BÁO CÁO KHOA HỌC: "PHÁT HIỆN VIRUT GÂY BỆNH ĐẦU VÀNG TRÊN TÔM SÚ BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR"

PHÁT HIỆN VIRUT GÂY BỆNH ĐẦU VÀNG TRÊN

TÔM SÚ BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR

Phan Quốc Việt, Nguyễn Hoàng Chương, Phạm Anh

Tuấn, Nguyễn Văn Hảo, Hồ Huỳnh Thuỳ Dương

Khoa Sinh học - Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên -

ĐHQG Tp HCM

Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thuỷ Sản I

Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thuỷ Sản II

TỔNG QUAN

Virut gây bệnh đầu vàng (YHV-Yellow Head Virus), tìm

thấy đầu tiên tại Thái Lan vào đầu những năm 1990, có vật

chất di truyền là ARN. Đây là một trong những tác nhân

chính gây bệnh đầu vàng ở tôm cùng với một số virut

tương cận như GAV (Gill-Associated Virus) và LOV

(Lymphoid Organ Virus). YHV tác động trên tôm chủ yếu

ở giai đoạn tôm con đến tôm gần trưởng thành. Tôm bệnh

sẽ chết hàng loạt sau 2 - 4 ngày, với sự xuất hiện màu vàng

ở phần đầu ngực và sự nhạt màu của toàn cơ thể. Các quan

sát mô bệnh học cho thấy tình trạng hoại tử của những tế

bào có nguồn gốc ngoại phôi bì và trung phôi bì cùng với

sự hình thành những thể vùi ưa kiềm trong tế bào chất.

Với khả năng lây nhiễm và gây chết nhanh, bệnh gây ảnh

hưởng không nhỏ đến nền kinh tế của những quốc gia có

nghề nuôi tôm phát triển. Do chưa có thuốc chữa trị đặc

hiệu nên công tác phòng ngừa và chẩn đoán bệnh sớm là rất

cần thiết. Các phương pháp chẩn đoán truyền thống như mô

bệnh học hay dựa trên kinh nghiệm của người nuôi không

cho phép phát hiện sớm và đặc hiệu tác nhân gây bệnh.

Nhiều phương pháp phân tử như lai tại chỗ, Western blot,

RT-PCR được phát triển nhằm khắc phục những nhược

điểm vừa kể trong việc phát hiện YHV trên tôm sú.

Chúng tôi thiết lập quy trình RT-PCR trên ARN YHV đồng

thời xác định tính đặc hiệu và độ nhạy của quy trình. Quy

trình sau đó được áp dụng để phát hiện YHV trong 20 mẫu

tôm sú nghi nhiễm.

VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP

Mẫu tôm: Các mẫu tôm nghi nhiễm YHV và ARN YHV do

Viện NCNT Thuỷ Sản II cung cấp. Các mẫu này được bảo quản trong cồn tuyệt đối và giữ ở -200C.

Phương pháp tách chiết ARN (TriZol): Mẫu tôm được

nghiền trong dung dịch TriZol (guanidinium thiocyanate,

phenol pH8, glycerol, sodium acetate). 200 l dịch nghiền

được ly giải và loại protein tiếp tục bằng dung dịch TriZol.

Sau đó ARN được tủa bằng isopropanol. Sau ly tâm, cặn

được làm khô và hòa lại trong 50 l H2O đã xử lý DEPC

(Diethyl pyrocarbonate)

Đoạn mồi cho phản ứng RT-PCR: Chúng tôi sử dụng các

phần mềm Annhyb và ClustalX để thiết kế các đoạn mồi

dùng cho phản ứng RT-PCR dựa trên các trình tự hệ gen

YHV được công bố (Tang & Lightner, 1999). Các đoạn

mồi này gồm đoạn mồi xuôi YHVf và các đoạn mồi ngược

YHVr và YHVi với trình tự như sau : YHVf 5'-GTGACC

ATYTYAACTGCAAGATCTCACGRCAACTCA-3',

YHVr 5'-CTGCYACTGAATTTCC

GACGAGAGTGTTAGGAGG-3', YHVi 5'-

GTCTCACACACATGGACTTC-3'.

đoạn mồi do hãng GENSET OLIGO (Singapore) tổng hợp

và cung cấp.

Phương pháp RT-PCR : bao gồm hai bước RT và PCR.

Trong bước RT, phản ứng được thiết lập với1 hạt bead RT-

PCR (Amersham), 1 l đoạn mồi YHVr, 19 l ARN, ủ ở

420C-45 phút. Để tiến hành phản ứng PCR, cho thêm vào

hỗn hợp RT 2 l đoạn mồi YHVf, 1.5 l đoạn mồi YHVi

và nước vừa đủ 50 l. Chương trình PCR : 950C-3'; 15 chu

kỳ 940C-30", 620C-30", 720C-30"; 36 chu kỳ 940C-30", 480C-30", 720C-30"; 720C-6'.

Phương pháp Southern Blot : Các sản phẩm PCR sau điện

di và biến tính được chuyển lên màng lai nylon (Hybond

N+ - Amersham) và tiến hành lai với mẫu dò là trình tự

đoạn mồi YHVi được đánh dấu bằng DIG - dUTP. Bộ kit

DIG Nucleic Acid Detection (Boehringer Mannheim) được

sử dụng để phát hiện các phân tử lai.

KẾT QUẢ - THẢO LUẬN

Kết quả thiết kế đoạn mồi và chương trình PCR tương ứng:

Các đoạn mồi thiết kế cho phản ứng RT và PCR dùng để

nhân bản một trình tự trên ARN hệ gen của YHV có vị trí

bắt cặp dự kiến theo sơ đồ sau (hình 1).

Hình 1 : Sơ đồ bắt cặp các đoạn mồi và sản phẩm PCR từ

ARN hệ gen YHV

Chúng tôi kiểm tra hiệu quả nhân bản của các cặp đoạn mồi

thiết kế cũng như các chương trình PCR tương ứng trên

ARN YHV có (hình 3) và không có (hình 2) kết hợp với

dịch chiết tôm. Kỹ thuật PCR sử dụng ở đây là kỹ thuật

PCR semi-nested, gồm hai bước : (1) PCRI cho phép nhân

bản đoạn ADN có kích thước 303 bp, (2) PCRII nhân bản

đoạn ADN có kích thước 186 bp từ sản phẩm PCRI.

Hình 2 : Kết quả điện di trên gel agarose 2% các sản phẩm

PCRI và II từ RNA YHV.

1,2 : Sản phẩm PCRI (303 bp);

3 : Thang X 174 Hae-III;

4,5 : Sản phẩm PCRII (186 bp).

Hình 3 : Kết quả điện di trên gel agarose 2% các sản phẩm

PCRII từ RNA YHV trộn với dịch chiết tôm

1 : Thang 186 bp

2, 3, 4, 5 : 1 l, 5 l, 10 l, 15l RNA YHV trộn với dịch

chiết tôm

Các kết quả trên cho thấy tín hiệu dương tính nhận được có

cường độ cao, với kích thước như dự kiến ; đồng thời

không thấy sản phẩm ký sinh. Phản ứng tiến hành trên dịch

chiết tôm kết hợp với ARN YHV cũng cho kết quả dương

tính rõ và có cường độ tương ứng với hàm lượng ARN

trong mẫu. Điều này cho thấy đoạn mồi và chương trình

PCR hoạt động tốt.

Tính đặc hiệu của sản phẩm PCR : Chúng tôi sử dụng mẫu

dò đặc hiệu cho YHV để kiểm tra tính đặc hiệu của các sản

phẩm PCR nhận được. Phản ứng Southern blot được tiến

hành trên các sản phẩm PCR khác nhau, được nhân bản từ

ADN MBV (Monodon Baculovirus), ARN YHV và ADN

WSSV (White Spot Syndrome Virus).

Hình 4 A, B : Kết quả điện di và Southern blot với mẫu dò

đặc hiệu cho YHV

1,2 : Sản phẩm PCR từ MBV; 3,4 : Sản phẩm PCRI từ

YHV; 5: Thang X174- HaeIII; 6,7: Sản phẩm PCRII từ

YHV; 8,9: Sản phẩm PCR từ WSSV.

Kết quả (hình 4 A và B) cho thấy tín hiệu lai là hoàn toàn

đặc hiệu cho các mẫu YHV.

Độ nhạy của quy trình RT-PCR : Độ nhạy của quy trình

được xác định bằng cách tiến hành phản ứng RT-PCR trên

ARN YHV (30 g/l) pha loãng nhiều bậc.

Hình 5 : Kết quả điện di trên gel agarose 2% các sản phẩm

PCR từ RNA YHV pha loãng

6: Thang 100 bp; 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11: Các sản phẩm

PCR ứng với độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-

6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10 của RNA YHV

Kết quả trên cho thấy quy trình có khả năng phát hiện được

6 pg ARN YHV hiện diện trong mẫu.

Kết quả phát hiện YHV trên 20 mẫu tôm nghi nhiễm bệnh

đầu vàng

Quy trình đã thiết lập trên ARN YHV được áp dụng để

phát hiện YHV trên 20 mẫu tôm nghi nhiễm, kết quả được

trình bày trong hình 6 cho thấy có 2/20 mẫu khảo sát cho

kết quả dương tính. Các mẫu còn lại, tuy đã được chẩn

đoán mô học là dương tính với bệnh đầu vàng nhưng lại

cho kết quả RT-PCR âm tính. Điều này có thể do nhiều

nguyên nhân : (1) đoạn mồi không phát hiện được các biến

chủng của YHV địa phương, (2) Mẫu không được bảo quản

tốt dẫn đến sự phân hủy ARN virut, (3) Bệnh do một virut

tương cận nhưng không phải là YHV.

Hình 6: Kết quả phát hiện YHV trên 20 mẫu tôm nghi

nhiễm đầu vàng.

11: Thang 100 bp ; 1 - 21: Sản phẩm PCR từ các mẫu tôm

nghi nhiễm.

KẾT LUẬN:

- Quy trình RT-PCR do chúng tôi thiết lập phát hiện được

YHV với độ đặc hiệu cao và độ nhạy là 6pg ARN YHV

tinh sạch.

- Trên 20 mẫu tôm sú nghi nhiễm, quy trình phát hiện 02

mẫu nhiễm YHV.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1- Cowley J.A., Dimmock C.M., Wongteerasupaya C.,

Boonsaeng V., Panyim S. & Walker P.J. 2001. Yellow

head virus from Thailand and gill-associated virus from

Australia are closely related but distinct prawn viruses. Dis.

Aquat. Org.,

2- Tang K.F.J. & Lightner D.V. 1999. A yellow head virus

gene probe : nucleotide sequence and application for in situ

hybridization. Dis. Aquat. Org., 35:165-173.

3- Wongteerasupaya C., Tongchuea W., Boonsaeng V.,

Panyim S., Tassanakajon A., Withyachumnarnkul B. &

Flegel T.W. 1997. Detection of yellow-head virus (YHV)

of Penaeus monodon by RT-PCR amplification. Dis.

Aquat. Org., 31:181-186.

SUMMARY

Detection of yellow head virus (yhv) in black tiger

shrimp (penaeus monodon) by RT-PCR

Yellow head disease (YHD) is one of the most threatening

epidemic diseases in shrimp rearing. Data collected in some

coastal regions of Viet Nam in 2001 showed an infection

rate of about 50-60% in post larvae.

We set up a RT-PCR-based protocol for the detection of

YHV (Yellow Head Virus), one of the main causing agents

of YHD generally called YHCV (Yellow Head Complex

Viruses). We designed primers based on genomic sequence

previously reported (Tang & Lightner, 1999).

Amplification reaction with these primers showed high

specificity and a detection limit of 6pg of pure YHV RNA.

On 20 shrimp samples collected from rearing ponds, RNA

was extracted by Trizol method and amplified using the

established protocol. We obtained two positive signals with

low intensity. This low positive rate may be due to high

genetic polymorphism of YHV or the presence of other

members of the YHCV.

ACKNOWLEDGMENTS: We gratefully acknowledge J.A.

Cowley who provided YHV RNA.

Ngưòi thẩm định nội dung khoa học: GS. Lê Đình Lương