K THU T KHÁNG SINH Đ THEO PH NG PHÁPỸ Ậ Ồ ƯƠ
KIRBY- BAUER
* Ph ng pháp khoanh gi y kháng sinh khu ch tán trong th ch (Kirby-Bauer).ươ ấ ế ạ
- Là m t ph ng pháp có th ti n hành các phòng xét nghi m hàngộ ươ ể ế ở ệ
ngày, không c n nhi u trang thi t b và máy móc.ầ ề ế ị
- Nguyên lý: Dùng khoanh gi y có đ ng kính và đ d y nh t đ nh, vôấ ườ ộ ầ ấ ị
trùng đã t m s n kháng sinh v i m t n ng đ nh t đ nh (d a vào hi uẩ ẵ ớ ộ ồ ộ ấ ị ự ệ
l c c a t ng kháng sinh), đ t lên m t đĩa môi tr ng đã nuôi c y viự ủ ừ ặ ộ ườ ấ
khu n. N ng đ vi khu n cũng đã đ c qui đ nh tr c. Đ t m cho viẩ ồ ộ ẩ ượ ị ướ ể ủ ấ
khu n m c và đo đ ng kính vòng c ch vi khu n xung quanh khoanhẩ ọ ườ ứ ế ẩ
gi y kháng sinh, d a vào đó xác đ nh m c đ nh y c m c a vi khu nấ ự ị ứ ộ ạ ả ủ ẩ
đ c th v i kháng sinh đó.ượ ử ớ
1. V T LI U.Ậ Ệ
1.1.Môi tr ng nuôi c y: ườ ấ
Môi tr ng nuôi c y dùng đ ki m tra m c đ nh y c m v i kháng sinh c a viườ ấ ể ể ứ ộ ạ ả ớ ủ
khu n ph i là môi tr ng đ c chu n hóa cao đ giúp cho h u h t các vi khu nẩ ả ườ ượ ẩ ể ầ ế ẩ
gây b nh m c t t, nh môi tr ng Muller-Hinton. môi tr ng này h u h t cácệ ọ ố ư ườ Ở ườ ầ ế
cation trong gi i h n nên không nh h ng nhi u đ n các ch t kháng khu n đ cớ ạ ả ưở ề ế ấ ẩ ượ
th .ử
1.2. Các ch t tăng sinh:ấ
Các vi khu n khó m c, đòi h i ph i có thêm ch t tăng sinh trong môi tr ngẩ ọ ỏ ả ấ ườ
trên nh máu ho c các s n ph m c a máu, vitamin ho c các y u t phát tri nư ặ ả ẩ ủ ặ ế ố ể
khác.
1.3. Đĩa petri:
Các đĩa đ đ môi tr ng có th b ng ch t d o ho c th y tinh trung tính, cóể ỗ ườ ể ằ ấ ẻ ặ ủ
đáy ph ng. Đ ng kính đĩa có th là 9 Cm, 11 Cm ho c l n h n.ẳ ườ ể ặ ớ ơ
1.4. Khoanh gi y th m kháng sinh:ấ ấ
Các khoanh gi y th m kháng sinh ph i đ c b o qu n t ng lo i riêng trongấ ấ ả ượ ả ả ừ ạ
h p kín tránh m. Các khoanh d tr ph i đ c gi trong t l nh – 20ộ ẩ ự ữ ả ượ ữ ủ ạ 0C, các
khoanh làm h ng ngày đ c gi 2 – 8ằ ượ ữ ở 0C tùy theo ch d n c a t ng hãng s nỉ ẫ ủ ừ ả
xu t. Các khoanh này ph i đ nhi t đ phòng 30 phút tr c khi s d ng.ấ ả ể ở ệ ộ ướ ử ụ
1.5. Dung d ch đ m PBS (Phosphat Buffer Saline) ho c n c mu i sinh lý đ phaị ệ ặ ướ ố ể
huy n d ch vi khu n.ề ị ẩ
1.6. Th c đo vòng c ch , pipet Pasteur, pipet 1 ml, t m…ướ ứ ế ủ ấ
Các ch ng qu c t :ủ ố ế
- Escherichia coli ATCC 25922
- Staphylococcus aureus ATCC 25923
- Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
- Enterococcus faecalis ATCC 29212
- Streptococcus pneumoniae ATCC 49619
- Haemophilus influenzae ATCC 49247
Ho cặATCC 49766
- Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226
Các ch ng này ph i thu n nh t và đ c ti n hành th nghi m songủ ả ầ ấ ượ ế ử ệ
song v i các ch ng phân l p t b nh nhân, các ch ng làm h ng ngày này đ cớ ủ ậ ừ ệ ủ ằ ượ
c y chuy n trên các môi tr ng không có ch t c ch và tránh c y chuy nấ ể ườ ấ ứ ế ấ ể
nhi u l n. Các ch ng d tr ph i đ c đông khô và gi trong t l nh.ề ầ ủ ự ữ ả ượ ữ ủ ạ
Đ i v i t ng m môi tr ng ho c t ng m th ch m i, ph i dùngố ớ ừ ẻ ườ ặ ừ ẻ ạ ớ ả
ch ng ủPseudomonas aeruginosa ATCC 27853 đ ki m tra n ng đ ion đ ki mể ể ồ ộ ể ể
tra n ng đ ion có m t trong môi tr ng.ồ ộ ặ ườ
Đô đ c chu n McFarland 0,5: Đ đ c này đ c ch b ng cách l y 0,5 ml 0,48 Mụ ẩ ộ ụ ượ ế ằ ấ
BaCl2 tr n đ u v i 99,5 ml 0,35 N Hộ ề ớ 2SO4, r i phân chia ra các ng có đ ng kínhồ ố ườ
t ng t các ng nghi m chu n b h n d ch vi khu n. Các ng này ph i đ c hàn kín,ươ ự ố ệ ẩ ị ỗ ị ẩ ố ả ượ
đ ch t i trong t l nh và có th s d ng đ c trong vòng 6 tháng. Đ đ c nàyể ở ỗ ố ủ ạ ể ử ụ ượ ộ ụ
t ng ng v i 10ươ ứ ớ 8CFU/ ml (Colony Forming Unit- Đ n v hình thành khu n l c).ơ ị ẩ ạ
2. L A CH N CÁC CH T KHÁNG KHU N TH NGHI M VÀ BÁOỰ Ọ Ấ Ẩ Ử Ệ
CÁO.
2.1. L a ch n các ch t kháng khu n thích h p nh t đ th nghi m và báo cáo làự ọ ấ ẩ ợ ấ ể ử ệ
b c quy t đ nh nh t, vì m i phòng xét nghi m lâm sàng có s tham kh o c aướ ế ị ấ ỗ ệ ự ả ủ
nh ng đ i t ng chuyên môn khác nhau (các nhà truy n nhi m, các bác sĩ đi u trữ ố ượ ề ễ ề ị
khác…). S cân nh c các tác nhân đ th nghi m d a trên hi u qu lâm sàng, t lự ắ ể ử ệ ự ệ ả ỷ ệ
kháng thu c, giá c , các khuy n cáo đã th ng nh t hi n nay v vi c l a ch nố ả ế ố ấ ệ ề ệ ự ọ
thu c u tiên và các thu c thay th . Các thu c đ c th cũng ph i phù h p v iố ư ố ế ố ượ ử ả ợ ớ
tình hình th c t s d ng t ng b nh vi n. Th nghi m các tác nhân đã đ c l aự ế ử ụ ở ừ ệ ệ ử ệ ượ ự
ch n mang l i l i ích cho m c đích qu n lý các b nh nhi m khu n.ọ ạ ợ ụ ả ệ ễ ẩ
- Các thu c cùng n m trong m t nhóm ch c n th m t lo i, vì k t qu c aố ằ ộ ỉ ầ ử ộ ạ ế ả ủ
chúng thông th ng t ng t nhau và có th so sánh đ c hi u qu trên lâm sàng.ườ ươ ự ể ượ ệ ả
Chúng h u nh gi ng nhau v ph kháng khu n, cách tác đ ng và k t qu khángầ ư ố ề ổ ẩ ộ ế ả
chéo. Báo cáo th ng d a trên th nghi m v i b n thân ch t kháng khu n, tr khiườ ự ử ệ ớ ả ấ ẩ ừ
các báo cáo này d a trên các ch t khác cho k t qu chính xác h n. Các k t quự ấ ế ả ơ ế ả
không mong đ i ph i đ c báo cáo.ợ ả ượ
2.2. L a ch n báo cáo. M i phòng xét nghi m ph i quy t đ nh ch t kháng khu nự ọ ỗ ệ ả ế ị ấ ẩ
nào trong b ng đ báo cáo h ng ngày (Lo i A) và ch t nào có l ch báo cáo ch nả ể ằ ạ ấ ẽ ỉ ọ
l cọ
(Lo i B)…ạ
3. CÁC B C TI N HÀNHƯỚ Ế .
3.1. Chu n b môi tr ng. ẩ ị ườ
Môi tr ng đ c chu n b theo h ng d n c a t ng hãng s n xu t: b ng cáchườ ượ ẩ ị ướ ẫ ủ ừ ả ấ ằ
cân chính xác l ng th ch Muller-Hinton khô và hòa tan vào trong nu c c t trungượ ạ ớ ấ
tính, ki m tra pH tr c khi h p ti t khu n. Trong khi h p, tránh đ môi tr ng ể ướ ấ ệ ẩ ấ ể ườ ở
nhi t đ cao và th i gian dài h n s c n thi t, vì đi u đó s làm gi m kh năngệ ộ ờ ơ ự ầ ế ề ẽ ả ả
đ m và thay đ i pH c a môi tr ng. Sau khi đ ngu i môi tr ng t i 50 – 60ệ ổ ủ ườ ể ộ ườ ớ 0C (có
pH kho ng 7,2 – 7,4) có th thêm máu ho c các s n ph m c a máu, l c cho đ u vàả ể ặ ả ẩ ủ ắ ề
đ vào đĩa petri đã vô khu n v i đ dày 3,5 – 4,5 mm (có nghĩa 25 ml th ch choỗ ẩ ớ ộ ạ
m t đĩa Petri đ ng kính 90 mm ho c 40 ml th ch cho đĩa có đ ng kính 110mmộ ườ ặ ạ ườ
v.v…). Các đĩa này ph i đ t trên m t ph ng n m ngang đ đ m b o cho đ sâuả ặ ặ ẳ ằ ể ả ả ộ
c a th ch m i v trí trong đĩa b ng nhau. Đ đĩa môi tr ng ngu i nhi t đủ ạ ở ọ ị ằ ể ườ ộ ở ệ ộ
phòng r i b o qu n trong túi nilon t l nh 4 – 8ồ ả ả ở ủ ạ 0C. Các đĩa th ch này đ c dùngạ ượ
trong vòng 7 ngày k t ngày chu n b .ể ừ ẩ ị
Các đĩa th ch có máu ho c ch ph m c a máu ph i đ c ki m tra vô khu n trongạ ặ ế ẩ ủ ả ượ ể ẩ
t m qua đêm m i đ c s d ng.ủ ấ ớ ượ ử ụ
3.2. Ria c y vi khu n: ấ ẩ
Sau khi vi khu n thu n khi t đ c nuôi c y qua đêm trên các môi tr ng khôngẩ ầ ế ượ ấ ườ
có ch t c ch , dùng que c y l y 5 – 10 khu n l c (ho c 3 v trí khác nhau, n u viấ ứ ế ấ ấ ẩ ạ ặ ị ế
khu n trong ng) đ tránh ph i các vi khu n đ t bi n, nghi n vào m t ng PBSẩ ở ố ể ả ẩ ộ ế ề ộ ố
(ho c n c mu i sinh lý) vô trùng, l c đ u b ng máy l c Votex, so sánh v i ng đặ ướ ố ắ ề ằ ắ ớ ố ộ
đ c chu n Mc Farland 0,5 (n u đ c quá thì cho thêm PBS ho c n c mu i sinh lý;ụ ẩ ế ụ ặ ướ ố
ng c l i n u không đ đ c thì cho thêm vi khu n), ta đ c h n d ch vi khu n ≈ 10ượ ạ ế ủ ụ ẩ ượ ỗ ị ẩ 8
CFU/ml. Dùng que tăm bông vô trùng nhún vào h n d ch vi khu n trên ép vào thành ngỗ ị ẩ ố
cho b t n c, r i ria đ u kh p v i nh ng đ ng b t chéo nhau 120ớ ướ ồ ề ắ ớ ữ ườ ắ 0 lên m t th ch đãặ ạ
đ c đ trong t m cho khô (nh ng không quá 30 phút).ượ ể ủ ấ ư
3.3. Chu n b khoanh gi y kháng sinh:ẩ ị ấ
L y ng khoanh gi y kháng sinh t t l nh đ nhi t đ phòng 30 phút choấ ố ấ ừ ủ ạ ể ở ệ ộ
thăng b ng nhi t đ gi a trong và ngoài ng.ằ ệ ộ ữ ố
Đ t các khoanh gi y đã ch n l a v i t ng vi khu n đ c th sao cho m t c aặ ấ ọ ự ớ ừ ẩ ượ ử ặ ủ
khoanh gi y áp sát vào m t môi tr ng, mép ngoài c a khoanh gi y cách thành trongấ ặ ườ ủ ấ
c a đĩa 15 mm và khoanh n cách khoanh kia 20mm. Đ đĩa th ch nhi t đ phòngủ ọ ể ạ ở ệ ộ
kho ng 30 phút cho kháng sinh khu ch tán, r i đ môi tr ng trong t m 35ả ế ồ ể ườ ủ ấ 0C qua
đêm. Các đĩa th v i các ch ng ử ớ ủ H. influenzae, S. pneumoniae và N. gonorrhoeae ph iả
đ trong t m có 5 -10% COể ủ ấ 2.
3.4. Đ c k t qu : Dùng th c đo đ ng kính vùng c ch , d a vào tiêu chu n c aọ ế ả ướ ườ ứ ế ự ẩ ủ
t ng hãng s n xu t khoanh gi y kháng sinh, ta có m c đ nh y c m, trung gian vàừ ả ấ ấ ứ ộ ạ ả
kháng c a t ng lo i vi khu n.ủ ừ ạ ẩ