Kỹ thuật RT-PCR: Xây dựng kỹ thuật phát hiện viêm gan siêu vi C

Xây d ng k thu t RT – PCR phát hi n viêm gan siêu vi C đ ng th i đ nhự ỹ ậ ệ ồ ờ ị

genotype HCV b ng lai trên v ch dò đ c hi u c a thanh inoLIPA ằ ạ ặ ệ ủ

Hoàng Hi u Ng cế ọ ( 1 ) , Ph m Hùng Vânạ( 2 )

Tóm t tắ

Đ t v n đ : ặ ấ ề Viêm gan siêu vi C là m t trong nh ng nguyên nhân gây x gan và ung th ganộ ữ ơ ư (1-8 ). Qui trình kỹ

thu t RT – PCR nh m phát hi n, xác đ nh genotype HCV do chúng tôi xây d ng v i m c đích giúp đ nh h ngậ ằ ệ ị ự ớ ụ ị ướ

và theo dõi đi u tr viêm gan siêu vi C.ề ị

M c tiêu: ụXây d ng k thu t RT – PCR đ phát hi n HCV đ ng th i xác đ nh ki u gen c a virus viêm gan Cự ỹ ậ ể ệ ồ ờ ị ể ủ

b ng k thu t lai trên v ch dò đ c hi u c a thanh InoLipa c a Bayers.ằ ỹ ậ ạ ặ ệ ủ ủ

Ph ng pháp nghiên c u: ươ ứ Chúng tôi xây d ng k thu t RT – PCR dùng m i đ c hi u cho vùng 5’ không mãự ỹ ậ ồ ặ ệ

hóa c a b gen HCV có g n biotin đ phát hi n RNA HCV. Sau đó, nh ng s n ph m PCR này đ c đ nhủ ộ ắ ể ệ ữ ả ẩ ượ ị

genotype b ng ph ng pháp lai trên v ch dò đ c hi u INOLiPA do g n s n ch t đánh d u biotin tr c đó. 45ằ ươ ạ ặ ệ ắ ẵ ấ ấ ướ

m u huy t thanh HCV (+) và 15 m u HCV (-) đã xác đ nh b ng k thu t RT – PCR thông th ng, l y trongẫ ế ẫ ị ằ ỹ ậ ườ ấ

th i gian t 3/2005 đ n 7/2005, đ c ti n hành th nghi m phát hi n RNA HCV b ng qui trình k thu t m iờ ừ ế ượ ế ử ệ ệ ằ ỹ ậ ớ

cùng v i k thu t RT – PCR thông th ng và k thu t Nested PCR c a Bayer. Nh ng s n ph m PCR có HCVớ ỹ ậ ườ ỹ ậ ủ ữ ả ẩ

(+) s ti p t c đ nh genotype b ng ph ng pháp lai.ẽ ế ụ ị ằ ươ

K t qu : ế ả V i m i qui trình PCR, chúng tôi đ u thu đ c k t qu 45 m u HCV (+) và 15 m u HCV (-) nhớ ỗ ề ượ ế ả ẫ ẫ ư

ban đ u. Các m u HCV (+) t k thu t PCR thông th ng không th ti p t c đ nh genotype HCV vì không cóầ ẫ ừ ỹ ậ ườ ể ế ụ ị

ch t đánh d u biotin. Các m u HCV (+) t k thu t Nested PCR và k thu t do chúng tôi xây d ng đ u xácấ ấ ẫ ừ ỹ ậ ỹ ậ ự ề

đ nh đ c genotype và cho k t qu genotype gi ng nh nhau.ị ượ ế ả ố ư

K t lu n: ế ậ Qui trình k thu t RT – PCR phát hi n RNA HCV b ng m i có g n biotin và đ nh genotype HCVỹ ậ ệ ằ ồ ắ ị

b ng ph ng pháp lai trên v ch do chúng tôi xây d ng và th nghi m đã thành công, cho k t qu chính xácằ ươ ạ ự ử ệ ế ả

nh đ i v i k thu t RT – PCR thông th ng và Nested PCR.ư ố ớ ỹ ậ ườ

Abstracts

Setting up the RT – PCR technique to detect hepatitis C virus and determine genotype HCV by hybrilizing

PCR products on specific inoLIPA strip.

Background: Hepatitis C virus is one of reasons that causes cirrhosis and hepatic cell carcinoma. The new RT –

PCR technique is set up to detect HCV and determine its genotypes with the aim of orientating and following

treatment of HCV.

Objectives: Setting up RT – PCR technique to detect hepatitis C virus and determine genotype HCV by

hybrilizing PCR products on specific Inolipa stripe.

Method: The primers bound to biotin were designed specifically to 5’ noncoding region of HCV genome and

detected RNA HCV by using RT – PCR. These PCR products then can be used to find HCV genotypes by

hybridizing to immobilized probes on nitrocellulose stripes. 45 serum samples with HCV (+) and 15 serum

samples with HCV (-), which had been known by ordinary RT – PCR, will be tested by new RT – PCR technique,

ordinary RT - PCR and Nested PCR. Then PCR products with HCV (+) will be determined HCV genotypes.

Results: From each process, we gather 45 positive samples with HCV and 15 negative samples as before.

Positive HCV PCR products from ordinary RT – PCR can not be followed to find out HCV genotypes. Positive

HCV PCR products from the last two processes can be used to determine HCV genotypes and results from them

are the same.

Conclusion: The new RT – PCR technique set up to detect HCV and determine its genotypes is success. The

results from it are similar to from ordinary RT – PCR and Nested PCR.

Đ t v n đ ặ ấ ề

Hieän nay, vieâm gan sieâu vi C laø

moät beänh lyù ñöôïc nhieàu nhaø

laâm saøng, dòch teã hoïc cuõng nhö

nghieân cöùu y hoïc ñaëc bieät quan

taâm. Nhöõng nghieân cöùu treân theá

giôùi cho thaáy coù söï töông quan roõ

reät giöõa beänh gan maõn tính, xô

gan vaø ung thö teá baøo gan vôùi

nhieãm HCV (1-8) – thaäm chí coù lieân

quan ñeán töøng type HCV rieâng bieät

(9,10). Ngoaøi ra, ñeå coù ñöôïc chæ

ñònh ñieàu trò ñaëc hieäu cuõng nhö

theo doõi ñöôïc hieäu quaû ñieàu trò

thì vieäc xaùc ñònh kieåu gen HCV

trong maùu cuõng raát quan troïng.

Vieäc öùng duïng kyõ thuaät PCR trong

phaùt hieän nhöõng taùc nhaân vi sinh

vaät ñaõ vaø ñang ñöôïc söû duïng ôû

Vieät Nam. Beân caïnh nhieàu giaù trò

lôïi ích hôn so vôùi caùc xeùt nghieäm

huyeát thanh chaån ñoaùn, vaán ñeà

giaù caû cuûa kyõ thuaät naøy laïi laø

moät yeáu toá caàn ñöôïc quan taâm

*Tác gi chính, ả1B môn Hóa sinh, Khoa Y, Đ i H c Y D c TP. HCM. ộ ạ ọ ượ 2B Môn Vi Sinh, Khoa Y, Đ i H c Yộ ạ ọ

D c TP. HCMượ

caân nhaéc. Vì theá, chuùng toâi tieán

haønh xaây döïng moät qui trình kyõ

thuaät RT – PCR nhaèm phaùt hieän

vaø xaùc ñònh genotype HCV vôùi

mong muoán tìm hieåu ñoä tin caäy

vaø söï chính xaùc cuûa kyõ thuaät

naøy treân nhöõng maãu beänh phaåm

so vôùi nhöõng qui trình khaùc hieän

ñang ñöôïc söû duïng. Chuùng toâi

cuõng ñaùnh giaù caùc lôïi ích veà

maët kinh teá cuûa kyõ thuaät naøy

ñeå coù höôùng ñöa ra aùp duïng treân

thöïc teá hieän nay taïi caùc phoøng thí

nghieäm coù trang bò PCR.

V t li u và phậ ệ ng phươ áp nghiên c uứ

Maãu maùu beänh phaåm töø beänh

nhaân ñaõ ñöôïc chaån ñoaùn nhieãm

HCV seõ ñöôïc taùch chieát huyeát

thanh. Maãu huye á t tha n h khoân g

nhieã m HCV – laø nhöõng maãu löu

tröõ ôû -70oC taïi coâng ty Nam Khoa.

Caùc maãu naøy ñaõ ñöôïc xaùc ñònh

RNA – HCV (-) qua kyõ thuaät RT – PCR

phaùt hieän HCV thöïc hieän taïi coâng

ty Nam Khoa. Tieán haønh ly trích

RNA töø nhöõng maãu huyeát thanh

beänh nhaân HCV (+) vaø HCV (-) döïa

treân nguyeân taéc duøng Guanidine

14M vaø urea vôùi phenol vaø caùc

chaát taåy khaùc ñeå laøm caùc chaát

gaây bieán tính protein nhôø ñoù ly

trích ñöôïc RNA toaøn phaàn ra khoûi

DNA vaø protein. Thöïc hieän RT toån g

hôïp cDNA töø nhöõng maãu RNA

ñöôïc ly trích vôùi nguyeân taéc

phieân maõ ngöôïc toaøn boä RNA

thaønh cDNA baèng moài ngaãu

nhieân. Giai ñoaïn naøy duøng kit

toång hôïp cDNA cuûa coâng ty Nam

Khoa vôùi chu kyø nhieät nhö sau:

25oC trong 5 phuùt; 42oC trong 30

phuùt; 85oC trong 5 phuùt; Thöïc hieän

PCR: Chuùng toâi thöïc hieän 3 qui

trình ñoàng thôøi. (1) Qui trình PCR vaø

moài bình thöôøng: Laø qui trình PCR söû

duïng boä kit RT – PCR phaùt hieän

HCV cuûa coâng ty Nam Khoa saûn

xuaát. Qui trình naøy söû duïng moät

caëp moài ñaëc hieäu cho moät ñoaïn

daøi #244 bp trong vuøng 5’ khoâng

maõ hoùa cuûa boä gen HCV. Sau ñoù,

saûn phaåm seõ ñöôïc ñieän di vaø

ñoïc keát quaû döôùi aùnh saùng tia

cöïc tím. (2) Qui trình Nested PCR vôùi

moài OP vaø NP cuûa Bayer: Qui trình

naøy döïa treân nguyeân taéc duøng

moài OP khueách ñaïi moät ñoaïn daøi

300 bp. Sau ñoù duøng saûn phaåm

PCR khueách ñaïi baèng moài OP naøy

laøm khuoân ñeå chaïy qui trình

nested PCR vôùi moài NP ñeå cho saûn

phaåm khueách ñaïi daøi #240 bp,

cuoái cuøng, saûn phaåm ñöôïc phaùt

hieän qua chaïy ñieän di treân thaïch

agarose. Saûn phaåm nested PCR coù

moät ñaàu gaén biotin do moài NP coù

gaén biotin. Nhôø vaäy, saûn phaåm

PCR naøy seõ duøng ñeå xaùc ñònh

genotype baèng phöông phaùp lai

treân vaïch doø ñaëc hieäu HCV –

INOLiPA. Caû hai laàn chaïy chöông

trình PCR baèng maùy iCycler cuûa

BioRad ñeàu theo chu kyø nhieät nhö

sau: 94oC trong 1 phuùt; 94oC trong 15

giaây; 55oC trong 30 giaây; 72oC trong

30 giaây; Laäp laïi 40 chu kyø; 72oC

trong 5 phuùt. (3) Qui trình PCR vôùi

moài gaén biotin: Ñaây laø qui trình PCR

do chuùng toâi nghieân cöùu trong ñoù

chuùng toâi duøng moät caëp moài

ñaëc hieäu cho moät ñoaïn daøi #244

bp taïi ñaàu 5’ khoâng maõ hoùa cuûa

boä gen HCV. Moät trong hai ñaàu

ñöôïc chuùng toâi gaén chaát ñaùnh

daáu biotin. Saûn phaåm ñöôïc chaïy

PCR ñeå khueách ñaïi, sau ñoù, coù

theå duøng ñeå xaùc ñònh ñöôïc

genotype HCV baèng phöông phaùp lai

treân vaïch doø ñaëc hieäu cuûa HCV –

INOLiPA. Chaïy chöông trình PCR baèng

maùy iCycler cuûa haõng BioRad nhö

sau: 1 chu kyø 40oC trong 10 phuùt; 1

chu kyø 95oC trong 5 phuùt; 40 chu

kyø 94oC trong 30 giaây; 60oC trong 30

giaây; 72oC trong 1 phuùt; 1 chu

kyø72oC trong 10 phuùt; Toång thôøi

gian thöïc hieän phaûn öùng laø 2 giôø

10 phuùt. Phaùt hieän genotype HCV:

Phaùt hieän genotype HCV baèng

phöông phaùp lai treân vaïch doø ñaëc

hieäu cho genotype cuûa thanh HCV -

INOLiPA. Nguyeân taéc kyõ thuaät laø:

saûn phaåm khueách ñaïi ñöôïc bieán

tính thaønh nhöõng chuoãi DNA ñôn.

Ñaàu 5’ cuûa saûn phaåm khueách ñaïi

HCV coù gaén vôùi biotin ñöôïc lai vôùi

nhöõng ñoaïn moài ngaén. Ñoaïn moài

ngaén naøy moät ñaàu ñöôïc gaén coá

ñònh treân giaáy nitrocellulose, ñaàu

coøn laïi töï do, coù trình töï nucleotid

boå sung vôùi trình töï nucleotid cuûa

ñaàu 5’ khoâng dòch maõ ñaëc hieäu

cho töøng genotype HCV. Biotin cuûa

ñaàu 5’seõ gaén vôùi phöùc hôïp

streptavidine – alkalin phosphatase.

Cuoái cuøng, saûn phaåm lai ñöôïc

phaùt hieän baèng söï xuaát hieän

maøu do phöùc hôïp streptavidine –

alkalin phosphatse töông taùc vôùi

chaát neàn BCIP/NBT chromogen.

Keát quaû

Vôùi nhöõng maãu huyeát thanh HCV

(+) vaø (-) ban ñaàu, chuùng toâi tieán

haønh thöïc hieän ñoàng thôøi 3 qui

trình PCR noùi treân trong ñoù phöông

phaùp PCR coù moài gaén biotin laø

cuûa nhoùm nghieân cöùu: Vôùi 45

maãu HCV (+) ban ñaàu, sau khi chaïy

RT – PCR baèng ba phöông phaùp, keát

quaû ñeàu (+). Vôùi 15 maãu HCV (-)

ban ñaàu, sau khi chaïy RT – PCR

baèng ba phöông phaùp, keát quaû

ñeàu (-). 45 maãu HCV [+] naøy ñeàu

ñöôïc tieán haønh xaùc ñònh kieåu gen

baèng phöông phaùp lai treân vaïch

vôùi boä thuoác thöû do haõng BioRad

cung caáp vaø keát quaû ñöôïc ñoïc

theo thang chuaån cuûa haõng naøy

Caùc keát quaû genotype ñöôïc ghi

laïi nhö sau: Kieåu gen 1b chieám tæ

leä cao nhaát 22 tröôøng hôïp

(52,38%). Tæ leä nhieãm type 1 thaáp

nhaát 1 tröôøng hôïp (2,4%). Coù 7

tröôøng hôïp ñoàng nhieãm 2 type (1

tröôøng hôïp nhieãm 1a/1b, 6 tröôøng

hôïp nhieãm 2a/2c) vaø 1 tröôøng hôïp

ñoàng nhieãm 3 type (2a/2c/1b).

Keát luaän

Vôùi nhöõng keát quaû thöû nghieäm

do phöông phaùp 1 mang laïi, chuùng

toâi khoâng theå tieáp tuïc thöïc hieän

xaùc ñònh genotype HCV baèng kyõ

thuaät lai treân vaïch vì trong thaønh

phaàn cuûa saûn phaåm khoâng coù

biotin – moät chaát duøng ñeå phaùt

hieän saûn phaåm baèng caùch hieän

maøu. Thöû nghieäm ñònh genotype

töø phöông phaùp Nested PCR cuûa

Bayer vaø phöông phaùp PCR coù moài

gaén biotin cuûa chuùng toâi cho keát

quaû nhö nhau vì saûn phaåm PCR thu

ñöôïc töø hai phöông phaùp ñeàu coù

gaén biotin ôû ñaàu 5’. Do ñoù ñeàu

coù theå ñöôïc phaùt hieän baèng

chaát hieän maøu. Keát quaû phaùt

hieän RNA HCV vaø ñònh genotype

giöõa phöông phaùp Nested PCR vaø

phöông phaùp cuûa chuùng toâi ñaõ

ñöôïc trình baøy ôû phaàn treân caøng

xaùc ñònh ñoä tin caäy cuûa qui trình

PCR coù moài ga é n bioti n môùi

ñöôïc xaây döïng so vôùi hai qui trình

coøn laïi. Nhö vaäy, qui trình kyõ

thuaät cuûa chuùng toâi vöøa coù

khaû naêng phaùt hieän RNA HCV vöøa

taïo ra ñöôïc nhöõng saûn phaåm PCR

coù theå tieán haønh ñònh genotype

HCV baèng phöông phaùp lai treân

vaïch. Vôùi cuøng keát quaû nhö treân,

qui trình kyõ thuaät do chuùng toâi

thieát keá chæ caàn söû duïng 1 caëp

moài ñeå phaùt hieän RNA – HCV so

vôùi Bayer phaûi söû duïng 2 caëp

moài. Ngoaøi ra, trong thaønh phaàn

genotype HCV PCR mix cuûa chuùng

toâi coù dUTP vaø UNG ñeå choáng

ngoaïi nhieãm coøn trong boä PCR

master mix cuûa Bayer thì khoâng.

Nhö vaäy, trong muïc tieâu naøy,

HCV 244 bp

HCV 240 bp

HCV 244 bp

Hình 1: K t qu HCV [+] trên th ch đi n di, ế ả ạ ệ

v i 3 ph ng pháp; A: phớ ươ ng pháp ươ PCR v i ớ

m i bình th ng, B: Ph ng pháp PCR v i ồ ườ ươ ớ

m i OP và NP, C: Ph ng pháp PCR m i g n ồ ươ ồ ắ

biotin

A B C

2,4%

11,9%

52,38%

2,4%

14,29%

2,4%

Soá tröôøng hôïp

1 1b 2a/2c 2a/2c/1b

Kieåu gen

Bieåu ñoà 1: Tæ leä phaân boá

kieåu gen.

ñieåm lôùn nhaát maø chuùng toâi ñaït

ñöôïc laø khoâng heà bò ngoaïi nhieãm

saûn phaåm khueách ñaïi neân keát

quaû xaùc ñònh genotype luoân roõ

raøng, khoâng coù caùc vaïch maøu

taïp nhieãm khieán vieäc ñoïc keát

quaû khoù khaên. Ñeå thöïc hieän

ñònh genotype HCV döïa treân qui

trình kyõ thuaät HCV – INOLiPA cuûa

Bayer, kinh phí seõ laø 300.000 VNÑ

cho phaùt hieän HCV – RNA, 300.000

VNÑ cho PCR tröôùc khi ñònh type vôùi

moài OP vaø NP, 1.300.000 VNÑ cho lai

treân vaïch doø ñaëc hieäu. Do ñoù

toång giaù thaønh laø 1.900.000 VNÑ.

Ñeå ñònh genotype HCV vôùi qui trình

cuûa chuùng toâi thì giaù thaønh seõ

laø 300.000 VNÑ PCR phaùt hieän vaø

ñònh genotype, 1.300.000 VNÑ cho lai

treân vaïch doø ñaëc hieäu. Toång giaù

thaønh seõ laø 1.600.000, tieát kieäm

ñöôïc 300.000 VNÑ so vôùi caùch laøm

cuûa Bayers.

Taøi lieä u tha m khaû o.

1. DAVID L.THOMAS, STANLEY M.LEMON.

Hepatitis. Mandell, Douglas, and Bennett’s

Principles & Practice of Infectious diseases.

Gerald L.Mandell, John E.Bennett. Raphael

Dolin. 2000;143:1736 – 1760.

2. DI BISCEGLIE AM, GOODMAN ZD, ISHAK

KG. et al. Long-terms clinical and

histopathological follow-up of chronic

posttransfusion hepatitis. Hepatology.

1991;14:969 - 974.

3. HOPF U, MOLLER B, KUTHER D, et al. Long-

term follow-up of posttransfusion and sporadic

chronic hepatitis non-A. non-B and frequency of

circulating antibodies to hepatitis C virus (HCV).

J Hepatol. 1990;10:69 - 76.

4. KORETZ RL, ABBEY H, COLEMAN E, et al.

Non-A. non-B post-transfusion hepatitis. Looking

back in the second decade. Ann intern Med.

1993:119:110 - 115.

5. MATTSSON L. SONNERBORG A, WEILAND

O. Outcome of acute symptomatic non-A, non-B

hepatitis: A 13-year follow-up study of hepatitis

C virus markers. Liver.1993;13:274 - 278.

6. SEEFF LB. Natural history of hepatitis C.

Hepatology. l997;26:21S – 28S.

7. TONG MJ, EL-FARRA NS, REIKES AR, et al.

Clinical outcomes after transfusion associated

hepatitis C. N Engl J Med. 1995;332:1463 –

1466.

8. TREMOLADA F, CASARIN C, ALBERTI A, et

al. Long-term follow-up of non-A non-B (type C)

post-transfuston hepatitis. J Hepatol.

1992;16:273 - 281.

9. BRUNO S. SILINI E, CROSIGNANI A., et al.

Hepatitis C virus genotypes and risk of

hepatocellular carcinoma in cirrhosis: A

prospective study. Hepatology. 1997;25:734 –

758.

10.MAHANEY. K, TEDESCHI. V., MAERTENS.

G., et al. Genotypic analysis of hepatitis C virus

in American patients. Hepatology. 1994;20 :

1405.

Xây dựng kỹ thuậ t RT – PCR phát hiện viêm gan siêu vi C

Viêm gan siêu vi C là một trong những nguyên nhân gây xơ gan và ung thư gan. Quy trình kỹ thuật RT - PCR nhằm phát hiện xác định genotype HVC do chúng tôi xây dựng với mục đích giúp định hướng và theo dõi điều trị viêm gan siêu vi C

Chủ đề:

Tài liệu liên quan

Tài liêu mới

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính

Nội dung tóm tắt

Hỗ trợ

Phương thức thanh toán

Theo dõi chúng tôi