TCVN T I Ê U C H U Ẩ N Q U Ố C G I A
TCVN 8683-6:2011
Xuất bản lần 1
GIỐNG VI SINH VẬT THÚ Y –
PHẦN 6: QUY TRÌNH GIỮ GIỐNG VI KHUẨN
NHIỆT THÁN VÔ ĐỘC CHỦNG 34 F2
Master seed of microorganisms for veterinary –
Part 6: The procedure for preservation of Bacillus anthracis 34 F2 strain, avirulent
HÀ NỘI 2011
TCVN 8683-6:2011
Lời nói đầu
TCVN 8683-6:2011 được chuyển đổi từ 10 TCN 261:1996 thành tiêu
chuẩn quốc gia theo quy định tại khoản 1 Điều 69 của Luật Tiêu chuẩn
và Quy chuẩn kỹ thuật và điểm a khoản 1 Điều 7 Nghị định số
127/2007/NĐ-CP ngày 01/8/2007 của Chính phủ quy định chi tiết thi
hành một số điều của Luật Tiêu chuẩn và Quy chuẩn kỹ thuật;
TCVN 8683-6:2011 do Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát
triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng
thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
3
TCVN 8683-6:2011
T I Ể U C H U Ẩ N Q U Ố C G I A TCVN 8683-6:2011
Giống vi sinh vật thú y –
Phần 6: Quy trình giữ giống vi khuẩn
nhiệt thán vô độc chủng 34 F2
Master seed of microorganisms for veterinary –
Part 6: The procedure for preservation of Bacillus anthracis 34 F2 strain, avirulent
CẢNH BÁO – Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao
tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên
quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an
toàn sức khỏe thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng
tiêu chuẩn.
1 Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này áp dụng cho việc giữ giống vi khuẩn Nhiệt thán, chủng 34 F2 được dùng để sản xuất
vắc xin nhiệt thán nha bào vô độc.
2 Tài liệu viện dẫn
Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi
năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì
áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).
TCVN 8684:2011, Vắc xin và chế phẩm sinh học dùng trong thú y – Phép thử độ thuần khiết.
3 Yêu cầu đối với giống vi sinh vật
3.1 Nhận dạng
Vi khuẩn được xác định qua tính chất nuôi cấy, hình thái, sinh hóa học và huyết thanh học.
3.2 Nuôi cấy
4
TCVN 8683-6:2011
Mọc tốt trong môi trường dinh dưỡng, môi trường vẫn trong, có các cụm nhỏ trắng như bông lơ lửng,
lắc thì phân tán đều và làm môi trường đục đều. Không mọc trong môi trường nước thịt gan yếm khí.
Mọc tốt trên thạch dinh dưỡng thành lớp dầy, trắng đục.
3.3 Hình thái vi khuẩn
Trong canh khuẩn từ 24 h đến 48 h ở 37 0C, vi khuẩn có hình gậy mập đầu vuông, Gram dương, có
nha bào, không có giáp mô, không di động.
Trên thạch dinh dưỡng 24 h, khuẩn lạc dạng R, rìa có nhiều răng cưa, đường kính khoảng 1 mm đến 3
mm.
3.4 Kiểm tra tính thuần khiết
Kiểm tra tính thuần khiết theo TCVN 8684:2011.
3.5 Kiểm tra tính độc
3.5.1 Chuẩn bị động vật
– 2 cừu mẫn cảm, khỏe mạnh, khoảng 1 năm tuổi.
– 2 dê mẫn cảm, khỏe mạnh, khoảng 1 năm tuổi.
– 2 thỏ mẫn cảm, khỏe mạnh, mỗi con có khối lượng từ 1,8 kg đến 2,0 kg.
– 2 con chuột lang khỏe mạnh, mỗi con có khối lượng từ 300 g đến 350 g.
3.4.2 Chuẩn bị giống vi khuẩn
Giống đông khô được hoàn nguyên bằng nước thịt dinh dưỡng. Ria lên thạch dinh dưỡng ủ ở 37 0C
trong 24 h. Chọn khuẩn lạc điển hình, cấy chuyển vào môi trường nước thịt dinh dưỡng, ủ ở 37 0C
trong 24 h. Đếm số và pha loãng đến các nồng độ cần tiêm cho các loại động vật.
3.4.3 Cách tiến hành
Tiêm theo đường dưới da cho cừu với liều 5 x 109 CFU/ml, cho dê với liều 1,5 x 108 CFU/ml, cho thỏ
với liều 5 x 107 CFU/ml và cho chuột lang với liều 5 x 107 CFU/ml đều không làm cho động vật phát
bệnh nhiệt thán.
3.5 Kiểm tra tính gây miễn dịch
3.5.1. Chuẩn bị động vật
Chuẩn bị 15 con chuột lang khỏe mạnh, mỗi con có khối lượng từ 300 g đến 350 g.
5
TCVN 8683-6:2011
3.5.2 Chuẩn bị giống vi khuẩn
Chọn khuẩn lạc điển hình, cấy vào môi trường nước thịt dinh dưỡng, ủ ở 37 0C trong 24 h. Đếm số và
pha loãng canh khuẩn đến nồng độ 5 x 106 CFU/ml.
3.5.3 Cách tiến hành
Tiêm cho 10 con chuột lang, liều 5 x 106 CFU/ml theo đường dưới da và 5 con chuột lang (không tiêm
vắc xin) dùng làm đối chứng.
Chuột miễn dịch phải sống ít nhất 90 %, chuột đối chứng chết 100 % khi được thử thách với liều 10
LD50 của chủng cường độc nhiệt nhán 17 JB.
4 Phương pháp truyền giống
4.1 Chuẩn bị môi trường
– Nước thịt dinh dưỡng
– Thạch dinh dưỡng
– Thuốc nhuộm Gram
– Huyết thanh ngựa
4.2 Chuẩn bị giống vi khuẩn
Giống được hoàn nguyên trở lại dung tích ban đầu bằng môi trường nước thịt dinh dưỡng, ủ ở 37 0C
trong 24 h. Ria cấy vi khuẩn từ canh khuẩn lên môi trường thạch dinh dưỡng, ủ ở 37 0C trong 24 h.
4.3 Cách tiến hành
Chọn khuẩn lạc điển hình cấy vào nước thịt dinh dưỡng ủ ở 37 0C trong 24 h.
Làm tiêu bản nhuộm Gram, kiểm tra tạp nhiễm vi khuẩn, nấm mốc và kiểm tra di động.
Ria canh khuẩn đã kiểm tra lên đĩa thạch dinh dưỡng (hoặc bình Roux), ủ ở 37 0C trong 72 h rồi để
nhiệt độ phòng trong 48 h đến 72 h chờ hình thành nha bào. Dùng nước sinh lý rửa mặt thạch, thu
hoạch huyễn dịch nha bào.
Kiểm tra thuần khiết huyễn dịch vừa thu hoạch theo TCVN 8684:2011.
Trộn huyễn dịch vi khuẩn với huyết thanh ngựa rồi đông khô.
6