Bài giảng Lai phân tử - ThS. Nguyễn Thị Mỹ Nương

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:34

Thêm vào BST

Báo xấu

2
lượt xem 1
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài giảng Lai phân tử giới thiệu nguyên lý, kỹ thuật và ứng dụng của phương pháp lai phân tử trong nghiên cứu và chẩn đoán sinh học phân tử. Nội dung bao gồm các loại lai như lai DNA-DNA, RNA-DNA, lai Southern, Northern và in situ hybridization, giúp sinh viên hiểu cách phát hiện trình tự nucleic acid đặc hiệu một cách chính xác và nhạy trong mẫu sinh học.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Bài giảng Lai phân tử - ThS. Nguyễn Thị Mỹ Nương

LAI PHÂN TỬ ThS. Nguyễn Thị Mỹ Nương Email: ntmnuong@hcmus.edu.vn 1
Nội dung 1. Mục tiêu, nguyên lý 2. Đánh dấu mẫu dò 3. Các kiểu lai: 1. Lai trong pha lỏng 2. Lai trong pha rắn 3. Lai tại chổ 4. Ứng dụng 2
Tài liệu tham khảo [1] Buckingham, L. (2007). Molecular diagnostics: Fundamentals, methods, and clinical applications (1st ed.). Philadelphia: F.A. Davis Co. Chương 6 3
Mục tiêu – nguyên lý 1. Mục tiêu: phát hiện một trình tự nucleic acid trong một hỗn hợp dựa theo nguyên tắc bắt cặp bổ sung Eastern blot 4
Mục tiêu – nguyên lý 2. Thành phần: - Trình tự mục tiêu - Mẫu dò (probe): + Đặc điểm: (1) bắt cặp bổ sung trình tự mục tiêu; (2) đánh dấu + Phân loại: DNA; RNA; oligo Làm sao biết được trình tự mẫu dò? 5
CAÙC PHAÂN TÖÛ DUØNG ÑAÙNH DAÁU HOAÙ HOÏC Coù aùi löïc vôùi anti- Digoxigenin Duøng phoái hôïp vôùi dATP, dCTP, dGTP, dTTP Coù aùi löïc vôùi streptavidin Duøng phoái hôïp vôùi dATP, dCTP, dGTP, dTTP 6
ÑAÙNH DAÁU BAÈNG BIOTIN Ñaùnh daáu maãu doø (probe) → Lai vôùi trình töï muïc tieâu → Phaùt hieän phaân töû lai thoâng qua phöùc hôïp avidin/chaát phaùt huyønh quang 7
PHÖÔNG PHAÙP NICK TRANSLATION  “Ñuïc loã” treân 2 maïch cuûa DNA baèng Dnase I  DNA polymerase I söû duïng hoạt tính 5’-3’ exonuclease “gaëm” maïch DNA theo chieàu 5’-3’  DNA polymerase I vöøa thuûy phaân vöøa toång hôïp maïch môùi buø vaøo loã troáng vôùi caùc dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP, dUTP ñaùnh daáu)  Keát quaû laø probe ñöôïc ñaùnh daáu 8
PHÖÔNG PHAÙP RANDOM PRIMING  Bieán tính maïch ñoâi DNA  Baét caëp toå hôïp “ moài“ ngaãu nhieân treân 2 maïch 64 = 1296 primers  DNA polymerase toång hôïp buø vaøo choã troáng baèng caùc dNTP trong ñoù coù nucleotide ñaùnh daáu  Keát quaû laø probe ñaùnh daáu 9
PHÖÔNG PHAÙP ÑAÙNH DAÁU OLIGONUCLEOTIDE PHAÛN ÖÙNG PHOSPHATASE PHAÛN ÖÙNG KINASE 10
PHÖÔNG PHAÙP ÑAÙNH DAÁU OLIGONUCLEOTIDE SÖÛ DUÏNG TERMINAL TRANSFERASE 11
TOÅNG HÔÏP MAÃU DOØ RNA BAÈNG PHIEÂN MAÕ IN VITRO  Trình töï seõ duøng laøm probe ñöôïc taïo doøng vaøo vector bieåu hieän  Tuøy maïch muoán duøng laøm probe seõ söû duïng promoter töông öùng  RNA polymerase nhaän bieát promoter ñaëc hieäu, gaén vaøo vaø toång hôïp RNA  Nucleotide töï do duøng trong quaù trình phieân maõ coù mang moät phaàn nucleotide ñaùnh daáu  Keát quaû laø maãu doø RNA ñaùnh daáu (riboprobe) 12
TOÅNG HÔÏP MAÃU DOØ RNA BAÈNG PCR VAØ PHIEÂN MAÕ IN VITRO gene A PCR T7 promoter Phieân maõ in vitro vôùi T7 RNA polymerase Maãu doø RNA Thay vì taïo doøng thì söû duïng PCR ñeå gaén theâm trình töï promoter phuø hôïp Quaù trình tieáp theo gioáng nhö taïo doøng 13
Các dạng lai • Lai trong pha lỏng • Lai trong pha rắn • Lai tại chổ Eastern blot 14
LAI TRONG PHA LỎNG Kit HC2 phát hiện HPV (Human Papillomavirus) trong bệnh phẩm, dựa vào nguyên tắc lai trong pha lỏng Thu nhận Biến tính Lai với mẫu Bắt giữ Phát hiện Bổ sung cơ bênh phẩm. DNA dò HPV phân tử lai phân tử lai chất, và đọc Tách chiết RNA DNA-RNA bằng kháng kết quả DNA bằng kháng thể nhận thể nhận biết phân tử biết phân tử lai DNA- lai DNA- RNA RNA 15
SOUTHERN BLOT 16
LAI TRÊN PHA RẮN SOUTHERN BLOT – CHUYỂN THẨM Điện chuyển thẩm Chuyển thẩm thụ động theo lực mao dẫn
SOUTHERN BLOT (tieáp) Taùch chieát & caét DNA baèng enzyme giôùi haïn Ñieän di Chuyeån leân maøng lai Lai vaø phaùt hieän phaân töû lai Bieán tính DNA Tieàn lai 18
LAI TREÂN PHA RAÉN & PHAÙT HIEÄN PHAÂN TÖÛ LAI BAÈNG ÑOÀNG VÒ PHOÙNG XAÏ Coá ñònh DNA leân maøng lai Lai vôùi maãu doø ñaùnh daáu phoùng xaï Röûa maøng lai Thöïc hieän phoùng xaï töï ghi 19
SOUTHERN - NORTHERN BLOT 20