Xây dựng kỹ thuậ t RT – PCR phát hiện viêm gan siêu vi C

Chia sẻ: Giang Duong Y Khoa | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:4

Thêm vào BST

Báo xấu

130
lượt xem 8
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Viêm gan siêu vi C là một trong những nguyên nhân gây xơ gan và ung thư gan. Quy trình kỹ thuật RT - PCR nhằm phát hiện xác định genotype HVC do chúng tôi xây dựng với mục đích giúp định hướng và theo dõi điều trị viêm gan siêu vi C

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Xây dựng kỹ thuậ t RT – PCR phát hiện viêm gan siêu vi C

X ây d ự ng k ỹ thu ậ t RT – PCR phát hi ệ n viêm gan siêu vi C đ ồ ng th ờ i đ ị nh g enotype HCV b ằ ng lai trên v ạ ch dò đ ặ c hi ệ u c ủ a thanh inoLIPA Hoàng Hi ế u Ng ọ c ( 1 ) , P h ạ m Hùng Vân ( 2 ) Tóm tắt Đặt vấn đề: Viêm gan siêu vi C là một trong những nguyên nhân gây xơ gan và ung thư gan (1-8 ). Qui trình kỹ thuật RT – PCR nhằm phát hiện, xác định genotype HCV do chúng tôi xây dựng với mục đích giúp định hướng và theo dõi điều trị viêm gan siêu vi C. Mục tiêu: Xây dựng kỹ thuật RT – PCR để phát hiện HCV đồng thời xác định kiểu gen của virus viêm gan C bằng kỹ thuật lai trên vạch dò đặc hiệu của thanh InoLipa của Bayers. Phương pháp nghiên cứu: Chúng tôi xây dựng kỹ thuật RT – PCR dùng mồi đặc hiệu cho vùng 5’ không mã hóa của bộ gen HCV có gắn biotin để phát hiện RNA HCV. Sau đó, những sản phẩm PCR này đ ược đ ịnh genotype bằng phương pháp lai trên vạch dò đặc hiệu INOLiPA do gắn sẵn chất đánh dấu biotin trước đó. 45 mẫu huyết thanh HCV (+) và 15 mẫu HCV (-) đã xác định bằng kỹ thuật RT – PCR thông th ường, l ấy trong thời gian từ 3/2005 đến 7/2005, được tiến hành thử nghiệm phát hiện RNA HCV bằng qui trình kỹ thuật mới cùng với kỹ thuật RT – PCR thông thường và kỹ thuật Nested PCR của Bayer. Những sản phẩm PCR có HCV (+) sẽ tiếp tục định genotype bằng phương pháp lai. Kết quả: Với mỗi qui trình PCR, chúng tôi đều thu được kết quả 45 mẫu HCV (+) và 15 mẫu HCV (-) nh ư ban đầu. Các mẫu HCV (+) từ kỹ thuật PCR thông thường không thể tiếp tục định genotype HCV vì không có chất đánh dấu biotin. Các mẫu HCV (+) từ kỹ thuật Nested PCR và kỹ thuật do chúng tôi xây dựng đ ều xác định được genotype và cho kết quả genotype giống như nhau. Kết luận: Qui trình kỹ thuật RT – PCR phát hiện RNA HCV bằng mồi có gắn biotin và định genotype HCV bằng phương pháp lai trên vạch do chúng tôi xây dựng và thử nghiệm đã thành công, cho kết quả chính xác như đối với kỹ thuật RT – PCR thông thường và Nested PCR. Abstracts Setting up the RT – PCR technique to detect hepatitis C virus and determine genotype HCV by hybrilizing PCR products on specific inoLIPA strip. Background: Hepatitis C virus is one of reasons that causes cirrhosis and hepatic cell carcinoma. The new RT – PCR technique is set up to detect HCV and determine its genotypes with the aim of orientating and following treatment of HCV. Objectives: Setting up RT – PCR technique to detect hepatitis C virus and determine genotype HCV by hybrilizing PCR products on specific Inolipa stripe. Method: The primers bound to biotin were designed specifically to 5’ noncoding region of HCV genome and detected RNA HCV by using RT – PCR. These PCR products then can be used to find HCV genotypes by hybridizing to immobilized probes on nitrocellulose stripes. 45 serum samples with HCV (+) and 15 serum samples with HCV (-), which had been known by ordinary RT – PCR, will be tested by new RT – PCR technique, ordinary RT - PCR and Nested PCR. Then PCR products with HCV (+) will be determined HCV genotypes. Results: From each process, we gather 45 positive samples with HCV and 15 negative samples as before. Positive HCV PCR products from ordinary RT – PCR can not be followed to find out HCV genotypes. Positive HCV PCR products from the last two processes can be used to determine HCV genotypes and results from them are the same. Conclusion: The new RT – PCR technique set up to detect HCV and determine its genotypes is success. The results from it are similar to from ordinary RT – PCR and Nested PCR. Đặt vấn đề ñònh ñieàu trò ñaëc hieäu cuõng nhö theo doõi ñöôïc hieäu quaû ñieàu trò Hieän nay, vieâm gan sieâu vi C laø thì vieäc xaùc ñònh kieåu gen HCV moät beänh lyù ñöôïc nhieàu nhaø trong maùu cuõng raát quan troïng. laâm saøng, dòch teã hoïc cuõng nhö Vieäc öùng duïng kyõ thuaät PCR trong nghieân cöùu y hoïc ñaëc bieät quan phaùt hieän nhöõng taùc nhaân vi sinh taâm. Nhöõng nghieân cöùu treân theá vaät ñaõ vaø ñang ñöôïc söû duïng ôû giôùi cho thaáy coù söï töông quan roõ Vieät Nam. Beân caïnh nhieàu giaù trò reät giöõa beänh gan maõn tính, xô lôïi ích hôn so vôùi caùc xeùt nghieäm gan vaø ung thö teá baøo gan vôùi huyeát thanh chaån ñoaùn, vaán ñeà (1-8) nhieãm HCV – thaäm chí coù lieân giaù caû cuûa kyõ thuaät naøy laïi laø quan ñeán töøng type HCV rieâng bieät *Tác giả Ngoaøiộ môn Hóa sinh, Khoa Y, Đại Học Y Dược oätHCM. 2Bộ Môn Vi Sinh, Khoa Y, Đại Học Y m TP. yeáu toá caàn ñöôïc quan taâm (9,10) . chính, B ra, ñeå coù ñöôïc chæ 1 Dược TP. HCM 1
caân nhaéc. Vì theá, chuùng toâi tieán naøy döïa treân nguyeân taéc duøng haønh xaây döïng moät qui trình kyõ moài OP khueách ñaïi moät ñoaïn daøi thuaät RT – PCR nhaèm phaùt hieän 300 bp. Sau ñoù duøng saûn phaåm vaø xaùc ñònh genotype HCV vôùi PCR khueách ñaïi baèng moài OP naøy mong muoán tìm hieåu ñoä tin caäy laøm khuoân ñeå chaïy qui trình vaø söï chính xaùc cuûa kyõ thuaät nested PCR vôùi moài NP ñeå cho saûn naøy treân nhöõng maãu beänh phaåm phaåm khueách ñaïi daøi #240 bp, so vôùi nhöõng qui trình khaùc hieän cuoái cuøng, saûn phaåm ñöôïc phaùt ñang ñöôïc söû duïng. Chuùng toâi hieän qua chaïy ñieän di treân thaïch cuõng ñaùnh giaù caùc lôïi ích veà agarose. Saûn phaåm nested PCR coù maët kinh teá cuûa kyõ thuaät naøy moät ñaàu gaén biotin do moài NP coù ñeå coù höôùng ñöa ra aùp duïng treân gaén biotin. Nhôø vaäy, saûn phaåm thöïc teá hieän nay taïi caùc phoøng thí PCR naøy seõ duøng ñeå xaùc ñònh nghieäm coù trang bò PCR. genotype baèng phöông phaùp lai treân vaïch doø ñaëc hieäu HCV – Vật liệu và phương pháp nghiên cứu INOLiPA. Caû hai laàn chaïy chöông trình PCR baèng maùy iCycler cuûa Maãu maùu beänh phaåm töø beänh BioRad ñeàu theo chu kyø nhieät nhö nhaân ñaõ ñöôïc chaån ñoaùn nhieãm sau: 94oC trong 1 phuùt; 94oC trong 15 HCV seõ ñöôïc taùch chieát huyeát giaây; 55oC trong 30 giaây; 72oC trong thanh. M aãu huy e á t tha n h khoâ n g 30 giaây; Laäp laïi 40 chu kyø; 72oC n hi e ã m HCV – laø nhöõng maãu löu trong 5 phuùt. (3) Qui trình PCR vôùi tröõ ôû -70oC taïi coâng ty Nam Khoa. moài gaén biotin: Ñaây laø qui trình PCR Caùc maãu naøy ñaõ ñöôïc xaùc ñònh do chuùng toâi nghieân cöùu trong ñoù RNA – HCV (-) qua kyõ thuaät RT – PCR chuùng toâi duøng moät caëp moài phaùt hieän HCV thöïc hieän taïi coâng ñaëc hieäu cho moät ñoaïn daøi #244 ty Nam Khoa. Tieán haønh l y trích bp taïi ñaàu 5’ khoâng maõ hoùa cuûa R NA töø nhöõng maãu huyeát thanh boä gen HCV. Moät trong hai ñaàu beänh nhaân HCV (+) vaø HCV (-) döïa ñöôïc chuùng toâi gaén chaát ñaùnh treân nguyeân taéc duøng Guanidine daáu biotin. Saûn phaåm ñöôïc chaïy 14M vaø urea vôùi phenol vaø caùc PCR ñeå khueách ñaïi, sau ñoù, coù chaát taåy khaùc ñeå laøm caùc chaát theå duøng ñeå xaùc ñònh ñöôïc gaây bieán tính protein nhôø ñoù ly genotype HCV baèng phöông phaùp lai trích ñöôïc RNA toaøn phaàn ra khoûi treân vaïch doø ñaëc hieäu cuûa HCV – DNA vaø protein. Thöïc hieän RT t oå n g INOLiPA. Chaïy chöông trình PCR baèng h ôïp cDNA töø nhöõng maãu RNA maùy iCycler cuûa haõng BioRad nhö ñöôïc ly trích vôùi nguyeân taéc sau: 1 chu kyø 40oC trong 10 phuùt; 1 phieân maõ ngöôïc toaøn boä RNA chu kyø 95oC trong 5 phuùt; 40 chu thaønh cDNA baèng moài ngaãu kyø 94oC trong 30 giaây; 60oC trong 30 nhieân. Giai ñoaïn naøy duøng kit giaây; 72oC trong 1 phuùt; 1 chu toång hôïp cDNA cuûa coâng ty Nam kyø72oC trong 10 phuùt; Toång thôøi Khoa vôùi chu kyø nhieät nhö sau: gian thöïc hieän phaûn öùng laø 2 giôø 25oC trong 5 phuùt; 42oC trong 30 10 phuùt. Phaùt hieän genotype HCV: phuùt; 85oC trong 5 phuùt; Thöïc hieän Phaùt hieän genotype HCV baèng PCR: Chuùng toâi thöïc hieän 3 qui phöông phaùp lai treân vaïch doø ñaëc trình ñoàng thôøi. (1) Qui trình PCR vaø hieäu cho genotype cuûa thanh HCV - moài bình thöôøng: Laø qui trình PCR söû INOLiPA. Nguyeân taéc kyõ thuaät laø: duïng boä kit RT – PCR phaùt hieän s aûn phaåm khueách ñaïi ñöôïc bieán HCV cuûa coâng ty Nam Khoa saûn tính thaønh nhöõng chuoãi DNA ñôn. xuaát. Qui trình naøy söû duïng moät Ñaàu 5’ cuûa saûn phaåm khueách ñaïi caëp moài ñaëc hieäu cho moät ñoaïn HCV coù gaén vôùi biotin ñöôïc lai vôùi daøi #244 bp trong vuøng 5’ khoâng nhöõng ñoaïn moài ngaén. Ñoaïn moài maõ hoùa cuûa boä gen HCV. Sau ñoù, ngaén naøy moät ñaàu ñöôïc gaén coá saûn phaåm seõ ñöôïc ñieän di vaø ñònh treân giaáy nitrocellulose, ñaàu ñoïc keát quaû döôùi aùnh saùng tia coøn laïi töï do, coù trình töï nucleotid cöïc tím. (2) Qui trình Nested PCR vôùi boå sung vôùi trình töï nucleotid cuûa moài OP vaø NP cuûa Bayer: Qui trình 2
ñaàu 5’ khoâng dòch maõ ñaëc hieäu Vôùi nhöõng keát quaû thöû nghieäm cho töøng genotype HCV. Biotin cuûa do phöông phaùp 1 mang laïi, chuùng ñaàu 5’seõ gaén vôùi phöùc hôïp toâi khoâng theå tieáp tuïc thöïc hieän streptavidine – alkalin phosphatase. xaùc ñònh genotype HCV baèng kyõ Cuoái cuøng, saûn phaåm lai ñöôïc thuaät lai treân vaïch vì trong thaønh phaùt hieän baèng söï xuaát hieän phaàn cuûa saûn phaåm khoâng coù maøu do phöùc hôïp streptavidine – biotin – moät chaát duøng ñeå phaùt alkalin phosphatse töông taùc vôùi hieän saûn phaåm baèng caùch hieän chaát neàn BCIP/NBT chromogen. maøu. Thöû nghieäm ñònh genotype töø phöông phaùp Nested PCR cuûa Bayer vaø phöông phaùp PCR coù moài Keát qua û gaén biotin cuûa chuùng toâi cho keát Vôùi nhöõng maãu huyeát thanh HCV quaû nhö nhau vì saûn phaåm PCR thu (+) vaø (-) ban ñaàu, chuùng toâi tieán ñöôïc töø hai phöông phaùp ñeàu coù haønh thöïc hieän ñoàng thôøi 3 qui gaén biotin ôû ñaàu 5’. Do ñoù ñeàu trình PCR noùi treân trong ñoù phöông coù theå ñöôïc phaùt hieän baèng phaùp PCR coù moài gaén biotin laø chaát hieän maøu. Keát quaû phaùt cuûa nhoùm nghieân cöùu: Vôùi 45 hieän RNA HCV vaø ñònh genotype maãu HCV (+) ban ñaàu, sau khi chaïy giöõa phöông phaùp Nested PCR vaø RT – PCR baèng ba phöông phaùp, keát phöông phaùp cuûa chuùng toâi ñaõ quaû ñeàu (+). Vôùi 15 maãu HCV (-) ñöôïc trình baøy ôû phaàn treân caøng ban ñaàu, sau khi chaïy RT – PCR xaùc ñònh ñoä tin caäy cuûa qui trình baèng ba phöông phaùp, keát quaû PCR coù mo ài ga é n bioti n môùi ñeàu (-). 45 maãu HCV [+] naøy ñeàu ñöôïc xaây döïng so vôùi hai qui trình ñöôïc tieán haønh xaùc ñònh kieåu gen coøn laïi. Nhö vaäy, qui trình kyõ baèng phöông phaùp lai treân vaïch 25 52,38% HCV 240 bp HCV 244 bp HCV 244 bp 20 p Soáröôøg hôï 15 tn 10 14,29% 14,29% 11,9% A B C 5 2,4% 2,4% 2,4% Kết quả HCV [+] trên thạch điện di, Hình 1: Kieå gen u 0 với 3 phương pháp; A: phương pháp PCR với 1 1b 2a/2c 2a/2c/1b mồi bình thường, B: Phương pháp PCR với mồi OP và NP, C: Phương pháp PCR mồi gắn Bieåu ñoà 1: Tæleä phaân boá biotin kieåu gen. vôùi boä thuoác thöû do haõng BioRad thuaät cuûa chuùng toâi vöøa coù cung caáp vaø keát quaû ñöôïc ñoïc khaû naêng phaùt hieän RNA HCV vöøa theo thang chuaån cuûa haõng naøy taïo ra ñöôïc nhöõng saûn phaåm PCR coù theå tieán haønh ñònh genotype Caùc keát quaû genotype ñöôïc ghi HCV baèng phöông phaùp lai treân laïi nhö sau: Kieåu gen 1b chieám tæ vaïch. Vôùi cuøng keát quaû nhö treân, leä cao nhaát 22 tröôøng hôïp qui trình kyõ thuaät do chuùng toâi (52,38%). Tæ leä nhieãm type 1 thaáp thieát keá chæ caàn söû duïng 1 caëp nhaát 1 tröôøng hôïp (2,4%). Coù 7 moài ñeå phaùt hieän RNA – HCV so tröôøng hôïp ñoàng nhieãm 2 type (1 vôùi Bayer phaûi söû duïng 2 caëp tröôøng hôïp nhieãm 1a/1b, 6 tröôøng moài. Ngoaøi ra, trong thaønh phaàn hôïp nhieãm 2a/2c) vaø 1 tröôøng hôïp genotype HCV PCR mix cuûa chuùng ñoàng nhieãm 3 type (2a/2c/1b). toâi coù dUTP vaø UNG ñeå choáng ngoaïi nhieãm coøn trong boä PCR Keát luaä n master mix cuûa Bayer thì khoâng. Nhö vaäy, trong muïc tieâu naøy, 3
ñieåm lôùn nhaát maø chuùng toâi ñaït hepatitis. Hepatology. posttransfusion 1991;14:969- 974. ñöôïc laø khoâng heà bò ngoaïi nhieãm 3. HOPF U, MOLLER B, KUTHER D, et al. Long- saûn phaåm khueách ñaïi neân keát term follow-up of posttransfusion and sporadic quaû xaùc ñònh genotype luoân roõ chronic hepatitis non-A. non-B and frequency of raøng, khoâng coù caùc vaïch maøu circulating antibodies to hepatitis C virus (HCV). taïp nhieãm khieán vieäc ñoïc keát J Hepatol.1990;10:69- 76. quaû khoù khaên. Ñeå thöïc hieän 4. KORETZ RL, ABBEY H, COLEMAN E, et al. ñònh genotype HCV döïa treân qui Non-A. non-B post-transfusion hepatitis. Looking trình kyõ thuaät HCV – INOLiPA cuûa back in the second decade. Ann intern Med. Bayer, kinh phí seõ laø 300.000 VNÑ 1993:119:110- 115. cho phaùt hieän HCV – RNA, 300.000 5. MATTSSON L. SONNERBORG A, WEILAND VNÑ cho PCR tröôùc khi ñònh type vôùi O. Outcome of acute symptomatic non-A, non-B moài OP vaø NP, 1.300.000 VNÑ cho lai hepatitis: A 13-year follow-up study of hepatitis treân vaïch doø ñaëc hieäu. Do ñoù C virus markers. Liver.1993;13:274- 278. toång giaù thaønh laø 1.900.000 VNÑ. 6. SEEFF LB. Natural history of hepatitis C. Ñeå ñònh genotype HCV vôùi qui trình Hepatology.l997;26:21S– 28S. cuûa chuùng toâi thì giaù thaønh seõ 7. TONG MJ, EL-FARRA NS, REIKES AR, et al. laø 300.000 VNÑ PCR phaùt hieän vaø Clinical outcomes after transfusion associated ñònh genotype, 1.300.000 VNÑ cho lai hepatitis C. N Engl J Med. 1995;332:1463 – treân vaïch doø ñaëc hieäu. Toång giaù 1466. thaønh seõ laø 1.600.000, tieát kieäm 8. TREMOLADA F, CASARIN C, ALBERTI A, et ñöôïc 300.000 VNÑ so vôùi caùch laøm al. Long-term follow-up of non-A non-B (type C) cuûa Bayers. hepatitis. J Hepatol. post-transfuston 1992;16:273- 281. 9. BRUNO S. SILINI E, CROSIGNANI A., et al. Taøi lieä u tha m khaû o . Hepatitis C virus genotypes and risk of 1. DAVID L.THOMAS, STANLEY M.LEMON. hepatocellular carcinoma in cirrhosis: A Hepatitis. Mandell, Douglas, and Bennett’s prospective study. Hepatology. 1997;25:734 – Principles & Practice of Infectious diseases. 758. Gerald L.Mandell, John E.Bennett. Raphael 10. MAHANEY. K, TEDESCHI. V., MAERTENS. Dolin. 2000;143:1736– 1760. G., et al. Genotypic analysis of hepatitis C virus 2. DI BISCEGLIE AM, GOODMAN ZD, ISHAK in American patients. Hepatology. 1994; 0 : 2 KG. et al. Long-terms clinical and 1405. histopathological follow-up of chronic 4