TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 542 - THÁNG 9 - SỐ CHUYÊN ĐỀ - 2024
97
ỨNG DỤNG VI SINH LÂM SÀNG HIỆN ĐẠI TRONG THỜI ĐẠI GENOMIC
Phạm Hng Vân1,2, Phạm Thiên Hương1,2,3, Nguyễn Việt Quốc1,2,3,
Nguyễn Quốc Việt1,2,3, Lê Thị Kiều Thảo1,2,3, Nguyễn Thị Hạnh Thảo1,2,3,
Hà Duy Quang1,2,3, Trần Thị Hồng Như1,2,3,
Phạm Hồng Anh1,2,3, Trần Khánh Duy1,2,3
TÓM TẮT12
Để phát hiện các tác nhân vi sinh gây nhiễm
trùng trên bệnh nhân, có thể sử dụng nhiều
phương pháp xét nghiệm vi sinh lâm sàng khác
nhau, bao gồm khảo sát trực tiếp, nuôi cấy, huyết
thanh học tìm kháng thể hay và hóa miễn dịch
tìm kháng nguyên đặc hiệu các tác nhân vi sinh
gây bệnh. Tuy nhiên, phải thừa nhận là những
phương pháp vi sinh truyền thống này cũng có
khá nhiều hạn chế khó khắc phục do vậy mà các
tác nhân vi sinh phát hiện được chỉ như bề nổi
của tảng băng trong khi đa số nằm trong phần
chìm của tảng băng lại không thể phát hiện được.
Do đó, việc ứng dụng công nghệ Multiplex real-
time PCR (MPL-rPCR) trong xét nghiệm vi sinh
lâm sàng thường quy là cần thiết nhờ độ nhạy và
độ đặc hiệu của công nghệ này trong xét nghiệm
là tuyệt đối cao, khắc phục hầu như được các trở
ngại mà các phương pháp xét nghiệm vi sinh lâm
sàng thường qui gặp phải. Tuy nhiên để công
nghệ này có thể dễ dàng được áp dụng trong các
phòng thí nghiệm lâm sàng thì phải đáp ứng
được tính khả thi về cả hai mặt kỹ thuật và cả
kinh phí. Muốn vậy thì công nghệ này phải được
1Liên Chi Hội Vi sinh Lâm sàng Thành phố Hồ
Chí Minh
2Viện nghiên cứu và phát triển Vi sinh Lâm sàng
Việt Nam
3Công ty Nam Khoa
Chịu trách nhiệm chính: Phạm Hùng Vân
Email: phhvan.nkbiotek@gmail.com
Ngày nhận bài: 13/6/2024
Ngày duyệt bài: 5/8/2024
làm chủ trong nước và phải được triển khai áp
dụng trên hệ thống mở để không bị lệ thuộc vào
nguồn cung sinh phẩm từ nước ngoài vốn dĩ rất
mắc tiền và cũng không bao phủ được đầy đủ các
tác nhân vi sinh cần được phát hiện. Trong thời
đại genomic hiện nay thì dữ liệu gene của hầu hết
các tác nhân vi sinh gây bệnh đều có sẵn trong
ngân hàng dữ liệu gen, chính nhờ vậy mà Viện
Nghiên cứu và Phát triển Vi sinh Lâm sàng Việt
Nam (VCM), trước đây là Viện Nghiên cứu về
Gen và Miễn dịch Quốc tế, đã nghiên cứu và tự
thiết kế được các trình tự mồi và taqman probe
để phát hiện các tác nhân vi sinh gây bệnh mà
không cần thiết phải bị phụ thuộc vào các bộ xét
nghiệm thương mại của nước ngoài. Không chỉ
vậy, VCM còn làm chủ được công nghệ sản xuất
các hạt nano từ bọc silica (có tên là MAGBEAD)
để làm cơ sở chế tạo được bộ kit tách chiết
nucleic acid (bao gồm cả DNA và RNA) từ các
mẫu bệnh phẩm khác nhau với chỉ một qui trình
trên các máy tách chiết tự động thuộc hệ thống
mở. Các sản phẩm này đã được đánh giá hiệu quả
qua các nghiên cứu trên các bệnh phẩm khác
nhau. Với các công nghệ thuộc các hệ thống mở
được làm chủ này, hiện nay xét nghiệm vi sinh
lâm sàng hiện đại dựa trên công nghệ MPL-rPCR
đã được triển khai áp dụng trên nhiều bệnh phẩm
khác nhau như đàm, máu, quệt mũi hầu, dịch não
tủy… và các kết quả đã giúp ích được nhiều
không chỉ cho các bác sĩ điều trị mà cả trong theo
dõi cũng như phát hiện các tác nhân vi sinh gây
bệnh có nguy cơ bùng phát dịch.
HỘI NGHỊ KHOA HỌC KỸ THUẬT - HỘI Y HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
98
SUMMARY
APPLICATION OF ADVANCED
CLINICAL MICROBIOLOGY IN THE
GENOMIC ERA
To detect microbial agents causing infection
in patients, many different clinical microbiology
testing methods can be used, including direct
examination, culture, serology for specific
antibodies or immune-chemistry for specific
antigens of the causing microbial agents.
However, it must be admitted that these
traditional microbiological methods also have
many limitations that are difficult to overcome,
so the detected microbial agents are only like the
detection of the tip of the iceberg while the
majority lie in the deep part of the ice sheet is
undetectable. Therefore, the application of
Multiplex real-time PCR (MPL-rPCR)
technology in routine clinical microbiology
testing is necessary because the sensitivity and
specificity of this technology in testing are
absolutely high, overcomes almost all the
obstacles that routine clinical microbiology
testing methods encounter. However, for this
technology to be easily applied in clinical
laboratories, it must meet both technical and
financial feasibility. To do so, this technology
must be mastered domestically and must be
deployed and applied on an open system so as
not to be dependent on the supply of biological
products from abroad, which is inherently very
expensive and does not fully cover all the
possible microbial pathogens need to be detected.
In the current genomic era, genetic data of most
pathogenic microorganisms are available in gen
banks, thanks to which the Vietnam Institute for
Clinical Microbiology Research and
Development (VCM), Formerly the International
Institute for Genetic and Immunological
Research, has researched and designed its own
primer sequences and taqman probes to detect
pathogenic microorganisms without having to
rely on the foreign commercial testing kits. Not
only that, VCM also masters the technology of
producing silica-coated magnetic nanoparticles
(named MAGBEAD) as a basis for
manufacturing nucleic acid extraction kits
(including DNA and RNA) from different
clinical samples on different automatic extraction
machines. These products have been evaluated
for effectiveness through studies on various
clinical specimens. With the technologies of
these mastered open systems, advanced clinical
microbiology testing based on MPL-rPCR
technology has now been deployed and applied
on many different specimens such as sputum,
blood, nasal swabs. pharynx, cerebrospinal
fluid... and the results have been of great help not
only to medical doctors but also in monitoring
and detecting pathogenic microbiological agents
at risk of outbreaks.
I. CÁC PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM VI SINH
LÂM SÀNG TRUYỀN THỐNG
Xét nghiệm vi sinh lâm sàng là xét
nghiệm mà kết quả phải trả lời cho lâm sàng
để dựa vào đó mà bác sĩ điều trị có thể điều
chỉnh được phác đồ kinh nghiệm nếu bệnh
nhân bị nhiễm trùng không cải thiện được về
mặt lâm sàng. Để có thể phát hiện được tác
nhân vi sinh gây nhiễm trùng thì một phòng
xét nghiệm vi sinh lâm sàng có thể sử dụng
các phương pháp vi sinh lâm sàng truyền
thống như sau:
(1) Khảo sát trực tiếp: Là xét nghiệm
phát hiện trực tiếp tác nhân vi sinh gây bệnh
qua quan sát trực tiếp dưới kính hiển vi phết
nhuộm hay soi tươi được làm từ mẫu bệnh
phẩm. Xét nghiệm này có ưu điểm là cho
được kết quả nhanh, nhưng độ nhạy của xét
nghiệm không cao cũng như độ đặc hiệu
cũng thấp vì trong đa số các trường hợp là
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 542 - THÁNG 9 - SỐ CHUYÊN ĐỀ - 2024
99
không thể xác định được một cách chính xác
tác nhân gây bệnh qua hình dạng quan sát
được.
(2) Nuôi cấy: Là xét nghiệm phân lập tác
nhân vi sinh gây bệnh từ mẫu bệnh phẩm
bằng phương pháp nuôi cấy. Xét nghiệm này
có ưu điểm là định danh được tác nhân gây
bệnh đã phân lập được đồng thời xác định
được tính nhạy cảm hay đề kháng đối với
kháng sinh (hay kháng nấm nếu tác nhân
phân lập được là vi nấm). Tuy nhiên nuôi cấy
cũng gặp phải khá nhiều hạn chế: (i) Trước
hết là có nhiều tác nhân vi sinh gây bệnh
nằm ngoài khả năng nuôi cấy của các phòng
xét nhiệm vi sinh lâm sàng như các tác nhân
virus hay vi khuẩn không điển hình. (ii)
Không chỉ vậy, với các tác nhân nuôi cấy
được nhưng nếu phòng xét nghiệm không
trang bị được các môi trường hay phương
tiện thích hợp thì cũng khó nuôi cấy được (ví
dụ nếu thiếu môi trường thạch nâu giàu XV
thì không thể nuôi cấy phân lập được tác
nhân H. influenzae từ các mẫu đàm) hay cho
dù có nuôi cấy được cũng không thể xác định
được tác nhân phân lập được có phải là tác
nhân gây bệnh không (ví dụ phân lập được E.
coli từ mẫu phân bệnh nhân bị tiêu chảy cũng
không thể xác định có phải là E. coli gây tiêu
chảy hay E. coli không gây tiêu chảy nếu
không có phương tiện phân biệt được hai
nhóm tác nhân này). (iii) Độ nhạy của nuôi
cấy cũng có thể không cao nếu các bệnh
phẩm không được cấy ngay, hay không được
bảo quản/vận chuyển thích hợp, hay được lấy
ở những bệnh nhân đã dùng kháng sinh
trước. (iv) Độ đặc hiệu của nuôi cấy cũng có
thể thấp nếu các bệnh phẩm là các bệnh
phẩm vốn dĩ bị tạp nhiễm (như mẫu phân,
đàm, dịch âm đạo…), hay bị tạp nhiễm trong
quá trình lấy mẫu hay quá trình làm xét
nghiệm nuôi cấy, mà phòng xét nghiệm
không có được giải pháp phân biệt được tác
nhân phân lập được là tác nhân tạp nhiễm
hay tác nhân gây bệnh.
(3) Huyết thanh học: Là xét nghiệm
phát hiện các kháng thể trong huyết thanh
bệnh nhân đặc hiệu tác nhân vi sinh gây bệnh
nhiễm trùng. Đây là xét nghiệm gián tiếp
phát hiện tác nhân gây bệnh chứ không phải
trực tiếp như khảo sát trực tiếp hay nuôi cấy
do vậy mà có những hạn chế khó có thể khắc
phục được. (i) Trước hết là kháng thể phát
hiện được nếu là thuộc lớp IgG thì trong đa
số các trường hợp không thể phân biệt được
bệnh nhân đang bị nhiễm trùng (ngoại trừ
trường hợp nhiễm HCV hay HIV) hay là
kháng thể tồn tại được từ các nhiễm trùng
trước đó vì IgG là một loại kháng thể có khả
năng tồn tại rất lâu trong huyết thanh bệnh
nhân cho dù nhiễm trùng đã qua rồi. Do vậy
để có thể xác định bệnh nhân đang bị nhiễm
trùng thì tốt nhất là phải thực hiện xét
nghiệm trên huyết thanh kép, lấy từ bệnh
nhân 2 lần cách nhau 14 ngày để xác định
được động học của kháng thể, tức là hiệu giá
kháng thể của lần sau phải cao hơn lần trước.
Tuy nhiên nếu phải làm huyết thanh kép thì
xét nghiệm sẽ mất tính hữu dụng lâm sàng,
nghĩa là kết quả xét nghiệm không có ý nghĩa
giúp lâm sàng trong quá trình điều trị cho
bệnh nhân vì quá trễ. (ii) Nếu kháng thể phát
hiện được là thuộc lớp IgM thì có thể xác
định được bệnh nhân đang bị nhiễm trùng do
lớp kháng thể này chỉ tồn tại khi có sự hiện
diện tác nhân nhiễm trùng và sẽ biến mất khi
tác nhân không còn (IgM chỉ được sản xuất
từ các tế bào miễn dịch không nhớ và tồn tại
rất ngắn). Tuy nhiên độ nhạy và độ đặc hiệu
của các xét nghiệm này lại bị phụ thuộc rất
nhiều vào chất lượng kit xét nghiệm mà đa
số là không cao vì giá trị cắt (cut-off) để
HỘI NGHỊ KHOA HỌC KỸ THUẬT - HỘI Y HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
100
phân biệt có nhiễm hay không nhiễm thường
không rõ.
(4) Hóa miễn dịch: Là xét nghiệm phát
hiện kháng nguyên của vi sinh vật gây bệnh
có trong mẫu bệnh phẩm lấy từ bệnh nhân bị
nhiễm trùng. Có nhiều giải pháp thực hiện
được xét nghiệm này dựa và các kỹ thuật như
miễn dịch men tóm bắt kháng nguyên
(Antigen capture ELISA), nhuộm miễn dịch
hỳnh quang trực tiếp (direct immuno-
fluorestcent staining). Các xét nghiệm này có
giá trị gần như trực tiếp phát hiện được tác
nhân gây bệnh có mặt trong bệnh phẩm.
Không chỉ vậy với phương pháp sắc ký miễn
dịch thì xét nghiệm này còn có thể thực hiện
được tại các điểm khám hay chăm sóc bệnh
nhân với kết quả có thể nhanh chỉ trong vòng
không quá 15 phút kể từ khi lấy bệnh phẩm.
Tuy nhiên hạn chế lớn của xét nghiệm hóa
miễn dịch là phổ phát hiện được các tác nhân
là không nhiều vì để có được bộ kit thực hiện
xét nghiệm thì sinh phẩm cơ bản phải có
chính là kháng thể đặc hiệu tác nhân gây
bệnh cần phát hiện mà hiện nay chỉ có một ít
tác nhân là có được sinh phẩm như vậy. Lý
do là các sinh phẩm này không thể được tổng
hợp trong ống nghiệm mà phải từ các tế bào
miễn dịch tạo được kháng thể qua các kết
quả nghiên cứu và thử nghiệm rất là công
phu. Do vậy mà hạn chế này mà xét nghiệm
hóa miễn dịch phát hiện các tác nhân vi sinh
gây bệnh là còn rất ít, không đủ bao phủ
được các tác nhân cần phát hiện. Ngoài ra
một số xét nghiệm có thể có độ nhạy cao
nhưng độ đặc hiệu không cao do vậy mà chỉ
có giá trị sàng lọc, một số xét nghiệm có độ
đặc hiệu cao mà độ nhạy không cao do vậy
mà chỉ có thể phát hiện được những trường
hợp mà số lượng kháng nguyên của tác nhân
gây bệnh hiện diện nhiều trong bệnh phẩm.
II. VI SINH LÂM SÀNG HIỆN ĐẠI TRONG XÉT
NGHIỆM VI SINH LÂM SÀNG TRUYỀN
THỐNG
Trong xét nghiệm nuôi cấy thì nhờ sự
tiến bộ về công nghệ liên quan đến định danh
cũng như kháng sinh đồ mà hiện nay hai
bước này trong xét nghiệm nuôi cấy là có thể
thực hiện được bằng các thiết bị tự động hệ
thống kín tức là phải sử dụng kèm các sinh
phẩm kit tương ứng với thiết bị. Tuy nhiên
buớc cơ bản là thao tác nuôi cấy để phân lập
được tác nhân gây bệnh từ bệnh phẩm thì
không thể thực hiện tự động được mà phải
dựa vào kỹ năng và kiến thức của chính
người làm xét nghiệm để chọn được qui trình
thích hợp, chọn các môi trường thích hợp, và
chọn được đúng tác nhân vi sinh phân lập
được trên hộp thạch nuôi cấy rồi mới có thể
đưa vào thực hiện định danh và kháng sinh
đồ tự động. Do vậy việc trang bị các thiết bị
như định danh/kháng sinh đồ tự động, hay
thiết bị định danh nhanh (Maldi-tof) chỉ giúp
các phòng xét nghiệm giảm đi các thao tác
thủ công trong các khâu này chứ không mở
rộng thêm được phổ phát hiện các tác nhân
vi sinh gây bệnh mà qui trình xét nghiệm
nuôi cấy thủ công đã không thể phát hiện
được. Với các xét nghiệm huyết thanh học và
hóa miễn dịch trong xét nghiệm vi sinh
truyền thống thì hiện nay các phòng xét
nghiệm vi sinh lâm sàng cũng có thể trang bị
được các phương tiện thực hiện xét nghiệm
một cách tự động, nhưng cũng như xét
nghiệm nuôi cấy truyền thống, vẫn không thể
mở rộng thêm khả năng phát hiện được phổ
các tác nhân vi sinh gây bệnh như mong
muốn. Chính vì vậy mà chúng ta có thể hình
dung rằng các tác nhân vi sinh gây bệnh mà
các phương pháp vi sinh truyền thống phát
hiện được, kể cả các phương pháp huyết
thanh và hóa miễn dịch, chỉ là bề nổi của
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 542 - THÁNG 9 - SỐ CHUYÊN ĐỀ - 2024
101
khối băng trong khi rất nhiều các tác nhân vi
sinh không phát hiện được lại nằm chính
trong phần chìm của tảng băng.
III. ỨNG DỤNG VI SINH LÂM SÀNG HIỆN ĐẠI
TRONG THỜI ĐẠI GENOMIC
Hiện nay chúng ta đang bước vào thời
đại genomic là thời đại mà các thông tin về
bộ gen của các sinh vật từ virus, vi khuẩn, vi
nấm, ký sinh trùng, thực vật, động vật và cả
con người đều đã được khám phá và các dữ
liệu thông tin này đều được lưu trữ trong các
ngân hàng dữ liệu gen. Chính nhờ vậy mà
các xét nghiệm vi sinh lâm sàng hiện đại
ngày nay đã được bổ sung thêm các xét
nghiệm sinh học phân tử, đó là những xét
nghiệm phát hiện trình tự nucleic acid (DNA
hay RNA) đặc hiệu của các tác nhân vi sinh
gây bệnh có mặt trong bệnh phẩm lấy từ
bệnh nhân bị nhiễm trùng. Có nhiều phương
pháp đã và đang được triển khai áp dụng
trong các phòng xét nghiệm vi sinh lâm sàng,
đó là:
(1) Phương pháp lai tại chỗ (in-situ
hybridization): Là phương pháp sử dụng
những đoạn dò (probe), là những đoạn DNA
sợi đơn được đánh dấu để phát hiện tác nhân
vi sinh muốn tìm trong bệnh phẩm nhờ bắt
cặp và lai đặc hiệu với trình tự DNA của tác
nhân này. Phương pháp lai tại chỗ có độ
nhạy tương tự như phương pháp nhuộm miễn
dịch huỳnh quang trực tiếp và tùy thuộc vào
sự hiện diện nhiều hay ít của tác nhân vi sinh
muốn tìm trong bệnh phẩm. Do vậy phương
pháp lai tại chỗ thường được áp dụng để phát
hiện các tác nhân vi sinh hiện diện nhiều
trong bệnh phẩm mà không thể nuôi cấy
được, như phát hiện HPV16 hay HPV18
trong các mẫu mô sinh thiết.
(2) Phương pháp PCR (Polymerase
Chain Reaction): Là phương pháp sử dụng
những chu kỳ nhiệt để khuếch đại trình tự
DNA đặc hiệu của tác nhân vi sinh muốn tìm
thành hàng triệu đến hàng tỉ bản sao rồi sau
đó phát hiện các sản phẩm khuếch đại này.
Chính dựa trên nguyên tắc “khuếch đại rồi
mới phát hiện” nên PCR đạt được độ nhạy
cực kỳ cao mà không có phương pháp nào
sánh được. Không chỉ đạt độ nhạy lý tưởng,
PCR còn đạt được độ đặc hiệu không khác gì
nuôi cấy. Độ đặc hiệu có được như vậy là
nhờ PCR chỉ khuếch đại những trình tự đặc
hiệu có trong mẫu thử. Sự khuếch đại đặc
hiệu này đảm bảo được là nhờ PCR phải sử
dụng những đoạn mồi đặc hiệu cho trình tự
muốn tìm. Không chỉ vậy, sản phẩm khuếch
đại sau khi hoàn tất PCR cũng phải được xác
định có đúng là từ DNA của vi sinh vật đích
muốn tìm hay không dựa vào sự kiểm tra
trình tự hay kích thước của sản phẩm có phù
hợp hay không. PCR đã mở đường cho một
cuộc cách mạng trong phát triển xét nghiệm
sinh học phân tử để phát hiện các tác nhân vi
sinh muốn tìm trong các bệnh phẩm chính là
nhờ độ nhạy cao và đồng thời lại đặc hiệu
không khác gì nuôi cấy.
(3) Phương pháp real-time PCR: Cũng
hoạt động dựa trên nguyên tắc của phương
pháp PCR nhưng khắc phục được hạn chế
của phương pháp PCR khi đưa vào áp dụng
trong các xét nghiệm vi sinh lâm sàng, đó là:
(i) Với phương pháp real-time PCR thì
không cần phải thực hiện giai đoạn phát hiện
và kiểm tra sản phẩm khuếch đại sau khi
thực hiện PCR như phương pháp PCR kinh
điển ở trên do giai đoạn này được thực hiện
ngay trong quá trình PCR và hiển thị qua
đường biểu diễn khuếch đại của sản phẩm
PCR. Chính nhờ vậy, real-time PCR đã khắc
phục được nguy cơ ngoại nhiễm sản phẩm
khuếch đại mà phương pháp PCR kinh điển
thường hay gặp phải khi triển khai áp dụng