intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE
 » 
 » 

Khảo sát trực tiếp

Chia sẻ: PHAM TRONG | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:0

Thêm vào BST
Báo xấu
75
lượt xem 7
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Tài liệu Khảo sát trực tiếp thuộc giáo trình Các kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau nhằm: sử dụng hiệu quả các phương tiện khảo sát trực tiếp trong xét nghiệm vi sinh lâm sàng các mẫu bệnh phẩm khác nhau.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Khảo sát trực tiếp

  1. Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau KHAÛO SAÙT TRÖÏC TIEÁP Muïc tieâu · Söû duïng coù hieäu quaû phöông tieän khaûo saùt tröïc tieáp trong xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc maãu beänh phaåm khaùc nhau nhôø bieát ñöôïc caùc loaïi khaûo saùt tröïc tieáp coù theå thöïc hieän ñöôïc taïi caùc phoøng thí nghieäm laâm saøng vaø coâng duïng cuûa töøng loaïi, nhôø vaäy coù theå . · Phuùc trình ñöôïc caùc keát quaû khaûo saùt tröïc tieáp vaø ñoàng thôøi tham vaán ñöôïc cho laâm saøng caùc yù nghóa höõu duïng laâm saøng maø keát quaû khaûo saùt tröïc tieáp nhôø bieát ñöôïc vai troø vaø yù nghóa cuûa khaûo saùt tröïc tieáp trong xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng. · Traùnh ñöôïc caùc tröôøng hôïp phaûi laøm khaûo saùt tröïc tieáp moät caùch voâ ích – thaäm chí coøn cho caùc thoâng tin sai laïc ñeán laâm saøng, vaø khoâng boû soùt caùc tröôøng hôïp caàn thieát phaûi laøm khaûo saùt tröïc tieáp vì caùc yù nghóa höõu duïng maø keát quaû khaûo saùt tröïc tieáp mang laïi cho laâm saøng vì bieát ñöôïc caùc tröôøng hôïp beänh phaåm naøo caàn phaûi laøm khaûo saùt tröïc tieáp, caùc tröôøng hôïp beänh phaåm naøo khoâng thaät söï caàn khaûo saùt tröïc tieáp. Caùc phöông phaùp khaûo saùt tröïc tieáp 1. Soi töôi Ö Qua kính hieån vi thöôøng ­ Soi töôi khoâng caàn neàn, laø phöông phaùp soi töôi qua kính hieån vi ñoùng bôùt tuï quang, vôùi beänh phaåm ñöôïc ñaët trong moät gioït nöôùc muoái sinh lyù treân moät lame kính, treo hay eùp döôùi moät lamelle. Phöông phaùp naày duøng ñeå xem söï di ñoäng cuûa vi khuaån. ­ Soi töôi caàn neàn, laø phöông phaùp soi töôi qua kính hieån vi ñoùng bôùt tuï quang vôùi beänh phaåm ñöôïc ñaët trong moät gioït dung dòch maøu laøm neàn nhö dung dòch möïc taøu; nigrosin; methylene blue, treân moät lame kính, eùp döôùi moät lamelle. Phöông phaùp naày duøng xem nang vi khuaån, hay tìm naám men coù trong beänh phaåm nhö Cryptococcus neoformans trong dòch naõo tuyû. 119
  2. Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau Ö Qua kính hieån vi neàn ñen hay ñaûo phase ­ Qua kính hieån vi neàn ñen, muïc ñích thoâng thöôøng nhaát laø xem hình daïng vaø söï di ñoäng cuûa vi khuaån coù trong moät beänh phaåm ñaët trong moät gioït nöôùc muoái sinh lyù treân moät lame kính eùp döôùi moät lamelle. Phöông phaùp naøy ñöôïc duøng ñeå tìm xoaén khuaån giang mai, vi khuaån leptospira, hay khaûo saùt söï di ñoäng vi khuaån. ­ Qua kính hieån vi ñaûo phase, muïc ñích thoâng thöôøng nhaát laø xem nang vi khuaån nhö laø S. pneumoniae, hay tìm naám men coù trong beänh phaåm nhö Cryptococcus neoformans trong dòch naõo tuyû. 2. Nhuoäm Ö Nhuoäm Gram, laø phöông phaùp nhuoäm thoâng thöôøng nhaát trong caùc phoøng thí nghieäm vi sinh. Phöông phaùp nhuoäm Gram cho pheùp xaùc ñònh ñöôïc hình daïng, caùch saép xeáp, vaø phaân bieät vi khuaån laø thuoäc loaïi Gram [+] hay Gram [-]. Ö Nhuoäm ñôn Methylene blue kieàm, laø phöông phaùp hay ñöôïc duøng ñeå nhuoäm khaûo saùt coù söï hieän dieän cuûa vi khuaån Corynebacteria hay khoâng vì phöông phaùp naày cho pheùp nhuoäm vi khuaån vaø caùc haït bieán saéc coù trong vi khuaån. Ö Nhuoäm khaùng acid, laø phöông phaùp hay ñöôïc duøng ñeå nhuoäm vaø phaùt hieän caùc vi khuaån khaùng acid nhö caùc Mycobacteria. Ö Phöông phaùp nhuoäm huyønh quang, laø phöông phaùp nhuoäm vi khuaån baèng phaåm maøu huyønh quang, vaø chæ aùp duïng cho moät soá tröôøng hôïp nhö nhuoäm huyønh quang rhodamin pheát ñaøm tìm vi khuaån lao. Ö Phöông phaùp nhuoäm khaùng theå ñaëc hieäu ñaùnh daáu men hay ñaùnh daáu huyønh quang, laø caùc phöông phaùp phaùt hieän tröïc tieáp vi sinh vaät muoán tìm coù trong beänh phaåm nhôø khaùng theå ñaëc hieäu khaùng nguyeân vi sinh vaät ñöôïc ñaùnh daáu baèng men (phaùt hieän qua quan saùt baèng kính hieån vi thöôøng) hay baèng huyønh quang (phaùt hieän qua quan saùt baèng kính hieån vi huyønh quang) Ö Caùc phöông phaùp nhuoäm khaùc, nhö nhuoäm nang, flagella, spore…chæ ñöôïc duøng trong caùc tröôøng hôïp ñaëc bieät. 120
  3. Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau Vai troø vaø yù nghóa cuûa khaûo saùt tröïc tieáp 1. Cho keát quaû raát sôùm, gaàn nhö chung cuoäc Coù nhöõng keát quaû khaûo saùt tröïc tieáp giuùp baùc só laâm saøng vaø phoøng thí nghieäm nghó ngay ñeán taùc nhaân gaây beänh vôùi söï chính xaùc gaàn nhö 99%, ví duï: Ö Keát quaû khaûo saùt tröïc tieáp dòch naõo tuyû thaáy coù song caàu Gram [-]; nghó ngay ñeán taùc nhaân N. meningitidis, thaáy song caàu Gram [+] hình muõi giaùo; nghó ngay ñeán S. pneumoniae, hay thaáy tröïc khuaån Gram [-] nhoû; nghó ngay ñeán H. influenzae… Ö Keát quaû soi töôi muû nieäu ñaïo töø ñaøn oâng thaáy coù song caàu Gram [-]; nghó ngay ñeán taùc nhaân N. gonorrhoeae… Ö Keát quaû soi töôi dòch naõo tuyû thaáy coù naám men coù nang; nghó ngay ñeán taùc nhaân naám men C. neoformans… Ö Keát quaû khaûo saùt tröïc tieáp pheát queät coå töû cung phaùt hieän C. trachomatis baèng phöông phaùp nhuoäm khaùng theå huyønh quang ñaëc hieäu C. trachomatis döông tính laø ñuû ñeå keát kuaän beänh nhaân bò nhieãm vi khuaån naøy. Caùc keát quaû nhö treân raát coù giaù trò giuùp cho baùc só ñieàu trò choïn ñöôïc khaùng sinh ñieàu trò ban ñaàu, vaø giuùp phoøng thí nghieäm bieát ñöôïc höôùng phaân laäp; ñònh danh; vaø khaùng sinh ñoà trong xeùt nghieäm caáy vaø phaân laäp tieáp theo. 2. Cho keát quaû sôùm vaø gôïi yù Raát nhieàu keát quaû khaûo saùt tröïc tieáp, neáu bieát taän duïng, baùc só laâm saøng seõ coù höôùng ñieàu trò ban ñaàu cuõng nhö phoøng thí nghieäm coù höôùng phaân laäp vaø ñònh danh, ví duï: Ö Khaûo saùt tröïc tieáp nöôùc tieåu, thaáy coù 1 vi khuaån/quang tröôøng x100, coù theå nghó ngay laø beänh nhaân bò nhieãm truøng tieåu vaø coù theå choïn löïa khaùng sinh ñieàu trò böôùc ñaàu tuøy theo hình aûnh Gram cuûa vi khuaån hieän dieän trong maãu. Ö Khaûo saùt pheát nhuoäm Gram maãu muû, hay abcess, hình aûnh vi khuaån thaáy trong beänh phaåm qua pheát nhuoäm Gram gôïi yù ñöôïc taùc nhaân vi khuaån gaây beänh, nhôø ñoù baùc só laâm saøng seõ coù höôùng ñieàu trò ban ñaàu cuõng nhö phoøng thí nghieäm coù höôùng phaân laäp vaø ñònh danh…. 121
  4. Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau 3. Cho keát quaû ñaùnh giaù maãu coù tin caäy ñeå nuoâi caáy vaø phaân laäp hay khoâng, vaø cho keát quaû gôïi yù Ö Laøm moät pheát Gram maãu ñaøm, quan saùt ôû quang tröôøng x100, coù theå ñaùnh giaù maãu tin caäy hay khoâng ñeå coù theå tieáp tuïc thöïc hieän quaù trình nuoâi caáy phaân laäp Ö Cuõng qua pheát nhuoäm Gram maãu ñaøm, neáu maãu tin caäy, coù theå tieáp tuïc qua quang tröôøng x1.000 ñeå quan saùt hình aûnh Gram caùc vi khuaån hieän dieän, vaø keát quaû naày seõ raát coù giaù trò gôïi yù cho phoøng thí nghieäm höôùng phaân laäp vi khuaån gaây beänh, vaø baùc só seõ coù theå coù höôùng duøng khaùng sinh naøo trong ñieàu trò ban ñaàu. 4. Coù nhöõng tröôøng hôïp maãu khoâng caàn phaûi laøm khaûo saùt tröïc tieáp Ö Maãu quyeät hoïng, neáu khoâng coù yeâu caàu tìm vi khuaån baïch haàu thì khoâng caàn thieát phaûi laøm khaûo saùt tröïc tieáp vì khoâng coù söï khaùc bieät giöõa maãu khoâng beâänh vôùi maãu beänh. Ö Maãu phaân, neáu khoâng coù yeâu caàu tìm Campylobacter, V. cholerae thì khoâng caàn thieát phaûi laøm khaûo saùt tröïc tieáp. Caâu hoûi oân taäp 1. Cho bieát caùc phöông phaùp khaûo saùt tröïc tieáp vaø coâng duïng cuûa töøng phöông phaùp naøy? 2. Cho bieát vai troø vaø yù nghóa cuûa caùc keát quaû khaûo saùt tröïc tieáp ñoái vôùi laâm saøng? Neâu caùc ví duï cuï theå. 3. Cho bieát caùc tröôøng hôïp naøo khoâng nhaát thieát phaûi laøm khaûo saùt tröïc tieáp, vaø caùc tröôøng hôïp naøo baét buoäc phaûi laøm khaûo saùt tröïc tieáp tröôùc khi tieán haønh nuoâi caáy phaân laäp? Taïi sao? 122
  5. Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau A B C D Hình 34: Soi töôi nhieàu khi raát coù giaù trò trong xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng: (A) Moät pheát soi töôi dòch naõo tuyû trong gioït möïc taøu cho hình aûnh nhö vaäy raát coù giaù trò ñeå chaån ñoaùn vieâm maøng naõo do Cryptococcus neoformans. (B) Pheát soi töôi qua kính hieån vi neàn ñen gioït moâi tröôøng EMJH caáy maùu beänh nhaân cho keát nhö treân giuùp keát luaän maãu caáy coù vi khuaån Leptospira. (C) Phaûn öùng phoàng nang (quellung reaction) duøng ñònh type S. pneumoniae coù theå ñoïc keát quaû qua pheát soi töôi trong gioït nigrosin nhö treân. (D) Soi töôi moät gioït moâi tröôøng cuûa chai caáy maùu qua kính hieån vi ñaûo phase vôùi hình aûnh nhö treân giuùp sôùm nhaän bieát chai caáy maùu [+] tröïc khuaån. 123
  6. Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau NHUOÄM GRAM Muïc tieâu · Nhaän ñònh ñöôïc moät keát quaû nhuoäm Gram toát hay coù vaán ñeà veà maët kyõ thuaät nhôø bieát roõ nguyeân taéc cuûa phöông phaùp nhuoäm Gram. · Thöïc hieän ñöôïc toát kyõ thuaät nhuoäm Gram caùc maãu beänh phaåm khaùc nhau nhôø naém vöõng ñöôïc caùc böôùc thöïc haønh trong kyõ thuaät nhuoäm Gram. · Traùnh ñöôïc caùc yeáu toá kyõ thuaät laøm sai leäch keát quaû nhuoäm Gram vaø coù theå bieän luaän ñöôïc moät keát quaû nhuoäm Gram coù vaán ñeà veà maët kyõ thuaät nhôø bieát ñöôïc caùc yeáu toá kyõ thuaät aûnh höôûng leân keát quaû nhuoäm Gram. Nguyeân taéc Do söï khaùc bieät veà caáu truùc vaùch teá baøo neân trong quaù trình nhuoäm Gram, vi khuaån Gram [+] seõ giöõ ñöôïc phöùc hôïp tím Gentian-iode khoâng bò taåy maøu bôûi alcool, trong khi vi khuaån Gram [-] khoâng giöõ ñöôïc phöùc hôïp maøu naøy, do vaäy keát quaû sau khi nhuoäm laø vi khuaån Gram [+] vaãn giöõ ñöôïc maøu tím cuûa gentian, coøn vi khuaån Gram [-] aên maøu hoàng cuûa phaåm maøu safranin hay fuchsin. Boä thuoác nhuoäm Gram Ñeå nhuoäm Gram, caàn phaûi coù boä thuoác nhuoäm Gram goàm caùc loï thuoác thöû sau: · Loï thuoác nhuoäm Gram laø dung dòch tím gentian · Loï lugol laø dung dòch iode · Loï alcool 95% · Loï safranin chöùa dung dòch safranin Boä thuoác nhuoäm Gram ñöôïc chöùa trong caùc chai saãm maøu, naép vaën chaët, giöõ trong toái ôû nhieät ñoä phoøng. 124
  7. Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau Phöông phaùp thöïc hieän 1. Tröôùc heát laøm moät pheát raát moûng beänh phaåm hay vi khuaån treân lame kính, ñeå khoâ töï nhieân, roài sau ñoù gaén treân lame baèng caùch hô nhanh qua ngoïn löûa ñeøn coàn hay ñeøn bunsen 3 laàn. Löu yù laø chæ hô nheï treân ngoïn löûa ñeå lam chæ aám leân vöøa phaûi chöù khoâng laøm lame bò quaù noùng vì nhö vaäy seõ laøm bieán theå hình daïng vi khuaån. 2. Ñaët lame treân giaù nhuoäm, cho vaøi gioït thuoác nhuoäm Gram (crystal violet = tím gentian) phuû truøm leân pheát vi khuaån, ñeå yeân trong 1 phuùt. Sau ñoù caàm lame leân vaø röûa saïch maøu thöøa dính treân lame döôùi moät voøi nöôùc maùy chaûy raát nheï. 3. Ñaët lame trôû laïi treân giaù nhuoäm, cho tieáp vaøi gioït lugol (iode) phuû truøm tieáp leân pheát vi khuaån, ñeå yeân trong 1 phuùt. Sau ñoù caàm lame leân vaø röûa saïch lugol thöøa dính treân lame döôùi moät voøi nöôùc maùy chaûy raát nheï. 4. Taåy maøu baèng caùch nhoû leân goùc treân cuûa lame nhuoäm dung dòch alcool 95% cho ñeán khi gioït alcool rôøi khoûi lame saïch maøu. Sau ñoù caàm lame leân vaø röûa saïch alcool khoûi lame döôùi moät voøi nöôùc maùy chaûy raát nheï. 5. Ñeå laïi lame treân giaù nhuoäm roài phuû vaøi gioït safranine leân pheát nhuoäm, ñeå yeân 1 phuùt. Sau ñoù caàm lame leân vaø röûa saïch safranin thöøa dính treân lame döôùi moät voøi nöôùc maùy chaûy raát nheï. 6. Thaám khoâ lame baèng caùch eùp lame giöõa 2 tôø giaáy thaám. Ñeå khoâ lame hoaøn toaøn trong khoâng khí. Sau ñoù nhoû moät gioït daàu soi kính leân pheát nhuoäm vaø quan saùt qua kính hieån vi, tröôùc heát ôû vaät kính x10 ñeå tìm vuøng pheát beänh phaåm, sau ñoù xoay sang vaät kính ´100 (vaät kính daàu) ñeå quan saùt hình thaùi vaø caùch aên maøu cuûa vi khuaån. Ñoïc keát quaû Quan saùt pheát nhuoäm Gram qua kính hieån vi, döôùi vaät kính daàu, chuùng ta seõ thaáy vi khuaån Gram[+] aên maøu tím, coøn vi khuaån Gram[-] aên maøu hoàng. Khi traû lôøi moät keát quaû nhuoäm Gram, phaûi traû lôøi caùc chi tieát sau: Ö Hình daùng vi khuaån. Ö Caùch saép xeáp caùc vi khuaån. Ö Caùch aên maøu cuûa vi khuaån, töùc laø vi khuaån Gram [+] hay Gram [-]. 125
  8. Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau Caùc sai laàm coù theå gaëp trong phöông phaùp nhuoäm Gram 1. Coù nhöõng sai laàm trong phöông phaùp nhuoäm Gram laøm cho vi khuaån Gram [+] nhuoäm thaønh maøu hoàng cuûa vi khuaån Gram [-], ñoù laø: Ö Pheát vi khuaån ôû löùa caáy quaù gìa, treân 24 giôø, luùc ñoù caáu truùc vaùch vi khuaån khoâng coøn beàn chaët nhö caáu truùc vaùch vi khuaån Gram [+] löùa caáy treû, do vaäy maát khaû naêng ngaên caûn söï taåy maøu cuûa Alcool. Ö Dung dòch lugol khoâng coøn toát nöõa do ñaõ pha quaù laâu vaø ñaõ maát ñi iodine, coù theå nhaän bieát tröôøng hôïp naøy khi dung dòch lugol khoâng coøn saäm maøu nöõa. Ö Taåy maøu baèng alcool quaù laâu ñaõ laøm cho vi khuaån Gram [+] cuoái cuøng cuõng bò taåy maøu, hay duøng loän chai taåy maøu alcool acid cuûa phöông phaùp nhuoäm khaùng acid. 2. Coù nhöõng sai laàm trong phöông phaùp nhuoäm Gram laøm cho vi khuaån Gram [-] nhuoäm thaønh maøu tím cuûa vi khuaån Gram [+], ñoù laø: Ö Pheát vi khuaån quaù daøy laøm cho alcool khoâng theå taåy maøu toaøn boä vi khuaån trong pheát nhuoäm. Ö Taåy alcool trong thôøi gian quaù ngaén hay dung dòch alcool bò pha quaù loaõng laøm cho maøu Gram khoâng ñöôïc taåy khoûi teá baøo vi khuaån. 3. Ngoaøi ra coøn coù moät sai laàm kyõ thuaät nöõa maø chuùng ta thöôøng gaëp, ñoù laø sau khi phuû Gram, chuùng ta khoâng röûa saïch maøu thöøa treân lame do vaäy khi chuùng ta phuû lugol treân pheát nhuoän thì maøu Gram thöøa seõ bò tuûa laïi baùm treân beà maët pheát nhuoäm. Keát quaû khi nhìn qua kính hieån vi chuùng ta seõ thaáy raát nhieàu tinh theå maøu Gram baùm treân pheát nhuoäm laøm laàm töôûng hình aûnh vi naám. Caâu hoûi oân taäp 1. Cho bieát nguyeân taéc cuûa phöông phaùp nhuoäm Gram. 2. Phöông phaùp tieán haønh nhuoäm Gram nhö theá naøo? Keát quaû aên maøu cuûa vi khuaån sau moãi giai ñoaïn nhuoäm nhö theá naøo? 3. Cho bieát caùch traû lôøi keát quaû cuûa moät pheát nhuoäm Gram vi khuaån. 4. Cho bieát caùc sai laàm thöôøng gaëp trong phöông phaùp nhuoäm Gram vaø haäu quaû cuûa caùc sai laàm naøy. 126
  9. Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau 1a. Phuû thuoác nhuoäm 1b. Röûa saïch maøu Gram 2a. Phuû dung dòch lugol Gram trong 1’ baèng nöôùc maùy trong 1’ 2b. Röûa saïch lugol baèng 3a. Taåy maøu baèng alcool 3b. Röûa saïch alcool baèng nöôùc maùy cho ñeán khi gioït alcool nöôùc maùy rôi khoûi lam heát maøu 4a. Phuû thuoác nhuoäm 4b. Röûa saïch safranin 3b. Thaám khoâ lame giöõa safranin trong 1’ baèng nöôùc maùy hai tôø giaáy thaám Hình 35: Hình veõ moâ taû caùc giai ñoaïn tieán haønh cuûa phöông phaùp nhuoäm Gram Hình 36: Moät boä thuoác nhuoäm Gram ñaày ñuû Hình 37: Keát quaû nhuoäm Gram laø Gram [+] aên maøu tím, Gram [-] aên maøu hoàng 127
  10. Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau NHUOÄM METHYLENE BLUE KIEÀM Muïc tieâu · Söû duïng hieäu quaû phöông phaùp nhuoäm nhuoäm methylene blue kieàm, ñaëc bieät trong phaùt hieän vi khuaån Corynebacterium diphthriae trong caùc maãu queät haàu hoïng nhôø bieát ñöôïc nguyeân taéc vaø muïc ñích cuûa phöông phaùp nhuoäm naøy · Thöïc hieän ñöôïc toát kyõ thuaät nhuoäm ñôn naøy nhôø naém vöõng ñöôïc caùc böôùc thöïc haønh trong kyõ thuaät nhuoäm methylene blue kieàm. Nguyeân taéc Methylene blue khi ñöôïc laøm kieàm hoaù thì seõ nhuoäm ñöôïc caùc haït bieán saéc cuûa caùc tröïc khuaån Corynebacteria, ñaëc bieät laø tröïc khuaån baïch haàu. Do vaäy nhuoäm methylene blue kieàm ngoaøi muïc ñích duøng ñeå nhuoäm ñôn, nhuoäm neàn sau khi nhuoäm khaùng acid, coøn coù muïc ñích chính laø nhuoäm caùc pheát beänh phaåm queät haàu hoïng ñeå phaùt hieän Corynebacterium diphtheriae. Boä thuoác nhuoäm methylene blue kieàm Ñeå nhuoäm methylene blue kieàm, caàn coù chai thuoác nhuoäm methylene blue kieàm chöùa trong chai saãm maøu, naép vaën chaët, giöõ trong toái ôû nhieät ñoä phoøng. Phöông phaùp thöïc hieän 1. Tröôùc heát laøm moät pheát moûng beänh phaåm hay vi khuaån treân lame kính, ñeå khoâ töï nhieân, roài sau ñoù gaén treân lame baèng caùch hô nhanh qua ngoïn löûa ñeøn coàn hay ñeøn bunsen 3 laàn. Löu yù laø chæ hô nheï treân ngoïn löûa ñeå lame chæ aám leân vöøa phaûi chöù khoâng laøm lame bò quaù noùng vì nhö vaäy seõ laøm bieán theå hình daïng vi khuaån. 4. Ñaët lame treân giaù nhuoäm, cho vaøi gioït thuoác nhuoäm methylene blue kieàm phuû truøm leân pheát vi khuaån, ñeå yeân trong 1 phuùt. Sau ñoù caàm lame leân vaø röûa saïch maøu thöøa dính treân lame döôùi moät voøi nöôùc maùy chaûy raát nheï. 5. Thaám khoâ lame baèng caùch eùp lame giöõa 2 tôø giaáy thaám. Ñeå khoâ lame hoaøn toaøn trong khoâng khí. Sau ñoù nhoû moät gioït daàu soi kính leân pheát nhuoäm vaø quan saùt qua kính hieån 128
  11. Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau vi, tröôùc heát ôû vaät kính x10 ñeå tìm vuøng pheát beänh phaåm, sau ñoù xoay sang vaät kính ´100 (vaät kính daàu) ñeå quan saùt hình thaùi vaø caùch aên maøu cuûa vi khuaån. Ñoïc keát quaû Teá baøo vi khuaån baét maøu xanh bieån nhaït, caùc haït bieán saéc baét maøu tím ñen (xem Hình 21A). Hình 38: Moät chai nhöïa saãm maøu chöùa beân trong thuoác nhuoäm alkaline methylene blue 129
  12. Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau NHUOÄM KHAÙNG ACID Muïc tieâu · Traùnh caùc sai soùt kyõ thuaät neáu coù trong khi thöïc haønh nhuoäm khaùng acid nhôø bieát ñöôïc caùc nguyeân taéc cuûa phöông phaùp nhuoäm khaùng acid, bieát ñöôïc trong phöông phaùp nhuoäm khaùng acid, khaâu naøo laø quyeát ñònh ñöôïc tính chính xaùc cuûa keát quaû ñeå . · Thöïc hieän ñöôïc toát kyõ thuaät nhuoäm khaùng acid naøy nhôø naém vöõng ñöôïc caùc böôùc thöïc haønh trong kyõ thuaät nhuoäm naøy. · Bieän luaän ñöôïc keát quaû phöông phaùp nhuoäm khaùng acid ñaëc bieät khi pheát nhuoäm coù sô soùt xaõy ra nhôø bieát ñöôïc caùc sô soùt kyõ thuaät coù theå xaõy ra trong khi thöïc haønh phöông phaùp nhuoâm khaùng acid. Nguyeân taéc Do teá baøo vi khuaån khaùng acid coù lôùp voû saùp bao boïc neân khi ñaõ nhuoäm ñöôïc phöùc hôïp maøu carbolfuchsin, phöùc hôïp naøy seõ khoâng bò taåy maøu bôûi dung dòch taåy maøu maïnh (acid, alcool acid). Tuy nhieân ñeå phöùc hôïp maøu naøy coù theå thaám xuyeân qua lôùp voû saùp cuûa vi khuaån, coù hai caùch: (1) Ñun noùng pheát nhuoäm vôùi dung dòch maøu carbolfuchin, nhôø ñoù maø carbolfuchsin thaám qua lôùp voû saùp cuûa vi khuaån ñeå nhuoäm maøu vi khuaån; ñaây laø phöông phaùp nhuoäm noùng Ziehl Neelsen. (2) Phöông phaùp thöù hai laø phöông phaùp nhuoäm laïnh coøn goïi laø phöông phaùp Kinyoun, trong phöông phaùp naøy ngöôøi ta duøng dung dòch carbolfuchsin ñaäm ñaëc, nhôø vaäy khi phuû dung dòch maøu ñaäm ñaëc naøy leân pheát nhuoäm vôùi thôøi gian laâu, carbolfuchsin vaãn coù theå thaám qua lôùp voû saùp ñeå nhuoäm maøu vi khuaån. Boä thuoác nhuoäm khaùng acid Ñeå nhuoäm khaùng acid, caàn phaûi coù boä thuoác nhuoäm khaùng acid goàm caùc loï thuoác thöû sau: 1. Loï thuoác nhuoäm carbolfuchsin laø dung dòch basic fuchsin vôùi phenol, ñöôïc pha ñaäm ñaëc ñeå vaãn coù theå duøng cho phöông phaùp nhuoäm laïnh. 2. Loï alcool-acid vôùi alcool 70% vaø acid chlohydric 3%. 3. Loï methylene blue chöùa dung dòch maøu methylene blue. 130
  13. Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau Boä thuoác nhuoäm khaùng acid ñöôïc chöùa trong caùc chai saãm maøu, naép vaën chaët, giöõ trong toái ôû nhieät ñoä phoøng. Phöông phaùp thöïc hieän Phöông phaùp trình baøy sau ñaây laø phöông phaùp nhuoäm laïnh, vôùi caùc böôùc nhö sau: 1. Tröôùc heát laøm moät pheát moûng beänh phaåm hay vi khuaån treân lame kính, ñeå khoâ töï nhieân, roài sau ñoù gaén treân lame baèng caùch hô nhanh qua ngoïn löûa ñeøn coàn hay ñeøn bunsen 3 laàn. 6. Ñaët lame treân giaù nhuoäm, cho vaøi gioït thuoác nhuoäm carbolfuchsin phuû truøm leân pheát vi khuaån, ñeå yeân trong 5 phuùt. Sau ñoù caàm lame leân vaø röûa saïch maøu thöøa dính treân lame döôùi moät voøi nöôùc maùy chaûy raát nheï. 7. Taåy maøu baèng caùch nhoû treân goùc treân cuûa lame nhuoäm dung dòch alcool acid cho ñeán khi gioït alcool rôøi khoûi lame saïch maøu. Sau ñoù röûa saïch alcool acid khoûi lame döôùi moät voøi nöôùc maùy chaûy raát nheï. 8. Ñeå laïi lame treân giaù nhuoäm roài phuû vaøi gioït methylene blue leân pheát nhuoäm, ñeå yeân 1 phuùt. Sau ñoù caàm lame leân vaø röûa saïch methylene blue thöøa dính treân lame döôùi moät voøi nöôùc maùy chaûy raát nheï. 9. Thaám khoâ lame baèng caùch eùp lame giöõa 2 tôø giaáy thaám. Ñeå khoâ lame hoaøn toaøn trong khoâng khí. Sau ñoù nhoû moät gioït daàu soi kính leân pheát nhuoäm vaø quan saùt qua kính hieån vi, tröôùc heát ôû vaät kính x10 ñeå tìm vuøng pheát beänh phaåm, sau ñoù xoay sang vaät kính ´100 (vaät kính daàu) ñeå quan saùt tìm tröïc khuaån khaùng acid. Ñoïc keát quaû Quan saùt pheát nhuoäm khaùng acid qua kính hieån vi, döôùi vaät kính daàu, tröïc khuaån khaùng acid aên maøu ñoû caùnh sen, coøn vi khuaån thöôøng cuõng nhö caùc neàn khaùc nhö teá baøo bieåu moâ hay baïch caàu aên maøu xanh methylene blue. Khi traû lôøi moät keát quaû nhuoäm khaùng acid, khoâng ñöôïc keát luaän laø döông tính M. tuberculosis maø chæ traû lôøi coù hieän dieän tröïc khuaån khaùng acid. Rieâng ñoái vôùi maãu ñaøm, caàn quan saùt 3 doøng, moãi doøng quan saùt khoaûng 100 quang tröôøng (QT) daàu, ghi nhaän keát quaû theo baûng döôùi ñaây ñeå traû lôøi treân phieáu traû lôøi keát quaû: 131
  14. Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau Baûng 5: Caùch ghi keát quaû quan saùt pheát nhuoäm khaùng acid moät maãu ñaøm. Soá tröïc khuaån khaùng acid /soá quang tröôøng Caùch ghi keát quaû 1-2/300 QT (3 doøng) +/- 1-9/100 QT (1 doøng) 1+, soá trung bình/100 QT 1-9/10 QT 2+, soá trung bình/10 QT 1-9/1 QT 3+, soá trung bình/1QT >9/1 QT 4+, >9/QT Caùc sai laàm kyõ thuaät coù theå gaëp trong phöông phaùp nhuoäm khaùng acid 1. Pheát nhuoäm quaù daøy seõ laøm alcool acid khoâng theå taåy heát maøu carbolfuchsin, vì vaäy nhöõng tröïc khuaån khoâng khaùng acid vaãn aên maøu ñoû caùnh sen. Tuy nhieân coù theå phaân bieät ñöôïc ñaây khoâng phaûi laø vi khuaån khaùng acid khi quan saùt maøu vuøng nhaày hay teá baøo bieåu moâ hay baïch caàu chung quanh vaãn coøn maøu ñoû chöùng toû maøu khoâng bò taåy heát. Ngoaøi ra, tröïc khuaån khoâng coù hình daïng tieâu bieåu cuûa tröïc khuaån khaùng acid: maäp, khoâng maõnh khaûnh nhö tröïc khuaån khaùng acid thöïc söï. 2. Maøu carbolfuchsin bò caën, seõ ñoùng leân pheát nhuoäm laøm alcool acid khoâng theå taåy heát maøu vaø do vaäy vi khuaån thöôøng vaãn nhuoäm maøu ñoû caùnh sen nhö treân. Ñeå traùnh tính traïng naøy, phaûi thöôøng xuyeân loïc maøu qua giaáy loïc moãi khi kieåm tra nhoû maøu carbolfuchsin leân moät lame troáng thaáy coù caën sau khi ñoå boû carbolfuchsin khoûi lame. 3. Thôøi gian phuû maøu carbolfuchin quaù ngaén khoâng ñuû 5 phuùt, hay duøng carbolfuchsin pha cho phöông phaùp nhuoäm noùng ñeå nhuoäm laïnh, do vaäy tröïc khuaån khaùng acid khoâng baét ñöôïc maøu carbolfuchsin. Ñeå traùnh caùc sai laàm treân, neân nhuoäm kieåm tra chaát löôïng tröôùc moãi lot thuoác nhuoäm môùi pha vaø ñònh kyø moãi thaùng moät laàn ñoái vôùi lot thuoác nhuoäm ñang söû duïng. 132
  15. Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau Caâu hoûi oân taäp 1. Cho bieát nguyeân taéc cuûa phöông phaùp nhuoäm khaùng acid. 2. Coù maáy phöông phaùp tieán haønh nhuoäm khaùng acid? Phöông phaùp nhuoäm laïnh tieán haønh nhö theá naøo? Keát quaû aên maøu cuûa vi khuaån sau moãi giai ñoaïn nhuoäm? 3. Cho bieát caùch traû lôøi keát quaû cuûa moät pheát nhuoäm khaùng acid moät maãu ñaøm. 4. Cho bieát caùc sai laàm thöôøng gaëp trong phöông phaùp nhuoäm khaùng acid vaø haäu quaû cuûa caùc sai laàm naøy. Hình 39: Moät boä thuoác nhuoäm khaùng acid hoaøn chænh bao goàm moät chai carbol fuchsin, moät chai alcool acid, vaø moät chai methylene blue. A B C D Hình 40: Moät soá hình aûnh quan saùt qua kính hieån vi thaáy coù tröïc khuaån khaùng acid. (A) pheát nhuoäm khaùng acid laøm töø khuùm vi khuaån M. tuberculosis, (B) Maãu ñaøm taäp trung vaø thuaàn nhaát; (C) Maãu ñaøm thaáy nhieàu M. avium; (D) Maãu ñaøm khoâng taäp trung. 133
  16. Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau Saûn phaåm lieân quan SPUTAPREP Boä thuoác thöû thuaàn nhaát, loaïi tröø taïp nhieãm vaø taäp trung ñaøm Nguyeân taéc hoaït ñoäng Nhôø taùc duïng cuûa dung dòch kieàm coù chöùa N-Acetyl-L-Cysteine (NALC) maø caùc chaát nhaày coù trong ñaøm bò laøm tan hoaøn toaøn vaø ñoàng thôøi vi khuaån taïp nhieãm trong ñaøm cuõng bò pH kieàm ly giaûi. Sau ñoù, maãu ñaøm ñaõ thuaàn nhaát vaø loaïi tröø taïp nhieãm naøy ñöôïc trung hoaø laïi baèng ñeäm phosphate, vaø cuoái cuøng caën ñaøm ñöôïc taäp trung baèng ly taâm. Caën ñaøm naøy seõ taäp trung raát nhieàu Mycobacteria ñeå saün saøng cho nuoâi caáy, khaûo saùt tröïc tieáp, hay laøm ly trích DNA cho thöû nghieäm PCR. Trình baøy SPUTAPREP goàm caùc thaønh phaàn sau: 1. N-Acetyl-L-Cysteine (NALC) boät nguyeân chaát chöùa trong 5 tube Eppendorf nhoû, moãi tube chöùa NALC ñuû duøng cho xöû lyù 2 maãu ñaøm. 2. Dung dòch MUCOPREP coù sodium citrate vaø NaOH, 50ml chöùa trong loï naép vaën chaët. Löôïng dung dòch naày ñuû duøng cho xöû lyù 10 maãu ñaøm 3. Dung dòch ñeäm phosphate ñaäm ñaëc 10 laàn, 5ml, chöùa trong tube 5ml, naép vaën chaët. Boä thuoác thöû SPUTAPREP chöa duøng hay ngay sau khi duøng neân ñöôïc giöõ trong tuû laïnh 4oC cho ñeán ngaøy heát haïn ghi treân hoäp (2 naêm sau ngaøy saûn xuaát). Qui trình thuaàn nhaát, loaïi tröø ngoaïi nhieãm vaø taäp trung maãu ñaøm vôùi SPUTAPREP 1. Tröôùc heát, pha loaõng ñeäm phosphate 10X vôùi 45ml nöôùc caát voâ truøng ñeå coù 50ml ñeäm phosphate 1X. Giöõ ñeäm phosphate 1X naày trong moät loï saïch vaø tröõ trong tuû laïnh 4oC. 2. Ñeå xöû lyù maãu ñaøm, ñaàu tieân chuaån bò moät tube ly taâm 15ml naép vaën. Cho vaøo tube 10ml MUCOPREP vaø toaøn boä boät NALC töø 1 tube Eppendorf. Laéc nheï cho tan NALC trong MUCOPREP, chia 5ml dung dòch naày vaøo moät tube 15ml khaùc, nhö vaäy laø coù 2 tube, moãi 134
  17. Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau tube coù 5ml ñeå xöû lyù cho hai maãu ñaøm. Dung dòch NALC chæ duøng trong ngaøy, khoâng löu laïi cho ngaøy sau. 3. Cho toái ña 5ml ñaøm vaøo tube 15ml chöa 5ml NALC treân. Laéc ñeàu, hay vortex trong voøng vaøi phuùt cho tan hoaøn toaøn ñaøm. Sau ñoù cho theâm 5ml ñeäm phosphate moät laàn. Laéc nheï ñeå troän ñeàu. 4. Ly taâm vôùi moät maùy ly taâm baøn toác ñoä toái ña (4.000 RPM) trong 15 phuùt. Ñoå boû phaàn nöôùc noåi, chöøa khoaûng 0.5ml caën. Caën ñöôïc duøng laøm pheát nhuoäm khaùng acid, caáy vaøo moâi tröôøng caáy lao (Lownstein Jensen hay Bactec), hay ñeå ly trích DNA cho PCR lao. Hình 41: Hai boä thuoác thöû thuaàn nhaát, loaïi tröø taïp nhieãm vaø taäp trung ñaøm thöôøng duøng vaø caùc thaønh phaàn chính beân trong. Boä SPUTAPREP-LJ daønh cho xöû lyù maãu ñaøm caáy treân moâi tröôøng Loweinstein Jensen hay laøm PCR. Boä SPUTAPREP-OGW daønh cho xöû lyù maãu ñaøm caáy treân moâi tröôøng Ogawa. 135
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

THÔNG TIN
TRỢ GIÚP
HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG
Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2