Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở viên nang mềm chứa nanocurcumin

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ VIÊN NANG MỀM<br /> CHỨA NANOCURCUMIN<br /> Nguyễn Tường Vân*, Vĩnh Định**<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: 1. Phân lập curcumin II, III từ bột nghệ. 2. Thẩm định quy trình định lượng đồng thời<br /> curcumin I, curcumin II, curcumin III. 3. Xây dựng tiêu chuẩn kỹ thuật cho Viên nang mềm chứa<br /> nanocurcumin.<br /> Đối tượng và phương pháp: - Viên nang mềm chứa nanocurcumin liposom đang nghiên cứu công<br /> thức và tiêu chuẩn kỹ thuật bao gồm: Curcumin toàn phần 15,0 mg v| c{c t{ dược Sáp ong trắng, Dầu cọ,<br /> Lecithin, Dầu đậu nành - Curcumin I, h|m lượng 99,26% (ChromaDex, USA). - Phân lập các curcumin từ<br /> nguyên liệu bằng sắc ký cột với hệ dung môi CHCl3-MeOH có độ phân cực tăng dần. - X{c định c{c đặc<br /> tính (màu sắc v| độ tan curcumin II, curcumin III phân lập), độ tinh khiết (SKLM với ba hệ dung môi có độ<br /> phân cực kh{c nhau; x{c định nhiệt độ nóng chảy v| độ tinh khiết của chất phân lập bằng phương ph{p quét<br /> nhiệt vi sai-DSC; đ{nh gi{ độ tinh khiết sắc ký lỏng theo phần trăm diện tích pic) và cấu trúc chất thu được<br /> (phổ hồng ngoại, phổ khối, phổ 1H-NMR, phổ 13C-NMR)<br /> Kết quả: Đã ph}n lập được CX2 (x{c định là curcumin II), CX3 (xác định là curcumin III) có nhiệt độ<br /> nóng chảy lần lượt là 169,71 oC và 219,08 oC với độ tinh khiết lần lượt là 99,45% và 98,30% bằng kỹ thuật<br /> DSC. Đã x}y dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời các curcuminoid và ứng dụng trên chế<br /> phẩm chứa nanocurcumin liposom. Sơ bộ thử độ hòa tan viên nang mềm nanocurcumin liposom. X{c định<br /> kích thước hạt của dung dịch thuốc trong viên nang mềm chứa nanocurcumin dạng liposom.<br /> Kết luận: Việc phân lập curcumin II, curcumin III bằng SK cột đơn giản v| có thể áp dụng trên quy<br /> mô điều chế để thiết lập chất đối chiếu. Quy trình định lượng được xây dựng chủ yếu bằng phương ph{p<br /> SKLHNC với đầu dò PDA. C{c điều kiện sắc ký được chọn dựa vào 4 tiêu chí là thành phần dung môi đơn<br /> giản, an toàn; cột sắc ký phổ biến; thời gian lưu < 30 phút v| độ phân giải giữa các pic curcumin > 2. Việc<br /> thẩm định quy trình thực hiện theo hướng dẫn thường quy.<br /> Từ khóa: nghệ, curcumin, Demethoxycurcumin, Bisdemethoxycurcumin, nanocurcumin.<br /> <br /> ABSTRACT<br /> DEVELOPMENT OF IN-HOUSE SPECIFICATION<br /> OF SOFTGEL CONTAINING NANOCURCUMIN<br /> Nguyen Tuong Van, Vinh Dinh<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement Vol. 22 - No 1- 2018:155 - 161<br /> Objectives: 1. Isolate Demethoxy curcumin, Bisdemethoxy curcumin from curcuma longa powder<br /> extract. 2. Validate the simutaneous determination of Curcumin, Demethoxy curcumin, Bisdemethoxy<br /> curcumin by RP-HPLC method with PDA detector. 3. Establish in-house specifications for soft capsules<br /> containing nanocurcumin liposome.<br /> Materials and methods: - Soft capsules CLINOVA which is being studied technical specifications<br /> <br /> *Khoa Dƣợc, Đại học Nguyễn Tất Thành<br /> **Khoa Dƣợc, Đại học Y Dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh<br /> Tác giả liên lạc: PGS. TS. Vĩnh Định<br /> ĐT: 0903639586<br /> <br /> Chuyên Đề Dƣợc<br /> <br /> Email: npvdinh@yahoo.com<br /> <br /> 155<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018<br /> <br /> contain: Curcuminoid 15.0 mg in form of nanoliposome and recipients (White bee wax, palm oil, lecithin,<br /> soybean oil). - Curcumin 99.26% (ChromaDex, USA). - Isolate demethoxy curcumin, bisdemethoxy<br /> curcumin from curcuma longa powder extract by traditional column chromatography, mobile phase is<br /> composed of CHCl3-MeOH with incerasing polarity. - Determine characteristics of isolated demethoxy<br /> curcumin, bisdemethoxy curcumin: color and solubility, purity (Thin layer chromatpgraphy with three<br /> mobile phases different in polarity, melting points, DSC and HPLC), structures (IR, MS, 1H-NMR and 13CNMR).<br /> Results: Demethoxy curcumin, bisdemethoxy curcumin were successfully isolated. DSC method<br /> dermines the purity of demethoxy curcumin, bisdemethoxy curcumin based on their melting points. The<br /> purities of demethoxy curcumin, bisdemethoxy curcumin are respectively 99.45% and 98.30%. The process<br /> was validated for simutaneous determination of Curcumin, Demethoxy curcumin and Bisdemethoxy<br /> curcumin. Then, this process was applied to analyzed soft capsules containing nanocurcumin liposome.<br /> Proceed the dissolution test of soft capsules containing nanocurcumin liposome. Determine averaged size<br /> and polydipersity index of nanocurcumin liposome contained in soft capsules.<br /> Conclusion: The process of isolation demethoxy curcumin, bisdemethoxy curcumin from curcuma<br /> longa powder extract by traditional column chromatography is both efective and simple. Therefore, it could<br /> be widely applied to set up reference substances. Quantitative process is carried out by HPLC with PDA<br /> detector. Chromatographic conditions are chosen based on 4 criteria (1) mobile phase is constituted of simple<br /> and safe organic solvents; (2) column chromatography is widely used; (3) retention time of curcuminoid is<br /> not more than 30 minutes and (4) resolution is not less than 2,0. The process was validated following<br /> procedures of ASEAN guilines.<br /> Keywords: Turmeric, curcumin, demethoxycurcumin, bisdemethoxycurcumin, nanocurcumin.<br /> <br /> ĐẶT VẤNĐỀ<br /> Curcumin là thành phần chính trong củ<br /> nghệ Curcuma longa L. Zingiberaceae.<br /> Curcuminoid có nhiều công dụng chữa bệnh<br /> nhƣng c{c bằng chứng l}m s|ng trên ngƣời<br /> khỏe v| ngƣời bệnh đều cho thấy<br /> nanocurcumin có sinh khả dụng đƣờng uống<br /> cao hơn curcumin. Các chế phẩm chứa<br /> nanocurcumin lƣu h|nh ng|y c|ng nhiều trên<br /> thị trƣờng. Hiện nay dƣợc điển Việt Nam<br /> chƣa có chuyên luận quy định về chế phẩm<br /> chứa nanocurcumin. Do đó, đề t|i đƣợc thực<br /> hiện nhằm mục tiêu “Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở<br /> viên nang mềm chứa nanocurcumin”.<br /> <br /> NGUYÊNLIỆU -PHƢƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU<br /> Nguyên liệu<br /> - Bột nghệ nguyên liệu điều chế<br /> nanocurcumin<br /> dạng<br /> liposom<br /> (số<br /> lô<br /> KH/CL/E006/13, 95% curcuminoid)<br /> <br /> 156<br /> <br /> - Viên nang mềm CLINOVA chứa<br /> curcumin toàn phần 15,0 mg v| c{c t{ dƣợc<br /> Sáp ong trắng, Dầu cọ, Lecithin, Dầu đậu nành<br /> Chất chuẩn<br /> Curcumin I, SKS: 00003927, HL:<br /> (ChromaDex, USA).<br /> <br /> 99,26%<br /> <br /> Hóa chất, dung môi<br /> Acetonitril, Methanol, Nƣớc cất 2 lần, Acid<br /> acetic băng, Kalidihydro phosphat, Natri<br /> hydroxyd,<br /> Chloroform,<br /> Benzen,<br /> Dichloromethan, Ethylacetat (tinh khiết phân<br /> tích).<br /> Trang thiết bị<br /> Máy quang phổ Hồng ngoại Thermo<br /> scientific iS50, Máy DSC, Máy NMR AVANCE<br /> 500, M{y đo khối phổ 910 TQ- FTMS.<br /> Phƣơng pháp nghiên cứu<br /> - Phân lập các curcumin từ bột nghệ<br /> nguyên liệu bằng sắc ký cột với hệ dung môi<br /> CHCl3-MeOH có độ phân cực tăng dần.<br /> <br /> Chuyên Đề Dƣợc<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018<br /> - X{c định c{c đặc tính (màu sắc v| độ tan<br /> curcumin II, curcumin III phân lập), độ tinh<br /> khiết (SKLM với ba hệ dung môi có độ phân<br /> cực kh{c nhau; x{c định nhiệt độ nóng chảy và<br /> độ tinh khiết của chất phân lập bằng phƣơng<br /> pháp quét nhiệt vi sai-DSC; đ{nh gi{ độ tinh<br /> khiết sắc ký lỏng theo phần trăm diện tích pic)<br /> và cấu trúc chất thu đƣợc (phổ hồng ngoại,<br /> phổ khối, phổ 1H-NMR, phổ 13C-NMR).<br /> - Quy trình định lƣợng dựa trên TLTK(3) và<br /> chọn điều kiện phù hợp để thẩm định.<br /> <br /> KẾT QUẢ<br /> Xác định đặc tính cảm quan, độ tinh khiết và<br /> cấu trúc chất thu đƣợc<br /> Phân lập curcumin II và curcumin III theo<br /> quy trình nhƣ sau:<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> lệ các curcumin trong nguyên liệu vì phần lớn<br /> curcumin II bị lẫn với curcumin I. Đặc điểm<br /> cảm quan: CX2 là tinh thể dạng bột, m|u đỏ<br /> cam, ít tan trong cloroform, tan trong<br /> methanol và dimetylsulfoxid. CX3 là tinh thể<br /> dạng bột, màu vàng nhạt, ít tan trong<br /> cloroform,<br /> tan<br /> trong<br /> methanol<br /> và<br /> dimetylsulfoxid.<br /> <br /> Độ tinh khiết SKLM<br /> Sắc ký đồ của CX2 và CX3 khi sắc ký với 3<br /> hệ dung môi có độ phân cực khác nhau. Phát<br /> hiện bằng mắt thƣờng. CX2 và CX3 cho một<br /> vết trên bản mỏng khi khai triển với ba hệ<br /> dung môi có độ phân cực khác nhau. Vậy chất<br /> phân lập đƣợc đạt độ tinh khiết sắc ký lớp<br /> mỏng.<br /> Độ tinh khiết xác định bằng kỹ thuật quét<br /> nhiệt vi sai (DSC)<br /> Curcumin II và Curcumin III tinh khiết có<br /> nhiệt độ nóng chảy lần lƣợt là 172 oC và 222<br /> oC. Dựa v|o đó, bằng kỹ thuật DSC x{c định<br /> nhiệt độ nóng chảy của CX2 và CX3 lần lƣợt là<br /> 169,71 oC và 219,08 oC, với độ tinh khiết lần<br /> lƣợt là 99,45% và 98,30%.<br /> <br /> Sơ đồ 1: Quy trình phân lập CX2, CX3 từ bột nghệ<br /> Sản phẩm phân lập đƣợc là 30 mg CX2<br /> (hiệu suất 2,0%) và 25 mg CX3 (hiệu suất<br /> 1,67%). Lặp lại quy trình phân lập 2 lần. Gộp<br /> và trộn đều sản phẩm phân lập thu đƣợc tổng<br /> cộng 60 mg CX2, 50 mg CX3. Mỗi lần phân lập<br /> chỉ tiến hành sắc ký trên cột một lần. Hàm<br /> lƣợng curcumin thu đƣợc không giống với tỉ<br /> <br /> Chuyên Đề Dƣợc<br /> <br /> Hình 1: Phổ DSC của CX2 (trái) và CX3 (phải)<br /> <br /> 157<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018<br /> <br /> Độ tinh khiết sắc ký lỏng<br /> CX2 v| CX3 đạt độ tinh khiết sắc ký lỏng<br /> trên 98% tính theo% diện tích pic. Mặt khác,<br /> độ tinh khiết săc ký trên đầu dò PDA<br /> (λmax = 420 nm) cho thấy không lẫn pic của tạp<br /> chất khác.<br /> Xác định cấu trúc bằng phƣơng pháp phổ<br /> <br /> Phổ hồng ngoại<br /> Phổ IR của hai chất CX2 và CX3 có các dao<br /> động đặc trƣng tƣơng tự nhau vì có các nhóm<br /> chức giống nhau của nhóm O-H (3331,0 cm-1),<br /> C=O (1625 cm-1), C=C anken (1602 cm-1),<br /> C=C aren (1573 cm-1), C-H aren thế para<br /> (826 cm1).Riêng CX3 không cho đỉnh hấp thu<br /> của liên kết C-H alkan (2943 cm-1).<br /> <br /> Hình 2: Phổ IR của CX3<br /> <br /> Phổ khối<br /> Khối lƣợng phân tử của CX2 và CX3 lần<br /> lƣợt l| 338,9 đ.v.C v| 308,9 đ.v.C<br /> <br /> Hình 3: Phổ khối ESI MS+ của CX2 (trái, M = 338,9), của CX3 (phải, M = 308,9)<br /> <br /> 158<br /> <br /> Chuyên Đề Dƣợc<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018<br /> Phổ cộng hưởng từ hạt nhân<br /> Bảng 1: Phổ 1H-NMR (DMSO, 500 MHz) của<br /> CX2, CX3 so với TLTK (200 MHz, DMSO)<br /> CX2 (ppm; j Curcumin CX3 (ppm;<br /> (1)<br /> Hz)<br /> II<br /> j Hz)<br /> OCH3 3,836 (s)<br /> 3,82<br /> 1<br /> 6,048 (s)<br /> 6,02<br /> 6,047 (s)<br /> 6,682<br /> 6,67<br /> 3<br /> (d; 16 Hz) (d; 15 Hz)<br /> 6,682<br /> (d; 16 Hz)<br /> 6,749<br /> 6,67<br /> 3’<br /> (d; 16 Hz) (d; 15 Hz)<br /> 6,815<br /> 6.81<br /> 9’; 9’<br /> (d; 7,5 Hz) (d; 8 Hz)<br /> 6,818 5<br /> 6,828<br /> (d; 8,5 Hz)<br /> 7<br /> N/A<br /> (d; 1,5 Hz)<br /> 7’<br /> 7,140<br /> 6.91<br /> 10<br /> (dd; 8; 2 Hz) (d; 8 Hz)<br /> 7,315<br /> 7,13<br /> 7,558<br /> 10’<br /> (dd;, 8; 2 Hz) (dd; 8 Hz) (d;, 8,5 Hz)<br /> 7,561<br /> 7.31<br /> 6, 6’<br /> (dd; 8; 4 Hz) (d, 2 Hz)<br /> 7,537<br /> 7.53 5<br /> 4<br /> (d; 16 Hz) (d, 15 Hz)<br /> 7,539<br /> (d; 16 Hz)<br /> 7,545 5(d,<br /> 7.53 5<br /> 4’<br /> (d, 15 Hz)<br /> 16 Hz)<br /> 8, 8’<br /> 10,066<br /> Vị trí<br /> <br /> Curcumin<br /> (1)<br /> III<br /> 5.99 (s)<br /> 6.67<br /> (d; 15,8 Hz)<br /> <br /> CX2<br /> <br /> Curcumin<br /> (1)<br /> II<br /> <br /> 1<br /> <br /> 55,69<br /> 100,85<br /> <br /> 55,7<br /> 100,9<br /> <br /> 6<br /> <br /> 111,27<br /> <br /> 111,2<br /> <br /> 9<br /> <br /> 115,68<br /> <br /> 9’; 7<br /> <br /> 115,90<br /> <br /> 115,7<br /> 115,7 /<br /> 115,9<br /> <br /> 3<br /> <br /> 120,83<br /> <br /> 120,8<br /> <br /> 3’<br /> <br /> 121,04<br /> <br /> 10,10’<br /> <br /> 123,15<br /> <br /> 5<br /> 5’<br /> 6’<br /> 4<br /> 4’<br /> 7’<br /> 8<br /> 8’<br /> 2<br /> 2’<br /> <br /> 125,81<br /> 126,34<br /> 130,30<br /> 140,34<br /> 140,67<br /> 147,99<br /> 149,34<br /> 159,78<br /> 183,11*<br /> 183,25*<br /> <br /> 121,1<br /> 123,2 /<br /> 123,1<br /> 125,8<br /> 126,4<br /> 130.4<br /> 140,4<br /> 140,7<br /> 148.0<br /> 149,8<br /> 159,8<br /> 183,1<br /> 183,2<br /> <br /> Dữ liệu phổ UV (λmax = 420 nm), IR và<br /> NMR chứng tỏ CX2 tƣơng ứng với Curcumin<br /> II có công thức phân tử C20H18O5. Phổ 13CNMR của CX3 cho thấy mất tín hiệu cộng<br /> hƣởng ở δ = 55,69 ppm của C Methoxy. Dữ<br /> liệu phổ UV, IR và NMR chứng tỏ CX3 tƣơng<br /> ứng với curcumin III có công thức phân tử<br /> C19H16O4. Cấu tạo của curcumin II v| III nhƣ<br /> sau:<br /> <br /> 6.91<br /> (d; 8,5 Hz)<br /> <br /> 7.57<br /> (d; 8,5 Hz)<br /> <br /> Demethoxy curcumin<br /> <br /> 7.61<br /> (d; 15,8 Hz)<br /> <br /> Bảng 2: Phổ 13C-NMR (DMSO, 125 MHz) của<br /> CX2, CX3 so với TLTK (200 MHz, DMSO)<br /> Vị trí<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Bisdemethoxy curcumi<br /> <br /> Vị trí<br /> <br /> CX3<br /> <br /> Curcumi<br /> (1)<br /> n III<br /> <br /> Thẩm định quy trình định lƣợng đồng thời<br /> curcumin I, curcumin II, curcumin III<br /> <br /> 1<br /> 7; 7’;<br /> 9; 9’<br /> 3; 3’<br /> <br /> 100,90<br /> <br /> 100,9<br /> <br /> 115,93<br /> <br /> 115,9<br /> <br /> 120,83<br /> <br /> 121,1<br /> <br /> Chế phẩm<br /> Viên nang mềm CLINOVA chứa hoạt chất<br /> là các curcuminoid dạng nanoliposom.<br /> <br /> 5; 5’<br /> <br /> 125,86<br /> <br /> 126,8<br /> <br /> 130,31<br /> <br /> 130,0<br /> <br /> 140,36<br /> <br /> 140,1<br /> <br /> 8; 8’<br /> <br /> 159,78<br /> <br /> 159,7<br /> <br /> 2; 2’<br /> <br /> 183,21<br /> <br /> 183,2<br /> <br /> 6; 6’;<br /> 10; 10’<br /> 4; 4’<br /> <br /> Mỗi viên nang mềm có chứa 250 mg<br /> nanocurcumin 6% (kl/kl) (tƣơng ứng 15 mg<br /> curcuminoid dạng nano) và một số t{ dƣợc:<br /> sáp ong trắng, dầu cọ, lecithin, dầu đậu nành.<br /> <br /> Điều kiện sắc ký lỏng<br /> Đầu dò: PDA2998, λ = 420 nm<br /> Cột: Luna® 5 µm C18, 100 Ao<br /> Pha động: Acid acetic 2% - Acetonitril<br /> (55:45)<br /> Thể tích tiêm: 10 µL<br /> Tốc độ dòng:1 mL/phút<br /> Nhiệt độ cột: 25 oC<br /> <br /> Chuyên Đề Dƣợc<br /> <br /> 159<br /> <br />