PHÁT HIỆN VIRUT GÂY BỆNH ĐẦU VÀNG TRÊN
TÔM SÚ BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR
Phan Quốc Việt, Nguyễn Hoàng Chương, Phạm Anh
Tuấn, Nguyễn Văn Hảo, Hồ Huỳnh Thuỳ Dương
Khoa Sinh học - Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên -
ĐHQG Tp HCM
Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thuỷ Sản I
Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thuỷ Sản II
TỔNG QUAN
Virut gây bệnh đầu vàng (YHV-Yellow Head Virus), tìm
thấy đầu tiên tại Thái Lan vào đầu những năm 1990, có vật
chất di truyền là ARN. Đây là một trong những tác nhân
chính gây bệnh đầu vàng ở tôm cùng với một số virut
tương cận như GAV (Gill-Associated Virus) và LOV
(Lymphoid Organ Virus). YHV tác động trên tôm chủ yếu
ở giai đoạn tôm con đến tôm gần trưởng thành. Tôm bệnh
sẽ chết hàng loạt sau 2 - 4 ngày, với sự xuất hiện màu vàng
ở phần đầu ngực và sự nhạt màu của toàn cơ thể. Các quan
sát mô bệnh học cho thấy tình trạng hoại tử của những tế
bào có nguồn gốc ngoại phôi bì và trung phôi bì cùng với
sự hình thành những thể vùi ưa kiềm trong tế bào chất.
Với khả năng lây nhiễm và gây chết nhanh, bệnh gây ảnh
hưởng không nhỏ đến nền kinh tế của những quốc gia có
nghề nuôi tôm phát triển. Do chưa có thuốc chữa trị đặc
hiệu nên công tác phòng ngừa và chẩn đoán bệnh sớm là rất
cần thiết. Các phương pháp chẩn đoán truyền thống như mô
bệnh học hay dựa trên kinh nghiệm của người nuôi không
cho phép phát hiện sớm và đặc hiệu tác nhân gây bệnh.
Nhiều phương pháp phân tử như lai tại chỗ, Western blot,
RT-PCR được phát triển nhằm khắc phục những nhược
điểm vừa kể trong việc phát hiện YHV trên tôm sú.
Chúng tôi thiết lập quy trình RT-PCR trên ARN YHV đồng
thời xác định tính đặc hiệu và độ nhạy của quy trình. Quy
trình sau đó được áp dụng để phát hiện YHV trong 20 mẫu
tôm sú nghi nhiễm.
VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP
Mẫu tôm: Các mẫu tôm nghi nhiễm YHV và ARN YHV do
Viện NCNT Thuỷ Sản II cung cấp. Các mẫu này được bảo
quản trong cồn tuyệt đối và giữ ở -200C.
Phương pháp tách chiết ARN (TriZol): Mẫu tôm được
nghiền trong dung dịch TriZol (guanidinium thiocyanate,
phenol pH8, glycerol, sodium acetate). 200 l dịch nghiền
được ly giải và loại protein tiếp tục bằng dung dịch TriZol.
Sau đó ARN được tủa bằng isopropanol. Sau ly tâm, cặn
được làm khô và hòa lại trong 50 l H2O đã xử lý DEPC
(Diethyl pyrocarbonate)
Đoạn mồi cho phản ứng RT-PCR: Chúng tôi sử dụng các
phần mềm Annhyb và ClustalX để thiết kế các đoạn mồi
dùng cho phản ứng RT-PCR dựa trên các trình tự hệ gen
YHV được công bố (Tang & Lightner, 1999). Các đoạn
mồi này gồm đoạn mồi xuôi YHVf và các đoạn mồi ngược
YHVr và YHVi với trình tự như sau : YHVf 5'-GTGACC
ATYTYAACTGCAAGATCTCACGRCAACTCA-3',
YHVr 5'-CTGCYACTGAATTTCC
GACGAGAGTGTTAGGAGG-3', YHVi 5'-
GTCTCACACACATGGACTTC-3'.
đoạn mồi do hãng GENSET OLIGO (Singapore) tổng hợp
và cung cấp.
Phương pháp RT-PCR : bao gồm hai bước RT và PCR.
Trong bước RT, phản ứng được thiết lập với1 hạt bead RT-
PCR (Amersham), 1 l đoạn mồi YHVr, 19 l ARN, ủ ở
420C-45 phút. Để tiến hành phản ứng PCR, cho thêm vào
hỗn hợp RT 2 l đoạn mồi YHVf, 1.5 l đoạn mồi YHVi
và nước vừa đủ 50 l. Chương trình PCR : 950C-3'; 15 chu
kỳ 940C-30", 620C-30", 720C-30"; 36 chu kỳ 940C-30",
480C-30", 720C-30"; 720C-6'.
Phương pháp Southern Blot : Các sản phẩm PCR sau điện
di và biến tính được chuyển lên màng lai nylon (Hybond
N+ - Amersham) và tiến hành lai với mẫu dò là trình tự
đoạn mồi YHVi được đánh dấu bằng DIG - dUTP. Bộ kit
DIG Nucleic Acid Detection (Boehringer Mannheim) được
sử dụng để phát hiện các phân tử lai.
KẾT QUẢ - THẢO LUẬN
Kết quả thiết kế đoạn mồi và chương trình PCR tương ứng:
Các đoạn mồi thiết kế cho phản ứng RT và PCR dùng để
nhân bản một trình tự trên ARN hệ gen của YHV có vị trí
bắt cặp dự kiến theo sơ đồ sau (hình 1).
Hình 1 : Sơ đồ bắt cặp các đoạn mồi và sản phẩm PCR từ
ARN hệ gen YHV
Chúng tôi kiểm tra hiệu quả nhân bản của các cặp đoạn mồi
thiết kế cũng như các chương trình PCR tương ứng trên
ARN YHV có (hình 3) và không có (hình 2) kết hợp với
dịch chiết tôm. Kỹ thuật PCR sử dụng ở đây là kỹ thuật
PCR semi-nested, gồm hai bước : (1) PCRI cho phép nhân