Bài giảng PCR (Polymerase chain reaction) - ThS. Nguyễn Thị Mỹ Nương

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:40

Thêm vào BST

Báo xấu

1
lượt xem 0
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài giảng PCR (Polymerase Chain Reaction) giới thiệu nguyên lý, quy trình và ứng dụng của kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase trong khuếch đại DNA. Nội dung bài giảng bao gồm các bước cơ bản của PCR, các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng và các biến thể như real-time PCR, giúp sinh viên hiểu rõ vai trò quan trọng của PCR trong chẩn đoán, nghiên cứu sinh học phân tử và y học hiện đại.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Bài giảng PCR (Polymerase chain reaction) - ThS. Nguyễn Thị Mỹ Nương

PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) ThS. Nguyễn Thị Mỹ Nương Email: ntmnuong@hcmus.edu.vn 1
Nội dung 1. Mục tiêu, nguyên lý 2. Các thành phần phản ứng, thiết lập phản ứng 3. Một số biến thể của PCR: ➢ Reverse transcriptase PCR (RT-PCR) ➢ Hot-start PCR ➢ Assembly PCR ➢ Nested/semi-nested PCR ➢ Allele-specific PCR ➢ Methylation – specific PCR ➢ Quantitative PCR (qPCR) 2
Tài liệu tham khảo [1] Buckingham, L. (2007). Molecular diagnostics: Fundamentals, methods, and clinical applications (1st ed.). Philadelphia: F.A. Davis Co. 3
Nguyên lý PCR Kary Mullis, Nobel 1993 1969 : Thermus aquaticus – Yellowstone National 1987 : Máy PCR đầu Park tiên (Perkin Elmer – Cetus) 1976 : Taq polymerase (Cetus) 4
Vì sao cần PCR? Khả năng nhân bản đặc hiệu:  Gene hiện diện với hàm lượng rất thấp trong mẫu, không thể phát hiện bằng bất cứ phương pháp nào  Để “nhìn thấy” gene trong gel agarose, cần  10-20 ng DNA Một trình tự 500 bp, 660g/mol bp, sẽ cần 109/500x660 mol (hằng số Avogadro = 6.0223) → 1.810 bản sao Nghĩa là để “nhìn thấy” gene, cần nhân DNA từ 100 tế bào lên 180 triêu lần  Khả năng phát hiện và định lượng đặc hiệu một trình tự DNA xác định trong tập hợp nhiều trình tự DNA  Phân lập trình tự DNA mục tiêu Đơn giản Nhanh 5
Các thành phần của PCR? 6
CAÙC THAØNH PHAÀN CUÛA PHAÛN ÖÙNG PCR 1. Primer (moài) Moài phaûi thoûa moät soá ñieàu kieän cô baûn : (1) daøi khoaûng 18-24 base, (2) Tm cuûa 2 primer gaàn nhau, (3) [G:G] 40-60%, (4) khoâng hình thaønh primer dimer, (5) khoâng phaûi laø trình töï laëp laïi. 2. DNA baûn maãu (template) Haøm löôïng ñuû nhöng khoâng quaù cao, tinh saïch – khoâng chöùa caùc chaát öùc cheá phaûn öùng (SDS, chaát öùc cheá töø maãu (hemoglobin, saéc toá, ..), heparin, ..) 3. Noàng ñoä MgCl2 Caàn cho hoaït ñoäng cuûa Taq polymerase ; haøm löôïng quaù cao seõ taïo nhieàu saûn phaåm kyù sinh, quaù thaáp thì laøm giaûm hieäu quaû nhaân baûn cuûa enzyme 4. dNTP Thaønh phaàn 4 loaïi dNTP phaûi caân baèng ; haøm löôïng thöôøng khoâng ñoåi nhöng coù theå thay ñoåi tuøy ñieàu kieän thöïc teá 7
CAÙC THAØNH PHAÀN CUÛA PHAÛN ÖÙNG PCR (tieáp) 5. Enzyme Ñöôïc choïn tuøy muïc ñích söû duïng :  Taq DNA polymerase (Thermus aquaticus) : thoâng duïng nhaát, hoaït tính polymerase khaù maïnh (35-100 nu/giaây), coù hoaït tính 5’3’ exonuclease Stoffel DNA polymerase : tính chòu nhieät cao hôn, khoâng coù hoaït tính 5’-3’ exonuclease, hoaït ñoäng ñöôïc ôû phoå MgCl2 roäng  multiplex PCR Taq vaø Stoffel DNA polymerase theâm 1 3’dA vaøo saûn phaåm PCR  Vent/DeepVent DNA polymerase (Thermococcus litoralis) : tính chòu nhieät raát cao, nhaân baûn ñöôïc nhöõng ñoïan DNA raát daøi, coù hoaït tính 3’-5’ exonuclease  tính trung thöïc cao hôn Taq pol 5-15 laàn, taïo saûn phaåm “ñaàu baèng”  Pfu DNA polymerase (Pyrococcus furiosus) : coù caû 2 hoaït tính 5’-3’ vaø 3’-5’ exonuclease, tính trung thöïc cao hôn Taq pol 12 laàn, thöôøng duøng trong cycle sequencing  Tth DNA polymerase (Thermus thermophilus) : vöøa coù chöùc naêng polymerase vöøa coù chöùc naêng phieân maõ ngöôïc (RT)  duøng trong phaûn öng RT-PCR  UlTma DNA polymerase (Thermotoga maritima) : tính chòu nhieät raát cao, coù hoaït tính 3’-5’ exonuclease  tính trung thöïc raát cao 8
CAÙC THAØNH PHAÀN CUÛA PHAÛN ÖÙNG PCR (tieáp) 5. Chöông trình PCR :  Nhieät ñoä : bieán tính – 94-95C ; lai < Tm cuûa caùc primer ~ 5C ; keùo daøi - 72C  Thôøi gian cuûa töøng chu kyø tuøy thuoäc thieát bò vaø kích thöôùc saûn phaåm  Soá löôïng chu kyø thöôøng  40 Ví duï : 1 chu kyø - 95C – 5‘ 35 chu kyø – 94C – 30” 55C – 30” 72C – 45” 1 chu kyø – 72C – 10’ 6. Thieát bò : Nhöõng caûi tieán maùy luaân nhieät lieân quan ñeán (1) microtiter plate 96 gieáng, (2) caùc block nhieät rieâng bieät trong 1 maùy, (3) block duøng cho lam kính ñeå tieán haønh in situ PCR. 7. Duïng cuï : OÁng Eppendorf “thaønh moûng” (thin-wall), ñaàu tip coù phin loïc 9
NHÖÕNG HAÏN CHEÁ CUÛA KYÕ THUAÄT PCR – CAÙCH KHAÉÊC PHUÏC 1. Ngoaïi nhieãm cao do khaû naêng nhaân baûn DNA maïnh 2. Sai soùt cuûa DNA polymerase trong quaù trình toång hôïp ➔ Laëp laïi phaûn öùng PCR neáu caàn thieát, söû duïng loaïi polymerase coù tính trung thöïc cao nhö Pfu, DeepVent, UlTma polymerase. 3. Keát quaû phuï thuoäc raát lôùn vaøo toaøn boä thao taùc ➔ Kyõ thuaät vieân caàn ñöôïc ñaøo taïo toát, töï ñoäng hoùa, söû duïng hoùa chaát pha saún (kit) ñaõ ñöôïc chuaån hoùa 4. Thieát bò ñaét tieàn 10
CÁC BIỆN PHÁP THẬN TRỌNG KHI SỬ DỤNG PCR Một giọt phản ứng PCR chứa 106 bản sao trình tự mục tiêu !!! 1. Tách biệt các khu vực thí nghiệm : pha chế, đặt phản ứng, phân tích kết quả. Di chuyển theo 1 chiều 2. Sử dụng thiết bị, dụng cụ, vật liệu tiêu hao riêng cho từng khu vực. Sử dụng tip có phin lọc 3. Thay găng tay, áo blouse, …. 4. Làm sạch khu vực thí nghiệm bằng dung dịch sodium hypochlorite 10 % và làm sạch lại bằng ethanol 5. Aliquot hóa chất 6. Thiết lập chứng (-) 7. Khử nhiểm  Chiếu UV 254 – 300 nm, 5-20’, dụng cụ và hóa chất (trừ bản mẫu)  Sử dụng UNG (Uracil-N-glycosylase) + dUTP 11
CÁC PHƯƠNG PHÁP PCR 12
Real-time PCR Như PCR, Real-time PCR nhân bản • Mục tiêu? một trình tự DNA đặc hiệu • Nguyên lý? • Quy trình - Thiết bị? Cho phép theo dõi tiến trình phản ứng • Kết quả? theo thời gian. Cho phép định lượng số lượng trình tự DNA mục tiêu trong mẫu 13
Real-time PCR được sử dụng phổ biến trong: Ví dụ: phân tích sự biểu hiện của gene BRCA1 trong ung • Phân tích biểu hiện gene thư vú • Nghiên cứu ung thư • Nghiên cứu thuốc,… • Chẩn đoán và theo dõi bệnh • Định lượng virus • Xét nghiệm trong thực phẩm Ví dụ: Định lượng • GMO virus HIV trong điều trị ….. Ví dụ: Phát hiện và định lượng % GMO 14
Tác nhân đánh dấu Chất nhuộm DNA Mẫu dò (probe) Taqman probe 15
Quy trình – thiết bị • Thành phần phản ứng: tương tự PCR + tác nhân phát huỳnh quang • Quy trình thực hiện: tương tự PCR • Eppendorf thành mỏng và trong • Máy Real-time PCR có thêm hệ thống đọc tín hiệu huỳnh quang liên kết với máy tính => không cần điện di 16
Kết quả Baseline : tín hiệu huỳnh quang nền Threshold : nằm phía trên baseline, ở đầu vùng nhân bản theo hàm mũ CT (Cycle Threshold) : chu kỳ ngưỡng 17
KEÁT QUAÛ PCR REAL-TIME A Ct (Cycle threshold - chu kyø ngöôõng) : C chu kyø PCR ôû ñoù tín hieäu ñaëc hieäu vöôït khoûi tín hieäu neàn B Ghi chuù : ñöôøng maøu ñoû laø t1n hieäu neàn Döïng ñöôøng chuaån (standard curve) vôùi moät chaát chuaån coù noàng ñoä ñaõ bieát. 101 baûn sao Haøm löôïng cuûa thaønh phaàn caàn 101 baûn sao phaùt hieän ñöôïc tính döïa treân ñöôøng chuaån naøy 18
ĐỊNH LƯỢNG TƯƠNG ĐỐI VÀ TUYỆT ĐỐI ĐỊNH LƯỢNG TƯƠNG ĐỐI ĐỊNH LƯỢNG TUYỆT ĐỐI So sánh hàm lượng giữa hai Dựng đường chuẩn (standard curve) với trình tự mục tiêu, thông qua tỷ những nồng độ pha loãng đã biết của 1 lệ hàm lượng của chúng amplicon. Phương pháp : 2 -C T PCR efficiency : được tính dựa trên giá trị “slope”: -3.32 tương ứng 100 % efficiency. Slope (-) hơn :  100 % efficiency, (+) hơn : CT = CT mục tiêu – CTtham khảo phản ứng bị ức chế, sai lầm do hút nhả, .. CT = CT mẫu thí nghiệm - CTmẫu chứng 19
PHÂN TÍCH ĐƯỜNG CONG NÓNG CHẢY (MELTING CURVE ANALYSIS) Đánh giá đặc điểm biến tính của 1 trình tự DNA mạch đôi khi gia nhiệt. Nhiệt độ ở đó 50 % trình tự DNA biến tính : điểm “nóng chảy”. Có thể được dùng phối hợp với chất “nhuộm” DNA mạch đôi để phát hiện đặc hiệu 1 sản phẩm nhân bản xác định. 20