Bài giảng Công cụ di truyền mới trong chọn tạo giống cây trồng: Chương 6 - TS. Vũ Thị Thúy Hằng

07/08/2017

Nội dung

Chương 6. Sử dụng chỉ thị phân tử trong xây dựng bản đồ di truyền và QTLs

1. Khái niệm chung 2. Bản đồ di truyền 3. Sử dụng chỉ thị phân tử trong xây dựng bản

đồ QTL

Vũ Thị Thúy Hằng

Chromosome bands

1. KHÁI NIỆM CHUNG

Bản đồ NST

Gen

Bản đồ gen Cho biết vị trí và khoảng cách của các gen hay các trình tự trên chromosomes

1

Bản đồ di truyền

Chỉ thị phân tử

2

Bản đồ vật lý

Bản đồ tế bào/Bản đồ vật lý Vị trí các gen hoặc đoạn DNA với khoảng cách vật lý Bản đồ di truyền Vị trí các gen hoặc chỉ thị phân tử dựa trên tần số trao đổi gen

Các đoạn trình tự gối nhau

3

Trình tự DNA

1

Cắt DNA thành những đoạn nhỏ có đoạn trình tự gối nhau để giải trình tự gen

Bản đồ vật lý

2

Nhân dòng các đoạn cắt

• Bản đồ vật lý cho biết khoảng cách giữa các đoạn gen/ chỉ thị phân tử, thường đo bằng số cặp nuleotit dọc theo DNA

3

Đọc trình tự các đoạn cắt

• Bản đồ vật lý được thiết lập nhờ cắt DNA thành nhiều đoạn nhỏ và các đoạn đó được sắp xếp theo trật tự dựa trên xác định các đoạn có trình tự gối nhau (bằng phần mềm)

4

Sắp xếp các trình tự dựa vào các đoạn gối nhau bằng phần mềm

1

07/08/2017

Bản đồ di truyền vs. bản đồ vật lý

Bản đồ di truyền

• Khoảng cách trên bản đồ di truyền dựa trên tần số hoán vị

gen; trong khi khoảng cách trên bản đồ vật lý tính bằng só cặp nuletotit;

• Bản đồ di truyền là sơ đồ sắp xếp vị trí tương đối của các gen, đoạn DNA/ chỉ thị phân tử trên từng NST theo đường thẳng, mỗi gen/đoạn DNA chiếm một vị trí nhất định và khoảng cách được xác định dựa vào tần số trao đổi chéo với đơn vị là centiMorgan, cM.

• Biết được trình tự DNA sẽ biết được trình tự, khoảng cách gen

– bản đồ vật lý.

• Nhìn chung: 1 cM ~ 1 MB of DNA.

• Tần số trao đổi chéo giữa các gen càng thấp thì khoảng cách giữa các gen càng gần, tần số trao đổi chéo giữa các gen càng cao thì khoảng cách giữa các gen càng xa nhau.

• Ở vùng chromosome có tần số hoán vị gen lớn, chiều dài bản

• Đơn vị đo khoảng cách gen được tính bằng tần số hoán vị gen

đồ vật lý có thể bị dự đoán quá dài

• Ngược lại, ở vùng ít có sự trao đổi chéo gen, chiều dài bản đồ

vật lý có thể bị dự đoán quá ngắn

Bản đồ di truyền và vật lý có thể khác nhau ở khoảng cách tương đối, ngay cả về vị trí của gen trên chromosome

2. BẢN ĐỒ DI TRUYỀN

2. Bản đồ di truyền dựa trên tần số hoán vị và có độ chính xác thấp hơn

1. Bản đồ vật lý cho biết vị trí thực của một gen.

• Bản đồ di truyền là sơ đồ sắp xếp vị trí tương đối của các gen, đoạn DNA/ chỉ thị phân tử trên từng NST theo đường thẳng, mỗi gen/đoạn DNA chiếm một vị trí nhất định và khoảng cách được xác định dựa vào tần số hoán vị gen với đơn vị là centiMorgan, cM.

• Thường sử dụng các chỉ thị phân tử để thiết lập bản đồ di

truyền

• Các tên gọi: bản đồ di truyền, bản đồ liên kết gen, bản đồ

locut tính trạng số lượng (bản đồ QTL)

Bản đồ vật lý

Bản đồ di truyền

- Một bản đồ di truyền cho biết vị trí của các chỉ thị phân tử (vd SSR, SNPs, RFLPs) trong một nhóm liên kết gen. Một nhóm liên kết gen = một bản đồ di truyền.

• Khoảng cách tương đối trên bản đồ di truyền giữa các gen/chỉ

thị phân tử được tính bằng tần số hoán vị gen

- Thiết lập/vẽ bản đồ di truyền có nghĩa là sử dụng các chỉ thị phân tử, xác định khoảng cách giữa chúng. Khi thiết lập bản đồ di truyền, có thể thu được chỉ một nhóm liên kết gen hoặc toàn bộ các nhóm liên kết gen cho loài. Thường thì số nhóm liên kết gen = số NST của loài

- Thông thường:

• 1 đơn vị trên bản đồ gen = 1 cM = 1% hoán vị gen. 2 chỉ thị phân tử có khoảng cách 1 cM, tức là số lần trung bình xảy ra trao đổi chéo giữa hai chỉ thị phân tử là 0.01

+ Khi đề cập đến xây dựng bản đồ liên kết gen cũng có nghĩa là xác định một gen chính của một tính trạng trên bản đồ/hay nhóm liên kết gen

• Gen/chỉ thị với tần số hoán vị gen < 50% thuộc cùng một

nhóm liên kết gen

+ Khi đề cập đến xây dựng bản đồ các locut tính trạng số lượng, nghĩa là xác định các locut cho tính trạng số lượng trên một hoặc một vài nhóm liên kết gen

• Hai gen/chỉ thị phân ly độc lập có tần số tái tổ hợp 50% sẽ

0.1cM

0.1cM

0.1cM

M1 M2

M1 M2

M1 M2

nằm trên NST không tương đồng hoặc nằm rất xa nhau trên cùng một NST (không liên kết)

0.2cM

0.2cM

M3

M3

0.25cM

0.25cM

0.1cM

0.1cM

0.2cM 0.1cM 0.15cM 0.1cM

M4 M6

M3 T1 (flower color) M4 M5

M4 M6

Nhóm liên kết gen

Bản đồ liên kết gen

Bản đồ locut tính trạng số lượng (Bản đồ QTL)

2

07/08/2017

Nguyên lý

Bản đồ di truyền dùng để làm gì?

• Cho thông tin về liên kết giữa gen/đoạn DNA/chỉ thị phân tử

Tính tần số hoán vị gen

với tính trạng quan tâm;

• Tần số hoán vị gen là tỷ lệ % số cá thể tái tổ hợp trên

• Xác định vị trí gen/đoạn DNA để nhân dòng

tổng số các thể đời con

Số cá thể tái tổ hợp x 100

Tần số hoán vị gen =

• Trong quá trình xây dựng bản đồ di truyền, những chỉ thị phân tử đồng phân ly với tính trạng đánh giá trong quần thể phân ly có thể được sử dụng làm chỉ thị trong chọn tạo giống;

Tổng số cá thể đời con

• Dùng trong các nghiên cứu so sánh bản đồ di truyền giữa các loài, giúp cho việc tìm hiểu quá trình tiến hóa và đa dạng hóa của loài;

• Cung cấp khung sườn để xây dựng bản đồ vật lý

Khoảng cách giữa 2 gen

Tần số hoán vị gen

Với dòng thuần, Lai P1(AA BB) và P2 (aa bb)

Bộ NST ở F1 gồm AB và ab

Lai F1 (AB ab) với cây thử (ab ab) để kiểm tra hoán vị gen

Giả sử thu được ……

AB ab

583

ab ab

597

Ab ab

134

aB ab

134

Tổng số = 1448 cây

Thì: 268 tái tổ hợp gen/1448 progeny = 0.185 =

18.5% hoán vị gen

16

Xác định vị trí 3 gen Với dòng thuần, lai P1 (AA BB DD) với P2 (aa bb dd)

Tuy nhiên, tại sao 13.2 + 6.4 #l 18.5?

Bộ NST ở F1 gồm ABD và abd

Chưa tính trao đổi chéo 2 lần …

Lai F1 (ABD abd) với cây thử (abd abd)

Lai F1 (ABD abd) với cây thử (abd abd)

Giả sử thu được:

Giả sử thu được ……

Ab + aB = (45+89)+(94+40) 268 /1448 =0.185 A-B =18.5

Ab + aB = (45+89)+(94+40) /1448 =0.185 A-B =18.5

ABD abd ABd abd

580 5

ABD abd ABd abd

580 5

Bd + bD = (5+40)+(5+45) 93 /1448 = 0.064 B-D =6.4

abD abd abd abd

5 592

(45+89)+(94+40)+2(5+5) = 284/1448 = 0.196 A-B =19.6

abD abd abd abd

5 592

AbD abd Abd abd

45 89

Ad + aD = (5+89)+(5+94) 191 /1448 = 0.132 A-D =13.2

AbD abd Abd abd

45 89

aBD abd aBd abd

94 40

aBD abd aBd abd

94 40

Tổng số = 1448

A-----D---B -13.2--6.4- ----19.6----

Trật tự là A-----D---B -13.2--6.4- ----18.5----

Tổng

1448

17

18

3

07/08/2017

Xây dựng bản đồ gen

Các bước xây dựng bản đồ gen sử dụng chỉ thị phân tử

i

ạ

l i

ạ

l

Con cái của quần thể lai lại (F1 x bố mẹ lai lại): dùng 3 chỉ thị 3 SSR + và 1 tính trạng đánh giá

• Tạo quần thể phân ly

1 F

o h c ẹ m ố B

ẹ m ố B

1

2

3

4 5

6 7 8

9

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

• Sử dụng các chỉ thị phân tử để đánh giá kiểu gen của quần

thể phân ly

• Phân tích liên kết gen giữa các chỉ thị phân tử để xác định

A C

khoảng cách giữa các chỉ thị - sử dụng phần mềm

D

• Vẽ bản đồ gen – sử dụng phần mềm

A

D

C

4/20

2/20

6/20

Số tái tổ hợp: AC = 6/20 (1, 3, 10, 13, 18, 19) AD = 4/20 (1, 3, 10, 13) CD = 2/20 C = 1/20 (18) D = 1/20 (19)

20

3. Sử dụng chỉ thị phân tử trong phân tích locut tính trạng số lượng (QTL)

Locut tính trạng số lượng là gì?

 Một gen/đoạn DNA hoặc một vùng chromosome ảnh

hưởng đến tính trạng số lượng

 Gen/vùng đó phải đa hình: tức là có sự biến động

dẫn đến những ảnh hưởng tới cá thể trong quần thể

- Khái niệm - Nguyên lý - Phương pháp phân tích: phân tích từng chỉ thị và phân tích khoảng

 Phải liên kết với một chỉ thị đa hình (chỉ thị đa hình là chỉ thị cho thấy mức độ biện động của quần thể)

Thiết kế /xác định một chỉ thị phân tử cho tính trạng

Thiết kế/xác định chỉ thị phân tử (tiếp)

• Một chỉ thị tốt nhất là trình tự DNA tác động đến kiểu hình

• Lai các cá thể khác nhau/đối lập nhau về tính trạng cần xác

(hay gen)

định chỉ thị phân tử

• Nhân thế hệ, tự thụ hoặc giao phấn thu thế hệ con

• Nếu một gen đã biết có liên quan đến tính trạng và được phân lập, có thể so sánh trình tự gen đó với các dạng dại hoặc dạng đột biến DNA

• Thu thập số liệu cho tính trạng đó ở thế hệ F2

• Thiết kết mồi đặc hiệu cho đoạn gen đó

• Chọn 5 - 10 cá thể ở F2 có biểu hiện các dạng tính trạng đó

• Trường hợp không biết gen, sàng lọc trong các quần thể đối

lập nhau

4

07/08/2017

Xây dựng bản đồ QTL

• Tách DNA từ cá thể chọn F2

• Hỗn hợp lượng bằng nhau DNA từ các cá thể đó thành 2 phần:

• Là xác định vị trí của một locut gây những biến động trong

mỗi phần cho một dạng tính trạng

genome dẫn đến biến động với tính trạng số lượng

•

Sàng lọc hỗn hợp DNA bằng loại chỉ thị cần sử dụng

• Ước tính ảnh hưởng của alen đó lên sự biến động của tính

trạng và kiểu di truyền.

• Phân tích liên kết gen để xác định chỉ thị liên kết với tính trạng/chỉ thị liên quan đến locut liên xác định tính trạng đó – chỉ thị QTL

Bản đồ QTL để làm gì ?

• Cho biết ảnh hưởng và tương tác của từng gen riêng rẽ

• Xác định vị trí của gen để nhân dòng

Ngoài ra, còn có thể sử dụng các quần thể khác để xác định chỉ thị QTLs nhưng chi phí đắt và lâu hơn như các dòng NILs (Near Isogenic Lines), RILs (Recombinant Inbreeds), các thế hệ nhân theo phương pháp một hạt

• Dự đoán giá trị chọn giống và phương pháp chọn lọc phù hợp

nhờ chỉ thị phân tử

Nguyên lý của xây dựng bản đồ QTLs

Nguyên lý (tiếp)

• Dựa trên đồng phân ly của locut QTL với chỉ thị phân tử

• Dựa trên đồng phân ly của kiểu hình và kiểu gen trong quần

trong quần thể phân ly

thể phân ly

– Chỉ thị di truyền cung cấp thông tin về kiểu gen

Q

M

Cặp NST

– Mối quan hệ giữa kiểu hình và kiểu gen sẽ cho biết vị trí và

q

m

ảnh hưởng của QTL

• Cần thiết lập quần thể để xây dựng bản đồ QTL

QTL alen không quan sát được

Alen có chỉ thị phân tử quan sát được

Tái tổ hợp

Đồng phân ly (liên kết gen)

A1

Q1

Kiểu gen bố mẹ

A1

Q1

A3A4

A1A2

A2

Q2

Giao tử (Không trao đổi chéo)

A2

Q2

A1A3

A2A4

“Phân tích liên kết gen = đếm các tái tổ hợp

A2A3

A1

Q2

Giao tử ít khi xảy ra (Trao đổi chéo)

Chỉ thị phân tử alen A1 đồng phân ly kháng bệnh (trội)

A1A2

A1A4

A3A4

A3A2

Q1

A2

5

07/08/2017

Tương quan giữa tái tổ hợp và khoảng cách di truyền

Khoảng cách trên bản đồ di truyền

Khoảng cách giữa hai locut (Morgans)

= Tần số trao đổi gen

1 -HALDANE FUNCTION X= 0.5log(1-2y) Haldane (1919) 2. KOSAMBI FUNCTION Map Function

Tuy nhiên, khoảng cách có thể cộng, nhưng tần số không 1 Morgan = 100 cM; 1 cM ~ 1 Mb

X= 0.25 log(1+2y) (1-2y)

x = khoảng cách di truyền

Sử dụng hàm số Haldane hoặc Kosambi để tính khoảng cách trên bản đồ di truyền từ tần số tái tổ hợp

y= tần số trao đổi chéo

• VD: Khoảng cách di truyền khi tần số trao đổi chéo 2% là bao nhiêu? y = 2% = .02 M x = -1/2ln(1-2 x 0.02) = -1/2ln(0.96) = 0.02041

= 2.041 cM.

Khi y dùng 0 – 1/2 thì x có đơn vị Morgan (M) Khi y dùng 0 – 50% thì x có đơn vị cM

Các bước xây dựng bản đồ QTL

Bước 6: Phát hiện QTL

Tất cả các thí nghiệm xây dựng bản đồ di truyền, bản đồ QTL đều có chung các bước:

Gồm:

1. Chọn bố mẹ khác nhau về tính trạng

- xác định vị trí của QTL thông qua sự liên kết giữa QTL và

2. Đánh giá 2 bố mẹ để tìm các chỉ thị đa hình

chỉ thị liên kết;

3. Thiết lập các dòng tái tổ hợp (dòng từ F2 …)

4. Đánh giá kiểu hình trên đồng ruộng

- Xác định mức độ ảnh hưởng của QTLs lên sự biểu hiện của tính trạng đó; từ đó xem QTL đó có ảnh hưởng chính, hay phụ đến tính trạng số lượng

5. Đánh giá kiểu gen của các dòng tái tổ hợp

6. Phát hiện QTL: So sánh, phân tích giá trị kiểu hình và

tìm mối tương quan giữa kiểu gen với kiểu hình

- Có nhiều phương pháp hay thuật toán khác nhau để phát hiện QTLs: phân tích từng chỉ thị (single marker analysis), Interval mapping (phân tích khoảng), CIM

6

07/08/2017

Bước 6: Phương pháp phân tích để phát hiện QTL: Cách 1: Phân tích với từng chỉ thị phân tử

Phương pháp phân tích để phát hiện QTL: Phân tích với từng chỉ thị phân tử (tiếp)

Chỉ thị DNA thể dùng để xây dựng bản đồ di truyền:

Nguyên lý:

A

M

QTL

Chỉ thị DNA

a

m

- Kiểm tra sự khác nhau ở giá trị trung bình của kiểu hình giữa các nhóm cá thể có/ hay không có chỉ thị phân tử. Nếu giá trị trung bình kiểu hình khác nhau ở mức có ý nghĩa (qua phân tích ANOVA) thì chỉ thị phân tử đó liên kết với một QTL

• Chỉ thị gần QTL nào sẽ cùng phân ly với QTL đó

- Từ đó, xác định một cách tương đối vị trí và mức độ ảnh

• Chỉ thị liên kết chặt với QTL được phát hiện nhờ tính toán

hưởng của QTLs

phân tích AOVA

• Hầu hết các giao tử F1 là AM hay am, nếu có trao đổi chéo giữa chỉ thị và QTLs, thì sẽ thu được giao tử Am & aM

Ưu và nhược điểm của cách 1

Bước 6: Phương pháp phân tích để phát hiện QTL: Cách 2: Phương pháp khoảng

Ưu điểm: Nhanh, đơn giản, không cần bản đồ di truyền

Các chỉ thị phân tử dùng để xây dựng bản đồ di truyền:

Nhược điểm:

 Không cho vị trí QTL chính xác vì không tính đến tái tổ hợp

A

giữa chỉ thị và QTL, không tính đến tương tác giữa các locut

M1

M2

 Không cho kết quả nếu vị trí của chỉ thị phân tử và QTL ở

quá xa nhau

QTL

 Số lượng các dòng tái tổ hợp dùng để đánh giá lớn

a

m1

m2

 Không phân biệt được giữa khoảng cách và mức độ ảnh

• Chỉ thị gần QTL nào thì sẽ phân ly cùng với QTL đó

hưởng của QTL: chỉ thị gần với QTL có ảnh hưởng nhỏ lên tính trạng cũng giống như chỉ thị ở xa QTL nhưng có ảnh hưởng lớn lên tính trạng

• Chỉ thị liên kết chặt với QTL được phân tích nhờ ANOVA

Ưu và nhược điểm của phương pháp phân tích khoảng

Phân tích QTLs: Phương pháp khoảng

Ưu điểm:

Nguyên lý:

• Dự đoán chính xác hơn vị trí của QTL

• Phân tích được khoảng cách và ảnh hưởng của QTL

• Phương pháp khoảng (Interval mapping method) dùng thông tin dựa trên giá trị của chỉ thị phân tử ở cả 2 đầu của QTLs để xác định vị trí QTL

• Xác suất một QTL ở một vài vị trí giữa các chỉ thị được

Nhược điểm:

tính toán

• QTL được xác nhận khi xác suất xảy ra cao nhất

- Phương pháp phân tích khoảng không tính đến ảnh hưởng của các QTL khác, do đó, vị trí và mức độ ảnh hưởng của QTL chính có thể không chính xác

Xác định vị trí của QTL ở giữa 02 chỉ thị phân tử;

- Cần có phần mềm

7

07/08/2017

1. Chọn lọc dựa vào chỉ thị

SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG CHỌN GIỐNG CÂY TRỒNG

Khái niệm: Chọn lọc dựa vào chỉ thị (Marker asisted selection - MAS) là sử dụng chỉ thị ADN liên kết chặt với các locut mục tiêu thay thế hoặc hỗ trợ chọn lọc dựa vào kiểu hình

Dựa trên giả thuyết: Các chỉ thị phân tử có thể dự đoán kiểu hình ở mức độ tin cậy



Tại sao phải sử dụng chỉ chị phân tử?

Tại sao?

Kiểu hình không cho thông tin một cách chính xác về kiểu gen:

 Hai cây có thể có kiểu hình giống nhau, nhưng rất

Chỉ thị phân tử DNA = phản ánh trực tiếp kiểu gen

Nhiều tính trạng không thể quan sát được trước khi tiến hành chọn lọc Kiểu hình là kết quả biểu hiện của kiểu gen, tuy nhiên kiểu hình cũng chịu tác động lớn của môi trường

Kiểu hình không hiệu quả khi xem xét đến những liên kết với gen không mong muốn

Kiểu gen B

Kiểu gen A

Môi trường

Kiểu gen

Ghi nhớ: • Các yếu tố di truyền • Mức độ ảnh hưởng tương đối của mỗi

Nhà chọn giống dựa trên kiểu hình; chỉ thị phân tử cho thông tin về kiểu gen

yếu tố di truyền lên kiểu hình

• Tương tác giữa các yếu tố di truyền (ức

chế, trội lặn, liên kết gen)

cùng kiểu hình

Kiểu hình

khác nhau về kiểu gen

 2 cây có kiểu hình rất khác nhau nhưng lại giống

• Chỉ thị phân tử cho phép nhà chọn giống đưa vào giống cây trồng chỉ một hoặc một vài gen mong muốn;

Tại sao Hoặc

• Trong khi phương pháp truyền thống chuyển toàn bộ genome (kèm theo gen mong muốn và gen không mong muốn)

Kiểu dại

Đột biến

• Tích lũy các alen lặn trong phương pháp lai lại truyền thống yêu cầu thời gian dài để thu được đồng hợp tử vì cần phải tự thụ ở mỗi lần lai lại

Các đốt ngắn Giảm chiều cao cây, nhiều cành

• Một số tính trạng phức tạp như kháng bệnh và chống chịu điều kiện bất thuận (QTLs) khó được phát hiện qua phương pháp chọn giống truyền thống, do ảnh hưởng của môi trường

Kiểu hình khác nhau

1

nhau về kiểu gen VD. Kiểu gen đột biến ở táo (Malus domestica). Kiểu đốt ngắn ở giống táo cv. Telamon do đột biến ở một locut

07/08/2017

Phương pháp chọn giống truyền thống vs. Công nghệ sin học

Chỉ thị phân tử sử dụng như thế nào?

Chọn giống truyền thống kết hợp nhiều gen một lúc

Chỉ thị phân tử đánh giá và cho thông tin kiểu gen một cách trực tiếp

Gen mong muốn

Nhiều gen được chuyển do tái tổ hợp

Phân tích ảnh hưởng của kiểu gen lên kiểu hình

Giống thương mại

Thể cho

Giống mới

Công nghệ sinh học thực vật

Ứng dụng CNSH, một gen được chuyển.

Cung cấp cho nhà chọn giống công cụ để hiểu rõ các yếu tố di truyền, tương tác giữa các yếu tố di truyền và mức độ ảnh hưởng lên sự biểu hiện kiểu hình

Một gen được chuyển

X

Gen mong muốn

Gen mong muốn

Giống TM

8

Thể cho

Improved Commercial Lúa vàng Plant Variety

Ưu điểm của MAS

Lợi ích từ MAS

 Phương pháp đơn giản hơn so với sàng lọc kiểu hình

• Đặc biệt đối với các tính trạng sàng lọc tốn công lao

động

 Chọn lọc các kiểu gen đặc thù chính xác và hiệu quả hơn

• Tiết kiệm thời gian và nguồn lực

 Có thể đẩy nhanh quá

 Chọn lọc ở giai đoạn cây con

Lúa + B-carotene

• Quan trọng đối với các tính trạng như chất lượng sản

phẩm là hạt

• Có thể chọn lọc trước khi trồng (lúa trước khi cấy)

 Sử dụng nguồn lực hiệu quả hơn; đặc biệt thí nghiệm đồng ruộng

 Tăng độ tin cậy

• Không bị ảnh hưởng ngoại cảnh

• Phân biệt được các thể đồng hợp tử với các thể dị hợp

tử và chọn lọc từng cây riêng rẽ

Vườn lai lại

Các chỉ thị phải liên kết chặt với các locut mục tiêu!

Điều kiện chọn lọc dựa vào chỉ thị

 Lý tưởng nhất là chỉ thị liên kết chặt với gen/QTL mục

 Công nghệ chi phí thấp: cho phép xác định hàng ngàn

trình tạo giống

Độ tin cậy đối với chọn lọc

Chỉ thị A

 Sử dụng chỉ

Chỉ sử dụng chỉ thị A:

QTL

5 cM

1 – rA = ~95%

 Các chỉ thị phải liên kết chặt với các locut mục

Chỉ thị B

Chỉ thị A

tiêu, cách <5 cM kiểu gen với chi phí thấp thị sẵn có, dễ tiếp cận, ví dụ SSR/ microsatellite, để tiến hành chọn với số lượng lớn;

Sử dụng chỉ thị A và B:

QTL

5 cM

5 cM

1 - 2 rArB = ~99.5%

tiêu

2

 Nếu sử dụng các chỉ thị hai sườn làm tăng độ tin cậy, nhưng làm tăng thời gian và chi phí

07/08/2017

Cảm nhiễm

Kháng

Quần thể lớn với hàng ngàn cá thể

Chọn lọc nhờ chỉ thị (MAS)

Chọn lọc kháng mặn

Chọn lọc vi khuẩn bạc lá

Chọn lọc chống chịu thiếu phốtpho trong đất

CHỌN GIỐNG NHỜ CHỈ THỊ CHỌN GIỐNG TRUYỀN THỐNG P1 P2 x x P1 P2 Thể cho (tính kháng bệnh) Thể nhận F1 F1 F2 Quần thể lớn với hàng ngàn cá thể F2 CHỌN LỌC KIỂU HÌNH

Những lưu ý khi sử dụng chỉ thị ADN trong chọn giống

Qui trình ‘xác định chỉ thị’

 Phương pháp kỹ thuật (đơn giản hay phức tạp)

(1) Lấy mẫu lá

 Độ tin cậy

 Độ đa hình

(2) Tách chiết ADN

 Chất lượng và số lương ADN cần thiết

 Chi phí

 Nguồn lực sẵn có: thiết bị, máy móc, đội ngũ chuyên

(3) PCR

(4) Điện di GEL môn kỹ thuật

Chỉ thị phải đa hình

2. QUY TRÌNH CHỌN GIỐNG DỰA

VÀO CHỈ THỊ

(5) Phân tích chỉ thị

P1 P2

P1 P2

1. Lai lại nhờ chỉ thị 2. Tích tụ gen - Pyramiding 3. Chọn lọc sớm 4.

‘Kết hợp” các phương pháp

RM296 1 2 3 4 5 6 7 8 RM84 1 2 3 4 5 6 7 8

3

Đa hình! Không đa hình

07/08/2017

2.1. Lai lại nhờ chỉ thị (MAB)

 MAB có nhiều ưu điểm so với phương pháp truyền thống:

• Chọn lọc các locut mục tiêu hiệu quả • Giảm thiểu liên kết xấu đi kèm • Phục hồi nhanh bố mẹ lai lại

Chọn lọc dựa và chỉ thị có ích khi gen mong muốn khó chọn lọc do:

1

2

3

4

1

2

3

4

1

2

3

4

1. Gen lặn 2. Nhiều gen cho tính trạng kháng bệnh

Target locus

CHỌN LỌC NỀN

CHỌN LỌC LOCUT MỤC TIÊU

CHỌN LỌC TÁI TỔ HỢP

CHỌN LỌC THỂ CHO

CHỌN LỌC NỀN DI TRUYỀN – THỂ NHẬN

* Chọn lọc gen từ thể cho

3. Tính trạng số lượng: do nhiều gen tham gia vào sự biểu hiện của tính trạng 4. Tương tác lớn của kiểu gen x môi trường

1

2

3

4

 Chọn lọc gen mục tiêu hay QTL

Để đánh gía sự có mặt của gen khi đánh giá kiểu hình trực tiếp không thể thực hiện được hay tốn kém, hoặc chỉ thực hiện được ở giai đoạn muộn.

 Có ích đối với những tính trạng khó

* Chọn lọc thể tái tổ hợp:

Locut mục tiêu

MAB: CHỌN LỌC – từ thể cho

Sử dụng chỉ thị hai sườn để chọn các thể tái tổ hợp giữa gen mục tiêu và chỉ thị sườn

đánh giá, các allen lặn

- Để xúc tiến sự phục hồi kiểu gen của thể nhận ở các locut khác.

- Sử dụng các chỉ thị phân tử để chọn lọc nền trong chương trình lai lại được kiểm chứng và chứng minh rất hiệu quả

* Chọn lọc nền di truyền thể nhận Chọn lọc locut mục tiêu

• “Liên kết xấu” là khi: Lượng lớn NST của thể cho giữ lại sau nhiều lần lai lại;

Lai lại truyền thống

Không mong muốn vì những gen khác của thể cho ảnh

hưởng xấu các tính trạng nông học

c

GEN MỤC TIÊU

c

F1

BC1

BC2

BC3

BC10

BC20

c

LOCUT MỤC TIÊU

‘Liên kết xấu’ Sử dụng chỉ thị giảm thiểu lượng NST của thể cho nhanh hơn

I

LOCUT MỤC TIÊU

O H C Ể H T

BC1

BC3

BC10

ThỂ cho/F1

Ở T Ế K N Ê L N E G

NST bố mẹ lai lại

c

GEN MỤC TIÊU

NST thể cho

Ribaut, J.-M. & Hoisington, D. 1998 Marker-assisted selection: new tools and strategies. Trends Plant Sci. 3, 236-239.

F1

BC1

BC2

4

Lai lai dựa vào chỉ thị

07/08/2017

Bước 1 – chọn locut mục tiêu

BC1

Bước 2 – chọn thể tái tổ hợp một trong hai phía của locut mục tiêu

 Sử dụng chỉ

1

2

3

4

MAB: CHỌN LỌC THỂ TÁI TỔ HỢP

HOẶC

 Giảm thiểu liên kết xấu

Bước 3 – chọn locut mục tiêu lần nữa

BC2

 Đòi hỏi quần thể lớn

• phụ thuộc vào khoảng cách của chỉ

CHỌN LỌC THỂ TÁI TỔ HỢP

thị sườn với locut mục tiêu)

Bước 4 – chọn thể tái tổ hợp một trong hai phía của locut mục tiêu

thị hai sườn để chọn các thể tái tổ hợp giữa gen mục tiêu và chỉ thị sườn

Hoặc

LAI LẠI TRUYỀN THỐNG

LAI LẠI NHỜ CHỈ THỊ

* *

 Sử dụng chỉ thị không liên kết để

1

2

3

4

CHỌN LỌC KIỂU HÌNH CÂY BC1 GẦN GIỐNG BỐ MẸ LAI LẠI

SỬ DỤNG CHỈ THỊ NỀN ĐỂ CHỌN LỌC CÂY CÓ CHỈ THỊ CỦA BỐ MẸ LAI LẠI NHIỀU NHẤT VÀ LƯỢNG GENOM THỂ CHO NHỎ NHẤT

 Xúc tiến sự phục hồi genom của bố

MAB: CHỌN LỌC NỀN P1 x P2 P1 x P2 P1 x F1 P1 x F1 BC1 BC1 đào thải thể cho, chọn lọc cây có chỉ thị của bố mẹ lai lại nhiều nhất và lượng genome thể cho nhỏ nhất

CHỌN LỌC NỀN

 Rút ngắn 2, 3 hoặc 4 thế hệ lai lại

mẹ lai lại (thể nhận)

2.2. Tích tụ gen

Quá trình kết hợp nhiều gen vào trong 1 kiểu gen, thường từ hai bố mẹ khác nhau

Kiểu gen

 Sử dụng để kết hợp nhiều gen kháng bệnh đối với các

Quy trình chọn giống x

P1: AAbb

P2: aaBB

x

BC2 BC2

 Tích tụ gen cực khó đạt được bằng phương pháp truyền

F1: AaBb

chủng đặc thù của một thể gây bệnh P1 Gen B P1 Gen A

AB

Ab

aB

ab

F2

 Lưu ý: đánh giá kiểu hình của một cây đối với nhiều dạng kháng cây con hầu như không thực hiện được

AB

AABB

AABb

AaBB

AaBb

thống F1 Gen A + B

Ab

AABb

AAbb

AaBb

Aabb

 Có ý nghĩa để tạo ra khả năng kháng “bền vững” với

aB

AaBB

AaBb

aaBB

aaBb

Chọn cây F2 có Gen A và Gen B

ab

AaBb

Aabb

aaBb

aabb

Hittalmani et al. (2000). Fine mapping and DNA marker-assisted pyramiding of the three major genes for blast resistance in riceTheor. Appl. Genet. 100: 1121-1128

Liu et al. (2000). Molecular marker-facilitated pyramiding of different genes for powdery mildew resistance in wheat. Plant Breeding 119: 21-24.

5

F2 MAS nhiều chủng của thể gây bệnh

07/08/2017

2.3. Chọn lọc MAS sớm

Cảm nhiễm

Kháng

P1 P2 x

 MAS tiến hành ở F2 hoặc F3

F1

 Chọn lọc cây có gen mong muốn, các allen được cố định ở trạng thái đồng hợp tử; đào thải cây có tổ hợp gen không mong muốn

 Tập trung nguồn lực cho ít dòng ở các giai đoạn sau

MAS 1 QTL – đào thải 75% kiểu gen không mông muốn MAS 2 QTLs – đào thải 94% kiểu gen không mong muốn

Refeences:

Ribaut & Betran (1999). Single large-scale marker assisted selection (SLS-MAS). Mol Breeding 5: 21-24.

PP PHẢ HỆ

(SLS-MAS)

P1 x P2

P1 x P2

F1

F1

MAS

F2

F2

 Ví dụ: bản đồ

Chọn lọc KIỂU HÌNH

F3

F3

Trồng thưa để chọn lọc cá thể

Chỉ gieo trồng các dòng F3 trên đồng ruộng

F4

liên kết từ quần thể dòng thuần tái tổ hợp nhỏ của 20 cá thể

F4

Các gia đình gieo thành hàng để chọn lọc.

Các gia đình gieo thành hàng để chọn lọc. Chọn phả hệ

F5

F5

F6

F6

KN năng suất sơ bộ. Chọn lọc

F7

F7

Thí nghiệm năng suất

F8 – F12 Khảo nghiệm nhiều điểm,

F8 – F12

nhân giống và phổ biến

Khảo nghiệm nhiều điểm, nhân giống và phổ biến

Collard et al., (2005) Euphytica 142 p 169

Ưu điểm: giảm số dòng/cá thể và tập trung vào số ít dòng/cá thể để đánh giá

Đánh gía kiểu hình ‘Hướng theo chỉ thị’

2.4 Các phương pháp kết hợp

Quần thể lớn ( 2000 cây) F2

P1 (S)

x P2 (R)

Bố mẹ cho

Bố mẹ lai lại

(còn gọi là chọn lọc lần lượt’)

x

F1 (R)

P1 (S)

• Sử dụng khi chỉ thị không chính xác 100% hay sàng lọc kiểu hình tốn kém hơn so với xác định chỉ thị

BC1F1 , kiểu hình R & S

Chọn lọc dựa vào chỉ thị (MAS)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 …

Trong một số trường hợp, sự kết hợp sàng lọc kiểu hình và MAS rất có ích 1. Đạt tối đa tiến bộ di truyền (khi một số QTLs chưa được xác định từ lập bản đồ QTL) 2. Mức tái tổ hợp giữa chỉ thị và QTL không phải chính xác 100%

6

3. Giảm được kích thước quần thể đối với những tính trạng mà sử dụng chỉ thị phân tử ít chi phí hơn hay dễ hơn so với sàng lọc kiểu hình tiết kiệm thời gian và giảm chi phí CHỌN LỌC KIỂU HÌNH

07/08/2017

VÍ DỤ: ỨNG DỤNG MAS Ở VIỆN NC LÚA QUỐC TẾ (IRRI)

Câu hỏi???

 Các trở ngại phi sinh vật chủ yếu gồm:

Lai lại dựa vào chỉ thị đối với khả năng chịu ngập

Bất lợi phi sinh vật là trở ngại lớn đối với SX lúa ở ĐN Châu Á

 Ưu tiên cao nhất ở IRRI  Nguồn chống chịu cho tất cả các tính trạng có trong nguồn gen, những QTL chính liên kết chặt với chỉ thị DNA đã được xác định cho một số tính trạng

Photo by Abdel Ismail

David Mackill, Reycel Mighirang-Rodrigez, Varoy Pamplona, CN Neeraja, Sigrid Heuer, Iftekhar Khandakar, Darlene Sanchez, Endang Septiningsih & Abdel Ismail

‘Các giống Mega’

Chiến lược lai lại

 Áp dụng chiến lược lai lại để chuyển các gen/QTLs vào

BR11

Bangladesh

• Hạn • Ngập nước • Mặn • Thiếu lân

CR1009

India

IR64

Toàn châu Á

 Sử dụng chỉ thị DNA để lai lại với hiệu quả cao – lai lại

 Nhiều giống lúa phổ biến và trồng diện tích lớn gọi là “các giống Mega” • Đặc biệt quen thuộc với nông

các giống mega

KDML105

Thái Lan

Mahsuri

Ấn Độ

 Các giống truyền thống có khả

MTU1010

Ấn Độ

RD6

Thái Lan

dựa vào chỉ thị (MAB) dân

Ấn Độ

Samba Mahsuri

Swarna

Ấn Độ, Bangladesh

1-10 triệu hectares

7

năng chịu bất lợi phi sinh vật, nông dân ngại trồng các giống khác • các đặc điểm nông học và chất lượng kém

07/08/2017

Chọn giống chịu ngập úng

• NS cao

• Mẫn cảm

Tính trạng tốt; vd kháng bệnh

x Lai lại truyền thống P1

• Bố mẹ lai lại (RP)

 DT lúa đồng bằng bị ngập ngắn hạn lớn

loại bỏ ~50% BC1

Chọn trực quan BC1 giống RP

 Những vùng thuận lợi cũng bị ngập ngắn

Lặp lại cho đến BC6

 Phân biệt với các kiểu chịu ngập úng

phục hồi genome của giống lai lại (RP)

Giống ưu việt P2 Thể cho P1 x F1 (đông Ấn đến ĐN Á; > 10 tr. ha P1 x BC1 P1 x BC2 hạn trong một số năm P1 x BC3 khác P1 x BC4 • Khả năng vươn dài • Nảy mầm trong điều kiện yếm khí P1 x BC5

Có thể phải lai lại bổ sung do liên kết xấu

P1 x BC6

Sàng lọc khả năng chịu ngập

BC6F2

0

10

30

40

LOD score 20

OPQ1

600

OPN4

IR40931-26

PI543851

1200

OPAB16

20

850

C1232

Sub-1(t)

RZ698

15

900

50cM

OPS14 RG553 R1016 RZ206

OPH7

950

10

RZ422

5

100cM

C985

0

1

2

4

6

8

9

3 7 5 Submergence tolerance score

RG570

150cM

Phân ly ở quần thể F3

RG451

RZ404

Xu and Mackill (1996) Mol Breed 2: 219

Lai lại

Gieo BC1F1

X

Swarna

IR49830

Thể cho Sub1

Cho hat F1 nảy mầm và gieo trong khay

F1 X

Swarna

BC1F1

8

Một QTL chính trên NST 9 kiểm soát tính chịu ngập úng – Sub1 QTL

07/08/2017

Phân tích kiểu gen để chọn lọc cây BC1F1 mang gen mong muốn để lai lại

Thu mẫu lá - 10 sau khi cấy để phân tích chỉ thị

Swarna

Swarna/ IR49830 F1

Cây #242

Swarna

BC1F1 697 cây

376 có Sub1 21 thể TTH Chọn cây mang allen thể cho ít nhất

BC2F1 320cây

158 có Sub1 5 thể TTH

Cây #246 và #81

BC2F2 937 plants

Cây #227

Swarna

Cây 237 BC2F2

1 cây mang Sub1 có 2 đoạn thể cho

BC3F1 18 cây

Chọn lọc Swarna+Sub1 Nhân cây BC2F2 chịu ngập úng

Swarna với Sub1

Mackill et al 2006. QTLs in rice breeding: examples for abiotic stresses. Paper presented at the Fifth International Rice Genetics Symposium.

Có thể phải tiếp tục đến BC3F2

Ribaut et al. 2002. Ribaut, J.-M., C. Jiang & D. Hoisington, 2002. Simulation experiments on efficiencies of gene introgression by backcrossing. Crop Sci 42: 557–565.

9

Khung thời gian để “tăng cường” các giống mega

07/08/2017

Swarna

246-237

Tỉ lệ hạt bạc bụng

Bạc bụng(0-10%)=84.9 Bạc bụng(10-25%)=9.1 Bạc bụng(25-50%)=3.5 Bạc bụng(>75%)=2.1

Bạc bụng(0-10%)=93.3 Bạc bụng(10-25%)=2.3 Bạc bụng(25-50%)=3.7 Bạc bụng(>75%)=0.8

CD Trung bình =0.2mm

Chiều dài TB=0.2mm

Chiều rộng TB =2.3mm

Chiều rộng TB=2.2mm

Dòng BC3F2 Xấp xỉ 2,9 MB của thể cho DNA

Amylose content (%)=25 Gel temperature=HI/I Gel consistency=98

Amylose content (%)=25 Gel temperature=I Gel consistency=92

Hiện trạng chọn giống phân tử

 Tổng quan tài liệu cho thấy hàng ngàn nghiên cứu lập bản đồ QTL nhưng không có nhiều báo cáo về áp dụng cho MAS trong chọn giống

4. HIỆN TRẠNG CỦA MAS: TRỞ NGẠI VÀ THÁCH THỨC

 Tại sao?

Chi phí – một cản trở chính

Nguyên nhân tác động ít của MAS trong chọn giống

 Hiệu quả chi phí chưa được hạch toán nhưng

Kiểu gen của Swarna-Sub1

 Thiếu nguồn lực (thiết bị)

 Chỉ thị không có hiệu quả chi phí

 Được xác định bởi:

 Độ chính xác của các nghiên cứu lập bản đồ

MAS đắt hơn đối với phần lớn tính trạng • Các tính trạng phẩm chất là ngoại lệ

 Ảnh hưởng của QTL có thể phụ thuộc vào nền di truyền

 Không có đa hình chỉ thị trong vật liệu chọn giống

 Kết hợp di truyền phân tử và chon giống truyền thống

10

• Tính trạng và phương pháp sàng lọc kiểu hình hoặc bị chi phối bởi điều kiện ngoại cảnh • Chi phí nhà kính/Thí nghiệm đồng ruộng • Chi phí lao động kém • Loại chỉ thị sử dụng

07/08/2017

Chi phí MAS

Chi phí MAS ở IRRI (ví dụ 1)

*gồm cả chi phí lao động

Cở sở nghiên cứu

Nước

Cây trồng

Tài liệu

Chi phí cho một mẫu* (US$)

ĐH Guelph

Canada

Đậu

2.74

Yu et al. (2000)

Dreher et al.

CIMMYT

Mexico

Ngô

1.24–2.26

(2003)

Australi

Kuchel et al.

ĐH Adelaide

Lúa mì

1.46

a

(2005)

 GAMMA Lab = USD $0.86 một mẫu Lao động:

Van Sanford et

Hoa kỳ

0.50–5.00

Vật tư tiêu hao:  Ước lượng PTN lập bản đồ Genom (GML) • USD $0.26 một mẫu (chi phí tối thiểu) • Chi phí chia nhỏ: tách chiết DNA: 19.1%; PCR: 61.6%; ddieeenj di Gel: 19.2% • Không tính phí găng tay, giấy thấm, điện, nước, thải rác

Lúa mì và đại mạch

al. (2001)

ĐH. Kentucky, Minnesota, . Oregon, Michigan, USDA-ARS

Yu et al. 2000 Plant Breed. 119, 411-415; Dreher et al. 2003 Mol. Breed. 11, 221-234; Kuchel et al. 2005 Mol. Breed. 16, 67-78; and Van Sanford et al. 2001 Crop Sci. 41, 638-644.

Chi phí cho MAS: Thế hệ đầu MAS

Chi phí MAS: ví dụ 2 - chọn lọc Swarna+Sub1

P1

P2

• USD $0.06 một mẫu (KTV) • USD $0.65 một mẫu (TTS sau tiến sĩ)

Swarna

Swarna/ IR49830 F1

Cây #242

F1

Swarna

BC1F1 697 cây

376 có Sub1 21 thể TTH Chọn lọc nền – 57 chỉ thị

2000 cây

F2

Cây #246

BC2F1 320 cây

Swarna

158 mang Sub1 5 TTH 23 chỉ thị nền

Chỉ tính chi phí VT tiêu hao. CL gen mục tiêu, TTH và CL nền BC1- BC3F2 = USD $2201

11 cây mang Sub1 10 chỉ thị nền

BC3F1 18 cây

USD $640 để sàng lọc 2000 cây với một chỉ thị cho một quần thể

Swarna+Sub1

Chi phí MAS cụ thể

x

Xem xét các ví dụ về MAS cho thấy một vấn đề chung:

• Philippines (Peso) =

35,200

• India (Rupee) =

28,800

• Bangladesh (Taka) =

44,800

 Hầu hết các chỉ thị DNA được xây dựng cho các

• Iran (Tuman) =

576,000

Vd 1- Chọn lọc phả hệ (2000 cây F2) = USD $640

• Philippines (Peso) =

121,055

• India (Rupee) =

99,045

• Bangladesh (Taka) =

154,070

• Iran (Tuman) =

1,980,900

VD 2: Swarna+Sub1 = USD $2201 (*vật tư tiêu hao)

 Chi phí tăng nhanh!

11

• Nói cách khác, không phải là QTLs. Xác định chỉ thị cho QTLs khó hơn rất nhiều

07/08/2017

Độ tin cậy của bản đồ QTLs cũng ảnh hưởng đến thành công của MAS

Tích hợp giữa sinh học phân tử và chọn giống thường thiếu

 Độ tin cậy của số liệu kiểu hình quan trọng!

 Khoảng cách lớn giữa phát triển các chỉ thị phân tử

 Khẳng định lại kết quả QTLs ở các quần thể độc lập

 Kiểm tra “Giá trị của chỉ thị” phải được thực hiện

 Những quan điểm quan trọng không được hiểu như

 Ảnh hưởng của nền di truyền phải được xác định

12

• Đòi hỏi: nhiều lần lặp lại ở nhiều môi trường và chọn tạo giống - Xây dựng chỉ thị, bản đồ QTL thường tách rời khỏi chọn giống - Sự trao đổi thông tin số liệu giữa các viện • Kiểm tra độ tin cậy của chỉ trị trong dự đoán kiển nghiên cứu và chọn giống thường thiếu hình • Kiểm tra mức độ đa hình của chỉ thị nhau giữa các lĩnh vực

07/08/2017

Sử dụng QTL trong chọn giống

• QTLs với ảnh hưởng nhỏ = khó có được bản đồ chính

Tóm tắt • Thiết lập bản đồ QTL mapping = là quá trình xác định vị trí của gen với ảnh hưởng lên tính trạng số lượng, sử dụng chỉ thị phân tử

xác

• Chỉ những QTLs trên đoạn chromosome rất nhỏ có thể

• Phân tích QTL = dựa trên xác định sự khác nhau về giá trị trung bình giữa các dòng với các chỉ thị phân tử

sử dụng trong chọn giống lai lại

• QTL có ảnh hưởng lớn trong hầu hết các nền di truyền và môi trường là có hữu ích nhất trong chọn giống

• QTL mapping = bước khởi đầu để khám phá gen có ích

trong chọn giống

8