Ph ng pháp ELISAươ
ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) là m t k thu t sinh hóa đ phát hi n kháng th hay kháng nguyên trong m u c n phânộ ỹ ậ ể ệ ể ẫ ầ
tích. Hi n nay ELISA đ c s d ng r ng rãi trong nhi u lĩnh v c nghiên c u nh y h c, nông nghi p và đ c bi t là trong các quy trìnhệ ượ ử ụ ộ ề ự ứ ư ọ ệ ặ ệ
ki m tra an toàn ch t l ng các s n ph m th c ph m.ể ấ ượ ả ẩ ự ẩ
1. Khái ni m v ELISAệ ề
Nguyên t c: Ph ng pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay- xét nghi m h p th mi nắ ươ ệ ấ ụ ễ
d ch liên k t v i enzyme) có r t nhi u d ng mà đ c đi m chung là đ u d a trên s k t h p đ c hi uị ế ớ ấ ề ạ ặ ể ề ự ự ế ợ ặ ệ
gi a kháng nguyên và kháng th , trong đó kháng th đ c g n v i m t enzyme. Khi cho thêm c ch tữ ể ể ượ ắ ớ ộ ơ ấ
thích h p (th ng là nitrophenol phosphate) vào ph n ng, enzyme s th y phân c ch t thành m tợ ườ ả ứ ẽ ủ ơ ấ ộ
ch t có màu. S xu t hi n màu ch ng t đã x y ra ph n ng đ c hi u gi a kháng th v i khángấ ự ấ ệ ứ ỏ ả ả ứ ặ ệ ữ ể ớ
nguyên và thông qua c ng đ màu mà bi t đ c n ng đ kháng nguyên hay kháng th c n phát hi n.ườ ộ ế ượ ồ ộ ể ầ ệ
Ph ng pháp này đ c thi t k cho vi c phát hi n và đ nh l ng v t ch t nh peptides, protein,ươ ượ ế ế ệ ệ ị ượ ậ ấ ư
antibodies, hormone,… Đôi khi nó còn đ c g i b i m t tên g i khác là EIA (Enzyme ImmunoAssay)ượ ọ ở ộ ọ
Kĩ thu t này khá nh y và đ n gi n, cho phép ta xác đ nh kháng nguyên ho c kháng th m t n ng đậ ạ ơ ả ị ặ ể ở ộ ồ ộ
r t th p (kho ng 0,1 ng/ml). So v i kĩ thu t mi n d ch phóng x (RIA- Radio Immuno Assay) thì kĩấ ấ ả ớ ậ ễ ị ạ
thu t này r ti n và an toàn h n mà v n đ m b o đ chính xác nh nhau. ELISA đ c dùng đ xácậ ẻ ề ơ ẫ ả ả ộ ư ượ ể
đ nh nhi u tác nhân gây b nh nh virus, vi khu n, n m, kí sinh.ị ề ệ ư ẩ ấ
Kĩ thu t ELISA g m ba thành ph n tham gia ph n ng là: kháng nguyên, kháng th và ch t t o màu;ậ ồ ầ ả ứ ể ấ ạ
th c hi n qua hai b c:ự ệ ướ
- Ph n ng mi n d ch h c: Là s k t h p gi a kháng nguyên và kháng thả ứ ễ ị ọ ự ế ợ ữ ể
- Ph n ng hóa h c: Thông qua ho t tính xúc tác c a enzyme làm gi i phóng oxy nguyên t [O] tả ứ ọ ạ ủ ả ử ừ
H2O2 đ oxy hóa c ch t ch th màu, do đó làm thay đ i màu c a h n h p trong dung d ch thíể ơ ấ ỉ ị ổ ủ ỗ ợ ị
nghi m.ệ
(Trích t Chemicon International)ừ
2. Phân lo i ELISAạ
2.1. Direct ELISA (ELISA tr c ti p)ự ế
Direct ELISA: Đây là d ng đ n gi n nh t c a ph ng pháp ELISA. Trong đó, kháng nguyên c n phátạ ơ ả ấ ủ ươ ầ
hi n s đ c g n tr c ti p lên b m t giá th và s đ c phát hi n b ng m t kháng th duy nh tệ ẽ ượ ắ ự ế ề ặ ể ẽ ượ ệ ằ ộ ể ấ
(kháng th này đã đ c g n enzyme).ể ượ ắ
S đ 2.1: Ti n trình th c hi n ph n ng ELISA tr c ti pơ ồ ế ự ệ ả ứ ự ế
- u đi m: Đ n gi n nh tƯ ể ơ ả ấ
- Nh c đi m:ượ ể
+ Đ đ c hi u b gi i h n vì th ng thì kháng nguyên có ít nh t là 2 epitope (trình di n kháng nguyên)ộ ặ ệ ị ớ ạ ườ ấ ệ
mà ph ng pháp này ch s d ng 1 kháng th g n vào m t epitope.ươ ỉ ử ụ ể ắ ộ
+ Ph i đánh d u cho t ng kháng th chuyên bi t v i t ng đ i t ng.ả ấ ừ ể ệ ớ ừ ố ượ
2.2. ELISA gián ti pế
Indirect ELISA: Ph ng pháp này khác Direct ELISA ch kháng th b t kháng nguyên không đ cươ ở ỗ ể ắ ượ
g n enzyme mà nó là m c tiêu g n đ c hi u c a m t kháng th khác (kháng th này m i là kháng thắ ụ ắ ặ ệ ủ ộ ể ể ớ ể
đ c g n v i enzyme).ượ ắ ớ
S đ 2.2: Ti n trình th c hi n ph n ng ELISA gián ti pơ ồ ế ự ệ ả ứ ế
- u đi m: Kháng th g n enzyme có th s d ng đ đánh d u cho nhi u lo i kháng nguyên nên ti nƯ ể ể ắ ể ử ụ ể ấ ề ạ ệ
l i và kinh t h n, d dàng th ng m i hóa.ợ ế ơ ễ ươ ạ
- Nh c đi m: Đ đ c hi u c a t ng kháng huy t thanh là khác nhau. Đi u này d n đ n k t quượ ể ộ ặ ệ ủ ừ ế ề ẫ ế ế ả
khác nhau gi a các thí nghi m và do đó c n ph i th nghi m v i nhi u kháng huy t thanh khác nhauữ ệ ầ ả ử ệ ớ ề ế
đ k t qu có th tin t ng đ c.ể ế ả ể ưở ượ
2.3. Sandwich ELISA
Đây là m t d ng ELISA đ c s d ng ph bi n nh t trong th c ti n do nó cho ph n ng m nh vàộ ạ ượ ử ụ ổ ế ấ ự ễ ả ứ ạ
nh y. Đ c g i là “sandwich” là do k t qu thí nghi m đ c đánh giá thông qua s k t h p c a haiạ ượ ọ ế ả ệ ượ ự ế ợ ủ
lo i kháng th là kháng th b t (capture antibodies) và kháng th phát hi n (detection antibodies).ạ ể ể ắ ể ệ Kỹ
thu t này cũng đ c phân làm hai d ng là Direct sandwich ELISA (DAS-ELISA - Double antibodyậ ượ ạ
sandwich) và Indirect sandwich ELISA (TAS-ELISA – Triple antibody sandwich).
DAS ELISA g m s dính th đ ng c a kháng th vào pha r n (đáy gi ng). Nh ng kháng th này sauồ ự ụ ộ ủ ể ắ ế ữ ể
đó k t h p v i các kháng nguyên đ c thêm vào. Nh ng kháng nguyên đ c pha loãng trong blockingế ợ ớ ượ ữ ượ
buffer nh m ngăn s dính không chuyên bi t c a chúng vào pha r n. đây, nh ng ph n c a blockingằ ự ệ ủ ắ Ở ữ ầ ủ
buffer không nên ch a b t kỳ kháng nguyên nào mà có th k t h p v i kháng th b t. Sau khi vàứ ấ ể ế ợ ớ ể ắ ủ
r a, ch còn ph c h p kháng nguyên - kháng th dính vào pha r n.ử ỉ ứ ợ ể ắ
Kháng th b t sau đó đ c thêm vào. Do v y, đây là s k t h p tr c ti p v i kháng nguyên đích vàể ắ ượ ậ ự ế ợ ự ế ớ
kháng th b t. Kháng th th hai này có th gi ng kháng th m t ho c khác v ngu n đ ng v t hayể ắ ể ứ ể ố ể ộ ặ ề ồ ộ ậ
loài đ ng v t s n xu t kháng th . Sau khi , r a, thêm c ch t vào và đ c trên máy đo quang ph . Vìộ ậ ả ấ ể ủ ử ơ ấ ọ ổ
s d ng m t kháng th g n k t v i enzyme nên h th ng b gi i h n v tính chuyên bi t và nh ngử ụ ộ ể ắ ế ớ ệ ố ị ớ ạ ề ệ ữ
thành ph n g n li n v i kháng th chuyên bi t. Đi u này gi i h n s linh ho t c a ph ng pháp, víầ ắ ề ớ ể ệ ề ớ ạ ự ạ ủ ươ
d nh m i kháng th đ c s d ng ph i đ c đánh d u riêng (cho nh ng kháng nguyên khác nhau).ụ ư ỗ ể ượ ử ụ ả ượ ấ ữ
Theo cách này, direct ELISA b gi i h n v s chu n b kháng th . H th ng cũng b gi i h n chị ớ ạ ề ự ẩ ị ể ệ ố ị ớ ạ ở ỗ
kháng nguyên ph i có ít nh t hai epitope vì c hai kháng th b t và phát hi n đ u k t h p tr c ti pả ấ ả ể ắ ệ ề ế ợ ự ế
v i kháng nguyên.ớ
Kháng th b t trên pha r n và kháng th phát hi n có th ch ng l i nh ng epitope khác nhau trên ph cể ắ ắ ể ệ ể ố ạ ữ ứ
h p kháng nguyên. Do đó, thu n l i khi kh o sát s khác bi t nh gi a nh ng kháng nguyên n u sợ ậ ợ ả ự ệ ỏ ữ ữ ế ử
d ng kháng th phát hi n và kháng th b t khác nhau. Vi c s d ng cùng m t kháng th b t và phátụ ể ệ ể ắ ệ ử ụ ộ ể ắ
hi n có th d n đ n v n đ khi có gi i h n v v trí g n k t s n có cho s phát hi n. Kích th c vàệ ể ẫ ế ấ ề ớ ạ ề ị ắ ế ẵ ự ệ ướ
m i quan h không gian c a các epitope trên kháng nguyên đích là r t quan tr ng và có th nh h ngố ệ ủ ấ ọ ể ả ưở
m nh đ n th nghi m.ạ ế ử ệ
Sandwich ELISA có th đ c chia làm hai h th ng:ể ượ ệ ố
2.3.1 Sandwich ELISA tr c ti pự ế
S đ 2.3: Ti n trình th c hi n ELISA Sandwich tr c ti pơ ồ ế ự ệ ự ế
- u đi m: Có th phát hi n s khác bi t nh gi a các kháng nguyên n u s d ng kháng th b t vàƯ ể ể ệ ự ệ ỏ ữ ế ử ụ ể ắ
kháng th phát hi n khác nhau.ể ệ
- Vì ph ng pháp này có u đi m h n h n nh ng ph ng pháp khác mà chúng tôi ch n ph ng phápươ ư ể ơ ẳ ữ ươ ọ ươ
này đ ch n đoán b nh virus đang nghiên c u.ể ẩ ệ ứ
Chú ý: n u s d ng kháng th b t và kháng th phát hi n gi ng nhau có th d n đ n v n đ n u cóế ử ụ ể ắ ể ệ ố ể ẫ ế ấ ề ế
s gi i h n v trí k t h p s n có đ phát hi n. M i quan h v kích th c và v trí không gian c a cácự ớ ạ ị ế ợ ẵ ể ệ ố ệ ề ướ ị ủ
epitope cũng có nh h ng đ n th nghi m.ả ưở ế ử ệ
2.3.2 Sandwich ELISA gián ti pế
S đ 2.4: Ti n trình th c hi n ph n ng ELISA Sandwich gián ti pơ ồ ế ự ệ ả ứ ế
Chuyên bi t h n Direct sanwich ELISA do antispecies kháng th đ c g n enzyme không ph n ngệ ơ ể ượ ắ ả ứ
v i kháng th b t kháng nguyên.ớ ể ắ
2.4. Ph n ng c ch /c nh tranhả ứ ứ ế ạ
Ph n ng c nh tranh mang nghĩa là hai ch t tham gia ph n ng cùng ái l c b t c p v i ch t th ba.ả ứ ạ ấ ả ứ ự ắ ặ ớ ấ ứ
Ph n ng c nh tranh đúng đ n thì hai ch t c nh tranh ph i đ c đ a vào đ ng th i.ả ứ ạ ắ ấ ạ ả ượ ư ồ ờ
S khác bi t gi a c ch và c nh tranh. C hai ph n ng đ u có s tham gia c a hai kháng th ph nự ệ ữ ứ ế ạ ả ả ứ ề ự ủ ể ả
ng v i kháng nguyên. N u m t kháng th đ c tr c ph n ng đó đ c g i là c ch (blocking/ứ ớ ế ộ ể ượ ủ ướ ả ứ ượ ọ ứ ế
inhibition assays). Ph n ng c nh tranh mang nghĩa c hai kháng th đ c thêm vàođ ng th i v iả ứ ạ ả ể ượ ồ ờ ớ
nhau (hình 1).
