Bài giảng: Cập nhật kỹ thuật mới nhất trong chuyển gen động vật

Cập nhật những kĩ thuật mới trong chuyển gen động vật

Th.s Nguyễn Thái Quỳnh Anh Đại học Khoa Học Tư Nhiên Tp HCM nguyenthaiquynhanh@gmail.com

Protein tái tổ hợp

Human growth hormone Human insulin Granulocyte colony-stimulating factor Follicle-stimulating hormone Factor VIII Insulin-like growth factor 1

Liệu pháp gen

SCID (Severe Combined Immunodeficiency) (bubble boy disease)

Suy giaûm mieãn dòch do thieáu Adenosine desaminase Taùch teá baøo T  nuoâi caáy in vitro  chuyeån gene laønh  tieâm caùc teá baøo naøy trôû laïi maùu cuûa beänh nhaân  heä mieãn dòch taêng cöôøng, nhöng khoâng hoaøn toaøn beàn vöõng  laëp laïi sau vaøi thaùng (1990)

Động vật chuyển gen

Tạo ra động vật với đặc điểm di truyền mong muốn: - Sản phẩm từ động vật - Tạo ra các động vật kháng bệnh ( kháng thể, vaccine) - “Bioreactor” sản xuất sinh dược phẩm - Mô hình động vật bệnh lý

Tái thiết lập chương trình

Induced pluripotent stem cells (iPS cells hoặc iPSCs) Tế bào gốc vạn năng được tạo ra từ tế bào trưởng thành

CAÙC THAØNH PHAÀN CHUYỂN GENE

VAÄT LIEÄU DI TRUYEÀN CAÀN CHUYEÅN PHÖÔNG PHAÙP CHUYEÅN GENE CHIEÁN LÖÔÏC CHUYEÅN GENE…

1. Vector virus

- Ex vivo  in vivo

1. Gene söûa chöõa hay thay theá Hai nhoùm chíeán löôïc chính :

2. Vector khoâng phaûi laø virus

2. Gene gaây cheát

- In vivo

3. Antisense nucleic acid

3. Phöông phaùp vaät lyù : vi tieâm, suùng baén gene

Teá baøo nhaän gene chuyeån: teá baøo chöa bieät hoùa nhö doøng teá baøo taïo maùu, nguyeân baøo sôïi, nguyeân baøo cô,..

Vaät lieäu di truyeàn caàn chuyeån goàm : Gene caàn chuyeån + Promoter maïnh + Gene choïn loïc Lieân keát vôùi plasmid hay vector laø virus

TẠO DÒNG PHÂN TỬ

Figure 9.2

Các phương pháp chuyển gen

 Hệ thống chuyển gen không sử dụng virus

Phương pháp hóa chất

Phương pháp vật lí

Phương pháp vi tiêm

 Hệ thống chuyển gen sử dụng virus

Adenovirus

Lentivirus

Retroviris

HEÄ THOÁNG CHUYEÅN KHOÂNG DUØNG VIRUS

 Ñoùng goùi beân ngoaøi

 Nhaäp baøo

 Thoaùt khoûi endosome

 Ñi vaøo nhaân

 Bieåu hieän

LIPOPLEX

Lipoplex laø caùc tuùi nhoû hình thaønh töø 1 lôùp maøng ñôn lipid tích ñieän döông, ñöôøng kính 50-200 nm. Troän caùc liposome naøy vôùi dung dòch DNA  phöùc hôïp tích ñieän döông bao laáy DNA  phöùc hôïp keát hôïp vôùi beà maët teá baøo tích ñieän aâm vaø ñöôïc ñöa vaøo trong Öu ñieåm : - Tính beàn - Khaû naêng gaén DNA, RNA traàn raát cao, haàu nhö khoâng coù giôùi haïn kích thöôùc ñoaïn gene caàn chuyeån - Coù theå xaâm nhieãm moïi loaïi teá baøo - Khoâng coù tính khaùng nguyeân & caùc hoaït tính sinh hoïc khoâng mong muoán Nhöôïc ñieåm : Khoâng coù tính ñaëc hieäu teá baøo

POLYPLEX

Polyplex laø 1 phöùc hôïp phaân töû hai chöùc naêng duøng ñeå gaén DNA & chuyeån DNA vaøo teá baøo ñích thoâng qua söï gaén leân thuï theå & söï nhaäp baøo. Moät phaàn cuûa phöùc hôïp laø 1 nhoùm gaén DNA (nhö polylysine tích ñieän döông), phaàn kia laø 1 ligand cuûa 1 thuï theå ñaëc hieäu naèm treân teá baøo ñích Öu ñieåm : khaéc phuïc nhöôïc ñieåm cuûa lipoplex vaø caùc vector virus

Calcium Phosphate DEAE -Dextran Liposome

Điện biến nạp

Vi Tiêm

Vi tiêm với DNA ngoại lai

Tế bào chất

Pipette giữ

Nhân

Súng bắn gen

CHIEÁN LÖÔÏC CHUNG ÑEÅ TAÏO VECTOR VIRUS TRONG LIEÄU PHAÙP GENE

VECTOR RETROVIRUS

Öu ñieåm : (1) Hieäu quaû xaâm nhieãm teá baøo cao (2) Vector khoâng hoaøn chænh  khoâng coù khaû naêng laây lan (3) Gaén xen ñöôïc vaøo boä gene  bieåu hieän beàn vöõng Nhöôïc ñieåm : (1) Ñoaïn gene < 7.5 kb (2) Chæ xaâm nhieãm teá baøo ñang phaân chia (3) Gaén cheøn vaøo boä gene  coù khaû naêng gaây ung thö (4) Khaû naêng taùi saép xeáp lôùn

Vector ñaàu tieân ñöôïc söû duïng cho lieäu phaùp gene sau khi ñaõ ñöôïc bieán ñoåi ñeå trôû thaønh khoâng hoaøn chænh vaø ñeå coù theå xaâm nhieãm nhieàu loaïi teá baøo. Nguoàn goác laø MMLV (Moloney Murine Leukemia Virus) Boä gene chöùa 3 gene gag-pol-env. Ba gene naøy seõ bò loaïi boû vaø thay theá baèng gene caàn chuyeån

Vector Lentivirus

1. Nhiễm virus vào tế bào

đích

2. Sao chép ngược bộ gen

RNA thành DNA

3. Chuyển DNA virus vào

trong nhân

4. Dịch mã trong cytoplasm tạo thành các protein in Gag- Pol – Env

5. Sự hình thành và đóng gói capsid với 2 mạch RNA và các reverse transcriptase 6. Các virion làm “nổ” tế bào

để tự thoát ra

VECTOR ADENOVIRUS

„

Jesse Gelsinger, 18 tuoåi (Pennsylvania, 1999) - Thieáu huït enzyme Ornithine transcarbamylase - cheát sau 4 ngaøy LPG - Coù theå do vector adenovirus gaây caùc phaûn öùng mieãn dòch traàm troïng

DNA maïch ñoâi coù theå mang gene muïc tieâu > 30 kb Öu ñieåm :  Laø kí chuû thöôøng xuyeân ôû ngöôøi, ñaõ ñöôïc söû duïng thöôøng xuyeân nhö vaccin  quen thuoäc vôùi heä thoáng mieãn dòch ngöôøi  Xaâm nhieãm caû caùc teá baøo khoâng phaân chia  DNA khoâng gaén xen vaøo boä gene nhöng coù theå bieåu hieän oån ñònh neáu teá baøo khoâng phaân chia Nhöôïc ñieåm : Tính khaùng nguyeân maïnh  gaây ñaùp öùng mieãn dòch maïnh

Vector Adeno-associated Virus

Moät soá nhöôïc ñieåm cuûa vector virus : - Tính ñaëc hieäu teá baøo quaù cao (nhaát laø caùc retrovirus) - Kích thöôùc gene caàn ñöa vaøo haïn cheá - Söï gaén xen ngaãu nhieân vaøo NST - Taïo phaûn öùng mieãn dòch khoâng mong muoán

MOÄT SOÁ PHÖÔNG PHAÙP CHUYEÅN GENE

CAÙC CHIEÁN LÖÔÏC CHUYEÅN GENE

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

PHÖÔNG PHAÙP NHÖÔÏC ÑIEÅM

EX VIVO

Vector virus (retro/adenovirus, HSV) Tính oån ñònh, ñoä an toanø

Caùc phöông phaùp hoùa hoïc, vaät lyù (hoùa/ñieän Hieäu quaû, tính oån ñònh,

bieán naïp, vi tieâm, suùng baén gene, liposome,..) tính ñaëc hieäu teá baøo

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

IN VIVO

Teá baøo ñaõ nhaän gene chuyeån ex vivo Tính oån ñònh cuûa teá baøo

Hieäu quaû, tính oån ñònh, ñoä

Vector virus an toaøn, truùng ñích

Caùc phöông phaùp hoùa hoïc, vaät lyù

- Liposome

Hieäu quaû, truùng ñích

Hieäu quaû, phaân boá trong cô

- Vi tieâm vaøo cô å theå

Phöông phaùp ex vivo

Phöông phaùp in vivo

PHÖÔNG PHAÙP EX VIVO

Gene ñöôïc chuyeån vaøo teá baøo nuoâi caáy in vitro roài teá baøo coù nhaän gene chuyeån ñöôïc ñöa trôû vaøo ngöôøi beänh

MOÄT SOÁ ÑAËC ÑIEÅM CUÛA PHÖÔNG PHAÙP EX VIVO

(1) gheùp töï thaân  khoâng bò thaûi loaïi (2) chuyeån gene in vitro cho hieäu quaû cao & giuùp choïn chính xaùc teá

(3) teá baøo baûo veä gene khoûi bò phaân huyû khi ñöa trôû vaøo cô theå

 Teá baøo söû duïng phaûi coù caùc tieâu chuaån : (1) deã laáy ra & caáy gheùp trôû laïi cô theå (2) coù khaû naêng sinh soâi & chuyeån vaät chaát di truyeàn cho theá heä con (3) coù khaû naêng bieåu hieän nhieàu loaïi protein  Caùc loaïi teá baøo thöôøng ñöôïc söû duïng laø : teá baøo tuyû xöông, caùc loaïi teá baøo chöa bieät hoùa nhö nguyeân baøo sôïi (fibroblast), keratinocyte (teá baøo sô caáp cuûa bieåu bì), teá baøo gan, ñaëc bieät laø teá baøo nguoàn laáy töø tuùi noaõn hoaøng  Thuaän lôïi : baøo coù nhaän gene chuyeån nhôø marker treân vector

CAÙC CHIEÁN LÖÔÏC CUÛA LIEÄU PHAÙP GENE

 Söûa chöõa sai hoûng treân gene beänh

 Boå sung gene laønh thay cho gene beänh

 ÖÙc cheá bieåu hieän cuûa gene beänh

 Tieâu dieät teá baøo beänh

SÖÛA CHÖÕA SAI HOÛNG TREÂN GENE BEÄNH

Thoâng qua taùi toå hôïp ñoàng daïng

Öu ñieåm : taùi laäp hoaøn toaøn tình traïng bình thöôøng Nhöôïc ñieåm : raát khoù thöïc hieän thaønh coâng

BOÅ SUNG GENE LAØNH THAY CHO GENE BEÄNH

Trong tröôøng hôïp gene beänh khoâng bieåu hieän, gene laønh ñöôïc ñöa vaøo teá baøo vaø bieåu hieän ñeå taùi laäp kieåu hình bình thöôøng

Öu ñieåm : deã thöïc hieän

Nhöôïc ñieåm :

Bieåu hieän cuûa gene khoâng ñöôïc ñieàu hoøa nhö trong ñieàu kieän bình thöôøng

Chæ söû duïng khi gene beänh laø laën

ÖÙC CHEÁ SÖÏ BIEÅU HIEÄN CUÛA GENE BEÄNH

TRIPLEX FORMING OLIGONUCLEOTIDES (TFO)

TFOs lieân keát vôùi moät trình töï DNA maïch ñoâi thoâng qua lieân keát hydrogen Hoogsteen

RIBOZYME-SPLICEOSOME

Söûa chöõa ñoät bieán treân mRNA thoâng qua Ribozyme goàm 3 vuøng : maõ hoùa (coding domain), “caét noái trans” (trans splicing domain) vaø vuøng lieân keát vôùi pre-mRNA (binding domain)

CAÙC KIEÅU GAÂY CHEÁT TEÁ BAØO BEÄNH

GAÂY CHEÁT TRÖÏC TIEÁP  Chuyeån gene öùc cheá phaân baøo (gene p53 öùc cheá khoái u, gene khaùng angiogenesis öùc cheá söï hình thaønh maïch maùu môùi, ..…  Chuyeån gene “töï saùt” maõ hoùa enzyme chuyeån “tieàn thuoác” thaønh thuoác tieâu dieät teá baøo GAÂY CHEÁT GIAÙN TIEÁP THOÂNG QUA VIEÄC KÍCH THÍCH HEÄ MIEÃN DÒCH  Chuyeån gene maõ hoùa khaùng nguyeân beà maët cuûa teá baøo khoái u  kích thích heä thoáng mieãn dòch nhaän dieän vaø tieâu dieät teá baøo bieåu hieän khaùng nguyeân beà maët cuûa khoái u.  Chuyeån gene cytokine  kích thích heä thoáng mieãn dòch hoaït ñoäng maïnh leân vaø tieâu dieät teá baøo khoái u.

GAÂY CHEÁT TEÁ BAØO BEÄNH

 “Tieàn thuoác” (prodrug) khoâng gaây ñoäc cho teá baøo  Döôùi taùc ñoäng cuûa gene “töï saùt” trong teá baøo, “tieàn thuoác” thuoác gaây

ñoäc teá baøo

 Thuoác khueách taùn  taïo taùc ñoäng “bystander” vôùi caùc teá baøo hay moâ keá

caän

CAÙC GENE TÖÏ SAÙT (SUICIDE GENES)

GPAT : Glycerol-3-phosphate acyltransferase (GDEPT-Gene Direct Enzyme Prodrug Therapy)

ADEPT (Antibody Direct Enzyme Prodrug Therapy)

VDEPT (Virus Direct Enzyme Prodrug Therapy)

HSV-TK: Herpes simplex virus – thymidine kinase GCV : nucleoside Gancyclovir

VÍ DUÏ VEÀ LIEÄU PHAÙP GENE TRONG UNG THÖ TUYEÁN GIAÙP

 dn-RET (dominant negative)- proto- oncogene vôùi “ñoät bieán theâm chöùc naêng” seõ baát hoaït oncoprotein bình thöôøng

 PTP (Protein Tyrosine Phosphatase) ñieàu hoøa bieåu hieän cuûa TNF (Tumor Necrosis Factor)

 Gadd45 kieåm tra chu trình teá baøo, söûa sai DNA, apoptosis

 HMGI(Y) (High Mobility Group) : Protein “nonhistone” trong nhaân ôû ÑV coù vuù coù tính linh ñoäng ñieän di cao, bieán ñoåi caáu truùc DNA vaø NSC laøm aûnh höôûng ñeán söï sao cheùp, phieân maõ, taùi toå hôïp,…, lieân quan ñeán söï hình thaønh khoái u vaø di caên

 ONYX-015 laø 1 adenovirus nhaân baûn trong teá baøo khoâng bieåu hieän p53 (protein söûa sai)

 NIS (Sodium Iodide Symporter) + hoùa trò 131I

Kĩ thuật chuyển gen trong tạo động vật biến đổi gen

1. Vi tiêm 2. Chuyển gen thông qua retrovirus 3. Chuyển tế bào gốc phôi

Qui trình chuyển tế bào gốc phôi 1. Tế bào gốc phôi (ES) được thu nhận từ lớp ICM của blastocysts trong giai đoạn phôi sớm

2. ES được nuôi cấy in vitro và xâm nhiễm với

gen chuyên biệt

3. ES biến đổi gen được vi tiêm vào blastocyst để thành lập mô dòng sinh dục và sinh dưỡng

Kĩ thuật knock-out gen

• Qui trình chung

• Chuột: mô hình động vật

hiệu quả – Nghiên cứu bệnh người (Alzhemer, Viêm khớp…)

triển thuốc và liệu

– Tạo dòng vector – Vector được chuyển vào tế bào gốc phôi và tái tổ hợp với vùng nst định trước

• Knock-out gen mục tiêu

– Chọn lọc marker lần 1

– Chèn DNA vào vị trí

(neomycine gene)

đặc hiệu nst

– Bất hoạt gen đặc hiệu

trên nst

– Chọn lọc marker lần 2 (herpes simplex virus - thymidine kinase gene và Ganciclovir)

– Kiểm tra tái tổ hợp

– Đưa đột biến vào động vật thí nghiệm tạo mô hình bệnh

đồng dạng

– Phát pháp

Nobel prize in Physiology or Medicine 2007 Nguyên tắc cho kĩ thuật biến đổi gen mục tiêu trên chuột bằng cách sử dụng tế bào gốc phôi -Knock-out: bất hoạt chức năng của gen bằng cách loại bỏ toàn bộ hay một phần -Knock-in: đưa một đột biến vào gen nội sinh

Hệ thống Cre/lox

• Hệ thống tái tổ hợp Cre/lox dùng để phân tích chức năng gen in vivo. Hai thành phần: Cre recombinase protein điều hòa sự tái tổ hợp đặt hiệu nằm giữa vị trí loxP  Xóa, chèn, chuyển và đảo đoạn trong DNA tế bào  Cho phép DNA biến đổi trở thành mục tiêu cho loại tế bào đạt hiệu hoặc được hoạt hóa bởi sự kích thích đặt hiệu bên ngoài

 Hoạt động ở cả eukaryo và prokaryo

Cre recombinase protein (38-kDa) được mã hóa bởi bacteriophage P1. Cre liên kết với vị trí loxP ( chưa sáng tỏ). Một cre bám một trong 2 vị trí bám dính recombinase lox-P 13-bp lặp lại đảo ngược xung quanh vùng trao đổi đoạn trung tâm. Cre thúc đẩy tiếp hợp của vùng DNA chứa lox-P và xúc tác sự tái tổ hợp giữa 2 vị trí .

• Lox P (locus of X-over P1) 34-bp là vị trí nhận diện của Cre

recombinase

• Tồn tại trình tự bất đối xứng (8 bp) ở giữa với 2 trình tự xuôi dọc hai bên (13-bp). Trình tự bất đối xứng là yếu tố qui định về định hướng của vị trí Lox-P – 2 LoxP site với cùng định hướng => xóa bỏ trình tự giữa – 2 LoxP đối hướng => đảo trình tự giữa – 2 trình tự DNA riêng biệt + 1 LoxP tương ứng => translocation