NGHIÊN CỨU SỰ ĐA HÌNH DI TRUYỀN CỦA MỘT
SỐ LOÀI THỰC VẬT THU THẬP TỪ MÃ ĐÀ VÀ
CÁT TIÊN (TỈNH ĐỒNG NAI)
Hà Thị Phúc, Đặng Quang Hưng, Phạm Bảo Yên,
Nguyễn Quang Huy, Nguyễn Vũ Minh Hạnh, Phan
Tuấn Nghĩa
Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà
Nội.
1. MỞ ĐẦU
Lâm trường Mã Đà thuộc tỉnh Đồng Nai là một trong
những khu vực chịu nhiều tác động của các yếu tố môi
trường khắc nghiệt, đặc biệt là các tác động của chiến tranh
hoá học. Tuy vậy, cho đến nay vẫn còn rất ít công trình
nghiên cứu về các tác động này lên các sinh vật có mặt ở
đây. Trong một công trình công bố gần đây [4], chúng tôi
đã phát hiện thấy có những sai khác về hoạt độ một vài
enzym bảo vệ oxy hoá cũng như phổ băng ADN giữa các
mẫu ốc Bradybaena similaris thu thập được từ khu vực này
so với mẫu ốc cùng loài thu thập được từ Vườn Quốc gia
Cát Tiên (Tỉnh Đồng Nai) là nơi có điều kiện sinh thái
tương tự Mã Đà nhưng ít bị tác động của chiến tranh hoá
học. Để tiếp tục đóng góp những dẫn liệu cho việc đi sâu
đánh giá về tác động của điều kiện môi trường lên hệ gen
các loài sinh vật ở vùng này, chúng tôi đã mở rộng nghiên
cứu tìm hiểu về những khác biệt trong phổ băng ADN giữa
một số loài thực vật thu thập từ hai vùng vừa nêu. Bài báo
này giới thiệu một phần các kết quả thu được.
2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU
2.1.Nguyên liệu
Các mẫu thực vật dùng cho nghiên cứu bao gồm các loài:
Trung quân (Ancistocladus tectorius), Quế bì
(Cinnamomum cassia), Săng mây (Segeraea elliptica) và
Lộc Vừng (Barringtonia acutangula). Mẫu được thu thập
thành từng cặp loài từ Lâm trường Mã Đà và rừng Quốc gia
Cát Tiên, được TS. Trần Đình Nghĩa giúp định tên khoa
học.
Các oligonucleotide (mồi) được mua của Operon
Technologies Inc. (Mỹ), các hoá chất còn lại dùng cho
nghiên cứu đều đạt độ tinh khiết phân tích.
Bảng 1: Các mồi ngẫu nhiên được sử dụng trong các phản
ứng RAPD
2.2.Phương pháp
- Tách chiết ADN tổng số từ các mẫu thực vật theo quy
trình của Stacey và Isaac [7] có cải tiến.
- Định lượng ADN bằng đo độ hấp phụ tử ngoại ở bước
sóng 260 nm (A260)
- Phân tích phổ băng ADN bằng phương pháp các đoạn
ADN đa hình được nhân bản ngẫu nhiên (RAPD) bằng kỹ
thuật PCR. Một phản ứng RAPD-PCR bao gồm đệm PCR
1x và nồng độ cuối cùng của các chất thành phần là: MgCl2
2,5 mM, dNTPs 0,2 mM, mồi ngẫu nhiên 0,5 mM, 2,5 đơn
vị Taq ADN polymerase và 10-20 ng ADN khuôn. Phản
ứng được thực hiện qua 45 chu kì lặp lại của 3 bước chính: biến tính ADN khuôn ở 940C, 35 giây, gắn mồi ở 370C, 30 giây và kéo dài chuỗi ở 720C, 1 phút. Sản phẩm của RAPD
sau đó được điện di trên gel agarose 2%, nhuộm băng bằng
ethidium bromide và chụp ảnh để phân tích.
3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Xây dựng quy trình tách chiết ADN từ mẫu thực
vật
Để tách chiết ADN từ các mẫu thực vật chúng tôi đã sử
dụng qui trình của Stacey và Issac [7], là qui trình đã được
dùng với nhiều đối tượng thực vật khác nhau. Tuy vậy khi
áp dụng qui trình tách chiết này, chúng tôi không thu được
ADN, vì vậy chúng tôi đã thay đổi một số thành phần đệm
tách chiết, cụ thể là tăng nồng độ EDTA trong hệ đệm lên
50 mM nhằm loại trừ hoàn toàn tác động phân cắt ADN bởi
các nuclease nội bào, tăng nồng độ NaCl từ 0,7M lên gấp
đôi nhằm hạn chế sự tạo phức giữa ADN và CTAB, bổ
sung thêm polyvinyl pirrolidone (PVP) và sodium dodecyl
sulfate (SDS) để làm tăng khả năng giải phóng ADN cũng
như tăng kết tủa một số hợp chất polyphenol, polysacharide
và protein...
Qui trình tách chiết tóm tắt gồm các bước: mẫu lá được
nghiền với nitơ lỏng, sau đó bổ sung đệm nghiền (Tris HCl
100 mM, pH 8.0, EDTA 50 mM pH8.0, NaCl 1,4 M;
CTAB 2%; PVP 2%; SDS 2%; beta-mecaptoethanol 2%) đã được làm nóng tới 650C. Hỗn hợp được ủ ở 650C trong 1
giờ kết hợp lắc nhẹ. Sau khi để nguội đến nhiệt độ phòng,
bổ sung một thể tích tương đương hỗn hợp phenol:
chloroforrm: isoamylalcohol (trộn theo tỷ lệ 25:24:1 về thể
tích), lắc mạnh mẫu trong 5 phút và ly tâm ở 6000 vòng/
phút ở 250C trong 10 phút để thu phần dịch trên tủa. Bổ
sung tiếp 0,1 thể tích tương ứng NaCl 3M cùng hai thể tích ethanol tuyệt đối và chuyển nhanh sang ủ ở –200C trong 1
giờ. Ly tâm hỗn hợp để thu tủa ADN ở 14.000 vòng/phút ở 40C trong 15 phút. Hoà tan kết tủa trong TE (Tris-HCl 10
mM pH 8,0 có chứa EDTA 2 mM), loại ARN bằng RNAse,
tái kết tủa ADN bằng 0,7 lần thể tích isopropanol và hoà
tan trở lại trong đệm TE.
Kết quả đo độ hấp phụ ở bước sóng 260 nm (A260) và 280
nm (A280) của các chế phẩm ADN thu được (bảng 2) chứng
tỏ sự có mặt của ADN, tỷ số A260/A280 của cả 4 đối tượng
đạt khoảng 1,9 đến 2,1. Khi phân tích chất lượng ADN
bằng điện di trên gel agarose (hình 1) cho thấy tất cả 4 mẫu
thực vật chọn nghiên cứu thu ở Mã Đà hay Cát Tiên đều
chỉ chứa một băng ADN có kích thước lớn, không lẫn
ARN. Các kết quả phân tích về độ hấp thụ tử ngoại và điện
di khẳng định qui trình với các cải tiến về thành phần cũng
như bước tách chiết kể trên đã cho phép thu được chế phẩm
ADN có chất lượng tốt.
Bảng 2: Độ hấp phụ ở bước sóng 260 nm và 280 nm của
các chế phẩm ADN thực vật
Hình 1: Điện di gel agarose các chế phẩm ADN thực vật
A: Trung Quân , B: Quế Bì,
C: Lộc Vừng, D: Săng Mây.
M: Thang chuẩn ADN l HindIII
MĐ: Mã Đà, CT: Cát Tiên
2. Nghiên cứu phổ băng ADN của các mẫu thực vật thu
thập từ Mã Đà và Cát Tiên
Để thu nhận phổ băng ADN của 4 loài thực vật đã lựa chọn
chúng tôi đã sử dụng kỹ thuật RAPD- PCR với các mồi
ngẫu nhiên khác nhau có ký hiệu và trình tự được ghi trong
bảng 1. Kết quả điện di sản phẩm RAPD-PCR của cả 4 loài
với các mồi khác nhau (hình 2, 3, 4 và 5) đều cho thấy có
tính đồng hình cao về phổ băng ADN giữa các mẫu cùng
loài thu nhận từ Mã Đà và Cát Tiên. Tuy vậy, chúng tôi
cũng đã bước đầu phát hiện được một số băng đa hình giữa
các mẫu cùng loài thu được từ hai vùng này.
Khi sử dụng các mồi D5, D6, D7, OPA4, OPA10 và
OPA12 để tìm hiểu phổ băng của loài Trung Quân (hình 2)
chúng tôi đã phát hiện thấy rằng mồi D6 cho kết quả đa
hình rõ nét nhất, trong đó có 2 băng với kích thước khoảng
0,8 kb và 1,8 kb chỉ thấy ở mẫu Mã Đà và các băng có kích
thước khoảng 0,8 kb và 1,0 kb chỉ xuất hiện ở mẫu Cát
Tiên. Ngoài ra mồi D7 cho 2 băng với kích thước khoảng
1,3 kb và 1,4 kb chỉ có ở mẫu Mã Đà. Tương tự, mồi
OPA12 cho một băng đa hình với kích thước khoảng 1,3 kb
chỉ có ở mẫu Cát Tiên.
Đối với loài Quế bì, chúng tôi cũng đã phát hiện được 2
băng đa hình với kích thước khoảng 1,4 kb với mồi OPA4
và OPA12, một băng có kích thước khoảng 1,6 kb với mồi
OPA10. Các băng này chỉ có ở mẫu Mã Đà, không có ở
Mẫu Cát Tiên (hình 3).
Các mồi OPA4, OPA10 và OPA12 khi được sử dụng với
loài Lộc Vừng và Săng Mây đã không có băng nhân bản
điển hình vì vậy chúng tôi đã sử dụng các mồi P4, P10,
Z16, Z17, Z18 và Z19. Kết quả thu được với loài Lộc Vừng
(hình 4) cho thấy có 3 băng đa hình được thể hiện, trong đó
các băng có kích thước khoảng 2 kb với mồi Z17 và 1 kb
với mồi Z18 chỉ thấy ở mẫu Mã Đà còn băng 1 kb với mồi
Z19 chỉ có ở mẫu Cát Tiên.
Tương tự, chúng tôi cũng đã phát hiện được 4 băng đa hình
ở mẫu Săng Mây (hình 5), cụ thể các băng có kích thước
khoảng 1,3 kb, 1,5 kb với mồi P4 và băng 1,7 kb với mồi
Z18 chỉ thấy ở mẫu Mã Đà còn băng có kích thước khoảng
1,4 kb với mồi P4 chỉ xuất hiện ở mẫu Cát Tiên
4. THẢO LUẬN
Qua nghiên cứu này chúng tôi đã xây dựng được một qui
trình tách chiết ADN cải tiến cho các mẫu thực vật. Mặc
dầu cho đến nay đã có rất nhiều qui trình tách chiết ADN
khác nhau từ nguyên liệu thực vật [5, 7], nhưng sự đa dạng
về tính chất của mẫu thực vật, đặc biệt là với mẫu có chứa
hàm lượng cao các chất polyphenol, polysacharide...thì
những qui trình thông thường ít khi cho kết quả. Chính vì
vậy, những cải tiến trong qui trình mà chúng tôi thiết lập
như loại bỏ sự phân cắt của nuclease, kết tủa chọn lọc các
tạp chất thông qua sự phối hợp CTAB và nồng độ NaCl
cũng như bổ sung SDS đã cho phép chúng tôi thu nhận
được chế phẩm ADN chất lượng tốt từ 4 mẫu thực vật khác
nhau và qui trình được thiết lập có thể dùng cho việc tách
chiết ADN từ nhiều mẫu thực vật khác.
RAPD là kỹ thuật đã được sử dụng khá phổ biến trong
nghiên cứu tính đa hình di truyền của các loài sinh vật [1,
2, 3, 6, 8], đặc biệt khi mà hệ gen của chúng còn ít được
nghiên cứu về trình tự [4, 8]. Bằng việc sử dụng kỹ thuật
này, chúng tôi [4] đã phát hiện thấy loài ốc cạn Bradybaena
similaris được thu từ Mã Đà có những sai khác về phổ băng
ADN so với phổ băng của cùng loài ốc này nhưng được thu
được từ Cát Tiên. Ngoài ra, chúng tôi cũng đã phát hiện
thấy có sự khác biệt về hoạt độ của enzym catalase,
superoxit dismuatse, NADH oxidase cũng như phổ băng
protein giữa hai loại mẫu ốc này.
Các số liệu thu được về phổ băng ADN của Trung Quân,
Quế Bì, Lộc Vùng và Săng Mây trên đây là những dẫn liệu
bổ sung về những sai khác trong hệ gen của các sinh vật
cùng loài nhưng sống trong các điều kiện môi trường khác
nhau. Tuy vậy, liệu những sai khác này có liên quan và liên
quan như thế nào đến các yếu tố môi trường hay không là
vấn đề cần được tiếp tục nghiên cứu. Xác định trình tự của
những đoạn ADN sai khác cũng như nghiên cứu các
protein được biểu hiện có thể là cơ sở tốt nhất để trả lời câu
hỏi vừa nêu.
Hình 2: Điện di gel agarose các sản phẩm RAPD-PCR của
mẫu Trung Quân với các mồi D5, D6, D7, OPA4, OPA10
và OPA12
M: Thang chuẩn ADN 1 kb, MĐ: Mã Đà, CT: Cát Tiên
Hình 3: Điện di gel agarose sản phẩm RAPD-PCR của mẫu
Quế Bì với các mồi OPA4, OPA10 và OPA12
M: Thang chuẩn ADN 1 kb, MĐ: Mã Đà, CT: Cát Tiên
Hình 4: Điện di gel agarose sản phẩm RAPD-PCR của mẫu
Lộc Vừng với các mồi P4, P10, Z16, Z17, Z18 và Z19.
M: Thang chuẩn ADN 1 kb, MĐ: Mã Đà, CT: Cát Tiên
Hình 5: Điện di gel agarose sản phẩm RAPD-PCR của mẫu
Săng Mây với các mồi P4, P10, Z16, Z17, Z18 và Z19.
M: Thang chuẩn ADN 1 kb, MĐ: Mã Đà, CT: Cát Tiên
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Alberto, F., Santos, R. (1997). DNA extraction and
RAPD markers to assess the genetic similarity among
Gelidium sesquipedale population. J. Phycol. 33:706-710
2. Bazzicalupo, M. and Renato, F. (1996). The Use of
RAPD for generating specific DNA probes for
microorganisms. In: Species Diagnostics Protocols. Ed.
Clapp, J.P. Humana Press Inc. New Jersey. pp: 155-175.
3. Drrelkl, L. E., Kevin, D. R. and Srodney, L. H. (1993).
Artifactual variation in RAPD banding patterns.
Biotechniques, 14: 214-217,
4. Đặng Quang Hưng, Nguyễn Quang Huy, Phan Tuấn
Nghĩa (2004). So sánh hoạt độ của một số enzyme bảo vệ
tổn thương oxy hoá và phổ băng ADN của ốc Bradybaena
similaris thu thập từ Mã Đà và Cát Tiên, Tỉnh Đồng Nai.
Tạp
chí Di truyền và ứng dụng: số 2: 32-38
5. Mien, T. G. van de Ven, Partrick G. L., and Rex, M. B.,
(1996). Isolation and purification of plant nucleic acids:
Genomic and Chloroplast DNA. In Species Diagnostics
Protocols, 1, ed. Clapp, J.P., Humana Press Inc. New
Jersey. pp.
01-14.
6. Quyền Đình Thi, Đào Thị Tuyết, Lê Thị Thu Giang,
Nguyễn Thị Thảo, Phạm Anh Tuấn (2003). Sử dụng
microsatterlite, mtRFLP và RAPD để phân tích tính đa hình
tôm sú. Tạp chí Công nghệ Sinh học, 1: 287-298
7. Stacey, J. and Isaac, P. G. (2000).Isolation and
purification of DNA from plants. Nucleic Acid Protocols
Handbook, Ed. Rapley, R. Humana Press Inc. New Jersey
pp. 13-16.
8. Wyss, P. (1996). The use of RAPD for isolate
identification of Arbuscular Mycorrhizal fungi. In Species
Diagnostics Protocols. Ed. Clapp, J.P., Humana Press Inc.
New Jersey. pp: 199-208.
SUMMARY
Investigation of DNA polymorphism of some plant
species collected from mada and catien regions (in
Dongnai province)
A modified protocol for isolation of DNA from some plants
was reported. Modifications consisted of i) the buffer
composition with high concentrations of EDTA (up to 50
mM) and NaCl up to 1.4M, addition of polyvinyl
pirrolidone (PVP), sodium dodecyl sulfate and ii) change in
the way to collect the DNA from isolation mixture. Four
plant species: Ancistocladus tectorius, Cinnamomum
cassia, Segeraea elliptica and Barringtonia acutangula
were collected from Mada and Catien regions for the study
to compare DNA banding patterns between each pair of the
species by using RAPD-PCR techniques. The obtained
results showed that all the four species collected from
Mada region showed some difference in DNA banding
patterns compared to those of the same species collected
from Catien region, indicating possible effects of
environmental factors on the genome of the species.
However, further investigation is needed to elucidate the
relations between the change in their genome and
influencing environmental factors.
Người thẩm định nội dung khoa học: PGS. TS. Trịnh Đình
Đạt
