Chương IV
DNA vật liệu di truyền
dnth
I. Bản chất của vật liệu di truyền
Hiện tượng biến nạp ở vi khuẩn
Hiện
tượng biến nạp (transformation)
được Griffith phát hiện ở vi khuẩn
Diplococcus pneumoniae.
Vi khuẩn này có hai dạng:
- Dạng SIII gây độc, có vỏ bao tế bào (capsule)
bằng polysaccharide cản trở bạch cầu phá vỡ tế bào ,
tạo khuẩn lạc láng (Smooth).
- Dạng RII không độc, không có vỏ bao, tạo khuẩn
lạc nhăn (Rough).
Có capsul
Không capsul
Chuột sống
Khuẩn lạc RII
Khuẩn lạc SIII
Dạng S còn sống
Dạng R còn sống
Chuột chết
Dạng R còn sống
Chuột sống
Dạng S bị đun chết
Dạng S bị đun chết
Chuột chết
Dạng S và R còn sống được phân lập từ chuột chết
Thí nghiệm của Griffith (1928)
Trong phổi chuột chết (do tiêm hỗn hợp
SIII chết với RII sống) có vi khuẩn S
và R.
Ø Các tế bào S chết đã truyền tính gây
bệnh cho các tế bào R sống.
Ø Đây được gọi là hiện tượng biến nạp.
Chất nào được truyền từ vi khuẩn S chết sang vi khuẩn R sống?
Xác định yếu tố biến nạp
Thí nghiệm Avery, McLeod và McCarty (1944)
Tế bào S + protease hay RNA-ase : hoạt tính biến nạp
còn
Protein và RNA không là tác nhân gây biến nạp
Tế bào S + DNA-ase : hoạt tính biến nạp mất
DNA chính là tác nhân gây biến nạp
Hiện tượng biến nạp chứng minh DNA mang tín hiệu di truyền
Thí nghiệm của Hershey và Chase (1952)
Alfred Hershey và Martha Chase
Thí nghiệm của Hershey và Chase (1952)
Phần nằm ngoài vi khuẩn chứa nhiều 35S (80%), phần trong các tế bào vi khuẩn chứa nhiều 32P (70%) (cid:0)
DNA được bơm vào trong tế bào.
DNA của phage T2 ban đầu xâm nhập vào tế bào vi khuẩn, sinh sản tạo ra thế hệ phage mới mang tính di truyền, tiếp tục nhiễm các vi khuẩn khác..
Kết luận: Vật chất di truyền của phage T2 là DNA
II. Cấu trúc của phân tử DNA
Thành phần hóa học của DNA
- Gốc phosphate
- Đường 5-deoxyribose
- Các base nitơ (A, G, T, C)
Cấu tạo hóa học của DNA gồm:
Quy luật của Chargaff (1951)
Trong DNA, số lượng purine (A và G) luôn bằng
với số lượng pyrimidine (T và C)
A luôn bắt cặp với T
C luôn bắt cặp với G
Phân tích DNA bằng kỹ thuật tán xạ tia X Franklin và Wilkins (1951)
M. Wilkins R. Franklin
Mẫu DNA
Chùm tia X
Nguồn tia X
Phiến ảnh
Màng lọc
Cấu trúc DNA theo Watson-Crick
Phân tử DNA là một chuỗi xoắn kép của hai mạch đơn.
Mạch đơn gồm các nucleotide nối bằng liên kết phosphodiester tạo chuỗi polynucleotide.
Mỗi nucleotide có thành phần là đường 5C, nhóm phosphate và base nitơ.
Hai mạch nối với nhau bằng các liên kết hydro giữa các base đối diện theo từng cặp (A=T và G(cid:0) C).
Đặc điểm quan trọng của mô hình là sự đối song song (anti paralell):
Mỗi mạch là một trình tự có định hướng với một đầu là 5’P và đầu kia là 3’OH, hướng của hai mạch đơn luôn ngược nhau trong chuỗi xoắn kép.
Số C trong phân tử nucleotide
Liên kết phosphodiester giữa hai nucleotide
Liên kết hydro giữa các base cùng cặp
James Watson (1928)
Francis Crick (1916-2004)
Mô hình cấu trúc DNA của Watson-Crick trưng bày ở London’s Science Museum.
http://www.sciencemuseum.org.uk/images/I030/10299555.aspx
DNA và nhiễm sắc thể
DNA có trong tất cả các loại tế bào từ vi khuẩn đến
người. Ty thể và lục lạp có DNA riêng.
Sự khác nhau về thành phần cấu tạo và tổ chức DNA
•
trong tế bào giữa Prokaryote và Eukaryote:
DNA ở Prokaryote có dạng vòng, cuộn lại hoặc ở
•
dạng siêu xoắn.
DNA ở Eukaryote được tổ chức thành nhiều
nhiễm sắc thể (NST) trong nhân tế bào. Mỗi
NST chứa 1 phân tử DNA mạch thẳng. Mỗi
loài có số NST và hình dạng đặc trưng riêng.
DNA trong tế bào ở dạng xoắn và cuộn thật chặt
Dạng vòng tròn
Dạng xoắn
Dạng siêu xoắn
Các dạng DNA của vi khuẩn
Độ lớn của DNA
Dạng DNA Cơ thể Số lượng cặp base
Động vật có vú 6 x 109
Thựcvật 2 x 108 - 2 x 1011 DNA nhiễm sắc thể
Nấm 2 x 107 - 2 x 108
Động vật 16 x 103 - 19 x 103
Thực vật bậc cao 150 x 103 - 250 x 104
DNA ty thể Nấm 17 x 103 - 78 x 103
Tảo xanh 16 x 103
protozoa 22 x 103 - 40 x 103
Thực vật bậc cao 120 x 103 - 200 x 103
DNA lục lạp
Tảo xanh 180 x 103
Nhiễm sắc thể của Eukaryote
NST của Eukaryote gồm DNA và các protein.
Nucleosome là đơn vị cấu trúc của NST, gồm sợi DNA dài 140 cặp base quấn quanh 8 phân tử protein histone.
Các nucleosome nối với nhau qua một histone trung
gian H1.
Chromatin (chất nhiễm sắc) là phức hợp của các
nucleosome xếp khít nhau.
Sợi chromatin với nhiều lần xoắn uốn khúc gắn với các
Cấu trúc nuleosome
DNA nối
Nucleosome
protein không histone tạo thành nhiễm sắc thể.
Chuỗi xoắn kép DNA
Nucleosome
Sợi chromatin gồm các nucleosome “đóng gói”
Vùng nhiễm sắc thể ở dạng lỏng lẻo
Vùng nén chặt của nhiễm sắc thể
Các mức độ
Nhiễm sắc thể kỳ giữa
tổ chức của nhiễm sắc thể
Các loại DNA
DNA có nhiều dòng họ
cấu trúc khác nhau: A, B,
C, …, Z.
Dạng B thường gặp
nhất trong điều kiện sinh
lý bình thường theo mô
hình Watson-Crick.
Dạng Z có chiều xoắn
ngược về bên trái theo
hình zig-zăc.
Dạng B Dạng Z
Dạng DNA
Số cặp base của một vòng xoắn (n) Góc xoắn so với mặt phẳng của base (độ) h- khoảng cách thẳng đứng giữa hai base kề nhau (Å) Đường kính r của chuỗi xoắn kép (Å)
A 11 + 32,7 2,56 23
B 10 +36,0 3,38 19
C 9,3 +38,6 3,32 19
Z 12 -30,0 3,71 18
III. Sao chép DNA
Sao chép theo khuôn và bán bảo tồn A luôn bắt cặp với T; G luôn bắt cặp với C (cid:0) Trình tự các nucleotide trên một mạch sẽ xác định chính xác trình tự đặc hiệu các nucleotide trên mạch bổ sung với nó.
Hai mạch cũ của DNA được tách ra để mỗi mạch làm khuôn tổng hợp mạch mới giống với cặp mạch ban đầu.
Mỗi phân tử DNA con sẽ mang một mạch cũ và một mạch mới.
(cid:0) Đây chính là kiểu sao chép bán bảo tồn.
Thí nghiệm của Meselson và Stahl (1958)
Cơ chế chung của sự sao chép DNA
- Các liên kết hydro phải bị phá vỡ và tách rời hai mạch.
- Phải có đoạn mồi (primer).
- Có đủ 4 loại ATP, GTP, TTP, CTP bắt cặp bổ sung với
- Mạch mới phải được tổng hợp theo hướng 5’P (cid:0)
các nucleotide trên mạch khuôn.
- Các nucleotide mới được nối lại với nhau bằng liên kết
3’OH.
- Mỗi bước được xúc tác bởi một enzyme đặc hiệu để
cộng hóa trị.
đảm bảo nhanh chóng, chính xác.
Cơ chế chung của sự sao chép DNA
- Các enzyme sao chép đi dọc mạch mẹ theo hướng 3’
(cid:0) 5’ để tạo mạch bổ sung theo hướng 5’(cid:0) 3’.
- Hai mạch DNA được tách ra để bắt đầu sao chép, điểm tách ra tạo thành chẻ ba sao chép (replication fork).
•
- Mạch mới luôn được tổng hợp theo hướng 5’ (cid:0) 3’
•
Trên một mạch khuôn, sự tổng hợp sẽ hướng từ ngoài vào chẻ ba (cid:0) mạch khuôn trước.
Trên mạch còn lại, sẽ tổng hợp theo hướng từ chẻ ba ra ngoài bằng cách tạo ra các đoạn Okazaki rồi nối lại (cid:0) mạch khuôn sau.
Polymerase III
Mạch DNA con
Helicase
Chẻ ba sao chép
DNA mẹ
Mạch khuôn trước
Gyrase
Primase Đoạn mồi RNA
Mạch khuôn sau
Protein ổn định mạch (SSP-protein)
Sao chép DNA
Ligase
Polymerase I
Đoạn Okazaki
Giai đoạn khởi sự
• Protein B đặc hiệu nhận biết điểm khởi sự sao chép
• Enzyme Gyrase cắt DNA làm tháo xoắn ở hai phía của
(replication origin hay ori) và gắn vào.
• Enzyme Helicase cắt liên kết hydro giữa hai base bắt
protein B.
• Các protein căng mạch (single - strand binding protein hay SSB-protein) gắn vào các mạch đơn DNA làm chúng tách thẳng ra, không xoắn lại được.
cặp, tạo chẻ ba sao chép.
Giai đoạn nối dài
DNA polymerase III gắn vào mạch khuôn, lắp các nucleotide bổ sung vào vị trí tương ứng, theo hướng 3’OH của mạch đang tổng hợp.
Nếu lắp sai, DNA polymerase III dùng hoạt
tính 5’ lùi lại cắt bỏ đi nucleotide sai, lắp
•
Mạch trước: mạch mới được tổng hợp theo hướng 5’ (cid:0)
3’
vào chẻ ba sao chép.
•
Mạch sau: mạch mới được tổng hợp theo hướng 5’ (cid:0)
3’ từ
chẻ ba ra ngoài.
exonuclease 3’(cid:0) cái đúng vào và tiếp tục sao chép.
Sao chép ở mạch sau
Emzyme primase tổng hợp đoạn mồi (primer) RNA
(khoảng 10 nucleotide) gần chẻ ba.
DNA polymerase III nối thêm vào đoạn mồi RNA để tạo thành các đoạn Okazaki dài khoảng 1000 – 2000 nucleotide.
DNA polymerase I dùng hoạt tính exonuclease 5’ (cid:0)
3’ cắt bỏ mồi RNA, lắp các nucleotide vào chỗ trống và tổng hợp tiếp theo hướng 5’ (cid:0) 3’.
Enzyme ligase nối liền các đoạn DNA lại với nhau, hoàn
thành việc tổng hợp mạch sau.
Sao chép nhiễm sắc thể ở Prokaryote
Nhiễm sắc thể ở tế bào E.coli chỉ là một sợi DNA vòng tròn, chỉ có một điểm ori.
Bộ gen của Prokaryote chứa khoảng 4,7*106 cặp nucleotide, thường chỉ có một replicon (đơn vị sao chép).
Tốc độ sao chép ở E.coli diễn ra rất
nhanh (khoảng 1000 nu/giây)
Sao chép nhiễm sắc thể vi khuẩn
Sao chép nhiễm sắc thể ở Eukaryote
Eukaryote có số lượng DNA lớn hơn nhiều so với
có nhiều nhiễm sắc thể, mỗi NST gồm
Prokaryote (cid:0) một sợi DNA thẳng liên kết với protein.
DNA ở Eukaryote có nhiều replicon.
Tế bào Eukaryote có cơ chế kiểm soát quá trình sao
chép, không sao chép tại điểm ori đã qua sao chép.
Tốc độ sao chép chậm hơn so với Prokaryote (khoảng
50 nu/giây).
Sao chép nhiều replicon ở Eukaryote
IV. CÁC CƠ CHẾ SỬA SAI VÀ BẢO VỆ DNA
Các dạng sai hỏng DNA
- Gãy hay đứt mạch
- Mất base nitơ (cid:0) mất purine)
- Gắn nhóm mới vào base nitơ bằng liên kết cộng hóa
base tương ứng không có cặp (vd:
- Biến đổi base nitơ (vd: cytosine thành uracil)
- Base bắt cặp sai
- Tạo dimer thymine bằng liên kết cộng hóa trị giữa 2
trị (vd: gắn nhóm methyl –CH3)
thymine liền kề
Sửa sai trong sao chép
Tổng hợp DNA in vitro, sai sót là 1x10-5. Trong
cơ thể sinh vật (in vivo), sai sót là 1x10-9.
fi Quá trình sao chép ở cơ thể sinh vật có độ
chính xác cao. Do:
•
3’ để việc sửa
• Các DNA polymerase I và III vừa có hoạt tính polymerase hóa vừa có hoạt tính exonuclease 5’ (cid:0) 3’, 3’ (cid:0)
Hướng sao chép luôn từ đầu 5’ (cid:0) sai được chính xác.
5’.
Sửa sai trong quá trình sao chép
Vị trí base sai
DNA polymerase lắp base đúng vào
Base sai bị cắt bỏ
Sửa sai khi bị đột biến
DNA có thể bị biến đổi khi không sao chép bởi các tác
nhân vật lý và hóa học, gây ra đột biến.
Cơ thể sinh vật có cơ chế sửa sai để giữ tần số đột biến
ở mức thấp.
Có nhiều enzyme đặc hiệu nhận biết các sai hỏng trên
DNA (liên kết cộng hóa trị sai giữa base với các chất
hóa học khác và giữa các base liền kề trên một mạch,
bắt cặp sai giữa các base…)
Cơ chế sửa sai DNA ngoài quá trình
sao chép
- Sửa sai trực tiếp
•
- Sửa sai gián tiếp
• Như sửa sai khi sao chép: các enzyme nhận biết gắn vào trình tự sai và cắt bỏ đoạn sai, sau đó dựa vào mạch đơn đúng làm khuôn để tổng hợp lại chỗ bị cắt cho đúng.
Trường hợp dimer thymine, các enzyme photolysae có thể trực tiếp loại bỏ các liên kết dimer thymine qua phản ứng quang hoạt hóa.
Enzyme sửa chữa cắt bỏ base sai
Sửa chữa base bắt cặp sai
Base bắt cặp sai
DNA polymerase bổ sung base đúng
Sửa chữa bằng cách cắt bỏ
Base bị biến đổi
Một base trong DNA hư hỏng dẫn đến bị mất chức năng
DNA polymerase bổ sung các base đúng
Enzyme sửa chữa cắt bỏ base biến đổi và vài base kế cận
Sửa sai DNA trực tiếp và gián tiếp trong đột biến dimer thymine
Tia cực tím
Dimer thymine
Sửa sai bằng cách cắt bỏ
Sửa sai bằng phản ứng quang hoạt hóa Dimer thymine
Ánh sáng cắt liên kết dimer
Enzyme liên kết
Chuỗi DNA đã được sửa sai
Enzyme được giải phóng
Dimer được sửa chữa
Chuỗi DNA đã được sửa sai
Gián tiếp Trực tiếp
Các hệ thống bảo vệ DNA
• Sự methyl hóa (gắn nhóm –CH3) ở những điểm nhất
• Enzyme endonuclease (cắt DNA ở giữa) có thể nhận
định trên DNA.
• Hệ thống cấp cứu (SOS) được mở ra khi DNA bị sai
biết DNA lạ, cắt và loại bỏ chúng.
• Các hệ thống sửa sai (hệ thống bảo vệ DNA) theo hai
hỏng nhiều.
ü
Sửa sai bằng cách cắt bỏ chỗ sai và tổng hợp lại dựa theo mạch đúng còn lại.
ü
Sửa sai nhờ cơ chế tái tổ hợp và các cơ chế khác.
kiểu:
Telomere
Telomere là những trình tự DNA không mã hóa, ngắn và đơn giản, lặp lại nhiều lần, nằm ở phần cuối của các nhiễm sắc thể eukaryote.
Có chức năng bảo vệ thông tin di truyền trên nhiễm sắc thể.
Sẽ mất dần sau mỗi lần sao chép.
Được tổng hợp bởi enzyme Telomerase (có nhiều trong các tế bào phân chia nhiều lần như protozoan, sinh vật đơn bào, tế bào ung thư…).
Sao chép ở đầu cuối nhiễm sắc thể
CÁC ĐIỂM CẦN NHỚ
1. Các thí nghiệm chứng minh DNA là chất di truyền: TN của Griffith (1928), Avery và cs (1944) và TN của Hershey và Chase (1952).
2. Thành phần và mô hình cấu trúc xoắn kép DNA theo Watson-
3. Hình dạng và các mức tổ chức của nhiễm sắc thể
4. Sự sao chép DNA theo khuôn: TN Meselson và Stahl (1958).
5. Các enzyme trong quá trình sao chép DNA.
6. Cơ chế sửa sai DNA.
7. Hệ thống bảo vệ DNA, Telomere.
Crick, quy luật của Chargaff (1951) về sự bắt cặp base nitơ.
