BÁO CÁO KHOA HỌC: "PHÁT HIỆN CÁC ĐỘT BIẾN HAEMOPHILIA A BẰNG KỸ THUẬT PCR-RFLP SỬ DỤNG DEEP VENT ADN POLYMERASE"

PHÁT HIỆN CÁC ĐỘT BIẾN HAEMOPHILIA A

BẰNG KỸ THUẬT PCR-RFLP SỬ DỤNG DEEP

VENT ADN POLYMERASE

Nguyễn Hoài Giang

Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương

Nguyễn Tùng Lâm

Trường Đại học Ngoại Thương

ĐẶT VẤN ĐỀ

Haemophilia A (bệnh máu khó đông) là một trong những

bệnh di truyền phổ biến liên quan đến nhiễm sắc thể X.

Ước tính trên thế giới có khoảng từ 1/5000 đến 1/10.000

các bé trai sinh ra mắc bệnh này. Theo số liệu thống kê của

Viện Huyết học và Truyền máu Trung ương số lượng bệnh

nhân Haemophilia A ở Việt nam cũng không phải là nhỏ.

Một trong những nguyên nhân gây ra bệnh Haemophilia A

là do các đột biến ở gen mã hoá cho yếu tố đông máu số

VIII (factor VIII). Gen này nằm trên cánh dài của nhiễm

sắc thể tại vị trí Xq28. Gen mã hoá cho yếu tố VIII rất lớn

(khoảng 180 kb) bao gồm 26 exon (1). Kỹ thuật PCR dùng

Taq ADN polymerase, sau đó phát hiện điểm đột biến bằng

enzyme giới hạn (PCR-RFLP) đã được các nghiên cứu

trước đây sử dụng rất có hiệu quả để phát hiện các đột biến

của bệnh Haemophilia A(1, 2).

Deep Vent ADN polymerase có hoạt tính xúc tác quá trình

tổng hợp ADN mới như Taq ADN polymerase. Các nghiên

cứu của hãng New England Biolab cho thấy Deep Vent

ADN polymerase có nhiều ưu điểm hơn so với Taq ADN polymerase. Ở 95oC, Taq ADN polymerase bị mất 50%

hoạt tính xúc tác sau 40 phút so với 1380 phút cùng điều

kiện của Deep Vent ADN polymerase. Deep Vent ADN

polymerase lại ít gây lỗi khi xúc tác tổng hợp sợi ADN mới

so với Taq ADN polymerase (3, 4). Những đột biến ở

intron 18 và 19 của gen mã hoá cho yếu tố VIII là đột biến

mất vị trí nhận biết của enzyme giới hạn Bcl I và Hind

III(1, 2). Do vậy, độ chính xác của các sản phẩm PCR so

với khuôn mẫu ADN ban đầu rất quan trọng, nó đảm bảo

kết quả chẩn đoán phát hiện đột biến ở bệnh nhân

Haemophilia A. Trong nghiên cứu này, chúng tôi muốn sử

dụng ưu điểm ít gây lỗi trong quá trình xúc tác của Deep

Vent ADN polymerase để sử dụng kỹ thuật PCR-RFLP

phát hiện các đột biến ở intron 18 và 19 của gen mã hoá

cho yếu tố đông máu số VIII. Kỹ thuật này có thể ứng dụng

để phát hiện các phụ nữ mang gen bệnh và chuẩn đoán sớm

trước sinh bệnh Haemophilia, phục vụ chương trình chăm

sóc và bảo vệ sức khoẻ cộng đồng.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Vật liệu

19 mẫu máu của bệnh nhân Haemophilia A do Viện Huyết

học và Truyền máu Trung ương cung cấp. 25 mẫu máu của

người bình thường khoẻ mạnh do Viện Vệ sinh Dịch tễ

Trung ương cung cấp. Taq ADN polymerase, Deep Vent

ADN polymerase, các enzyme giới hạn Bcl I và Hind III và

thang ADN chuẩn 100bp của hãng New England Biolabs

(Mỹ). Các hoá chất khác sử dụng cho nghiên cứu này đều

của các hãng Sigma, Merck, Promega…

Phương pháp nghiên cứu

• Tách chiết ADN từ máu được cải tiến theo phương

pháp được mô tả bởi Sambrook và cộng sự (5).

• Phản ứng PCR sử dụng enzyme Taq ADN polymerase,

với cặp mồi đặc hiệu cho intron 18 và 19 của yếu tố VIII

được tiến hành theo nghiên cứu của Kogan và cộng sự (2).

• Phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu cho intron 18 và

19 của yếu tố VIII, sử dụng enzyme Deep Vent được tối ưu

theo theo phương pháp nghiên cứu được mô tả bởi Nguyễn

Hoài Giang và các đồng tác giả (6).

• Cắt sản phẩm PCR bằng enzyme giới hạn Bcl I và Hind

III theo thường qui chuẩn của hãng New England Biolabs

(4).

• Điện di sản phẩm PCR trên gel polyacrylamide 6% và

nhuộm bạc theo phương pháp của Sambrook và cộng sự

(5).

KẾT QUẢ, THẢO LUẬN

1. Phát hiện đột biến ở intron 18 của gen mã hoá cho

yếu tố đông máu số VIII

0,5 ml của 44 mẫu máu (19 mẫu của bệnh nhân

Haemophilia A và 25 mẫu của người bình thường khoẻ

mạnh) được tách chiết ADN bằng đệm phân giải, đệm phân

giải nhân, proteinase K và kết tủa ADN bằng isopropanol,

theo phương pháp đã cải tiến của Sambrook và cộng sự (5).

Kết quả đo OD ở bước sóng 260 nm cho thấy tất cả các

mẫu ADN tách chiết được đều đủ điều kiện để tiến hành

phản ứng PCR. Sủ dụng điều kiện PCR dùng Taq ADN

polymerase cho cặp mồi của intron 18, gen mã hoá yếu tố VIII theo Kogan và cộng sự (30 chu kỳ với 94oC-1 phút, 45oC-1 phút, 72oC -1 phút), chúng tôi đã thành công trong

việc khuyếch đại intron này từ các mẫu ADN của người

khoẻ mạnh và bệnh nhân Haemophilia A (giếng 1 , Hình

1). Theo nghiên cứu của hãng New England biolabs và

kinh nghiệm của chúng tôi về Deep Vent ADN polymerase

(4, 6), điều kiện PCR với Deep Vent ADN polymerase cho

cặp mồi của intron 18 sau khi tối ưu hoá là 30 chu kỳ với 94oC-30 giây, 50oC-20 giây, 72oC-20 giây; 2 mM Mg2+;

200 àM dNTPs. Kết quả điện di trên gel polyacrylamide

6% cho thấy sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu cho

intron 18 có kích thước 142 bp ở cả người bình thường

khoẻ mạnh và bệnh nhân Haemophilia, giống như kết quả

của Kogan và cộng sự (giếng 1 đến 3, Hình 1). Theo nghiên

cứu trước đây (1, 2), đột biến ở intron 18 sẽ làm thay đổi vị

trí nhận biết của enzyme giới hạn Bcl I. Nghĩa là những

bệnh nhân Haemophilia A có đột biến ở intron 18 sẽ không

thay đổi kích thước của sản phẩm PCR sau khi ủ với

enzyme Bcl I (giếng 5, Hình 1). Ngược lại những người

bình thường khoẻ mạnh hoặc những bệnh nhân

Haemophilia A không có đột biến ở intron 18 sẽ bị enzyme

giới hạn Bcl I cắt tạo ra 2 băng kích thước 99 và 43 bp

(giếng 4, Hình 1). Trong số 25 mẫu người bình thường

khoẻ mạnh khi sử dụng kỹ thuật PCR-RFLP với cặp mồi

đặc hiệu cho intron 18: 25/25 mẫu (100%) đều bị cắt với enzyme Bcl I ở 50oC sau 12 giờ. Trong số 19 mẫu bệnh

nhân Haemophilia A có 8 mẫu không bị cắt và 11 mẫu bị cắt bởi enzyme Bcl I ở 50oC sau 12 giờ. Kết quả này cho

thấy có 8/19 (42%) số bệnh nhân Haemophilia A được

nghiên cứu có mang đột biến ở intron 18 gen mã hoá cho

yếu tố VIII.

Hình 1. PCR-RFLP với intron 18 (Haemophilia A).

Giếng 1: Sản phẩm PCR được khuyếch đại với enzyme Taq

ADN polymerase (ADN khuôn được tách chiết từ mẫu máu

của người bình thường khoẻ mạnh).

Giếng 2: Sản phẩm PCR được khuyếch đại với enzyme

Deep Vent ADN polymerase (ADN khuôn được tách chiết

từ mẫu máu của người bình thường khoẻ mạnh).

Giếng 3: Sản phẩm PCR được khuyếch đại với enzyme

Deep Vent ADN polymerase (ADN khuôn được tách chiết

từ mẫu máu của bệnh nhân Haemophilia A).

Giếng 4: Sản phẩm PCR (ở giếng 2) sau khi cắt bằng

enzyme Bcl I.

Giếng 5: Sản phẩm PCR (ở giếng 3) sau khi cắt bằng

enzyme Bcl I.

Mr: Thang ADN chuẩn - 100bp (New England Biolabs).

2. Phát hiện đột biến ở intron 19 của gen mã hoá yếu tố

đông máu số VIII

Sử dụng điều kiện PCR của intron 19 của Kogan và cộng sự là 30 chu kỳ với 94oC-1 phút, 55oC-1 phút, 70oC-3 phút;

chúng tôi cũng đã thành công trong việc khuyếch đại intron

này bằng Taq ADN polymerase (giếng 1, Hình 2). Tương

tự với intron 18, điều kiện PCR với Deep Vent ADN

polymerase cho cặp mồi của intron 19 sau khi tối ưu hoá là 30 chu kỳ với 94oC-30 giây, 57oC-20 giây, 72oC-40 giây và

sản phẩm PCR có kích thước 730 bp.

Loại trừ 8 mẫu đã phát hiện được mang đột biến ở intron

18, 11 mẫu bệnh nhân còn lại và 25 mẫu người bình thường

khoẻ mạnh được khuyếch đại bằng cặp mồi đặc hiệu cho

intron 19 với Deep Vent ADN polymerase theo điều kiện

PCR đã được tối ưu hoá như trên (giếng 3 và 5, Hình 2).

Các nghiên cứu trước đây đã chỉ rõ đột biến ở intron 19 sẽ

làm thay đổi vị trí nhận biết của enzyme giới hạn Hind III

(1, 2). Nghĩa là những bệnh nhân Haemophilia A có đột

biến ở intron 19 sẽ không thay đổi kích thước của sản phẩm

PCR sau khi ủ với enzyme Hind III. Ngược lại những

người bình thường khoẻ mạnh hoặc những bệnh nhân

Haemophilia A không có đột biến ở intron 19 sẽ có một

hoặc hai vị trí nhận biết đặc hiệu với enzyme giới hạn Hind

III cắt tạo ra 2 băng kích thước 480 và 250 bp hoặc 3 băng

kích thước 480, 160 và 90 bp (1, 2). Tất cả các mẫu bệnh

nhân Haemophilia A (11/11 hay 100%) đem nghiên cứu,

đều bị cắt bởi enzyme Hind III ở 37oC sau 12 giờ (giếng 2,

4 và 6, Hình 2). Kết quả nghiên cứu trên 11 bệnh nhân

Haemophilia A cho thấy không phát hiện được đột biến ở

intron 19 gen mã hoá cho yếu tố VIII. Kết quả này có thể

được giải thích là do đột biến ở intron 19 không phổ biến ở

bệnh nhân Haemophilia A của Việt nam hoặc chúng tôi cần

tăng số mẫu nghiên cứu lên nhiều hơn nữa.

Hình 2. PCR-RFLP với intron 19(Haemophilia A).

Giếng 1: Sản phẩm PCR được khuyếch đại với enzyme Taq

ADN polymerase. (ADN khuôn được tách chiết từ máu của

người bình thường khoẻ mạnh).

Giếng 2: Sản phẩm PCR (ở giếng 1) sau khi cắt bằng

enzyme giới hạn Hind III.

Giếng 3: Sản phẩm PCR được khuyếch đại với enzyme

Deep Vent ADN polymerase (ADN khuôn được tách chiết

từ máu của người bình thường khoẻ mạnh).

Giếng 4: Sản phẩm PCR (ở giếng 3) sau khi cắt bằng

enzyme Hind III.

Giếng 5: Sản phẩm PCR được khuyếch đại với enzyme

Deep Vent ADN polymerase (ADN khuôn được tách chiết

từ máu của bệnh nhân Haemophilia A).

Giếng 6: Sản phẩm PCR (ở giếng 5) sau khi cắt bằng

enzyme Hind III .

Mr: Thang ADN chuẩn 100bp.

KẾT LUẬN

• Hình thành được qui trình phát hiện các đột biến ở

intron 18 và 19 của gen mã hoá cho yếu tố VIII, bệnh

Haemophilia A bằng kỹ thuật PCR-RFLP với Deep Vent

ADN polymerase.

• 8/19 (42%) số bệnh nhân Haemophilia A được nghiên

cứu có mang đột biến ở intron 18 gen mã hoá cho yếu tố

VII và không có mẫu nào mang đột biến ở intron 19.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Bowen DJ. (2002). Haemophilia A and haemophilia

B: molecular insights. Mol. Pathol. 55:1-8.

2. Kogan SC, Doherty M and Gitschier J (1987). An

improved method of prenatal diagnosis of nenetics disease

by analysis of amplified DNA sequences-application to

haemophilia A. N. Engl. J. Med. 317:985-990.

3. Rolfs AI. Schuller U. Finckh I. Weber-Rolfs (1992).

PCR: Clinical Diagnostics and Research. Springer-Verlag

Berlin, Heidelberg.

4. Catalog and Technique Reference 2000-2001. New

England Biolab.

5. Sambrook J, Frisch EF, and Maniatis T. (1989).

Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press,

USA.

6. Nguyễn Hoài Giang, Nguyễn Hạnh Phúc, Lê Thị Kim

Tuyến. (2002). Tối ưu hoá điều kiện phản ứng PCR sử

dụng Deep vent ADN polymerase để khuyếch đại gen NS4

của virút hepatitis C. Tạp chí Nghiên cứu Y học. 1: 9-11.

LỜI CẢM ƠN

Các tác giả xin cảm ơn Viện Huyết học và Truyền máu

Trung ương đã cung cấp các mẫu máu của bệnh nhân

Haemophilia A.

Các tác giả cũng xin cảm ơn TS. Nguyễn Hạnh Phúc (Viện

Vệ sinh Dịch tễ Trung ương) đã hỗ trợ kinh phí cho nghiên

cứu này.

SUMMARY

Detection of mutations (in Introns 18 and 19) from

haemophilia patients by PCR-RFLP with DEEP VENT

DNA POLYMERASE

Haemophilia A is an X-linked recessive genetic disorder

caused by the mutations in the factor VIII gene. The

incidence of haemophilia A is from 1/5000 to 1/10.000

males births. The changes of factor VIII gene are the points

mutations and inversion mutation in intron 22. Genetics

analysis in haemophilia A families is widely carried out by

linkage analysis by allelotyping using restriction fragment

length polymorphism (RFLP) and microsatellite repeat

(STR) markers to track chromosomes linked with the

disease. PCR-RFLP is a fast and convenient method to

detect the mutations in the factor VIII gene.

Deep Vent DNA polymerase is purified from the strain of

E.coli that carries the Deep Vent DNA polymerase gene of

Pyrococcus species GB-D. The native organism was

isolated from a submarine thermal vent at 2010 meters and

it able to grow at temperature as high as 104oC. Deep Vent

DNA polymerase is a high-fidelity thermophilic DNA

polymerase. The fidelity of Deep Vent DNA polymerase is

derived in part from an integral 3’-5’ proofreading

exonuclease activity.

In this study, we applied the PCR-RFLP technique with

Deep Vent DNA polymerase to detect the mutations in

introns 18 and 19 of factor VIII gene from Vietnamese

haemophilia A patients. Our data showed that 8/19 (42%)

patients have the mutation in intron 18 and none of them

has the mutation in intron 19. This method can be used for

carrier analysis and prenatal diagnosis of haemophilia A.

Người thẩm định nội dung khoa học: GS.TS. Lê Đình

Lương