ỨNG DỤNG PCR/RFLP ĐỂ ĐIỀU TRA PHÂN TÍCH
KIỂU GEN GEN PROTEIN SỮA ( KAPPA - CASEIN
b-LACTOGLOBULIN ) Ở BÒ SỮA VIỆT NAM
Trịnh Thị Kim Thoa, Lê Thị Hằng, Phùng Thị Bích
Thuỷ, Nguyễn Anh,
Viện Công nghệ Sinh học, 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu giấy,
Hà nội
MỞ ĐẦU.
Nhằm thúc đẩy ngành chăn nuôi bò sữa ở nước ta, các nhà
chăn nuôi di truyền quần thể đã và đang tiến hành lai tạo ra
đàn bò sữa thuần chủng, bò lai 1/2, 3/4 và 5/8 máu Hà lan
thích nghi trong điều kiện chăn nuôi trang trại và bán trang
trại ở Việt nam.
Ngày nay bên cạnh phương pháp chọn giống phenotype,
việc nghiên cứu, ứng dụng các chỉ thị gen vào chương trình
giống động thực vật ngày càng phát triển [1, 2, 3, 4, 6, 7, 8,
9, 10]. Sử dụng các chỉ thị phân tử để kiểm tra, đánh giá
chọn lọc di truyền trong lai tạo bò sữa đã được triển khai tại
một số nước như Mỹ, Canada, Đan mạch, Nauy.... Ở nước
ta hướng nghiên cứu này mới được đề cập trong vài năm
gần đây [12, 13]. Người ta đã sử dụng biến thể BB của gen
Kappa - casein ( K-Cn ), -lactoglobulin (-Lg) là hai trong
số các gen được sử dụng như là một chỉ thị di truyền chọn
giống bò sữa. Thật vậy, các nhà nghiên cứu trước đây đã
chứng minh được vai trò của chúng liên quan tới chất
lượng sữa, chất lượng và năng suất pho mát [1, 2]. K-Cn
còn được coi là tiêu chuẩn chọn lọc kinh tế quan trọng để
nâng cao chất lượng sữa công nghiệp [ 9 ]. Chính vì lẽ đó,
chúng tôi đã tiến hành điều tra phân tích kiểu gen gen
kappa-casein, -lactoglobulin nhằm góp phần cùng các nhà
di truyền phenotype đánh giá chất lượng con giống trong
quá trình tạo giống.
Trong bài báo này chúng tôi trình bày một số kết quả điều
tra ban đầu về kiểu gen của gen K-Cn và -Lg ở đàn bò
đực, cái Hà lan hạt nhân tại các Trung tâm Giống và ở thế
hệ lai. Hy vọng những kết quả nhận được sẽ đóng góp phần
nào vào chương trình cải tạo đàn bò sữa ở nước ta.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Chúng tôi tiến hành điều tra phân tích gen K-Cn và -Lg ở
tinh trùng, máu của 45 bò sữa giống hạt nhân (Hà Lan,
Sind) và 84 bò lai (1/2, 3/4 và 5/8 máu Hà Lan ) nuôi
dưỡng tại Trung tâm Tinh Moncada, Trung tâm Giống và
Sữa Phù Đổng Hà Nội và Trung tâm nghiên cứu bò và
đồng cỏ Ba vì - Hà Tây.
- Tách chiết ADN từ máu bò theo phương pháp
proteinase K/phenol/chloroform [5].
- Mồi được tổng hợp trên máy pharmacia LKB, Gene
assmbler special tại Viện Công nghệ sinh học - TTKHTN
& CNQG.
- Cặp mồi 1 gồm 23 và 24 oligonucleotide dùng để nhân
đoạn ADN đặc hiệu thuộc gen K - Cn.
- Cặp mồi 2 gồm 25 oligonucletide dùng để nhân -lg.
Theo phương pháp của Sulimova có cải tiến [ 11 ], chúng
tôi đã tiến hành PCR để nhân đoạn gen K-Cn - 228 bp. Chu trình Thermal cycle : biến tính sơ bộ: 7 phút ở 940C, mẫu được nhân lên bởi 35 chu trình: biến tính 2 phút ở 940C, đính mồi 1 phút 30 giây ở 570C, kéo dài 4 phút ở 720C.
Hỗn hợp PCR : 50 l, ( nồng độ MgCl2 : 3 mM, Taq-
polymerase: 2,5 đơn vị, d NTP: 0,5 mM, nồng độ ADN từ
0,5 - 1,0 g/ l ).
- 15 l sản phẩm PCR được cắt bằng 10 đơn vị của
enzym cắt Hind III hoặc pst I.
Chúng tôi đã tiến hành PCR để nhân đoạn gen -Lg - 262
bp theo phương pháp của Medrano [ 7 ]:
Mẫu được nhân lên bởi 35 chu trình [ biến tính 45 giây ở 940C, đính mồi 1 phút ở 600C, và kéo dài 1 phút ở 720C ).
Hỗn hợp PCR : 25 l ( MgCl2 50 mM, d NTP : 10 mM,
mồi 10 pmol/ml, Taq- polymerase 1,25 đơn vị, ADN : 50 -
100 ng/ l).
- 15 l sản phẩm PCR được cắt bằng 3,6 đơn vị của enzym
cắt Hae III.
Các sản phẩm PCR, sản phẩm sau khi xử lý với enzym
giơí hạn được kiểm tra bằng điện di trên agarose với nồng
độ tương ứng 2%, 3% và được nhuộm bằng ethidium
bromide. Điện di đồ được quan sát và chụp ảnh bằng máy
Gen-Doc ( phrmacia ).
III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Kết quả nhân lên sau PCR và phân loại kiểu gen của gen K-
Cn trong thí nghiệm được trình bày tại hình 1.
Hình 1. Điện di đồ các mẫu sản phẩm ADN 228 bp. đã
được nhân lên sau PCR và các mẫu sản phẩm PCR sau khi
xử lý với các enzym giới hạn Hind III và Pst I trên gel
agarose 2%, 3% ( nhuộm bằng ethidium bromide ).
a) Điện di đồ các mẫu sản phẩm ADN 228 bp: Giếng 1 -
maker 50 base - pair ladđer;
Giếng 2,3,4,5,6 - sản phẩm ADN 228 bp nhân lên từ máu
bò giống HàLan.
b) Điện di đồ các mẫu sản phẩm PCR sau khi xử lý với
enzym Hind III và Pst 1: Giếng 1 maker 1 kb; Giếng 2,3,4
sản phẩm ADN 228 bp nhân lên từ ADN máu bò Hà lan
sau khi xử lý với Hind III; Giếng 5,6 7 - sản phẩm ADN
228 bp nhân lên từ máu bò lai Hà lan sau khi xử lý với Pst
I.
Kết quả nhân đoạn gen -Lg và các biến thể của gen -Lg
được trình bày tại hình 2.
Hình 2: Điện di đồ các mẫu sản phẩm ADN 262 bp. đã
được nhân lên sau PCR và các mẫu sản phẩm PCR sau khi
xử lý với các enzym cắt giới hạn Hind III và Pst I trên gel
agarose 2%, 3% ( nhuộm bằng ethidium bromide )
a) Điện di đồ các mẫu sản phẩm ADN 262 bp. được nhân
lên sau PCR: Giếng 1 Maker 50 base - pair ladđer; Giếng
2,3,4 đoạn ADN 262 bp. nhân lên từ ADN máu bò Hàlan;
Giếng 5,6,7,8 - đoạn ADN 262 bp nhân lên từ ADN máu
bò lai 3/4 và 5/8 máu Hà lan
b) Điện di đồ mẫu sản phẩm PCR khi xử lý với enzym Hae
III: Giếng 7 Maker 50 base - pair ladđer; Giếng 1,2,3 - đoạn
ADN 262 bp nhân lên từ ADN máu bò Hà lan khi sử ly với
Hae III; Giếng 4,5,6 - đoạn ADN 262 bp nhân lên từ ADN
máu bò lai 3/4 và 5/8 máu Hà lan khi xử lý với Hae III.
Kết quả điều tra, phân tích về các kiểu gen của gen ( K - Cn
), -Lg ở bò giống hạt nhân ( bố, mẹ ) Hà lan, sind được
trình bày tại bảng 1.
Bảng 1: Kết quả điều tra cơ bản về kiểu gen của -Lg ở bò
sữabgen K-Cn và
Kết quả phân tích cho thấy, tất cả 45 bò giống bố mẹ ở
nước ta đều mang biến thể di truyền AA K-Cn. Còn biến
thể BB của gen K-Cn không thấy xuất hiện. Trong khi đó
bò Hà lan tại các nước Mỹ, Canada và Nezaland chiếm từ 3
- 4% biến thể BB của gen K-Cn [ 1, 5] . Biến thể AA -Lg
ở bò đực lớn hơn 2 lần biến thể AA -Lg ở bò cái ( -Lg ở
bò đực lạibbảng1) và chiếm tỷ lệ 57,14 %. Ngược lại Biến
thể AB của gen thấp hơn biến thể AA -Lg ở bò cái gần 2
lần. Biến thể B B của gen -Lg ở bò cái và bò đực chiếm tỷ
lệ gần như nhau và đạt : 28 % và 21,43%. Như vậy qua
điều tra, phân tích kiểu gen của gen K-Cn và -Lg ở bò đực
, cái giống Hà lan tại một số trung tâm giống ở nước ta cho
thấy, chất lượng bò giống của nước ta kém hơn chất lượng
bò giống của các nước Mỹ, Canada và Newzeland nếu dựa
vào hai chỉ tiêu đã nêu trên.
Bò lai hướng sữa ( 1/2, 3/4 và 5/8 máu Hà lan) ở nước ta
được tạo ra từ bò cái lai sind ( bò vàng Việt nam x bò sind)
với bò Hà lan thuần chủng. Vì thế, chúng tôi tiến hành điều
tra kiểu gen của gen K-Cn và -Lg ở bò đực Sind.
Kết quả nghiên cứu cho thấy: tất cả 6 bò Sind được kiểm
tra đều mang biến thể A A của gen K-Cn. Có 4 đực mang
biến thể BB của gen -Lg ( đạt 66,67 %) ( bảng 1). Như
vậy biến thể BB của gen -Lg chiếm tỷ lệ khá cao ở bò đực
Sind so với bò cái và bò đực giống Hà lan.
Đồng thời với việc điều tra , phân tích kiểu gen gen K-Cn
và -Lg ở bò sữa bố mẹ, chúng tôi tiến hành điều tra, phân
tích kiểu gen gen K-Cn và -Lg ở bò lai. Kết quả điều tra
phân tích kiểu gen gen K-Cn và -Lg ở bò lai được trình
bày tại bảng 2.
Qua kiểm tra, phân tích gen protein sữa ở bò lai cho thấy,
91,67 % bò lai mang biến thể AA của gen K-Cn, chỉ có
8,33 % bò lai mang biến thể BB của gen K-Cn. Như vậy
biến thể BB gen K-Cn ở bò lai nước ta cao hơn biến thể BB
gen K-Cn của bò Hà lan của nước ngoài ( 3-4%). Tuy kết
quả phân tích kiểu gen của gen K-Cn ở một số bò bố mẹ
không có con nào mang biến thể BB gen K-Cn, nhưng ở
con lai lại có 7 con ( chiếm 8,33%) mang thể biến thể BB
gen K-Cn. Đây có lẽ do con lai được tạo ra bằng tinh trùng
nhập ngoại chăng? Tỷ lệ biến thể AB của gen -Lg cao
nhất khi so sánh với biến thể AA và BB của gen -Lg. Ở bò
lai biến thể AB gen -Lg chiếm 48,8%. Bảng 2 cho thấy
biến thể BB của gen -Lg đạt 40,5 %. Tỷ lệ này cao hơn so
với tỷ lệ biến thể BB (25,64%) của gen -Lg ở bò Hà lan
(bố, mẹ), nhưng lại thấp hơn so với tỷ lệ biến thể BB của
gen -Lg ở bò sind (66,67 %) . Kết quả nhận được cho thấy
ở con lai phần nào đã biểu hiện tính trội di truyển của bò
Sind nên tỷ lệ biến thể BB của gen -Lg mới đạt tỷ lệ cao
như vậy.
Bảng 2: Kết quả điều tra cơ bản về kiểu gen của gen K-Cn
và -Lg ở bò lai
Từ kết quả phân tích ở trên, cho thấy bằng công nghệ gen
có thể xác định đặc điểm di truyền sớm thông qua các gen
xác định trong công tác chọn giống. Thật vậy, có thể xác
định kiểu gen gen K-Cn và gen -Lg trong các mẫu tinh
trùng hoặc mẫu máu bò tại các trung tâm giống một cách có
hệ thống trong quá trình chọn lọc lai tạo để góp phần thúc
đẩy cải tạo đàn bò sữa một cách nhanh chóng, đồng bộ về
mặt sản lượng lẫn chất lượng sữa.
Kết quả nghiên cứu dấu hiệu di truyền sớm có ý nghĩa vô
cùng quan trọng trong công tác giống. Kết quả nghiên cứu
của chúng tôi là những số liệu điều tra cơ bản đầu tiên về
kiểu gen của một số gen K- Cn và - Lg ở bò giống Hà lan
và bò lai đang khai thác tại Trung tâm Tinh đông viên
Moncada, Trung tâm giống và sữa Phù đổng Hà nội và
Trung tâm nghiên cứu bò và đồng cỏ Ba vì - Hà Tây. Vấn
đề này không chỉ có ý nghĩa khoa học mà còn có ý nghĩa
thực tiễn, bởi lẽ lần đầu tiên chúng ta điều tra, thống kê về
kiểu gen các gen có liên quan tới chất lượng sữa ở bò giống
(bố mẹ) hạt nhân và kiểm tra ở thế hệ lai. Vì rằng từ trước
tới nay, chúng ta chỉ mới kiểm tra chất lượng giống thông
qua phương pháp di truyền quần thể với thờì gian 6 - 7 năm
để theo dõi năng suất cũng như chất lượng sữa của các thế
hệ lai, do đó gặp nhiều khó khăn trở ngại, bởi phạm vi triển
khai trên quy mô lớn cần phải có thời gian và kinh phí
nhiều. Thực tế phát triển ngành chăn nuôi bò sữa ở nước ta
hiện nay đòi hỏi các nhà khoa học phải tạo ra một đàn bò
sữa vừa có năng suất cao lại có chất lượng sữa tốt là điều
kiện đầu tiên cần thiết và quan trọng đối với nhà nông. Chất
lượng sữa của đàn bò hướng sữa của nước ta hiện nay (hàm
lượng lipit, protein ) còn thấp so với tiêu chuẩn sữa công
nghiệp và tiêu chuẩn sữa quốc tế. Vì vậy để nâng cao chất
lượng sữa bò, song song với các biện pháp chọn giống theo
di truyền quần thể, chúng ta cần chú ý kiểm tra, đánh gía
chất lượng giống theo phương pháp kiểu gen để bổ sung
khả năng cho những tính trạng quan tâm, mới có thể thực
hiện được 1 cách nhanh chóng và ở quy mô lớn.
Sử dụng công nghệ gen trong chương trình giống sẽ cho
phép chúng ta chọn lọc các cá thể giống tốt mà khi kiểm
định phenotype ta có thể bỏ sót. Song để thực hiện được
vấn đề này đòi hỏi chúng ta cần phân tích mẫu với số lượng
lớn, đồng thời kiểm tra cả thế hệ con cháu mới có thể thực
hiện được mục tiêu của mình.
VI. KẾT LUẬN.
Từ các kết quả nhận được ở trên, chúng tôi rút ra được một
số kết luận sau:
1. Đã điều tra, phân tích được kiểu gen gen K-Cn và gen
- Lg của 129 bò sữa ( gồm 45 bò giống thuần chủng Hà
lan, Sind và 84 bò sữa lai (1/2, 3/4 và 5/8 ):
• Tất cả 45 bò giống thuần chủng Hà lan, Sind đều mang
tần số A A gen K-Cn và đạt 100%. Không có con nào mang
tần số BB gen K-Cn. Tần số A A gen -Lg đạt 31,11%, tần
số AB đạt 37,78% và tần số BB đạt 31,11 % ở 45 bò giống
bố mẹ thuần chủng Hà lan và Sind.
• Trong số 84 bò sữa lai (1/2, 3/4 và 5/8) tần số BB gen
K-Cn đạt 8,3 3%, tần số A A gen K-Cn đạt 91,57%. Tần số
A A gen -Lg đạt 10,7%, tần số AB đạt 48,8% và tần số
BB đạt 40,5 % ở 84 cá thể bò lai.
2. Tần số A A gen -Lg ở bò lai giảm đi 2,5 lần và tần số
BB gen -Lg ở bò lai gần tương đương so với bò Hà lan
thuần chủng, đạt 40,5%.
3. Các kết quả nhận được trên đây là cơ sở khoa học để
bổ sung giúp các nhà chăn nuôi trong lai tạo giống, song
song với phương pháp chọn giống kinh điển theo
phenotype, cần tuyển chọn đàn bò bố mẹ và kiểm tra di
truyền ở thế hệ lai theo kiểu gen để tạo ra đàn bò sưã có
năng suất cao và chất lượng tốt.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Anne-Marie Bech et all, 1990. Milk protein
polymorphism in Danish dairy cattle and the influence of
genetic variants on milk yeld. J. of dairy research, 57, p.53-
62.
2. Bovenhuis H. and Weller J. I; 1994. Mapping and
analysis of dairy cattle quantitave trait loci by maixmum
likelihood methodology using milk protein genes as genetic
markers. Genetics ( in America), 137, p.267-280.
3. Chung. -lactoglobuin locibE.R, Kim. W.T et all, 1998.
DNA genotyping of K-casein and in Korean Holstein AI
bulls. J. Diry sci ( in Korean) 20(2),p. 75-84.
4. Henderson D.A and Marshall, 1996. Kappa-casein
kiểu gen effects in a multiple breed beef cattle population.
J. of animal science, V. 74, supplement.
5. Hemy A. E, 1989. PCR technology principles and
application for DNA amplification. Chapter 17, p.221.
6. Lien S, etal. 1990. Milk protein mapping.
Biotechnology. J. p. 414-419.
7. Medrano J. F, 1990. Application of the PCR procedure
for genetic evalution in cattle. Procceding of the 4th the
world congress on genetics applied to livestock production.
23-27 July, p. 71-74.
8. Moody D. E, et all, 1996. Characterization of DNA
polymorphisms in three populations of hereford. Cattle and
their associations with growth and maternal EPD in line 1.
Heefords. J. Anim. Sci, 74, 1784-1793.
9. Zadworny. D and Kuhnlein, 1990. The identification
of the kappa-casein kiểu gen in Holstein dairy cattle using
PCR. Theo. Appl.genet 1990, 80: 631-634.
10. Pedersen J, 1991. Selection to increase frequency of
K-casein variant B in dairy cattle. J. Anim, Breed. Gee.
108, 434-445.
11. Sulimova G.E et all, 1991. PCR application of the
PCR procedure for identification of K-casein alleles in
cattle. Genetic (in Russian) T.17, N. 12, p. 2053-2062.
12. Trinh Thi Kim Thoa, Dau Hung Anh, Le dinh luong,
1998. Identification of the Kappa-casein kiểu gen in dairy
bulls by PCR. Genetics and applications. N. 3 p. 5-11.
13. Trinh Thi Kim Thoa, HoangTuan Anh, 1999.
Application of the PCR and RFLP technology for evalution
in dairy bulls in Vietnam. J. Genetics and applications. N.
4, p. 30-34.
SUMMARY
Using PCR/RLFP techniques for DNA genotyping of
Kappa-casein and -lactoglobulin loci in Vietnamese
dairy cattle .
Trinh Thi Kim Thoa, Le Thi Hang, Phung Thi Bich
Thuy, Nguyen Anh
Institute of Biotechnology-18 Hoang Quoc Viet, Cau giay,
Hanoi, Vietnam
The polymorphism of kappa-casein (K-Cn) and -
lactoglobulin ( -Lg) loci in sperm and blood samples from
127 cattle ( 20 bulls and 109 cows) of the Holland, Sind
and Holland cross-breed cows were analyed by PCR/RLFP
techniques. The results were shown that, the dairy Holland
and Sind cattle ( 47 cattle) in two breeding centre only
carry the AA allele K-Cn ( 100%). Frequency BB gene K-
Cn of those cattle did not founded. While frequency BB
gene K-Cn of cattle from American, Canadian and
Newzeland was 3-4%.
Frequency AA, AB and BB of gene b -Lg were 25,64%,
35,9% and 38,46% for Holland, Sind cattle, respectively.
Like that, frequency AA gene -Lg of bulls was higher
than this frequency of cows. It was 57,14%. Contrary to the
frequency AB gene -Lg from bulls was lower than
frequency AB gene -Lg from cows- two times. The
frequency BB of -Lg from Holland bulls and cows was
equivalent. It was 28% and 21,43 % respectively. From
those results were shown that, quality of Vietnamese cattle
is bad more than quality of cattle from American, Canadian
and Newzeland.
The Vietnamese cross-breed cattle have created from Sind
cross-breed cows. So we were determined genotype of gene
K-Cn and -Lg from Sind bulls. Results were observed
that, all six Sind bulls have carrying variant AA gene K-Cn.
Only four Sind were carrying variant BB gene -Lg (66,67
%). Thus, so variant BB of gene -Lg from Sind bulls
were higher than that from Holland bulls and cows.
The polymorphism of K-Cn and -Lg loci also was
determined from 84 cross-breed cows ( 1/2, 3/4 and 5/8 ).
The homozygous AA and homozygous BB of K-Cn were
observed at the frequency of 91,57% and 8,33%
respectively for cross-breed cows. In the -Lg system three
genotypes were observed. The AA, AB and BB variants
were 10,7 %, 48,8% and 40,5 %, respectively.
Like that, the homozygous AA -Lg of cross-breed cows
decreased two times and the homozygous BB equivalent
with homozygous BB -Lg of Holland cattle.
This study was performed to provide the basic data for
preservation and improvement of genetic resources and was
given us such as complementary criteria in breeding
selection for improvement Vietnamese population cattle.
