Báo cáo: Các phương pháp chuyển gene ở dộng vật

CÁC PH

Ể

ƯƠ GENE

Đ NG V T

NG PHÁP CHUY N Ở Ộ

Ậ

GVHD:

TS. NGUY N VĂN DUY Ễ

THÀNH VIÊN NHÓM 7:

1. THÁI MINH TÂM

2. THÁI VI T HI U

Ế

3. D

NG TH THANH BÌNH

ƯƠ

Ị

4. PH M ĐÌNH TH O

Ả

Ạ

I. KHÁI QUÁT CHUNG:

ậ ư

ạ ề ượ ỹ ế ở ạ ổ ợ

ế ộ ạ

ạ ở ạ ặ ắ

ủ ộ ộ ổ ế

ạ ệ ợ ớ ệ ặ ẫ ấ

ủ ớ ơ ể ặ

ố ớ ể ệ ẩ

ể ượ ượ ể c xem là thành công khi gen chuy n vào đ

ủ ủ ế

ủ ế ệ ượ ổ ạ ị 1. KHÁI NI M:Ệ ể ậ ỹ - K thu t chuy n gen là k thu t đ a 1 hay ế c thi t k d ng DNA tái t h p nhi u gen l đã đ ể ồ ậ ủ ủ vào t bào ch c a đ ng v t làm cho gen l có th t n ế ổ ợ t i d ng plasmix tái t h p ho c g n vào b gen t ủ bào ch . Trong t bào ch ,các gen này ho t đ ng t ng ư h p nên các protein đ c tr ng d n t i vi c xu t hi n ể các đ c tính m i c a c th chuy n gen. - Đ i v i các th nhân chu n, vi c chuy n gen đ vào genome c a t bào ch , đ c tính c a gen chuy n n p đ ổ ợ c t h p ể ặ c duy trì n đ nh qua các th h con cháu.

Ị

Ử

Ể

ể

ứ ủ ệ ế ấ

2. L CH S PHÁT TRI N: - 1977 Gurdon chuy n mRNA và DNA vào phôi Xenopus ể ( ch) và quan sát th y bi u hi n ch c năng c a chúng

ự ộ ậ ượ ả ươ ế c k t qu t ng

ự ở ộ - 1980 Brinster và c ng s nh n đ t chu t

ự ể ấ

ộ ỏ ủ ộ - 1981 Wagner và c ng s đã c y chuy n thành công gen β-globulin c a th vào phôi chu t

ề ả ạ

ợ ậ

ừ ỏ ừ ưở ượ - T năm 1985 nhi u tác gi thành công trong t o ể th ,c u, l n, bò...chuy n gen và các v t nuôi tăng tr ng nhanh đ c

ộ

ượ ứ ư ụ ọ ự

ấ ượ ề ẩ ệ - Ngày nay, đ ng v t chuy n gene đã đ ể ậ c ng d ng r t nhi u trong các lĩnh v c khác nhau nh y h c, d c ph m, nông nghi p,…

Ể

Ụ

ậ ể ộ ể ả

ấ

ạ ậ ớ ề ế ặ ả

ổ ợ ể ị ẩ

ả ế ổ ậ ấ ả

ể ậ ạ

ứ ề ề ệ

ọ ệ ữ ề ệ ằ

ể ườ ủ

3. M C ĐÍCH CHUY N GENE: ế - Chuy n gen vào các dòng t bào đ ng v t nuôi đ s n xu t protein tái t h p. ớ - T o v t nuôi chuy n gen v i đ c tính c i ti n m i v ữ các s n ph m s a, th t, lông… - Bi n v t nuôi thành bioreacter s n xu t protein tái t h p.ợ - T o v t nuôi chuy n gen “knock out” làm mô hình nguyên c u v y sinh h c các b nh di truy n. ị - Chuy n gen li u pháp nh m ch a tr các b nh di truy n (c a ng

i).

ƯỢ

Ể NG CHUY N GENE:

ế

ể ng pháp chuy n gen đ u đ ộ ể c phát ụ c ng d ng

ượ ệ

Ố 4. Đ I T ề ượ ươ ầ - H u h t các ph ượ ứ tri n trên mô hình chu t và sau đó chúng đ trên gia súc, gia c m.ầ - Vi c chuy n gen th

c thao tác trên:

ườ ứ ụ

ế ế

ớ

ế ể ng đ + T bào tr ng đã th tinh. + T bào tinh trùng. ở ạ + Mô phôi giai đo n s m. ố + T bào g c phôi.

Ệ Ạ Ậ Ể Ộ II. CÔNG NGH T O Đ NG V T CHUY N GENE:

ồ ướ ơ ả G m các b c c b n sau:

ậ ể ộ ậ

ế ạ ạ ế ổ ợ ơ ở ậ ạ

ế

ạ ấ ậ ợ ử ố ớ ề ấ

ậ ủ ự ệ

ổ ậ ể ố ộ ộ ể ạ

ộ ể ậ ấ -Tách chi t, phân l p gene mong mu n. ố -T o t h p gene bi u hi n trong t bào đ ng v t. ệ ế -T o c s v t li u bi n n p gene. ệ -Bi n n p gene t o phôi đông v t. ạ -Nuôi c y phôi và c y truy n h p t ( đ i v i ĐV b c cao). -Phân tích đánh giá tính n đ nh và s bi u hi n c a gene ị ạ l và t o ra dòng đ ng v t chuy n gene g c m t cách liên t c.ụ -S n xu t đ ng v t chuy n gene. ả

ướ ố ế ậ B c 1: Tách chi t, phân l p gene mong mu n:

ướ ượ ể c khi đ

ậ c chuy n vào genome c a t ậ ủ ượ ể ả ế c phân

ậ

ể ạ -Gen ngo i lai tr ạ ộ ủ ể ạ bào v t ch đ t o ra đ ng v t chuy n gen ph i đ ế ạ l p và tinh ch (t o dòng). -Công c s d ng đ t o dòng:

ố ế ắ ạ ụ ử ụ + Enzyme c t và n i DNA (enzyme h n ch và

ligase).

ẫ

ủ ế ườ + Các m u dò (probe). + Vector. ậ + T bào v t ch ( th ng là E.coli).

QUY TRÌNH TÁCH CHI T, Ế PHÂN L P :Ậ

ộ ẫ ở ắ ượ

ạ

ố

ạ

ế ậ

ệ ề ậ

ủ ậ

ưở ể -C t DNA m u và plasmid ắ c c t b i cùng m t đ ế enzyme h n ch . -Chèn gene mong mu n vào plasmid. T o plasmid tái ổ ợ t h p. -Bi n n p plasmid tái ế ổ ợ t h p vào t bào v t ch .ủ -T o đi u ki n thu n ạ ợ l i cho v t ch sinh ng phát tri n. tr

ừ ậ ố ườ c gen mong mu n t i ta cũng có th phân l p đ

ả ể ư ủ ượ ặ

ủ ệ ướ ượ c

ạ ổ ợ ẽ ổ ơ

ổ

ớ ố không ch a ứ

ỉ ẩ ự ể

ừ ả ủ ơ ở ấ trên c s trình t các axit

ự ể thi tế k c p ế ặ

ể Ng ẩ s n ph m bi u hi n c a nó nh mRNA ho c protein. ộ ừ + T mRNA d i tác đ ng c a enzyme sao chép ng s t ng h p ra DNA b sung m ch đ n (single strand ạ ế complement DNA-ss cDNA), ti p theo là DNA b sung m ch kép (double strand complement DNA- ds cDNA. DNA b sung (complement DNA- cDNA) này khác v i DNA g c là ồ các intron mà ch bao g m các exon (Hình 4.2). + T s n ph m protein,có th suy ra trình t nucleotid c a gen c u trúc ử amin trong phân t protein.Sau đó có th m i ồ (primer) đ dòể tìm đo nạ gen mong mu n. ố

ể ạ Hình 4.2: So sánh hai d ng gen chuy n

ạ ấ ạ

ấ ệ ộ ồ ự ạ

ủ ệ ệ ế ắ D ng ạ

ự ồ ạ ỉ

ộ ủ ả D ng genome bao g m t t c các đo n exon và intron Các đo n intron liên quan xu t hi n m t cách t nhiên. ể đ n vi c c t ghép mRNA và bi u hi n c a gen. cDNA là m t trình t ch bao g m các đo n exon mã hoá protein c a gen.

ổ ợ ộ ể ệ ế ạ c 2 : T o t h p gene bi u hi n trong t bào đ ng

ướ B v t:ậ

ố ứ ủ

ế ợ ồ ớ ừ ạ c k t h p l i v i nhau

ằ ệ ử ụ ế ạ

ố ị ự ứ ộ ậ

ổ ế ế ạ

ượ ự ớ ể c đi kèm v i các trình t không mã hoá có

ủ ự ố ề ể ế ề

ố ế ề ạ

ể ằ ở ủ ế ị

ầ ệ ự ủ ề ể ệ -Các vùng ch c năng khác nhau c a gen có ngu n g c t ể ượ các loài khác nhau có th đ ố trong ng nghi m b ng cách s d ng enzyme h n ch và ligase. -B sung các trình t polylinker ch a m t s v trí nh n bi t các enzyme h n ch khác nhau -Gen chuy n đ ệ vai trò đi u hoà s bi u hi n c a gen. Các y u t đi u hoà cũng có th n m trong đo n intron. Y u t đi u hoà ở ầ g n đ u 5’ c a gen là promoter, có vai trò quy t đ nh trong vi c đi u hoà s bi u hi n c a gen.

ộ ở ế ừ ộ ồ ố ặ

ậ ư

ặ

ư ậ

ậ Promoter t bào đ ng v t có ngu n g c ho c t đ ng v t nh methallothionein (MT), thymidine kinase, ß-actin, ừ amylase, insulin, ß-lactoglobulin, adiposite P2...ho c t ộ virus đ ng v t nh Simian virus(SV40),Rous sarcoma virus (RSV)...

Ơ Ồ Ấ Ệ Ể S Đ C U TRÚC BI U HI N GENE

ầ ị

ự Enhancer: gen tăng c SIG: trình t tín hi u ngườ ATG: v trí kh i đ u phiên mã ở ệ AAA: đuôi polyA

ướ

ơ ở ậ

ế

ệ

ạ

B

c 3:T o c s v t li u bi n n p gen

ế ạ ậ ạ

Ở ộ ợ ứ ề ạ

- đ ng v t có vú thì giai đo n bi n n p gen ở ấ thích h p nh t là tr ng giai đo n ti n nhân (pronucleus).

ằ ứ ử ụ

ố ụ ự ỗ ươ ng pháp s d ng c xây d ng cho m i

ứ ố ằ ậ c thu nh n b ng ph ượ ươ ng trình đã đ ấ ng pháp nuôi c y tr ng trong ng

ể ạ ụ ứ ề ạ

ượ - Tr ng chín đ kích d c t theo ch ươ ặ loài ho c b ng ph nghi m. ệ Sau đó th tinh nhân t o đ t o ra tr ng ti n nhân.

ướ

ộ

ể

B

c 4:

Chuy n gen vào đ ng v t

ậ :

-Ph ng pháp chuy n gene tr c ti p: ươ ự ể ế

. Chuy n gene nh calcium phosphate ờ ể

. Chuy n gene nh xung đi n ể ệ ờ

. Chuy n gene nh vi tiêm ể ờ

. Chuy n gene nh liposome,… ể ờ

-Ph ng pháp chuy n gene gián ti p: ươ ể ế

Chuy n gene nh virus: ể ờ

+ vector retrovirus ( RNA )

+ vector adenovirus ( DNA s i kép ) ợ

+ vector adeno-associated virus ( DNA s i đ n ) ợ ơ

+ vector herpes simplex virus ( DNA s i kép ) ợ

+ vector baculovirus ( DNA vòng kép ),….

a. Ph

ng pháp vi tiêm:

ươ

Nguyên t c:ắ

ự

ế

ạ

ế

bào đ ng v t nh ờ

ậ

ộ

- Tiêm tr c ti p DNA ngo i lai vào nhân t d ng c vi tiêm v i kim tiêm r t m nh.

ụ

ả

ấ

ớ

ng t

ươ

ả ấ

ế

- Ph bào đ

ng pháp này cho k t qu r t cao nh ng s l c x lý nh do ph i thao tác trên t ng t

ố ượ bào. ế

ư ừ

ế ả

ử

ỏ

ượ

ng đ

c dùng đ đ a DNA vào h p t

ho c các t

bào

ượ

ể ư

ợ ử

ặ

ế

- Th ườ phôi s m.ớ

ể

ụ

- Chuy n gene vào tinh trung ho c tr ng khi đã th tinh nh ng ch a k t h p thành h p t ế ợ

ứ ặ ng b i. ộ ợ ử ưỡ

ể

ỉ

- Vi c chuy n gene ch thành công khi gene chuy n vào di truy n cho các th h sau.

ế ệ

ệ ề

Qui trình:

- Thi t k c u trúc gene chuy n, l a ch n gene thích h p và t o dòng. ế ế ấ ự ể ạ ợ ọ

- Thu nh n tr ng đã thu tinh ứ ậ

- Chu n b dung d ch DNA cho vi tiêm, n ng đ t 1-5 µm/ml ộ ừ ẩ ồ ị ị

bào h p t - Chu n b t ẩ ị ế ợ ử

- Vi tiêm DNA vào ti n nhân ề

- Chuy n phôi vi tiêm vào c th nh n ơ ể ể ậ

- Ki m tra gene chuy n con non. Lai t o đ c ng c di truy n. ể ở ể ể ủ ề ạ ố

b. Chuy n gene nh xung đi n: ể ệ ờ

Nguyên t c: ắ

ệ ệ ạ

bào cao và t o ra m t xung đi n ( đi n bào xu t hi n các l - Khi trong đi n tr cao th trong m t th i gian r t ng n) lúc đó trên t ộ ng có m t m t đ t ộ ườ ấ ờ ậ ộ ế ắ ệ nh . ỏ ộ ệ ế ế ấ ỗ

bào chúng có ỗ ế m t s t ở ộ ố ế

ng tác v i genome c a t bào  t bào chuy n gene. - Qua các l th t ể ươ này, DNA có th đi sâu vào trong t ể ủ ế ế ớ bào và ể

- Máy t o xung đi n có công su t n đ nh,đi n th t 500-1500 v/cm ấ ổ ế ừ ệ ệ ạ ị

- Sau m i l n th c nghi m thì có 20-50% t bào còn s ng. ỗ ầ ự ệ ế ố

Chú ý:

ệ ả ả ợ ơ

ẳ bào đích. - Các DNA du i th ng cho hi u qu chuy n gene cao h n, do kh năng dung h p ể v i genome c a t ớ ỗ ủ ế

- Tránh đ t ể ế bào dính vào nhau, nên th c hi n trong dung d ch huy n phù đ n ệ ự ề ơ ị

- C n dùng nhi u DNA và t bào đ n ề ầ ế ơ

- Các t bào khác nhau thì các thông s s d ng khác nhau. ế ố ử ụ

Máy xung đi n ( hãng biorad ) ệ

Chuy n gene nh vector retrovirus: ờ ể

1. Đ c đi m c u t o và di truy n ấ ạ ề

ể ặ c a retrovirus: ủ

- ạ

ả ậ ủ ế

bào v t ch và ế ắ ộ

Là lo i virus RNA, có kh năng xâm nhi m vào t ễ g n b gene virus vào genome t bào ch .ủ

- C u trúc g m : ấ ồ

ấ ạ

ỏ ỏ

ỏ

+ Có c u t o v g m: v ngoài ỏ ồ cùng glycoprotein, v trong là lipide kép, v trong cùng là capside.

+ Ph n lõi RNA g m 2 s i đ ng ợ ồ ồ

d ng và các enzyme. ầ ạ

+ Enzyme phiên mã ng c ( reverse ượ

ủ ở

Transcriptase ), enzyme cài xen ( integrase ) giúp cho quá trình cài xen b gene c a virus v i ủ ộ ớ genome t bào v t ch nh ng ế ữ ậ ng đ ng. đi m t ồ ươ ể

2. C ch ho t đ ng c a vector: ạ ộ

ủ

ế

c lo i b các gene gag, pol,

- RNA c a virus đ ượ ủ env và thay vào đó là gene c n chuy n.

ạ ỏ ầ

ể

c đ a vào t

ượ

ế

bào v t ch ủ ậ

ư ng pháp khác nhau.

- Vector retrovirus đ b ng nhi u ph ề

ươ

ằ

bào ch t thì ph n v c a

ỏ ủ

ầ

ấ

i phóng RNA.

- Khi vào trong t ế vector b phân h y, gi ủ ị

ả

ế

bào

ủ  các ế

ủ

ụ

ẩ

- Enzyme phiên mã ng  cDNA c xúc tác RNA ượ  enzyme cài xen giúp  vào trong nhân t bào bào v t ch g n cDNA vào genome t ậ ế ắ s n ph m protein c a gene m c tiêu trong t ả đích.

ệ ố

ướ ế ấ ề ứ  c y ấ

B c 5: nuôi c y phôi trong ng nghi m T bào tr ng ti n nhân chuy n vào con nh n đ c gây ch a gi ề ậ  phôi dâu ( morula ) ho c túi phôi ( blastocyst ) ặ ượ . ả ữ

ướ

ươ

ộ

ậ

ng pháp đánh giá đ ng v t sau khi

c 6: Các ph ừ

ể

B sinh ra t phôi chuy n gene:

ễ

- Southern blot - Northern blot - Western blot. - PCR - RT-PCR - Mi n d ch Elisa. ị

B c 7: t o ngu n đ ng v t chuy n gene m t cách liên t c. ướ ụ ể ạ ậ ộ ồ ộ

Ph ng pháp ELISA ( enzyme linked immunosorbent assay ) ươ

1. Nguyên t c:ắ

- Thông qua s k t h p c a kháng th và kháng nguyên trong huy t thanh. ể ự ế ợ ủ ế

- Kháng th không g n kháng nguyên s b r a trôi. ẽ ị ữ ể ắ

- Nh n bi t s g n này b ng m t c ch t đ c bi t làm thay đ i màu ậ ế ự ắ ấ ặ ộ ơ ằ ệ ổ

ử ụ ệ

Đĩa plastic s d ng đ ti n hành xét nghi m ể ế ELISA

CÁ H I CHUY N GENE HOOCMON SINH TR

NG GH

Ồ

Ể

ƯỞ

NG I Ở ƯỜ

cá có t c đ tăng tr

ng cao g p 10-30 l n

ộ

ố

ưở

ấ

ầ

ợ

ậ

3. Ý nghĩa, thu n l i và khó khăn

:

ữ

ự

ọ

ề

ắ

ạ

Ứ

ụ

ọ

ệ

ạ

ươ

ổ

ng pháp c đi n

ể trong ch n ọ

3.1.Ý nghĩa : a. Trong nghiên c u :ứ - T o ni m tin v ng ch c cho khoa h c s s ngố . - ng d ng công ngh gene trong ch n t o gi ngố . - Thay cho ph ậ gióng v t nuôi.

b.Trong s n xu t:

ả

ấ

v t nuôi có th sinh tr ng s n ph m t

ưở t và s l

ả

ậ ấ ượ

ng nhanh, ng d i ồ ố ượ

ể ẩ

ố

ữ

c nh ng nhu c u ngày càng ầ ng và ch t i, c v s l ườ

ả ề ố ượ

ấ

cho

ậ

ạ

ổ

ừ

ồ ị ả ượ ng các ch t c n

ữ

ng th t, ấ ầ

- T o raạ cho ch t l dào. - Đáp ng đ ượ ứ tăng c a con ng ủ l ng. ượ - Đêm l ồ i nông dân t ng ườ tr ng, s a… tăng, hàm l ứ thi ế

i ngu n thu nh p kh ng l chăn nuôi (s n l ượ ấ

t tăng, thêm nhi u ch t quý… ) ề

ậ

ế ỷ ủ

ế ỷ

ọ

ệ

ợ : 3.2.Thu n l i - Th k 21 là th k c a công ngh sinh h c

ậ

ế

ứ

ề ỹ

ề ủ

ự

ầ

ứ

ố

ế

ứ

ờ

ề

ạ

ượ

ệ

ả

ư ế c th i gian, công s c và ti n b c, c hi u qu thành công cao

ệ - Ki n th c v k thu t di truy n và công ngh gene ngày càng phong phú, đ y đ , s giao l u ọ khoa h c qu c t giúp các nhà nghiên c u ti t ượ ệ ki m đ ờ ồ đ ng th i thu đ h nơ .

3.3.Khó khăn:

ậ

ỗ

ơ

ổ

ị

ệ

ữ

ể ể

ố

ề

ọ

ằ

ẫ

ả ữ

ượ

ẫ ứ

ề

ệ

ơ ớ ằ ụ

ợ

ả

ấ

ề M i c th sinh v t đ u có tính n đ nh, do đó vi c chuy n nh ng gene mong mu n là không h ư đ n gi n, các nhà khoa h c v n ch a b ng lòng ủ ế c vì ch y u chúng v n v i nh ng gì đã có đ ệ n m trong đi u ki n phòng thí nghi m, khó ng d ng đu c ra s n xu t.

Ỹ

Ể

SO SÁNH K THU T CHUY N GENE Ậ VI KHU N, Đ NG V T VÀ TH C V T Ự Ậ

Ộ

Ậ

Ẩ

Ở

Gi NG NHAU

Ố

ậ

ữ

• M c đích t o ra nh ng sinh v t chuy n gene mang các đ c ặ c đó, ph thu c vào

ụ

ộ

ể ậ ướ

ng.

ng th t, tr ng…).

ư ả ạ

ả ượ

ứ

ị

ạ ụ t tr i h n nh ng sinh v t tr tính v ữ ượ ộ ơ m c đích c a con ng ườ ủ ụ – Nh tăng năng su t. ấ – Gi m thi u ô nhi m môi tr ễ ể ườ – T o ra các s n ph m sinh h c ( s n l ẩ ả ọ • Đ u dùng các vector chuy n gene ề • Đ u c n có s tham gia c a các enzyme. ề ầ

ể ủ

ự

Gi NG NHAU

Ố

• Kh năng ti p nh n DNA (RNA) đ u ph thu c vào t

bào

ụ

ề

ộ

ế

ậ

ả ậ

• Sau khi gene đ

bào nh n đ u có kh năng

ế nh n và gene c n chuy n. ể c chuy n vào t ể

ề

ậ

ả

bào cho b ng ph

ng pháp

ầ ế ượ phân c t b i các enzyme nuclease các t ế

ề

ằ

ươ

bào.

ắ ở • Đ u ph i t o dòng gene t ừ ả ạ PCR ho c b ng vi khu n. ặ ằ ộ ụ

ẩ ạ ộ

ủ ế

ộ

ự

• Đ u ph thu c vào ho t đ ng sinh lý c a t • T bào cho không cho toàn b NST. • Đ u ph i th c hi n quá trình ch n l c dòng. ọ ọ ệ • Đ u ch u tác đ ng tr c ti p vào y u t

con ng

i và các đi u

ự ế

ế ố

ộ

ườ

ề

ả ị ki n chuy n gen.

ề ế ề ề ệ

ể

i ích cho con ng

i (gà,

• Các loài sinh v t g n gũi, có nhi u l ậ ầ

ề ợ

ườ

bò, dê, thu c lá, ngô, bông…)

ố

KHÁC NHAU

N I DUNG

Đ NG V T

Ộ

VI KHU NẨ

TH C V T Ự Ậ

Ộ

Ậ

Vi khuaån E. coli

Haït phaán, teá baøo laù

Teá baøo tröùng

Caùc teá baøo nhaän thöôøng duøng

T ố ươ đ n g i n ơ

ng đ i ả

T ng đ i ố ươ ph c t p ứ ạ

Heä enzyme cuûa teá baøo nhaän

TH C V T Ự Ậ

N I Ộ DUNG

VI KHU NẨ

Đ NG Ộ V TẬ

ệ

ạ

Ưu đi mể

ọ

ặ

ấ

ả ấ ố

ề

ệ

ấ

ả

-T o ra các h p ợ ch t quý do có h ệ enzyme r t đa ấ d ng và ạ ph c t p. ứ ạ

-Th i ờ gian th ế h ệ ng n.ắ -Thao tác ng t ươ đ i đ n ố ơ gi nả

ưở ườ

-Công ngh này cho phép ch n và chuy n ch riêng ể ỉ đ c tính mong mu n. H p ợ ố lí, hi u qu và đem l i k t ạ ế ả ệ t. qu r t t - Đi u ki n nuôi c y đ n gi n h n. T bào th c v t ậ ế ự do có thành nên ch u nh ị ả ng b t l h i c a môi ấ ợ ủ ng trong quá trình tr chuy n gen. ể