Báo cáo: Các phương pháp chuyển gene ở dộng vật

Chia sẻ: Huynh Minh Tri | Ngày: | Loại File: PPT | Số trang:43

Thêm vào BST

Báo xấu

265
lượt xem 86
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật đưa 1 hay nhiều gen lạ đã được thiết kế ở dạng DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ của động vật làm cho gen lạ có thể tồn tại ở dạng plasmix tái tổ hợp hoặc gắn vào bộ gen tế bào chủ. Trong tế bào chủ,các gen này hoạt động tổng hợp nên các protein đặc trưng dẫn tới việc xuất hiện các đặc tính mới của cơ thể chuyển gen.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Báo cáo: Các phương pháp chuyển gene ở dộng vật

CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GENE Ở ĐỘNG VẬT GVHD: TS. NGUYỄN VĂN DUY THÀNH VIÊN NHÓM 7: 1. THÁI MINH TÂM 2. THÁI VIẾT HIẾU 3. DƯƠNG THỊ THANH BÌNH 4. PHẠM ĐÌNH THẢO
I. KHÁI QUÁT CHUNG: 1. KHÁI NIỆM: - Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật đưa 1 hay nhiều gen lạ đã được thiết kế ở dạng DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ của động vật làm cho gen lạ có thể tồn tại ở dạng plasmix tái tổ hợp hoặc gắn vào bộ gen tế bào chủ. Trong tế bào chủ,các gen này hoạt động tổng hợp nên các protein đặc trưng dẫn tới việc xuất hiện các đặc tính mới của cơ thể chuyển gen. - Đối với các thể nhân chuẩn, việc chuyển gen được xem là thành công khi gen chuyển vào được tổ hợp vào genome của tế bào chủ, đặc tính của gen chuyển nạp được duy trì ổn định qua các thế hệ con cháu.
2. LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN: - 1977 Gurdon chuyển mRNA và DNA vào phôi Xenopus (ếch) và quan sát thấy biểu hiện chức năng của chúng - 1980 Brinster và cộng sự nhận được kết quả tương tự ở chuột - 1981 Wagner và cộng sự đã cấy chuyển thành công gen β-globulin của thỏ vào phôi chuột - Từ năm 1985 nhiều tác giả thành công trong tạo thỏ,cừu, lợn, bò...chuyển gen và các vật nuôi tăng trưởng nhanh được - Ngày nay, động vật chuyển gene đã được ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực khác nhau như y học, dược phẩm, nông nghiệp,…
3. MỤC ĐÍCH CHUYỂN GENE: - Chuyển gen vào các dòng tế bào động vật nuôi để sản xuất protein tái tổ hợp. - Tạo vật nuôi chuyển gen với đặc tính cải tiến mới về các sản phẩm sữa, thịt, lông… - Biến vật nuôi thành bioreacter sản xuất protein tái tổ hợp. - Tạo vật nuôi chuyển gen “knock out” làm mô hình nguyên cứu về y sinh học các bệnh di truyền. - Chuyển gen liệu pháp nhằm chữa trị các bệnh di truyền (của người).
4. ĐỐI TƯỢNG CHUYỂN GENE: - Hầu hết các phương pháp chuyển gen đều được phát triển trên mô hình chuột và sau đó chúng được ứng dụng trên gia súc, gia cầm. - Việc chuyển gen thường được thao tác trên: + Tế bào trứng đã thụ tinh. + Tế bào tinh trùng. + Mô phôi ở giai đoạn sớm. + Tế bào gốc phôi.
II. CÔNG NGHỆ TẠO ĐỘNG VẬT CHUYỂN GENE: Gồm các bước cơ bản sau: -Tách chiết, phân lập gene mong muốn. -Tạo tổ hợp gene biểu hiện trong tế bào động vật. -Tạo cơ sở vật liệu biến nạp gene. -Biến nạp gene tạo phôi đông vật. -Nuôi cấy phôi và cấy truyền hợp tử ( đối với ĐV bậc cao). -Phân tích đánh giá tính ổn định và sự biểu hiện của gene lạ và tạo ra dòng động vật chuyển gene gốc một cách liên tục. -Sản xuất động vật chuyển gene.
Bước 1: Tách chiết, phân lập gene mong muốn: -Gen ngoại lai trước khi được chuyển vào genome của tế bào vật chủ để tạo ra động vật chuyển gen phải được phân lập và tinh chế(tạo dòng). -Công cụ sử dụng để tạo dòng: + Enzyme cắt và nối DNA (enzyme hạn chế và ligase). + Các mẫu dò (probe). + Vector. + Tế bào vật chủ( thường là E.coli).
QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT, PHÂN LẬP : -Cắt DNA mẫu và plasmid được cắt bởi cùng một enzyme hạn chế. -Chèn gene mong muốn vào plasmid. Tạo plasmid tái tổ hợp. -Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào vật chủ. -Tạo điều kiện thuận lợi cho vật chủ sinh trưởng phát triển.
Người ta cũng có thể phân lập được gen mong muốn từ sản phẩm biểu hiện của nó như mRNA hoặc protein. + Từ mRNA dưới tác động của enzyme sao chép ngược sẽ tổng hợp ra DNA bổ sung mạch đơn (single strand complement DNA-ss cDNA), tiếp theo là DNA bổ sung mạch kép (double strand complement DNA- ds cDNA. DNA bổ sung (complement DNA- cDNA) này khác với DNA gốc là không chứa các intron mà chỉ bao gồm các exon (Hình 4.2). + Từ sản phẩm protein,có thể suy ra trình tự nucleotid của gen cấu trúc trên cơ sở trình tự các axit amin trong phân tử protein.Sau đó có thể thiết kế cặp mồi (primer) để dò tìm đoạn gen mong muốn.
Hình 4.2: So sánh hai dạng gen chuyển Dạng genome bao gồm tất cả các đoạn exon và intron xuất hiện một cách tự nhiên. Các đoạn intron liên quan đến việc cắt ghép mRNA và biểu hiện của gen. Dạng cDNA là một trình tự chỉ bao gồm các đoạn exon mã hoá protein của gen.
Bước 2 : Tạo tổ hợp gene biểu hiện trong tế bào động vật: -Các vùng chức năng khác nhau của gen có nguồn gốc từ các loài khác nhau có thể được kết hợp lại với nhau trong ống nghiệm bằng cách sử dụng enzyme hạn chế và ligase. -Bổ sung các trình tự polylinker chứa một số vị trí nhận biết các enzyme hạn chế khác nhau -Gen chuyển được đi kèm với các trình tự không mã hoá có vai trò điều hoà sự biểu hiện của gen. Các yếu tố điều hoà cũng có thể nằm ở trong đoạn intron. Yếu tố điều hoà ở gần đầu 5’ của gen là promoter, có vai trò quyết định trong việc điều hoà sự biểu hiện của gen.
Promoter ở tế bào động vật có nguồn gốc hoặc từ động vật như methallothionein (MT), thymidine kinase, ß-actin, amylase, insulin, ß-lactoglobulin, adiposite P2...hoặc từ virus động vật như Simian virus(SV40),Rous sarcoma virus (RSV)... SƠ ĐỒ CẤU TRÚC BIỂU HIỆN GENE Enhancer: gen tăng cường ATG: vị trí khởi đầu phiên mã SIG: trình tự tín hiệu AAA: đuôi polyA
Bước 3:Tạo cơ sở vật liệu biến nạp gen - Ở động vật có vú thì giai đoạn biến nạp gen thích hợp nhất là trứng ở giai đoạn tiền nhân (pronucleus). - Trứng chín được thu nhận bằng phương pháp sử dụng kích dục tố theo chương trình đã được xây dựng cho mỗi loài hoặc bằng phương pháp nuôi cấy trứng trong ống nghiệm. Sau đó thụ tinh nhân tạo để tạo ra trứng tiền nhân.
Bước 4: Chuyển gen vào động vật : -Phương pháp chuyển gene trực tiếp: . Chuyển gene nhờ calcium phosphate . Chuyển gene nhờ xung điện . Chuyển gene nhờ vi tiêm . Chuyển gene nhờ liposome,… -Phương pháp chuyển gene gián tiếp: Chuyển gene nhờ virus: + vector retrovirus ( RNA ) + vector adenovirus ( DNA sợi kép ) + vector adeno-associated virus ( DNA sợi đơn ) + vector herpes simplex virus ( DNA sợi kép ) + vector baculovirus ( DNA vòng kép ),….
a. Phương pháp vi tiêm: Nguyên tắc: - Tiêm trực tiếp DNA ngoại lai vào nhân tế bào động vật nh ờ dụng cụ vi tiêm với kim tiêm rất mảnh. - Phương pháp này cho kết quả rất cao nh ưng số lượng tế bào được xử lý nhỏ do phải thao tác trên t ừng t ế bào. - Thường được dùng để đưa DNA vào hợp tử hoặc các tế bào phôi sớm. - Chuyển gene vào tinh trung hoặc trứng khi đã th ụ tinh nhưng chưa kết hợp thành hợp tử lưỡng bội. - Việc chuyển gene chỉ thành công khi gene chuyển vào di truyền cho các thế hệ sau.
Qui trình: - Thiết kế cấu trúc gene chuyển, lựa chọn gene thích hợp và tạo dòng. - Thu nhận trứng đã thu tinh - Chuẩn bị dung dịch DNA cho vi tiêm, nồng độ từ 1-5 µm/ml - Chuẩn bị tế bào hợp tử - Vi tiêm DNA vào tiền nhân - Chuyển phôi vi tiêm vào cơ thể nhận - Kiểm tra gene chuyển ở con non. Lai tạo để củng cố di truyền.
b. Chuyển gene nhờ xung điện: Nguyên tắc: - Khi trong điện trường có một mật độ tế bào cao và tạo ra một xung điện ( điện cao thế trong một thời gian rất ngắn) lúc đó trên tế bào xuất hiện các lỗ nhỏ. - Qua các lỗ này, DNA có thể đi sâu vào trong tế bào và ở một số tế bào chúng có thể tương tác với genome của tế bào  tế bào chuyển gene. - Máy tạo xung điện có công suất ổn định,điện thế từ 500-1500 v/cm - Sau mỗi lần thực nghiệm thì có 20-50% tế bào còn sống.
Chú ý: - Các DNA duỗi thẳng cho hiệu quả chuyển gene cao hơn, do khả năng dung h ợp với genome của tế bào đích. - Tránh để tế bào dính vào nhau, nên thực hiện trong dung d ịch huy ền phù đ ơn - Cần dùng nhiều DNA và tế bào đơn - Các tế bào khác nhau thì các thông số sử dụng khác nhau. Máy xung điện ( hãng biorad )