ĐA HÌNH DI TRUYỀN GEN HORMON KÍCH
THÍCH BAO NOÃN (FSH) TRONG MỘT SỐ GIỐNG
LỢN Ở VIỆT NAM
Nguyễn Thị Diệu Thúy1, Nguyễn Thu Thúy1, Nguyễn Văn Cường1, A.W. Kuss2, H. Geldermann2
1. Viện Công nghệ Sinh học, 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu
Giấy, Hà Nội.
2. Trường ĐH Hohenheim, Stuttgart, CHLB Đức.
Ở Việt Nam, lợn là vật nuôi quan trọng, cung cấp khoảng
75% tổng lượng thịt cho xã hội [5]. Cho đến nay, ở nước ta
các chương trình lai tạo và chọn giống lợn được sử dụng
chủ yếu dựa trên đặc điểm ngoại hình và một số chỉ tiêu
sinh hoá. Quá trình chọn lọc dựa trên di truyền số lượng
này đã góp phần chọn lọc đàn giống lợn có những đặc điểm
ưu việt hơn ví dụ như mức độ sinh trưởng cao hơn, chất
lượng thịt tốt. Tuy nhiên, quá trình này cần nhiều thời gian
và trong một số trường hợp kết quả chọn lọc không hoàn
toàn chính xác. Trong khoảng hơn mười năm gần đây, các
nhà di truyền học đã nghiên cứu và phát triển các chỉ thị di
truyền phân tử cũng như các gen liên quan đến các tính
trạng để hỗ trợ cho quá trình chọn lọc giống vật nuôi.
Việc tăng số lượng con sinh ra trong một lứa là một trong
những tính trạng sinh sản của lợn rất được quan tâm. Một
số chỉ thị di truyền liên quan đến tính trạng này như ESR
(Oestrogen receptor gene) [4], PRLR (Prolactin receptor)
[6], FSH (Follicle Stimulating Hormone subunit Gene)
…đã được nghiên cứu ở một số giống lợn [2]. Gen kích
thích bao noãn FSH nằm trên nhiễm sắc thể số 2 và sản
phẩm của nó là tiểu đơn vị của hormone kích thích bao
noãn. FSH tương tác với thụ thể của nó (receptor) nằm trên
các tế bào hạt và có tác dụng kích thích sự trưởng thành và
biệt hóa của các tế bào trứng. FSH cùng với LH (Lutein
Hormone) giữ vai trò quan trọng trong sự phát triển của
trứng trước khi thụ tinh. Đa hình gen FSH đã được nghiên
cứu rất kỹ ở giống lợn Meishan, Landrace, Yorkshire và
Duroc [2,3]. Kết quả của sự đột biến gen này là sự xen vào
của gen nhảy (transposon) chứa toàn bộ trình tự của RNA
polymerase II cũng như các vùng có thể sao chép. Gen
nhảy này có độ dài 292 bp xen vào ở vị trí 809 bp, nằm
giữa Intron I và Exon II của gen FSH. Đột biến này liên
quan đến số lượng con sinh ra trong 1 lứa. Những cá thể
mang gen nhảy thì số lượng con sinh ra trong 1 lứa ít hơn
so với cá thể không mang gen nhảy. Kết quả thực nghiệm
từ 289 lợn nái Landrace và Yorkshire cho thấy những cá
thể đồng hợp tử không mang gen nhảy (NN) có số con sinh
ra trong một lứa trung bình cao hơn cá thể đồng hợp mang
gen nhảy (TT) 1,5 con [3]. Sử dụng phương pháp này có
thể dự đoán số lượng lợn con sinh ra trong 1 lứa. Với mục
đích là bước đầu ứng dụng các kết quả của di truyền chất
lượng vào công tác chọn lọc đàn giống, chúng tôi tiến hành
khảo sát đa hình kiểu gen FSH của một số giống lợn ở Việt
Nam.
Vật liệu và phương pháp
- Các hoá chất sử dụng ở dạng tinh khiết dùng cho phân
tích sinh học phân tử đặt từ các hãng Alconox, Roth,
Eppendorf, Pharmacia, Merk, Serva, Sigma, MBI
Fermentas,…
- 302 mẫu máu thu được từ 7 giống lợn: Móng Cái
(n=61) từ nông trường Thành Tô (Hải Phòng), Mường
Khương (n=73) từ huyện Mường Khương (Lào Cai), Mẹo
(n=47) từ huyện Quỳ Châu (Nghệ An), Cỏ (n=42) từ huyện
Kon Kuông (Nghệ An), Tạp Ná (n=25) từ huyện Thông
Nông (Cao Bằng) và 2 giống lợn ngoại Landrace (n=24) và
Yorkshire (n=17) đã nhập vào Việt Nam trên 20 năm tại
Trung tâm Nghiên cứu lợn Thụy Phương, Viện Chăn nuôi
Quốc gia.
- DNA được tách chiết từ máu qua các bước: tiêu hoá
bằng ProteinaseK và làm sạch bằng Phenol, Chloroform
theo phương pháp được mô tả trong [1].
- Trình tự ADN của đoạn gen FSH cần nhân lên và trình
tự cặp mồi đặc hiệu được trình bày dưới đây:
Trong đó: P1 và P2 là trình tự mồi đặc hiệu với đoạn
gen FSH
Đoạn viết ở dạng chữ in là trình tự đoạn gen nhảy dài
292 bp.
- Thành phần và chu trình nhiệt phản ứng PCR của gen
FSH được ghi trong bảng 2 và 3.
Bảng 2: Thành phần phản ứng PCR
Bảng 3: Chu trình nhiệt phản ứng PCR nhân đặc hiệu đoạn
FSH
- Sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel agarose 1,5%,
nhuộm Ethidium Bromide và phát hiện dưới ánh sáng UV.
Kết quả và thảo luận
Kết quả PCR nhân đoạn gen FSH
Trước tiên, chúng tôi phải tiến hành tối ưu hoá điều kiện
phản ứng PCR, trong đó quan trọng nhất là 2 yếu tố nồng
độ MgCl2 và nhiệt độ bám. Phản ứng PCR được tiến hành
trên máy Gradient Cycle PTC-100 với gradient nồng độ MgCl2 từ 1,5mM đến 3,0mM và nhiệt độ bám từ 500C đến
620C. Kiểm tra sản phẩm PCR trên agarose 1,5% cho thấy ở điều kiện nhiệt độ bám 550C và nồng độ MgCl2 1,5mM là
cho kết quả tốt nhất, sản phẩm PCR có 1 vạch rõ và duy
nhất có kích thước 540bp tương ứng với cá thể có mang
đoạn gen nhảy.
Kết quả phân tích kiểu gen FSH bằng PCR trong 7 giống
lợn Móng cái (MC), Mường Khương (MK), Mẹo (ME), Cỏ
(CO), Tạp Ná (TN), Landrace (LR) và Yorkshire (YS)
được trình bày ở hình 1. Sản phẩm PCR thu được có độ dài
khác nhau, phụ thuộc vào sự có mặt hay vắng mặt của gen
nhảy ở 1 hoặc cả 2 nhiễm sắc thể. Những cá thể mang gen
nhảy được ký hiệu là T tương ứng với sản phẩm PCR có độ
lớn là 540bp, những cá thể không mang gen nhảy ký hiệu là
N tương ứng với sản phẩm PCR có độ lớn là 248 bp. Sản
phẩm PCR ở các giếng 4,5,6 là 1 băng ADN có độ lớn
tương ứng với 248 bp, tức là những cá thể này có kiểu gen
đồng hợp tử NN, sản phẩm PCR ở các giếng 1,2,3 là 1 băng
ADN có độ lớn tương ứng với 540 bp, tức là những cá thể
này có kiểu gen đồng hợp tử TT, sản phẩm PCR ở các
giếng 7,8,9,10,11 xuất hiện 2 băng ADN tương ứng với
540bp và 248 bp, đó là các cá thể có kiểu gen dị hợp tử TN.
Hình 1: Kết quả điện di agarose 1,5%
M: ADN chuẩn 100bp
1-3: Sản phẩm PCR nhân đoạn gen FSH của các cá thể có
kiểu gen TT (540bp)
4-6: Sản phẩm PCR nhân đoạn gen FSH của các cá thể có
kiểu gen NN (248 bp)
7-11: Sản phẩm PCR nhân đoạn gen FSH của các cá thể có
kiểu gen TN (540bp và 248bp)
Tần suất xuất hiện kiểu gen FSH trong một số giống lợn
Trong 61 MC có 59 con mang kiểu gen đồng hợp tử TT
chiếm 96,7%; 2 các thể mang kiểu gen đồng hợp tử NN
chiếm 3,3% và không có cá thể nào mang kiểu gen dị hợp
tử TN. Trong số 73 cá thể giống lợn MK tần số kiểu gen
đồng hợp tử NN là 11% (8 cá thể), dị hợp tử TN 21,9% (16
các thể) là cao hơn so với MC, còn lại là 49 cá thể mang
kiểu gen đồng hợp tử TT chiếm 67,1%. Còn đối với các
giống lợn Yorkshire và Landrace nhập vào Việt Nam thì
tần số kiểu gen NN, TN và TT lần lượt là 76,5%, 79,5%;
5,9%, 8,3% và 17,6%, 12,5%. Kết quả bảng 1 cho thấy tần
số cá thể không mang gen nhảy tức là kiểu gen NN ở các
giống lợn ngoại nhập cao hơn hẳn so với các giống lợn nội
Việt Nam. Trong số các giống lợn nội thì không có cá thể
nào của giống lợn CO mang kiểu gen NN, và chỉ có 2,1%
và 4% giống lợn ME và TN mang kiểu gen đồng hợp tử
NN. Kết quả này chỉ ra rằng với giống lợn ngoại đã được
chọn lọc thì tần số kiểu gen NN (không mang gen nhảy)
cao hơn hẳn các giống lợn nội, liên quan số lợn con sinh ra
trong một lứa nhiều hơn. Điều này có thể do các giống lợn
ngoại YS và LR là các giống nhập ngoại vì thế đã qua quá
trình chọn lọc nhân tạo của con người, còn các giống lợn
nội (MK, ME, CO, TN) còn hoàn toàn chăn nuôi tự nhiên.
Bảng 4. Tần suất các kiểu gen FSH trong một số giống lợn
I. Kết luận
- Đã nhân được đoạn gen đặc hiệu của gen FSH có độ
dài 540 bp trong trường hợp có mang gen nhảy và độ dài
248 bp trong trường hợp không mang gen nhảy bằng kỹ
thuật PCR.
- Đã khảo sát đa hình di truyền gen FSH của 7 giống lợn
trong đó có 5 giống lợn nội và 2 giống lợn ngoại nhập vào
Việt Nam. Kết quả cho thấy hai giống lợn ngoại Yorkshire
và Landrace có tần số kiểu gen không mang gen nhảy cao
hơn hẳn các giống lợn nội Việt Nam.
II. Tài liệu tham khảo
1. Frederich M. Ausubel, Roger Brent, Robert E.
Kingston, David D. Moore, J.G. Seidman, John A. Smith,
and Kevin Struhl. Shrort Protocols in Molecular Biology,
Third Edition.
2. Li, N., Zhao, Y.F., Xia, L., Zhang, F.J., Chen, Y.Z.,
Dai, R.J., Zhang, J.S., Shen, S.Q., Chen, Y.F. and Wu, C.X.
1998. Candidate gene approach for identification of genetic
loci controlling litter size in swine. Proc 6th World
Congress Quatitative Genetics of Livestock 26: 183-186.
3. Li et al. DNA marker for pig litter size. United States
Patent, September 18, 2001.
4. Max Rothschild et al. The estrogen receptor locus is
associated with a major gene influencing litter size in pigs.
1996. Proc. Natl. Acad. USA. Genetics. Vol. 93, 201-205.
5. Nguyễn Văn Đức, Tạ Thị Bích Duyên, Giang Hồng
Tuyến, Nguyễn Văn Hà và Lê Viết Ly. 2000. Kết quả chọn
lọc dòng lợn Móng Cái về tăng trọng, tiêu tốn thức ăn và tỷ
lệ nạc. Tóm tắt báo cáo khoa học năm 1999. Viện Chăn
Nuôi, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, 3-5.
6. Vincent, A.L., Short, T.H., Eckardt, G.R., McLaren,
D.G., Southwood, O.I., Plastow, G.S., Tuggle, C.K. and
Rothschild, M.F. 1998. The prolactin gene receptor is
associated with increased litter size in pigs. Proc 6th World
Congress Quantitative Genetics of Livestock 27: 15-18.
SUMMARY
Genetic frequency of follicular stimulating hormone
gene in pig breeds in VietNam.
Nguyen Thi Dieu Thuy et al.
Institute of Biotechnology.
The follicular stimulating hormone gene (FSH) plays an
importance role in the development of the oocyte before
fertilization by interacting with its receptor on granular
cells to promote the maturation and differentiation of
ovarian follicles. The association between litter size and the
polymorphism of porcine FSH beta-subunit gene was
confirmed. A mutation caused by an insertion of a
transposon which contains a complete promoter for RNA-
polymerase II and other possible transcription regions, in
the FSH-beta subunit gene has been identified. The litter
size in pigs carrying the mutation is significantly lower
than those of pigs lacking the mutation. To analyze the
frequency of follicular stimulating hormone gene in pig
breeds in Viet Nam we have screened the mutated FSH-
gene in 302 individuals belonging to 5 local pig breeds
(Muong Khuong, Mong Cai, Meo, Co and Tap Na) and 2
exotic pig breeds (Yorkshire and Landrace) by polymerase
chain reaction (PCR). Two specific primers (P1: 5’-
ccttnnagacagtcaatgg-3‘; P2: 5‘-ccagtnnttcaaggtttggtca-3‘)
have been used for PCR amplification of mutated and
unmutated DNA fragment in the FSH gene. PCR condition
was optimized on MgCl2 and annealing temperature. The PCR condition of 1.5mM MgCl2 and 550C gave the best
result. The mutated and unmutated allele was identified as
allele “T” and “N”. The homozygote (TT) and (NN) will
present one bands of 540bp and 248bp, respectively. The
heterozygote (TN) will present two bands of 540bp and
248bp. Analysis of FSH gene polymorphism on Landrace,
Yorkshire, showed that the frequencies of the homozygote
(NN) were 79.2% and 76.5%, respectively. In digenous pig
breeds, the frequencies of the homozygote (NN) were very
low, even in case of Co breed no animal has been detected.
Among the local pig breeds, the highest frequency of the
homozygote (NN) and the heterozygote (TN) was found in
Muong Khuong breed and have the value of 11% and
21.9%, respectively. The frequency of homozygote (NN) in
exotic breeds is higher than in indigenous breeds. The
preliminary results are consistent with the fact that the
exotic breeds were selected for reproductive trait, while
indigenous breeds were not.
Người thẩm định nội dung khoa học: PGS.TS. Nguyễn Kim
Độ.
