ỨNG DỤNG PCR/RFLP ĐỂ ĐIỀU TRA PHÂN TÍCH
KIỂU GEN GEN PROTEIN SỮA ( KAPPA - CASEIN
b-LACTOGLOBULIN ) Ở BÒ SỮA VIỆT NAM
Trịnh Thị Kim Thoa, Lê Thị Hằng, Phùng Thị Bích
Thuỷ, Nguyễn Anh,
Viện Công nghệ Sinh học, 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu giấy,
Hà nội
MỞ ĐẦU.
Nhằm thúc đẩy ngành chăn nuôi bò sữa ở nước ta, các nhà
chăn nuôi di truyền quần thể đã và đang tiến hành lai tạo ra
đàn bò sữa thuần chủng, bò lai 1/2, 3/4 và 5/8 máu Hà lan
thích nghi trong điều kiện chăn nuôi trang trại và bán trang
trại ở Việt nam.
Ngày nay bên cạnh phương pháp chọn giống phenotype,
việc nghiên cứu, ứng dụng các chỉ thị gen vào chương trình
giống động thực vật ngày càng phát triển [1, 2, 3, 4, 6, 7, 8,
9, 10]. Sử dụng các chỉ thị phân tử để kiểm tra, đánh giá
chọn lọc di truyền trong lai tạo bò sữa đã được triển khai tại
một số nước như Mỹ, Canada, Đan mạch, Nauy.... Ở nước
ta hướng nghiên cứu này mới được đề cập trong vài năm
gần đây [12, 13]. Người ta đã sử dụng biến thể BB của gen
Kappa - casein ( K-Cn ), -lactoglobulin (-Lg) là hai trong
số các gen được sử dụng như là một chỉ thị di truyền chọn
giống bò sữa. Thật vậy, các nhà nghiên cứu trước đây đã
chứng minh được vai trò của chúng liên quan tới chất
lượng sữa, chất lượng và năng suất pho mát [1, 2]. K-Cn
còn được coi là tiêu chuẩn chọn lọc kinh tế quan trọng để
nâng cao chất lượng sữa công nghiệp [ 9 ]. Chính vì lẽ đó,
chúng tôi đã tiến hành điều tra phân tích kiểu gen gen
kappa-casein, -lactoglobulin nhằm góp phần cùng các nhà
di truyền phenotype đánh giá chất lượng con giống trong
quá trình tạo giống.
Trong bài báo này chúng tôi trình bày một số kết quả điều
tra ban đầu về kiểu gen của gen K-Cn và -Lg ở đàn bò
đực, cái Hà lan hạt nhân tại các Trung tâm Giống và ở thế
hệ lai. Hy vọng những kết quả nhận được sẽ đóng góp phần
nào vào chương trình cải tạo đàn bò sữa ở nước ta.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Chúng tôi tiến hành điều tra phân tích gen K-Cn và -Lg ở
tinh trùng, máu của 45 bò sữa giống hạt nhân (Hà Lan,
Sind) và 84 bò lai (1/2, 3/4 và 5/8 máu Hà Lan ) nuôi
dưỡng tại Trung tâm Tinh Moncada, Trung tâm Giống và
Sữa Phù Đổng Hà Nội và Trung tâm nghiên cứu bò và
đồng cỏ Ba vì - Hà Tây.
- Tách chiết ADN từ máu bò theo phương pháp
proteinase K/phenol/chloroform [5].
- Mồi được tổng hợp trên máy pharmacia LKB, Gene
assmbler special tại Viện Công nghệ sinh học - TTKHTN
& CNQG.
- Cặp mồi 1 gồm 23 và 24 oligonucleotide dùng để nhân
đoạn ADN đặc hiệu thuộc gen K - Cn.
- Cặp mồi 2 gồm 25 oligonucletide dùng để nhân -lg.
Theo phương pháp của Sulimova có cải tiến [ 11 ], chúng
tôi đã tiến hành PCR để nhân đoạn gen K-Cn - 228 bp. Chu
trình Thermal cycle : biến tính sơ bộ: 7 phút ở 940C, mẫu
được nhân lên bởi 35 chu trình: biến tính 2 phút ở 940C,
đính mồi 1 phút 30 giây ở 570C, kéo dài 4 phút ở 720C.
Hỗn hợp PCR : 50 l, ( nồng độ MgCl2 : 3 mM, Taq-
polymerase: 2,5 đơn vị, d NTP: 0,5 mM, nồng độ ADN từ
0,5 - 1,0 g/ l ).
- 15 l sản phẩm PCR được cắt bằng 10 đơn vị của
enzym cắt Hind III hoặc pst I.
Chúng tôi đã tiến hành PCR để nhân đoạn gen -Lg - 262
bp theo phương pháp của Medrano [ 7 ]:
Mẫu được nhân lên bởi 35 chu trình [ biến tính 45 giây ở
940C, đính mồi 1 phút ở 600C, và kéo dài 1 phút ở 720C ).
Hỗn hợp PCR : 25 l ( MgCl2 50 mM, d NTP : 10 mM,
mồi 10 pmol/ml, Taq- polymerase 1,25 đơn vị, ADN : 50 -
100 ng/ l).
- 15 l sản phẩm PCR được cắt bằng 3,6 đơn vị của enzym
cắt Hae III.
Các sản phẩm PCR, sản phẩm sau khi xử lý với enzym
giơí hạn được kiểm tra bằng điện di trên agarose với nồng
độ tương ứng 2%, 3% và được nhuộm bằng ethidium
bromide. Điện di đồ được quan sát và chụp ảnh bằng máy
Gen-Doc ( phrmacia ).
III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Kết quả nhân lên sau PCR và phân loại kiểu gen của gen K-
Cn trong thí nghiệm được trình bày tại hình 1.