TNU Journal of Science and Technology
230(01): 423 - 431
http://jst.tnu.edu.vn 423 Email: jst@tnu.edu.vn
PHYLOGENETIC RELATIOSHIP OF PANAX SPECIES
IN VIENAM USING MIG-SEQ METHOD
Hoang Thi Binh1, Le Minh Tam2, Pham Quang Tuyen3,
Trinh Ngoc Bon3, Vu Quoc Luan4, Nguyen Van Ngoc1*
1Dalat University, 2Vaccine Company Limited of Dalat Pasteur,
3Silviculture Research Institute - Forest Science Institute of Vietnam,
4Tay Nguyen Institute for Scientific Research - Vietnam Academy of Scientific and Technology
ARTICLE INFO
ABSTRACT
Received:
04/6/2024
This study aim to examine the phylogenetic relationship between Panax
species (Araliaceae) of Vietnam using MIG-seq method based on Next
Generation Sequencing platform. A total of 29 Vietnamese Panax
samples, including five species, two varieties, and one sample of Panax
ginseng as an outgroup, were utilized. The MIG-seq method generated
a dataset of 6821 SNPs, which was used to reconstruct a phylogenetic
tree using maximum likelihood. The tree demonstrated the phylogenetic
relationship between Panax species with high resolution and strongly
supported monophyly through bootstrap values. The results revealed that
the Panax species of Vietnam comprise two main sister groups. The first
group includes P. stipuleanatus and P. bipinnatifidus, while the second
group comprises three species (P. pseudoginseng, Panax sp., P.
vietnamensis) and two varieties (P. vietnamensis var. fuscidicus and P.
vietnamensis var. langbianensis). These research findings provide a
foundation for the application of the MIG-seq method in studying
phylogenetic relationships of plant in Vietnam.
Revised:
17/12/2024
Published:
18/12/2024
KEYWORDS
Araliaceae
Classification
ISSR
Phylogeny
Sequencing
NGHIÊN CU MI QUAN H PT SINH GIA CÁC LI THUC CHI
PANAX VIT NAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP MIG-SEQ
Hoàng Th Bình1, Lê Minh Tâm2, Phm Quang Tuyến3,
Trnh Ngc Bon3, Vũ Quốc Lun4, Nguyn Văn Ngọc1*
1Trường Đại học Đà Lạt, 2Công ty TNHH Mt thành viên Vắc Xin Pasteur Đà Lạt
3Vin Nghiên cu Lâm sinh - Vin Khoa hc Lâm Nghip Vit Nam
4Vin Khoa hc Tây Nguyên - Vin Hàn Lâm Khoa hc Công ngh Vit Nam
TÓM TT
Ngày nhn bài:
04/6/2024
Nghiên cu này nhm xây dng mi quan h phát sinh gia c loài
thuc chi Panax Vit Nam bằng phương pháp MIG-seq trên nn tng
gii trình t gene thế h mi. Tng cng 29 mu thuc các loài Panax
Vit Nam 01 mu thuc loài Panax ginseng (làm nhóm ngoài) đã
đưc s dng. Nghiên cứu đã thu được tng cộng 6821 điểm đa hình
đơn nucleotide (SNPs) làm chỉ th phân t để xây dng cây phát sinh
chng loại theo phương pháp maximum likelihood. Cây biu th mi
quan h phát sinh gia các loài Panax Vit Nam có độ phân gii cao,
với các nhóm đơn hình được h tr mnh m bi các ch s bootstrap.
Kết qu nghiên cu cho thy, chi Panax Vit Nam gm 2 nhóm
quan h gần gũi, nhóm th nht gm các loài P. stipuleanatus P.
bipinnatifidus, nhóm th 2 gm các loài P. pseudoginseng, Panax sp.,
P. vietnamensis 02 th P. vietnamensis var. fuscidicus P.
vietnamensis var. langbianensis. Kết qu nghiên cứu làm sở cho vic
ng dụng phương pháp MIG-seq trong nghiên cu mi quan h phát
sinh cho các đi ng thc vt Vit Nam.
Ngày hoàn thin:
17/12/2024
Ngày đăng:
18/12/2024
DOI: https://doi.org/10.34238/tnu-jst.10537
* Corresponding author. Email: ngocnv@dlu.edu.vn
TNU Journal of Science and Technology
230(01): 423 - 431
http://jst.tnu.edu.vn 424 Email: jst@tnu.edu.vn
1. Gii thiu
Chi Panax thuc h Nhân sâm (Araliaceae), là mt chi thc vt gm nhiu loài có giá tr dược
liu cao [1], [2]. Các loài thuc chi này phân b ch yếu ba khu vực chính là Đông Bc Á, Tây
Trung Quc Bc M [3]. Việt Nam, năm 1969, Grushvitzky cộng s (1969) đã ghi nhận
loài Panax bipinnatifidus Seem. trong h Araliaceae min Bc Việt Nam [4]. Sau đó, Phạm
Hoàng H đã phát hiện loài P. schinseng Nees var. japonicum Mak. (Sâm Nht Bn) phân b
tại vùng núi Langbiang (năm 1970), ba loài vùng núi phía Bc và Tây Nguyên Việt Nam (năm
1993) là: P. bipinnatifidus Seem, P. japonica (Nees) Meyer, và P. pseudoginseng Wall (Tam tht
Bắc) [5]. Năm 1985, Sâm Ngc Linh (P. vietnamensis) được Th Dung Grushvitzky phát
hin và công b loài mi [6].
T năm 2000, nhiều nghiên cu v thành phn loài chi Panax đã đưc thc hin. Theo Nguyn
Tp (2005), chi này Việt Nam 5 loài, trong đó P. bipinnatifidus Seem, P. stipuleanatus H.T.
Tsai et K.M. Feng (Tam tht hoang) P. vietnamensis Ha et Grushv. (Sâm Ngc Linh) là các loài
bản địa, còn P. ginseng (sâm Hàn Quc) P. notoginseng (Tam tht) loài nhp nội [7]. Năm
2013, Phan Kế Long và cng s đã ghi nhận mt th sâm mi P. vietnamensis var. fuscidiscus ti
ờng Tè, Lai Châu và đặt tên địa phương sâm Lai Châu [8]. Các nghiên cứu sau đó đã phát
hin thêm nhiu loài và th mi, nâng tng s loài Panax Vit Nam lên 6 loài và 3 th, bao gm:
Panax japonicus var. japonicus (Sâm Nht Bn), P. japonicus var. bipinnatifidus (Sâm Vũ Diệp),
P. stipuleanatus (Tam tht hoang), P. notoginseng (Tam tht), P. pseudoginseng (Tam tht Bc),
P. vietnamensis var. vietnamensis (Sâm Ngc Linh), P. vietnamensis var. fuscidiscus (Sâm Lai
Châu), P. vietnamensis var. langbianensis (Sâm Langbian) P. zingiberensis (Tam tht gng)
[1]. Trong đó, Panax vietnamensis var. langbianensis (sâm Langbian) được Nông Văn Duy
cng s công b o năm 2016 [9].
Mi quan h phát sinh chng loi lch s tiến hóa ca chi Panax đã được nghiên cu bng
các vch phân t truyn thng ph biến như ITS, 18SRNA, trnC-trnD, matK, rbcL hay psbK-
psbL,… [10]-[13]. Vit Nam, vic ng dng mã vch phân t trong nghiên cu mi quan h phát
sinh các loài thuc chi Panax gần đây nhận được nhiu quan tâm. Nguyn Th Phương Trang
cng s đã sử dng trình t gen ITS-rDNA để phân tích lch s tiến hoá, mi quan h di truyn gia
sâm Ngc Linh (P. vietnamensis) các loài khác thuc chi Panax, cho thy P. vietnamensis
quan h gần gũi vi P. notoginseng mc s sai khác 18 nucleotide [14]. Nhóm nghiên cu
ca Phan Kế Long đã sử dng trình t ITS-rDNA matK để nghiên cu quan h phát sinh gia
các loài thuc chi Panax Vit Nam, kết qu nghiên cứu đã chỉ ra mi quan h gần gũi giữa sâm
Lai Châu sâm Ngc Linh [15]. Nguyn Th Phương Trang cùng các đng nghiệp đã sử dng
các vùng gen rbcLrpoL để phân bit các loài sâm Vit Nam [16], trong khi nhóm ca Lê Thanh
ơng đã khảo sát tiềm năng của 5 vch DNA ng dụng trong định loi các loài sâm Vit
Nam, kết qu đã xác đnh ITS psbA-trnH ch th đạt hiu qu cao nht [17]. Phm Quang
Tuyến và cng s cũng đã dùng trình tự ITS1-5.8S-ITS2 để nghiên cứu đa dạng di truyền, xác định
mi quan h tiến hóa ca 24 mu sâm Lai Châu [18].
Nn tng gii trình t gen thế h mới (Next Generation Sequencing: NGS) ra đi những năm
2000 đã giúp giảm 50.000 ln chi phí và th đọc trên toàn h gene (hàng t cặp base) tăng từ 100
đến 1000 lần lưu lượng xso vi công ngh trước đó của d án gii mã h gen người. D liu
lớn thu được t các nn tng gii trình t gene thế h mi (Illumina, IonTorrent, PGM, SOLiD,
454,…) thể s dng trong nghiên cu lp ráp, chú gii lp bản đ h gen (de novo assembly),
phân tích đa hình đơn nucleotide (SNPs/InDel), lp ráp, chú gii h phiên mã (de novo), nghiên
cứu xác định h SNPs đặc trưng cho các loài hay các dòng giúp cho công tác định danh, phân loi,
nghiên cu mi quan h phát sinh,
K thuật “xác định đặc tính di truyền các đoạn trình t đơn giản lp li (Inter Simple Sequence
Repeats: ISSR) bng gii trình t gene” (Multiplexed ISSR genotyping by sequencing: MIG-seq)
được phát trin bởi Suyama và Matsuki năm 2015 dựa trên nn tng công ngh gii trình t gene
TNU Journal of Science and Technology
230(01): 423 - 431
http://jst.tnu.edu.vn 425 Email: jst@tnu.edu.vn
thế h mi [19]. MIG-seq đã được Suyama cng s ng dng trong phân tích các biến d di
truyn theo các quy lut Mendel, di truyn qun thể, định danh các dòng, các cá th và trong phân
tích mi quan h phát sinh chng loi,… [20]. Phương pháp giải trình t gene MIG-seq cung cp
các ch th SNPs t các trình t đọc tương đối ngn trải đều trên toàn h gene, trái ngược vi các
đoạn DNA có b gene kéo dài liên tc. MIG-seq tương tự như RAD-seq [21], [22], tuy nhiên MIG-
seq thc hin mt phn ng PCR, không s dng enzyme ct gii hn và có th ng dng rng rãi
cho nhiu loi mẫu hơn là kỹ thut RAD-seq, k c mu bo tàng và hoá thch, thm chí vi cht
ng s ng DNA rt thp [19]. Khác vi các ch th phân t truyn thng, các mi dùng
trong MIG-seq th khuếch đại hiu qu hàng nghìn vùng trên toàn b h gen k c trong điều
kiện chưa có bt k thông tin di truyền gì trước đó, và cho phép phát hiện hàng trăm cho đến hàng
nghìn biến d di truyn (SNPs, InDel,…).
Vit Nam, vic ng dụng các phương pháp giải trình t gene thế h mới để nghiên cu mi
quan h phát sinh gia các loài thuc chi Panax còn hn chế, đc biệt chưa có nghiên cứu nào s
dụng phương pháp MIG-seq. Trong nghiên cu này, chúng tôi s dng các ch th SNPs được
t vic ng dụng phương pháp MIG-seq để nghiên cu làm rõ mi quan h phát sinh gia các loài
thuc chi Panax Vit Nam.
2. Vt liu và phương pháp nghiên cứu
2.1. Vt liu nghiên cu
Vt liu nghiên cu bao gm 30 mu lá đưc thu t các loài thuc chi Panax Vit Nam. Các
mẫu được Phm Quang Tuyến Trnh Ngc Bon, Vin Khoa hc Lâm nghip Việt Nam định
danh ban đầu dựa vào các đặc điểm hình thái. Theo đó, vật liu nghiên cu bao gm mu ca các
loài: sâm Ngc Linh P. vietnamensis (P01, P02), tam tht Bc P. pseudoginseng (P11, PB1,
PB2, PB3), sâm Diệp P. bipinnatifidus (PD1, PD2), sâm Lai Châu - P. vietnamensis var.
fuscidiscus (P03, P04, PV1, PV2), tam tht hoang P. stipuleanatus (PS1, PS2, PS3, PS4, TT41,
TT41A, TT42, TT42A) sâm Langbian - P. vietnamensis var. langbianensis (P10). Ngoài ra,
trong nghiên cu này có s dng 8 mẫu chưa được định danh, trong đó 4 mẫu (P06, P07, P08, P09)
được thu t Lai Châu và 4 mu (PT1G, PT2G, PT3G, PT3GA) thu t Tuyên Quang. Mu sâm Hàn
Quc P. ginseng (P05) thu tại vườn thc nghim khoa Sinh học, trường Đại học Đà Lt đưc la
chọn làm nhóm đối chng (out group). Thông tin chi tiết được được mô t ti Bng 1.
Bng 1. Danh sách các mu s dng trong nghiên cu
STT
Ký hiu mu
Tên khoa hc
Tên thông thường
Địa đim thu mu
1
P01
P. vietnamensis
Sâm Ngc Linh
Kon Tum
2
P02
P. vietnamensis
Sâm Ngc Linh
Kon Tum
3
P03
P. vietnamensis var. fuscidicus
Sâm Lai Châu
Tam Đường, Lai Châu
4
P04
P. vietnamensis var. fuscidicus
Sâm Lai Châu
Tam Đường, Lai Châu
5
P05
P. ginseng
Sâm Hàn Quc
Đại học Đà Lạt
6
P06
Panax sp.
Chưa biết
Tuyên Quang
7
P07
Panax sp.
Chưa biết
Tuyên Quang
8
P08
Panax sp.
Chưa biết
Tuyên Quang
9
P09
Panax sp.
Chưa biết
Tuyên Quang
10
P10
P. vietnamensis var. langbianensis
Sâm Langbian
Lâm Đồng
11
P11
P. pseudoginseng
Tam tht Bc
Lai Châu
12
PB1
P. pseudoginseng
Tam tht Bc
Tam Đường, Lai Châu
13
PB2
P. pseudoginseng
Tam tht Bc
Tam Đường, Lai Châu
14
PB3
P. pseudoginseng
Tam tht Bc
Tam Đường, Lai Châu
15
PD1
P. bipinnatifidus
Sâm Vũ Diệp
Tam Đường, Lai Châu
16
PD2
P. bipinnatifidus
Sâm Vũ Diệp
Tam Đường, Lai Châu
17
PS1
P. stipuleanatus
Tam tht hoang
Sapa, Lào Cai
18
PS2
P. stipuleanatus
Tam tht hoang
Sapa, Lào Cai
19
PS3
P. stipuleanatus
Tam tht hoang
Sapa, Lào Cai
TNU Journal of Science and Technology
230(01): 423 - 431
http://jst.tnu.edu.vn 426 Email: jst@tnu.edu.vn
STT
Ký hiu mu
Tên khoa hc
Tên thông thường
Địa đim thu mu
20
PS4
P. stipuleanatus
Tam tht hoang
Sapa, Lào Cai
21
PT1G
Panax sp.
Chưa biết
Tuyên Quang
22
PT2G
Panax sp.
Chưa biết
Tuyên Quang
23
PT3G
Panax sp.
Chưa biết
Tuyên Quang
24
PT3GA
Panax sp.
Chưa biết
Tuyên Quang
25
PV1
P. vietnamensis var. fuscidicus
Sâm Lai Châu
Tam Đường, Lai Châu
26
PV2
P. vietnamensis var. fuscidicus
Sâm Lai Châu
Tam Đường, Lai Châu
27
TT41
P. stipuleanatus
Tam tht hoang
Sapa, Lào Cai
28
TT41A
P. stipuleanatus
Tam tht hoang
Sapa, Lào Cai
29
TT42
P. stipuleanatus
Tam tht hoang
Sapa, Lào Cai
30
TT42A
P. stipuleanatus
Tam tht hoang
Sapa, Lào Cai
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp tách chiết DNA
DNA tng s đưc tách chiết t các mẫu đã được sy khô trong túi silicagel bng phương
pháp CTAB [23] vi s điu chnh nh theo mô t ca Toyama cng s [24]. DNA sau khi đưc
tách s được kim tra nồng độ độ tinh sch bng máy NanoDrop (Hoa Kỳ) được lưu tr
nhiệt độ -40oC để dùng cho các phân tích phân t tiếp theo.
2.2.2. Phương pháp gii trình t gene thế h tiếp theo (MIG-seq)
DNA tng s được pha loãng nồng độ 10 pM/μl làm khuôn mẫu để khuếch đại hàng nghìn
chui trình t ngn ca các vùng Inter-simple sequence repeats (ISSR) vi b mi PCR tiêu chun
theo Suyama và Matsuki [19], [25]. Mi xuôi và mồi ngược ca phn ng PCR th nht có chiu
dài 31 nucleotide, bao gm 14 nucleotide trình t đuôi, 3 nucleotide mỏ neo, 12 nucleotide vùng
SSR, cui cùng là 2 nucleotide m neo th hai đầu 3’. S khác bit gia mi xuôi và mồi ngược
ch trong trình t đuôi ca chúng. Nhiệt độ bt cp thp (48oC) được s dụng để tăng khả năng
khuếch đại vùng ISSR hơn, bao gồm c mt s bt cp không hoàn toàn khp [19], [20].
Phn ứng PCR đầu tiên được thc hin nhm khuếch đại các vùng ISSR t b gene DNA bng
s kết hp PCR với đoạn mồi đuôi ISSR. Theo đó, thành phần ca phn ng PCR th nht bao
gồm: 1 μl DNA mu, 0,2 μM của mi mi PCR th nht, 3,5 μl dung dịch đệm PCR (Multiplex
PCR Assay Kit Ver.2, Takara Bio, Kusatsu, Japan), 0,035 μl hỗn hp enzyme PCR (Multiplex
PCR Assay Kit Ver.2, Takara Bio). Điều kin thc hin phn ng PCR th nhất như sau: Bước
kích hoạt ban đầu 94°C trong 1 phút, 25 chu k khuếch đại (mi chu k khuếch đại bao gm:
Biến tính 94°C trong 30 giây, bt cp 48°C trong 1 phút, kéo dài 72°C trong 1 phút), bước
cui cùng 72°C trong 10 phút. Sn phẩm PCR được kim tra bng h thống đin di vi mch
(MultiNA; Shimadzu, Kyoto, Nht Bn) vi thuc th DNA-2500 (Shimadzu).
Mi sn phm ca phn ng PCR th nht s được pha loãng xung 50 ln bằng nước ct
sau đó s dng làm mu cho phn ng PCR th hai (phn ng PCR gắn đuôi). Bước này cho phép
thêm các trình t b sung để gn các vùng ca tế bào Flow cell trên máy gii trình t Illumina
các ch du đối vi tng mu cho các sn phm ca phn ng PCR th nht, s dng cp mi xuôi
mồi ngược đã được ch du (index) riêng cho tng mu. Trình t mi xuôi: 5'-
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACXXXXXACACTCTTTCCCTACACGACGCT
CTTCCGATCTCTG-3', trình t mồi ngược: 5'-
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATxxxxxxxxxGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCT
TCCGATCTGAC-3' (trong đó "XXXXX" "xxxxxxxxx’" biểu th ch du gồm 5 9 base tương
ng vi mi xuôi và mồi ngược) [19], [20].
Thành phn phn ng PCR th 2 gm: 2,5 μl sản phm PCR th nhất đã pha loãng, 2,4 μl dung
dịch đệm PrimeSTAR GXL 5X (Takara Bio), 0,96 μM dNTP mixture, 0,24 μl enzym DNA
polymerase PrimeSTAR GXL (Takara Bio), 1,2 μl mỗi loi mi xuôi mồi ngược, 3,5 μl nước
ct. Phn ng PCR th 2 được chy theo 20 chu k khuếch đại. Mi chu k bao gm: Biến tính
TNU Journal of Science and Technology
230(01): 423 - 431
http://jst.tnu.edu.vn 427 Email: jst@tnu.edu.vn
98°C trong 10 giây, bt cp 54°C trong 15 giây kéo dài 68°C trong 30 giây. Sau đó, 3 μl
mi sn phm ca phn ng PCR th 2 s đưc cho vào một thư viện hn hp. Hn hp này sau
đó được tinh sch và các phân đoạn với kích thước t 350800 bp s đưc chn bi mt h thng
chn lọc kích thước Pipin Prep DNA (Sage Science, Beverly, MA, USA). Nồng độ cuối cùng được
đo bằng phn ứng định lượng PCR, thư viện mu vi nồng độ khong 10 pM s được dùng cho
vic gii trình t gene trên thiết b Illumina MiSeq Sequencer (Illumina, San Diego, CA, USA) s
dng b Kit MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycle, Illumina).
Để đảm bảo thu được s ng và chất lượng trình t đọc (read) ln nht, nhóm nghiên cứu đã
thc hin chy 2 ln MIG-seq cho tt c các mu nghiên cu. D liệu thu được t 2 ln chy s
được t hợp để có đưc b d liu tối ưu thực hin các phân tích tiếp theo.
2.2.3. Chn lọc các điểm đa hình đơn nucleotide (SNPs)
D liệu thu được bằng phương pháp MIG-seq s đưc kim soát chất lượng bng phn mm
Trimmomatic phiên bản 0.39 [26]. Sau đó, chương trình Population trong phn mm Stacks [27]
được s dụng để gọi các điểm đa hình đơn nucleotide theo các thông số đưc thiết lập như mô t
trong các nghiên cứu trước đó [28], [29]. D liệu SNPs thu được s đưc s dụng để xây dng cây
phát sinh chng loi.
2.2.4. Phương pháp phân tích phát sinh chủng loi
Phn mềm RAxML ver. 8.2 [30] được s dụng để xây dng cây phát sinh chng loi da vào
d liu SNPs bằng phương pháp Maximum likelihood và mô hình tiến hoá GTR + G theo khuyến
ngh ca jMmodelTest 2.1.1 [31]. Hình thái cây phát sinh đưc khẳng định bng vic thc hin
phương pháp bootstrap lặp li 1000 ln.
3. Kết qu và bàn lun
3.1. Kết qu tách chiết DNA và gii trình t gen bằng phương pháp MIG-seq
Tt c 30 mu Panax đưc tách chiết gii tnh t thành công bng phương pp MIG-seq. Theo
nh 1, tt c các mu s ng trình t đọc thô (đưng solid line), s ng trình t đọc sau khi ct
adapter (dashed line) và s ng trình t đọc đt cht lượng (dotted line) đt trên 10000 read.
Hình 1. Tng s ng trình t đọc thu đưc sau hai ln chy MIG-seq
Kết qu tng hp sau 2 ln chy MIG-seq thu được mu s ng trình t đọc thp nht
(11122 read) là P10 (P. vietnamensis var. Langbianensis), mu s ng trình t đọc cao nht