ng pháp ELISA ươ
ậ
ầ
ể
ệ
ặ
ệ
ệ
ệ
ọ
ộ
ư
ự
ể ứ
ượ ử ụ
ẩ
ự
ệ
ấ ắ ụ
ấ ượ ề ươ
ặ ề ạ ệ ự ế ợ
ớ ấ ể
ườ ơ ấ
ấ ứ ữ ặ
ề ự ộ ẽ ủ đã x y ra ph n ng đ c hi u gi a kháng th v i kháng ệ ả ế ượ ồ ể ớ ể ầ ệ
ng pháp này đ ỏ ệ ng đ màu mà bi ườ c thi ng v t ch t nh peptides, protein, ươ t đ ộ t k cho vi c phát hi n và đ nh l ế ế ư ậ ấ ị
ượ ọ ộ
ể ở ộ ồ ả ặ ơ ị ộ
ậ ấ ạ ớ
ả ẻ ề ượ ư ể ậ ẫ ơ
ệ ề
ấ ạ ư ầ ể
c: ướ ự
ữ ể ọ
ừ ủ ử
[O] t i phóng oxy nguyên t ị ả ủ ỗ ơ ấ ổ ợ ỉ ị
Ph ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) là m t k thu t sinh hóa đ phát hi n kháng th hay kháng nguyên trong m u c n phân ộ ỹ ẫ c s d ng r ng rãi trong nhi u lĩnh v c nghiên c u nh y h c, nông nghi p và đ c bi tích. Hi n nay ELISA đ t là trong các quy trình ề ki m tra an toàn ch t l ng các s n ph m th c ph m. ẩ ể ả 1. Khái ni m v ELISA Nguyên t c: Ph ễ ng pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay- xét nghi m h p th mi n ệ d ch liên k t v i enzyme) có r t nhi u d ng mà đ c đi m chung là đ u d a trên s k t h p đ c hi u ể ặ ế ớ ị ơ ấ gi a kháng nguyên và kháng th , trong đó kháng th đ c g n v i m t enzyme. Khi cho thêm c ch t ể ượ ắ ữ ộ ng là nitrophenol phosphate) vào ph n ng, enzyme s th y phân c ch t thành m t thích h p (th ả ứ ợ ch t có màu. S xu t hi n màu ch ng t ả ứ ự ấ c n ng đ kháng nguyên hay kháng th c n phát hi n. nguyên và thông qua c ộ Ph ệ ệ ượ c g i b i m t tên g i khác là EIA (Enzyme ImmunoAssay) antibodies, hormone,… Đôi khi nó còn đ ượ ọ ở m t n ng đ Kĩ thu t này khá nh y và đ n gi n, cho phép ta xác đ nh kháng nguyên ho c kháng th ạ r t th p (kho ng 0,1 ng/ml). So v i kĩ thu t mi n d ch phóng x (RIA- Radio Immuno Assay) thì kĩ ễ ị ậ ấ thu t này r ti n và an toàn h n mà v n đ m b o đ chính xác nh nhau. ELISA đ c dùng đ xác ả ộ ả đ nh nhi u tác nhân gây b nh nh virus, vi khu n, n m, kí sinh. ấ ẩ ị Kĩ thu t ELISA g m ba thành ph n tham gia ph n ng là: kháng nguyên, kháng th và ch t t o màu; ậ ả ứ ồ th c hi n qua hai b ệ - Ph n ng mi n d ch h c: Là s k t h p gi a kháng nguyên và kháng th ả ứ ự ế ợ ễ ị - Ph n ng hóa h c: Thông qua ho t tính xúc tác c a enzyme làm gi ả ứ ạ ọ H2O2 đ oxy hóa c ch t ch th màu, do đó làm thay đ i màu c a h n h p trong dung d ch thí ể nghi m.ệ
(Trích t
Chemicon International)
ừ
2. Phân lo i ELISA ạ
ươ ầ
c g n tr c ti p lên b m t giá th và s đ ấ ủ ể ng pháp ELISA. Trong đó, kháng nguyên c n phát ấ c phát hi n b ng m t kháng th duy nh t ộ ệ ằ ẽ ượ ể
ự ế ả ơ ề ặ c g n enzyme). 2.1. Direct ELISA (ELISA tr c ti p) Direct ELISA: Đây là d ng đ n gi n nh t c a ph ạ hi n s đ ự ế ệ ẽ ượ ắ (kháng th này đã đ ượ ắ ể
S đ 2.1: Ti n trình th c hi n ph n ng ELISA tr c ti p ự ế ệ
ả ứ
ơ ồ
ự
ế
ả
ng thì kháng nguyên có ít nh t là 2 epitope (trình di n kháng nguyên) ườ ấ ệ
Ư ể ượ ộ ặ ươ i h n vì th ỉ ử ụ ể ắ ộ
t v i t ng đ i t ng. - u đi m: Đ n gi n nh t ấ ơ c đi m: - Nh ể + Đ đ c hi u b gi ệ ị ớ ạ mà ph + Ph i đánh d u cho t ng kháng th chuyên bi ừ ả ng pháp này ch s d ng 1 kháng th g n vào m t epitope. ố ượ ệ ớ ừ ể ấ
ch kháng th b t kháng nguyên không đ ở ỗ ể ắ
ng pháp này khác Direct ELISA ặ ụ ệ ủ ể ể ắ ộ ớ
c g n v i enzyme). ớ
2.2. ELISA gián ti pế c Indirect ELISA: Ph ượ ươ ể g n enzyme mà nó là m c tiêu g n đ c hi u c a m t kháng th khác (kháng th này m i là kháng th ắ đ ượ ắ
S đ 2.2: Ti n trình th c hi n ph n ng ELISA gián ti p ế ệ
ả ứ
ơ ồ
ự
ế
ạ ấ ề ể ể ử ụ
ng m i hóa. ạ
ề ả ế ế ể ắ h n, d dàng th ễ ộ ặ
ớ ả ầ ề ệ ữ ẫ ế c đi m: Đ đ c hi u c a t ng kháng huy t thanh là khác nhau. Đi u này d n đ n k t qu ử
c. ươ ệ ủ ừ ệ ng đ ể ưở ượ
ạ ượ ử ụ
c s d ng ph bi n nh t trong th c ti n do nó cho ph n ng m nh và ự ễ c đánh giá thông qua s k t h p c a hai ế ượ ấ ệ ổ ế ả
ệ ể
Kỹ ạ ượ ạ ạ ậ
ể ự ụ ộ ế ể ắ
ồ ớ ượ ữ
ế ợ ằ ệ ủ
ủ c thêm vào. Nh ng kháng nguyên đ ượ t c a chúng vào pha r n. ắ Ở ớ ữ ể ắ ủ và
ứ ợ ỉ
ự ế ớ
ượ ể ứ ề ậ ặ ộ ồ
ậ ể ố ủ ử
ậ ả ộ
ệ ươ ạ ủ ầ ắ
ể ắ ế ớ ể ể ượ ử ụ ệ ả ượ ấ
ữ ể ệ ố ẩ ị
i h n v s chu n b kháng th . H th ng cũng b gi ể ắ ị ớ ạ ề ự ả ệ ề ế ợ ấ
ứ i nh ng epitope khác nhau trên ph c ể ắ ữ ể ắ
ệ i khi kh o sát s khác bi t nh gi a nh ng kháng nguyên n u s ể ố ệ ạ ỏ ữ ữ ả
ệ ử ụ ể ắ ể ộ
i h n v v trí g n k t s n có cho s phát hi n. Kích th - u đi m: Kháng th g n enzyme có th s d ng đ đánh d u cho nhi u lo i kháng nguyên nên ti n ệ Ư ể i và kinh t l ế ơ ợ - Nh ế ể ượ khác nhau gi a các thí nghi m và do đó c n ph i th nghi m v i nhi u kháng huy t thanh khác nhau đ k t qu có th tin t ả ể ế 2.3. Sandwich ELISA Đây là m t d ng ELISA đ ả ứ ộ ạ nh y. Đ c g i là “sandwich” là do k t qu thí nghi m đ ượ ọ ự ế ợ ủ lo i kháng th là kháng th b t (capture antibodies) và kháng th phát hi n (detection antibodies). ể ắ ể thu t này cũng đ c phân làm hai d ng là Direct sandwich ELISA (DAS-ELISA - Double antibody sandwich) và Indirect sandwich ELISA (TAS-ELISA – Triple antibody sandwich). DAS ELISA g m s dính th đ ng c a kháng th vào pha r n (đáy gi ng). Nh ng kháng th này sau ữ c pha loãng trong blocking đó k t h p v i các kháng nguyên đ buffer nh m ngăn s dính không chuyên bi đây, nh ng ph n c a blocking ự ầ ủ buffer không nên ch a b t kỳ kháng nguyên nào mà có th k t h p v i kháng th b t. Sau khi ể ế ợ ứ ấ r a, ch còn ph c h p kháng nguyên - kháng th dính vào pha r n. ắ ể ử c thêm vào. Do v y, đây là s k t h p tr c ti p v i kháng nguyên đích và Kháng th b t sau đó đ ự ế ợ ể ắ kháng th b t. Kháng th th hai này có th gi ng kháng th m t ho c khác v ngu n đ ng v t hay ể ộ ể ắ , r a, thêm c ch t vào và đ c trên máy đo quang ph . Vì loài đ ng v t s n xu t kháng th . Sau khi ổ ọ ơ ấ ể ấ ộ i h n v tính chuyên bi t và nh ng s d ng m t kháng th g n k t v i enzyme nên h th ng b gi ữ ệ ố ị ớ ạ ề ử ụ t. Đi u này gi i h n s linh ho t c a ph thành ph n g n li n v i kháng th chuyên bi ng pháp, ví ề ớ ạ ự ề ớ c đánh d u riêng (cho nh ng kháng nguyên khác nhau). c s d ng ph i đ d nh m i kháng th đ ụ ư ỗ ị ớ ạ ở ỗ Theo cách này, direct ELISA b gi i h n ch kháng nguyên ph i có ít nh t hai epitope vì c hai kháng th b t và phát hi n đ u k t h p tr c ti p ự ế ả v i kháng nguyên. ớ Kháng th b t trên pha r n và kháng th phát hi n có th ch ng l ế ử h p kháng nguyên. Do đó, thu n l ự ậ ợ ợ d ng kháng th phát hi n và kháng th b t khác nhau. Vi c s d ng cùng m t kháng th b t và phát ụ c và hi n có th d n đ n v n đ khi có gi ệ ệ ể ẫ ế ấ ể ắ ớ ạ ắ ế ẵ ề ị ướ ự ề ệ
ủ ể ả ấ ọ ưở ng
ế ố ạ ệ
c chia làm hai h th ng: ể ượ ệ ố
ự ế
m i quan h không gian c a các epitope trên kháng nguyên đích là r t quan tr ng và có th nh h ệ m nh đ n th nghi m. ử Sandwich ELISA có th đ 2.3.1 Sandwich ELISA tr c ti p
ơ ồ
S đ 2.3: Ti n trình th c hi n ELISA Sandwich tr c ti p ự ế ệ
ự ỏ ữ
ế t nh gi a các kháng nguyên n u s d ng kháng th b t và ệ
ế ử ụ ể ắ
ể ệ
ng pháp khác mà chúng tôi ch n ph ng pháp ư ươ ươ ẳ ơ ọ
Ư ể ể ươ ể ẩ ứ ệ
ể ắ ệ ể
i h n v trí k t h p s n có đ phát hi n. M i quan h v kích th ể ẫ ế c và v trí không gian c a các ị ấ ề ế ủ ế ử ụ ị ố ệ ề ướ
ể ệ ng đ n th nghi m. ử ế ợ ẵ ưở ệ ế
- u đi m: Có th phát hi n s khác bi ệ ự kháng th phát hi n khác nhau. - Vì ph ng pháp này có u đi m h n h n nh ng ph ữ ể này đ ch n đoán b nh virus đang nghiên c u. Chú ý: n u s d ng kháng th b t và kháng th phát hi n gi ng nhau có th d n đ n v n đ n u có s gi ố ự ớ ạ epitope cũng có nh h ả 2.3.2 Sandwich ELISA gián ti pế
ệ
ự
ơ ồ
ả ứ
ệ ơ
S đ 2.4: Ti n trình th c hi n ph n ng ELISA Sandwich gián ti p ế ể ượ ắ
ả ứ c g n enzyme không ph n ng
ế ạ
ứ ấ ớ
c đ a vào đ ng th i. ự ắ ặ ồ ắ ờ
ữ ứ
ế t h n Direct sanwich ELISA do antispecies kháng th đ ể ắ ả ứ ứ ạ ạ t gi a c ch và c nh tranh. C hai ph n ng đ u có s tham gia c a hai kháng th ph n ể ả ệ c g i là c ch (blocking/
ế ớ
ủ ượ ọ ứ ờ ớ c thêm vàođ ng th i v i ồ c ph n ng đó đ ể ượ
Chuyên bi v i kháng th b t kháng nguyên. ớ 2.4. Ph n ng c ch /c nh tranh Ph n ng c nh tranh mang nghĩa là hai ch t tham gia ph n ng cùng ái l c b t c p v i ch t th ba. ấ ả ứ ả ứ Ph n ng c nh tranh đúng đ n thì hai ch t c nh tranh ph i đ ấ ạ ả ượ ư ả ứ S khác bi ề ả ạ ế ả ứ ự ự tr ng v i kháng nguyên. N u m t kháng th đ c ộ ứ ả ứ ể ượ ủ ướ ế inhibition assays). Ph n ng c nh tranh mang nghĩa c hai kháng th đ ả ạ ả ứ nhau (hình 1).
ạ
ệ
ự
ữ ứ
t gi a c ch và c nh tranh ế
ể
c mô t ượ
ng kháng nguyên trên b m t đĩa và l ể ự ế ượ
c thêm vào đĩa cùng m t lúc ượ i u. Kháng nguyên và kháng th g n enzyme đ ộ ể ố ư ệ ố ẩ s đ 2.5 ả ở ơ ồ ề ặ ể ắ ng kháng th g n enzyme đã ể ắ ượ ộ
ế ạ
ho c cùng nh kháng nguyên đã đ ươ ự ặ ể ắ c g n trên đĩa thì kháng th g n ượ ắ
ẽ
ẽ ắ ự ế ợ ủ ạ ề ặ ư ồ ớ ể ắ
ạ ẽ ả ư ậ ồ ụ ạ ả ộ
ộ ấ
c thêm tr c ti p vào đĩa n u nó đ c pha loãng trong blocking ự ế ượ
ng quan c a n ng đ phân t ướ ứ ộ ạ c n ki m tra ể ủ ồ ử ầ ụ ộ ộ
và r a, l ử ượ ể ượ ơ ấ ủ
ự ươ
ế ớ
Hình 1 : s khác bi 2.4.1. Direct C-Elisa: Ki m tra kháng nguyên Direct C-ELISA ki m tra kháng nguyên đ Trong h th ng tr c ti p, l đ c chu n đ đ t ượ đ t o u th c nh tranh. ể ạ ư N u kháng nguyên t ng t ế enzyme s g n lên kháng nguyên này. Khi n ng đ c a kháng nguyên c nh tranh cao s ngăn c n b t ả ấ ộ ủ ế kỳ s k t h p c a kháng th g n enzyme v i kháng nguyên trên b m t đĩa (c nh tranh 100%). N u n ng đ kháng nguyên c nh tranh gi m (ví d : pha loãng) s c nh tranh s gi m. Nh v y n ng đ ộ ự ạ ồ kháng nguyên c nh tranh càng cao thì đ h p thu màu càng gi m. ạ ả Kháng nguyên c nh tranh có th đ ế ể ượ ạ c khi thêm kháng th g n enzyme. buffer tr ể ắ M c đ c nh tranh theo th i gian ph thu c vào m i t ờ ố ươ và kháng nguyên trên b m t đĩa (và m c đ t ng đ ng c a kháng nguyên). ứ ộ ươ ồ ề ặ ủ ng kháng th đ Sau khi c đánh d u đ ng sau khi thêm c ch t. khi không có c đ nh l ấ ượ ị ượ ự ắ kháng nguyên trong m u ki m tra hay không có s t ng đ ng c a kháng nguyên thì không có s g n ể ẫ ủ ồ ả c đánh d u và không có s c nh tranh v i kháng nguyên này. K t qu là k t v i kháng nguyên đ ự ạ ượ ế ớ ng đ màu còn đ i ch ng âm thì không. m u có ch a kháng nguyên thì s c nh tranh làm gi m c ả ứ ẫ
ấ ự ạ ườ ứ ộ ố
S đ 2.5. Direct C-ELISA ki m tra kháng nguyên
ơ ồ
ể
ể
chi ti t ế ở ơ ồ
ể c mô t ng t s đ 2.6. ể ể ượ ể ươ ể ự ạ
ữ ể ẫ ớ
2.4.2. Direct C-Elisa: Ki m tra kháng th Direct C-ELISA ki m tra kháng th đ ả ể ở v i Direct C-ELISA ki m tra kháng th . S c nh tranh Direct C-ELISA ki m tra kháng th t ự ớ ể c đánh d u v i các v trí trên kháng nguyên trên đĩa. đây là gi a kháng th trong m u và kháng th đ ị ể ượ c tr n v i nhau tr c khi thêm vào đĩa. M u và kháng th đánh d u đ ướ ớ ẫ ấ ượ ể ẫ ộ
S đ 2.6. Direct C-ELISA ki m tra kháng th
ơ ồ
ể
ể
nh h ế ộ ạ ủ
ế ố ả ng kháng th th nh t đ
ố ớ
ả
ch t t o màu ừ ấ ạ ả ươ ễ ế
ặ ừ ưở ể ứ ấ ượ ắ ể ứ ấ ố ớ ể ứ ng đ n k t qu ELISA ế ế ưở N u các đ i ch ng âm cho k t qu d ố ứ ể ượ ấ ặ
ể ả
i t ệ ố ớ ố ạ ử ụ ệ ả ấ ồ ấ
ể ng và c m u ki m tra thì ph i ki m ệ ể ấ ấ ả
ạ
ể ể ng thì có th ki m ươ ứ ế ạ ẫ
ể ượ ắ ạ ố ố ố ớ ứ ề ạ
c g n enzyme và n ng đ c a ch t t o màu. ớ ố ả ặ ự ố ệ ả ộ i m t th nghi m trong đi u ki n đang g p s c thì ch nên thay đ i m t ử ệ ề ệ ổ ộ ỉ
ng đ n đ nh y c a ph n ng ELISA 3. Các y u t ả ứ c g n vào đáy gi ng - S l ế ố ượ - Ái l c c a kháng th th nh t đ i v i kháng nguyên ự ủ - Ái l c c a kháng th th hai đ i v i kháng nguyên ự ủ nh h 4. Các y u t ế ố ả ế • kháng th đ ho c t ế • l ạ ấ ả ế • tra l • tra l • y u t ế ố ng tính thì có th do s nhi m t ể ự c đánh d u ho c chính các đ i ch ng b nhi m. ứ ố ễ ị ng ho c đ i v i m u thì ph i ki m tra N u màu không xu t hi n đ i v i đ i ch ng d ẫ ươ ặ ố ớ ứ t c hoá ch t bao g m: h n s d ng, n ng đ , đi u ki n b o qu n ồ ả ề ộ N u màu xu t hi n quá th p đ i v i đ i ch ng d ươ ứ ố ớ ố ả ẫ i kháng th đ ấ ạ ộ ủ ồ N u có t o màu đ i v i m u nh ng không t o màu v i đ i ch ng d ư i ngu n g c đ i ch ng, h n s d ng và đi u ki n b o qu n. ạ ử ụ ồ Khi ch y l ạ ạ thí nghi m. ệ
