Chương 3: Ứng dụng vi sinh vật trong CNTP
3.3. Tổng hợp acid amin bằng phương pháp vi sinh vật
3.3.1. Bản chất của quá trình
3.3.2. Sản xuất acid glutamic và bột ngọt
3.3.3. Sản xuất Lysin bằng phương pháp vi sinh
3.3.1. Bản chất của quá trình tổng hợp acid amin bằng
phương pháp vi sinh vật
• Acid amin
▫ Axit amin là những hợp chất hữu cơ mạch thẳng hoặc mạch vòng trong phân tử có chứa ít nhất một nhóm amin(-NH2) và một nhóm cacboxyl (-COOH)
▫ Tính chất của từng amino axit phụ thuộc vào cấu tạo, kích
thước và diện tích của(-R)
▫ amino axit mang cả tính bazơ lẫn tính axit (lưỡng tính) ▫ Amino axit ở trạng thái tinh thể rắn, không màu hầu hết hòa
tan dễ trong nước
3.3.1. Bản chất của quá trình tổng hợp acid
amin bằng phương pháp vi sinh vật
• Các phương pháp sản xuất acid amin
▫ Phương pháp thủy phân ▫ Phương pháp tổng hợp hóa học ▫ Phương pháp kết hợp ▫ Phương pháp tổng hợp acid amin bằng công nghệ vi
sinh vật
3.3.1. Bản chất của quá trình tổng hợp acid amin
bằng phương pháp vi sinh vật • Các phương pháp sản xuất acid amin
▫ Phương pháp thủy phân:
Người ta dùng acid hoặc kiềm để thủy phân các nguyên liệu
chứa nhiều protein
Phương pháp này có nhược điểm là cần thiết bị chịu acid hoặc
chịu kiềm
Trong trường hợp sử dụng kiềm để thủy phân sẽ tạo ra nhiều
acid amin dạng D
Trong trường hợp sử sụng acid để thủy phân sẽ tạo ra ô nhiễm
môi trường không khí do lượng acid dư bay hơi trong quá trình thủy phân
Giá thành thường cao
3.3.1. Bản chất của quá trình tổng hợp acid amin
bằng phương pháp vi sinh vật • Các phương pháp sản xuất acid amin
▫ Phương pháp tổng hợp hóa học:
Đây cũng là phương pháp được áp dụng nhiều trong thực tế. Tuy nhiên, phương pháp này cũng lại cho ra những acid amin raxemic ( hỗn hợp acid amin dạng D và dạng L )
Việc tách 2 loại acid amin này ra rất tốn kém
3.3.1. Bản chất của quá trình tổng hợp acid amin
bằng phương pháp vi sinh vật • Các phương pháp sản xuất acid amin
▫ Phương pháp kết hợp:
Người ta kết hợp phương pháp hóa học và phương pháp sinh
học
Bằng con đường hóa học, người ta thu nhận hợp chất dạng L –
Keto và các tiền chất của acid amin
Sau đó người ta sử dụng vi sinh vật để chuyển hóa những chất
này thành acid amin
3.3.1. Bản chất của quá trình tổng hợp acid amin
bằng phương pháp vi sinh vật • Các phương pháp sản xuất acid amin
▫ Phương pháp tổng hợp acid amin bằng công nghệ vi sinh vật :
Phương pháp này lợi dụng khả năng sinh tổng hợp thừa một số loại acid amin của một số vi sinh vật, người ta nuôi cấy vi sinh vật để thu nhận các acid amin.
Phương pháp này cho phép ta thu nhận acid amin dạng L Nguyên liệu sản xuất rẻ, dễ kiếm Tốc độ trao đổi chất, tốc độ sinh sản và phát triển mạnh của vi
sinh vật cho phép ta được năng suất cao
Giá thành sản phẩm thấp hơn giá thành sản phẩm từ những
phương pháp khác
3.3.1. Bản chất của quá trình tổng hợp acid amin
bằng phương pháp vi sinh vật
• Cơ chất cho pp vi sinh vật:
▫ Nguồn Cacbon: hydrohydrate (glucose , fructose, sucrose, maltose, lactose, dịch thủy phân tinh bột , cellulose, mật rỉ…), các acid hữu cơ, rượu…
▫ Nguồn nitơ:
N vô cơ: anoniac lỏng hay khí, amoni sulfate, amoni
nitrate, amoni phosphate, amoni clorua, amoni carbonate…
N hữu cơ: amoni acetate, nước chiết nấm men, nước chiết
thịt , nước chiết malt,ure, peptone và các amino acid
▫ Nguồn khoáng và các nguyên tố vết: KH2PO4 ▫ Nguồn Vitamin: vitamin H và vitamin B1
3.3.2. Sản xuất acid glutamic và bột ngọt
▫ Axit glutamic (Glu) là một loại axit amin có trong protein thiên nhiên, thường thấy trong cơ thể động vật và thực vật dưới nhiều dạng khác nhau
▫ Glutamine(Gln) là một axit amin rất quan trọng
trong cơ thể người • Bột ngọt: C5H8NO4Na
▫ Bột ngọt (hay mì chính) là tên thường gọi của Monosodium Glutamate (viết tắt là MSG),
▫ Là muối của axit glutamic, một trong hơn 20 loại
axit amin để kiến tạo nên protein cơ thể
▫ Tên thường gọi: Natri glutamat ▫ Mã quốc tế và cộng đồng châu Âu: INS 621, EEC
621
• Axit glutamic: C5H9NO4
3.3.2. Sản xuất acid glutamic và bột ngọt
• Vai trò axit glutamic và bột ngọt
▫ Axit glutamic
Trao đổi chất của người và động vật Xây dựng protit, cấu tử tế bào, tổng hợp các aa khác Tham gia vào phản ứng chuyển amin, giúp cho cơ thể chuyển hóa nhóm amin và tách NH3 ra khỏi cơ thể Tổng hợp chất hoạt động bề mặt N-acetylglutamat Acetylglutamat dùng trong xử lý ô nhiễm nước biển do
dầu hỏa và dầu thực vật
Làm thuốc chữa bệnh thần kinh và tâm thần, hôn mê gan,
bại liệt ▫ Bột ngọt
Chất điều vị: giống với vị của thịt Chuyển hóa chất bổ dưỡng trong cơ thể con người
3.3.2. Sản xuất acid glutamic và bột ngọt
• Các phương pháp sản xuất axit glutamic
▫ Phương pháp tổng hợp hóa học ▫ Phương pháp thủy phân protit ▫ Phương pháp lên men ▫ Phương pháp kết hợp
3.3.2. Sản xuất acid glutamic và bột ngọt
• Các phương pháp sản xuất axit glutamic
▫ Phương pháp tổng hợp hóa học
Ứng dụng các phản ứng tổng hợp hóa học để tổng hợp nên các axit glutamic và các aminoaxit khác từ các khí thải của công nghiệp dầu hỏa và các ngành công nghiệp khác Ưu điểm: có thể sử dụng các nguồn nguyên liệu không phải là thực phẩm, tận dụng được phế liệu CN dầu hỏa Nhược điểm: thực hiện ở các nước có CN dầu hỏa phát
triển và yêu cầu kỹ thuật cao. Tạo ra hỗn hợp không quay cực D, L – axit glutamic, việc tách L- axit glutamic ra lại khó khăn làm tăng giá thành sản phẩm
3.3.2. Sản xuất acid glutamic và bột ngọt
• Các phương pháp sản xuất axit glutamic
▫ Phương pháp thủy phân protit
Sử dụng các tác nhân xúc tác là các hóa chất hoặc fecmen để thủy phân protit thành hỗn hợp amino axit, từ đó tách các axit glutamic ra và sản xuất bột ngọt
Ưu điểm: dễ khống chế quy trình sản xuất và được ứng dụng vào các cơ sở sản xuất thủ công, bán cơ giới và cơ giới dễ dàng
Nhược điểm: cần sử dụng nguyên liệu giàu protit hiếm và đắt, cần nhiều hóa chất và các thiết bị chống ăn mòn, hiệu suất thấp nên giá thành cao
3.3.2. Sản xuất acid glutamic và bột ngọt
• Các phương pháp sản xuất axit glutamic
▫ Phương pháp lên men
Lợi dụng một số VSV (Micrococcus glutamicus, Brevi
bacterium) có khả năng tổng hợp ra các axit amin từ các nguồn gluxit và đạm vô cơ
Ưu điểm : không sử dụng nguyên liệu protit, không cần dùng nhiều hóa chất và các thiết bị chống ăn mòn , hiệu suất cao, hạ giá thành, tạo ra L- axit glutamic có hoạt tính sinh học cao
3.3.2. Sản xuất acid glutamic và bột ngọt
• Các phương pháp sản xuất axit glutamic
▫ Phương pháp kết hợp
Là phương pháp tổng hợp hóa học và vi sinh vật học Phương pháp vi sinh vật học tổng hợp nên các axit amin từ các nguồn đạm vô cơ và gluxit mất nhiều thời gian, do đó người ta lợi dụng các phản ứng tổng hợp tạo nên những chất có cấu tạo gần giống axit amin ,từ đó lợi dụng vi sinh vật tạo ra axit amin.
Phương pháp này tuy nhanh nhưng yêu cầu kỹ thuật cao, chỉ áp dụng vào nghiên cứu, ít áp dụng vào công nghiệp sản xuất
3.3.2. Sản xuất acid glutamic và bột ngọt • Các chủng vi sinh tham gia vào quá trình tổng hợp
Brevibacterium Lactofermentus, Micrococus Glutamicus; chủ yếu là Corynebacterium Glutamicum (do Kinosita phát hiện từ 1956)
▫ Giống vi khuẩn thuần khiết này được lấy từ ống thạch nghiêng tại các cơ sở giữ giống, sau đó được cấy truyền, nhân sinh khối trong môi trường lỏng, nhân lên đến yêu cầu sản xuất đại trà ▫ Chủng vi khuẩn giống phải có khả năng tạo ra nhiều axit
glutamic, tốc độ sinh trưởng phát triển nhanh, có tính ổn định cao trong thời gian dài, chịu được nồng độ axit cao, môi trường nuôi cấy đơn giản, dễ áp dụng trong thực tế sản xuất
axit glutamic ▫ VSV thường sử dụng: Corynebacterium Glutanicum,
3.3.2. Sản xuất acid glutamic và bột ngọt
Tinh bột
Rỉ đường
Thủy phân
Xử lí
Trung hòa
Lọc dịch xử lí
Ống gốc
Lọc
Pha loãng
Pha chế dịch lên men
Nhân giống cấp I
Thanh trùng
Nhân giống cấp II
Làm nguội
Nhân giống cấp
Lên men
• QTCN theo pp lên men
3.3.2. Sản xuất acid glutamic và bột ngọt
Pha loãng
Sấy
Trao đổi ion
Tinh thể
Kết tinh
Bao gói
Ly tâm
Nước cái
Bảo quản
Axit glutamic ẩm
Sản phẩm
• QTCN theo pp lên men
3.3.2. Sản xuất acid glutamic và bột ngọt
• Các sản phẩm của quá trình lên men
▫ Sản phẩm chính: L-Glu và CO2 (hiệu suất lý thuyết: 81,66%
, thực tế SX: 45 - 50%) Glucoza + NH3 + 1,5 O2
L-Glu + CO2 + 3 H2 L-Glu + CO2 + 3 H2
3 axetat + NH3 + 1,5 O2 ▫ Sản phẩm phụ:
Acid lactic: chiếm tỉ lệ nhỏ, do quá dư thừa biotin hay
thiếu hụt O2
Acid Succinic: cũng tạo ra khi thừa biotin hay thiếu O2 Acid -xetoglutaric: khi thiếu NH4+ và pH acid Sp khác: glutamin, L-acetylglutamin, alanin và aspartic…
3.3.2. Sản xuất acid glutamic và bột ngọt • Công đoạn trao đổi ion: Tách lấy acid Glutamic khỏi dịch lên men
bằng hạt nhựa Polyetylen sunfuric (Rezin). Quá trình trao đổi nhựa ion gồm các quá trình sau: ▫ Quá trình hấp phụ : R’-SO3H+ + NH3ROO- R’SO3NH3RCOOH ▫ Quá trình tách: R’SO3NH3RCOOH +NaOH R’SO3Na + NH2RCOOH + H2O
Dịch lên men
Dịch thải/nước
Pha chế dịch lên men
Xử lý nhựa Rafin
Acid HCl
Dịch rửa
Trao đổi ion
Nước
Acid glutamic và dịch thải
• Chỉ tiêu chất lượng sản phẩm (TCVN 1459-1996, QĐ 867/98 QĐ-BYT)
3.3.2. Sản xuất acid glutamic và bột ngọt
STT
Chỉ tiêu thử nghiệm
Phương pháp
Yêu cầu
<0.50
TCVN 5533-91
Độ ẩm
1
TCVN 4835-02
6.70-7.20
pH
2
Hàm lượng tro không tan trong
TCVN 5612-91
Không quy định
3
HCl (g/100g)
Hàm lượng Acid Acetic (g/100g).
TCVN 5564-91
Không quy định
4
Hàm lượng Glutamate (g/100g)
TCVN 5705-90
>99.00
5
Hàm lượng chì Pb (mg/kg).
AOAC 96 (973.82)
<2.00
6
Hàm lượng Asen As (mg/kg)
AOAC 96 (993.14)
<5.00
7
Tổng lượng vi khuẩn hiếu khí/g
TCVN 5667-92
104
8
Coliform/g
TCVN 4882-01
102
9
10
E.coli/g
TCVN 5155-90
3
3.3.3. Sản xuất Lysin bằng phương pháp vi sinh
• Giới thiệu:
▫ Là aa “ không thay thế” ▫ Giúp chuyển hóa protein, tổng hợp
hemoglobin, điều hòa hệ thần kinh, sinh dục nam, chuyển hóa axit nucleic, chuyển hóa canxi, dự trữ N…
▫ Giảm độc tính của gossypol trong khô dầu bóng ▫ Tăng cường tiết dịch tiêu hóa ▫ Trộn 0.1-0.4% lysine vào thức ăn, sẽ làm tăng
hiệu quả sử dụng thức ăn, giảm chi phí thức ăn, tăng trọng, tăng khả năng chống đỡ bệnh tật
3.3.3. Sản xuất Lysin bằng phương pháp vi sinh
• Các phương pháp sản xuất lysine
▫ Phương pháp thủy phân ▫ Phương pháp tổng hợp hóa học ▫ Phương pháp lên men ▫ Phương pháp chuyển hóa sinh học
3.3.3. Sản xuất Lysin bằng phương pháp vi sinh
▫ Phương pháp thủy phân
Người ta dùng acid hoặc kiềm để thủy phân các nguyên liệu chứa nhiều protein. Cơ chất là bột mì, bột đậu nành, Protein từ máu, keratin…
Phương pháp này đơn giản dễ thực hiện nên được sử dụng rộng
rãi
Hiệu suất rất thấp, khó thực hiện, và khó điều khiển các thông số Vấn đề tinh sạch rất khó khăn nên dạng sản phẩm tạo ra sẽ nằm dưới dạng tổ hợp và ứng dụng làm thức ăn cho gia súc, gia cầm
Cần thiết bị chịu acid hoặc chịu kiềm Giá thành sản phẩm cao
• Các phương pháp sản xuất lysine
3.3.3. Sản xuất Lysin bằng phương pháp vi sinh
• Các phương pháp sản xuất lysine
▫ Phương pháp tổng hợp hóa học
Ưu điểm là sản xuất ổn định, có thể chuẩn hóa điều kiện
sản xuất và hiệu suất
Nhược điểm là tạo ra các đồng phân dạng D mà cơ thể không thể sử dụng được nên vấn đề tách ra khó khăn Ứng dụng trong công nghệ hóa học hay là làm thức ăn
cho 1 số loài gia cầm
3.3.3. Sản xuất Lysin bằng phương pháp vi sinh
• Các phương pháp sản xuất lysine
▫ Phương pháp lên men
Nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường thức ăn để lấy acid
amine
Đây là phương pháp thông dụng nhất, sản lượng và sản
phẩm tạo ra có chất lượng cao hơn, giá thành sản phẩm rẻ hơn
Tận dụng được những nguồn cơ chất rẻ tiền , đơn giản Phương pháp tiến hành và điều khiển thông số dễ dàng
3.3.3. Sản xuất Lysin bằng phương pháp vi sinh
Dùng những sinh khối của vi sinh vật để chuyển hóa 1 cơ chất thành
sản phẩm thông qua 1 hay 2 phản ứng
Vấn đề tinh sạch và điều khiển thông số khó hơn phương pháp lên
men
Khó thực hiện vì phản ứng có thể là nội bào hay ngoại bào nên không
có cơ chế điều hòa của vi sinh vật
Cơ chất tham gia phải có cấu tạo tương tự như sản phẩm. Nên phạm
vi ứng dụng bị hạn chế
Để khắc phục người ta kết hợp với phương pháp hóa học: tổng hợp ra các tiền thân của các acid amine sau đó dùng vi sinh vật để chuyển thành L- lysine
• Các phương pháp sản xuất lysine ▫ Phương pháp chuyển hóa sinh học
3.3.3. Sản xuất Lysin bằng phương pháp vi sinh
• Các VSV tổng hợp lysine :
▫ Có nhiều loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp được Lysine: Corynebacterium acetophilum, Micrococcus glutamicum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, Bacillus methanolicus, Ustilago maydis, Torulopsis utilis, Bacillus megaterium, Aerobacter derogences, Escherichia coli, Streptomyces coloniformis, Mycobacterium tuberculosis,, Pseudomonas fluorescens…
▫ VSV dùng trong công nghiệp : Micrococcus glutamicum Brevibacterium flavum Brevibacterium lactofermentum Corynebacterium glutamicum
Corynebacterium glutamicum
Brevibacterium lactofermentum
3.3.3. Sản xuất Lysin bằng phương pháp vi sinh
• Con đường sinh tổng hợp lysine của vi khuẩn
Corynebacterium glutamicum :
3.3.3. Sản xuất Lysin bằng phương pháp vi sinh
• Quy trình công nghệ:
3.3.3. Sản xuất Lysin bằng phương pháp vi sinh
• Hệ thống lên men:
3.3.3. Sản xuất Lysin bằng phương pháp vi sinh
• Hệ thống lọc:
3.3.3. Sản xuất Lysin bằng phương pháp vi sinh
• Sấy phun:
3.3.3. Sản xuất Lysin bằng phương pháp vi sinh
• Sản phẩm:
▫ Sản phẩm lysine dưới dạng bột
L - Lysine – HCl L- lysine sulphate
▫ Sản phẩm lysine dưới dạng thuốc bổ
Chương 3: Ứng dụng vi sinh vật trong CNTP
3.4. Tổng hợp enzyme bằng phương pháp vi sinh
3.4.1. Phương pháp tổng hợp enzyme từ vi sinh
3.4.2. Tổng hợp enzyme amylase
3.4.3. Tổng hợp enzyme protease
3.4.4. Tổng hợp pectinase
3.4.5. Tổng hợp cellulase
3.4.1. Phương pháp tổng hợp enzyme từ vi sinh
• Nguyên tắc:
▫ Nuôi cấy tăng sinh khối chủng vi sinh vật có khả năng
tổng hợp nhiều enzyme mong muốn trong môi trường
dinh dưỡng thích hợp
▫ Tách chiết, tinh sạch enzyme từ sinh khối vi sinh vật
3.4.2. Tổng hợp enzyme amylase
• Giới thiệu
▫ QT thủy phân Tinh bột thành đường glucose dùng trong
SX rượu, bia, giấy, thuộc da...
▫ Có thể dùng acid để thủy phân tinh bột, nhưng rất khó kiểm soát và tạo SP không mong muốn, không ATTP, giá thành lại cao
▫ Dùng amylase có nhiều ưu điểm: năng lượng xúc tác thấp, không yêu cầu cao về thiết bị, giảm chi phí tinh sạch
▫ Amylase có ở TV, ĐV và VSV VSV thích hợp nhất
3.4.2. Tổng hợp enzyme amylase
• PHÂN LOẠI
Endoamylase (Enzyme nội phân) Exoamylase (Enzyme ngoại phân)
▫ Hiện nay có 6 loại Enzyme Amylase được xếp làm 2 nhóm:
3.4.2. Tổng hợp enzyme amylase • Enzyme alpha-Amylase (EC3.2.1.1):
▫ M = 50.000 – 60.000 Dal ▫ Cắt lk 1,4 α-glucoside tại vị trí bất kỳ ▫ Chuỗi mạch acid amin có cấu trúc bậc 3 tương tự nhau:
3.4.2. Tổng hợp enzyme amylase
• Enzyme β-amylase (EC 3.2.1.2)
▫ Phổ biến ở thực vật, đặc biệt là hạt nảy mầm ▫ Thủy phân các liên kết 1,4 α-glucoside từng nhóm maltose
từ đầu không khử của mạch tinh bột
▫ M ~ 64.000 Dal
3.4.2. Tổng hợp enzyme amylase
• Enzyme γ-amylase (Glucoamylase)
▫ Thủy phân được 2 kiểu lk 1,4 và 1,6 ▫ Chủ yếu được tạo ra bởi các vi sinh vật. ▫ M = 27.000 – 112.000 Dal ▫ Chứa các gốc methioni, tritophan và cystein
3.4.2. Tổng hợp enzyme amylase
• Enzyme pullulanase (EC 3.2.1.41)
▫ Thủy phân được liên kết α-1,6 của tinh bột, glucogen,
pullulan và các dextrin tới hạn
▫ Nhiều loại nấm sợi sản sinh ra loại enzyme này
3.4.2. Tổng hợp enzyme amylase
▫ Enzyme có ở hầu hết mọi thực vật, động vật và vi sinh vật nhưng chỉ một số có khả năng tích lũy một lượng lớn các enzyme này trong những điều kiện xác định.
▫ Nguồn enzyme ở VSV phong phú nhất:
VSV có khả năng chuyển hóa một khối lượng cơ chất lớn hơn khối
lượng cơ thể hàng chục ngàn lần sau một ngày đêm
Enzyme thu nhận từ VSV có hoạt tính cao hơn Tốc độ sinh sản của vi sinh vật mạnh VSV có cơ thể nhỏ bé nên vận hành SX đơn giản VSV thích hợp cho sản xuất quy mô công nghiệp VSV không đòi hỏi quá khắc khe về dinh dưỡng rẻ tiền VSV có thể sinh tổng hợp cùng lúc nhiều loại enzyme khác nhau
• NGUỒN THU NHẬN ENZYME AMYLASE
3.4.2. Tổng hợp enzyme amylase • NGUỒN THU NHẬN ENZYME AMYLASE
▫ Nguồn động vật:
Enzyme amylase có trong tụy tạng của động vật Tụy tạng là ống dạng chùm, dài, lớn, nằm ngang phía sau
dạ dày, giữa lá lách và tá tràng
Tụy tạng vừa có chức năng nội tiết vừa có chức năng ngoại
tiết
Thu nhận amylase từ động vật phần lớn là từ dịch tụy tạng 98% tụy tạng được cấu tạo từ các tế bào ngoại tiết hoặc là tế
bào tuyến
Các tế bào này tiết enzyme tiêu hoá vào trong tá tràng
3.4.2. Tổng hợp enzyme amylase • NGUỒN THU NHẬN ENZYME AMYLASE
Đại mạch (Hordeum sativum): có giống hai hàng và giống nhiều hàng (4,6 hàng), trong đó người ta sử dụng loại hai hàng để sản xuất malt làm bia, những loại còn lại để làm thức ăn cho gia súc
Lúa (Oryse sativa L): Chủ yếu ở vùng Đông Nam Á Ngô (Zea mays): có nhiều loại ngô: ngô đá, ngô bột, ngô răng ngựa. Hạt ngô có màu trắng,màu vàng hay màu hồng. Ngô màu vàng do có sự hiện diện của carotenoid và zeaxanthine ở trong nội nhũ, ngô màu hồng là do trong nội nhũ của ngô có anthocyanin
▫ Nguồn thực vật:
3.4.2. Tổng hợp enzyme amylase
▫ Nấm sợi Aspergillus, Rhizopus ▫ Nấm men và giả nấm men thuộc các giống: Candida,
Saccharomyces, Endomycopsy, Endomyces.
▫ Nhiều vi khuẩn có khả năng tạo lượng lớn Amylase như: Bac. Polymyxa, Phytomonasdestructans, Bact. cassavanum, Clostridium acetobutylium, Pseudomonas saccharophila.
• Nguồn vi sinh vật:
3.4.2. Tổng hợp enzyme amylase
• TH amylase từ VSV theo pp nuôi cấy bề mặt:
3.4.2. Tổng hợp enzyme amylase
Asp. Oryzae
• TH amylase từ VSV theo pp nuôi cấy bề sâu:
3.4.2. Tổng hợp enzyme amylase
• TH amylase từ VSV theo pp nuôi cấy bề sâu:
3.4.2. Tổng hợp enzyme amylase
• TH amylase từ VSV theo pp nuôi cấy bề sâu:
3.4.3. Tổng hợp enzyme protease
• Giới thiệu:
▫ Nhóm enzyme protease(peptit-hidrolase) xúc tác qt thủy
phân lk peptit(-CO-NH-)n của protein, polypeptit thành axit amin
▫ Protease cũng có khả năng thủy phân liên kết ester và vận
chuyển axit amin.
3.4.3. Tổng hợp enzyme protease
▫ Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4)
• Phân loại protease
Peptidase (Protease)
Exopeptidase
Endopeptidase
(E.C. 3.4.11-17)
(E.C. 3.4.21-99)
Serine proteinase
Aminopeptidase
Cystein proteinase
Carboxypeptidase
Aspartic proteinase
Metallo proteinase
(E.C.3.4)
3.4.3. Tổng hợp enzyme protease
• Phân loại protease: Protease được phân chia thành hai
loại: Endopeptidase và exopeptidase. ▫ Exopeptidase: Dựa vào vị trí tác động trên mạch
polypeptide, exopeptidase được phân chia thành hai loại: Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗ̉i polypeptide để giải phóng ra một amino axit, một dipeptide hoặc một tripeptide.
Cacboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở
đầu C của chuỗi polypeptide và giải phóng ra một amino axit hoặc một dipeptide.
3.4.3. Tổng hợp enzyme protease
• Phân loại protease:
▫ Endopeptidase: Dựa vào động học của cơ chế xúc tác,
endopeptidase được chia thành 4 nhóm: Serin proteinase: chứa nhóm –OH của gốc Serin trong trung tâm hoạt động, gồm chymotrypsin và subtilisin, hoạt động mạnh ở pH kiềm
Cyteine proteinase: chứa nhóm –SH trong trung tâm
hoạt động, gồm papayin,bromelin...
Aspartic proteinase: chứa nhóm -COOH, gồm pepsin,
chymosin, cathepsin, renin..., pH trung tính.
Metallo proteinase: chứa KL, pH trung tính và hoạt độ
giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA
3.4.3. Tổng hợp enzyme protease
• Phân loại protease:
▫ Ngoài ra, protease được phân loại một cách
đơn giản hơn thành 3 nhóm: Protease acid: pH 2-4 Protease trung tính: pH 7-8 Protease kiềm: pH 9-11
3.4.3. Tổng hợp enzyme
protease
• Nguồn thu nhận enzym protease:
▫ Nguồn thực vật:
Papain thu được từ nhựa của lá, thân,
quả đu đủ (Carica papaya)
Bromelain thu từ quả, chồi dứa, vỏ
dứa (Pineapple plant). dùngchống lại hiện tượng tủa trắng của bia khi làm lạnh (chilling proofing) và trong công nghệ làm mềm thịt
Ficin thu được từ nhựa cây cọ (Ficus
carica)
3.4.3. Tổng hợp enzyme
protease
• Nguồn thu nhận enzym protease:
▫ Nguồn động vật
Tụy tạng: Trypsin, chymotrypsin Dạ dày bê: renin dùng trong công
nghệ phomat, biến đổi cazein thành paracazein gây đông tụ sữa
3.4.3. Tổng hợp enzyme protease
• Nguồn thu nhận enzym protease:
▫ Nguồn vi sinh vật
Vi khuẩn: Bacillus subtilis, B. mesentericus,
B. thermorpoteoliticus và một số giống Clostridium
Nấm mốc: Aspergillus oryzae, A. terricola, A.
fumigatus, A. saitoi, Penicillium chysogenum, A. candidatus, P. cameberti, P. roqueforti…
Xạ khuẩn: Streptomyces grieus, S. fradiae, S.
Trerimosus...
3.4.3. Tổng hợp enzyme protease
• Thu nhận enzym bromelin từ cây dứa:
Quả, thân,chồi
Xay nhuyễn
Chế phẩm bromelin thô
Kết tủa
Chiết lọc
Ly tâm
Dịch lọc
Sấy khô
Ly tâm
Tinh sạch
Dịch ly tâm
Sản phẩm enzym tinh khiết
3.4.3. Tổng hợp enzyme protease
• Thu nhận enzyme pepsin từ dạ dày heo:
Dạ dày heo (mới mổ, tươi)
Bóc màng nhầy
Sấy nhẹ ở 30- 35
Nghiền nhuyễn
Xay bằng máy nghiền
Dung dich tự phân tách mỡ
Cân chính xác một lượng màng nhầy
Phế phẩm pepsin thô
Lọc dung dịch
Kết tủa
Tinh bột hòa tan
Ly tâm kết tủa
3.4.3. Tổng hợp enzyme protease
• Tổng hợp enzyme protease Bacillus subtilis
▫ Giai đoạn nuôi cấy và thu canh trường Protease
▫ Quá trình tinh sạch enzym
3.4.3. Tổng hợp enzyme protease • Tổng hợp enzyme protease Bacillus subtilis
• Pectin
3.4.4. Tổng hợp pectinase
▫ Pectin là polysaccharide dị thể, chủ yếu là một mạch chính gồm các gốc acid –α–D–1,4 galacturonic, liên kết với nhau bằng liên kết 1,4–O glucozic; còn gọi là acid polygalacturonic hay acid pectic
▫ Pectine hòa tan trong tự nhiên là ester metylic của acid
pectic
▫ Trong thực tế không phải tất cả các nhóm –COOH ở C6 của đường galactose cũng bị metyl hóa (tạo ester metylic), mà đôi khi một số nhóm –COOH bị decacboxyl hóa (khử CO2), một số nhóm –COOH thay thế -H bằng kim loại, cũng có lúc giữ nguyên dạng –COOH…
▫ Protopectine được cho rằng là hợp chất giữa pectine và
araban, galactose hay tinh bột
3.4.4. Tổng hợp pectinase
• Phân loại:
HMP (High Methoxyl Pectin): Nhóm có chi số methoxyl cao (HMP): MI >7%, trong phân tử pectin có trên 50% các nhóm acid bị ester hoá (DE >50%)
LMP (Low Methoxyl Pectin): Nhóm có chỉ số methoxyl thấp:
MI < 7 %, khoảng từ 3 – 5%, trong phân tử pectin có dưới 50% các nhóm acid ị ester hoá (DE ≤ 50%)
▫ Theo nhóm methoxyl có trong phân tử:
Pectin hoà tan (methoxyl polygalacturonic): Pectin hoà tan là polysaccharide cấu tạo bởi các gốc acid galacturonic trong đó một gốc acid có chưa nhóm thế methoxyl
Pectin không hoà tan (protopectin): là dạng kết hợp của pectin
với araban (polysaccharide ở thành tế bào)
▫ Theo khả năng hoà tan trong nước
3.4.4. Tổng hợp pectinase
• Pectin
3.4.4. Tổng hợp pectinase
• Enzyme pactinase:
▫ Enzyme pectinase là enzym xúc tác sự phân hủy các
polyme pectin. Sản phẩm tạo thành : acid galacturonic, galactose, arabinose, metanol…
▫ Enzyme pectinase có ở thực vật bậc cao và các sản phẩm của vi sinh vật. Ở thực vật bậc cao : có nhiều trong lá, khoai tây, chanh, cỏ chẻ ba, trong các loại quả thường có enzyme pectinesterase
▫ Sự phân hủy pectin trong tự nhiên thường xảy ra khi
trái cây chín. Vì vậy enzym pectinase có vai trò hết sức quan trọng trong quá trình bảo quản trái cây và rau quả
3.4.4. Tổng hợp pectinase
• Enyme pactinase:
3.4.4. Tổng hợp pectinase
• Phân loại theo cơ chế tác dụng
▫ Pectinemathyllestarase là các enzyme xúc tác sự thủy
phân liên kết este trong phân tử pectine hay acid pectinic. Khi toàn bộ các nhóm metoxyl đều bị tách ra khỏi cơ chất thì sản phẩm tạo thành là methanol và các acid polygalacturonic. Sự thủy phân chỉ xảy ra ở các liên kết este trong phân tử pectine và acid polygalacturonic có thể bị thủy phân một phần hoặc hoàn toàn.
▫ Polygalacturonaselà các enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết 1-4 glucozic trong phân tử pectine có nhiều polygalacturonase có tính đặc hiệu rất khác nhau:
3.4.4. Tổng hợp pectinase
• Phân loại:
▫ Polymethulgalacturonase: là enzyme tác dụng trên acid polygalacturonic đã được metoxyl hóa, chia làm 2 dạng nhỏ: Endo-glucosidase-polymethylesterase kiểu I xúc tác sự
thủy phân liên kết glucozic nội mạch của các phân tử acid polygalacturonic được este hóa ở mức độ cao
Exo-glucosidase-polymethylesterase kiểu III: xúc tác thủy phân liên kết glucozic ở đầu mạch để tách từng gốc acid galacturonic ra khỏi phân tử pectine ,bắt đầu từ không khử. Enzyme này có ái lực với gốc galacturonic đã metoxyl hóa
3.4.4. Tổng hợp pectinase
• Phân loại theo cơ chế tác dụng
▫ Polymethulgalacturonase: là enzyme tác dụng trên acid polygalacturonic đã được metoxyl hóa, chia làm 2 dạng nhỏ: Endo-glucosidase-polymethylesterase kiểu I xúc tác sự
thủy phân liên kết glucozic nội mạch của các phân tử acid polygalacturonic được este hóa ở mức độ cao
Exo-glucosidase-polymethylesterase kiểu III: xúc tác thủy phân liên kết glucozic ở đầu mạch để tách từng gốc acid galacturonic ra khỏi phân tử pectine ,bắt đầu từ không khử. Enzyme nay có ái lực với gốc galacturonic đã metoxyl hóa
3.4.4. Tổng hợp pectinase
• Phân loại:
▫ Polygalactuironase là các enzyme tác dụng chủ yếu lên các axit pectic (acid polygalacturonic không bị este hóa) và acid pectinic (các acid polygalactironic bị este hóa ở mức độ thấp), gồm 2 dạng nhỏ : Endo –glucosidase-polygalacturonase kiểu II: xúc tác sự thủy phân liên kết glucozic ở giữa mạch các phân tử acid pectic và acid pectinic. Các enzyme này tác dụng ở vị trí liên kết đầu nhóm cacboxyl tự do
Exo- glucosidase- polygalacturonase kiểu IV: xúc tác sự
thủy phân các liên kết glucozit ở đầu mạch của acid pectic và acid pectinic. Enzyme này có ái lực với các liên kết glucozic ở đầu mạch gần với nhóm cacboxyl tự do
3.4.4. Tổng hợp pectinase
• Nguồn gốc thu nhận
▫ Từ thực vật: Pectinase có nhiều trong lá, than, củ và quả thực vật như: củ khoai tây, củ cà rốt, trong quả cafê, quả táo, vỏ cam, vỏ bưởi… nhưng chỉ có enzyme pectinsterase ▫ Từ VSV: VSV phân giải pectine hầu như có mặt ở các đại
diện nấm mốc, nấm men, vi khuẩn như: Nấm mốc: Asp.niger, Asp oryase, Asp.terreus, Asp.saito,
Asp.japonicus…
Nấm men: Sac.ellipsoideus, Sac.fragilis, Sac.ludwigii … Vi khuẩn: Bac.polymixa, Bac.felseneus, Clostridium
roseum…
3.4.4. Tổng hợp pectinase
• Thu nhận:
▫ Hiện nay người ta thu nhận pectinase chủ yếu từ
VSV
▫ Có hai phương pháp thu nhận chế phẩm thu
nhận chế phẩm pectinase: Thu nhận chế phẩm pectinase từ canh trường bề
mặt
Thu nhận chế phẩm enzyme từ canh trường bề sâu
3.4.4. Tổng hợp pectinase
• Thu nhận chế phẩm pectinase từ canh trường bề mặt
Môi trường
Dụng cụ nuôi cấy
Hấp khử trùng
Hấp khử trùng
Để nguội
Để nguội
Phối vào dụng cụ
Giống vsv
Cấy vào mt
Nhân giống
Nuôi cấy trong 36h
Thu nhận Ezyme thô
3.4.4. Tổng hợp pectinase
• Thu nhận chế phẩm enzyme từ canh trường bề sâu
3.4.4. Tổng hợp pectinase
• Ứng dụng của enzyme pectinase:
▫ Làm trong nước quả
Syrup quả Nước quả đục
▫ Sản xuất rượu vang: cải thiện kết tủa màu và ổn
định các loại rượu vang đỏ
▫ Trích ly dược liệu: khử pectin có trong dược liệu tạo điều kiện trích ly nội chất nhanh hơn và trích ly sau thời gian bảo quản không bị vẫn đục
3.4.5. Tổng hợp cellulase
3.4.5. Tổng hợp cellulase
• Khái niệm:
▫ Cellulose là thành phần cơ bản của tế bào thực vật, người và động vật không có khả năng phân giải cellulose. Nó chỉ có giá trị làm tăng tiêu hóa, nhưng với lượng lớn nó trở nên vô ích hay cản trở tiêu hóa
• Chế phẩm cellulase thường dùng để:
▫ Tăng chất lượng thực phẩm và thức ăn gia súc. ▫ Tăng hiệu suất trích ly các chất từ nguyên liệu thực vật. ▫ Tăng độ hấp thu, nâng cao phẩm chất về vị và làm mềm
nhiều loại thực phẩm thực vật. Đặc biệt là đối với thức ăn cho trẻ con
▫ Xử lý các loại rau quả như bắp cải, hành, cà rốt, khoai tây,
táo và lương thực như gạo, chè, các loại tảo biển…
▫ Hỗ trợ qt đường hóa trong sản xuất bia
3.4.5. Tổng hợp cellulase
• Phân loại enzyme cellulase
Dựa trên phương thức thủy phân và đặc điểm cấu trúc: ▫ Endoglucanase hoặc 1,4-β-Dglucan-4-glucanohydrolase (EC 3.2.1.4), phân cắt tại vị trí vô định hình bên trong phân tử cellulose tạo ra các chuỗi oligosaccharide
▫ Exoglucanase, bao gồm 1,4-β-D-glucan glucanohydrolase
(cellodextrinase) (EC 3.2.1.74) và 1,4-β-Dglucan cellobiohydrolase (cellobiohydrolase) (EC 3.2.1.91). Exoglucanase phân cắt từ đầu khử hoặc không khử của chuỗi cellulose tạo ra sản phẩm chính glucose hay cellobiose. Exoglucanase hoạt động chủ yếu trên vùng cellulose tinh thể ▫ β-glucosidase hoặc β-glucoside glucohydrolase (EC3.2.1.21). Thủy phân cellodextrin hòa tan và cellobiose thành glucose
3.4.5. Tổng hợp cellulase
• Cấu trúc của enzyme cellulase
▫ Cellulase là một cấu trúc nhiều đơn vị bao gồm vị trí
liên kết và thủy phân carbonhydrate (CBD)
▫ CBD là tiểu phần có trong cấu trúc của cellulases và
được phân chia thành 54 họ khác nhau
▫ Chức năng chủ yếu của CBD gắn kết vùng xúc tác vào
cellulose tinh thể
▫ Sự gắn kết đưa vùng xúc tác lại gần vùng cellulose tinh
thể cho sự thủy giải hiệu quả
▫ Một vài CBD khác ưu tiên gắn kết với vùng cellulose vô
định hình
3.4.5. Tổng hợp cellulase
• Tính chất của enzyme cellulase
▫ Enzyme cellulase thủy phân cellulose tự nhiên và các dẫn xuất như carboxymethyl cellulase (CMC) hoặc hydroxyethyl cellulase (HEC)
▫ Cellulase cắt liên kết β - 1,4 – glucosid trong cellulose,
lichenin và các β – D – glucan của ngũ cốc
▫ Độ bền và tính đặc hiệu cơ chất có thể khác nhau ▫ Cellulase hoạt động ở pH từ 3-7, nhưng pH tối thích
trong khoảng 4-5
▫ Nhiệt độ tối ưu từ 40- 50oC ▫ Hoạt tính cellulase bị phá hủy hoàn toàn ở 80o C trong
vòng 10-15 phút
3.4.5. Tổng hợp cellulase
• Cơ chế thuỷ phân cellulose của enzyme cellulase
3.4.5. Tổng hợp cellulase
• VSV tổng hợp enzyme cellulase
▫ Các loài vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose mạnh
trong dạ cỏ: Ruminococcus albus. Ruminococcus flavefaciens Buturivibrio fibrisolvens – Ruminobacter parum Cillbacterium – cellulosolvens Các vi khuẩn thuộc loài Bacteroides và Clostridium như: amylophilus, Bac. Succinogenes, Bac. Amylo-gense…
3.4.5. Tổng hợp cellulase
• VSV tổng hợp enzyme cellulase
Cellulase từ vi khuẩn: Pseudomonas fluorescens ; Acetobacter xyli-num; Cytophaga Sporocytophaga – myxococcoides; Cellvibrio gilvus, cellvibrio fulvus….
Cellulase từ xạ khuẩn như : Actimimyces coelicolor; Act. Sulfureus,
Act. Cellulosae, Act. Diastaticus, Act. hydroscopicus; Act. Themofuscus, Act. bovis, Act. flavochromogenes, Thermonosporacurvala
Cellulase từ nấm: Asp. Flavus; Asp. Niger; Asp. Oryzae;
Asp.Terreus; Asp. Amstelodamy; Asp. Fumigatus;Chaetomium globosum; chaeelatum; chae. Fumicolum; Mucor pusillus; Penicillium notatum, Pen. Variabite; Pen. Pusillum; Tricoderma koningi; Tr-lignorum Tr. Viride; Sporotrichum pruinosum; Myro thecium verrucaris; Chrysosporium lignorum…
▫ Trong môi trường:
3.4.5. Tổng hợp cellulase
• Các phương pháp thu hồi enzymee cellulase từ vi sinh vật được sử dụng chủ yếu là phương pháp lên men rắn (SSF), phương pháp lên men lỏng (SmF),... ▫ Phương pháp lên men lỏng SmF (lên men ngập nước) ▫ Phương pháp lên men rắn SSF
• Phương pháp lên men lỏng SmF (lên men ngập nước)
3.4.5. Tổng hợp cellulase
▫ SmF (Submerged Fermentation) là phương pháp lên men
trong môi trường lỏng là sự nuôi cấy vi sinh vật trong nước có chứa các chất dinh dưỡng
Đo các thông số trong quá trình dễ dàng hơn so với quá trình lên men
rắn
Tế bào vi khuẩn và nấm men được phân bố đều khắp môi trường Có hàm lượng nước cao, là điều kiện lý tưởng cho vi khuẩn
▫ Ưu điểm:
Chi phí cao do môi trường dinh dưỡng đắt tiền Lò phản ứng lớn làm chiếm diện tích, khó kiểm soát sự hoạt động của
các vi sinh vật
Nguy cơ ô nhiễm cao do lượng nước thải ra môi trường sau quá trình
nuôi cấy
▫ Nhược điểm:
3.4.5. Tổng hợp cellulase
• Phương pháp lên men lỏng SmF (lên men ngập nước)
3.4.5. Tổng hợp cellulase
• Phương pháp lên men rắn SSF
▫ SSF (Solid State Fermentation) là quá trình lên men xảy ra trong môi trường không hoặc gần như không có nước tự do
Hiệu quả không gian lớn: cùng một thể tích lên men rắn, sử dụng được
một khối lượng cơ chất 4-5 lần lên men lỏng
Môi trường rắn dễ bảo quản. Lượng nước ít nên tiêu hao năng lượng cho việc khử trùng và xử lý SP
ít
Hoạt tính nước thấp, ít bị nhiễm Đòi hỏi thiết bị và kỹ thuật đơn giản Năng suất cao
▫ Ưu điểm
Sự truyền nhiệt bị hạn chế làm ảnh hưởng đến sự khuếch tán qua bề
mặt
Tính đồng nhất khi cấy, vi sinh vật phát triển không đồng đều, cách
khắc phục khó do khối lượng lên men lớn
▫ Nhược điểm
3.4.5. Tổng hợp cellulase • Phương pháp lên men rắn SSF
