laø ñoäng taùc nghieâng oáng thöû nghieäm ñeå ñoïc keát quaû chæ laøm moät laàn

vì neáu laøm laïi thì gel seõ bò vôõ ngay.

Ñoái vôùi phöông phaùp ñònh löôïng , keát quaû ñònh löôïng bieän luaän nhö ví duï trình baøy trong

baûng 9.

Ñoái vôùi phöông phaùp ñònh tính , keát quaû maãu thöû coù endotoxin khi chöùng [+] cho keát quaû

[+], chöùng [-] cho keát quaû [-], khoâng coù öùc cheá (keát quaû chöùng öùc cheá [+]), vaø maãu thöû cho

keát quaû [+]. Maãu thöû khoâng coù endotoxin khi chöùng [+] cho keát quaû [+], chöùng [-] cho keát

quaû [-], khoâng coù öùc cheá (chöùng öùc cheá [+]), vaø maãu thöû cho keát quaû [-]. Keát quaû khoâng

ñoïc ñöôïc khi coù öùc cheá (töùc laø keát quaû chöùng öùc cheá laø [-]). Maãu coù keát quaû [+] laø maãu coù

nhieãm vi khuaån Gram [-] vì endotoxin laø thaønh phaàn lipopolysaccharide cuûa vaùch vi khuaån

Gram [-].

141

Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau

Baûng 9: Caùch bieän luaän keát quaû trong phöông phaùp ñònh löôïng

Tube Keát quaû Tube Keát quaû

1 [-] 1 [-]

2 [+] 2 [+]

3 [+] 3 [+]

4 [-] 4 [-]

5 [-] 5 [+]

6 [-] 6 [+]

Maãu coù chöùa Maãu coù chöùa chaát

endotoxin ‡ 0.06 IU/ml öùc cheá thöû nghieäm

Caâu hoûi oân taäp

1. Cho bieát nguyeân taéc cuûa thöû nghieäm LAL.

2. Cho bieát caùc aùp duïng cuûa thöû nghieäm LAL, ñaëc bieät laø trong xeùt nghieäm vi sinh laâm

saøng.

3. Ñeå coù theå coù keát quaû chính xaùc, haõy cho bieát caùc vaät lieäu duøng ñeå laáy vaø chöùa beänh

phaåm phaûi ñaùp öùng ñöôïc caùc ñieàu kieän gì? Vaø muoán ñaùp öùng caùc ñieàu kieän naøy thì phaûi

duøng caùc vaät lieäu gì?

4. Caùc vaät lieäu nhöïa vaø thuyû tinh duøng trong thí nghieäm LAL phaûi ñaùp öùng ñöôïc caùc ñieàu

kieän gì? Vaø muoán ñaùp öùng caùc ñieàu kieän naøy thì phaûi duøng caùc vaät lieäu gì?

5. Haõy trình baøy caùch laøm moät thí nghieäm LAL vaø caùch ñoïc – phaân tích keát quaû.

142