Báo cáo kết quả đề tài cấp Bộ năm 2008: Nghiên cứu xây dựng vườn giống vô tính bạch đàn và quy trình nhân nhanh Invitro một số dòng bạch đàn ưu trội của vườn giống Fortip Vạn Xuân phục vụ sản xuất

BỘ CÔNG THƯƠNG

TỔNG CÔNG TY GIẤY VIỆT NAM

VIỆN NGHIÊN CỨU CÂY NGUYÊN LIỆU GIẤY

……………………*……………………

BÁO CÁO KẾT QUẢ ĐỀ TÀI CẤP BỘ NĂM 2008

TÊN ĐỀ TÀI:

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG VƯỜN GIỐNG VÔ TÍNH BẠCH ĐÀN VÀ QUY TRÌNH NHÂN NHANH INVITRO MỘT SỐ DÒNG BẠCH ĐÀN ƯU TRỘI CỦA VƯỜN GIỐNG FORTIP VẠN XUÂN PHỤC VỤ SẢN XUẤT

CƠ QUAN CHỦ QUẢN: BỘ CÔNG THƯƠNG

CƠ QUAN CHỦ TRÌ: VIỆN NGHIÊN CỨU CÂY NGUYÊN LIỆU GIẤY

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: ThS. PHẠM ĐỨC HUY

7116 17/02/2009

PHÚ THỌ, THÁNG 12/2008

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

HSNC: Hệ số nhân chồi

TLCHH: Tỷ lệ chồi hữu hiệu

BAP: 6-Benzylaminopurine

NAA: 1-Naphtalene acetic acid

IBA: 3-Indolbutiric acid

Hvn (m): Chiều cao vút ngọn

Dg (cm): Đường kính phía trên vị trí ghép

Dt (m): Đường kính tán lá

S (%): Tỷ lệ sống

N: Số mẫu kiểm tra

MỤC LỤC

Trang

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

1 TÓM TẮT

2 I. TỔNG QUAN

2 1.1. Cơ sở pháp lý của đề tài

2 1.2. Tính cấp thiết và mục tiêu nghiên cứu của đề tài

2 1.2.1. Tính cấp thiết của đề tài

3 1.2.2. Mục tiêu của đề tài

4 1.3. Địa điểm, đối tượng và nội dung nghiên cứu

4 1.3.1. Địa điểm nghiên cứu

4 1.3.2. Đối tượng nghiên cứu

4 1.3.3. Nội dung nghiên cứu

5 1.4. Tổng quan tình hình nghiên cứu

5 1.4.1. Tình hình nghiên cứu trong nước

7 1.4.2. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài

9 II. THỰC NGHIỆM

9 2.1. Phương pháp nghiên cứu

9 2.1.1. Trồng vườn giống

10 2.1.2. Trồng và chăm sóc vườn vật liệu

10 2.1.3. Thử nghiệm nhân giống invitro

2.1.3.1. Phương pháp cắt, rửa và khử trùng mẫu 11

2.1.3.2. Thử nghiệm và chọn môi trường cơ bản 11

2.1.3.3. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến HSNC và 11

TLCHH

2.1.3.4. Điều kiện thí nghiệm 13

2.1.3.5. Thu thập và xử lý số liệu 13

15 2.2. Thiết bị, dụng cụ và nguyên vật liệu

16 2.3. Kết quả thực nghiệm và thảo luận

16 2.3.1. Trồng vườn giống

2.3.1.1. 16 Điều tra chọn địa điểm và thu thập điều kiện tự nhiên của địa điểm thiết lập vườn giống

2.3.1.2. Thiết kế và trồng vườn giống 16

2.3.1.3. Sinh trưởng của các dòng ở 6 tháng tuổi 16

21 2.3.2. Trồng vườn vật liệu

21 2.3.3. Thử nghiệm nhân giống invitro

2.3.3.1. Nghiên cứu môi trường cơ bản thích hợp cho nhân nhanh chồi. 21

2.3.3.2. 23 Ảnh hưởng của BAP đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu

2.3.3.3. 26 Ảnh hưởng của BAP và NAA đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu

2.3.3.4. 30 Ảnh hưởng của BAP và IBA đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu

2.3.2.5. So sánh HSNC và TLCHH giữa 5 dòng 31

33 III KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

33 3.1. Kết luận

33 3.2. Kiến nghị

35 IV. TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHẦN PHỤ BIỂU

TÓM TẮT

Đề tài: “Nghiên cứu xây dựng vườn giống vô tính Bạch đàn và quy trình nhân nhan in vitro một số dòng Bạch đàn ưu trội của vườn giống FORTIP Vạn Xuân phục vụ sản xuất” được thực hiện trong 2 năm (2007 và 2008). Năm 2007, đề tài đã chọn lọc được 20 cây trội của vườn giống FORTIP Vạn Xuân, thử nghiệm các phương pháp ghép và tạo được 400 cây ghép với cành ghép được lấy từ 20 cây trội đã chọn lọc

Năm 2008, đề tài đã thực hiện 2 mục tiêu chính là xây dựng vườn giống từ cây ghép của 20 dòng đã được chọn lọc và tiến hành nghiên cứu nuôi cấy in vitro cho 5 dòng ưu trội nhất từ 20 dòng đã chọn lọc.

Vườn giống được trồng tháng 6 năm 2008, diện tích 1,0 ha tại Đội Ngọc Mỹ - Công ty lâm nghiệp Lập Thạch – Vĩnh Phúc. Các dòng cây ghép cho tỷ lệ sống cao, biến động từ 82-100%. Đến nay sinh trưởng của các dòng cây ghép tương đối tốt và không bị sâu bệnh.

Đề tài thực hiện các thử nghiệm nhân giống in vitro giai đoạn nhân chồi bao gồm: thử nghiệm môi trường cơ bản, nồng độ BAP, ảnh hưởng phối hợp của BAP + NAA và BAP + IBA. Đề tài chọn được môi trường MS + 30g/l sucrose + 4.5g/l agar + 2.0mg/l vitaminB2 + 1.5mg/l BAP + 1.5 mg/l NAA, pH =6 là thích hợp nhất trong các môi trường đã thử nghiệm và cũng là môi trường phù hợp cho cả 5 dòng tiến hành nghiên cứu.

1 I. TỔNG QUAN

1.1. Cơ sở pháp lý của đề tài.

- Căn cứ quyết định số 1999/QĐ-BCT, ngày 03/12/2007 của Bộ trưởng Bộ Công nghiệp về việc giao kế hoạch khoa học và công nghệ năm 2008 cho Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy.

- Căn cứ hợp đồng nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ số 45.08

RD/HĐ-KHCN, ngày 23/01/2008.

- Căn cứ quyết định số 12/QĐ-KHTH, ngày 28/01/2007 của Viện trưởng Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy về việc giao nhiệm vụ nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ.

- Căn cứ quy phạm kỹ thuật xây dựng rừng giống và vườn giống (QPN 15

– 93) của Bộ Lâm nghiệp ngày 02/11/1993 (chi tiết xem phụ biểu 5).

1.2. Tính cấp thiết và mục tiêu nghiên cứu của đề tài.

1.2.1. Tính cấp thiết của đề tài.

Ở nước ta hiện nay, cây Bạch đàn (Eucalyptus) là một trong những loài cây trồng rừng chủ lực trên hầu hết các vùng sinh thái nhằm đáp ứng các nhu cầu nguyên liệu giấy, gỗ trụ mỏ, gỗ xây dựng, gỗ xẻ và củi. Trong khoảng 10 năm trở lại đây, năng suất rừng trồng bạch đàn đã được cải thiện rõ rệt nhờ kết quả của các chương trình cải thiện giống.

Giai đoạn từ năm 1996-1999, dự án FORTIP (Regional Project on Forest Tree Improvement) về cải thiện giống cây rừng đã xây dựng 46 ha rừng giống và vườn giống cho các loài cây Bạch đàn, Keo lá tràm và Keo tai tượng với nguồn hạt được lấy từ các giống, xuất xứ triển vọng trong và ngoài nước. Dự án cũng đã xây dựng được nhiều vườn giống, rừng giống thế hệ 1 và thế hệ 1.5 đáp ứng nhu cầu giống cho nghiên cứu và sản xuất [3].

Vườn giống Bạch đàn tại Vạn Xuân, Phú Thọ gồm 144 gia đình được thiết lập năm 1996 là một trong những vườn giống có nhiều gia đình và cá thể có năng suất rất cao trong dự án FORTIP nói trên. Đây là nguồn vật liệu quý cần để chọn lọc những dòng có năng suất cao từ đó nhân giống phục vụ trồng rừng và

2 xây dựng vườn giống cho phục phụ các chương trình nghiên cứu cải tạo giống tiếp theo.

Đồng thời, để đạt được kết quả tốt thì một chương trình cải thiện giống không chỉ dừng lại ở chỗ có được những giống được cải thiện mà giống đó phải được nhân rộng phục vụ sản xuất và cung cấp vật liệu cho các chương trình cải thiện giống khác. Do đó, yêu cầu cần thiết là xây dựng vườn giống từ các dòng đã chọn lọc và tiến hành nhân giống vô tính phục vụ cho trồng rừng thử nghiệm từ đó từng bước đưa cây giống chất lượng cao vào trồng rừng sản xuất.

Trong xây dựng rừng giống, vườn giống, để tăng phẩm chất di truyền của hạt giống, người ta thiết lập vườn giống bằng cây ghép với cành ghép lấy từ cây tuyển chọn và gốc ghép là cây có sức chống chịu tốt với điều kiện bất lợi của ngoại cảnh như khí hậu, đất đai, sâu bệnh...vv. Vườn giống trồng từ cây ghép có nhiều ưu điểm rõ rệt so với vườn giống trồng từ hạt như nhanh ra quả, duy trì các đặc tính di truyền của cây mẹ [12].

Về nhân giống vô tính, hiện nay ở nước ta thì nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy in vitro là phương pháp ưu thế nhất. Đặc biệt trong nhân giống cây bạch đàn nói riêng và cây lâm nghiệp nói chung thì đây là phương pháp cho hiệu quả rõ rệt nhất.

Từ những đặc điểm trên, xây dựng vườn giống bằng cây ghép với cành ghép từ những cây ưu trội của vườn giống FORTIP Vạn Xuân và thử nghiệm nhân giống in vitro là cần thiết. Xây dựng vườn giống cung cấp nguồn hạt giống cho khảo nghiệm chọn lọc giống mới và phục vụ lai tạo giống. Thử nghiệm nhân giống in vitro nhằm tạo cây con phục vụ khảo nghiệm dòng vô tính, công nhận giống mới và phát triển vào sản xuất.

1.2.2. Mục tiêu của đề tài.

1) Xây dựng vườn giống từ cây ghép của các dòng bạch đàn năng suất cao tại

vườn giống FORTIP Vạn Xuân.

2) Xác định điều kiện nuôi cấy in vitro (môi trường hóa học) thích hợp để nhân nhanh các dòng đã được chọn lọc tại vườn giống FORTIP Vạn Xuân phục vụ sản xuất.

3 1.3. Địa điểm, đối tượng và nội dung nghiên cứu.

1.3.1. Địa điểm:

Vườn giống được thiết lập tại Đội Ngọc Mỹ - Công ty Lâm nghiệp Lập Thạch với diện tích 1,0 ha. Vườn vật liệu và thử nghiệm nhân giống in vitro tại Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy.

1.3.2. Đối tượng nghiên cứu

• Cây trồng vườn giống:

Vườn giống được trồng từ cây ghép với cành ghép lấy từ 20 cây trội được chọn lọc của vườn giống Vạn Xuân (20 cây trội đã được chọn năm 2007 của đề tài này chi tiết xem phụ biểu 1).

Cây ghép đem trồng là cây có vết ghép đã ổn định. Sinh trưởng phát triển

tốt, không sâu bệnh, tán lá phát triển cân đối, chiều cao > 50cm.

• Cây thử nghiệm nuôi cấy in vitro:

Từ 20 cây trội đã chọn lọc, đề tài lựa chọn 5 cây có thể tích thân cây cao nhất làm đối tượng để tiến hành nghiên cứu nhân giống in vitro, cụ thể là các cây trội sau: Cây trội số 154, 141, 122, 136 và 126 (đặc điểm cụ thể của 5 cây trội thử nghiệm nhân giống in vitro xem phụ biểu 1).

1.3.3. Nội dung nghiên cứu.

Để đạt được mục tiêu đề ra, đề tài thực hiện các nội dung nghiên cứu sau:

1. Điều tra chọn địa điểm thiết lập vườn giống.

2. Thu thập điều kiện tự nhiên, đất đai của địa điểm thiết lập vườn giống.

3. Thiết kế và trồng vườn giống.

4. Trồng và chăm sóc vườn vật liệu phục vụ cho nuôi cấy in vitro.

5. Nghiên cứu kỹ thuật nuôi cấy in vitro.

6. Thu thập các chỉ tiêu nghiên cứu, xử lý số liệu và viết báo cáo khoa học.

4 1.4. Tổng quan tình hình nghiên cứu.

1.4.1. Trong nước.

Ở Việt Nam, từ năm 1996-1999, dự án FORTIP (Regional Project on Forest Tree Improvement) về cải thiện giống cây rừng đã xây dựng 46 ha rừng giống và vườn giống cho các loài cây Keo lá tràm, Keo tai tượng và Bạch đàn với nguồn hạt được lấy từ các xuất xứ tốt trong và ngoài nước. Các gia đình trồng trong vườn giống theo khối, lặp lại 8 lần. Sau đó đánh giá sinh trưởng và giữ lại những gia đình tốt nhất có triển vọng [3].

Ngoài diện tích rừng giống trên, hiện nay nước ta chiếm đa số là các rừng giống được chuyển hoá từ rừng tự nhiên hoặc rừng trồng, nên phẩm chất di truyền của hạt giống còn thấp. Chúng ta có khoảng 2.000 ha rừng giống và vườn giống các loại như Thông 3 lá ở Lâm Đồng, Thông Nhựa ở Quảng Bình, Tếch ở Định Quán, Keo và Bạch đàn ở Vùng Trung tâm Bắc bộ.

Vấn đề xây dựng rừng giống đã được Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy quan tâm từ lâu, năm 1996 Viện đã chuyển hoá được 10,3 ha rừng giống từ rừng trồng với nguồn hạt nhập nội. Hiện nay, rừng giống chuyển hoá này đã cho hiệu quả kinh tế rõ rệt, rừng trồng từ nguồn hạt này cho năng suất và chất lượng rừng tăng lên rõ rệt.

Trong những năm gần đây, Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng – Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam đã xây dựng vườn giống Bạch đàn ghép tại Ba Vì phục vụ cho công tác lai tạo. Đây cũng là một trong số rất ít vườn giống cây lâm nghiệp được trồng bằng cây nghép ở nước ta [3].

Đối với lĩnh vực nhân giống in vitro, mặc dù còn nhiều khó khăn cần giải quyết, song trong những năm gần đây, việc áp dụng các biện pháp nhân giống in vitro vào nghiên cứu và thực tiễn sản xuất trong lâm nghiệp đã thu được kết qủa đáng khích lệ. Một số cơ sở đã tiến hành nhân giống in vitro ở quy mô công nghiệp như Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy – Phù Ninh – Phú Thọ, Lâm trường thực nghiệm Yên Lập – Quảng Ninh, Công ty Giống cây Lâm nghiệp Trung ương, …vv. Đồng thời, một số tỉnh và địa phương đã thành lập phòng nuôi cấy in vitro để phục vụ cho công tác giống cây trồng và đã có những thành công bước đầu.

5 Một số loài cây trồng rừng quan trọng, một số loài cây quý hiếm đã được nghiên cứu và sản xuất. Cây Bạch đàn (Eucalyptus), cây Tếch (Techtona grandis), cây Hông (Paulownia fortunei) đã được Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy Phù Ninh sản xuất ở quy mô công nghiệp; cây Keo lai (A. mangium x A. auriculiformis) cây Trầm gió (Aquilaria crassna Pierri), cây tre Tàu (sinocalamus latiflus), tre Mạnh tông (Dendrocalamus asper) và nhiều loài cây khác đã nghiên cứu thành công. Các kết quả này cho thấy bước đầu có nhiều triển vọng cho sản xuất cây con giống chất lượng cao.

Mai Đình Hồng, 1995 đã đưa ra môi trường nuôi cấy in vitro cây bạch đàn urô dòng U6 như sau: môi trường nhân chồi là MS + 3% đường + 4.5 g/l agar + 0.5 mg/l BAP + 0.25 mg/l NAA. Môi trường tạo rễ và cây con hoàn chỉnh là MS 1/4 nồng độ + 1.5 % đường + 5 g/l agar + 1 mg/l IBA [2].

Nhóm tác giả của Viện Sinh học nhiệt đới, Sở NN&PTNT Kiên Giang và Trường Đại học Nông lâm Tp.HCM đã nghiên cứu và đưa ra môi trường nuôi cấy cây Trầm hương (Aquilaria crassna) là WPM + 0.1 mg/l BA + CW (10%) cho phát sinh chồi. Môi trường thuận lợi cho tạo chồi và nhân nhanh chồi là WPM + BA (0.1 mg/l) + NAA (0.1 mg/l) [7].

Cũng với cây trầm, Đoàn Thị Mai và cộng sự đã đưa ra môi trường nhân chồi thích hợp là MS cải tiến bổ sung 1.0 mg/l BAP + 0.5 mg/l kinetin. Môi trường ra rễ thích hợp nhất là 1/2 MS cải tiến bổ sung 2.0 mg/l IBA [5].

Nhân giống in vitro cây Tre tàu (Sinocalamus latiflorus) và tre Mạnh tông (Dendrocalamus asper) với mẫu vật được lấy từ hạt và được khử trùng bằng hypoclorit canxi trong 15 phút, HgCr2 trong 5 phút. Qua nhiều công thức thí nghiệm, nghiên cứu thu được kết quả sau: Tạo chồi từ hạt tốt trên môi trường MS có BA 3 mg/l và Kinetin 1 mg/l; nhân chồi tốt trên môi trường MS có BA 2mg/l và kinetin 1 mg/l; chồi, cây con ra rễ và sinh trưởng thành cây hoàn chỉnh tốt trên môi trường có nồng độ khoáng MS giảm 1/2 và IBA 10 mg/l [10].

Nhân giống vô tính cây Hông (Paulownia fortunei) bằng phương pháp nuôi cấy mô. Mẫu nuôi cấy tạo vật liệu ban đầu từ chồi đỉnh và chồi bên. Mẫu vật được khử trùng bằng hypoclorit canxi trong 20 phút sau đó cấy vào các loại môi trường khác nhau. Kết quả thu được như sau: môi trường thích hợp nhất cho tạo chồi và nhân nhanh chồi là MS cải tiến có bổ sung 30 g/l đường, 8 g/l agar, 5

6 mg/l BA và 0.1 mg/l NAA. Môi trường tạo rễ và cây con hoàn chỉnh tối ưu là 1/2 dinh dưỡng khoáng MS + 20g/l đường + 0.1 mg/l NAA + 1.0 g/l than hoạt tính [13].

1.4.2. Ngoài nước.

Ở các nước có nền lâm nghiệp phát triển, mạng lưới cung ứng giống được xây dựng khá hoàn chỉnh. Mỗi địa phương đều có rừng giống và vườn giống cung cấp nguồn hạt giống, vật liệu nhân giống cho địa phương đó. Do vậy chủ động nguồn giống cho các chương trình trồng rừng của khu vực.

Ngoài vườn giống lấy hạt, một số nước còn thiết lập vườn giống nghiên cứu hay còn gọi là ngân hàng dòng (clone banks) với mục đích là lưu giữ và bảo tồn các giống đã tuyển chọn phục vụ cho các chương trình cải thiện giống dài hạn nhằm sản xuất một lượng lớn hạt giống từ những dòng ưu tú đã chọn lọc.

Trong lĩnh vực nhân giống in vitro, môi trường hóa học dùng cho các loài cây thân gỗ rất đa dạng, tuy nhiên người ta thường sử dụng 5 loại môi trường sau[14]:

(cid:153) Môi trường khoáng MS (Murashige & Skoog, 1962) là môi trường cơ bản, giàu dinh dưỡng thích hợp cho các loài thực vật nói chung. Môi trường này không chỉ đơn thuần sử dụng trong nuôi cấy mô mà nó còn được sử dụng trong nuôi cấy tế bào, nuôi cấy phôi vô tính, nuôi cấy hạt phấn, bao phấn…vv.

(cid:153) Môi trường MS cải tiến (Murashige & Skoog medium including Nitsch vitamins, 1969). Đây là môi trường MS (1962) được bổ sung thêm một số loại vitamin. Thành phần môi trường được nghiên cứu và công bố bởi Nitsch năm 1969, môi trường này được sử dụng để nuôi cấy nhiều loài cây khác nhau trong đó có cây mận (Prunus spp), cây ôliu (Olea europaea)…vv.

(cid:153) Môi trường WPM (Woody Plant Medium) được Mccown đưa ra vào năm 1980 là môi trường thường được dùng để nuôi cấy các loài cây gỗ. Đã có nhiều công trình nuôi cấy in vitro sử dụng môi trường này như nhân giống thông (Loblolly pine, Pinus taeda) ở Mỹ.

7 (cid:153) Môi trường Litvay là môi trường mà tên môi trường được lấy từ tên tác giả nghiên cứu ra (Litvay J.D, 1985). Đây cũng là môi trường được tác giả sử dụng để nuôi cấy cây thông nói chung (Pinus).

(cid:153) Môi trường WV3 (Westvaco3 Medium, 1997) là môi trường đã được sử

dụng để nuôi cấy cây thông, cây dương.

lai (P. caribaea x P. elliottii) ở Ôxtrâylia,…vv.

Công trình của M.E.cortezzi Graca và S.Mendes thuộc Trung tâm nghiên cứu lâm nghiệp Curitiba, Brazil đã nuôi cấy in vitro cây Bạch đàn (Eucalyptus dunnii Maid) tốt nhất trên môi trường MS có bổ sung 0,1 mg/l BAP + 0,01 mg/l IBA[16].

I. Joihs và cộng sự của Viện nghiên cứu lâm nghiệp Ấn Độ đã nuôi cấy thành công cây Bạch đàn lai (E.terecornis x E.gandis) trên môi trường MS + BAB 1,0mg/l và NAA 1,0 mg/l[15].

8 II. THỰC NGHIỆM.

2.1. Phương pháp nghiên cứu.

2.1.1. Trồng vườn giống.

Vườn giống được trồng theo quy phạm kỹ thuật xây dựng rừng giống, vườn giống hiện hành của Bộ NN&PTNT (Quy phạm ngành 15-93) và các tiêu chuẩn kỹ thuật trong trồng rừng Bạch đàn.

a) Xử lý thực bì.

Thực bì được phát trắng toàn diện theo lô, sau đó xếp thực bì theo băng

rộng 2m và đốt hoàn toàn. Thực bì được xử lý trước khi cuốc hố 20 ngày.

b) Làm đất.

Hố trồng được cuốc với kích thước 60x60x60cm. Trước khi trồng 10 ngày bón lót 500g/hố phân NPK 10-5-5 và 10kg/hố phân chuồng hoai sau đó trộn phân và lấp đất đầy hố cao hơn mặt đất tự nhiên 5cm .

c) Trồng và chăm sóc vườn giống

Cự ly trồng là 6m x 6m (hàng cách hàng 6m và cây cách cây 6m), mật độ 277 cây/ha. Thời vụ trồng vào vụ xuân từ 15/02 đến 15/05. Hàng nằm trên đường từ chân lên đỉnh theo hướng Đông – Tây.

Các dòng được trồng theo hàng có chuyển dịch sao (phụ lục 4) cho các cây cùng một dòng cách xa nhau nhằm hạn chế tối đa sự giao phấn trong cùng một dòng

Thường xuyên kiểm tra, theo dõi và cắt tỉa các chồi phát sinh ở phần gốc

ghép. Chăm sóc năm 1 (năm 2008) 3 lần, cụ thể như sau:

Lần 1: Phát thực bì cạnh tranh, cắt dây leo trên toàn diện tích, rẫy cỏ và xới vun đất màu xung quanh gốc với đường kính từ 0,5 – 0,6m. Tiếp tục trồng dặm cây chết, thời gian chăm sóc từ 1-1,5 tháng, thời gian chăm sóc vào tháng 5-6.

Lần 2: Phát thực bì cạnh tranh, cắt dây leo trên toàn diện tích, rẫy cỏ và xới vun đất màu xung quanh gốc với đường kính từ 0,6 – 0,8m. Thời gian chăm sóc vào tháng 8-10. Bón thúc 500gam phân NPK

Lần 3: Phát thực bì cạnh tranh, cắt dây leo trên toàn diện tích.

9

(cid:153)

Theo dõi, thu thập số liệu của vườn giống.

Theo dõi thu thập các chỉ tiêu Hvn; Hg; Dt; sâu bệnh và phẩm chất cây: tốt, xấu, trung bình.

- Cây tốt: là cây sinh trưởng tốt, tán lá xanh đẹp, phát triển cân đối, không sâu

bệnh.

- Cây trung bình: là cây sinh trưởng phát triển ở mức độ trung bình, không sâu

bệnh.

- Cây xấu: là cây sinh trưởng kém, còi cọc, sâu bệnh.

2.1.2. Trồng và chăm sóc vườn vật liệu

Vườn vật liệu được trồng từ cây ghép của 5 cây trội chọn lọc. Cây được trồng ra đất theo luống, giữa các luống cách nhau 0,5m. Cây được trồng theo hàng trên luống với cự ly 25 x 25cm, mỗi giống trồng 20 cây.

Trước khi trồng làm đất toàn diện và nhặt sạch cỏ, khi trồng bón lót 100g phân NPK cho mỗi hố. Vườn vật liệu được tưới chăm sóc và rẫy nhổ cỏ và cắt tỉa tạo chồi thường xuyên nhằm cung cấp nguồn vật liệu tốt nhất cho nhân giống in vitro.

2.1.3. Thử nghiệm nhân giống in vitro.

Sơ đồ chung của phương pháp nhân giống in vitro

Xử lý cho nảy chồi và cắt mẫu.

Cấy mẫu vào

Cây trội (đối tượng cần nhân giống). Khử trùng mẫu nuôi cấy Môi trường tái sinh chồi (giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu).

5 loại môi trường khác nhau để tìm ra môi trường thích hợp nhất.

Tăng tỷ lệ sống của mẫu nuôi cấy.

Nuôi mẫu trong tủ lạnh. Môi trường nhân nhanh chồi.

Môi trường được bổ sung auxin, cytokinin, các chất đa lượng, vi lượng và vitamin với tỷ lệ khác nhau nhằm tìm ra môi trường thích hợp cho nhân nhanh chồi.

10 Nội dung cụ thể của phương pháp như sau:

2.1.3.1. Phương pháp cắt, rửa và khử trùng mẫu cấy • Cắt mẫu.

Mẫu nuôi cấy (explant) lấy từ chồi bên của cây cấp dòng. Mẫu được lấy ở chồi từ 30-40 ngày tuổi, sinh trưởng tốt, không sâu bệnh, cắt bỏ phần ngọn non, toàn bộ phiến lá và gần hết phần cuống lá (cuống lá được cắt sát với chồi) . Mẫu cấy có chiều dài từ 1.5-3.0 cm, đường kính mẫu cấy từ 1-2 mm, mang từ 2-3 nách lá trong đoạn từ lá thứ 3 đến lá thứ 6. • Khử trùng mẫu

Mẫu sau khi cắt được ngâm ngay vào nước. Sau đó rửa mẫu bằng nước 3

lần, tiếp tục rửa bằng xà phòng (xà phòng bột) và rửa lại 4 lần bằng nước cất.

Đưa mẫu vào phòng cấy vô trùng, rửa lại 2 lần bằng nước cất vô trùng. Khử trùng bằng cồn 750 khoảng 2 giây, sau đó rửa lại 4 lần bằng nước cất vô trùng. Cuối cùng, khử trùng mẫu bằng HgCl2 0,1% trong thời gian 11 phút.

2.1.3.2. Thử nghiệm và chọn môi trường cơ bản.

Đề tài tiến hành cấy mẫu đã được khử trùng vào ống nghiệm chứa 5 loại môi trường sau có bổ sung sucrose 30g/l; 4.5g/l agar, 2.0mg/l vitamin B2, pH=6 và không bổ sung chất điều hoà sinh trưởng (thành phần 5 loại môi trường xem phụ biểu 2)[14].

1. Công thức 1: Môi trường Litvay.

2. Công thức 2: Môi trường MS.

3. Công thức 3: Môi trường MS cải tiến.

4. Công thức 4: Môi trường WPM.

5. Công thức 5: Môi trường WV3.

6. Công thức 6: Đối chứng (môi trường nuôi cấy dòng PN14 không bổ

sung chất điều hòa sinh trưởng)[8].

2.1.3.3. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến HSNC và TLCHH.

Các chất điều hoà sinh trưởng tuy chiếm hàm lượng rất nhỏ trong môi trường nuôi cấy nhưng có vai trò quan trọng quyết định sự thành công của quá trình nhân giống. Trong môi trường nhân giống in vitro người ta thường sử dụng

11 các chất kích thích sinh trưởng trong nhóm auxin như NAA và IBA. Các chất trongvà cytokinin . Auxin được sử dụng để điều chỉnh sự phát sinh rễ. Cytokinin sử dụng để điều chỉnh sự phát sinh chồi. Tỷ lệ cân đối giữa auxin/cytokinin tạo cây hoàn chỉnh [1]. Trong nhân giống in vitro, người ta thường sử dụng auxin là IAA, NAA và IBA, cytokinin là BAP, BA và kinetin.

•

Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến HSNC và TLCHH của 5 dòng nghiên cứu.

Từ môi trường cho HSNC tốt nhất ở các thí nghiệm về ảnh hưởng của môi trường cơ bản đến HSNC (MS + 30 g/l sucrose + 4.5g/l agar + 2.0 mg/l vitamin B2, pH=6) chúng tôi tiến hành bổ sung BAP ở mức các nồng độ thay đổi như sau:

Công thức 7: Nồng độ 0,5 mg BAP/l. Công thức 8: Nồng độ 1,0 mg BAP/l. Công thức 9: Nồng độ 1,5 mg BAP/l. Công thức 10: Nồng độ 2,0 mg BAP/l. Công thức 11: Nồng độ 2,5 mg BAP/l. Công thức 12: Đối chứng (môi trường sản xuất dòng PN14).

Ảnh hưởng phôi hợp của BAP và NAA đến HSNC và TLCHH.

• Để tìm hiểu ảnh hưởng của auxin đến quá trình phát sinh chồi trong sự tương tác với BAP và cũng là để tìm ra môi trường thích hợp cho nhân chồi 5 dòng nghiên cứu, đề tài tiến hành bổ sung NAA với các nồng độ khác nhau vào môi trường MS + 30 g/l sucrose + 4.5g/l agar + 2.0 mg/l vitamin B2 + 2.0 mg/l BAP, pH=6 (môi trường cho HSNC và TLCHH cao nhất ở thí nghiệm trên). Nồng độ NAA trong môi trường thay đổi như sau: Công thức 13: Nồng độ 0,5 mg/l NAA Công thức 14: Nồng độ 1,0 mg/l NAA Công thức 15: Nồng độ 1,5 mg/l NAA Công thức 16: Nồng độ 2,0 mg/l NAA Công thức 17: Nồng độ 2,5 mg/l NAA Công thức 18: Đối chứng (môi trường sản xuất dòng PN14).

12 Ảnh hưởng phôi hợp của BAP và IBA đến HSNC và TLCHH.

• Song song với việc nghiên cứu ảnh hưởng phối hợp của BAP và NAA, đến HSNC và TLCHH của 5 dòng nghiên cứu. Đề tài tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của BAB và IBA đến hiệu quả của quá trình nhân nhanh chồi. Môi trường WPM + 30 g/l sucrose + 4.5g/l agar + 2.0 mg/l vitamin B2 + 2.0 mg/l BAP, pH=6 được bổ sung IBA ở mức các nồng độ (mg/l) thay đổi như sau:

Công thức 19: Nồng độ 0,05 mg/l IBA Công thức 20: Nồng độ 0,10mg/l IBA Công thức 21: Nồng độ 0,15 mg/l IBA Công thức 22: Nồng độ 0,20 mg/l IBA Công thức 23: Nồng độ 0,25 mg/l IBA Công thức 24: Đối chứng (môi trường sản xuất dòng PN14).

2.1.3.4. Điều kiện thí nghiệm

(cid:153) Sau khi cấy mẫu được duy trì trong tủ lạnh (ngăn mát 120C±1) 48 giờ.

(cid:153) Quá trình nuôi cấy (nhân chồi và tạo rễ) được tiến hành trong điều kiện ánh

sáng, nhiệt độ và độ ẩm được duy trì như sau:

- Ánh sáng: mẫu được nuôi cấy dưới ánh đèn nêon với cường độ ánh từ

1000 – 3000 lux, thời gian chiếu sáng 10 giờ/ngày.

- Nhiệt độ: duy trì nhiệt độ trong phòng từ 23 – 270C.

- Độ ẩm: thường xuyên xấp xỉ 60%.

(cid:153) Các thí nghiệm chọn loại môi trường cơ bản, mỗi công thức theo dõi 60 mẫu sống (ống nghiệm). Vì giai đoạn này tỷ lệ chồi hữu hiệu chưa thể hiện rõ nên đề tài chỉ đánh giá kết quả qua HSNC sau 4 tuần nuôi cấy.

(cid:153) Các thí nghiệm nghiên cứu môi trường nhân chồi, mỗi công thức theo dõi 10 bình, mỗi bình 6 chồi nuôi cấy. Môi trường chứa trong bình tam giác. Đánh giá kết quả qua HSNC và TLCHH sau 4 tuần nuôi cấy.

(cid:153) Mỗi công thức thí nghiệm được thực hiện 3 lần lặp lại, mỗi lần 60 mẫu.

2.1.3.5. Thu thập và xử lý số liệu.

(cid:153)

Thu thập các chỉ tiêu

- Số chồi mới tạo thành.

13

- Số chồi hữu hiệu: Những chồi có chiều cao từ 1,0 cm trở lên, thân, lá và ngọn rõ ràng, có nhiều hơn 2 cặp lá, không bị callus. Ghi tình trạng phát triển của chồi ở cả hai giai đoạn nhân chồi và ra rễ bao gồm: hình thái của chồi, những chồi chết, chồi bị đen.

∑ Chồi tạo thành

HSNC (lần) = -----------------------

∑ Chồi ban đầu

∑ Chồi hữu hiệu

TLCHH (%) = -------------------- x 100

∑ Chồi tạo thành

(cid:153) Xử lý số liệu.

- Vẽ biểu đồ và tính các giá trị trung bình được thực hiện trên phần

mềm Excel.

- Để kiểm tra ảnh hưởng của các nhân tố thí nghiệm, chúng tôi sử dụng phương pháp phân tích phương sai một nhân tố bằng phần mềm SPSS 16.0. Sử dụng tiêu chuẩn Duncan để phân nhóm và tìm ra công thức thí nghiệm tốt nhất, cụ thể như sau:

Kết quả thực nghiệm cho thấy, các dòng có sinh trưởng và phát triển (HSNC và TLCHH) đồng gần như nhau ở cùng một môi trường cơ bản hoặc nồng độ chất điều hòa sinh trưởng nên đề tài phân tích ảnh hưởng của môi trường hoặc nồng độ chất điều hòa sinh trưởng đến 5 dòng.

Để tiến hành phân tích phương sai, trước hết cần kiểm tra các mẫu có nằm trong một tổng thể hay không nói cách khác phương sai tổng thể bằng nhau là điều kiện cần và đủ để tiến hành phân tích phương sai một nhân tố. Khi giá trị Sig trong bảng Test of Homogeneity of Variances >0,05 điều này có nghĩa phương sai tổng thể bằng nhau và ngược lại.

Nếu phương sai tổng thể không bằng nhau, chúng tôi sẽ tiến hành kiểm tra sự sai khác về tỷ lệ sống của cành ghép qua tiêu chuẩn LSD. Các công thức có sự sai khác được đánh dấu (*), còn lại là không sai khác.

14 - Phân tích phương sai một nhân tố (Anova)

Giả thuyết Ho: Không có sự sai khác giữa các chỉ tiêu so sánh (chỉ tiêu so sánh đồng đều ở các nhân tố kiểm tra)

Giả thuyết H1: Có sự sai khác giữa các chỉ tiêu so sánh (chỉ tiêu so sánh có sự khác nhau rõ rệt về mặt thống kê)

+ Trong bảng ANOVA, Nếu giá trị Sig của F thu được >0,05 thì chấp nhận H0 (Không có sự sai khác)

+ Trong bảng ANOVA, nếu giá trị Sig của F <0,05 thì chấp nhận H1 (Sai khác rõ rệt về mặt thống kê).

- Phân nhóm bằng tiêu chuẩn Duncan

Sử dụng tiêu chuẩn Duncan để phân nhóm ảnh hưởng của các nhân tố đến kết quả nghiên cứu. Trong bảng phân nhóm Duncan, chỉ tiêu so sánh được chia thành các nhóm khác nhau. Giữa các nhóm có sự sai khác nhau rõ rệt, trong cùng một nhóm không có sự sai khác.

Khi sử dụng phương pháp phân nhóm bằng tiêu chuẩn Duncan có thể có nhiều đối tượng so sánh ở cùng một cấp, điều này có nghĩa chỉ tiêu so sánh nằm ở giữa 2 cấp. Nếu có nhiều đối tượng có giá trị so sánh cùng ở 2 cấp chứng tỏ chỉ tiêu so sánh phân cấp không nhiều (nói các khác là ảnh hưởng của các nhân tố kiểm tra không lớn).

2.2. Thiết bị, dụng cụ và nguyên vật liệu.

- Panh, kéo nuôi cấy mô.

- Thước đo chiều cao, thước đo đường kính, địa bàn.

- Hóa chất sử dụng trong nuôi cấy mô và các trang thiết bị phụ trợ khác.

15 2.3. Kết quả thực nghiệm và thảo luận.

2.3.1. Trồng vườn giống.

2.3.1.1. Điều tra chọn địa điểm thiết lập vườn giống và thu thập điều kiện tự nhiên của địa điểm thiết lập vườn giống.

Thuộc xã Hợp Lý, huyện Lập Thạch, tỉnh Vĩnh Phúc. Ở độ cao 100m so với mực nước biển, độ dốc bình quân 120, hướng phơi Tây Bắc. Đất Feralit vàng đỏ phát triển trên đá mẹ phiến sạn kết. Độ sâu tầng đất từ 30-80cm, thành phần cơ giới thịt trung bình, hơi chặt, tỷ lệ đá lẫn từ 10-15%. Thực bì chủ yếu là sim, mua, chiều cao bình quân <1,0cm, độ che phủ bình quân <30%. Lượng mưa bình quân năm từ 1600-1700mm, nhiệt độ bình quân năm 230C. Hàng năm xuất hiện sương hại từ tháng 11 năm trước đến tháng 3 năm sau. Trồng rừng trên đất sau khai thác bạch đàn.

Đề tài đã tiến hành đào và mô tả phẫu diện đất, kết quả mô tả phẫu diện

đất được thể hiện ở phụ biểu 4.

Ở khu vực này cây Bạch đàn nói chung cũng như Bạch đàn urophylla sinh trưởng phát triển tốt. Địa điểm trồng vườn giống có độ dốc nhỏ, và có cách ly với rừng trồng Bạch đàn. Ở đây cũng chưa từng xảy ra sâu bệnh hại rừng trồng Bạch đàn ở mức độ nguy hiểm. Đồng thời đất rừng thuộc sự quản lý của Công ty lâm nghiệp Lập Thạch thuộc quy hoạch vùng nguyên liệu của Công ty giấy Bãi Bằng nên thuận lợi cho việc quản lý, bảo vệ và duy trì vườn giống lâu dài. Do vậy, đây là địa điểm tốt để thực hiện xây dựng vườn giống của đề tài.

2.3.1.2. Thiết kế và trồng vườn giống.

Kết hợp với Công ty thiết kế lâm nghiệp, đề tài đã xây dựng hồ sơ thiết kế và trồng vườn giống theo đúng quy phạm kỹ thuật xây dựng rừng giống, vườn giống của Bộ NN&PTNT. Sơ đồ bố trí các dòng trồng tại vườn giống thể hiện tại phụ biểu 3.

2.3.1.3. Sinh trưởng của các dòng.

Vườn giống được trồng giữa tháng 6/2008, đến đầu tháng 12/2008 đề tài tiến hành đo đếm các chỉ tiêu sinh trưởng và phát triển. Kết quả sinh trưởng và phát triển của các dòng cây ghép ở 6 tháng tuổi như sau:

16 a) Tỷ lệ sống.

Tỷ lệ sống phản ánh sự thích ứng của điều kiện lập địa và khí hậu đối với cây trồng [9]. Lập Thạch là nơi thích hợp cho trồng rừng Bạch đàn đồng thời cây ghép được trồng có bầu to (Φ14cm). Cây đem trồng đủ tiêu chuẩn, sinh trưởng và phát triển tốt nên ở tất cả các dòng , khi đem trồng cây sinh trưởng, phát triển tốt nên hầu hết cây trồng đều sống 100%. Tuy nhiên do vết ghép yếu nên một số cây bị gãy ở phần ghép do gió bão hoặc sự va quyệt của gia súc nên tỷ lệ sống biến đổi từ 82-100%. Kết quả tỷ lệ sống của các dòng được thể hiện ở bảng 02.

Tỷ lệ sống có sự khác nhau giữa các dòng nhưng không phải do bản chất di truyền của cây mà do các tác động cơ học nên sự khác nhau về tỷ lệ sống không có ý nghĩa nhiều về sự thích ứng của cây trồng đối với điều kiện lập địa.

b)

Sinh trưởng chiều cao vút ngọn

Hvn là yếu tố quan trọng để đánh giá năng suất sinh khối của cây trồng. Đối với cây lấy gỗ thì Hvn không những thể hiện năng suất mà còn thể hiện chất lượng gỗ. Bảng 02 cho thấy chiều cao vút ngọn của các dòng cây ghép có sự khác nhau không nhiều. Hvn trung bình cao nhất là dòng số 14 với 1.93m, sau đó đến dòng số 5 với 1.87m và thấp nhất là dòng số 6 với 1.5m.

Để kiểm tra sự sai khác về mặt thống kê, đề tài phân tích phương sai một nhân tố. Bảng 01 cho thấy sinh trưởng hvn giữa các dòng không có khác nhau rõ rệt vì giá trị Sig >0.05.

c)

Sinh trưởng đường kính phía trên vị trí ghép.

Cùng với sinh trưởng chiều cao, đường kính ở thân cây có yếu tố quyết định đến năng suất và chất lượng gỗ Bạch đàn. Trong trường hợp này thì đường kính phía trên vị trí ngoài việc cho thấy sinh trưởng đường kính của cây mẹ, còn cho thấy khả năng tương thích giữa cành ghép và gốc ghép.

Bảng 02 cho thấy Dg bình quân của các dòng là 1.9cm, giữa các dòng có sự khác nhau không nhiều, chỉ tiêu này biến động từ 1.5 - 2.4cm. Trong đó, cao nhất là dòng số 4 với Dg=2.4cm và thấp nhất là dòng số 1 với Dg = 1.53 cm. Chỉ tiêu này không có sự sai khác về mặt thống kê.

17 d)

Sinh trưởng đường kính tán

Sinh trưởng Dt thể hiện khả năng sử dụng không gian dinh dưỡng của cây trồng (gồm cả phía trên mặt đất và hệ rễ dưới mặt đất). Đối với rừng giống và vườn giống từ cây ghép thì đường kính tán ảnh hưởng rõ rệt đến sản lượng và chất lượng hạt giống.

Dt của các dòng nói chung khá cao (1.1m) và giữa các dòng có sự biến động mạnh. Cao nhất là dòng 13 và dòng 7 với Dt là 1.34m; thấp nhất là dòng 19 với Dt là 0.87m. Tuy nhiên sự khác nhau này cũng không có ý nghĩa về mặt thống kê toán học.

Tóm lại: Sinh trưởng của các dòng cây ghép không có sự sai khác rõ rệt về cả Hvn, Dg và Dt. Có thể tại thời điểm đo đếm vườn giống mới ở 6 tháng tuổi nên các chỉ tiêu này chưa được thể hiện một các rõ ràng. Tại thời điểm này, vườn giống chưa có hiện tượng sâu bệnh hại. Bảng 02: So sánh phương sai của các chỉ tiêu sinh trưởng.

ANOVA

df Mean Square

Sig.

Sum of Squares

Hvn (m)

Between Groups

1.007

.455

3.438

33.603

Within Groups

.181 .180

37.041

187 206

Total

9.589

Dg (cm)

Between Groups

.830

.670

113.739

Within Groups

.505 .608

123.329

187 206

Total

2.791

Dt (m)

Between Groups

1.356

.154

20.258

Within Groups

.147 .108

23.049

187 206

Total

18 Bảng 01. Sinh trưởng và tỷ lệ sống của các dòng ở 6 tháng tuồi.

Dòng

S (%)

Total

Mean N Mean N Mean N Mean N Mean N Mean N Mean N Mean N Mean N Mean N Mean N Mean N Mean N Mean N Mean N Mean N Mean N Mean N Mean N Mean N Mean N

Hvn (m) Dg (cm) Dt (m) 1.17 10 0.93 10 1.0875 8 1.3429 7 1.15 12 1.1692 13 1.3462 13 1.2615 13 1.18 10 0.975 16 1.1063 16 1.0357 14 1.2615 13 1.1538 13 1.2222 9 1.1 8 1.05 8 1.1833 6 0.875 4 1.225 4 1.1435 207

1.64 10 1.77 10 1.75 8 1.8714 7 1.8917 12 1.5 13 1.6231 13 1.7615 13 1.88 10 1.525 16 1.8 16 1.7357 14 1.5769 13 1.9308 13 1.7778 9 1.725 8 1.7375 8 1.65 6 1.525 4 1.8 4 1.7208 207

1.53 10 1.6 10 2.0125 8 2.4 7 2.1083 12 1.9308 13 1.8077 13 2.1846 13 2 10 1.725 16 1.9188 16 1.8929 14 1.7462 13 2.2077 13 2.2778 9 2.025 8 2 8 1.8333 6 1.75 4 2.225 4 1.9435 207

90.0 10 90.0 10 100.0 8 100.0 7 100.0 12 92.3 13 92.3 13 100.0 13 90.0 10 87.5 16 87.5 16 100.0 14 92.3 13 100.0 13 100.0 9 100.0 8 87.5 8 100.0 6 100.0 4 100.0 4 95.5 207

19 Cây ghép 6 tháng tuổi tại vườn giống

Cây sau khi ghép Ảnh 1: Cây sau khi ghép và cây ghép trồng tại vườn giống

Cây ghép 6 tháng tuổi tại vườn giống

Vị trí ghép

Ảnh 2: Cây ghép trồng tại vườn giống và vị trí ghép

20 2.3.2. Trồng vườn vật liệu.

Vườn vật liệu được trồng từ cây ghép của 5 cây trội chọn lọc. Cây được trồng ra đất theo luống, giữa các luống cách nhau 0,5m. Cây được trồng theo hàng trên luống với cự ly 25 x 25cm. Mỗi cây trội trồng 20 cây ghép theo đúng phương pháp và kỹ thuật đề ra.

2.3.3. Thử nghiệm nuôi cấy in vitro.

2.3.3.1. Nghiên cứu môi trường cơ bản thích hợp cho nhân nhanh chồi.

Để một nghiên cứu về nhân giống in vitro thành công thì một trong những

giai đoạn quan trọng trước hết là xác định môi trường nuôi cấy thích hợp cho đối

tượng cần nhân giống. Điều này phụ thuộc trước hết vào thành phần và nồng độ

chất dinh dưỡng có trong môi trường nuôi cấy [1]. Giai đoạn này nhằm tìm được

môi trường thích hợp cho giai đoạn nhân nhanh chồi, giai đoạn có vai trò quyết

định đến hiệu quả của quá trình nhân giống.

Đề tài thử nghiệm 5 loại môi trường bổ sung 30g/l sucrose + 4.5 g/l agar +

2.0 mg/l vitamin B2, pH=6 thường được sử dụng để nhân giống các loài cây thân

gỗ để tìm môi trường thích hợp cho các dòng nghiên cứu. Ở đây, đề tài bổ sung

2.0 mg/l vitamin B2 vì đây là vitamin quan trọng trong nuôi cấy các loài bạch

đàn nói chung và thường được sử dụng với nồng độ 2.0mg/l.

Do môi trường cơ bản chưa được bổ sung chất điều hòa sinh trưởng nên

đề tài chỉ đánh giá qua HSNC. Đồng thời môi trường đối chứng ở đây đề tài

cũng sử dụng môi trường nuôi cấy của dòng PN14 không bổ sung chất điều hòa

sinh trưởng. Kết quả được trình bày ở bảng 03 và biểu đồ 01.

21 Bảng 03. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của 5 loại môi trường đến HSNC của 5

dòng nghiên cứu

HSNC (lần)

Stt

Môi trường

Dòng 154 Dòng 141 Dòng 122 Dòng 136 Dòng 126

Litvay

0.92

0.89

0.91

0.97

1.07

WV3

0.81

0.85

0.86

0.98

1.11

WPM

0.89

0.92

1.04

1.11

MS

1.12

1.06

1.03

1.16

1.21

5 MS cải tiến

1.02

0.94

0.96

1.06

1.16

6 Đối chứng

1.06

0.97

1.01

1.11

1.17 Biểu đồ 01: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến HSNC của 5 dòng Bạch đàn

Litvay

) n ầ l (

WV3 WPM

C N S H

MS MS cải tiến

Đối chứng

1.40 1.20 1.00 0.80 0.60 0.40 0.20 0.00

Dòng 154 Dòng 141 Dòng 122 Dòng 136 Dòng 126 Môi trường/Dòng

Bảng 03 cho thấy, môi trường MS cho HSNC cao nhất ở cả 5 dòng nghiên

cứu (dòng 154 là 1.12%; dòng 141 là 1.06; dòng 122 là 1.03%; dòng 136 là

1.16% và 1.21% với dòng 126). Sau môi trường MS thì môi trường đối chứng

cho HSNC cao thứ 2, tiếp đó là môi trường MS cải tiến, Litvay, WPM và cuối

cùng là WV3. Điều này được thể hiện rõ hơn ở biểu đồ 01.

Môi trường khoáng MS là môi trường giàu dinh dưỡng được sử dụng để

nuôi cấy các loài thực vật nói chung và thích hợp cho nhiều loài khác nhau. Môi

trường này không những được sử dụng trong nuôi cấy chồi mà còn được sử dùng

trong nuôi cấy tế bào lát mỏng, tế bào đơn, nuôi cấy phôi…vv [10]. Điều này

cúng phù hợp với nhiều kết quả nghiên cứu về nuôi cấy bạch đàn trong và ngoài

22 nước. Để kiểm tra xem sự khác biệt về HSNC thu được, đề tài tiến hành phân

tích phương sai một nhân tố kết quả thu được như sau:

Kết quả ở bảng phân tích phương sai (phụ biểu 5.1) cho thấy giá trị Sig của F < 0.05 rất nhiều. Do đó, HSNC ở các môi trường nuôi cấy đã có sự sai khác rõ rệt về mặt thống kê.

Để xác định môi trường cho HSNC nhân chồi cao nhất, đề tài tiến hành

phân nhóm bằng tiêu chuẩn Duncan, kết quả thu được như sau.

Bảng 04: Phân nhóm về ảnh hưởng của môi trường đến HSNC.

HSNC

Duncana

Subset for alpha = 0.05

Môi trường

WV3

1 .9227 .9493

Litvay

.9787

WPM

1.0273

MS cải tiến

1.0600

15 15 15 15

1.1147

Sig.

.122

.155

.338

.111

Bảng 04 cho thấy, môi trường MS và môi trường đối chứng cho HSNC cao nhất và không có sự sai khác về mặt thống kê vì chúng cùng ở một nhóm. Tuy nhiên về giá trị trung bình của HSNC của môi trường MS (1,11 lần) cao hơn môi trường đối chứng (1,06 lần) nên đề tài chọn môi trường MS có bổ sung 30g/l sucrose + 4.5 g/l agar + 2.0 mg/l vitamin B2, pH=6 cho các thử nghiệm tiếp theo.

2.3.3.2. Ảnh hưởng của BAP đến HSNC VÀ TLCHH.

Hầu hết các công trình nghiên cứu về nuôi cấy in vitro đã chỉ ra rằng chất điều hoà sinh trưởng có vai trò quan trọng, quyết định đến hiệu quả của quá trình nhân giống. Cụ thể nó quyết định đến HSNC, tốc độ nhân nhanh chồi và TLCHH. Đề tài sử dụng các chất điều hoà sinh trưởng trong nhóm auxin có NAA và IBA, nhóm cytokinin là BAP.

23 BAP là một cytokinin có tác dụng kích thích tạo chồi mạnh và được sử dụng rộng rãi trong các môi trường tạo chồi và nhân chồi. BAP gần như là một chất không thể thay thế trong quá trình nuôi cấy in vitro các loài thực vật. Ảnh hưởng của BAP đến HSNC và TLCHH của 5 dòng nghiên cứu được tổng hợp ở bảng 05.

Bảng 05 cho thấy, nồng độ BAP có ảnh hưởng mạnh và tích cực đến quá

trình phát sinh chồi và sinh trưởng chiều cao của chồi nuôi cấy. Khi tăng nồng

độ từ 0.5 mg/l đến 1.5 mg/l khả năng đẻ nhánh của chồi tăng lên rõ rệt. Khi tiếp

tục tăng nồng độ của BAP tới 2.0 và 2.5 mg/l thì hiệu quả nhân chồi giảm. Lúc

này xuất hiện những chồi nhỏ, mảnh, mướt, chồi hình thành không rõ rệt thân, lá

và ngọn, những chồi này không có tác dụng cho những lần nhân chồi tiếp theo

cũng như cấy tạo rễ nên không được đo đếm. Nhiều chồi cấy hình thành khối

callus to ở gốc. Như vậy, nồng độ BAP cao đã ức chế sinh trưởng và phát triển

của chồi.

Nồng độ BAP ở mức 1.5mg/l cho HSNC và TLCHH cao nhất cho cả 5

dòng thí nghiệm. HSNC và TLCHH của 5 dòng là 1.83 lần và 22.8% với dòng

154; 1.8 lần và 21.3% với dòng 141; dòng 122 là 1.95 lần và 20.8%; dòng 136 là

2.02 lần và 20.1%; với dòng 126 là 1.98 lần và 19.9%.

HSNC và TLCHH của môi trường có bổ sung BAP 1.5mg/l vẫn thấp hơn

môi trường đối chứng. Đặc biệt là TLCHH của môi trường tốt nhất này vẫn thấp

hơn môi trường đối chứng rất nhiều. Như vậy, chỉ riêng BAP cho HSNC và

TLCHH chưa cao, chưa đáp ứng được yêu cầu nhân nhanh in vitro các dòng

nghiên cứu.

24 Bảng 05. Ảnh hưởng của BAP đến HSNC và TLCHH

Dòng 154

Dòng 141

Dòng 122

Dòng 136

Dòng 126

Nồng độ BAP 0.5mg/l

1.0mg/l 1.5mg/l 2.0mg/l 2.5mg/l ĐC

HSNC TLC HH 16.5 20.6 22.8 16.9 9.6 26.1

1.15 1.53 1.83 1.68 1.63 1.92

HSNC TLC HH 18.6 20.1 21.3 17.7 14.4 23.6

1.28 1.69 1.80 1.60 1.47 1.98

HSNC TLC HH 18.5 19.4 20.8 15.3 13.6 26.1

1.38 1.86 1.95 1.78 1.63 2.00

HSNC TLC HH 17.5 19.3 20.1 15.9 12.9 25.8

1.37 1.84 2.02 1.78 1.63 2.02

HSNC TLC HH 17.5 16.6 19.9 15.9 12.9 23.7

1.37 1.84 1.98 1.78 1.63 2.04

Biểu đồ 02a: Ảnh hưởng của BAP đến HSNC của 5 dòng

2.50

0.5mg/l

2.00

1.0mg/l

1.50

1.5mg/l

C N S H

1.00

2.0mg/l

2.5mg/l

0.50

ĐC

0.00

Dòng 154

Dòng 141

Dòng 122

Dòng 136

Dòng 126

Nồng độ BAP/Dòng

Biểu đồ 02b: Ảnh hưởng của BAP đến TLCHH của 5 dòng Bạch đàn

30.00

0.5mg/l

25.00

1.0mg/l

20.00

1.5mg/l

15.00

H H C L T

10.00

2.0mg/l 2.5mg/l

5.00

ĐC

0.00

Dòng 154 Dòng 141 Dòng 122 Dòng 136 Dòng 126 Nồng độ BAP/Dòng

Nhằm xác định những khác biệt trên có thực sự khác nhau về mặt thống kê toán học hay không, đề tài tiến hành phân tích phương sai về ảnh hưởng của nồng độ BAP đến HSNC và TLCHH của các dòng nghiên cứu. Phụ biểu 5.2 cho

25 thấy, HSNC và TLCHH ở môi trường nuôi cấy có bổ sung các nồng độ BAP có sự khác nhau rõ rệt về mặt thống kê.

Bảng 06: Phân nhóm về ảnh hưởng của nồng độ BAP.

HSNC

Subset for alpha = 0.05

Nồng độ BAP

N

1 1.3100

0.5 mg/l

Duncana

1.6000

2.5 mg/l

2.0 mg/l

1.7227 1.7527

1.0 mg/l

1.9140

1.5 mg/l

15 15 15 15 15 15

1.9920

Đối chứng

1.000

.383

1.000

Sig.

TLCHH

Subset for alpha = 0.05

Nồng độ BAP

N

Duncana

2.5 mg/l

2.0 mg/l

16.3667 17.6800

0.5 mg/l

19.2000

1.0 mg/l

20.9733

1.5 mg/l

1 15 12.6667 15 15 15 15 15

25.0600

Đối chứng

1.000

.062

1.000

Sig.

Như vậy, nồng độ BAP thích hợp cho nhân nhanh hai 5 dòng là 1.5 mg/l.

Do vậy, đề tài sử dụng môi trường MS + 30g/l sucrose + 4.5 g/l agar + 2.0 mg/l

vitamin B2 + 1.5 mg/l BAP, pH=6 cho các thí nghiệm nhân nhanh chồi tiếp

theo.

2.3.3.3. Ảnh hưởng của BAP và NAA đến HSNC VÀ TLCHH

Trong đời sống thực vật, tỉ lệ auxin/cytokinin có vai trò quan trọng trong

sự biệt hóa cơ quan và quyết định sự sinh trưởng, phát triển của cây. Nhiều

26 nghiên cứu đã chứng minh rằng tổ hợp giữa auxin và cytokinin hầu hết đều cho

hiệu quả tốt hơn sự tác động riêng rẽ của cytokinin trong nuôi cấy in vitro.

NAA là chất điều hoà sinh trưởng nhân tạo thường có tác dụng mạnh hơn

so với IAA ở đa số các loài thực vật (IAA là chất điều hoà sinh trưởng tự nhiên) .

NAA có tác dụng kích thích tế bào phát triển theo chiều ngang. Nhiều nghiên

cứu đã sử dụng NAA kết hợp với cytokinin trong giai đoạn nhân chồi. Thông

thường NAA được sử dụng với nồng độ từ 0.5 đến 3.0 mg/l cho nhân chồi.

Để tìm ra môi trường nhân nhanh chồi thích hợp, đề tài bổ sung NAA với

các nồng độ thay đổi vào môi trường MS + 30g/l đường sucrose + 4.5g/l agar +

2.0mg/l vitaminB2 + 1.5mg/l BAP, pH=6. Kết quả thí nghiệm được trình bày ở

bảng 07 và đồ thị 3a, 3b.

Bảng 07 cho thấy rằng, khi bổ sung NAA với nồng độ 0.5 mg/l đến

1.5mg/l thì HSNC và TLCHH tăng lên rõ rệt và cao nhất ở nồng độ NAA

1.5mg/l cho tất cả các dòng. Khi nồng độ NAA tiếp tục tăng đến 2.0 và 2.5mg/l

thì HSNC và TLCHH đều giảm mạnh, đặc biệt TLCHH giảm rất mạnh và rõ rệt

. Qua quá trình theo dõi, quan sát cho thấy khi bổ sung NAA 1.5 mg/l chồi sinh

trưởng và phát triển tốt, thân chồi mập, lá xanh và hình thái cây khoẻ. Ngược lại,

môi trường có nồng độ NAA 2.0 và 2.5mg/l chồi sinh trưởng kém, chiều cao

thấp, phiến lá xoăn và dày, xuất hiện rễ ở thân chồi.

HSNC ở cả 5 dòng nghiên cứu với nồng độ 1.5mg/l cao hơn không đáng

kể so với môi trường đối chứng. Ngược lại, TLCHH cao hơn tương đối rõ so với

môi trường đối chứng. tuy nhiên riêng với dòng 136 thì TLCHH ở môi trường có

bổ sung 1.5mg/l NAA lại thấp hơn môi trường đối chứng.

27 Bảng 07. Ảnh hưởng của BAP + NAA đến HSNC và TLCHH

Dòng 154

Dòng 141

Dòng 122

Dòng 136

Dòng 126

Nồng độ NAA

HSNC TLC HH 17.6

1.30

HSNC TLC HH 18.2

1.47

HSNC TLC HH 17.1

1.52

HSNC TLC HH 17.0

1.54

HSNC TLC HH 18.8

1.57

0.5mg/l

1.0mg/l

1.62

21.2

1.65

20.3

1.74

19.2

1.70

18.0

1.74

18.9

1.5mg/l

1.95

24.8

2.06

23.7

2.10

23.5

2.06

21.9

2.03

23.5

2.0mg/l

1.77

19.8

1.93

21.9

1.95

22.5

1.91

19.6

1.91

20.5

2.5mg/l

1.84

10.8

1.97

13.3

2.00

14.4

1.91

13.7

1.84

14.8

ĐC

1.96

21.1

2.03

22.9

2.09

24.4

2.08

23.8

2.07

22.6 Biểu đồ 03a: Ảnh hưởng phối hợp của BAP + NAA đến HSNC của 5 dòng

2.50

0.5mg/l

2.00

1.0mg/l

1.50

1.5mg/l

C N S H

1.00

2.0mg/l

2.5mg/l

0.50

ĐC

0.00

Dòng 154

Dòng 141

Dòng 122

Dòng 136

Dòng 126

Nồng độ NAA/Dòng

Biểu đồ 03b: Ảnh hưởng phối hợp của BAP + NAA đến TLCHH của 5 dòng Bạch đàn

30.00

0.5mg/l

25.00

20.00

1.0mg/l 1.5mg/l

15.00

H H C L T

10.00

2.0mg/l 2.5mg/l

5.00

ĐC

0.00

Dòng 154 Dòng 141 Dòng 122 Dòng 136 Dòng 126 Nồng độ NAA / Dòng

28 Từ những kết thực nghiệm thu được và qua phân tích thống các chỉ tiêu

thống kê (phục lục 6) cho thấy môi trường có bổ sung các mức nồng độ NAA có

sự khác nhau rõ rệt về HSNC cà TLCHH.

Bảng 08 cho thấy môi trường với 1.5 mg/l NAA là tốt nhất cho nhân chồi

ở cả 5 dòng nghiên cứu. Tuy nhiên, HSNC và TLCHH khi nuôi cấy ở môi

trường này chỉ cao hơn rất ít so với môi trường đối chứng và không có sự khác

nhau về mặt thống kê vì chúng nằm trong cùng một nhóm khi sử dụng phân

nhóm Duncan. Kết quả phân tích thống kê với độ tin cậy 95%.

Bảng 08. Phân nhóm về ảnh hưởng phối hợp của BAP + NAA

HSNC

Subset for alpha = 0.05

Nồng độ NAA

N

Duncana

0.5 mg/l

1 1.4787

1.6893

1.0 mg/l

2.0 mg/l

1.8907 1.9127

2.5 mg/l

2.0400

1.5 mg/l

15 15 15 15 15 15

2.0453

1.000

.489

.867

Sig.

TLCHH

Subset for alpha = 0.05

Nồng độ NAA

N

Duncana

2.5 mg/l

17.7467

0.5 mg/l

1.0 mg/l

19.6467 20.8400

2.0 mg/l

22.9533

1 15 13.4200 15 15 15 15 15

23.4800

1.5 mg/l

1.000

.131

.503

Sig.

29 Việc sử dụng tổ hợp chất điều hoà sinh trưởng BAP và NAA phù hợp một

số nghiên cứu trong và ngoài nước, tuy nhiên ở các loài khác nhau thì nồng độ

có khác nhau [2] [8].

Như vậy môi trường MS + 30g/l đường sucrose + 4.5g/l agar + 2.0mg/l

vitaminB2 + 1.5mg/l BAP + 1.5mg/l NAA , pH=6 là công thức tốt nhất ở thử

nghiệm về ảnh hưởng phối hợp của BAP và NAA.

2.3.3.4. Ảnh hưởng của BAP và IBA đến HSNC VÀ TLCHH

IBA là chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin và một số nghiên cứu

cũng sử dụng chúng trong giai đoạn nhân chồi. Tuy nhiên chúng được dùng

nhiều hơn trong quá trình tạo rễ in vitro. Do vậy, đề tài cũng tiến hành thử

nghiệm ảnh hưởng phối hợp của BAP và IBA trong quá trình nhân chồi.

IBA được bổ sung vào môi trường MS + 30g/l sucrose + 4.5 g/l agar + 2.0

mg/l vitamin B2 + 1.5 mg/l BAP, pH=7 với các mức nồng độ khác nhau. Qua 4

tuần nuôi cấy kết quả được thể hiện ở bảng Bảng 06, biểu đồ 04a.

Bảng 09. Ảnh hưởng của BAP + IBA đến HSNC và TLCHH

Dòng 154

Dòng 141

Dòng 122

Dòng 136

Dòng 126

Nồng độ IBA

HSNC TLC HH 19.2

1.24

HSNC TLC HH 21.3

1.23

HSNC TLC HH 22.7

1.25

HSNC TLC HH 26.8

1.27

HSNC TLC HH 29.0

1.36

0.05mg/l

0.10mg/l

1.39

21.2

1.37

25.6

1.39

30.0

1.43

30.3

1.44

30.4

0.15mg/l

1.58

21.1

1.63

25.2

1.64

30.4

1.64

31.1

1.58

20.7

0.20mg/

1.30

18.4

1.29

21.1

1.28

24.8

1.28

27.8

1.27

27.2

0.25mg/l

1.11

19.2

1.10

20.2

1.09

21.4

1.06

24.0

1.08

22.7

ĐC

2.10

20.9

2.14

25.2

2.13

21.9

2.13

27.1

2.22

26.0

30 Biểu đồ 04a: Ảnh hưởng phối hợp của BAP + IBA đến HSNC của 5 dòng

2.5

2.0

0.05mg/l

0.10mg/l

) n ầ l (

1.5

0.15mg/l

1.0

C N S H

0.20mg/

0.25mg/l

0.5

ĐC

0.0

Dòng 154

Dòng 141

Dòng 122

Dòng 136

Dòng 126

Nồng độ IBA/Dòng

Bảng trên cho thấy hiệu quả của việc bổ sung của các nồng độ IBA vào

môi trường nhân chồi là kém hơn rõ rệt. Số lượng chồi tạo thành cũng như

HSNC thấp hơn rất nhiều môi trường đối chứng. TLCHH có cao nhưng không

phải là số chồi hữu hiệu nhiều hơn mà là do số chồi tạo thành thấp nên TLCHH.

Như vậy, IBA không thích hợp cho môi trường nhân chồi của 5 dòng Bạch đàn

nghiên cứu.

2.3.3.5. So sánh HSNC và TLCHH của 5 dòng nghiên cứu.

Từ kết quả thu được ở môi trường tốt nhất trong các thử nghiệm (MS + 30g/l đường sucrose + 4.5g/l agar + 2.0mg/l vitaminB2 + 1.5mg/l BAP + 1.5mg/l NAA , pH=6), đề tài tiến hành so sánh 5 dòng nghiên cứu nhằm xem xét dòng nào có khả năng nuôi cấy in vitro tốt nhất.

Qua kết quả phân tích thống kê (phụ biểu 6) cho thấy HSNC và TLCHH ở các dòng sai khác không có ý nghĩa. Như vậy, trong 5 dòng thử nghiệm không dòng nào vượt trội về khả năng nhân nhanh in vitro.

31 Ảnh 3. Chồi được nuôi cấy trong môi trường MS + 30g/l sucrose + 4.5 g/l agar +

2.0 mg/l vitamin B2 + 1.5 mg/l BAP, pH=6 sau 4 tuần.

Ảnh 4. Chồi được nuôi cấy trong môi trường MS + 30g/l sucrose + 4.5 g/l agar +

2.0 mg/l vitamin B2 + 1.5 mg/l BAP + 1.5 mg/l NAA , pH=6 sau 4 tuần

Ảnh 5. Chồi được nuôi cấy trong môi trường MS + 30g/l sucrose + 4.5 g/l agar +

2.0 mg/l vitamin B2 + 1.5 mg/l BAP + 0.15 mg/l IBA , pH=6 sau 4 tuần.

32 III. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

3.1. Kết luận.

Đề tài đã thực hiện đầy đủ các nội dung nghiên cứu theo đúng tiến độ và

phương pháp của đề cương nghiên cứu và hợp đồng, cụ thể như sau:

1. Đề tài đã điều tra khảo sát và được 1,0 ha tại Lô 36, Khoảnh 1, Đội Ngọc Mỹ, Công ty lâm nghiệp Lập Thạch – Vĩnh Phúc để trồng vườn giống.

Thu thập điều kiện tự nhiên, đất đai của nơi thiết lập vườn giống.

2.

3. Thiết kế và trồng 1,0ha vườn giống bạch đàn từ cây ghép của 20 dòng bạch đàn ưu trội. Đến tháng 12/2008 các dòng chưa có sự khác nhau về đường kính, chiều cao vút ngọn cũng như đường kính tán.

4. Trồng vườn vật liệu gồm 100 cây ghép với cành ghép được lấy từ 5 cây ưu trội đã chọn lọc phục vụ cho nhân giống in vitro.

5. Đề tài đã tiến hành thử nghiệm nhân giống in vitro và tạo ra 100 bình giống gốc của 5 dòng chọn lọc. Môi trường tạo chồi và nhân chồi thích hợp cho 5 dòng là: MS + 30g/l sucrose + 4.5g/l agar + 2.0mg/l vitaminB2 + 1.5mg/l BAP + 1.5 mg/l NAA, pH =6. Với môi trường này thì HSNC và TLCHH của các dòng nghiên cứu lần lượt là:

Cây trội 154: HSNC là 1,95 lần và TLCHH là 24,8%.

Cây trội 141: HSNC là 2,06 lần và TLCHH là 23,7%.

Cây trội 122: HSNC là 2,1 lần và TLCHH là 23,5%.

Cây trội 136: HSNC là 2,06 lần và TLCHH là 21,9%.

Cây trội 126: HSNC là 2,03 lần và TLCHH là 23,5%.

3.2. Kiến nghị

Cần tiếp tục thử nghiệm ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng ở

các thang nồng độ nhỏ hơn và một số chất phụ gia khác bổ sung vào môi trường

nuôi cấy. Đồng thời, thử nghiệm môi trường tạo cây con hoàn chỉnh, từ đó sản

xuất cây giống phục vụ trồng rừng khảo nghiệm.

33 Kính mong Bộ công thương tiếp tục cấp kinh phí cho chăm sóc, quản lý

bảo vệ vườn giống và tiến hành nuôi cấy mô ở các năm tiếp theo để kết quả của

đề tài được ứng dụng vào sản xuất.

34 IV. TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. TIẾNG VIỆT.

1. Lê Văn Chi, 1992. Cách sử dụng chất điều hoà sinh trưởng và vi lượng

hiệu quả cao. Nhà xuất bản Khoa học – Kỹ thuật, trang 5 – 23.

2. Mai Đình Hồng, 1999. Ứng dụng công nghệ sinh học để sản xuất cây nguyên liệu giấy chất lượng cao. Thông tin khoa học công nghệ và môi trường tỉnh Phú Thọ tháng 9, trang 46 – 48.

3. Lê Đình Khả và cộng sự, 2003. Chọn tạo giống và nhân giống cho một số loài cây trồng chủ yếu ở Việt Nam . Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội.

4. Đoàn Thị Mai, Trần Hồ Quang, Ngô Thị Minh Duyên, 1998. Kỹ thuật nhân giống keo lai bằng nuôi cấy mô phân sinh. Tạp chí lâm nghiệp số 7, trang 35-36.

5. Đoàn Thị Mai và cộng sự, 2005. Bước đầu ứng dụng công nghệ mô - hom trong nhân giống trầm hương. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, kỳ 2 tháng 3, trang 57 – 67.

6. Đoàn Thị Mai và cộng sự, 2000. Kết quả bước đầu về nhân giống bạch đàn lai bằng phưương pháp nuôi cấy mô phân sinh. Tạp chí lâm nghiệp số 10, trang 46 – 47.

7. Trần Văn Minh và cộng sự, 1998. Nhân giống cây trầm qua nuôi cấy

đỉnh sinh trưởng. Tạp chí lâm nghiệp số 11, trang 44 – 45.

8. Đoàn Thanh Nga, 2003. Báo cáo hoàn thiện công nghệ nhân giống một số dòng bạch đàn. Trung tâm nghiên cứu cây nguyên liệu giấy, 35 trang.

9. Huỳnh Đức Nhân và cộng sự, 2007. Chọn lọc cây trội và khảo nghiệm dòng vô tính bạch đàn urophylla. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội.

10. Vũ Ngọc Phượng và cộng sự, 2002. Nhân giống in vitro cây tre tàu (Sinocalamus latiflorus) và tre mạnh tông (Dendrocalamus asper). Tạp chí sinh học số 6, trang 59 – 64.

11. Nguyễn Đức Thành, 2001. Nuôi cấy mô tế bào thực vật – Nghiên cứu và

ứng dụng. Nhà xuất bản Khoa học – Kỹ thuật, Hà Nội, 125 trang.

35 12. Hoàng Ngọc Thuận, 2000. Nhân giống vô tính cây ăn quả. Nhà xuất bản

Nông nghiệp Hà Nội..

13. Đoàn Thị Ái Thuyền và cộng sự, 2001. Nhân giống vô tính cây hông – Paulowvina fortunei (seem) Hemsi. Bằng phương pháp nuôi cấy mô. Tạp chí sinh học số 9, trang 46 – 50.

II. TIẾNG ANH

14. Ducchefa Biochemie BV, 2002. Catalogue 98-99: Biochemicals, Plant Cell and tissue culture, Plant Moleculair Biochemicals. The Netherlands.

15. I.Joihs et al, 2002. In vitro clonal propagation of Mature Eucalyptus F1

hybrid. Forest Tree Physiology.

16. M.E. Cortezzi Grasca and S.Mendes, 2001. Micropropagation of

Eucalyptuss dunnii Maid. Forest Tree Physiology.

36

PHẦN PHỤ BIỂU

PHỤ BIỂU 1: CHIỀU CAO, ĐƯỜNG KÍNH, THỂ TÍCH VÀ ĐỘ VƯỢT CỦA

20 CÂY TRỘI.

STT Hvn (m) Độ vượt (%) (so với cây cùng lặp) Số hiệu cây trội D1.3 (cm) Vcây (dm3) Tổng điểm

Hvn D1.3

1 154 lặp 1 26,0 39,8 1.293,2 138 200 88

2 122 lặp 1 25,5 36,6 1.072,6 136 184 84

3 38 lặp 1 25,0 28,0 615,4 133 141 83

4 139 lặp 1 26,0 27,1 599,6 138 136 81

5 127 lặp 1 29,0 23,9 520,2 154 120 83

6 104 lặp 1 27,0 26,4 590,9 144 133 78

7 137 lặp 1 25,2 28,3 633,8 134 142 85

8 141 lặp 1 28,5 33,8 1.022,4 152 170 97

9 107 lặp 1 22,8 27,1 525,8 121 136 85

10 138 lặp 1 24,5 28,3 616,2 130 142 85

11 126 lặp 2 23,4 26,4 512,1 149 161 89

12 136 lặp 2 24,9 29,6 685,0 159 180 98

13 122 lặp 4 26,0 31,2 794,7 144 178 87

14 148 lặp 4 24,0 23,6 418,6 133 135 77

15 153 lặp 4 24,0 25,8 501,6 133 147 80

16 126 lặp 4 24,0 31,5 747,8 133 180 90

17 137 lặp 5 32,0 25,2 638,1 181 150 81

18 126 lặp 5 23,4 26,4 512,1 132 157 84

19 128 lặp 6 22,5 24,8 434,6 140 156 91

20 132 lặp 6 22,5 26,5 496,2 140 167 90

PHỤ BIỂU 2: THÀNH PHẦN 5 LOẠI MÔI TRƯỜNG CƠ BẢN

TT Thành phần (mg/l) Litvay WV3 WPM

MS MS cải tiến

I

Đa lượng

452.88

72.50

332.02

16.61

656.79

170.00

340.00

270.00

1900.00

910.06

180.54

903.38

903.79

400.00

1650.00

990.00

386.80

0.025

0.125

0.250

0.25

0.025

0.500

1 CaCl2 2 KH2PO4 3 KNO3 4 MgSO4 5 NH4NO3 6 K2SO4 7 Ca(NO3)2 II Vi lượng 1 CoCl2.6H2O 2 CuSO4 3

36.71

36.70

36.700

FeNaEDTA

36.700

31.000

6.20

6.200

31.000

4 H3BO3

6.200

0.830

4.150

15.160

22.30

16.900

21.000

0.250

0.25

0.250

1.250

8.600

8.60

8.600

43.000

5 KI 6 MnSO4. H2O 7 Na2MoO4.2 H2O 8 ZnSO4.7 H2O TT Thành phần (mg/l) Litvay WV3 WPM

MS MS cải tiến

0.05

III Vitamin 1 Biotin

0.50

Folic acid

2.00

1000.00

100.00

5.00

0.50

3 Glycine 4 Myo-Inositol 5 Nicotinic acid 6

0.50 0.1

Pyridoxine HCl

0.40

1.00

0.10

0.50

0.1

(vitamin B6) 7 Thiamine HCl (vitamin B1)

PHỤ BIỂU 3: SƠ ĐỒ BỐ TRÍ CÁC DÒNG TẠI VƯỜN GIỐNG

Địa điểm: Lô 36 Khoảnh 1 Đội Ngọc Mỹ - Công ty lâm nghiệp Lập thạch

Diện tích: 1,0 ha

8 18 14 11

2 18 14

18 14

17 12 15 20 11 14 18 8

7 17 13 10

1 17 13

2 17 13

1 16 11 14 19 10 13 17 7

6 16 12

20 16 12

1 16 12 20 15 10 13 18

12 16 6

5 15 11

19 15 11 20 15 11 19 14

12 17

11 15 5

4 14 10

18 14 10 19 14 10 18 13

11 16

10 14 4

3 13

17 13

9 18 13

9 17 12

10 15

13 3

2 12

16 12

8 17 12

8 16 11

12 2

1 11

15 11

7 16 11

7 15 10

11 1

14 10

6 15 10

6 14

5 14

5 13

4 13

4 12

3 12

3 11

2 11

2 10

1 10

Ngày trồng: 20/6/2008

Ghi chú: Số hiệu cây ghép được đánh theo số thứ tự tại Phụ biểu 1.

PHỤ BIỂU 4: BIỂU MÔ TẢ PHẪU DIỆN ĐẤT

Tỷ lệ đá lẫn

Tỷ lệ rễ cây

Tỷ lệ

TP cơ giới

Độ chặt

Độ ẩm

Tên phẫu diện Tầng đất Độ dày trung bình Màu sắc

(%)

mùn

0-5 cm

Nâu xám Rất ít

Thịt nhẹ

Xốp

Hơi ẩm

Trung bình

Phẫu diện I (sườn)

80-100 cm

Vàng nhạt

trung

Hơi chặt

Hơi ẩm

Ít

>100 cm

Thịt bình

Lô 36 khoảnh 1 Đội Ngọc Mỹ Công ty lâm nghiệp Lập

Thạch

0-5 cm

Nâu xám Rất ít

Thịt nhẹ

Xốp

Hơi ẩm

Trung bình

75-115 cm

Vàng nhạt

trung

Hơi chặt

Hơi ẩm

Ít

Phẫu diện I (chân) Lô 36 khoảnh 1

>115 cm

Thịt bình

Đội Ngọc Mỹ Công ty lâm nghiệp Lập Thạch

PHỤ BIỂU 5: QUY PHẠM KỸ THUẬT XÂY DỰNG RỪNG GIỐNG, VƯỜN GIỐNG

QUYẾT ĐỊNH

Ban hành Quy phạm kỹ thuật xây dựng rừng giống và vườn giống (QPN/15-93); Quy phạm kỹ thuật xây dựng rừng giống chuyển hóa (QPN/16-93)

BỘ TRƯỞNG BỘ LÂM NGHIỆP

Căn cứ Nghị định số 15/CP ngày 2-3-1993 của Chính phủ về nhiệm vụ, quyền hạn và trách nhiệm quản lý Nhà nước của Bộ, cơ quan ngang Bộ;

Căn cứ Điều lệ về công tác tiêu chuẩn hóa ban hành kèm theo Nghị định số 141/HĐBT ngày 24-8-1982 của Hội đồng Bộ trưởng;

Theo đề nghị của các ông: Vụ trưởng Vụ Khoa học - Kỹ thuật và Vụ Lâm sinh - Công nghiệp rừng.

QUYẾT ĐỊNH:

Điều 1. Nay ban hành kèm theo Quyết định này 2 bản Quy phạm.

1. Quy phạm kỹ thuật xây dựng rừng giống và vườn giống (QPN/15-93).

2. Quy phạm kỹ thuật xây dựng rừng giống chuyển hóa (QPN 16-93).

Điều 2. Quy phạm này áp dụng cho tất cả các cơ sở sản xuất lâm nghiệp và có hiệu lực kể từ ngày ký.

Điều 3. Các ông Chánh Văn phòng, Vụ trưởng các Vụ Khoa học - Kỹ thuật, Vụ Lâm sinh - Công nghiệp rừng, Cục trưởng Cục Kiểm lâm, Vụ Tổ chức lao động, Vụ Kế hoạch, Vụ kế toán tài chính, Viện trưởng các Viện Khoa học Lâm nghiệp, Viện Điều tra Quy hoạch rừng, Thủ trưởng các cơ quan chức năng, các tổ chức hành chính sự nghiệp, các tổ chức sản xuất kinh doanh trực thuộc Bộ, Giám đốc các Sở Nông - Lâm nghiệp tỉnh chịu trách nhiệm thi hành Quyết định này./.

QUY PHẠM

KỸ THUẬT XÂY DỰNG RỪNG GIỐNG VÀ VƯỜN GIỐNG (QPN 15-93)

(Ban hành kèm theo Quyết định số 804-QĐ/KT ngày 2-11-1993)

PHẦN MỘT CÁC VẤN ĐỀ CHUNG

CHƯƠNG 1 ĐIỀU KHOẢN CHUNG

Điều 1. Quy phạm này quy định những yêu cầu kỹ thuật xây dựng rừng giống và vườn giống từ khâu chọn xuất xứ cho đến khi bắt đầu thu hái hạt giống, nhằm cung cấp hạt giống có chất lượng được cải thiện (1).

Điều 2. Các cơ sở trồng rừng giống và vườn giống phải tiến hành thiết kế, định rõ vị trí, diện tích từng lô, khoảnh cần trồng rừng giống và vườn giống, xác định các biện pháp kỹ thuật cụ thể cần thực hiện trong quá trình trồng rừng và vườn giống.

Điều 3. Rừng giống và vườn giống phải được xây dựng theo những biện pháp kỹ thuật đặc biệt và đầu tư cao.

Điều 4. Nghiêm cấm dùng nguồn hạt không rõ xuất xứ hoặc lấy từ xuất xứ không phù hợp, hoặc hạt xô bồ để xây dựng rừng giống.

Nghiêm cấm dùng cây hom hoặc cây ghép từ cây mẹ không được chọn lọc để xây dựng vườn giống.

Điều 5. Quy phạm này chỉ áp dụng cho việc trồng rừng giống từ cây hạt hoặc cây hom được chọn lọc hỗn hợp (2) và trồng vườn từ cây hạt, cây hom, cây ghép được chọn lọc theo dòng dõi (chọn cá thể) (3).

CHƯƠNG 2 ĐIỀU KIỆN GÂY TRỒNG RỪNG GIỐNG VÀ VƯỜN GIỐNG

Điều 6. Chỉ được gây trồng rừng và vườn giống ở những nơi có đủ các điều kiện sau đây:

Điều kiện tự nhiên thuận lợi cho ra hoa, kết quả và có hạt chắc.

Nơi chưa xẩy ra dịch bệnh và không bị lũ lụt làm ngập rừng và vườn giống (trừ các loại rừng trên đất ngập).

Phải cách ly với các rừng trồng kinh tế có cùng loài cây với cự ly ít nhất là 150m. Đối với loài cây thụ phấn nhờ gió thì rừng giống và vườn giống có thể

nằm trên hướng gió chính trong mùa nở hoa mà không cần cách ly. Việc cách ly cũng có thể được thực hiện bằng cách tròng cây khác loài không có khả năng lai giống tự nhiên với cây trong rừng giống và vườn giống.

Có điều kiện chăm sóc bảo vệ và thu hoạch quả thuận lợi.

Điều 7. Diện tích tối thiểu cho rừng giống và vườn giống lấy hạt là 1 ha. Diện tích tối thiểu cho vườn giống lấy hom là 0,1 ha.

CHƯƠNG 3 CHỌN XUẤT XƯ, CHỌN VÀ QUẢN LÝ CÂY MẸ

Điều 8. Chọn xuất xứ:

Vật liệu để gây trồng rừng giống (hạt, hom) phải được lấy từ xuất xứ tốt nhất đã được khảo nghiệm (có năng suất cao, chất lượng tốt, không bị sâu bệnh), phù hợp với điều kiện sinh trưởng của vùng gây trồng, có khả năng ra hoa kết hạt tại nơi gây trồng rừng giống. Hạt của những xuất xứ này có thể nhập từ nơi khác.

Điều 9. Chọn cây mẹ lấy giống

1. Cây mẹ lấy giống để gây trồng rừng giống và vườn giống là những cây trội được chọn lọc trong các rừng trồng từ những xuất xứ tốt nhất đã được xác định, hoặc từ rừng tự nhiên nhằm mục đích lấy giống.

2. Số lượng cây mẹ cần thiết để lấy giống dùng cho xây dựng rừng giống tùy thuộc vào quy mô cải thiện giống, song ít nhất là 20 cây.

3. Tiêu chuẩn chung của cây trội là cây ở tuổi thành thục công nghệ, khoẻ mạnh, tán lá phát triển cân đối, không bị sâu bệnh, có sản phẩm theo mục đích kinh tế cao.

4. Tiêu chuẩn cụ thể phải căn cứ vào mục tiêu trồng rừng để lựa chọn.

a) Đối với câu lấy gỗ: sinh trưởng nhanh, đoạn thân dưới cành dài, thân cây thẳng tròn đều, không xoắn vặn, cành nhánh nhỏ, góc phân cành lớn.

b) Đối với cây lấy củi là sinh trưởng nhanh, nhiệt trị của gỗ lớn, nhiều gỗ, có khả năng nẩy chồi mạnh.

c) Đối với cây lấy lá, lấy vỏ phải là cây sinh trưởng nhanh, có nhiều vỏ hoặc nhiều lá, hàm lượng các chất cần dùng trong vỏ hoặc trong lá cao.

d) Đối với cây lấy quả phải là cây nhiều quả, quả to, tỷ lệ nhân nhiều và hàm lượng các chất cần thiết trong nhân cao.

e) Đối với cây lấy nhựa phải là cây nhiều nhựa.

5. Đánh giá cây trội:

Các cây trội được lựa chọn ban đầu theo đặc điểm bên ngoài nói ở điểm 1 được coi là cây trội dự tuyển. Chỉ sau khi đã qua đánh giá mới được coi là cây trội chính thức để lấy vật liệu giống.

Đối với rừng đều tuỏi thì cây trội là cây có chỉ tiêu chọn giống trực tiếp theo mục tiêu kinh tế vượt trị số trung bình của đám rừng hoặc của lâm phần ít nhất là 1,5-2 lần độ lệch chuẩn (tức x + 1,5 đến x + 2 hoặc x + 1,5Sx đến x + 2Sx)(4).

Đối với rừng tự nhiên khác tuổi cây trội được đánh giá theo phương pháp quan sát.

Chọn cây trội để xây dựng rừng giống thì yêu cầu các chỉ tiêu này có thể thấp hơn chọn cây trội để xây dựng vườn giống.

Sau khi cây trội được đánh giá được gọi là cây trội chính thức. Vật liệu để xây dựng vườn giống và rừng giống phải được lấy từ cây trội chính thức.

Điều 10. Quản lý cây trội (cây mẹ lấy giống).

1. Cây trội phải được ghi chép vào phiếu theo mẫu chung theo phụ lục 1.

2. Cây trội phải được đánh số theo một hệ thống chung trong các đơn vị kinh doanh.

3. Mỗi cây trội được sơn một vòng sơn tương phản với màu sắc của vỏ cây (đỏ, vàng hoặc trắng). Vòng sơn có chiều rộng 2cm, được sơn ở độ cao 1,5m. Phía dưới viết số hiệu cây trội theo cùng một hướng.

4. Những cây trội đã được hội đồng giống của ngành công nhận thì được đánh thêm một số vòng sơn như vòng sơn trước và đánh số phía trên theo một hệ thống chung trong từng tỉnh (theo loại cây).

5. Cây trội là một tài sản quốc gia. Phải có biện pháp bảo vệ đặc biệt.

PHẦN BA XÂY DỰNG VƯỜN GIỐNG

CHƯƠNG 9 TẠO CÂY GHÉP

Điều 35. Tiêu chuẩn cây để làm gốc ghép.

Cây để làm gốc ghép phải là những cây còn ở tuổi vườn ươm sinh trưởng khỏe mạnh, không bị sâu bệnh, có đường kính phát triển để phù hợp với kích thước của cành ghép. Kỹ thuật tạo cây làm gốc ghép như kỹ thuật tạo và chăm sóc cây con.

Điều 36. Cành ghép lấy từ các cây trội đã được chọn lọc và đánh giá hoặc được Hội đồng giống của ngành lâm nghiệp công nhận. Khi cắt khỏi cây mẹ cành ghép phải được cắt bớt phiến lá và được bảo quản trong điều kiện ẩm mát.

Điều 37. Mùa ghép được xác định theo đặc điểm sinh học, vật hậu, yêu cầu sinh thái của cành ghép và theo diễn biến thời tiết khí hậu của từng vùng.

Điều 38. Trước khi ghép phải tạo điều kiện cho cây làm gốc ghép sinh trưởng phát triển khỏe mạnh, phải bảo đảm cho đất có đủ độ ẩm cần thiết. Sau khi ghép phải có biện pháp che nắng và giữ ẩm cho cây ghép phát triển thuận lợi.

Điều 39. Khi ghép mắt và ghép áp mà cành ghép chắc chắn đã liền sinh với gốc ghép cần cắt bỏ phần trên của gốc ghép cách chỗ ghép 10-12cm.

Điều 40. Phải kịp thời cắt bỏ các chồi phụ mọc từ gốc ghép trong suốt quá trình sinh trưởng của cây ghép.

Điều 41. Số cây ghép của mỗi dòng thay đổi tùy theo số dòng vô tính tham gia xây dựng vườn giống (ít nhất không dưới 20 dòng) và số lần lặp của chúng trong vườn giống. Khi số dòng vô tính trên cùng một diện tích vườn giống càng nhiều thì số cây ghép trong mỗi dòng càng ít.

CHƯƠNG 10 TRỒNG, CHĂM SÓC VƯỜN GIỐNG VÀ THU HÁI QUẢ

Điều 42. Trước khi trồng vườn giống phải thiết kế. Nội dung và các bước thiết kế tuân thủ các quy định tại phần 2 của quy phạm.

Điều 43. Mật độ trồng vườn giống là mật độ cuối cùng (200 đến 400 cây/ha hoặc 200-400 cụm cây). Tùy theo phát triển tán của các loài cây mà thay đổi khoảng cách trồng là 5m x 5m, 6m x 6m hoặc 6m x 7m hoặc 7m x 7m.

Nguyên tắc chung là cây có tán lá nhỏ thì trồng mật độ cao, cây có tán lớn thì trồng mật độ thấp.

Điều 44. Khi trồng bằng cây ghép (vườn giống vô tính) thì mỗi hố trồng một cây (theo mật độ cuối cùng).

Khi trồng bằng cây hạt (vườn giống cây hạt) thì mỗi cụm 3 cây (trồng cách nhau 1m) được coi là một cụm cây. Khoảng cách giữa tâm các cụm cây là khoảng cách được tính theo mật độ cuối cùng.

Điều 45. Bố trí cây trong vườn giống phải bảo đảm nguyên tắc các cây cùng dòng vô tính hoặc cùng một gia đình không được trồng cạnh nhau. Sơ đồ bố trí cây theo phụ lục 2.

Điều 46. Việc lựa chọn sơ đồ bố trí cây cụ thể phải căn cứ vào yêu cầu cải thiện giống, trình độ cho phép của cán bộ kỹ thuật và công nhân trồng rừng tại cơ sở và phải được cấp có thẩm quyền phê duyệt.

Điều 47. Cây trồng trong vườn giống được bố trí thành nhiều khối. Trong mỗi khối chỉ trồng một cây ghép của mỗi dòng vô tính hoặc một cụm cây của mỗi gia đình.

Điều 48. Kích thước hố trồng ở vườn giống vô tính ít nhất là 60 x 60 x 60cm. Kích thước trồng ở vườn giống cây hạt như kích thước trồng ở rừng giống (xem Điều 22).

Phải bón lót đủ lượng phân hữu cơ trước khi trồng và phải nhiều hơn so với trồng rừng sản xuất.

Điều 49. Yêu cầu kỹ thuật trồng, thời vụ trồng, chăm sóc và bảo vệ cây trong vườn giống như yêu cầu cho rừng giống (xem phần 2).

Điều 50. Tỉa thưa cho vườn giống cây hạt được thực hiện khi các cây trong cụm bắt đầu khép tán. Việc tỉa thưa được tiến hành từng bước cho đến khi chỉ còn lại một cây trong cụm. Cây giữ lại phải là cây sinh trưởng và phát triển tốt nhất, đạt yêu cầu cao nhất về sản phẩm giống theo mục tiêu đặt ra. Phương pháp bài cây được thực hiện như tỉa rừng giống (xem chương VIII).

Điều 51. Tỉa thưa di truyền vườn giống chỉ được thực hiện sau khi cây giống đã trưởng thành thể hiện đầy đủ các yêu cầu chọn giống hoặc có kết quả của khảo nghiệm hậu thế. Chỉ chặt tỉa những dòng vô tính hoặc những gia đình không đạt yêu cầu chọn giống hoặc cho hậu thế (đời sau) không đạt yêu cầu theo mục tiêu đề ra.

Điều 52. Thu hái quả để cung cấp hạt cho trồng rừng sản xuất được tiến hành như thu hái quả ở rừng giống (xem Điều 35).

PHỤ LỤC 2

MỘT SỐ KIỂU SẮP XẾP CÂY CHỦ YẾU TRONG CÁC VƯỜN GIỐNG

1. Sắp xếp theo hàng có chuyển dịch là cách xắp xếp mà trật tự cây trong hàng không thay đổi, song trật tự cây giữa các hàng có thay đổi. Đây là cách sắp xếp đơn giản dễ thực hiện, song có hiện tượng tổ hợp lặp một phần có định kỳ. Vì vậy nên hạn chế sử dụng.

Hàng 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 10 Hàng 2 16 17 18 19 20 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Hàng 3 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 1 2 3 Hàng 4 20 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14...

...20

Thí dụ (cho 20 dòng)

2. Sắp xếp theo khối hoán vị: Chuyển dịch bậc thang có hệ thống của các cây trong mỗi lần gặp để tránh lặp lại một trật tự cây trong khối. Đây là phương pháp được áp dụng ở Mỹ, Colombia, Canada, ưu điểm của cách sắp xếp này là dễ thực hiện, tránh được tổ hợp lặp định kỳ, song vẫn ít tạo được thụ phấn chéo ngẫu nhiên.

10 11 12

13 14 15 16

17 18 19 20

a) Khối xuất phát

b) Khối lặp lại chuyển dịch bậc thang có hệ thống lần đầu.

Thí dụ

3. Sắp xếp theo khối đảo nghịch là một sự biến đổi khác của việc dùng khối cặp đôi với sự nối tiếp đảo ngược của các dòng trong khối và sắp xếp ngẫu nhiên khác nhau cho mỗi cặp khối. Kiểu sắp xếp này chỉ phù hợp cho cây tự thụ phấn. Khi dùng cho cây thụ phấn chéo phải có biến đổi để tránh hai cây cùng dòng nằm cạnh nhau. Cách bố trí này được dùng cho cây Ulmus carpiniflolia ở Hà Lan.

Sắp xếp theo khối đảo nghịch

4. Sắp xếp theo khối cân bằng không đầy đủ: là cách sắp xếp mà vị trí các cây trong khối nhỏ và các khối nhỏ trong vườn giống có thể được ấn định ngẫu nhiên. Cách sắp xếp này cho phép sắp xếp ngẫu nhiên các dòng vô tính cũng như tạo khả năng so sánh tính chất của các dòng vô tính một cách hiện quả nhất. Đây là cách sắp xếp phù hợp với cây thụ phấn chéo, được dùng ở Đức.

Ưu điểm của cách sắp xếp này là dự kiến được sự hoán vị của những cây cạnh nhau trong các khối nhỏ, là phương pháp thích hợp để so sánh các công thức sắp xếp cây trong vườn giống và nghiên cứu so sánh các dòng vô tính, thích hợp cho nghiên cứu khả năng tổng hợp riêng; song không thích hợp cho tỉa thưa có hệ thống.

Thí dụ: Trường hợp có:

10 dòng vô tính mỗi khối nhỏ có 3cây

9 lần lặp

30 khối nhỏ (khối 3 cây)

1 2 3

2 4 10 3 8 9

3 1

10 6

10 8 1

1 2 4

2 5 8

3 9 10 5

9 4

9 10

1 3 5

2 5 9

3 9 10 7

6 10 8

5 3

1 4 6

2 6 7

4 5 10 3

1 5

10 4 2

1 5 7

2 7 9

4 6 9

4 7

10 7

1 7

1 6 8

2 8 10 4 7 8

9 2

9 3

1 7 9

3 4 7

5 6 10 1

6 8

6 1

1 8 10 3 4 8

5 7 8

4 7

10 7

5 8

9 4

1 9 10 3 5 6

6 7 10 10 9 1

10 4

3 6

2 3 6

3 7 10 6 8 9

2 6

a) Kế hoạch lý thuyết

b) Sau khi đã sắp xếp ngẫu nhiên trong

khối và giữa các khối.

11 10 21

13 19 25

12 17 22

21 2

14 20

11 12 13 14 15

13 13 23

16 22 3

16 17 18 19 20

14 19 24

11 17 24 4

21 22 23 24 25

10 15 20 25

12 18 24 5

12 23 9

17 8

24 15

22 18 14 10

16 2

13 24 10

11 2

18 9

23 19 15

17 9

14 25

21 12 3

19 10

11 7

24 20

21 7

18 4

22 13 4

16 12 8

11 22 8

19 5

16 7

23 14 5

21 17 13 9

5. Sắp xếp mạng cân bằng được dùng khi số dòng vô tính là bình phương của một số nguyên. Cách sắp xếp này có ưu điểm là các khối nhỏ trong mỗi lần gặp có thể ngẫu nhiên và cách sắp xếp về cơ bản giống với ô vuông latinh. Đây là cách sắp xếp được dùng ở Đức và ở Mỹ.

25 dòng, mỗi khối nhỏ 5 cây, 6 lần lặp, 30 khối nhỏ.

6. Sắp xếp hoàn toàn ngẫu nhiên: Được thực hiện bằng cách trước hết chia vườn giống thành các khối bằng nhau sao để đủ cho mỗi dòng có một cá thể tham gia, còn vị trí của các cá thể trong khối thì hoàn toàn ngẫu nhiên. Sau đó phải điều chỉnh để tránh được hiện tượng các cây cùng dòng nằm cạnh nhau. Đây là phương pháp dễ sử dụng khi tỉa thưa có hệ thống, song khó thực hiện trên hiện trường. Phương pháp này được dùng nhiều ở Ôxtrâylia, Canađa, Đanh Mạch, Na Uy, Nam Phi, Liên Xô (cũ), Mỹ, Đức, Nam Tư v.v..

Một biến tướng của phương pháp này được dùng ở Thái Lan để trồng vườn giống Tếch là sắp xếp ngẫu nhiên hai lần. Thí dụ:

Khi trồng khoảng cách 12m x 12m thì lần đầu để khoảng cách 24m x 24m và bố trí cây hoàn toàn ngẫu nhiên, lần thứ hai lại bố trí ngẫu nhiên trong khoảng còn lại để thành khoảng cách 12m x12m, đồng thời có điều chỉnh để tránh hai cây của một dòng vô tính nằm cạnh nhau.

PHỤ BIỂU 6: PHÂN TÍCH THỐNG KÊ VỀ ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI

TRƯỜNG ĐẾN HSNC VÀ TLCHH

5.1. Ảnh hưởng của môi trường cơ bản đến HSNC .

Test of Homogeneity of Variances

HSNC

Levene Statistic

df1

df2

Sig.

1.033

.404

ANOVA

HSNC

Sum of Squares

df Mean Square

F

Sig.

Between Groups

.078

9.062

.000

.391

Within Groups

.724

.009

Total

1.115

84 89

5.2. Ảnh hưởng của BAP đến HSNC và TLCHH

Test of Homogeneity of Variances

Levene Statistic

df1

df2

Sig.

HSNC

3.747

.074

TLCHH

2.211

.061

ANOVA

Sum of Squares

df

Mean Square

F

Sig.

HSNC

Between Groups

4.426

.000

Within Groups

.737

.885 100.945 .009

Total

5.162

84 89

TLCHH

Between Groups

1331.144

73.753

.000

Within Groups

303.216

266.229 3.610

Total

1634.360

84 89

5.3. Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến HSNC và TLCHH

Test of Homogeneity of Variances

Levene Statistic

df1

df2

Sig.

HSNC

.899

.486

TLCHH

.239

.944

ANOVA

Sum of Squares

Mean Square

df

F

Sig.

HSNC

3.648

.730

96.947

.000

Between Groups

Within Groups

.632

.008

Total

4.281

84 89

TLCHH

1041.402

208.280

45.333

.000

Between Groups

Within Groups

385.936

4.594

84 89

Total

1427.338

5.4. So sánh khả năng nhân nhanh giữa 5 dòng nghiên cứu.

Test of Homogeneity of Variances

Levene Statistic

df1

df2

Sig.

HSNC

.414

.798

TLCHH

.494

.740

ANOVA

Sum of Squares

df Mean Square

Sig.

HSNC

Between Groups

.268

.235

1.419

.067

Within Groups

4.013

.047

Total

4.281

TLCHH

Between Groups

20.567

5.142

.311

.870

Within Groups

1406.771

16.550

Total

1427.338

HSNC

Duncan

Subset for alpha = 0.05

Dong

Dòng 154

1.7389

Dòng 141

1.8517

Dòng 136

1.8578

Dòng 126

1.8656

Dòng 122

1.9000

Sig.

.114

.550

Means for groups in homogeneous subsets are displayed.

TLCHH

Duncan

Subset for alpha = 0.05

Dong

Dòng 126

18.9944

Dòng 154

19.2278

Dòng 136

19.9500

Dòng 141

20.0333

Dòng 122

20.2000

Sig.

.438

Means for groups in homogeneous subsets are displayed.

QUY TRÌNH NHÂN NHANH IN VITRO

CHO 5 DÒNG BẠCH ĐÀN CHỌN LỌC

I. CẮT, BẢO QUẢN VÀ KHỬ TRÙNG MẪU CẤY.

1.1. Nguồn lấy mẫu.

Mẫu có thể lấy từ các nguồn sau:

- Chặt cây để tạo chồi: Phương pháp này tạo ra được rất nhiều chồi nhưng nhược điểm là phải chặt bỏ, để khắc phục nhược điểm này bằng cách bảo tồn và lưu giữ trong vườn dòng hoặc trong in vitro. Khi sử dụng phương pháp này cần lưu ý đến khả năng đâm chồi bất định của từng loài để quyết định chiều cao gốc chặt. Với các loài dễ mọc chồi bất định như bạch đàn, phi lao...thường để chiều cao gốc chặt 10 - 15 cm từ mặt đất. Với các loài khó mọc chồi như như các loài keo lá tràm, keo tai tượng...thường để chiều cao gốc chặt từ 0.7 - 1.2 m.

- Khoanh vỏ: Từng loài cây khác nhau kỹ thuật khoanh vỏ khác nhau. Đối với bạch đàn thường được khoanh vở ở cách mặt đất 10 - 15 cm, vở được khoanh và cắt đi khoảng 2/3 đường chu vi. Dọn sạch, quanh gốc cây được tiến hành khoanh và tiến hành chăm sóc như làm cỏ, tưới nước, bón phân. Các chồi mọc lên từ chỗ khoanh vỏ được đưa vào làm vật liệu nuôi cấy.

- Ghép cây: Ghép cành, mắt...của cây cần nhân giống lên gốc ghép non của

cây cùng loài.

- Ngoài ra còn có nhiều phương pháp khác như: giâm hom, triết cành, ươm

rễ, ken cây....

1.2. Kích thước mẫu nuôi cấy

Mẫu nuôi cấy càng to thì khả năng nhiễm khuẩn càng lớn vì vậy khi lấy mẫu nên chọn mẫu nhỏ (nhỏ đến mức tối thiểu cho phép). Nếu nuôi cấy chồi thì mẫu nuôi cấy phải lấy đủ 1 đoạn có chứa chồi nách hoặc chồi đỉnh. Lấy mẫu ở các vị trí khác nhau ảnh hưởng rất khác nhau đến kết quả nuôi cấy, vì vậy tuỳ từng loài cây và mục đích nuôi cấy mà chọn vị trí lấy mẫu cho thích hợp.

Mẫu được lấy ở chồi từ 30-40 ngày tuổi, sinh trưởng tốt, không sâu bệnh, cắt bỏ phần ngọn non, toàn bộ phiến lá và gần hết phần cuống lá (cuống lá được cắt sát với chồi) . Mẫu cấy có chiều dài từ 1.5-3.0 cm, đường kính

mẫu cấy từ 1-2 mm, mang từ 2-3 nách lá trong đoạn từ lá thứ 3 đến lá thứ 6.

1.3. Tuổi sinh lý của mẫu nuôi cấy

- Tuổi sinh lý của mẫu nuôi cấy ảnh hưởng rất lớn đến kết quả nuôi cấy. Tuổi sinh lý càng già thì khả năng phát sinh hình thái càng yếu. Theo thuyết phát triển giai đoạn thì gốc là phần non nhất của cây, nếu lấy mẫu ở phần này tỷ lệ mẫu đưa vào sẽ rất thành công.

- Thời gian lấy mẫu: Nên lấy mẫu vào buổi sáng và không lấy vào thời điểm đang có nguy cơ bị nấm bệnh, tốt nhất là nên phun phòng nấm bệnh định kỳ cho nguồn mẫu định sử dụng.

- Mùa cắt mẫu: Nên cắt vào cuối giai đoạn ngủ của cây. ở thời điểm này lượng auxin tập trung rất nhiều để chuẩn bị cho quá trình nảy chồi. Đối với bạch đàn nếu lấy mẫu nuôi cấy tháng 11 thì khả năng nảy chồi kém, tốt nhất là lấy vào tháng 3-4.

1.4. Bảo quản mẫu.

- Sau khi cắt rời cây mẹ, mẫu lúc này bị mất cân bằng sinh thái, chủ yếu là lượng nước bị mất. Để khắc phục hiện tượng này cần làm như sau: Mẫu vật lấy song để ngay vào bình lạnh, nhiệt độ thấp sẽ làm giảm bớt khả năng thoát hơi nước.

1.5. Khử trùng mẫu cấy.

Vô trùng mẫu cấy là một thao tác khó, ít khi thành công ngay trong lần khử trùng đầu tiên. Tuy vậy nếu kiên trì tìm được nồng độ thích hợp và thời gian vô trùng thích hợp thì sau vài lần thử chắc chắn sẽ đạt kết quả tốt.

Mẫu nuôi cấy được lấy với kích thước vừa đủ, sơ bộ rửa sạch dưới vòi nước máy. Nếu vật liệu quá nhỏ có thể cho vào cốc lọc lưới và xịt mạnh dưới vòi nước.

Nếu vật liệu cấy có nhựa bám hoặc dây bẩn tự nhiên cần rửa bằng bột xà phòng giặt thông thường với liều lượng khoảng 2 thìa cà phê/100 ml nước. Khuấy đều 5 phút, có thể dùng bút lông cọ rửa những vết bẩn rõ. Sau đó xối nước máy cho hết xà phòng, thấm khô mẫu cấy bằng giấy thấm.

Bước tiếp theo là thanh trùng bằng hoá chất: bước này phải thực hiện trên tủ cấy vô trùng.

Đưa mẫu cấy vào cốc đong đã được thanh trùng.

Dùng cồn 75oc để đẩy hết bọt khí ra ngoài mẫu nuôi cấy trong khoảng thời

gian 1 - 2 giây, sau đó rửa lại bằng nước cất vô trùng từ 4 - 6 lần.

Khử trùng mẫu bằng HgCl2 0,1% trong thời gian 11 phút. Ngoài ra thời gian phụ thuộc vào độ non già của mẫu nuôi cấy ở từng thời điểm. Sau đó rửa lại bằng nước cất vô trùng 4 - 6 lần.

Cuối cùng trước khi cấy cần thấm khô mẫu trên giấy thấm và cắt bỏ tất cả những vết cắt cũ để loại trừ phần mô đã bị thuốc sát trùng thấm sâu. Mức độ cắt nhiều ít tuỳ thuộc chủng loại thuốc và đặc điểm giải phẫu của mẫu. Cần chú ý là trong toàn bộ quá trình sát trùng và tráng rửa cần đảm bảo đủ lượng để làm ngập mẫu nuôi cấy.

II. CẤY MẪU.

Mẫu được cấy vào môi trường trong ống nghiệm, kỹ thuật cấy như sau:

- Dùng panh gắp mẫu và dùng kéo cắt bỏ những phần không cần thiết

như cuống lá, đoạn thân không có nách lá...

- Thả mẫu vào ống nghiệm hoặc bình tam giác

- Dùng kim cấy cấy phần gốc của mẫu vật vào trong môi trường

- Mẫu cấy xong phải gói kín và được bảo quản lạnh 72 giờ

Chú ý: Khi lấy mẫu về phải cấy ngay trong ngày.

III. CẤY CHUYỂN MẪU.

3.1. Cấy chuyển lần đầu:

Mẫu được cấy ở môi trường đổ trong bình tam giác 250ml hoặc 500ml. Sau khi cấy mẫu được 28 ngày thì tiến hành cấy chuyển sang môi trường nhân chồi. Dùng panh để lấy chồi và dùng kéo cắt bỏ bớt lá, đoạn thân khô, phần gốc bị già. Dùng kim ấn nhẹ cho phần gốc nằm trong môi trường. Nên chuyển mỗi mẫu sang một bình mới để giảm nguy cơ nấm khuẩn và cứ tiến hành cấy chuyển như vậy cho đến khi mật độ mẫu trong bình đủ tiêu chuẩn một bình giống gốc.

3.2. Cấy chuyển bình gốc.

Mục đích là càng tạo ra nhiều chồi càng tốt nên mỗi loài cây khác nhau có cách cấy khác nhau. Nếu muốn tạo chồi từ chồi đỉnh và chồi bên thì cắt

chồi ra thành từng đoạn, mỗi đoạn mang theo 1 - 2 nách lá. Dùng kim cấy dàn đều và ấn nhẹ trên bề mặt môi trường.

IV. ĐIỀU KIỆN VẬT LÝ

4.1. Ánh sáng

Ánh sáng là nhân tố cần thiết cho quang hợp vì vậy trong quá trình nuôi cấy ánh sáng dữ một vai trò rất quan trọng. Cây trong ống nghiệm có thể sử dụng được ánh sáng tự nhiên hoặc ánh sáng nhân tạo. Nếu sử dụng ánh sáng tự nhiên thì phòng nuôi dưỡng được thiết kế theo kiểu nhà kính bát giác. Nếu sử dụng ánh sáng đèn thì phải có hệ thống đèn chiếu sáng với chủng loại ánh sáng đèn phù hợp.

Ánh sáng: mẫu được nuôi cấy dưới ánh đèn nêon với cường độ ánh từ

1000 – 3000 lux, thời gian chiếu sáng 10 giờ/ngày.

4.2. Nhiệt độ

Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp nhất 23-270C đối với nhân chồi và thúc chồi.

4.3. Độ ẩm.

Độ ẩm tương đối của không khí cũng ảnh hưởng rất lớn đến khả năng nảy chồi và ra rễ của các loài thực vật. Vì vậy trong nuôi cấy mô khi chúng ta tạo ra nền nuôi cấy cũng cần phải nghiên cứu độ ẩm phải đạt độ ẩm tương đối của không khí trong bình nuôi cấy như ở ngoài là 85-90% sẽ thuận lợi cho cây phát triển.

Độ ẩm của phòng nuôi lại hoàn toàn ngược lại. Độ ấm của phòng nuôi không cho phép vượt quá 60 %.

V. MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY.

Môi trường nuôi cấy là môi trường MS có bổ sung thành phần các chất

như sau: 30g/l sucrose + 4.5g/l agar + 2.0mg/l vitaminB2 + 1.5mg/l BAP +

1.5 mg/l NAA, pH =6. Pha môi trường theo phương pháp truyền thống, thành

phần môi trường MS như sau.

Các chất đa lượng

332.02 mg/l 2.99 mM CaCl2

170.00 1.25 mM KH2PO4

1900.00 18.79 mM KNO3

180.54 1.50 mM MgSO4

1650.00 20.61 MM NH4NO3

Các chất vi lượng

0.025 mg/l CoCl2.6H2O 0.11 µM

0.025 CuSO4 0.10 µM

36.700 0.10 mM FeNaEDTA

6.200 0.10 mM H3BO3

0.830 KI 5.00 µM

16.900 0.10 mM MnSO4. H2O

0.250 Na2MoO4.2 H2O 1.03 µM

8.600 ZnSO4.7 H2O 29.91 µM

Các chất vitamin

2.00 mg/l Glycine 26.64 µM

100.00 0.564 mM Myo-Inositol

0.50 Nicotinic acid 4.06 µM

0.50 Pyridoxine HCl (vitamin B6) 2.43 µM

0.10 Thiamine HCl (vitamin B1) 0.30 µM

* Thao tác khi cấy.

- Cồn 950 dùng để đốt đèn cồn - Cồn 750dùng để sát trùng dụng cụ - Nước rửa khử trùng (do Trung quốc sản xuất có tên là LiqunrBenzalkoni Bromidi) dùng để vệ sinh buồng cấy và sát trùng tay.

- Sau khi hoàn tất công tác vệ thì mới bắt đầu các thao tác cấy - Châm đèn cồn, cắm dụng cụ cấy vào lọ cồn 750 - Đặt ống nghiệm, bình cấy, bình gốc... lên bàn

- Mở nút bình gốc, hơ miệng bình lên ngọn đèn cồn

- Hơ panh kéo lên ngọn đèn cồn, hơ lần lượt cho đến khi cháy hết cồn

trên panh kéo

- Khi panh kéo nguội bắt đầu cấy chuyển.

- Sau khi cấy hết một mẻ từ 7-8 ống nghiệm hoặc một bình gốc thì dọn dẹp, vệ sinh mặt bàn cấy. Panh kéo cắm trở lại lọ đựng cồn 75o - Dùng kim cấy để dằm mẫu vật xuống nền nuôi cấy. Kim cấy trước khi đưa vào để dằm mẫu vật cũng được hơ lên ngọn đè cồn, khi sử dụng xong cắm trở lại vào lọ đựng cồn 750

- Hơ nút bông trên ngọn lửa đèn cồn sau đó đậy nút, bao giấy và buộc

dây.

Nếu tiếp tục cấy thì thao tác lặp lại như trên.