Báo cáo tổng kết đề tài khoa học cấp nhà nước: Nghiên cứu tạo interleukin-2 tái tổ hợp dùng cho điều trị bệnh ung thư

viÖn khoa häc vµ c«ng nghÖ viÖt nam viÖn c«ng nghÖ sinh häc B¸o c¸o tæng kÕt ®Ò tµi khoa häc cÊp nhµ n−íc Nghiªn cøu t¹o interleukin-2 t¸i tæ hîp dïng cho ®iÒu trÞ bÖnh ung th− M∙ sè KC 04.33

Chñ nhiÖm ®Ò tµi: PGs, ts. tr−¬ng nam h¶i

6702 24/12/2007

hµ néi - 2007

Bé Khoa häc vµ C«ng nghÖ ViÖn Khoa häc vµ C«ng nghÖ ViÖt Nam ViÖn C«ng nghÖ Sinh häc

B¸o c¸o tæng kÕt

§Ò tµi ®éc lËp cÊp Nhµ n−íc

M∙ sè: KC. 04. 33

Nghiªn cøu t¹o interleukin-2 t¸i

tæ hîp dïng cho ®iÒu trÞ bÖnh ung th−

Chñ nhiÖm §Ò tµi: PGS. TS. Tr−¬ng nam h¶i

01 / 2005 – 06 / 2007

BỘ KHOA HỌC VIỆN KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC --------(cid:194)(cid:194)(cid:194)--------

.

VKHCNVN V.CNSH

.

H S N C V

N C H K B

B K H C N

V C N S H

Báo cáo tổng kết Khoa học và Kỹ thuật Đề tài

NGHIÊN CỨU TẠO INTERLEUKIN-2 TÁI TỔ HỢP

DÙNG CHO ĐIỀU TRỊ UNG THƯ

Mã số:

KC. 04. 33

Chủ nhiệm đề tài:

PGS. TS. TRƯƠNG NAM HẢI

Cơ quan chủ trì:

Viện Công nghệ sinh học

Cơ quan chủ quản:

Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

01/2005 ‐ 06/2007

Thời gian thực hiện:

Hà Nội - 2007

Bản báo cáo viết xong ngày 15 / 12/ 2007. Tài liệu này được chuẩn bị trên cơ sở kết quả thực hiện Đề tài cấp Nhà nước, mã số KC. 04. 33. Mọi sao chép phải được sự đồng ý của Viện Công nghệ sinh học.

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

Lêi c¶m ¬n

Chủ nhiệm đề tài KC. 04.33 xin chân thành cảm ơn các cán bộ nghiên cứu thuộc 3 cơ quan nghiên cứu khoa học là (i) Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, (ii) Trường Đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQGHN, Bộ Giáo dục và Đào tạo và (iii) Viện Kiểm định Quốc gia Vacxin và Sinh phẩm y tế, Bộ Y tế đã tham gia thực hiện đề tài.

Chủ nhiệm đề tài KC. 04.33 xin chân thành cám ơn Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, Trường Đại học khoa học tự nhiên và Viện Kiểm định Quốc gia Vacxin và Sinh phẩm y tế đã ủng hộ và tạo điều kiện thuận lợi về trang thiết bị và kinh phí cho các tập thể cán bộ chủ trì và tham gia thực hiện đề tài này.

PGS. TS. TRƯƠNG NAM HẢI

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

Chủ nhiệm và tập thể cán bộ nghiên cứu thực hiện đề tài xin chân thành cảm ơn Vụ Quản lý Khoa học và Công nghệ các ngành KT-KT của Bộ Khoa học và Công nghệ và Ban chủ nhiệm chương trình KC. 04 đã tạo điều kiện thuận lợi về kinh phí và quản lý trong suốt thời gian thực hiện đề tài. CƠ QUAN CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

MỤC LỤC

DANH SÁCH NHỮNG NGƯỜI CHỦ TRÌ THỰC HIỆN ..................................................8 DANH SÁCH NHỮNG NGƯỜI THAM GIA THỰC HIỆN VÀ CƠ QUAN PHỐI HỢP......9 BÀI TÓM TẮT ......................................................................................................................11 LỜI MỞ ĐẦU ........................................................................................................................15 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC ... 17 1.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU Ở NƯỚC NGOÀI .........................................................17 1.1.1. Ung thư và các liệu pháp chữa trị ung thư.............................................................17 1.1.2 Ung thư thận và u hắc tố.........................................................................................18 1.1.3 Các liệu pháp chữa trị ung thư................................................................................19 1.1.4. Interleukin-2 và ứng dụng trong điều trị ung thư ..................................................19 1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC ............................................................23 CHƯƠNG 2. LỰA CHỌN ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...........26 2.1. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI ...........................................................................................26 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CẦN THỰC HIỆN ........................................................26 2.2.1 Tạo dòng gen IL-2 ..................................................................................................26 2.2.2 Tạo đột biến điểm của gen IL-2 .............................................................................26 2.2.3. Biểu hiện gen IL-2 trong các hệ biểu hiện khác nhau ...........................................27 2.2.4. Nghiên cứu và tối ưu điều kiện lên men cho các chủng vi sinh vật tái tổ hợp mang gen IL-2 .................................................................................................................27 2.2.5. Tách chiết, tinh chế IL-2 từ dịch lên men và nghiên cứu tính chất của IL-2. .......27 2.2.6. Đánh giá chất lượng IL-2 ......................................................................................27 2.3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................29 2.3.1. Vật liệu ..................................................................................................................29 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................30 CHƯƠNG 3. NHỮNG NỘI DUNG VÀ KẾT QUẢ ĐÃ THỰC HIỆN ............................47 3.1. KẾT QUẢ TẠO DÒNG GEN IL-2..............................................................................47 3.1.1. Tách chiết RNA tổng số từ người và tổng hợp cDNA mã hóa gen IL-2...............47 3.1.2. Gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pCR 2.1-TA ........................................48 3.1.3. Xác định trình tự nucleotide của gen IL-2.............................................................49 3.1.4. Kết luận .................................................................................................................50 3.2. KẾT QUẢ TẠO ĐỘT BIẾN GEN IL-2.......................................................................51 3.2.1. Tạo đột biến điểm làm mất điểm glycosyl hóa và thay thế Cys125 bằng Ser125....51 3.2.2. Gây hồi biến Ser25 thành Leu25..............................................................................54 3.2.3. Kết luận .................................................................................................................58 3.3. KẾT QUẢ BIỂU HIỆN IL-2 TRONG CÁC HỆ BIỂU HIỆN KHÁC NHAU............59 3.3.1. Biểu hiện gen lai Trx-rhIL2MN trong tế bào vi khuẩn E. coli..............................59 3.3.2. Biểu hiện gen lai Trx-rhIL2MN trong nấm men P. pastoris.................................63 3.3.3. Biểu hiện gen rhIL2 ở dạng riêng lẻ trong nấm men P. pastoris ..........................65 3.3.4. Kết luận .................................................................................................................68

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

3.4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN CÁC CHỦNG VI SINH VẬT TÁI TỔ HỢP MANG GEN IL-2 Ở BÌNH TAM GIÁC VÀ TRONG HỆ THỐNG LÊN MEN 5L, 14L...............................................................................................69 3.4.1. Kết quả lên men tổng hợp IL-2 tái tổ hợp trong bình tam giác .............................69 3.4.2. Kết quả lên men sản xuất IL-2 tái tổ hợp trong hệ thống Bioflo 110 dung tích 5, 14L. ...73 3.4.3. Kết luận .................................................................................................................74

3.5. KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT, TINH CHẾ IL-2 TỪ DỊCH LÊN MEN VÀ NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT ..............................................................................................................75 3.5.1. Tách chiết và tinh chế IL-2 bằng sắc ký ái lực......................................................75 3.5.2. Cắt protein lai bằng Enterokinase và lọc IL-2 qua cột sắc ký ái lực và kiểm tra khả năng bắt cặp đặc hiệu của IL-2 bằng Western blot..............................................76 3.5.3. Kết luận .................................................................................................................77 3.6. KẾT QUẢ BƯỚC ĐẦU VỀ BẢO QUẢN MẪU IL-2 ................................................78 3.7. THỬ NGHIỆM IL-2 TÁI TỔ HỢP TRÊN MÔ HÌNH TẾ BÀO NUÔI CẤY CTLL-2 ....79 3.7.1. Điều kiện tối ưu để nhân và bảo quản dòng tế bào CTLL-2 .................................79 3.7.2. Xác định hoạt tính sinh học của các mẫu rhIL2MN biểu hiện trong E. coli BL21 .......80 3.7.3. Xác định hoạt tính sinh học của mẫu rhIL2 biểu hiện trong P. pastoris ...............82 3.7.4. Kết luận. ................................................................................................................83 3.8. THỬ NGHIỆM IL-2 TÁI TỔ HỢP TRÊN MÔ HÌNH TẾ BÀO ĐỘNG VẬT...........84 3.8.1. Kết quả nghiên cứu................................................................................................84 3.8.2. Kết luận .................................................................................................................97 3.9. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG IL-2 ...............................................................98 3.9.1. Hiệu giá của sản phẩm IL-2 ..................................................................................98 3.9.2. Tính vô trùng của sản phẩm IL-2 ..........................................................................98 3.9.3. Tính an toàn của sản phẩm IL-2 ............................................................................98 3.9.4. Chất gây sốt của sản phẩm IL-2 ............................................................................98 3.9.5. Tính chất lý hóa của sản phẩm ..............................................................................99 3.9.6. Kết luận .................................................................................................................99 CHƯƠNG 4. TỔNG QUÁT HOÁ VÀ ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ THU ĐƯỢC................. 100 4.1. KẾT QUẢ VỀ KHOA HỌC ......................................................................................100 4.2. TỔNG HỢP CÁC SẢN PHẨM ĐẠT ĐƯỢC SO VỚI ĐĂNG KÝ ..........................102 4.3. TRÌNH ĐỘ CÔNG NGHỆ.........................................................................................104 4.4. KHẢ NĂNG ÁP DỤNG ............................................................................................104 4.5. ĐÀO TẠO ..................................................................................................................105 4.6. HỢP TÁC QUỐC TẾ .................................................................................................105 4.7. TÌNH HÌNH SỬ DỤNG KINH PHÍ ..........................................................................106 4.8. DANH SÁCH CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ .......................................................106 4.9. HẠN CHẾ CỦA ĐỀ TÀI ...........................................................................................107 CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..........................................................................110 5.1. KẾT LUẬN ................................................................................................................110 5.2. ĐỀ NGHỊ....................................................................................................................111 TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................................112

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

MỤC LỤC CÁC HÌNH

Hình 1. Sự phát triển của tế bào ung thư ..................................................................................18 Hình 2. Cấu trúc không gian của Interleukin-2 ........................................................................20 Hình 3. Sự tác động của ProleukinRIL-2 lên tế bào ung thư.....................................................23 Hình 4. Tóm tắt các nội dung nghiên cứu theo sơ đồ ...............................................................28 Hình 5. Điện di các RNA tổng số tách từ mẫu mô lách người Việt Nam ................................47 Hình 6. Sản phẩm PCR nhân gen IL-2 .....................................................................................48 Hình 7. Kết quả cắt kiểm tra DNA các plasmid bằng enzyme EcoR I. ...................................48 Hình 8. Kết quả so sánh trình tự IL-2 nhận được với trình tự trên ngân hàng gen quốc tế NCBI......49 Hình 9. So sánh trình tự amino acid đã được dịch mã của gen IL-2 nhận được.......................50 Protein_IL-2) và trình tự amino acid đã đăng kí trên ngân hàng dữ liệu gen............................50 quốc tế với số đăng ký NP_000577...........................................................................................50 Hình 10. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8% ...........................................................52 Hình 11. Kết quả cắt kiểm tra DNA plasmid các dòng biến nạp bằng Not I và Nco I .............53 Hình 12. Kết quả đọc trình tự nucleotide của dòng số 4 chứa gen rhIL2 .................................54 Hình 13. Cấu trúc của hai plasmid pTZ600 và pTZ900 ...........................................................56 Hình 14. Sơ đồ mô tả quá trình tạo đột biến điểm định hướng tạo gen Trx-rhIL2-MN...........57 Hình 15. Kết quả đọc trình tự gen đã hồi biến (phải) so với gen chưa hồi biến (trái) ..............58 Hình 16. Điện di SDS-PAGE protein Trx-rhIL2MN trên gel polyacrylamide 12,5% .............60 Hình 17. Western blot với kháng thể kháng hIL-2 ...................................................................61 Hình 18. Điện di protein rhIL2 dạng tan và không tan trên gel polyacrylamide 12,5%...........61 Hình 19. Ảnh phổ MS/MS của mảnh peptide 634,4 dalton mang điện tích +2 của Trx được nhận dạng. A – phổ TOF MS, B – phổ MS/MS. .......................................................................62 Hình 20. Ảnh phổ TOF MS và MS/MS của mảnh peptide 874,6 dalton mang điện tích 2+ của IL-2 được nhận dạng. A – phổ TOF MS, B – phổ MS/MS. ..........................................63 Hình 21. Các peptide nhận dạng được qua khối phổ từ băng protein.......................................63 có kích thước 32 kDa.................................................................................................................63 Hình 22. Ảnh biểu hiện gen Trx-rhIL2MN. .............................................................................64 Hình 23. Ảnh Western Blot với kháng thể kháng IL-2.............................................................64 Hình 24. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8% ...........................................................66 Hình 25. Điện di SDS-PAGE sản phẩm biểu hiện rhIL2 trong nấm men P. pastoris.............67 Hình 26. Ảnh Western Blot với kháng thể kháng IL-2.............................................................67 Hình 27. Ảnh hưởng của IPTG tới sự biểu hiện của protein rhIL2MN...................................70 Hình 28. Ảnh hưởng của nồng độ Amp tới sự biểu hiện của protein .......................................71 Hình 29. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy ................................................................71 Hình 30. Khảo sát thời gian thu mẫu biểu hiện .......................................................................72 Hình 31. Quá trình phát triển của chủng E. coli Bl21 và sinh tổng hợp Interleukin-2. ............73

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

Hình 32. Điện di protein tái tổ hợp Trx-rhIL2-MN trên polyacryamide gel 12,5%...............73 Hình 33. Điện di protein tinh sạch lần 1 .................................................................................755 Hình 34. Điện di protein tinh sạch lần 2 .................................................................................755 Hình 35. Điện di sản phẩm protein cắt bằng enterokinase trên gel polyacrylamide 12,5% ...766 Hình 36. Mẫu Trx-rhIL2MN giữ ở dạng đông khô sau các khoảng thời gian..........................78 bảo quản khác nhau ...................................................................................................................78 Hình 37. Hình ảnh tế bào CTLL-2 nuôi cấy in vitro ................................................................79 Hình 38. Xác định và so sánh hoạt tính của các mẫu IL-2 thử nghiệm ....................................81 Hình 39. Đồ thị minh hoạ sự phát triển của tế bào CTLL-2 dưới tác động..............................82 của các IL-2 khác nhau (rhIL2: VN, TQ1: Trung Quốc, US: Mỹ)............................................82 Hình 40. Niêm mạc đại tràng chuột nhắt trắng bình thường (Chụp dưới kính lúp) .................85 Hình 41. Niêm mạc đại tràng chuột nhắt trắng bị ung thư .......................................................86 Hình 42. Niêm mạc đại tràng chuột nhắt trắng bình thường ....................................................86 Hình 43. Niêm mạc đại tràng chuột nhắt trắng bị ung thư .......................................................87 Hình 44. Tiêu bản hiển vi mô học lông nhung ruột chuột nhắt trắng bình thường: .................87 Hình 45. Tiêu bản hiển vi mô bệnh học lông nhung ruột chuột nhắt trắng bị ung thư dưới tác động của AOM: ...................................................................................................................88 Hình 46. Tế bào biểu mô niêm mạc bị giải biệt hóa, đang chuyển dạng..................................88 thành ung thư, có nhân lớn và tăng sắc do bắt màu kiềm đậm (PĐ: 100 x 10).........................88 Hình 47. Tế bào mô liên kết ở lõi lông nhung bị giải biệt hóa, phân bố lộn xộn, đang chuyển dạng thành ung thư, có nhân lớn và tăng sắc (PĐ: 100 x 10) .......................................89 Hình 48. Chuột nhắt trắng Swiss khoẻ mạnh (a) và mang u báng Sarcoma 180......................90 sau 12 ngày cấy truyền (b).........................................................................................................90 Hình 49. Ảnh minh họa sinh khối tế bào ung thư Sarcoma 180:.............................................91 Hình 50. Sự giảm sinh khối u báng Sarcoma 180 dưới tác động của IL2 tái tổ hợp ................92 Hình 51. Biểu đồ so sánh tỷ số phát triển u giữa các lô thí nghiệm .........................................92 Hình 52. Tế bào ung thư báng Sarcoma 180 ở lô đối chứng (x1000) ......................................93 Hình 53. Tế bào ung thư báng Sarcoma 180 ở lô tiêm chế phẩm IL2.VN ...............................93 Hình 54. Tế bào ung thư báng Sarcoma 180 dưới tác động của chế phẩm IL2.TQ .................94 Hình 55. Tế bào ung thư báng Sarcoma 180 bình thường dưới kính .......................................94 hiển vi điện tử truyền qua (x10.000). ........................................................................................94 Hình 56. Tế bào ung thư báng Sarcoma 180 dưới tác động của IL2 VN (x10.000).................95 Tế bào chết theo kiểu hoại thư...................................................................................................95 Hình 57. Tế bào u báng Sarcoma 180 dưới tác động của IL2 TQ (x10.000) ...........................95 Hình 58. Đồ thị biểu diễn thời gian sống thêm của các lô chuột thí nghiệm............................96

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

MỤC LỤC CÁC BẢNG

Bảng 1. Danh sách những người chủ trì thực hiện......................................................................8

Bảng 2. Kết quả tinh chế IL-2 tái tổ hợp từ dịch thô ................................................................77

Bảng 3. Dữ liệu kiểm tra hoạt tính của các mẫu rhIL-2MN tái tổ hợp .....................................80

Bảng 4. Đơn vị hoạt tính của các mẫu IL-2 thử nghiệm...........................................................81

Bảng 5. Khả năng hoạt hoá tế bào CTLL-2 phát triển của mẫu ở nồng độ thử khác nhau.......82

Bảng 6. Đơn vị hoạt tính của các mẫu rhIL-2 thử nghiệm........................................................82

Bảng 7. Số trung bình của u ở ruột 1 chuột trong các lô thí nghiệm ........................................85

Bảng 8. Định lượng các khối u báng Sarcoma 180 khi mổ chuột thí nghiệm ..........................90

Bảng 9. Tác động của chế phẩm IL2-TQ và IL2-VN lên thời gian sống thêm.........................96

của chuột nhắt trắng Swiss mang u báng Sarcoma 180.............................................................96

Bảng 10. Các dòng gen và dòng vector tạo ra của đề tài ........................................................102

Bảng 11. Sản phẩm khoa học của đề tài .................................................................................102

Bảng 12. Danh sách các học viên được đào tạo......................................................................105

Bảng 13. Danh sách các cán bộ được nâng cao trình độ.........................................................105

Bảng 14. Danh sách các cơ quan hợp tác quốc tế ...................................................................105

Bảng 15. Kinh phí phân bổ cho các hạng mục........................................................................106

Bảng 16. Tóm tắt các nội dung công việc thực hiện và nội dung xin điều chỉnh ...................108

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

DANH SÁCH NHỮNG NGƯỜI CHỦ TRÌ THỰC HIỆN

Chức vụ, đơn vị

Trách nhiệm trong đề tài

Chương mục trong báo cáo

Số TT

Họ và tên Học hàm, học vị

Phó Viện trưởng,

PGS. TS.

Chủ nhiệm đề tài

Toàn bộ nội

Trưởng phòng Kỹ thuật di truyền,

Trương Nam Hải

Chủ đề mục

dung báo cáo

Viện CNSH

Phó Viện trưởng,

PGS. TS.

Trưởng phòng Hoá sinh protein,

Chủ đề mục

Phan Văn Chi

Viện CNSH

Phó Phòng Công nghệ lên men

TS. Phạm Thị Bích Hợp

Chủ đề mục

Viện CNSH

PGS. TS

Trưởng phòng Tế bào động vật,

Chủ đề mục

Đỗ Khắc Hiếu

Viện CNSH

Trưởng phòng Vi sinh phân tử,

TS. Đinh Duy Kháng

Chủ đề mục

Viện CNSH

PGS. TS

Trường Đại học khoa học tự

Chủ đề mục

Trần Công Yên

nhiên, ĐHQGHN

GS. TS.

Trung tâm Quốc gia Kiểm định

Chủ trì đề tài

Nguyễn Đình Bảng

Vaccin và sinh phẩm y học

nhánh

Công ty CP dược TW

Chủ trì đề tài

Chưa thực

Trần Bình Duyên

Mediplantex

nhánh

hiện

GS. TS. Nguyễn Bá

Chủ trì đề tài

Chưa thực

Bệnh viện K Hà Nội

Đức

nhánh

hiện

Bảng 1. Danh sách những người chủ trì thực hiện

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

DANH SÁCH NHỮNG NGƯỜI THAM GIA THỰC HIỆN VÀ CƠ QUAN PHỐI HỢP

1. Nội dung: Tạo dòng gen IL-2

Cơ quan tham gia: Viện Công nghệ sinh học Những người tham gia thực hiện: PGS. TS Phan Văn Chi, NCS Lê Thị Bích Thảo, Th.S Đặng Thành Nam, Th.S Nguyễn Nam Long, CN. Bùi Thị Huyền.

2. Nội dung: Tạo đột biến gen IL-2

Cơ quan tham gia: Viện Công nghệ sinh học Những người tham gia thực hiện: PGS. TS Trương Nam Hải, CN.Vũ Minh Đức, CN. Đặng Trần Hoàng, CN. Nguyễn Hồng Thanh, NCS. Phùng Thu Nguyệt.

3. Nội dung: Biểu hiện gen IL-2 trong các hệ biểu hiện khác nhau

Cơ quan tham gia: Viện Công nghệ sinh học Những người tham gia thực hiện: PGS. TS Trương Nam Hải, PGS. TS Phan Văn Chi, PGS. TS Đinh Duy Kháng, CN. Vũ Minh Đức, CN. Đặng Trần Hoàng, KS. Lê Quỳnh Giang, Th.S Nguyễn Tiến Minh, NCS. Phạm Minh Tuấn.

4. Nội dung: Nghiên cứu điều kiện lên men các chủng vi sinh tái tổ hợp mang

gen IL-2 ở quy mô 5 và 14 lít.

Cơ quan tham gia: Viện Công nghệ sinh học Những người tham gia thực hiện: PGS. TS Trương Nam Hải, TS. Phạm Thị Bích Hợp, Th.S Trần Thị Hường, CN. Vũ Minh Đức, Th.S Nguyễn Văn Hiếu, Th.S Hồ Tuyên, Th.S Lại Thanh Tùng, Th.S Phan Thị Hồng Thảo, CN. Phạm Thanh Huyền, CN. Phạm Kim Dung, KTV. Phan Văn Chí.

5. Nội dung: Tách chiết và tinh chế IL-2 từ dịch lên men và nghiên cứu tính

chất của nó.

Cơ quan tham gia: Viện Công nghệ sinh học Những người tham gia thực hiện: PGS. TS Trương Nam Hải, CN. Vũ Minh Đức, CN. Đặng Trần Hoàng, CN. Nguyễn Hồng Thanh.

6. Nội dung: Thử nghiệm IL-2 trên mô hình tế bào CTLL-2 nuôi cấy in vitro

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

Cơ quan tham gia: Viện Công nghệ sinh học. Những người tham gia thực hiện: PGS. TS Đỗ Khắc Hiếu, TS. Đỗ Thị Thảo.

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

7. Nội dung: Thử nghiệm IL-2 trên mô hình động vật thí nghiệm

Cơ quan tham gia: Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN. Những người tham gia thực hiện: PGS. TS Trần Công Yên, PGS. TS Nguyễn Thị Quỳ, ThS. Hoàng Thị Mỹ Nhung, CN Bùi Thị Vân Khánh, CN. Nguyễn Thuỷ Chung, CN. Lê Thị Thanh, CN. Vũ Đình Quang, CN. Kiều Thị Thu Hà.

8. Nội dung: Đánh giá chất lượng của chế phẩm IL-2

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

Cơ quan tham gia: Trung tâm Quốc gia Kiểm định vacxin và sinh phẩm y học Những người tham gia thực hiện: GS. TS Nguyễn Đình Bảng, TS. Nguyễn Thị Kim Hương.

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

BÀI TÓM TẮT

Trong những năm gần đây, bệnh ung thư đang trở thành một trong những

nguyên nhân gây tử vong cao ở nước ta do sự ô nhiễm môi trường và nguồn thực phẩm

cùng nhiều nguyên nhân khác. Do vậy việc điều trị các bệnh ung thư là rất cấp thiết,

tuy nhiên giá thành các loại thuốc điều trị ung thư thường cao và phải nhập ở nước

ngoài. Ngày nay với sự phát triển của Công nghệ sinh học ở Việt Nam, việc sản xuất

các protein tái tổ hợp phục vụ cho y học ngày càng được quan tâm. Xuất phát từ nhu

cầu thực tiễn cần sản xuất thuốc ở trong nước dùng cho điều trị bệnh ung thư, Đề tài

KC.04.33 đã được xây dựng để bước đầu tạo ra các sản phẩm protein tái tổ hợp

Interleukin-2 dùng trong điều trị bệnh nhân ung thư đường tiêu hóa giai đoạn muộn. Đề

tài đã được các cán bộ nghiên cứu từ 3 cơ quan phối hợp để thực hiện triển khai và thu

được các kết quả chính như sau:

1. Tạo dòng gen IL-2 và tạo đột điểm của gen IL-2

Bằng các kỹ thuật di truyền chúng tôi đã tiến hành tách chiết RNA tổng số từ tế bào

lách của người và tổng hợp cDNA mã hóa gen IL-2. Tuy nhiên để tạo ra IL-2 giống

như dạng thương phẩm (Proleukin IL-2), chúng tôi đã tiến hành tạo các đột biến điểm

của gen IL-2 như: i) Làm mất điểm glycosyl hóa Alanine-Proline-Threonine ở đầu N

của IL-2 bằng cách biến đổi thành Alanine-Methionine-Alanine để giảm tính độc của IL-2 đối với tế bào, ii) đột biến gốc Cys125 thành Ser125 để hạn chế khả năng tạo sai cầu disulfide trong phân tử IL-2, iii) hồi biến Ser25 thành Leu25 để giúp cho phân tử IL-2 có

cấu trúc giống như dạng thương phẩm Proleukin IL-2.

2. Biểu hiện gen IL-2 trong các hệ biểu hiện khác nhau

Các gen IL-2 cải biến và dạng tự nhiên đã được nhân lên và gắn vào các vector biểu

hiện như pET32c (+), pPIC9, pPICzα để đưa vào các hệ biểu hiện trong E. coli và P.

pastoris. Kết quả biểu hiện gen cho thấy chúng tôi đã biểu hiện thành công các protein

lai Trx-rhIL2MN với kích thước khoảng 32 kDa và protein dạng đơn rhIL-2 với kích

thước khoảng 15,4 kDa. Chủng E. coli tái tổ hợp có khả năng tổng hợp IL-2 đạt khoảng

90 mg/l IL-2, cao hơn 2000 lần so với dự tính và chủng nấm men P. pastoris có khả

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

năng tổng hợp IL-2 cao gấp 100 lần so với dự tính khoảng 5 mg/ml.

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

3. Nghiên cứu lên men các chủng vi sinh tái tổ hợp mang gen IL-2 quy mô 5 và 14 lít.

Các chủng vi sinh tái tổ hợp E. coli và P. pastoris mang gen IL-2 đã được nuôi cấy

trong các hệ thống lên men Bioflo 110 dung tích 5 và 14 lít. Kết quả lên men trong cả

hai hệ thống đều cho xấp xỉ sinh khối khoảng 70-80 g sinh khối ướt/lít và 192 mg

protein lai Trx-IL2/lít.

4. Tách chiết và tinh chế IL-2 tái tổ hợp

Protein lai Trx-rhIL2MN tạo ra trong vi khuẩn E. coli đã được tinh sạch bằng sắc

ký ái lực và phần protein lai Trx được loại bỏ bằng enzyme enterokinase. Các thành

phần không mong muốn như chí nhiệt tố (pyrogen) đã được loại ra khỏi IL-2 tái tổ hợp

bằng bộ kit chuẩn. Protein tái tổ hợp được tổng hợp có độ tinh sạch cao đạt 99% và độ

đặc hiệu 100% với kháng thể kháng IL-2 của người.

5. Thử nghiệm IL-2 trên mô hình tế bào CTLL-2 nuôi cấy in vitro

Hoạt tính sinh học của chế phẩm IL-2 tái tổ hợp tổng hợp trong E. coli đã được xác định bằng phép thử sinh học trên tế bào nuôi cấy in vitro CTLL-2 đạt khoảng 2,7 x 106 U/mg, tương đương với mẫu của Trung Quốc sản xuất (2,9 x 106 U/mg). Trong khi đó, hoạt tính của rhIL-2 biểu hiện trong nấm men cao hơn đạt 4x106 U/mg. Cả hai dạng IL-

2 tái tổ hợp đều có khả năng kích thích sự phát triển của tế bào CTLL-2.

6. Thử nghiệm IL-2 trên mô hình động vật gây ung thư thực nghiệm

Kết quả nghiên cứu thử nghiệm IL-2 của VN trên chuột gây ung thư thực nghiệm đường

tiêu hóa ruột cho thấy IL-2 tái tổ hợp đã làm giảm 43,5% sinh khối u báng đường ruột, đạt

hiệu lực kháng u (+) và có thể làm tăng thời gian sống của chuột lên 51,3% so với đối chứng.

Đây là những kết quả sơ bộ ban đầu về nghiên cứu tác động điều trị của IL-2 trên mô hình tế

bào động vật, tuy nhiên nó đã chứng tỏ chế phẩm IL-2 do Việt Nam sản xuất có hoạt tính

đối với u báng ở chuột gây ung thư thực nghiệm.

7. Đánh giá chất lượng của chế phẩm IL-2

Chế phẩm IL-2 tái tổ hợp đã được gửi sang Viện Kiểm định Quốc gia Vacxin và

Sinh phẩm y học để đánh giá theo quy trình chuẩn (SOP) của Tổ chức Y tế thế giới.

Kết quả cho thấy chế phẩm IL-2 do đề tài tạo ra được đánh giá là an toàn, đảm bảo điều

kiện vô trùng, có tính chất lý hóa phù hợp, hiệu giá tương đương với sản phẩm do

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

Trung Quốc sản xuất và hàm lượng chất gây sốt trong ngưỡng cho phép.

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

AOM Azoxymethane

Axit deoxyribonucleic

DNA

Ampicilin

Amp

Axit ribonucleic

RNA

5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate

BCIP

BMGY

Buffered Minimal Glycerol Media

BMMY

Buffered Minimal Methanol Media

Base Pair

cDNA

Complementary deoxyribonucleic acid

Cystein

Cys

Công nghệ sinh học

CNSH

2’-deoxyribonucleotide 5’-triphosphate

dNTP

dissovle oxygen

dO2

Escherichia coli

E. coli

Ethylen diamin tetra acid acetic

EDTA

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

ELISA

Electrospray Ionization

EST

Food and Drug Administration

FDA

FPLC

Fast Protein Liquid Chromatography

Forward (xuôi chiều)

Glass Fiber matrix

GFX

HPLC

High Performance Liquid Chromatography

Interleukin

Isopropyl β-D-thiogalactosidase

IPTG

Kilo Dalton

kDa

Luria and Bertani

Luria-Bertani Ampicilin

LBA

Leucine

Leu

Lysine

Lys

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

MS/MS

Mass spectrophotometry

NBT

Nitro Blue Tetrazolium

NCBI

National Center for Biotechnology Information

Optical Density

P. pastoris

Pichia pastoris

PMSF

Phenyl Methane Sulphonyl Fluoride

rhIL2MM

Recombinant Human Interleukin-2 Mutant Methionin

rhIL2MN

Recombinant Human Interleukin-2 Mutant Natural

RT-PCR

Reverse Transcription – Polymerase Chain Reaction

Reverse (ngược chiều)

SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate – Polyacrylamide Gel Electrophoresis

Serine

Ser

Tris – Buffer Saline

TBS

Thioredixin

Trx-

5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-galactosidase

Xgal

Yeast Peptone Dextrose

YPD

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

LỜI MỞ ĐẦU

Ung thư là sự phát triển và phân chia không bình thường của các tế bào do bị

đột biến gen ở tế bào soma. Theo cảnh báo của Tổ chức y tế thế giới (WHO), với hơn

10 triệu trường hợp xuất hiện mới hàng năm, bệnh ung thư đang trở thành một trong

những nguyên nhân chính gây tử vong trên thế giới. Ở Việt Nam hàng năm nước ta có

khoảng 150 000 bệnh nhân bị ung thư và khoảng 1/3 số bệnh nhân đã bị chết vì các

bệnh ung thư (theo số liệu thống kê tại bệnh viện K, Hà nội và Trung tâm U bướu

thành phố Hồ Chí Minh). Do vậy việc điều trị bệnh ung thư đang trở nên cấp thiết và

quan trọng trong mục tiêu chăm sóc sức khỏe cộng đồng của nước ta.

Hiện nay các phương pháp điều trị bệnh ung thư thường đang được sử dụng là

phương pháp chiếu xạ, giải phẫu hay sử dụng hoá chất trong quá trình trị liệu. Tuy

nhiên các phương pháp này thường gây nên các tác dụng phụ do tính không đặc hiệu có

thể giết cả các tế bào ung thư lẫn tế bào thường và ảnh hưởng lớn tới sức khỏe của

bệnh nhân ung thư. Do vậy phương pháp điều trị ung thư bằng miễn dịch trị liệu đã

được ứng dụng một cách có hiệu quả để có thể tiêu diệt một cách chọn lọc các tế bào

ung thư. Phương pháp này có ưu điểm là sử dụng các cytokine để kích hoạt hệ thống

miễn dịch các tế bào T, NK nhằm nhận biết và tiêu diệt các tế bào ung thư ác tính trong

thời gian ngắn. Đây là phương pháp mới được áp dụng ở Việt Nam trong những năm

gần đây để điều trị cho các bệnh nhân ung thư. Liệu pháp điều trị ung thư bằng miễn

dịch đã bước đầu thành công với nhiều loại ung thư như ung thư tế bào máu, ung thư

thận, ung thư bàng quang, u trung mô ác tính, u màng não, ung thư tuyến giáp, u hắc

tố...Hiện nay, Cơ quan quản lý Dược phẩm và Thực phẩm Hoa Kỳ (US Food and Drug

Administration – US FDA) đã chính thức cho phép sử dụng Interleukin-2 (IL-2) để

điều trị hai loại ung thư, đó là ung thư hắc tố (melanoma) và ung thư thận ác tính.

Ngoài ra, hiện nay IL-2 còn được thử nghiệm với nhiều loại ung thư khác.

IL-2 là một cytokine quan trọng thúc đẩy sự hoạt hoá các tế bào miễn dịch. IL-2

kích thích sự tăng sinh các tế bào chuyên biệt của hệ thống miễn dịch như tế bào T, tế

bào NK để tấn công và tiêu diệt các tế bào ung thư. Theo một số công trình nghiên cứu

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

cho thấy IL-2 có thể tăng cường hoạt hoá hệ thống miễn dịch của các bệnh nhân bị ung

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

thư biểu mô thận và u hắc tố. Ngày nay với sự phát triển của kỹ thuật di truyền phục vụ

cho y dược, các sản phẩm cytokine của người có thể được tổng hợp dưới dạng tái tổ

hợp để điều trị các bệnh ung thư. Hãng Amgen Pharmaceutical của Mỹ cũng đã phát

triển sản phẩm thuốc Proleukin-2 để điều trị cho các bệnh nhân bị ung thư biểu mô

thận ác tính và ung thư hắc tố. Ngoài ra do có khả năng kích thích hệ thống miễn dịch

nên ngoài việc điều trị ung thư thì IL-2 tái tổ hợp (rhIL2) còn có thể được sử dụng

trong điều trị bệnh nhân bị nhiễm virus HIV. Tuy nhiên rhIL2 thường được sử dụng

phối hợp với các chất khác như Interferon-α, flourouracil, cis-retinic acid…

Tuy nhiên, hiện nay ở nước ta hướng nghiên cứu tạo thuốc IL-2 dạng tái tổ hợp

dùng cho điều trị ung thư vẫn chưa được tiến hành. Phương pháp miễn dịch trị liệu cần

phải được triển khai ứng dụng ở các bệnh viện Trung ương để có thể theo kịp nền y

học hiện đại của thế giới. Do vậy, ở nước ta hiện nay Bộ Y tế rất khuyến khích việc tự

sản xuất thuốc trong nước để chữa trị cho bệnh nhân ung thư. Với trang thiết bị và nhân

lực của phòng thí nghiệm trọng điểm về công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học

thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam có thể thực hiện các nghiên cứu về chế

tạo protein tái tổ hợp bằng kỹ thuật di truyền.

Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn và khả năng về kỹ thuật và nhân lực, trong

chương trình khoa học KC.04, Viện CNSH phối hợp cùng 3 cơ quan nghiên cứu đầu

ngành trong cả nước để tiến hành đề tài KC.04.33 “Nghiên cứu tạo Interleukin-2 tái

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

tổ hợp dùng cho điều trị bệnh ung thư’’.

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC

1.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU Ở NƯỚC NGOÀI

1.1.1. Ung thư và các liệu pháp chữa trị ung thư

Ung thư là sự phát triển không bình thường của tế bào do sai sót của quá trình

điều khiển ở mức độ phân tử xảy ra trong quá trình sống của tế bào. Tất cả các loại tế

bào trong cơ thể về nguyên tắc đều có thể biến thành tế bào khối u. Các khối u này có

thể là lành tính (tumor) hoặc có thể biến thành ác tính (cancer). Đặc điểm của tế bào

ung thư là có thể nhân lên mà không cần các chất điều hoà sinh trưởng của tế bào

bình thường cần phải có và chúng trơ với các tín hiệu chết theo chương trình của tế

bào bình thường (apoptosis). Các tế bào ung thư cũng có thể lan sang các mô xung

quanh và lan truyền trong cơ thể để tạo nên khối u thứ cấp. Quá trình này gọi là di

căn. Để phát triển thì cả hai quá trình hình thành các loại khối u trên đều cần tạo ra

các mạch máu mới, do đó mà gần đây một trong những liệu pháp chữa trị khối u đang

được các nhà nghiên cứu quan tâm là tạo ra các chất ức chế quá trình tạo các mạch

máu của khối u đang phát triển.

Nguyên nhân của ung thư được xác định là do đột biến. Thế nhưng các đột biến

gây ung thư khác với đột biến của bệnh di truyền ở hai điểm sau. Các đột biến dẫn

đến ung thư chủ yếu là do đột biến tế bào soma, còn các đột biến ở bệnh di truyền

xảy ra ở các tế bào mầm (the germ cells). Tuy nhiên cũng có trường hợp một số đột

biến ở bệnh nhân bị bệnh di truyền đã tạo tiền đề cho sự phát triển một số dạng ung

thư. Điểm khác thứ hai là ung thư không thể hình thành do đột biến đơn, mà nó là

hậu quả của sự tích luỹ từ ít nhất 3 cho đến 20 đột biến xảy ra trong các gen điều

khiển quá trình tăng sinh tế bào, phụ thuộc vào loại ung thư. Chính vì thế mà ung thư

hay xảy ra ở người cao tuổi, vì cần có sự tích luỹ các đột biến gen. Điều này cũng

giúp một phần lý giải tỷ lệ người bị bệnh ung thư cao gắn liền với ô nhiễm môi

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

trường, hút thuốc lá...

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

Sự phân chia của tế bào bình thường

Sự phân chia của tế bào ung thư

Tế bào bị phá hủy

Hình 1. Sự phát triển của tế bào ung thư (http://www.edinformatics.com/biotechnology/cancer.htm)

1.1.2 Ung thư thận và u hắc tố

Trong các loại ung thư có thể được điều trị bằng liệu pháp miễn dịch, 2 dạng

ung thư là u hắc tố (melanoma) và ung thư thận ác tính bước đầu đã được điều trị có

kết quả nhờ interleukin-2 [10, 11, 26].

Thận là một phần trong hệ tiết niệu. Chức năng chính của nó là lọc máu và sản

xuất nước tiểu để loại bỏ chất thải ra ngoài cơ thể. Khi ung thư thận phát triển, nó có

thể xâm lấn vào các cơ quan ở gần thận như gan, đại tràng, hoặc tuyến tuỵ. Tế bào ung

thư thận có thể tách khỏi khối u ban đầu và di căn tới các bộ phận khác của cơ thể. Các

triệu chứng của ung thư thận là đái ra máu, có khối u ở vùng thận. Các triệu chứng ít

gặp hơn như mệt mỏi, chán ăn, đau ở vùng thắt lưng không khỏi, sốt lặp đi lặp lại nhiều

lần. Ung thư thận tăng lên theo độ tuổi, bệnh thường xuất hiện nhiều nhất là trong độ

tuổi 50-70. Nó xảy ra ở nam giới nhiều gấp đôi nữ giới. Nguyên nhân của ung thư thận

là do đột biến gen, sử dụng thuốc lá, béo phì, sự phơi nhiễm trong nghề nghiệp, tia

xạ… Ung thư thận được điều trị chủ yếu bằng hormon, hoá chất, liệu pháp miễn dịch.

U hắc tố là một loại ung thư khá thường gặp và đang có tần suất mắc bệnh tăng

nhanh nhất trong một số loại ung thư hiện nay. Các nhà nghiên cứu dự đoán tần suất

mắc bệnh tiếp tục tăng trong 20 năm tới. Nguyên nhân làm tăng tần suất mắc bệnh

chưa được xác định. Một số yếu tố có thể có liên quan, như thói quen phơi nắng và

những thay đổi mang tính chất toàn cầu như thủng tầng ozon và sự ô nhiễm môi

trường. U hắc tố có thể gặp ở mọi lứa tuổi người trưởng thành. Theo thống kê thì u hắc

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

tố có tính chất gia đình. Cắt bỏ khối u là lựa chọn điều trị dành cho u hắc tố. Sau khi

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

giải phẫu các bệnh nhân được chỉ định dùng các chất như interferon-α, interleukin-2

được sử dụng để điều trị bổ trợ nhằm chống di căn.

1.1.3 Các liệu pháp chữa trị ung thư

Cho đến nay ung thư vẫn là một trong những căn bệnh nan y và đứng đầu trong

những bệnh gây tử vong. Các phương pháp điều trị chính hiện đang được dùng là giải

phẫu, chiếu xạ hay hóa chất. Các phương pháp này có thể được sử dụng phối hợp để

tăng cường hiệu quả điều trị. Tuy nhiên, không phải lúc nào cũng có thể sử dụng các

phương pháp này để điều trị các loại ung thư. Đặc biệt, phương pháp chiếu xạ hay hoá

chất do tính không đặc hiệu nhiều khi giết cả tế bào ung thư lẫn các tế bào bình

thường, ảnh hưởng không tốt đến toàn bộ cơ thể.

Một liệu pháp khác cũng đã được sử dụng để điều trị ung thư có hiệu quả là liệu

pháp miễn dịch có sử dụng các chất cytokine để kích hoạt hệ thống miễn dịch của cơ

thể người nhằm nhận biết và tiêu diệt các tế bào ung thư ác tính. Liệu pháp này bước

đầu đã thành công với nhiều loại ung thư như ung thư tế bào máu, ung thư thận, ung

thư bàng quang, u trung mô ác tính, u màng não, ung thư tuyến giáp, sarcom mô mềm

ở chi, u lympho, u hắc tố.

1.1.4. Interleukin-2 và ứng dụng trong điều trị ung thư

Interleukin là một trong các nhóm cytokine đóng vai trò quan trọng trong hệ

thống miễn dịch. Interleukin được phân loại bao gồm có 33 nhóm IL khác nhau ký

hiệu từ IL-1 đến IL-33. Các IL này có vai trò trung gian trong việc liên kết với các

thụ thể đặc hiệu để điều khiển quá trình hoạt động của tế bào, quá trình apoptosis và

các quá trình phân chia của tế bào. Mỗi nhóm IL có vai trò khác nhau trong hệ

thống miễn dịch và chúng có thể được tạo ra bởi các loại tế bào khác nhau.

Interleukin-2 (IL-2) là một lymphokine quan trọng thúc đẩy sự hoạt hóa của

các tế bào T. IL-2 lần đầu tiên được phát hiện vào năm 1975 như là một nhân tố

kích thích sự tăng sinh của các tế bào T và đây là một trong số các cytokine được

nghiên cứu kỹ nhất bởi chức năng quan trọng của nó trong hệ thống miễn dịch. Kể

từ đó đến nay đã có hơn 150 công trình nghiên cứu khoa học về vai trò của IL-2

trong điều trị các bệnh ung thư đã được công bố từ năm 1990 đến nay. Những công

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

trình nghiên cứu khoa học này đã đem lại cho các nhà khoa học những hiểu biết

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

quan trọng về việc sử dụng IL-2 trong điều trị các bệnh ung thư bằng liệu pháp miễn

dịch, đặc biệt là ung thư biểu mô thận ác tính và ung thư hắc tố.

Gen mã hoá cho IL-2 lần đầu tiên được tách dòng vào năm 1983 và cấu trúc tinh

thể của protein này đã được mô phỏng vào năm 1992. IL-2 là một glycoprotein có

trọng lượng phân tử khoảng 15 kDa gồm 153 amino acid, nó có cấu trúc dạng cầu với 4

chuỗi xoắn α-helices được cuộn theo cấu trúc điển hình họ cytokine kiểu 1.

Hình 2. Cấu trúc không gian của Interleukin-2

Trải qua quá trình biến đổi sau dịch mã, protein hIL-2 bị cắt đoạn trình tự tín

hiệu tiết dài 20 amino acid và tạo thành hIL-2 hoàn chỉnh chứa 133 amino acid. Các

kết quả nghiên cứu trước đây cho thấy có 3 vùng trên phân tử hIL2 có vai trò quyết

định hoạt tính sinh học của cytokine này đó là: i) vùng tận cùng đầu N (các gốc

amino acid 1-20), ii) vùng tận cùng đầu C (các gốc amino acid 121-133) và iii) cầu disunfide giữa các gốc Cys58 và Cys105. Nghiên cứu của Grace (1987) cho thấy các

đột biến mất 20 amino acid ở đầu N và 10 gốc amino acid ở đầu C có thể làm mất

99% hoạt tính của IL-2 và khả năng liên kết của chúng với các thụ thể IL-2. Phân

tích trình tự amino acid cho thấy hIL-2 tự nhiên của người có chứa 3 gốc Cys tại các vị trí 58, 105, 125 trong đó hai gốc Cys58 và Cys105 tạo cầu disulfide. Việc hình thành

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

chính xác cầu disulfide này sẽ quyết định đến hoạt tính sinh học của hIL-2. Các kết quả nghiên cứu trước đây cho thấy đột biến các gốc Cys105 làm phá huỷ cầu disunfide do vậy làm giảm 8-10 lần hoạt tính của hIL-2, trong khi đó sự thay thế hoặc đột biến Cys58 làm hoạt tính của hIL-2 giảm tới 250 lần. Tuy nhiên sự đột biến mất gốc Cys tại vị trí

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

125 chỉ ảnh hưởng rất ít tới hoạt tính hIL-2 và sự thay đổi gốc Cys125 thành Ser125

không ảnh hưởng tới hoạt tính của hIL-2 (Liang SM. et al). Do vậy đột biến thay đổi Cys ở vị trí 125 thành Ser có thể ngăn cản sự tạo thành cầu disunfide không mong muốn giữa gốc này với Cys58 hoặc Cys105. Ngoài ra, tại đầu N của protein hIL-2 có

điểm glycosyl hoá được nhận biết bởi trình tự Ala-Pro-Thr ở 3 vị trí amino acid đầu

tiên. hIL-2 trong tự nhiên tồn tại ở dạng glycosyl hoá có tính thấm cao với màng tế bào

do vậy gây nên độc tính của protein này trong cơ thể bệnh nhân. Vì vậy, để tạo ra IL-2

dạng thương phẩm, protein tái tổ hợp IL-2 phải chứa các đột biến điểm làm mất điểm

glycosyl hoá để làm giảm tính thấm và tính độc của IL-2 đối với tế bào và đột biến thay thế Cys125 thành Ser125 nhằm ngăn cản sự tạo thành sai cầu disulfide để đảm bảo cấu

trúc của protein tự nhiên.

Các kết quả nghiên cứu cho thấy, với việc sử dụng IL-2 trong điều trị ung thư

có thể làm tăng khả năng sống sót cho các bệnh nhân. Theo nghiên cứu của

Rosenberg 1980 tại National Cancer Institute (NCI, Spain) cho thấy, khi điều trị cho

các bệnh nhân ung thư thận ác tính bằng IL-2 với các liều lượng khác nhau có thể

làm giảm tỷ lệ di căn của các khối u từ 15-20%, ngoài ra IL-2 còn có vai trò quan

trọng trong việc điều trị các bệnh ung ác tính khác như ung thư bạch cầu, ung thư

phổi, ung thư buồng trứng…Trong những năm tiếp theo từ năm 1990, các nhà khoa

học đã tiếp tục nghiên cứu để làm tăng hoạt động của IL-2 và sử dụng kết hợp nhiều

phương pháp trị liệu khác như hoá trị liệu và miễn dịch trị liệu, kết quả là khoảng 5-

10% các bệnh nhân được điều trị có thể sống sót sau 10 năm. Đây là một trong rất

nhiều nỗ lực lớn của các nhà khoa học trên thế giới trong việc nghiên cứu và ứng

dụng IL-2 trong việc điều trị các căn bệnh nan y này.

Trong những năm gần đây, các nhà khoa học đang quan tâm nghiên cứu sâu

về vai trò của IL-2 trong hệ miễn dịch với vai trò có thể nhận biết các kháng nguyên

lạ như các tế bào ung thư và phát triển các phương pháp trị liệu mới chống lại

những thay đổi của tế bào như ức chế các nhân tố phát triển khối u và các tín hiệu

dẫn truyền, cảm ứng quá trình tự chết của tế bào (appotosis), liệu pháp miễn dịch sử

dụng các cytokine, sử dụng vaccine chống ung thư và các liệu pháp gen. Phương

pháp điều trị miễn dịch trị liệu bằng IL-2 có thể kết hợp với các yếu tố miễn dịch

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

khác như TNF, melatonin, Interferon (IFN)-alpha, IFN-beta, LAK- lymphokine-

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

activated killer và TIL để có thể tăng cường hiệu quả sử dụng IL-2 trong điều trị

ung thư [55, 72].

Ngày nay cùng với sự phát triển của Công nghệ sinh học hiện đại và các

thành tựu của kỹ thuật di truyền, các protein tái tổ hợp sử dụng cho mục đích y học

ngày càng được quan tâm.

Hãng Amgen Pharmaceutical (Mỹ) đã phát triển sản phẩm ProleukinRIL-2

(aldesleukin) để điều trị trên các bệnh nhân ung thư hắc tố và ung thư biểu mô thận.

Tên hoá học của sản phẩm là des-alanyl-1, Ser-125 human interleukin-2. Sản phẩm ProleukinRIL-2 là một lymphokine được tạo ra bởi kỹ thuật DNA tái tổ hợp. Bằng

các kỹ thuật di truyền, gen IL-2 đã được thay đổi ở một số gốc amino acid như: mất

điểm glycosyl hoá ở vị trí alanin thứ nhất và thay thế amino acid Cys 125 bằng Ser

để đảm bảo cấu trúc không gian và hoạt tính sinh học của IL-2 tái tổ hợp. Các nghiên cứu in vitro của ProleukinRIL-2 trên các dòng tế bào người cho thấy sản

phẩm này có thể làm i) tăng cường quá trình phân chia tế bào lymphokine, do đó

thúc đẩy sự tăng cường hệ thống miễn dịch; ii) tăng cường tính độc của lymphokine

để nhận biết và tiêu diệt các tế bào ung thư, iii) cảm ứng các tế bào giết như LAK

và thúc đẩy hoạt động của các tế bào NK, iv) kích thích sự tạo thành các nhân tố của hệ thống miễn dịch là Interferon-gamma. Sự thử nghiệm chế phẩm ProleukinRIL-2

trên mô hình động vật và trên cả những bệnh nhân bị ung thư cho thấy chúng có khả

năng làm giảm các tỷ lệ di căn của các khối u, có hoạt tính sinh học, không bị kết

tủa và sử dụng dễ dàng nên thường được sử dụng nhiều trong điều trị bằng phương

pháp miễn dịch trị liệu [28]. Trong số 255 bệnh nhân bị ung thư biểu mô thận và 270 bệnh nhân bị ung thư hắc tố ở Mỹ đã được điều trị bằng ProleukinRIL-2 tái tổ hợp cho thấy có ProleukinRIL-2 có thể làm kìm hãm quá trình phát triển của các tế

bào khối u sớm nhất chỉ sau 4 tuần trị liệu. Đối với ung thư biểu mô thận ác tính, kết quả điều trị cho thấy nếu bệnh nhân có phản ứng với ProleukinRIL-2 thì tế bào

ung thư sẽ được kiểm soát hoàn toàn và tế bào ung có thể biến mất, 76% bệnh nhân

có thể chữa khỏi ung thư sau 7 năm. Đối với ung thư da ác tính nếu bệnh nhân có đáp ứng với ProleukinRIL-2 thì khoảng 59% bệnh nhân đã khỏi bệnh hoàn toàn sau

5 năm. Đây là những kết quả nghiên cứu rất quan trọng cho y học, góp phần làm

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

giảm tỷ lệ tử vong của các bệnh nhân bị ung thư biểu mô thận và ung thư hắc tố trên

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

thế giới. Hiện nay chế phẩm ProleukinRIL-2 có đang được bán rộng rãi trên thị trường Anh và Mỹ. Ngoài ra ProleukinRIL-2 còn có khả năng kích thích hoạt động của hệ miễn dịch,

do vậy chúng có thể được sử dụng trong điều trị cho các bệnh nhân bị nhiễm HIV. Các kết

quả so sánh giữa 2 nhóm bệnh nhân bị HIV được điều trị bằng thuốc chống HIV kết hợp với ProleukinRIL-2 và một nhóm được điều trị chỉ bằng thuốc chống HIV, không kết hợp ProleukinRIL-2 đã cho thấy, các bệnh nhân được điều trị bằng ProleukinRIL-2 và thuốc

chống HIV có khả năng kéo dài sự sống hơn nhóm bệnh nhân còn lại. Không giống như các sản phẩm thuốc khác, ProleukinRIL-2 không tấn công trực tiếp vào virus HIV mà

chúng hoạt hóa các tế bào chuyên biệt của hệ thống miễn dịch như các tế bào T-( tế bào T4

và T8), các đại thực bào, và các tế bào giết tự nhiên (NK) để giúp cơ thể chống lại sự tấn

công của virus này. Sản phẩm đã được đánh giá là an toàn và hiệu quả trong việc điều trị

ung thư và HIV do nó có khả năng tăng cường hệ miễn dịch của cơ thể và giúp cho hệ

miễn dịch có thể điều khiển được sự sản sinh của các tế bào ung thư và virus HIV [27]. Hiện nay chế phẩm ProleukinRIL-2 đang được bán rộng rãi trên thị trường Anh và Mỹ.

Trung Quốc thời gian gần đây cũng đã sản xuất IL-2 tái tổ hợp để điều trị ung thư. Ví dụ:

ProLeukine IL-2 tế bào T

Tấn công tế bào ung thư

ProLeukine IL- 2 kích thích sự tăng sinh của tế bào T

thuốc RecoSun là IL-2 tái tổ hợp của người đã được chế tạo và sử dụng tại Trung Quốc.

Tế bào T

Tế bào ung thư

Tế bào T đặc hiệu

Hình 3. Sự tác động của ProleukinRIL-2 lên tế bào ung thư

(http://www.biology.iupui.edu/biocourses/Biol540/3DrugCaseStudiesANS2k7.htm)

1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC

Theo số liệu thống kê ở các bệnh viện lớn của nước ta như Bệnh viện K, Trung

tâm u bướu thành phố Hồ Chí Minh thì số bệnh nhân bị ung thư đã tăng lên đáng kể

trong những năm gần đây. Trong số 150000 trường hợp bị ung thư xuất hiện mới hàng

năm ở nước ta thì có khoảng trên 50000 bệnh nhân đã bị tử vong vì căn bệnh này. Bệnh

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

ung thư là một trong những nguyên nhân gây tử vong lớn, vượt qua cả tỷ lệ tử vong về

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

tim mạch ở các nước đang phát triển và ở Việt Nam. Đây là tình trạng đáng báo động

và có xu hướng ngày càng tăng bởi sự xuất hiện của các làng ung thư, các khu đô thị bị

ô nhiễm môi trường sống. Nguyên nhân chủ yếu gây nên ung thư ở nước ta chủ yếu là

do sự ô nhiễm môi trường như bụi bẩn, do ô nhiễm nguồn nước sinh hoạt như rác thải,

phế thải từ các nhà máy đổ xuống sông ngòi, và do cả nguồn thực phẩm bị nhiễm hoá

chất. Do vậy mà bệnh ung thư có nguy cơ và tiềm năng đe dọa tới sức khoẻ cộng đồng.

Tuy nhiên bệnh ung thư có thể chữa khỏi được đến 70% nếu được phát hiện ở giai

đoạn sớm.

Hiện nay có ít nhất 4 phương pháp để điều trị ung thư, đó là phẫu thuật loại bỏ

khối u, xạ trị, hoá trị liệu và miễn dịch trị liệu (immuno therapy). Cả bốn phương pháp

này đều nhằm mục đích là tiêu diệt các tế bào ung thư và không gây tổn thương nhiều

đến các tế bào lành. Tuy nhiên ung thư thường được coi là đột biến của gen, do vậy cần

phải phối hợp các phương pháp với nhau để tạo hiệu quả điều trị tốt nhất. Ngày nay với

sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật đã làm tăng hiệu quả và an toàn của các phương pháp

nên nhiều bệnh nhân đã được cứu sống. Phẫu thuật cắt bỏ khối u là phương pháp điều

trị cổ điển nhất, tuy nhiên phương pháp này chỉ hiệu nghiệm với những khối u chưa di

căn và nằm thu gọn một phần nào đó trong cơ thể. Đôi khi cả các tế bào lành cũng

được cắt bỏ để tránh sự xâm nhiễm của các tế bào ung thư vào tế bào lành. Thực tiễn ở

Việt Nam cho thấy phương pháp phẫu thuật được phát triển rộng rãi và sớm nhất trong

điều trị ung thư. Còn đối với phương pháp hoá trị liệu và xạ trị chỉ mới xuất hiện ở Việt

Nam từ đầu thế kỷ 20 tại Viện Radium, nay gọi là bệnh viện K Hà nội. Hóa trị liệu là

phương pháp sử dụng hoá chất hay xạ trị liệu là sử dụng các tia xạ và các hạt như

proton, electron, tia x-ray, gamma-xray... để tiêu diệt tế bào ung thư và làm teo các

khối u. Các phương pháp này thường hiệu quả nhưng lại bao gồm cả sự tiêu diệt các tế

bào ung thư và tế bào lành, do vậy có thể tạo ra các tác dụng phụ gây suy nhược cho cơ

thể của bệnh nhân.

Phương pháp điều trị miễn dịch trị liệu có ưu điểm hơn hẳn so với những

phương pháp điều trị trên. Khi nói đến ung thư người ta thường nghĩ ngay tới việc tiêu

diệt khối u bằng hoá chất, phóng xạ hoặc bằng phẫu thuật, các phương pháp này

thường hữu hiệu nhưng gây tổn thương và tiêu diệt một lượng lớn các tế bào lành.

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

Trong khoảng vài thập kỷ trở lại đây, một phương pháp trị liệu mới ra đời cũng rất hữu

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

hiệu trong việc điều trị bệnh ung thư. Miễn dịch trị liệu là phương pháp tăng cường khả

năng chống trả bệnh tật của cơ thể, làm tăng sức chịu đựng của bệnh nhân và đồng thời

có khả năng ngăn ngừa sự phát triển của tế bào ung thư. Phương pháp này không làm

ảnh hưởng tới các tế bào bình thường nhưng có hiệu quả rất lớn trong việc tìm và tiêu

diệt các tế bào đích. Liệu pháp này hiện đang được nghiên cứu kỹ và đem lại nhiều

triển vọng cho bệnh nhân ung thư. Với các bệnh ung thư hiểm nghèo, y học cũng đã

cống hiến nhiều phương pháp trị liệu bệnh khá hiệu quả và đem lại sự sống cho rất

nhiều bệnh nhân. Ở Việt Nam, phương pháp hóa trị liệu mới chỉ được triển khai trong

vòng 15 năm trở lại đây, còn miễn dịch trị liệu thì vẫn đang còn đang trong thời kỳ

nghiên cứu. Đây là phương pháp trị liệu mới cần phải được phát triển mạnh mẽ hơn

nữa để đem lại hiệu quả trong việc điều trị cho các bệnh nhân bị ung thư. Với sự kết

hợp nhiều phương pháp điều trị ung thư, y học đã đem lại nhiều hy vọng để cứu sống

cho các bệnh nhân bị ung thư.

Hiện nay, hướng nghiên cứu sản xuất thuốc dưới dạng protein tái tổ hợp như IL-2 để

dùng trong liệu pháp miễn dịch trị liệu vẫn chưa được phát triển ở Việt Nam. Viện Công

nghệ sinh học là một trong những viện nghiên cứu đầu ngành trong cả nước cũng đã tiến

hành nghiên cứu để tạo ra các sản phẩm phục vụ trong y học như protein bất hoạt ribosom

(RIP), Erythropoetin người, các kit phát hiện chẩn đoán nhanh các týp virus dengue gây

bệnh sốt xuất huyết ở người hay xây dựng các bộ sinh phẩm để phát hiện thực phẩm như gia

cầm bị nhiễm vi khuẩn gây bệnh Salmonella. Bằng việc sử dụng các kỹ thuật di truyền,

chúng tôi đã biểu hiện thành công nhiều protein tái tổ hợp trong các hệ biểu hiện như trong E.

coli và trong nấm men như P. pastoris hay S. cerevisiae. [2, 3, 4, 5]. Ngoài ra, với sự đầu tư

của nhà nước về phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen với tổng kinh phí hơn 3 triệu

đô la Mỹ, Viện Công nghệ sinh học có đủ điều kiện để tiến hành các nghiên cứu tạo các

protein tái tổ hợp có khả năng sử dụng trong y tế.

Trong giai đoạn hiện nay, Bộ Y tế Việt Nam rất khuyến khích việc nghiên cứu

tự sản xuất thuốc trong nước với giá thành rẻ và chất lượng tốt để chữa bệnh, đặc biệt

cho đối tượng bệnh nhân nghèo chiếm đa số. Xuất phát từ những nhu cầu thực tế và

khả năng của mình, đề tài KC.04.33 đã được tiến hành để chế tạo thuốc IL-2 dùng

trong điều trị bệnh ung thư. Đề tài đã phối hợp các tập thể nghiên cứu từ các cơ quan

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

khác nhau để tiến hành thực hiện các nội dung nghiên cứu này.

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

CHƯƠNG 2 LỰA CHỌN ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI

Đề tài KC.04.33 tập trung nghiên cứu sản xuất protein tái tổ hợp IL-2 phục vụ

cho việc điều trị các bệnh ung thư là một trong những hướng nghiên cứu mới của Viện

CNSH, không những ở Việt Nam mà còn trên thế giới.

Việc thực hiện thành công mục tiêu đề tài đặt ra không chỉ có ý nghĩa về mặt

khoa học mà còn góp phần giảm khoảng cách về trình độ khoa học giữa Việt Nam và

các nước trên thế giới, đồng thời thúc đẩy sự phát triển nền y học Việt Nam tiến tới

việc tự sản xuất các sản phẩm thuốc trên nền công nghệ cao để sử dụng trong nước.

Đồng thời việc nghiên cứu áp dụng các quy trình kỹ thuật hiện đại thuộc lĩnh

vực công nghệ sinh học sẽ góp phần nâng cao trình độ các cán bộ kỹ thuật, đào tạo đại

học và sau đại học, từ đó để nâng cao tiềm lực của khoa học công nghệ thuộc lĩnh vực

CNSH, thực hiện chủ trương của Đảng và Nhà nước là tự phát triển nội lực trong công

cuộc công nghiệp hoá và hiện đại hoá đất nước.

2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CẦN THỰC HIỆN

2.2.1 Tạo dòng gen IL-2

- Tách chiết RNA tổng số và RNA thông tin từ mẫu tế bào người.

- Nhân gen IL-2 từ RNA thông tin nhờ enzyme phiên mã ngược bằng kỹ thuật PCR.

- Tách dòng gen IL-2 bằng các vector tách dòng và xác định trình tự gen bằng máy

đọc trình tự gen tự gen (Automatic Gene Sequencer).

2.2.2 Tạo đột biến điểm của gen IL-2

- Tạo đột biến làm mất điểm glycosyl hoá bằng cách thay 3 gốc amino acid Alanine-

Proline-Threonine ở đầu N (từ vị trí số 1) của IL-2 thành Alanine-Methionine-

Alanine để làm giảm tính thấm và tính độc của IL-2 đối với bệnh nhân.

- Tạo đột biến chuyển Cys ở vị trí 125 thành Ser để ngăn cản sự tạo thành cầu

disulfide, nhằm đảm bảo cấu trúc tự nhiên của protein tái tổ hợp.

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

- Hồi biến Ser ở vị trí 25 thành Leu 25 nhằm đảm bảo cấu trúc tự nhiên của protein IL-2.

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

2.2.3. Biểu hiện gen IL-2 trong các hệ biểu hiện khác nhau

- Thiết kế các vector biểu hiện gen IL-2 cải biến trong tế bào E. coli. Thiết kế các

vector cho phép biểu hiện dạng nội bào và dạng tiết ra khoang chu chất của tế bào

để tránh khả năng protein biểu hiện ở dạng thể vùi (mất hoạt tính) khi được tổng

hợp trong tế bào.

- Thiết kế các vector biểu hiện gen IL-2 cải biến trong tế bào nấm men P. pastoris ở

dạng ngoại bào

- Nghiên cứu sự biểu hiện của gen IL-2 cải biến trong các hệ E. coli và trong nấm

men P. pastoris

2.2.4. Nghiên cứu và tối ưu điều kiện lên men cho các chủng vi sinh vật tái tổ hợp

mang gen IL-2

- Nghiên cứu các điều kiện lên men cho các chủng vi sinh vật tái tổ hợp ở quy mô

bình tam giác.

- Tối ưu các điều kiện lên men chủng vi sinh vật tái tổ hợp trong các bình lên men 5

lít và 14 lít hiện đang có tại Viện CNSH.

2.2.5. Tách chiết, tinh chế IL-2 từ dịch lên men và nghiên cứu tính chất của IL-2.

- Tách chiết IL-2 từ dịch lên men và tinh chế bằng sắc ký ái lực (affinity

chromatography).

- Kiểm tra khả năng bắt cặp đặc hiệu của IL-2 tái tổ hợp với kháng thể kháng hIL-2

của người bằng Western blot.

- Định lượng và định tính hoạt tính của IL-2 trên dòng tế bào CTLL-2 nuôi cấy in

vitro.

- Nghiên cứu độc tính và hoạt tính dược học của IL-2 tái tổ hợp ở mức độ động vật

được gây ung thư thực nghiệm trước khi thử nghiệm cho người.

2.2.6. Đánh giá chất lượng IL-2

- Định lượng hàm lượng interleukin-2 có trong chế phẩm.

- Đánh giá tính an toàn của chế phẩm IL-2.

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

Các nội dung trên được trình bày trên sơ đồ sau.

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

Tách RNA tổng số từ tế bào lách người

Tổng hợp cDNA

Tạo dòng gen

C 125

1-A P T

Gen IL-2

Đưa vào vector tách dòng pCR 2.1

đột biến1

đột biến 2

S-25

Gen rhIL2MM

S 125 x

1-A M A x

Đưa vào vector biểu hiện pET 32a (+)

Hồi biến

Tách dòng và biểu hiện

Gen rhIL2MN

S 125 x

L-25 x

1-A M A x

Biểu hiện gen rhIL2MN

Biểu hiện protein dạng riêng lẻ rhIL2MN trong P. pastoris (pPIC9)

Biểu hiện protein dạng lai Trx- rhIL2MN trong E. coli (pET32c) và trong P. pastoris (pPIC9 and pPICZ)

rhIL2MN

Trx

His

EnK

Protein IL-2 lai

Tinh sạch bằng sắc ký ái lực

rhIL2MN

Trx

His

EnK

Tinh sạch và tinh chế IL-2

Cắt bằng enterokinase

rhIL2MN

Tinh chế rhIL2MN bằng sắc ký ái lực

IL2 tái tổ hợp tinh sạch

Đánh giá chất lượng IL-2

Thử nghiệm IL-2 trên mô hình nuôi cấy tế bào CTLL-2

Thử nghiệm IL-2 trên động vật ung thư thực nghiệm

Hình 4. Tóm tắt các nội dung nghiên cứu theo sơ đồ

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

2.3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1. Vật liệu

2.3.1.1. Vật liệu sinh học (chủng vi sinh vật, plasmid và động vật thí nghiệm)

- Chủng vi khuẩn E. coli DH5α [end A1 rec A1 hsdR17 supE44 gypA96 thi-

1relA1Δlac U169 (Φ80 lacZM15)] được sử dụng làm chủng tách dòng.

- Chủng vi khuẩn E. coli BL21 [F omp hsd SB(rBmB)gal dcm (DE3) plysS(Caml)]

được sử dụng làm chủng biểu hiện.

- Chủng nấm men P. pastoris GS115 được sử dụng làm chủng biểu hiện.

- Plasmid pCR2.1 do hãng Invitrogen sản xuất được sử dụng làm vector tách dòng

trong tế bào E. coli DH5α.

- Plasmid pET32c(+) do hãng Novagen sản xuất được sử dụng làm vector biểu hiện

trong tế bào E. coli BL21 (DE3).

- Plasmid pPIC9 và pPICZαA do hãng Invitrogen sản xuất được sử dụng làm vector

biểu hiện trong hệ nấm men P. pastoris GS115.

- Nguồn tế bào CTLL2 được mua từ ngân hàng tế bào Hoa Kỳ ATCC do sự giúp đỡ

của GS. J. M Pezzuto, hiệu trưởng Trường đại học Hawaii, Mỹ và được sử dụng để

đánh giá hoạt tính sinh học của chế phẩm IL-2.

- Chuột bạch để gây ung thư thực nghiệm bằng hóa chất AOM và thử nghiệm IL-2.

- Chuột lang, chuột nhắt trắng và thỏ được sử dụng để đánh giá chất lượng IL-2 theo

tiêu chuẩn quốc tế.

2.3.1.2. Các loại sinh phẩm, vật tư và hóa chất

- Các đoạn mồi: Các primer cho kỹ thuật PCR được tổng hợp dựa trên trình tự các

gen cần nghiên cứu.

- Enzyme: Các enzyme hạn chế (Biolabs, Anh); Taq-DNA polymerase (BioLabs,

Anh), Ribonuclease (Sigma, Mỹ), T4-DNA ligase (Biolabs, Anh)….

- Hóa chất: SDS, Tris-HCl, EDTA (Serva, Đức), X-gal (Sigma, Mỹ), Phenol.

Methanol, isoamylalcohol, EtBr, glycerol, ethanol, chloroform (Roche, Đức), Agar

(Fluka, Đức), dNTP (Promega, Mỹ), Amp (Merck, Đức), Agarose (Gibco, Mỹ),

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

Polyacrylamide (Merck, Đức)…

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

- Các hóa chất sử dụng trong sinh học phân tử và tinh chế protein như sắc ký ái lực,

sắc ký lọc gel...

- Các hóa chất dùng cho nghiên cứu hóa sinh như làm ELISA và Western blot.

- Các loại môi trường nuôi cấy và lên men vi khuẩn như LB (yeast extract, tryptone,

NaCl), BMGY (yeast extract, peptone, potasium phosphate, YNB, biotin, glycerol,

methanol), BMMY (potasium phosphate, YNB, biotin).

- Nguyên liệu, vật tư hóa chất để nghiên cứu động vật ung thư thực nghiệm.

- Kháng thể kháng IL-2 của người được mua từ hãng Sigma (mã số A00038).

- Bộ KIT để loại chí nhiệt tố của hãng Bio-Rad (Mỹ).

2.3.1.3. Máy móc và thiết bị

- Máy PCR (MJ Research, Mỹ), máy li tâm lạnh (Sorvall RC5B, Mỹ), máy ổn nhiệt

(Mỹ), máy điện di DNA (Nhật), máy điện di protein (BioRad, Mỹ), máy ly tâm

eppendorf (Sorvall, Mỹ), máy lắc ổn nhiệt (New Jersey, Mỹ), máy quang phổ

(Shimadzu, Nhật) , máy xác định trình tự gen (ABI PRISM-3100 Avant Genetic

Analyzer (Applied Biosystems, Mỹ) máy biến nạp bằng xung điện (Biorad, Mỹ).

- Hệ thống thiết bị sử dụng cho tinh sạch protein như cột sắc ký lọc gel, cột sắc ký ái

lực, cột sắc ký HPLC (Amersham Bioscience, Mỹ), hệ thống sắc ký FPLC

(Amersham Bioscience, Mỹ) và hệ thống sắc ký HPLC (Shimadzu, Nhật).

- Hệ thống lên men lượng lớn Bioflo 110 với dung tích 5L và 14L của hãng NBS (Mỹ).

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu

2.3.2.1. Tách RNA tổng số

* Tách chiết RNA tổng số: RNA tổng số được tách từ các tế bào lách người bằng Trizol

(Invitrogen) theo Chomczynski và cộng sự [15].

Phương pháp: Mẫu mô lách được lấy từ - 80°C, nghiền trong Nitơ lỏng cho mịn, đồng

nhất rồi hòa vào trong dung dịch Trizol. Trong quá trình phân giải mẫu Trizol bảo vệ

các phân tử RNA không bị phá hủy trong khi các thành phần khác của tế bào và mô bị

phá vỡ, làm đồng nhất. Sau đó thêm chloroform, lắc đều và li tâm để phân hỗn hợp

thành 2 pha: pha nước nổi và pha hữu cơ. RNA được giữ lại trong pha nước. Sau khi

tách pha nước, RNA được phát hiện bởi kết tủa với iso propanol. RNA tổng số tách

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

được từ mô lách người được hòa trong nước vô trùng có xử lí DEPC (diethyl

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

pirocarbonate) 0.1%, chia nhỏ và bảo quản ở - 80°C. RNA tách được được kiểm tra

chất lượng bằng điện di trên gel agarose 1% và định lượng bằng đo độ hấp thụ ở bước

sóng 260 nm trên quang phổ.

RNA tổng số được hòa vào trong đệm tra mẫu có chứa formamide,

formaldehyde và đệm MOPS [3-N-morpholine) propane sulfonic acid 0.02 M, 5 mM

CH3COONa, 1 mM EDTA, pH7.0] và đệm màu. RNA tổng số sau đó được chạy điện

di kiểm tra trên gel agarose 0,8%.

2.3.2.2. Tạo dòng gen IL-2

* Nhân gen bằng kỹ thuật RT-PCR: Nhân gen bằng kỹ thuật RT-PCR sử dụng

kit SuperScript One Step RT-PCR (Invitrogen) với cặp mồi được thiết kế dựa theo trình

tự của gen IL-2 kích thước 399 bp đã được đăng kí trên Ngân hàng Dữ liệu Gen Quốc

tế NCBI với số đăng kí NP_000577 có trình tự như sau:

IL-2_Fw: 5’- GCC ATG GCA CCT ACT TCA AGT TCT ACA-3’

IL-2_Rv: 5’- GCG GAT CCT AAG TCA GTG TTG AGA TGA-3’

Kỹ thuật RT-PCR được tiến hành trong tổng thể tích 25 μl với 0.5 μg RNA tổng

số, 10 pmol mồi mỗi loại, 1.2 mM MgSO4, 0.2 mM mỗi loại dNTP, 0.5 μl RT/Taq-

Platimum và đệm 1X PCR. Chu trình nhiệt của kỹ thuật RT-PCR để tổng hợp cDNA được thực hiện ở 50 oC trong 30 phút tiếp theo 94 oC trong 2 phút. Kỹ thuật PCR: hỗn hợp được biến tính ở 94OC trong 3 phút, tiếp theo là 35 chu kì gồm 94OC: 48 giây, 56OC: 45 giây, 72OC: 1phút 20 giây và 72OC trong 8 phút. Sản phẩm RT-PCR sau đó

được sử dụng ngay cho phản ứng nối ghép gen.

* Phản ứng nối ghép gen vào vector tách dòng pCR 2.1-TA

Sản phẩm PCR được gắn vào vector tách dòng pCR 2.1-TA (Invitrogen) sau đó

được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli (dòng DH5-α) của hãng Invitrogen (Mỹ)

với mục đích chọn lọc các dòng tế bào mang vector tách dòng pCR2.1-TA được gắn

thêm sản phẩm PCR. Vector tái tổ hợp được tách chiết theo phương pháp của

Sambrook J và Russell DW và được sử dụng làm nguyên liệu để đọc trình tự.

* Xác định trình tự DNA

Trình tự DNA được tiến hành xác định trên máy đọc trình tự tự động ABI

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

PRISM®3100 Avant Gentic Analyzer (Applied Biosystems, Mỹ).

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

2.3.2.3. Tạo đột biến mất điểm glycosyl hóa

Gen IL-2 tự nhiên có một điểm nhận biết đặc hiệu ở bộ 3 amino acid APT ở

đầu N để glycosyl hoá. Trong tự nhiên IL-2 dạng glycosyl hóa có khả năng thấm tốt

qua màng. Tuy nhiên, trong quá trình điều trị bệnh nhân ung thư với liều cao của IL-2

tái tổ hợp thì mức độ thấm cao qua màng lại có ảnh hưởng độc tính đối với bệnh nhân.

Vì vậy, các công ty dược phẩm khi sản xuất IL-2 tái tổ hợp đều làm mất khả năng

glycosyl hóa của nó bằng cách thay đổi bộ ba đặc hiệu APT thành bộ ba khác. Trong

công trình này chúng tôi đã thay đổi bộ ba APT này thành bộ ba AMA. Để làm được

điều đó chúng tôi đã thiết kế mồi xuôi chiều đầu 5’ của gen như sau:

5’ A GCC ATG GCT TCA AGT TCT ACA AAG AAA 3’

Nco I

Đoạn mồi này vừa tạo đột biến làm mất điểm glycosyl hoá vừa tạo một điểm

cắt của enzyme hạn chế Nco I. Điểm cắt hạn chế này sẽ tạo thuận lợi khi đưa gen vào

vectơ biểu hiện pET32c(+).

2.3.2.4. Tạo đột biến thay thế gốc cystein ở vị trí 125 thành serine:

Trong cấu trúc của gen IL-2 tự nhiên có 3 amino acid Cys ở các vị trí 58, 105

và 125 trong đó hai Cys ở vị trí 58 và 105 tạo cầu disulfide trong cấu hình bậc ba của

IL-2. Để làm giảm khả năng thấm không gây độc cho tế bào và protein tái tổ hợp giữ

nguyên cấu trúc không gian, các đột biến làm mất điểm glycosyl hoá và thay thế amino

5’ AGGCGGCCGC TCA AGT TAG TGT TGA GAT GAT GCT TTG CGA AAA GGT 3’

Serin125

Not I stop Đoạn mồi này vừa tạo đột biến thay Cys125 bằng Ser vừa tạo một stop codon ở cuối gen

acid Cys 125 bằng serin ở gen này đã được tạo ra như sau:

vừa tạo một điểm cắt hạn chế của enzyme Not I. Điểm cắt này sẽ tạo thuận lợi khi đưa

gen vào vectơ biểu hiện pET32c(+).

2.3.2.5. Biểu hiện gen IL-2 ở E. coli

Gen IL-2 trong vector tạo dòng pCR2.1 được lấy ra bằng cách xử lý plasmid

pCR-2.1 bằng hai enzyme hạn chế Nco I và Not I, đoạn DNA dài khoảng 400 bp chứa

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

gen IL-2 được thu lấy sau khi chạy điện di sản phẩm cắt trên gel agarose và tinh sạch

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

bằng bộ kit Qiaquick Gel Extraction. Đoạn gen thu được được nối với vector

pET32c(+) đã được xử lý trước đó bằng 2 enzym hạn chế trên. Vector tái tổ hợp

pET32c(+) chứa gen mã hóa cho protein lai giữa theriodoxin với IL-2 (Trx-rhIL2)

được biến nạp vào tế bào E. coli BL21 (DE3) và nuôi cấy trong môi trường LB có bổ sung Amp (nồng độ cuối cùng là 100 μg/ml) ở 370C. Khi giá trị OD600 của dịch nuôi

cấy đạt 0,5, IPTG được bổ sung vào dịch nuôi cấy tế bào với nồng độ cuối cùng là 1

mM. Các mẫu tế bào được thu vào các thời điểm 1, 2, 3 giờ sau khi cảm ứng bằng

IPTG. Dịch tế bào được ly tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút, phần tủa tế bào được hoà lại vào 300 μl đệm TE (20 mM Tris-HCl, 2.5 mM EDTA, pH 7.8) và được giữ ở -850C. Mẫu tế bào giữ ở -850C được làm tan và tiến hành siêu âm trong 3 giây cho mỗi lần và

lặp lại 20 lần. Ly tâm 13000 vòng/phút thu dịch nổi chứa protein tan. Phần tủa tế bào

được rửa lại 2-3 lần bằng đệm TE để loại hoàn toàn protein tan còn lại trong tủa tế bào.

Sau đó, tủa tế bào được dịch hóa bằng đệm TE và bổ sung 1 thể tích đệm pha mẫu

dùng cho điện di. Trong đệm này có SDS và β-Mercaptoethanol nên các protein không

tan còn lại trong tủa tế bào sẽ được hòa tan hoàn toàn. Các protein này được xem như

protein pha không tan từ tế bào E. coli. Thông thường các protein thể vùi khi biểu hiện

trong E. coli đều nằm trong tủa tế bào. Quá trình chạy điện di kiểm tra SDS-PAGE trên

gel polyacrylamide 12,5% được thực hiện với lượng mỗi mẫu thu được ở phần dịch nổi

và phần tủa tế bào là 25 μl.

* Định lượng protein pha tan và không tan trong tế bào E. coli: Protein pha tan và

không tan được chuẩn bị như phần trên được phân tích bằng điện di SDS-PAGE. Một

lượng xác định protein chuẩn cũng được chạy trên cùng bản gel với các protein tan và

không tan. Sau khi kết thúc điện di, bản gel được nhuộm bằng Coomassie để phát hiện

các băng protein. So sánh độ đậm của băng protein mong muốn với các băng protein

chuẩn đã biết về lượng ta có thể định lượng một cách tương đối băng protein mong

muốn được phát hiện trên gel polyacrylamide. Do thể tích mẫu protein đã được xác

định (ví dụ 25 µl mẫu protein cho mỗi đường chạy trên gel) ta có thể dễ dàng định

lượng được protein của mẫu điện di. Bằng cách tính lượng protein/µl mẫu điện di và

nhân với tổng thể tích toàn bộ của mẫu ta có thể định lượng được toàn bộ protein IL-2

biểu hiện được trong một đơn vị thể tích. Ví dụ: Sau khi phá tế bào bằng siêu âm trong

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

đệm TE và thu lấy dịch trên chứa protein tan với thể tích mẫu là 10 ml. Kết quả xác

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

định băng IL-2 trên gel có nồng độ là 10 µg/µl, ta có thể tính được lượng IL-2 có trong

10 ml mẫu ban đầu là 10 mg. Tương tự như vậy ta có thể tính được lượng protein trong

pha không tan sau khi hòa lại tủa tế bào trong đệm pha mẫu điện di.

2.3.2.6. Biểu hiện gen IL-2 trong nấm men P. pastoris

* Tạo chủng nấm men mang gen Trx-rhIL2MN

Gen Trx-rhIL2MN được gắn vào plasmid pPIC9 và pPICZαA tạo nên plasmid

tái tổ hợp pPIC-TrxrhIL2MN, pPICZ-TrxrhIL2MN. Plasmid này được cắt bằng

enzyme Sal I rồi được biến nạp vào chủng nấm men P. pastoris GS115 bằng phương

pháp xung điện, các thể biến nạp được chọn lọc trên môi trường MD (Invitrogen).

Plasmid pPICZ-TrxrhIL2MN được cắt bằng enzyme Sac I rồi được biến nạp vào chủng

nấm men P. pastoris GS115 bằng phương pháp xung điện và chọn lọc trên môi trường

YPD (Invitrogen) có bổ sung chất kháng sinh Zeocin (Invitrogen).

* Biểu hiện gen Trx-rhIL2MN

Một khuẩn lạc nấm men riêng rẽ mang gen Trx-rhIL2MN được nuôi lắc qua

đêm trong môi trường BMGY (Invitrogen) để đạt OD600 = 2 - 6. Tế bào nấm men được

thu lại bằng ly tâm rồi hòa lại trong môi trường biểu hiện BMMY với OD600 = 1. Dịch

nuôi cấy tế bào được thu lại sau các khoảng thời gian cảm ứng 6, 12, 18, 24, 48, 72, 96

giờ. Cứ sau 24 giờ, methanol được bổ sung vào môi trường biểu hiện với nồng độ 0,5%

để duy trì tình trạng cảm ứng.

* Kiểm tra mức độ biểu hiện của protein lai Trx-rhIL2MN bằng điện di SDS-PAGE

Dịch nuôi cấy được xử lý bằng đệm pha mẫu có 1% SDS và biến tính trong 10

phút, rồi chạy diện di SDS-PAGE. Các băng protein được quan sát sau khi nhuộm bạc

theo phương pháp của Morrisey (1981).

* Kiểm tra tính đặc hiệu của IL-2 bằng phương pháp Western Blot

Sau khi điện di trên gel 12,5% polyacrylamide, các băng protein được chuyển

sang màng PVDF. Các vị trí không có protein trên màng được phủ sữa loại béo qua

đêm. Tiếp theo màng được phủ kháng thể IgG kháng IL-2 của người được sản xuất từ

chuột rồi phủ kháng thể kháng IgG chuột gắn alkaline phosphatase. Phản ứng hiện màu

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

với cơ chất BCIP và NBT.

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

2.3.2.7. Thiết kế vector biểu hiện rhIL2 dạng riêng lẻ trong nấm men

Đoạn gen mã hóa cho interleukin-2 ở dạng tự nhiên (kí hiệu là rhIL2) được nhân

5'-Tct ctc gag aaa aga* gag gct gaa gct gca cct act tca agt tct-3' Xho I 5’ AGGCGGCCGC TCA AGT TAG TGT TGA GAT GAT GCT TTG CGA AAA GGT 3’ Nco I Stop Serin125

lên từ khuôn pET32-Trx-rhIL2MN bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu là:

Sản phẩm PCR nhận được sẽ được cắt bằng các enzyme hạn chế Xho I và Nco I,

sau đó sẽ được gắn trực tiếp vào pPIC9 để tạo thành vector biểu hiện pPIC9-rhIL2

mang gen mã hóa cho interleukin-2 ở dạng tự nhiên.

• Tạo chủng nấm men mang gen rhIL2

Plasmid pPIC9-rhIL2 được cắt bằng enzyme Sac I rồi được biến nạp vào chủng

nấm men P. pastoris GS115 bằng phương pháp xung điện và chọn lọc trên môi trường

YPD (Invitrogen) có bổ sung chất kháng sinh Zeocin (Invitrogen).

• Biểu hiện gen rhIL2

Một khuẩn lạc nấm men riêng rẽ mang gen rhIL2 được nuôi lắc qua đêm trong

môi trường BMGY (Invitrogen) để đạt OD600 = 2-6. Tế bào nấm men được thu lại bằng

ly tâm rồi hòa lại trong môi trường biểu hiện BMMY với OD600 = 1. Dịch nuôi cấy tế

bào được thu lại sau các khoảng thời gian cảm ứng 6, 12, 18, 24, 48, 72, 96 giờ. Cứ sau

24 giờ, methanol được bổ sung vào môi trường biểu hiện với nồng độ 0,5% để duy trì

tình trạng cảm ứng.

• Kiểm tra mức độ biểu hiện của protein rhIL2 bằng điện di SDS-PAGE

Dịch nuôi cấy được xử lý bằng đệm pha mẫu có 1% SDS và biến tính trong 10

phút, rồi chạy diện di SDS-PAGE. Các băng protein được quan sát sau khi nhuộm bạc

theo phương pháp của Morrisey (1981).

2.3.2.8. Phương pháp lai Western blot.

Mẫu protein (2 μl/giếng) được phân tách bằng điện di trên gel polyacrylamide

12,5%. Sử dụng màng nitrocellulose thấm lên bản gel để tách các băng protein ra khỏi gel

và chuyển lên màng nhờ lực điện trường. Quá trình hiện màu được tiến hành như sau:

màng được rửa lần lượt bằng đệm TBS 1X (1M Tris-Cl, pH7.5, 5M NaCl) và đệm TBS-T

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

1X (1M Tris-Cl, pH7.5, 5M NaCl, 0.1% Tween20). Phủ kháng thể 1 (Mouse anti-

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

humanIL2) lên màng, lắc ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ. Sau khi rửa kháng thể thừa không

tham gia phản ứng bằng đệm TBS và TBS-T, bổ sung kháng thể 2 (Rabbit antimouse IgG)

đã được gắn với enzyme Alkaline photphatase, lắc ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ. Rửa

kháng thể thừa, bổ sung dung dịch hiện màu (kit Bio-Rad). Tiếp tục lắc trong 15 phút để

phản ứng enzyme diễn ra và quan sát sự xuất hiện của các vạch màu.

2.3.2.9. Phân tích và thuỷ phân protein bằng trypsin

Protein tổng số của tế bào ở các thời điểm biểu hiện khác nhau được phân tích

qua điện di SDS-PAGE (Laemmli và cộng sự). Các băng protein mong muốn được thu

lại qua cắt gel, tẩy màu với dung dịch 50 mM NH4HCO3, sau đó được khử bằng dung dịch 5 mM Dithiothreitol ở 560C trong 1 giờ loại bỏ các cầu nối disulfide và alkyl hoá

gốc Cys bằng 10mM Iodoacetamide (Carbamidomethyl nhóm – SH của amino acide Cys) ở 250C trong tối 1giờ. Mẫu protein sau đó được thuỷ phân bằng trypsin với tỷ lệ enzyme/cơ chất bằng 1/50 ở 370C qua đêm.

2.3.2.10. Nhận dạng IL-2MN tái tổ hợp bằng khối phổ

Hỗn hợp peptide thuỷ phân với trypsin được phân tách qua cột sắc ký ngược pha

C18 trên hệ thống sắc ký lỏng nano HPLC (LC Packings, Dionex, Mỹ), các peptide sau

đó được thu và nhận dạng trực tiếp trên hệ thống khối phổ QSTAR®XL

MS/MS(AppliedBiosystems, Mỹ) với nguồn ion hoá ESI (ElectroSpray Ionization).

Phổ LC-MS/MS các mảnh peptide sau đó được so sánh trên ngân hàng dữ liệu protein

NCBInr (non-redundant database) qua sử dụng phần mềm Mascot v. 1.8 (Matrix

Science, Anh) với các thông số tìm kiếm như sau:

- Enzyme digestion: Trypsin - Type of Ions: + 2, + 3

- Taxonomy: All entries - Protein Mass: Unrestricted

- Fixed modifications: Carbamidomethyl (C) - Peptide Mass Tolerance: ± 0.5 Da

- Variable modifications: Oxidation (M) - Fragment Mass Tolerance: ± 0.5 Da

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

- Mass values: Monoisotopic - Max Missed Cleavages: 1

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

2.3.2.11. Lên men các chủng vi sinh vật tái tổ hợp IL-2 ở quy mô bình tam giác và

trong các hệ thống lên men Bioflo110 dung tích 5L và 14L

(cid:153) Lên men sản xuất IL2 tái tổ hợp ở quy mô bình tam giác:

- Giai đoạn nuôi cấy sơ cấp để làm tươi lại chủng: Lấy một đầu que cấy khuẩn lạc

riêng rẽ vào bình tam giác chứa môi trường LBA lỏng, lắc ở 370C qua đêm.

- Nuôi cấy thứ cấp để tổng hợp protein tái tổ hợp IL-2: Thu tế bào từ nuôi cấy qua

đêm bằng cách ly tâm 5 phút với tốc độ 5000 vòng/ phút. Hoà tế bào lại với môi trường LBA mới với độ pha loãng 100 lần. Nuôi lắc ở 370C đến khi độ hấp thụ

quang của dịch nuôi cấy ở 600 nm đạt 0,6.

- Bổ sung chất cảm ứng IPTG vào dịch nuôi cấy tại thời điểm này để kích thích quá

trình biểu hiện protein tái tổ hợp IL-2.

- Thu hồi mẫu theo thời gian để xác định thời điểm thích hợp mà tại đó hàm lượng

protein được tổng hợp cao nhất.

(cid:153) Lên men sản xuất IL2 tái tổ hợp trong hệ thống lên men Bioflo110 dung tích 5, 14L

i) Chủng giống, môi trường và thiết bị

Chủng giống: Chủng E. coli BL21 tái tổ hợp mang gen IL-2. Chủng được bảo

quản ở nhiệt độ -800C, hoạt hóa và nhân giống trước khi lên men.

Môi trường nhân giống và lên men: .Thành phần môi trường LBA:

- Bacto-Tryptone : 10 g/ l

- Cao nấm men : 5 g/ l

- NaCl : 10 g/ l

: 2 giọt/ l

- Dầu phá bọt Adecanol - Khử trùng 1210C trong 30 phút.

Chuẩn bị 5 lít môi trường lên men. Trước khi cấy giống, bổ sung Amp vô trùng tới nồng

độ cuối cùng là 100 μg/ml hay 100 mg/l và chỉnh pH về 6.0 (dùng HCl hoặc NaOH).

- Amp: Pha dung dịch đặc nồng độ 100 mg/ml, khử trùng bằng lọc qua màng lọc

Sattorius φ=0,2 μm. Bổ sung vào môi trường theo tỷ lệ 1 ml dung dịch/lít môi trường.

- Chất cảm ứng IPTG: Pha dung dịch đặc nồng độ 500 mM, khử trùng bằng lọc qua

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

màng lọc Sattorius φ=0,2 μm. Khi cảm ứng, bổ sung dung dịch IPTG vào môi trường

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

lên men theo tỷ lệ 2 ml/lít môi trường.

Thiết bị: Hệ thống lên men Bioflo 110 dung tích 5 lít do hãng New Brunswick

Scientific (Mỹ) sản xuất. Hệ thống này được điều khiển bằng chương trình phần mềm

BioCommand Plus cũng do hãng NBS cung cấp, cho phép kiểm soát chế độ lên men và

thu thập các thông số kỹ thuật.

Nồi khử trùng ALP (Nhật); máy lắc ổn nhiệt CPT Hàn Quốc; bơm nhu động

Masterflex L/S (Mỹ); máy ly tâm để bàn Kendro (Đức); máy ly tâm lớn Sorvall (Mỹ);

máy phổ kế SP-300 (Nhật); máy nén khí (Thomas Industries, Mỹ); máy cấp nước lạnh

(mrc BL-130, Isarel).

ii) Các bước thực hiện

Chuẩn bị giống cho lên men:

Nhân giống E. coli BL21 trong bình tam giác dung tích 250 ml chứa 50 ml môi trường LBA, nuôi trên máy lắc tròn 200 vòng/phút, nhiệt độ 370C trong 14 giờ. Ly tâm

huyền dịch tế bào 5000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ dịch nổi. Rửa tế bào bằng nước

muối sinh lý (NaCl 0,9%) vô trùng; ly tâm loại bỏ dịch rửa rồi hòa lại trong 50 ml môi

trường LBA mới.

Lên men:

Khởi động hệ thống Bioflo 110 và chương trình phần mềm BioCommand Plus. Thiết lập chế độ lên men trong bình như sau: pH môi trường 6,0; nhiệt độ 370C; sục khí

0,5 vvm (lít khí/ lít môi trường/ phút); tốc độ khuấy 200 vòng/phút.

Bổ sung 5 ml dung dịch đặc Amp vô trùng vào bình lên men. Cấy 50 ml huyền

dịch tế bào đã chuẩn bị ở trên. Lấy mẫu đo mật độ tế bào OD600 ở 0 giờ.

Các thông số chủ yếu của quá trình lên men, ví dụ nhiệt độ, độ pH, tốc độ khuấy,

nồng độ oxy hòa tan dO2, được điều khiển và lưu trữ tự động bởi chương trình phần

mềm BioCommand Plus. Điều chỉnh tốc độ khuấy trong phạm vi 200-500 vòng/phút và

sục khí 0,5-0,75 vvm để duy trì dO2 ≥ 30%.

Phân tích mẫu:

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

Sinh khối tế bào: Đo mật độ quang (OD) của huyền dịch tế bào ở bước sóng 600

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

nm trên máy phổ kế. Đồng thời, sinh khối tế bào ướt của các mẫu lấy từ bình lên men

cũng được xác định. Để thực hiện phân tích này, các ống Eppendorf sạch được cân

trước, sau đó hút vào mỗi ống Eppendorf 1,5 ml huyền dịch tế bào của mẫu cần xác

định. Ly tâm 5000 vòng/ phút trong 5 phút, loại bỏ dịch nổi. Rửa tế bào một lần bằng

1,5 ml nước muối sinh lý, ly tâm 5000 vòng/ phút trong 5 phút. Dùng pipet hút cẩn

thận để loại bỏ hết dịch nổi. Cân ống Eppendorf với cặn tế bào. Lượng sinh khối tế bào

ướt được tính bằng chênh lệch giữa trọng lượng ống có tế bào với ống ban đầu.

Chuẩn bị mẫu cho phân tích IL-2 bằng điện di:

Hút 1,5 ml huyền dịch tế bào vào ống Eppendorf, ly tâm 5000 vòng/phút trong 5

phút để thu cặn tế bào. Hòa lại trong 300 μl dung dịch đệm xử lý mẫu để bảo quản cho

tới khi điện di.

Cảm ứng sinh tổng hợp Interleukin-2:

Mật độ tế bào trong bình lên men được theo dõi liên tục cho tới khi OD đạt 0,6.

ở thời điểm đó, cảm ứng sinh tổng hợp IL-2 bằng bổ sung 10 ml dung dịch đặc IPTG và hạ nhiệt độ lên men xuống tới 300C. Từ đó, sau mỗi giờ lại lấy một mẫu cho các

phân tích như đo OD600, xác định sinh khối tế bào và lượng IL-2 tạo thành.

2.3.2.12. Tách chiết và tinh chế IL-2 tái tổ hợp từ dịch lên men bằng phương pháp sắc

ký ái lực

Cơ sở lý thuyết :

Cột sắc kí ái lực có chứa hạt gel là Sepharose có gắn ion Ni2+ trên bề mặt. Khi dịch phá tế bào qua cột, nhóm histidine của protein tái tổ hợp sẽ gắn với ion Ni2+ qua

liên kết tĩnh điện. Khi có mặt imidazole trong đệm thu protein, chất này sẽ cạnh tranh vị trí liên kết với ion Ni2+ giúp đẩy protein tái tổ hợp ra khỏi cột. Protein IL-2 tái tổ hợp

được thiết kế có chứa 6 gốc His, do vậy protein này có thể được tinh sạch qua cột sắc

ký ái lực His-Trap affinity chromatography column thể tích 5 ml (Amersham

Bioscience, Mỹ)

Chuẩn bị mẫu :

- Dịch nuôi cấy tế bào được ly tâm 5000 vòng/phút, tủa tế bào được hoà lại vào đệm

pha mẫu, bổ sung PMSF 1 mM để ức chế protease và giữ trong -850C.

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

- Mẫu tế bào từ -850C làm tan ở 370C, phá tế bào bằng lysozyme (0,2 mg/ml) ở 40C.

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

- Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút, phần dịch nổi được lọc qua màng lọc kích

thước 0,45 μm (Milipore, Mỹ) trước khi đưa lên cột.

Đệm tinh sạch:

- Binding buffer: 50 mM sodium phosphate, 0,5 M NaCl, pH 7,4 và 10 mM imidazole

- Washing buffer: thành phần giống binding buffer và 50 mM immidazole

- Elution buffer: thành phần giống binding buffer và 300 mM immidazole

- Ethanol 20%.

Các bước tinh sạch:

- Cân bằng cột với 15 ml binding buffer với tốc độ 3 ml/phút

- Đưa 30 ml mẫu lên cột với tốc độ 1 ml/phút

- Rửa cột với 30 ml binding buffer với tốc độ 3 ml/phút

- Rửa cột với 30 ml washing buffer với tốc độ 3 ml/phút

- Đẩy protein tái tổ hợp ra khỏi cột với 10 ml elution buffer tốc độ 3 ml/phút

- Rửa cột bằng 50 ml binding buffer cho để các protein được loại khỏi cột

- Giữ cột trong ethanol 20%.

- Kiểm tra phân đoạn protein đã thu trên gel polyacrylamide 12,5%.

2.3.2.13. Cắt protein lai Trx-IL2MN bằng enterokinase

Cơ sở lý thuyết: Protein lai tinh sạch từ bước trên được cắt bởi Enterokinase

thành 2 protein Trx và IL-2. Do phần Trx có gắn đuôi His-tag nên được bám trên cột

sắc ký ái lực Histrap HP còn phần IL-2 không bám nên trôi ra ngoài. IL2 được thu lại

và đông khô để tăng nồng độ và giữ hoạt tính của sản phẩm.

Phương pháp: Phản ứng được tiến hành ở 250C trong 16 giờ với tổng thể tích 60

μl, bao gồm: 50 μl dịch protein, 2 μl enterokinase (1U/ 40 μg), 3 μl Tris-HCl 1M, 5 μl

CaCl2. 0.1M. Sản phẩm cắt sẽ được kiểm tra bằng điện di SDS-PAGE trên gel

polyacrylamide 12,5%.

2.3.2.14. Phương pháp loại pyrogen khỏi IL-2 bằng kit Affi-Prep, Polymyxin matrix

Cơ sở lý thuyết: Để loại bỏ được chế nhiệt tố (pyrogen) ra khỏi protein tái tổ

hợp IL-2, cột Affi-Prep, Polymyxin matrix chứa các hạt polymeric macroporous có

đường kính 45µm gắn với USP Grade Polymyxin B thường được sử dụng. Cột loại

pyrogen có thể loại được nội độc tố (endotoxin) bằng sắc ký ái lực. Để quá trình này

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

được hiệu quả, tất cả các dụng cụ thí nghiệm và dung dịch đệm phải được chuẩn bị

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

trong nước vô trùng không có pyrogen và sau khi sử dụng, chất nền phải được kiềm

hóa bằng việc xử lý với 0,1N NaOH trong thời gian nhất định trước khi sử dụng lại cho lần thí nghiệm tiếp theo. Sắc ký ái lực được thực hiện ở nhiệt độ phòng hoặc 40C.

Phương pháp:

- Chuẩn bị cột loại pyrogen: hạt gel (bộ kit Affi-Prep Polymyxin mua từ hãng Bio-

Rad) ngâm trong dung dịch bảo quản được nhồi lên cột sắc kí 5 ml.

- Loại bỏ pyrogen ra khỏi cột bằng cách rửa cột với 3 lần thể tích 0,1N NaOH với tốc

độ 1 ml/phút.

- Tiếp tục rửa cột với 10-15 lần thể tích nước vô trùng.

- Cân bằng cột với dung dịch đệm không chứa pyrogen (10 mM đệm phosphate, 100

mM NaCl, pH 6). Khả năng liên kết ái lực tốt nhất của endotoxin là trong dung dịch

đệm phosphate 10-50 mM, pH 6-7. Nồng độ muối cao hơn 0,2 mM có thể làm giảm

hiệu quả liên kết của endotoxin với chất nền trong một số điều kiện). Đệm đẩy

protein ra khỏi cột cần phải được chuẩn bị không chứa pyrogen và ở dạng trung tính

trước khi bắt đầu thực hiện sắc ký.

Quá trình sắc ký:

- Cho mẫu protein tinh sạch qua cột với vận tốc 0.1 ml/phút (cid:198) thu lại dịch qua cột,

bảo quản ở 40C. Do phản ứng động học giữa endotoxin và chất nền nên tốc độ đưa

mẫu lên cột và tốc độ đẩy protein phụ thuộc vào endotoxin có trong mẫu. Endotoxin

tự do có khả năng liên kết tương đối nhanh với chất nền, trong khi dung dịch có

chứa endotoxin gắn với protein thì liên kết với chất nền tương đối chậm. Vì vậy,

các mẫu có endotoxin liên kết chặt chẽ với protein có thể được ủ qua đêm ở 40C

với Affi-Prep, Polymyxin matrix và lắc nhẹ để làm tăng hiệu quả liên kết của

endotoxin với chất nền.

- Lặp lại bước 2 và 3 để cân bằng lại cột. Các bước cân bằng cột có thể được thực

hiện ở tốc độ nhanh hơn so với tốc độ liên kết của endotoxin.

- Giữ cột trong 0.05M HEPES, pH7.5 có chứa 0.05% sodium azide.

2.3.2.15. Thử nghiệm tác dụng của IL-2 trên động vật gây ung thư thực nghiệm

(cid:153) Đối tượng

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

- 400 chuột nhắt đực trắng dòng Swiss và thức ăn tổng hợp dưới dạng viên nén được

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

Viện Vệ sinh Dịch Tễ Trung ương cung cấp.

- Dòng tế bào ung thư báng Sarcoma 180 do phòng Nghiên cứu UTTN cung cấp.

(cid:153) Hoá chất

- Hóa chất gây ung thư Azoxymethane (AOM) do hãng Sigma, Hoa Kỳ cung cấp.

- Thuốc nhuộm Haematoxylin, Eosin và Xanh methylen do hãng BioRad cung cấp.

- IL2 tái tổ hợp của Viện Công nghệ Sinh học và IL2 của Trung Quốc do Viện CNSH

cung cấp.

- Dầu Oliu thực phẩm tinh khiết.

(cid:153) Thiết bị

- Kính hiển vi điện tử truyền qua JEM 1010 của Nhật

- Kính hiển vi Olympus BH2 với hệ thống chụp ảnh tự động của Nhật

- Kính lúp Olympus và máy ảnh kĩ thuật số hãng Sony của Nhật

- Máy cắt lát Microtom và hệ thống làm tiêu bản hiển vi của Mỹ.

- Máy ly tâm Hettich của Đức và các ống đong chuẩn.

(cid:153) Gây ung thư thực nghiệm đường tiêu hóa cho chuột nhắt trắng bằng hóa chất AOM

- Tiêm truyền AOM dưới da cho chuột với liều 15mg/con/lần/tuần x 2 tuần.

- Cho chuột uống (per.os) 0,2ml dầu Ôliu 1 lần/tuần x 14 tuần để kích thích sự

phát triển của u.

- 14 tuần sau khi tiêm AOM tiến hành mổ chuột để kiểm tra sự phát sinh u ở đại

trực tràng (bằng cách bổ dọc đại trực tràng, rửa bằng dung dịch sinh lý NaCl 0,9%, cố định bằng cồn 70o trong 20 phút, nhuộm xanh methylen 0,04% ở 40C trong 15

phút sau đó quan sát dưới kính lúp và chụp ảnh).

(cid:153) Nghiên cứu mô bệnh học ruột chuột dưới tác dụng của IL2

- Gây ung thư thực nghiệm đường ruột cho chuột bằng hóa chất AOM.

- 30 ngày sau khi truyền hóa chất, chuộtViệt Nam điều trị bằng chế phẩm IL2 (của

Việt Nam và Trung quốc) theo phác đồ sau:

• Chuột được điều trị cách tuần trong hai đợt, mỗi đợt cách nhau 30 ngày.

• Đợt I : Tiêm dưới da IL2 liều 600.000 IU/kg/lần x 5 lần/tuần x 5 tuần

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

Song song với điều trị bằng IL2, chuột được uống dầu Oliu với liều 0,2ml/con/

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

lần/ tuần x 14 tuần.

• Đợt II: tiếp tục điều trị như đợt I nhưng ngừng cho chuột uống dầu Oliu.

- Tuần thứ 40 sau khi truyền hóa chất, chuột được mổ để:

• Lấy ruột làm tiêu bản hiển vi mô bệnh học theo kỹ thuật thường quy. Quan

sát tiêu bản và chụp ảnh dưới kính hiển vi Olympus BH2 với hệ thống

chụp ảnh tự động.

• Quan sát các nốt di căn lên gan (nếu có).

• Lấy máu để xét nghiệm công thức bạch cầu.

(cid:153) Nghiên cứu hoạt tính kháng u báng của IL2

- Gây u báng thực nghiệm trong xoang bụng cho 120 chuột: 106 TBUT Sarcoma 180

được cấy truyền vào xoang bụng mỗi chuột.

- Hai ngày sau cấy truyền ung thư, các chuột ở lô thí nghiệm được tiêm (i.p cách nhật)

chế phẩm IL2 tái tổ hợp của Việt nam và Trung quốc, liều 600.000 IU/kg với lượng

0,2ml/con x 4 lần .

- Ngày thứ 14 sau cấy truyền tiến hành mổ chuột để khảo sát các chỉ tiêu nghiên cứu sau :

• Sinh khối u: là thể tích tế bào ung thư phát triển trong xoang bụng chuột sau ly

tâm (ml).

• Tỷ số phát triển u (%) :

Sinh khối trung bình của u ở lô thí nghiệm

GR = --------------------------------------------------- x 100% Sinh khối trung bình của u ở lô đối chứng • Tỷ số ức chế u (%):

IR = (100 - GR) x 100%

• Đánh giá hiệu lực kháng u của các chế phẩm theo thang H.Itokawa (1989):

GR từ 0 đến 10% (+++), từ 11 đến 40% (++), từ 41 đến 70% (+), trên 70% (-).

- Làm tiêu bản hiển vi quang học và hiển vi điện tử để đánh giá tác động của IL2 lên

hình thái cấu trúc của tế bào u báng Sarcoma 180.

(cid:153) Nghiên cứu thời gian sống thêm của chuột ung thư được điều trị bằng IL2

- Gây u báng thực nghiệm trong xoang bụng cho 30 chuột và điều trị bằng các chế

phẩm IL2 được tiến hành như ở trên. Số chuột trên được chia làm 3 lô: Lô đối chứng

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

ung thư và 2 lô điều trị bằng IL2 của TQ và VN.

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

- Ngày thứ 14 sau cấy truyền không tiến hành mổ chuột mà tiếp tục theo dõi và ghi

nhật kí thời gian sống của chuột ở các lô cho đến ngày thứ 40.

- Xác định thời gian sống trung bình (ngày) của chuột ở mỗi lô và tính thời gian sống

kéo dài thêm của chuột (ILS%) ở các lô được điều trị bằng IL2:

Thời gian sống trung bình của chuột ở lô điều trị ILS = ------------------------------------------------------------ x 100% Thời gian sống trung bình của chuột ở lô đối chứng

2.3.2.16. Đánh giá chất lượng của chế phẩm IL-2

(cid:153) Xác định hiệu giá (hàm lượng) của IL-2

- Sử dụng phiến nhựa vô trùng 96 giếng và môi trường nuôi tế bào M-1640

- Sử dụng interleukin-2 mẫu chuẩn quốc tế có chứa 102 đơn vị quốc tế (đvqt)/lọ

để xác định số đvqt IL-2 của sản phẩm.

- Các giếng thử nghiệm: Cho cùng thể tích môi trường M-1640 và cho IL-2 sản

phẩm theo hàm lượng dần.

- Các giếng so sánh: Cho IL-2 thương phẩm của Hãng Shenzhen Kexing

Bioproduct có chứa 100.000 đvqt/lọ 1 ml đã được phép lưu hành tại Trung Quốc.

- Các giếng chứng: Không cho IL-2.

- Sử dụng tế bào NK phụ thuộc IL-2 cho vào tất cả các giếng. - Theo dõi sự phát triển của tế bào NK ở nhiệt độ 37o C và khí trường thích hợp.

Đọc kết quả sau 72 giờ.

Hiệu giá của IL-2 đạt yêu cầu khi kết quả đạt được trong khoảng từ 80% đến

120% hàm lượng ghi trên nhãn mẫu đối chứng.

(cid:153) Xác định tính vô trùng

- Sử dụng môi trường dinh dưỡng thioglycolat để phát hiện vi khuẩn hiếu khí và kị khí,

môi trường soybean casein dạng lỏng để phát hiện vi nấm. _ Cấy IL-2 sản phẩm vào hai môi trường trên. - Theo dõi hàng ngày ở nhiệt độ 35oC đối với môi trường thioglycolat và 25 oC

đối với môi trường soybean casein. Đọc kết quả cuối cùng vào ngày thứ 14.

IL-2 đạt tiêu chuẩn vô trùng nếu ở ngày thứ 14 không có vi khuẩn hoặc vi nấm

mọc trên hai môi trường.

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

(cid:153) Xác định tính an toàn

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

- Sử dụng 2 chuột lang thí nghiệm nặng khoảng 350 g, và 2 chuột nhắt thí

nghiệm 5 tuần tuổi, không có biểu hiện bệnh lý, khoẻ mạnh và tăng trọng bình thường

trong thời gian cách lý ít nhất là 5 ngày.

- Tiêm 5 ml IL-2 sản phẩm vào màng bụng chuột.

- Theo giõi chuột ít nhất 7 ngày.

IL-2 đạt yêu cầu an toàn nếu chuột khoẻ mạnh và tăng trọng bình thường.

(cid:153) Xác định chất gây sốt

- Sử dụng 3 thỏ thí nghiệm cân năng ít nhất 1,5 kg, thân nhiệt không trên 39 oC - Cách ly thỏ 2 ngày ở nhiệt độ 20-25 oC.

- Không cho thỏ ăn mà chỉ cho uống nước trong vòng 16 giờ truớc khi thí

nghiệm và cho đến lúc kết thúc thí nghiệm

- Đo nhiệt độ hậu môn thỏ. Kiểm tra nhiệt độ thỏ 15 phút trước tiêm IL-2. Nếu thân nhiệt thỏ không trên 39oC thì tiến hành thí nghiêm.

- Tiêm IL-2 vào tĩnh mạch tai thỏ

- Sau tiêm, ghi nhiệt độ thỏ ít nhất 3 lần trong vòng 3 giờ, cách nhau

1 giờ. Nhiệt độ cao nhất của thỏ ghi nhận được trong mỗi lần đo được gọi là nhiệt độ

tối đa. Hiệu số giữa nhiệt độ tối đa và nhiệt độ đo lần đầu sau tiêm được goi là nhiệt độ chênh lệch. Nhiệt độ chênh lệch của một thỏ phải ≤ 0,6 oC. Tính tổng nhiệt độ chênh

lệch của 3 thỏ.

IL-2 đạt yêu cầu về chất gây số nếu tổng nhiệt độ chênh lệch của 3 thỏ ≤ 1,3 oC.

(cid:153) Xác định tính chất lý hoá

- Xác định độ trong và màu sắc băng mắt thường dưới ánh sáng trắng.

- Xác định pH bằng máy đo pH.

- Xác định chất bảo quản thimerosal bằng phương pháp quang phổ.

- Sử dụng bình gạn. Cho IL-2 sản phẩm vào và dung dịch thimerosal chuẩn

0,01% một lượng ngang nhau, ít hơn 10 ml vào 2 bình gạn riêng biệt, thêm

vừa đủ 10 ml dung dịch amoni acetat 1% pH 6,0.

- Thêm 10 ml dung dịch diphenylthiocarbazon (ditizon) 0,01% trong

cloroform vào các bình gạn và lắc 45 giây.

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

- Cẩn thận tách lớp cloroform ra.

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

- Chỉnh máy ở các điểm 0 và 100% ở bước sóng 490 nm bằng dung dịch

ditizon pha loãng và đo phổ của dung dịch IL-2 ở các bước sóng từ 250 đến

470 nm, vẽ đồ thị và xác định nồng độ thimerosal có trong mẫu IL-2.

- Sinh phẩm y tế nếu có cho chất bảo quản thimerosal thì hàm lượng phải

≤ 0,012 g/l

- Phát hiện protein ngoại lai bằng phương pháp điện di.

Thông thường, trong sinh phẩm y tế dạng tiêm, ngoài protein hoạt chất, không

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

có protein ngoại lai.

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

CHƯƠNG 3 NHỮNG NỘI DUNG VÀ KẾT QUẢ ĐÃ THỰC HIỆN

3.1. KẾT QUẢ TẠO DÒNG GEN IL-2

3.1.1. Tách chiết RNA tổng số từ người và tổng hợp cDNA mã hóa gen IL-2

3.1.2. Gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng PCR 2.1-TA

3.1.3. Xác định trình tự nucleotide của gen IL-2

3.1.4. Kết luận

3.1.1. Tách chiết RNA tổng số từ người và tổng hợp cDNA mã hóa gen IL-2

RNA tổng số được tách chiết từ tế bào lách người như mô tả trong phần phương

pháp. Kết quả trên hình 5 cho thấy các RNA tách được đã khá sạch và nguyên vẹn,

gồm 3 băng đặc trưng cho RNA (28S, 18S và 5S). Kết quả đo phổ hấp thụ của RNA ở

260 nm cho thấy phổ RNA nhận được ở dạng một peak đặc trưng với đỉnh hấp thụ ở

260 nm. Tỉ số OD 260/280 nm của các mẫu nhận được đều đạt đạt yêu cầu (>1.8). Hàm

lượng RNA tổng số của các mẫu mô lách nhận được đạt xấp xỉ 3 μg/μl tương ứng

khoảng 180-200 μg từ 1 gram mẫu tươi.

Hình 5. Điện di các RNA tổng số tách từ mẫu mô lách người Việt Nam Đường chạy số 1, 2, 3: các mẫu mô lách.

Nhân gen bằng kỹ thuật PCR:

Trình tự gen IL-2 gồm 133 amino acid (đã được loại bỏ 20 amino acid tín hiệu

tiết) được nhân lên bằng kỹ thuật RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu và các điều kiện như

đã được mô tả trong phần phương pháp. Kết quả trên hình 6 cho thấy xuất hiện một

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

băng DNA có kích thước khoảng 400 bp tương đương với kích thước của đoạn gen IL-

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

2 cần nhân theo thiết kế. Như vậy sản phẩm PCR thu được là đặc hiệu và có thể sử

dụng cho phản ứng nối ghép gắn gen vào vector tách dòng.

M 1 2

bp

Sản phẩm PCR

500 400 300 200 100

Hình 6. Sản phẩm PCR nhân gen IL-2 M: DNA chuẩn 100 bp; Đường chạy 1, 2: Sản phẩm PCR

3.1.2. Gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pCR 2.1-TA

Sản phẩm PCR nhân gen IL-2 được gắn vào vector tách dòng pCR 2.1-TA

(Invitrogen) và được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α. Các dòng tế bào được

chọn lọc theo hướng dẫn của hãng Invitrogen. DNA plasmid được tách chiết và làm

sạch theo Sambrook và cộng sự. Để xác định sự có mặt của đoạn gen mới được chèn

trong vector tách dòng pCR 2.1 TA, DNA plasmid của các dòng tế bào này được tách

chiết và xử lý bằng enzyme giới hạn EcoR I. DNA plasmid của các dòng tế bào chọn

lọc sau khi cắt bằng enzyme EcoR I được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%

M 1 2

(Hình 7, đường chạy 1 và 2).

Sản phẩm cắt

500 400

300

Hình 7. Kết quả cắt kiểm tra DNA các plasmid bằng enzyme EcoR I.

Đường chạy M: DNA chuẩn 100 bp; Đường chạy 1 và 2 là các plasmid của các dòng 1 và 2 sau khi đựơc xử lý bằng EcoR I.

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

Kết quả điện di đồ trên Hình 7 cho thấy các plasmid trên đường chạy 1 và 2 sau

khi cắt bằng EcoR I có văng ra một băng có kích thước tương đương với sản phẩm

PCR (399 bp). Như vậy các dòng plasmid này đã được gắn sản phẩm PCR.

3.1.3. Xác định trình tự nucleotide của gen IL-2

Để khẳng định sản phẩm đã tách dòng là đoạn gen mã hóa cho IL-2, các dòng 1

và 2 được tiến hành xác định trình tự nucleotide trên máy đọc trình tự tự động ABI

PRISM®3100 Avant Gentic Analyzer (Applied Biosystems). Trình tự nucleotide của

IL-2 tách dòng được so sánh với trình tự gen IL-2 đã đăng kí trên ngân hàng dữ liệu

gen quốc tế NCBI với số đăng ký là NP_000577 và phân tích bằng phần mềm ABI

PRISM® 3100 Avant Data Collection v 1.0 và Clustal-X (Hình 8).

Kết quả phân tích trên hình 8 cho thấy, so với gen IL-2 đã được đăng kí trên

ngân hàng dữ liệu gen quốc tế với số đăng kí NP_000577 thì gen IL-2 đã tách dòng có

4 nucleotide đơn thay đổi: (1) A ở vị trí 36 được thay bằng G; (2) G ở vị trí 54 được

A36

G54T

T74C

GenBank GCACCTACTTCAAGTTCTACAAAGAAAACACAGCTACAACTGGAGCATTTACTGCTGGAT 60 IL2 GCACCTACTTCAAGTTCTACAAAGAAAACACAGCTGCAACTGGAGCATTTACTTCTGGAT *********************************** ***************** ****** GenBank TTACAGATGATTTTGAATGGAATTAATAATTACAAGAATCCCAAACTCACCAGGATGCTC 120 IL2 TTACAGATGATTTCGAATGGAATTAATAATTACAAGAATCCCAAACTCACCAGGATGCTC ************* ********************************************** GenBank ACATTTAAGTTTTACATGCCCAAGAAGGCCACAGAACTGAAACATCTTCAGTGTCTAGAA 180 IL2 ACATTTAAGTTTTACATGCCCAAGAAGGCCACAGAACTGAAACATCTTCAGTGTCTAGAA ************************************************************ GenBank GAAGAACTCAAACCTCTGGAGGAAGTGCTAAATTTAGCTCAAAGCAAAAACTTTCACTTA 240 IL2 GAAGAACTCAAACCTCTGGAGGAAGTGCTAAATTTAGCTCAAAGCAAAAACTTTCACTTA ************************************************************ GenBank AGACCCAGGGACTTAATCAGCAATATCAACGTAATAGTTCTGGAACTAAAGGGATCTGAA 300 IL2 AGACCCAGGGACTTAATCAGCAATATCAACGTAATAGTTCTGGAACTAAAGGGATCTGAA ************************************************************ GenBank ACAACATTCATGTGTGAATATGCTGATGAGACAGCAACCATTGTAGAATTTCTGAACAGA 360 IL2 ACAACATTCATGTGTGAATATGCTGATGAGACAGCAACCATTGTAGAATTTCTGAACAGA ************************************************************ GenBank TGGATTACCTTTTGTCAAAGCATCATCTCAACACTGACT 399 IL2 TGGATTACCTTTTGTCAAAGCATCATCTTAACACTGACT **************************** **********

thay bằng T; (3) T ở vị trí 74 được thay bằng C và (4) C ở vị trí 389 được thay bằng T.

C389T Hình 8. Kết quả so sánh trình tự IL-2 nhận được với trình tự trên ngân hàng gen quốc tế NCBI với số đăng ký là NP_000577; GenBank: trình tự NP_000577; IL-2: trình tự mẫu.

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

Để xem xét các biến đổi này có làm thay đổi về trình tự amino acid trong phân

tử protein hay không, trình tự nucleotide tách dòng được chuyển đổi sang trình tự

amino acid qua sử dung phần mềm DNA Club và so sánh với trình tự amino acid gen

IL2 theo số đăng kí NP_000577. Kết quả cho thấy trong 4 biến đổi về nucleotide trên

có hai biến đổi về amino acid là 1) ở vị trí 25, Leu biến đổi thành Ser và 2) ở vị trí 130,

Ser biến đổi thành Leu (hình 9). Như vậy trình tự gen IL-2 nhận được đã có 2 thay đổi

về amino acid so với trình tự NP_000577. Điều đó cho thấy sự đa dạng của gen IL-2 ở

Leu →Ser

Ser →Leu (130)

NP_000577 60 APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLE IL2 60 APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMISNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLE ************************ *********************************** NP_000577 120 EELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNR IL2 120 EELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNR ************************************************************ NP_000577 WITFCQSIISTLT 133 Protein_IL2 WITFCQSIILTLT 133 ********* ***

các tộc người khác nhau.

Hình 9. So sánh trình tự amino acid đã được dịch mã của gen IL-2 nhận được Protein_IL-2) và trình tự amino acid đã đăng kí trên ngân hàng dữ liệu gen quốc tế với số đăng ký NP_000577.

3.1.4. Kết luận

Từ các kết quả đã nhận được, chúng tôi rút ra một số kết luận sau: Đã tách dòng

và xác định trình tự đoạn gen mã hóa cho IL-2 có kích thước 399 bp (133 amino acid)

từ RNA tổng số của lách người bằng kỹ thuật RT-PCR. Kết quả phân tích trình tự gen cho thấy có hai biến đổi về amino acid là Leu25 thành Ser25 và Ser130 biến đổi thành Leu130. Như vậy trình tự gen IL-2 nhận được đã có 2 thay đổi về amino acid so với

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

trình tự NP_000577 của gen IL-2 đăng ký trong Genbank.

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

3.2. KẾT QUẢ TẠO ĐỘT BIẾN GEN IL-2

3.2.1. Tạo đột biến điểm làm mất điểm glycosyl hóa và thay thế Cys125 bằng Ser125

3.2.1.1. Phương pháp tạo đột biến và nhân đoạn gen rhIL2 bằng các oligonucleotide tổng hợp

3.2.1.2. Kết quả nhân và tách dòng gen rhIL2

3.2.1.3. Xác định trình tự gen rhIL2 3.2.2. Gây hồi biến Ser25 thành Leu25

3.2.2.1. Phương pháp tạo đột biến và nhân đoạn gen Trx-rhIL2MN bằng oligonucleotide tổng hợp

3.2.2.2. Kết quả tách dòng gen Trx-rhIL2MN và xác định trình tự gen

3.3.3. Kết luận 3.2.1. Tạo đột biến điểm làm mất điểm glycosyl hóa và thay thế Cys125 bằng Ser125

3.2.1.1. Phương pháp tạo đột biến và nhân đoạn gen rhIL2 bằng các đoạn mồi

oligonucleotide tổng hợp

Trong thiết kế trình tự cặp mồi oligonucleotide dùng để nhân đoạn gen rhIL2

bằng kỹ thuật PCR, một số đột biến đã được đưa vào trong trình tự mồi để đạt các mục

đích sau: i) Biến đổi điểm nhận biết glycosyl hóa APT ở đầu N của IL-2 thành AMA

bằng cách sử dụng đoạn mồi xuôi mã hóa cho vùng đầu N của IL-2 có chứa các trình tự nucleotide ATG (mã hóa cho Met2) thay cho CCT (mã hóa cho Pro2) và trình tự GCT (mã hóa cho Ala3) thay cho ACT (mã hóa cho Thr3); ii) Thay thế gốc Cystein ở vị trí 125 thành Serine bằng cách thay trình tự TGT (mã hóa cho Cys125) bằng TCG (mã hóa cho Ser125) trên đoạn mồi ngược; iii) Hồi biến gốc Leucine ở vị trí 130 thành Serine bằng cách thay TTA (mã hóa cho Leu130) bằng TCA (mã hóa cho Ser130) trên đoạn mồi

ngược. Các thay đổi này được thể hiện trên trình tự các đoạn mồi xuôi và ngược dùng

Met2 Ala3 5’-Forward: AGCC ATG GCT tca agt tct aca aag aaa Nco I

3’-Reverse: AGGCGGCCGC TCA AGT TAG TGT TGA GAT GAT GCT TTG CGA AAA GG Not I Stop Ser130 Ser125

để nhân gen IL-2 như được trình bày dưới đây.

PCR được tiến hành với tổng thể tích 50 μl. Dịch phản ứng bao gồm Taq DNA

polymerase 0.5 U/μl (ROCHE), 0.5 μM mồi mỗi loại, 0.25 mM mỗi loại dNTP, 2 mM

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

MgSO4, 1 μM DNA vector pCR-rhIL2 (100 ng), đệm 10X PCR. Chương trình PCR được tiến hành theo các bước: 940C trong 1 phút; 940C trong 30 giây; 580C trong 1

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

phút; 720C trong 1 phút (25 chu kỳ lặp lại từ bước 2); 720C trong 5 phút. Sản phẩm

PCR được kiểm tra trên gel agarose 0.8% và tinh sạch qua kit tinh sạch PCR bằng cột GFX. Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được giữ trong -200C.

Gen rhIL2 sau khi nhân lên được gắn vào vector tách dòng pCR2.1-TOPO

(Invitrogen) tại hai vị trí enzyme hạn chế Nco I và Not I tạo nên vector tái tổ hợp pCR-

rhIL2. Plasmid tái tổ hợp được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α và được tách

chiết theo phương pháp của Sambrook (Sambrock và cộng sự). Trình tự DNA được

tiến hành xác định trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM® 3100 Avant Gentic

Analyzer (Applied Biosystems, Mỹ) để khẳng định kết quả tạo đột biến.

3.2.1.2. Kết quả nhân và tách dòng gen rhIL2

Điều kiện để nhân gen IL-2 bằng kỹ thuật PCR được thực hiện như đã mô tả

trong phần phương pháp. Kết quả được trình bày trên hình 10. Kết quả điện di trên hình

10 cho thấy sản phẩm PCR thu được có một băng DNA duy nhất với kích thước

khoảng 400 bp tương đương với kích thước của đoạn gen rh-IL2. Như vậy sản phẩm

PCR thu được là đặc hiệu và có thể sử dụng cho phản ứng nối ghép gen vào vector tách

dòng pCR2.1.

1 2

1000

400

750 500 250

Hình 10. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8% Đường chạy 1: DNA chuẩn 1 kb (Fermentas) Đường chạy 2: Sản phẩm PCR

Gen rhIL2 nhận được được gắn vào vector tách dòng pCR2.1-TOPO

(Invitrogen) tại hai vị trí enzyme hạn chế Nco I và Not I tạo nên vector tái tổ hợp pCR-

rhIL2. Plasmid tái tổ hợp được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α và được tách

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

chiết theo phương pháp của Sambrook (Sambrock và cộng sự).

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

Để xác định sự có mặt của gen rhIL2 trong vector tách dòng pCR2.1, plasmid

tái tổ hợp (pCR-rhIL2) của các dòng tế bào này được tách chiết và xử lý bằng enzyme

hạn chế Not I và Nco I. Sản phẩm cắt DNA plasmid của các dòng tế bào chọn lọc được

1 2 3 4 5 6 7 M 8 9 10

kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0.8% (Hình 11).

bp

400

1000 750 500 250

Hình 11. Kết quả cắt kiểm tra DNA plasmid các dòng biến nạp bằng Not I và Nco I

Đường chạy M: DNA chuẩn 1kb (Fermentas)

Đường chạy 1-10: Sản phẩm cắt pCR-rhIL2 bằng Not I và Nco I

Kết quả điện di trên hình 11 cho thấy trong số các dòng biến nạp được cắt kiểm tra,

dòng số 4 và số 10 văng ra một băng tương đương với kích thước gen rhIL2 (khoảng 400

bp). Kết quả này cho thấy đoạn gen rhIL2 đã được tách dòng vào vector pCR2.1.

3.2.1.3. Xác định trình tự gen rhIL2

Để xác định pCR-rIL2 mang trình tự gen đột biến, các dòng số 4 và 10 được

chọn lọc và tiến hành xác định trình tự nucleotide trên máy đọc trình tự tự động ABI

PRISM®3100 Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Mỹ). Trình tự nucleotide

được xử lý bằng chương trình Chromas 2.13 (Australia).

So sánh kết quả đọc trình tự gen dòng số 4 mang gen rhIL2 đã đột biến với trình

tự gen IL-2 đăng kí trên ngân hàng dữ liệu quốc tế (Genbank) bằng chương trình Blast

2.0 (hình 11) cho thấy vị trí nhận biết quá trình glycosyl hóa gồm có trình tự nucleotide CCT (mã hóa cho Pro2) được thay thế bằng ATG (mã hóa cho Met2), trình tự ACT (mã hóa cho Thr3) được thay thế bằng GCT (mã hóa cho Ala3) và trình tự TGT (mã hóa cho Cys125) được thay bằng TCG (mã hóa cho Ser125). Như vậy chúng tôi đã tạo đột biến

thành công 3 vị trí trong gen rhIL2 (Hình 12). Dòng gen IL-2 đột biến nhận được với 2

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

loại đột biến như trên được ký hiệu là dòng rhIL2MM.

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

Ala1 Pro2 Thr3 Ser4 Ser5 Ser6 Thr7 Lys8 Lys9

Phe124 Cys125 Gln126 Ser127 Ile128 Ile129

A

Ala1 Met2 Ala3 Ser4 Ser5 Ser6 Thr7 Lys8 Lys9

Phe124 Ser125 Gln126 Ser127 Ile128 Ile129

B

Hình 12. Kết quả đọc trình tự nucleotide của dòng số 4 chứa gen rhIL2

A: Trình tự nucleotide của rhIL2 trên ngân hàng GenBank trước khi đột biến tại vị trí Pro2, Thr3 và Cys125 B: Trình tự nucleotide của rhIL2 sau khi đột biến thành Met2, Ala3 và Ser125

3.2.2. Gây hồi biến Ser25 thành Leu25

Theo kết quả phần tạo đột biến gen (phần 3.2.1), chúng tôi đã tạo được dòng gen có chứa 2 đột biến là làm mất điểm glycosyl hoá (trình tự amino acid Pro2 Thr3 được thay thế bằng Met2 Ala3 và đồng thời tạo đột biến thay thế Cys125 thành Ser125 để ngăn

cản sự tạo thành cầu disunfide. Tuy nhiên dòng gen IL-2 mà chúng tôi tách dòng (xem

kết quả phần 3.1.3) có một điểm khác so với trình tự IL-2 chuẩn đã được sử dụng để

tổng hợp thuốc Proleukin IL-2 đó là bộ ba mã hoá cho amino acid Leu ở vị trí 25 bị

thay bằng bộ ba mã hoã cho Ser. Do Proleukin IL-2 đã được FDA công nhận là thuốc

chữa một số bệnh ung thư ở người như ung thư biểu mô thận và u hắc tố và mục đích

của chúng tôi là tạo ra được sản phẩm thuốc giống với dược phẩm Proleukin IL-2 của Mỹ nên chúng tôi phải gây hồi biến gen IL-2 ở Ser25 thành Leu25 để giống với trình tự

gen đã được công nhận rộng rãi.

3.2.2.1. Phương pháp tạo đột biến và nhân đoạn gen rhIL2MN bằng các đoạn mồi oligonucleotide tổng hợp

Như trình bày ở trên, gen IL-2 chúng tôi tách dòng được từ tế bào lách người

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

Việt Nam có một điểm khác so với các trình tự IL-2 chuẩn đó là gốc leucine ở vị trí 25

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

biến đổi thành Serine, do đó để tạo đột biến thay thế Ser thành Leu chúng tôi dùng

phương pháp tạo đột biến bằng mồi oligonucleotide. Do gần vị trí gây đột biến có một

vị trí cắt của enzyme hạn chế Ase I và đây cũng là vị trí cắt duy nhất của Ase I trên gen

IL-2 nên chúng tôi thiết kế mồi có chứa cả vị trí cắt của enzyme Ase I. Việc thiết kế

điểm cắt của Ase I sẽ thuận lợi cho chúng tôi nối lại gen IL-2 sau khi đã gây đột biến.

Dưới đây là trình tự đoạn mồi oligonucleotide ngược chiều IL-2(S-L)r để

tạo đột biến thay thế Ser thành Leu ở vị trí 25 với bộ ba 5’CAG 3’ là bộ ba đối mã

của 5’CTG 3’ – mã hoã cho Leu và trình tự ATTAAT là vị trí nhận biết của

(1) Mồi xuôi: 5’-TCGAATTCAGCGATAAAATTATTCACCTG-3’

EcoR I

(2) Mồi ngược hồi biến: 5’-AGATTAATTCCATTCAGAATCATCTGTAAATC-3’

AseI

(3) Mồi ngược: 5’-AGGCGGCCGCTCAAGTTAGTGTTGAGATGATGCTTTGCGAAAAGG-3’

Not I Stop

enzyme hạn chế Ase I.

Bộ ba CAG ở mồi (2) là đối mã của GTC, bộ ba mã hóa cho Leu ở vị trí 25 của IL-2

- Gen rhIL-2MM trên vector pET32-rhIL2MM (có chứa 2 đột biến làm mất điểm glycosyl hóa và thay thế Cys125 thành Ser125) được dùng làm khuôn để tạo đột biến chuyển Ser25 thành Leu bằng kỹ thuật PCR. Plasmid pET32-

rhIL2MM là sản phẩm trung gian trong quá trình thiết kế vector biểu hiện IL-2

mà chúng tôi sẽ trình bày ở phần sau. Plasmid này chứa gen IL-2 ở dạng lai

với protein Thioredoxin của E. coli.

- Plasmid pTZ57R/T (Fermentas, Mỹ) được dùng làm vector tách dòng.

- Các vector pPIC9 và pPICZαA (Invitrogen, Mỹ) được dùng làm vector biểu

hiện.

- Chủng vi khuẩn E. coli DH5α được dùng làm vi khuẩn tách dòng.

- Các đoạn mồi oligonucleotide được dùng để nhân các đoạn gen

Đoạn gen để tạo đột biến điểm hồi biến Ser thành Leu được nhân lên bằng

PCR nhờ cặp mồi (1) và (2) có kích thước khoảng 600 bp. Đoạn gen Trx-

rhIL2MM được sử dụng làm khuôn trong phản ứng nhân gen bằng PCR nhờ cặp

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

mồi (1) và (3) có kích thước khoảng 900 bp. Đoạn gen được nhân lên có chứa các

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

đột biến trên được ký hiệu là Trx-rhIL2MN. Cả hai gen trên được đưa vào vector

tách dòng pTZ57R/T tạo thành các plasmid tái tổ hợp pTZ600 và pTZ900. Plasmid

pTZ600 sẽ cung cấp phần đầu của gen Trx-rhIL2 (khoảng 600 bp) với vị trí 25 của

hIL-2 đã được hồi biến nằm ngay trước vị trí cắt của enzyme hạn chế Ase I.

Plasmid pTZ900 sẽ cung cấp phần còn lại của gen hIL-2 (khoảng 300 bp) khi được

cắt bằng hai enzyme hạn chế Ase I và Not I. Cấu trúc của pTZ600 và pTZ900 được

EcoRI

His.Tag S.Tag AseI NotI

EcoRI

His.Tag S.Tag AseI

Trx

rh IL-2

pTZ

900 bp

600 bp

minh hoạ trên hình 13:

Hình 13. Cấu trúc của hai plasmid pTZ600 và pTZ900

Các plasmid này được biến nạp vào vi khuẩn E. coli DH5α khả biến và

được tách chiết theo phương pháp của Sambrook (Sambrook, Russel, 2001) và

kiểm tra trên gel agarose 0.8%. Sau đó DNA plasmid được cắt bằng các enzyme

hạn chế tương ứng. Plasmid pTZ600 được cắt bằng hai enzyme EcoR I và Ase I,

plasmid pTZ900 được cắt bằng hai enzyme Ase I và Not I, plasmid pPIC9 được cắt

bằng hai enzyme Not I và EcoR I. Sản phẩm xử lý bằng enzyme hạn chế được điện

di trên gel agarose 1%, sau đó các băng DNA mong muốn được cắt và tinh sạch

qua kit Qiaquick Gel Extraction. Các đoạn DNA tinh sạch được nối với nhau bằng

T4 ligase tạo thành plasmid pPIC-Trx-rhIL2MN.

Plasmid tái tổ hợp được biến nạp vào vi khuẩn E. coli DH5α. DNA plasmid

từ thể biến nạp được tách chiết và kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% .

Gen Trx-rhIL2MN được kiểm tra trình tự và khung đọc trên máy đọc trình tự tự

động ABI PRISM® 3100 Avant Gentic Analyzer (Applied Biosystems, Mỹ).

Cắt plasmid pPIC-Trx-rhIL2MN bằng hai enzyme hạn chế EcoR I và Not I

để thu gen Trx-rhIL2MN rồi đưa gen này vào vector pPICZαA tạo thành plasmid

pPICZ-Trx-rhIL2MN. Sơ đồ mô tả quá trình tạo đột biến chuyển Ser thành Leu ở

vị trí 25 trong phần IL-2 của gen Trx-rhIL2MM thành Trx-rhIL2-MN được minh

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

họa trên hình 14.

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

bla

pET32-rhIL-2MM

Trx-IL-2MM 6300 bps

lacI

PCR, cặp mồi 1,2 PCR, cặp mồi 1,3

900 bps

600 bps

T4 DNA ligase

lacZ

bla

MCS

pTZ57R/T

2886 bps

rep

bla

pTZ900 3786 bps

pTZ600 3486 bps

®o¹n 900bp

®o¹n 600bp

rep

MCS

signall

bla

ColE1

pPIC9

Cắt EcoRI, AseI

Cắt AseI, NotI

8035 bps HIS4

300 bps

600 bps

Cắt AseI, NotI

Nối bằng T4 DNA ligase

5' AOX1

signal

bla

Trx-rhIL-2MN

ColE1

pPIC-Trx-rhIL-2MN

8900 bps

HIS4

Hình 14. Sơ đồ mô tả quá trình tạo đột biến điểm định hướng tạo gen Trx-rhIL2-MN

3.2.2.2. Kết quả tách dòng gen Trx-rhIL2MN và xác định trình tự gen

Plasmid pPIC-Trx-rhIL2MN được biến nạp vào vi khuẩn E. coli DH5α khả biến

rồi chọn lọc trên môi trường LB có bổ sung Amp. Plasmid từ các khuẩn lạc được tách

chiết và kiểm tra trên gel agarose 0,8%.

Kết quả, trong số các plasmid tách được có một dòng có kích thước lớn hơn so

với đối chứng, chúng tôi cắt plasmid này bằng hai enzyme EcoR I và Not I để kiểm tra

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

có gen chèn vào plasmid hay không và kết quả là có văng ra một đoạn có kích thước

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

khoảng 900 bp như mong muốn. Kết quả tạo hồi biến chuyển Ser thành Leu ở vị trí 25

được khẳng định bằng cách đọc trình tự gen (Hình 15). Dòng gen này được ký hiệu là

24 Ile Ser Asn Gly Ile Asn 29 24 Ile Leu Asn Gly Ile Asn 29

Trx-rhIL2MN.

Hình 15. Kết quả đọc trình tự gen đã hồi biến (phải) so với gen chưa hồi biến (trái)

3.2.3. Kết luận

- Đã nhân được đoạn gen rhIL2 bằng các đoạn mồi tạo đột biến và nối gen này vào

vectơ tách dòng pCR 2.1-TA.

- Đã đọc trình tự của gen rhIL2 đột biến và so sánh với gen rhIL2 trên ngân hàng

gen quốc tế thì thấy đã gây được đột biến mất khả năng glycosyl hoá, chuyển gốc

Cys ở vị trí 125 thành Ser.

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

- Đã gây hồi biến thành công Ser25 thành Leu25 trong gen lai Trx-rhIL2MN.

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

3.3. KẾT QUẢ BIỂU HIỆN IL-2 TRONG CÁC HỆ BIỂU HIỆN KHÁC NHAU

3.3.1. Biểu hiện gen lai Trx-rhIL2MN trong tế bào vi khuẩn E. coli

3.3.1.1. Kết quả biểu hiện gen Trx-rhIL2MN với hệ vector pET32c(+) 3.3.1.2. Kiểm tra tính bắt cặp đặc hiệu của Trx-rhIL2MN bằng phương pháp Western blot 3.3.1.3. Khảo sát tính tan của Trx-rhIL2MN tái tổ hợp 3.3.1.4. Nhận dạng protein biểu hiện bằng phương pháp khối phổ

3.3.2. Biểu hiện gen lai Trx-rhIL2MN trong tế bào nấm men P. pastoris

3.3.3. Biểu hiện gen rhIL-2 ở dạng riêng lẻ trong nấm men P. pastoris

3.3.4. Kết luận

Trong quá trình biểu hiện gen IL-2 chúng tôi đã tiến hành biểu hiện song song

trong cả 2 hệ E. coli và nấm men P. pastoris. Lý do là vì khi biểu hiện gen eukaryot

(gen IL-2 người) trong tế bào E. coli thường xảy ra hiện tượng protein tổng hợp được

tồn tại ở dạng thể vùi và mất hoạt tính. Mặc dù khi biểu hiện IL-2 bằng vector

pET32c(+) thì gen này đã được ghép nối với một đoạn của gen mã hóa cho

Thioredoxin của E. coli và theo kết quả của các tác giả khác thì protein lai với

Thioredoxin thường biểu hiện tốt hơn và tồn tại ở dạng tan nhiều hơn so với biểu hiện

một mình trong tế bào E. coli.

3.3.1. Biểu hiện gen lai Trx-rhIL2MN trong tế bào vi khuẩn E. coli

3.3.1.1. Kết quả biểu hiện gen Trx-rhIL2MN với hệ vector pET32c (+)

Để đảm bảo chắc chắn cho quá trình biểu hiện, cấu trúc gen Trx-rhIL2MN trong

vector pET32c (+) được kiểm tra bằng cách xác định trình tự gen trước khi biến nạp

plasmid này vào tế bào E. coli. Kết quả kiểm tra cho thấy không có một sự thay đổi nào

trong trình tự của gen IL-2 trong vector biểu hiện và trình tự các vùng nối giữa gen Trx

và IL-2 có chứa các điểm his-tag và điểm cắt cho enterokinase đều chính xác như dự

tính.

Kết quả biểu hiện protein Trx-rhIL2MN sau khi cảm ứng bằng IPTG ở các thời

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

gian khác nhau được biểu hiện ở hình 16.

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

1 2 3 4 M

kDa

66.2

32 kDa

18.4

14.4

Hình 16. Điện di SDS-PAGE protein Trx-rhIL2MN trên gel polyacrylamide 12,5% Đường chạy M: Protein chuẩn Đường chạy 1-4: Protein Trx-rhIL2MN được cảm ứng bằng IPTG 1 mM sau 0, 1, 2, 3 giờ.

Theo tính toán, đoạn gen rhIL2MN được gắn vào vector biểu hiện pET32c

(+) tại vị trí cắt của enzyme hạn chế Nco I và Not I sẽ tạo ra protein lai giữa

protein Trx-Tag thioredoxin với protein tái tổ hợp khi biểu hiện. Khối lượng phân

tử của rhIL2 khoảng 15,4 kDa và khối lượng phân tử protein lai của rhIL2 với

Trx-Tag thioredoxin khoảng 32 kDa. Kết quả trên hình 16 cho thấy, protein Trx-

rhIL2MN đã được biểu hiện với kích thước khoảng 32 kDa, như vậy protein lai

Trx-rhIL2MN đã được biểu hiện dưới dạng lai với Thioredoxin.

Chúng tôi đã xác định một cách tương đối lượng IL-2 tái tổ hợp tổng hợp được

trong tế bào E. coli thông qua việc so sánh lượng protein lai Trx-rhIL2MN trên bản điện

di với các băng protein chuẩn đã biết về lượng. Kết quả cho thấy chủng E. coli có khả năng

tổng hợp protein lai Trx-rhIL2MN khoảng 195 mg/L, tương đương với khoảng 90 mg

IL-2/L.

3.3.1.2. Kiểm tra tính bắt cặp đặc hiệu của Trx-rhIL2MN bằng phương pháp

Western blot

Sau khi điện di trên gel 12,5% polyacrylamide, các băng protein được chuyển

sang màng PVDF. Sau đó màng được phủ kháng thể IgG kháng IL-2 của người được

sản xuất từ chuột rồi phủ kháng thể kháng IgG chuột gắn alkaline phosphatase. Phản

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

ứng hiện màu với cơ chất BCIP và NBT (Hình 17).

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

kDa 70 55

1 2 3

Hình 17. Western blot với kháng thể kháng hIL-2

35 25

15,4 kDa

18 10

Đường chạy 1: Protein lai Trx-rhIL2MN Đường chạy 2: hIL-2 chuẩn Đường chạy 3: Protein chuẩn

Kết quả điện di trên hình 17 cho thấy protein tái tổ hợp Trx-rhIL2MN có khả năng bắt

cặp đặc hiệu với kháng thể kháng hIL-2 của người. Trên đường chạy 1, ngoài băng protein

chính với khối lượng khoảng 32 kDa còn xuất hiện 1 băng mờ với kích thước xấp xỉ 70

kDa. Đây có thể là sản phẩm dimer của IL-2. Từ kết quả trên cho thấy chúng tôi đã thiết kế

và biểu hiện thành công protein tái tổ hợp Trx-rhIL2MN của người trong các tế bào E. coli.

3.3.1.3. Khảo sát tính tan của IL-2 MN tái tổ hợp

Chúng tôi đã kiểm tra mức độ protein lai Trx-rhIL2MN ở dạng tan sau khi biểu

hiện trong tế bào E. coli. Cách thức xác định protein ở pha tan và không tan được tiến

kDa

116

66.2

32 kDa

18.4

14.4

hành như mô tả trong phần phương pháp.

Hình 18. Điện di protein rhIL2 dạng tan và không tan trên gel polyacrylamide 12,5%

Đường chạy 1: Protein tái tổ hợp dạng tan Đường chạy 2: Protein chuẩn Đường chạy 3: Protein tái tổ hợp dạng không tan Kết quả cho thấy phần lớn protein lai Trx-rhIL2MN biểu hiện đều ở dạng tan

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

(85%) và chỉ có một lượng nhỏ protein ở dạng không tan (15%) trong tổng số protein .

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

3.3.1.4. Nhận dạng protein biểu hiện bằng phương pháp khối phổ

Băng protein với kích thước 32 kDa được thu lại bằng việc cắt gel trên bản điện

di SDS-PAGE, thuỷ phân bằng enzyme trypsin tạo ra các mảnh peptide. Hỗn hợp

peptide thu được sẽ được phân tách qua cột sắc ký C18 trên hệ sắc ký lỏng Nano

HPLC thành các phân đoạn nhỏ. Các peptide thu được qua sắc ký sẽ được trực tiếp thu

nhận và ion hoá bởi nguồn ion hoá ESI (ElectroSpray Ionization) tạo thành các ion đa

điện tích và được phân tích tự động qua hệ thống khối phổ. Phổ MS/MS các mảnh

peptide được so sánh với ngân hàng protein trên NCBI qua sử dụng phần mềm Mascot

v1.8 (Hình 19, Hình 20).

L N I D Q N P G T A P K

B

A

Hình 19. Ảnh phổ MS/MS của mảnh peptide 634,4 dalton mang điện tích +2 của Trx được nhận dạng. A – phổ TOF MS, B – phổ MS/MS.

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

H L Q C L E E E L K P L E E V L N L A

B

A

Hình 20. Ảnh phổ TOF MS và MS/MS của mảnh peptide 874,6 dalton mang điện tích 2+ của IL-2 được nhận dạng. A – phổ TOF MS, B – phổ MS/MS.

gi|575449 E. coli thioredoxin gen gi|386818 interleukin 2

TT Thioredoxin

Interleukin 2

GIPTLLLFK

DLISNINVIVLE LK

LNIDQNPGTAPK

HLQCLEEELKP LEEVLNLAQSK

IIHLTDDSFDTDVLK

4 MIAPILDEIADEYQGK

SDKIIHLTDDSFDTDVLK

Hình 21. Các peptide nhận dạng được qua khối phổ từ băng protein có kích thước 32 kDa

Kết qủa xác định cho thấy protein thu nhận được qua biểu hiện ở trên là IL-2

(Hình 21), hơn nữa protein thioredoxin cũng được tìm thấy trên cùng một mẫu phân

tích khối phổ. Điều này khẳng định rằng gen IL-2 đã được biểu hiện dưới dạng lai cùng

với thioredoxin ở tế bào E. coli.

3.3.2. Biểu hiện gen lai Trx-rhIL2MN trong nấm men P. pastoris.

Song song với việc biểu hiện gen IL-2 trong tế bào E. coli, chúng tôi cũng tiến

hành biểu hiện protein lai Trx-rhIL2MN cả trong nấm men P. pastoris để protein này có

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

thể được tiết ra dưới dạng ngoại bào và giúp cho quá trình tinh sạch protein dễ dàng hơn.

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

Quy trình thiết kế vector biểu hiện gen IL-2 bằng cả 2 hệ pPIC9 và pPICZα được mô tả

trong phần phương pháp.

Điều kiện biểu hiện gen IL-2 trong nấm men được thực hiện như mô tả trong

phần phương pháp, mẫu biểu hiện được xử lý bằng đệm pha mẫu và chạy điện di SDS-

2 3 4

kDa 110 90 70

PAGE, bản gel được nhuộm bạc. Kết quả điện di được trình bày trên hình 22.

Hình 22. Ảnh biểu hiện gen Trx-rhIL2MN.

Đường chạy1: Mẫu dịch nuôi cấy chủng pPICZα-Trx-rhIL2MN

Đường chạy 2: Protein chuẩn (Fermentas) Đường chạy 3: IL-2 chuẩn Đường chạy 4: Mẫu dịch nuôi cấy chủng pPIC-Trx-rhIL2MN

45 35 25 18 10

Kết quả điện di sản phẩm protein biểu hiện trong nấm men P. pastoris trên hình

22 cho thấy băng protein với kích thước dự đoán 32 kDa của protein lai Trx-rhIL2MN

không thấy xuất hiện. Thay vào đó, ở đường chạy số 1 với mẫu dịch nuôi cấy của

chủng P. pastoris GS115 mang pPIC-Trx-rhIL2MN biểu hiện bằng hệ vector pPICZα

chỉ có hai băng với kích thước khoảng 18 và 19 kDa, còn trong đường chạy số 4 với

mẫu dịch nuôi cấy của chủng P. pastoris GS115 mang pPICz-Trx-rhIL2MN biểu hiện

bằng hệ pPICZα lại xuất hiện 3 băng với các kích thước là khoảng 15, 17, 19 kDa.

Điều này có thể là do các protease trong môi trường nuôi cấy nấm men đã cắt ở giữa

các protein lai tạo nên các protein có kích thước nhỏ hơn. Để kiểm tra các băng protein

này có phải là sản phẩm phân hủy của protein lai Trx-rhIL2MN do protease hay không,

chúng tôi đã tiến hành phản ứng Western Blot của các băng protein trên với kháng thể

1 2 3 4

kDa

110 90

kháng IL-2. Kết quả được trình bày trên hình 23.

Hình 23. Ảnh Western Blot với kháng thể kháng IL-2.

55 45 35 25 18 10

Đường chạy 1: Mẫu dịch nuôi cấy tế bào mang plasmid pPICZ- Trx-rhIL2MN Đường chạy 2: Protein chuẩn (Fermentas) Đường chạy 3: IL-2 chuẩn Đường chạy 4: Mẫu dịch nuôi cấy tế bào mang plasmid pPIC- Trx-rhIL2MN

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

Kết quả lai trên hình 23 cho thấy ở cả hai mẫu dịch nuôi cấy chỉ có các băng

protein với kích thước khoảng 19 kDa mới bắt đặc hiệu với kháng thể kháng IL-2

chứng tỏ băng protein này còn chứa đoạn protein rhIL2MN. Còn các băng protein khác

trong hình 23 đều không có khả năng bắt cặp đặc hiệu với kháng thể kháng hIL-2.

Chúng tôi sử dụng phần mềm PeptideCutter để kiểm tra vị trí cắt của các

protease trong trình tự protein lai Trx-rhIL2MN thì thấy rằng chỉ có thrombin có khả

năng cắt Trx-rhIL2MN để tạo ra đoạn protein có kích thước khoảng 19 kDa có mang

toàn bộ phần IL-2. Các protease khác khi cắt Trx-rhIL2MN đều không tạo ra đoạn

protein có kích thước tương ứng. Nếu protein lai bị cắt bằng thrombin thì sẽ còn lại

một protein gồm toàn bộ phần rhIL-2MN nối với một đoạn peptide dài 29 amino acid.

Đoạn peptide này chứa trình tự S-Tag và trình tự nhận biết của enterokinase ngay sát

phần Trx-rhIL2MN vì vậy protein lai có thể được tinh sạch qua cột sắc ký ái lực S-

protein và rhIL2MN có thể được thu lại sau khi xử lý protein lai bằng enterokinase.

3.3.3. Biểu hiện gen rhIL2 ở dạng riêng lẻ trong nấm men P. pastoris

Việc biểu hiện trong nấm men có thuận lợi hơn so với biểu hiện trong E. coli là

protein sau khi biểu hiện có thể được tiết ra môi trường do đó thuận tiện hơn cho việc

tinh chế. Ngoài ra, tế bào nấm men không tổng hợp các chất chí nhiệt tố như tế bào E.

coli do đó sản phẩm tạo ra an toàn hơn so với con đường tổng hợp từ E. coli. Tuy nhiên

kết quả biểu hiện protein lai Trx- rhIL2MN với các hệ vector pPIC9 và pPICZαA trong

nấm men P. pastoris cho thấy protein lai này đã bị phân cắt do các protease tiết ra

trong môi trường nuôi cấy nấm men. Do đó chúng tôi đã tiến hành thêm việc biểu hiện

gen IL-2 dạng đơn không lai với protein Trx trong nấm men P. pastoris.

* Kết quả biểu hiện interleukin-2 ở dạng riêng lẻ trong nấm men P. pastoris

• PCR nhân gen rhIL-2

Đoạn gen mã hóa cho rhIL2 được nhân lên bằng PCR dựa trên khuôn là vector

pET32-rhIL2MN mang gen mã hóa cho IL-2 tái tổ hợp. Trong trình tự mồi cho kỹ

thuật PCR, chúng tôi có gắn thêm điểm cắt của enzyme hạn chế Xho I vào phía đầu 5'

và Nco I vào đầu 3'. Sự có mặt của 2 enzyme hạn chế sẽ giúp cho phản ứng gắn đoạn

gen rhIL2 vào vector pPIC9 để biểu hiện trong nấm men. Ảnh điện di kiểm tra sản

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

phẩm PCR trên hình 24 cho thấy xuất hiện băng DNA có kích thước khoảng 400 bp,

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

1 M

400 bp

500 400 300 200 100

đúng với kích thuớc của đoạn gen mã hóa cho IL2.

Hình 24. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 0.8%

M : DNA chuẩn, Đường chạy 1: Đoạn gen rhIL2

• Thiết kế vector biểu hiện pPIC9-rhIL2 mang gen mã hóa interleukin-2

Đoạn gen rhIL2 được gắn trực tiếp vào vector pPIC9 tại vị trí cắt của hai enzyme

hạn chế là Xho I và Nco I. Vector tái tổ hợp pPIC9-rhIL2 được biến nạp vào tế bào khả

biến E. coli DH5α trên môi trường chọn lọc có chứa Amp (100 μg/ml). Để xác định sự

có mặt của gen rhIL2 trong vector tách dòng pCR2.1, plasmid tái tổ hợp (pPIC9-rhIL2)

của các dòng tế bào này được tách chiết và xử lý bằng enzyme hạn chế Xho I và Nco I.

Sản phẩm cắt DNA plasmid của các dòng tế bào chọn lọc được kiểm tra bằng điện di

trên gel agarose 0,8%. Chúng tôi đã chọn được một số dòng plasmid tái tổ hợp có chứa

đoạn chèn có kích thước khoảng 400 bp, phù hợp với kích thước của đoạn gen rhIL2.

Các plasmid này được tinh chế và xác định trình tự nucleotide của đoạn chèn để khẳng

định chắc chắn đã có đoạn gen rhIL2 gắn vào.

• Biểu hiện rhIL2 trong nấm men P. pastoris

Điều kiện biểu hiện như mô tả trong phần phương pháp, mẫu biểu hiện được xử lý

bằng đệm pha mẫu và chạy điện di SDS-PAGE, bản gel được nhuộm bạc. Kết quả điện

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

di trình bày trên hình 25.

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

M 1

116

18.4

rhIL2 15,4 kDa

Hình 25. Điện di SDS-PAGE sản phẩm biểu hiện rhIL2 trong nấm men P. pastoris

M : Protein chuẩn, Đường chạy 1: Protein rhIL2 biểu hiện

Kết quả hình 25 cho thấy trên điện di đồ xuất hiện 1 băng protein có kích thước

khoảng 15,4 kDa, phù hợp với kích thước của interleukin-2 dạng thuần thục.

Kiểm tra tính bắt cặp đặc hiệu của protein tái tổ hợp biểu hiện trong nấm men bằng

Western blot

Sau khi điện di trên gel 12,5% polyacrylamide, các băng protein được chuyển

sang màng PVDF. Sau đó màng được phủ kháng thể IgG kháng IL-2 của người được

sản xuất từ chuột rồi phủ kháng thể kháng IgG chuột gắn alkaline phosphatase. Phản

ứng hiện màu với cơ chất BCIP và NBT (Hình 26).

1 2 3

Hình 26. Ảnh Western Blot với kháng thể kháng IL-2

Đường chạy 1: Mẫu IL-2 đối chứng của Trung Quốc

Đường chạy 2 : Marker protein chuẩn

Đường chạy 3: Protein rhIL-2 biểu hiện trong nấm men

rhIL2 14,5 kDa

Kết quả điện di trên hình 26 cho thấy protein tái tổ hợp rhIL2 biểu hiện trong

nấm men có khả năng bắt cặp đặc hiệu với kháng thể kháng hIL-2 của người (đường

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

chạy 3). Kết quả nhận được cho thấy chúng tôi đã thiết kế và biểu hiện thành công

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

protein tái tổ hợp rhIL-2 của người ở dạng riêng lẻ và tiết ra môi trường nuôi cấy từ tế

bào nấm men P. pastoris. Kết quả này mở ra thêm cơ hội sản xuất protein IL-2 từ nấm

men và có thể đơn giản hóa quá trình tinh chế, đặc biệt là thuận lợi trong việc làm sạch

các chất chí nhiệt tố trong sản phẩm cuối cùng.

3.3.4. Kết luận

- Đã biểu hiện thành công protein lai Trx-rhIL2MN với hệ vector pET32c(+) trong

tế bào vi khuẩn E. coli BL21 (DE3). Protein lai Trx-rhIL2MN nhận được có khả

năng nhận biết đặc hiệu bằng Western Blot với kháng thể đặc hiệu kháng hIL-2.

Kết quả định dạng protein lai Trx-rhIL2MN bằng khối phổ cũng đã giúp khẳng định

protein biểu hiện được đúng là protein lai Trx-rhIL2MN.

- Đã khảo sát được tính tan của rhIL-2MN biểu hiện trong tế bào E. coli. Kết quả cho

thấy khoảng 85% protein lai Trx-IL2 biểu hiện ở dạng tan trong tế bào E. coli.

- Chủng E. coli tái tổ hợp có khả năng tổng hợp IL-2 đạt khoảng 90 mg/L, cao gấp

nhiều lần so với dự tính ban đầu (50 μg/L).

- Kết quả biểu hiện protein lai Trx-rhIL2MN trong tế bào nấm men P. pastoris

GS115 cho thấy protein lai bị phân cắt bởi protease trong tế bào.

- Đã biểu hiện thành công protein IL-2 dạng riêng lẻ trong tế bào nấm men P. pastoris.

Protein sau khi tổng hợp được tiết ra môi trường nuôi cấy. Kết quả lai Western blot cho

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

thấy protein nhận được chính là hIL-2.

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

3.4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN CÁC CHỦNG VI SINH VẬT TÁI TỔ HỢP MANG GEN IL-2 Ở BÌNH TAM GIÁC VÀ TRONG HỆ THỐNG LÊN MEN 5L, 14L

3.4.1.Kết quả lên men tổng hợp IL-2 tái tổ hợp trong bình tam giác

3.4.1.1. Ảnh hưởng của nồng độ IPTG 3.4.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ Amp 3.4.1.3. Khảo sát nhiệt độ nuôi cấy 3.4.1.4. Khảo sát để lựa chọn thời gian thu mẫu thích hợp 3.4.1.5. Lên men chủng tái tổ hợp trong những điều kiện thích hợp

3.4.2. Kết quả lên men sản xuất IL-2 tái tổ hợp trong hệ thống Bioflo 110 dung tích 5L và 14L.

3.4.3. Kết luận

3.4.1. Kết quả lên men tổng hợp IL-2 tái tổ hợp trong bình tam giác

Để xây dựng quy trình lên men chủng vi sinh vật tái tổ hợp mang gen IL-2 quy mô

bình tam giác, chúng tôi phải tiến hành khảo sát các nhân tố ảnh hưởng đến quá trình biểu

hiện protein và từ đó lựa chọn điều kiện nuôi cấy thích hợp nhất. Các nhân tố chủ yếu ảnh

hưởng trực tiếp đến quá trình sinh trưởng, phát triển và tổng hợp protein của chủng bao

gồm nhiệt độ nuôi cấy, nồng độ chất cảm ứng IPTG, nồng độ Amp trong môi trường và

đặc biệt là thời gian để thu hồi sinh khối. Đây cũng là một số yếu tố rất quan trọng và liên

quan trực tiếp đến quá trình lên men lớn và giá thành của sản phẩm. Quá trình lên men

được trình bày như trong phần phương pháp.

3.4.1.1. Ảnh hưởng của nồng độ IPTG

IPTG được coi là chất cảm ứng bởi vì nó có khả năng tác động vào promoter T7

lac, có khả năng kiểm soát chặt chẽ quá trình biểu hiện gen đích mã hoá cho protein

hIL-2. Nồng độ IPTG khảo sát từ 1 μM đến 1000 μM. Kết quả khảo sát được thể hiện

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

trong hình 27.

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

32 kDa

kDa 110 70 55 35 25 18 10

1 2 3 4 5 6 7 8 M

Hình 27. Ảnh hưởng của IPTG tới sự biểu hiện của protein rhIL2MN

Đường chạy 1: 0 μM IPTG Đường chạy 2: 1 μM IPTG Đường chạy 3: 10 μM IPTG Đường chạy 4: 50 μM IPTG Đường chạy 5: 100 μM IPTG Đường chạy 6: 500 μM IPTG Đường chạy 7: 1000 μM IPTG Đường chạy 8: 3000 μM IPTG Đường chạy M: Protein chuẩn

Kết quả hình 27 cho thấy, nồng độ IPTG có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng

tổng hợp protein IL-2 của chủng tái tổ hợp. Ở các đường chạy từ 1-8, nồng độ IPTG

tăng dần từ 0- 3000 μM thì băng protein tái tổ hợp IL-2 có kích thước khoảng 32 kDa

cũng xuất hiện theo chiều hướng đậm dần lên rất rõ rệt. Tại nồng độ IPTG 100 μM

(đường chạy 5) thì khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp IL-2 của chủng cao hơn hẳn so

với các nồng độ khác. Chúng tôi chọn nồng độ này để áp dụng trong lên men lượng lớn.

3.4.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ Amp

Trong môi trường nuôi cấy ban đầu, Amp được coi là nhân tố chọn lọc những

dòng tái tổ hợp mang gen kháng Amp do trong quá trình sinh trưởng, những dòng tái tổ

hợp sản sinh enzyme β-lactamase có khả năng phá huỷ Amp. Vì vậy, việc khảo sát

nồng độ Amp thích hợp trong môi trường nuôi cấy là rất cần thiết. Kết quả khảo sát

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

được thể hiện trong hình 28.

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

kDa

110

Hình 28. Ảnh hưởng của nồng độ Amp tới sự biểu hiện của protein

32 kDa

Đường chạy 1: Amp 100 μg/ml

Đường chạy 2: Amp 150 μg/ml

Đường chạy 3: Amp 200 μg/ml

Đường chạy M : Protein chuẩn

1 2 3 M

Kết quả hình 28 cho thấy, trong dải nồng độ Amp khảo sát từ 100 μg/ml đến

200 μg/ml, khả năng biểu hiện protein không có nhiều khác biệt. Chúng tôi chọn nồng

độ Amp 100 μg/ml để lên men trong bình tam giác và lên men lượng lớn.

3.4.1.3. Khảo sát nhiệt độ nuôi cấy

Nhiệt độ là nhân tố ảnh hưởng rất lớn đến cả quá trình sinh trưởng, phát triển

cũng như quá trình sinh tổng hợp protein. Vì vậy, chúng tôi đã khảo sát nhiệt độ nuôi cấy sau khi bổ sung chất cảm ứng IPTG trong dải nhiệt độ từ 28 - 370C. Kết quả khảo

kDa

110

sát thể hiện trong hình 29.

70 Hình 29. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy

32 kDa

Đường chạy M: Protein chuẩn Đường chạy 1: 28oC Đường chạy 2: 30oC Đường chạy 3: 37oC

M 1 2 3

Kết quả trong hình 29 cho thấy, nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp của chủng. Tại nhiệt độ 370C thì khả năng tổng hợp protein cao hơn ở mức nhiệt độ 280C và 300C. Tuy nhiên theo kết quả kháo sát tính tan của IL2MN cho thấy ở 370C, protein tái tổ hợp nằm chủ yếu ở phân đoạn không tan (Kết quả không trình bày ở đây), do đó chúng tôi lựa chọn 300C là nhiệt độ thích hợp cho cả quá trình

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

biểu hiện protein quan tâm.

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

3.4.1.4. Khảo sát để lựa chọn thời gian thu mẫu thích hợp

Việc xác định thời điểm mà tại đó nồng độ protein được tổng hợp cao nhất là rất

cần thiết. Đặc biệt trong lên men quy mô lớn, việc xác định thời điểm thu hồi mẫu giúp

tiết kiệm thời gian lên men và các chi phí liên quan khác. Chúng tôi tiến hành thu mẫu

ở các thời điểm khác nhau và đánh giá hàm lượng protein trên gel polyacryamide. Kết

kDa

110

quả khảo sát được thể hiện trong hình 30.

Hình 30. Khảo sát thời gian thu mẫu biểu hiện

32 kDa

Đường chạy 1: 0 giờ Đường chạy 2: 1 giờ Đường chạy 3: 2 giờ Đường chạy 4: 3 giờ Đường chạy 5: 4 giờ Đường chạy 6: 5 giờ Đường chạy M: Protein chuẩn

1 2 3 4 5 6 M

Kết quả hình 30 cho thấy, hàm lượng protein tái tổ hợp tăng dần theo thời gian

từ 0 giờ đến 5 giờ. Tại thời điểm 5 giờ (đường chạy 6), hàm lượng protein cao gấp 4-5

lần ở các thời điểm 1, 2 và 3 giờ. Vì vậy, chúng ta có thể thu mẫu ngay ở thời điểm 5

giờ sau khi cảm ứng với IPTG.

3.4.1.5. Lên men chủng tái tổ hợp trong những điều kiện tối ưu

Dựa trên những điều kiện tối ưu đã khảo sát ở trên, chúng tôi đã xây dựng quy

trình lên men trong bình tam giác và lên men chủng tái tổ hợp mang gen hIL-2 theo

quy trình xây dựng như sau: - Nuôi cấy khuẩn lạc riêng rẽ qua đêm trong môi trường LBA lỏng qua đêm ở 37oC,

230 vòng/phút và nồng độ Amp cuối cùng đạt 100 μg/ml

- Ly tâm 5 phút ở tốc độ 5000 vòng/ phút để thu tế bào từ nuôi cấy qua đêm. Hoà tế bào lại trong môi trường LBA mới với độ pha loãng 100 lần. Nuôi lắc ở 37oC đến

khi độ hấp thụ của dịch nuôi cấy ở OD600 đạt 0,5 - 0,6.

- Bổ sung IPTG vào mẫu dịch nuôi cấy sao cho nồng độ IPTG cuối cùng đạt 100 μM

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

và nuôi lắc ở 300C trong 5 giờ.

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

3.4.2. Kết quả lên men sản xuất IL-2 tái tổ hợp trong hệ thống Bioflo 110 dung

tích 5L và 14L.

Thu hồi sản phẩm:

Sau 5 giờ cảm ứng, thu sinh khối tế bào bằng ly tâm 5000 vòng/phút trong 10

phút trên máy Sorvall. Tế bào được rửa sạch bằng nước muối sinh lý, hòa lại trong

dung dịch đệm thích hợp để xử lý thu hồi Interleukin-2. Sinh khối ở thời điểm kết thúc

lên men xấp xỉ 70-80 g tế bào ướt/ lít và 185-192 mg IL-2/ lít.

IL-2 Batch No7

7.5

2.5

6.5

H p

1.5

D O

5.5

0.5

4.5

Run time (h)

OD600

Hình 31. Quá trình phát triển của chủng E. coli Bl21 và sinh tổng hợp Interleukin-2. Mũi tên chỉ thời điểm cảm ứng biểu hiện IL-2.

1 2

32 kDa

Hình 32. Điện di protein tái tổ hợp Trx-rhIL2-MN trên polyacryamide gel 12,5% Đường chạy 1: Protein chuẩn

Đường chạy 2: Mẫu lên men gen Trx-rhIL2-MN

Kết quả điện di trên hình 32 cho thấy protein Trx-rhIL2-MN có kích thước 32

kDa đã biểu hiện thành công trong hệ thống lên men Bioflo110 dung tích 5L và 14L.

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

Kết quả này mở ra triển vọng có thể sản xuất IL-2 tái tổ hợp trên quy mô lớn hơn.

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

3.4.3. Kết luận

(cid:131) Đã nghiên cứu ảnh hưởng của IPTG, Amp, nhiệt độ, thời gian cảm ứng của

chủng tái tổ hợp mang gen IL-2 ở quy mô bình tam giác và tối ưu các điều kiện

này trước khi lên men lượng lớn.

(cid:131) Đã nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố như pH môi trường, tốc độ khuấy, độ

thông khí, nhiệt độ, nhiệt độ cảm ứng của chủng E. coli BL21 và biểu hiện gen

IL-2 trong hệ thống lên men Bioflo 110 dung tích 5 lít và 14 lít.

(cid:131) Đã tối ưu hóa các thông số điều khiển quá trình lên men IL-2 trong 2 hệ thống

bình lên men (pH môi trường, nhiệt độ, độ thông khí, thời gian, thời điểm thu

sản phẩm).

(cid:131) Đã áp dụng hai quy trình lên men để sản xuất IL-2 bởi chủng E. coli BL21 tái tổ

hợp. Sản phẩm tích lũy cao nhất ở thời điểm sau khi cảm ứng 5 giờ. Kết quả lên

men trong cả hai hệ thống 5 lít và 14 lít đều cho xấp xỉ 70-80 g sinh khối ướt/lít

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

và 192 mg/lít protein lai Trx-IL-2.

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

3.5. KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT, TINH CHẾ IL-2 TỪ DỊCH LÊN MEN VÀ

NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT

3.5.1. Tách chiết và tinh chế IL-2 bằng sắc ký ái lực 3.5.2. Cắt protein lai bằng Enterokinase và lọc IL-2 qua cột sắc ký ái lực. 3.5.3. Kiểm tra tính bắt cặp đặc hiệu của rhIL-2MN sau khi cắt enterokinase bằng phản ứng Western blot 3.5.4. Kết luận

3.5.1. Tách chiết và tinh chế IL-2 bằng sắc ký ái lực

Sau khi biểu hiện thành công protein tái tổ hợp Trx-rhIL2MN trong vi khuẩn E.

coli BL21 (DE3), IL-2 từ dịch phá tế bào E. coli được tinh chế bằng cột sắc ký ái lực

Histrap HP của hãng Amersham. Các bước thực hiện tinh chế trên cột được thực hiện

theo hướng dẫn của hãng như đã trình bày ở phần phương pháp. Các protein không

mong muốn bị rửa khỏi cột trong khi protein lai Trx-rhIL2MN có vùng His-tag nên được

giữ lại và được đẩy ra ở nồng độ imidazole 300 mM. Quá trình tinh sạch protein bằng cột

sắc ký được lặp lại 2 lần để đảm bảo độ sạch của protein thu được.

Protein tái tổ hợp IL-2 tinh sạch bằng cột sắc ký ái lực lần 1 (Hình 33) và lần 2

1 2

116

66,2

66,2 45 35

Trx-rhIL2MN

18,4

14,4

(Hình 34) được điện di kiểm tra trên SDS-PAGE 12,5%.

Hình 33. Điện di protein tinh sạch lần 1 Hình 34. Điện di protein tinh sạch lần 2 Đường chạy 1: Protein chuẩn, Đường chạy 1: Protein chuẩn, Đường chạy 2: Protein Trx-rhIL2MN Đường chạy 2: Protein Trx-rhIL2MN

Kết quả kiểm tra trên hình 33 cho thấy sau khi tinh sạch ái lực lần 1 protein tái tổ

hợp Trx-rhIL2MN vẫn bị lẫn với một số protein khác, tuy nhiên sau khi tinh sạch lần 2

thì tại đường chạy số 2 (hình 34) chỉ xuất hiện một băng protein đơn nhất với kích

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

thước phân tử khoảng 32 kDa. Kích thước của các băng protein này phù hợp với kích

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

thước băng protein Trx-rhIL2MN. Điều này chứng tỏ protein tái tổ hợp Trx-rhIL2MN

biểu hiện trong E. coli BL21 (DE3) đã được tinh sạch thành công.

3.5.2. Cắt protein lai bằng Enterokinase và lọc IL-2 qua cột sắc ký ái lực và kiểm

tra khả năng bắt cặp đặc hiệu của IL-2 bằng Western blot

Enterokinase (enteropeptidase EC 3.4.21.9) là một serine protease có tính đặc

hiệu cao, được dùng để phân giải protein lai nhằm giải phóng protein bổ trợ hoặc chuỗi

polyamino axit ra khỏi cấu trúc protein tái tổ hợp. Enzyme này nhận biết trình tự gồm

Asp-Asp-Asp-Asp-Lys- và sẽ cắt protein tại vị trí ngay sau gốc Lys. Gen mã hoá cho

trình tự nhận biết của enterokinase đã được đưa vào nhiều hệ vectơ biểu hiện khác

nhau, khi được biểu hiện, vị trí cắt của enzyme có thể nằm ở phía đầu N hoặc đầu C

của protein tái tổ hợp. Đối với trường hợp của chúng tôi, gen rhIL2MN đã được thiết

kế gắn vào ngay sau trình tự nucleotide mã hoá cho trình tự nhận biết đặc hiệu của

enterokinase trong vectơ biểu hiện. Do vậy, sau khi biểu hiện được protein dưới dạng

lai Trx-IL2MN chúng tôi có thể loại bỏ các thành phần Trx-Stag-Histag không mong

muốn ra khỏi cấu trúc protein IL2 tái tổ hợp bằng cách protein này với enterokinase và

loại Trx-Stag-Histag khỏi phần IL-2 bằng cột sắc ký ái lực. Lúc này phần Trx-Stag-

Histag sẽ được giữ lại trên cột, còn phần IL-2 sẽ ra khỏi cột và được thu lấy.

1 2 3

116

kDa

66.2

15,4

Hình 35. Điện di sản phẩm protein cắt bằng enterokinase trên gel polyacrylamide 12,5%

Đường chạy 1: Trx-rhIL2MN cắt bằng enterokinase Đường chạy 2: protein chuẩn, Đường chạy 3: hIL2 chuẩn Kết quả trên hình 35 cho thấy trong đường chạy số 1 với sản phẩm cắt protein

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

lai Trx-rhIL2MN bằng enteroki nase và sau khi tinh chế 1 lần nữa qua cột His-tag

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

trong dịch protein không bám trên cột thấy xuất hiện băng protein kích thước xấp xỉ

15,4 kDa tương đương với băng protein interleukin-2 chuẩn ở đường chạy 3. Ngoài

băng protein chính với khối lượng 15,4 kDa còn xuất hiện 1 băng rất mờ với kích thước

khoảng 30 kDa trong cả hai đường chạy 1 và 3 (protein IL-2 chuẩn). Đây có thể là sản

phẩm dimer của IL-2.

Sau khi thu được IL-2 tái tổ hợp chúng tôi tiến hành xử lý chế phẩm với kit

(Affi-Prep Polymyxin matrix, Biorad) để loại bỏ chất chí nhiệt tố. Quy trình xử lý được

thực hiện như hướng dẫn của hãng.

Hiệu quả của quá trình tinh chế IL-2 trình bày ở trên được tóm tắt trong bảng 2.

Từ 930 mg protein tổng số từ dịch chiết tế bào E. coli ban đầu chúng tôi thu được 8 mg IL-2 tinh sạch. Chế phẩm IL-2 tinh chế có hoạt tính sinh học đạt 2,7x106 thử nghiệm trên dòng tế bào CTLL2, còn trên dòng tế bào NK hoạt tính của chế phẩm này đạt 9,8x104.

Kết quả xác định hoạt tính của IL-2 được trình bày chi tiết hơn trong các phần sau (Phần

3.7 và 3.9).

Bảng 2. Kết quả tinh chế IL-2 tái tổ hợp từ dịch thô

Các bước tinh sạch

Thể tích (ml)

Protein IL-2 (mg)

Dịch thô

1000

930

Sắc ký ái lực lần 1

207

270

Loại muối lần 1

200

196

Sắc ký ái lực lần 2

103

Loại muối lần 2

Sắc ký ái lực sau khi cắt enterokinase

Loại pyrogen

3.5.3. Kết luận

- Đã tinh chế thành công protein lai Trx-rhIL2MN với kích thước khoảng 32 kDa

bằng phương pháp sắc ký ái lực. Protein tái tổ hợp tinh sạch được rửa trôi ra khỏi

cột ở nồng độ imidazol là 300 mM.

- Đã cắt thành công protein lai Trx-rhIL2MN bằng enterokinase để tạo nên protein tái

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

tổ hợp rhIL2 có kích thước là 15,4 kDa.

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

3.6. KẾT QUẢ BƯỚC ĐẦU VỀ BẢO QUẢN MẪU IL-2

Chúng tôi chưa có đủ thời gian để nghiên cứu một cách đầy đủ điều kiện bảo

quản chế phẩm IL-2 tạo được. Kết quả dưới đây mới chỉ là kết quả ban đầu đối với

IL-2 dạng lai Trx-rhIL2MN và cũng chỉ mới với điều kiện mẫu đông khô. Đây là một

bước quan trọng trong quá trình chuẩn bị mẫu IL-2. Các mẫu IL-2 dạng Trx-rhIL2MN

sau khi tinh chế bằng sắc ký ái lực được gom lại sau các lần tinh chế trước khi cắt với

enterokinase. Nếu bảo quản ở dạng dung dịch thường không được lâu và ổn định, do

đó chúng tôi đã đông khô mẫu trước khi dùng tiếp cho phản ứng cắt bằng enzyme

enterokinase. Điều kiện bảo quản được tiến hành như sau.

Dung dịch chứa Trx-rhIL2MN sau khi tinh chế bằng sắc ký ái lực được chia ra các lọ penicilin với nồng độ 1 mg/ml, giữ trong -850C trong 24 giờ và được tiến hành đông khô. Mẫu IL-2 ở dạng đông khô được tiếp tục bảo quản ở 40C. Sau các thời gian

tương ứng là 4, 8 và 12 tuần, mẫu IL-2 được lấy ra kiểm tra chất lượng bằng điện di

SDS-PAGE. Kết quả trên hình 36 cho thấy sau 12 tuần mẫu Trx-IL2MN vẫn giữ được

M 1 2 3

116

66,2

Trx-rhIL2MN

18,4

14,4

chất lượng và không bị phân hủy trong điều kiện bảo quản.

Hình 36. Mẫu Trx-rhIL2MN giữ ở dạng đông khô sau các khoảng thời gian bảo quản khác nhau

M: Protein chuẩn

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

Đường chạy 1, 2, 3: Trx-rhIL2MN sau các thời gian bảo quản 4, 8 và 12 tuần

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

3.7. THỬ NGHIỆM IL-2 TÁI TỔ HỢP TRÊN MÔ HÌNH TẾ BÀO NUÔI CẤY CTLL-2

3.7.1. Điều kiện tối ưu để nhân và bảo quản dòng tế bào CTLL-2

3.7.2. Xác định hoạt tính sinh học của mẫu rhIL2MN biểu hiện trong E. coli BL21

3.7.3. Xác định hoạt tính sinh học của mẫu rhIL2MN biểu hiện trong P. pastoris

3.7.4. Kết luận

3.7.1. Điều kiện tối ưu để nhân và bảo quản dòng tế bào CTLL-2

- Môi trường nuôi cấy tế bào: RPMI 1640 kèm theo 2 mM L-glutamine, 1,5 g/L

sodium bicarbonate, 4,5 g/L glucose, 10 mM HEPES, và 1,0 mM sodium

pyruvate, ngoài ra bổ sung 2 mM L-glutamine, 1mM sodium pyruvate, 10% T-

STIM Con A và 10% fetal bovine serum – FBS (GIBCO).

- Nuôi cấy, duy trì: Tế bào nuôi ở dạng hỗn dịch vì thế chu trình cấy chuyển tế bào là từ 5-7 ngày khi mật độ tế bào đạt tới 2 x 105 tế bào/ml. Tế bào được cấy chuyển sang chai nuôi cấy mới với mật độ tế bào ban đầu là 1 x 104 tế bào/ml.

- Thực hiện bảo quản và cất giữ dòng tế bào CTLL2 trong nitơ lỏng với số lượng

20 ống.

+ Bảo quản: Tế bào phát triển khỏe mạnh sẽ được lựa chọn, để bảo quản trong nitơ

lỏng bằng môi trường cất giữ có 5% DMSO (Dimethyl Sulfoxide) và 10% FBS.

Hình 37. Hình ảnh tế bào CTLL-2 nuôi cấy in vitro

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

Đã xác lập được phép thử sinh học có sử dụng Non-radioactive proliferation kit

của Promega để định tính và định lượng mẫu interleukin 2 tái tổ hợp cụ thể:

+ Ủ mẫu ở 5-6 nồng độ khác nhau cùng với tế bào phụ thuộc interleukin CTLL2 (1 x 105 tế bào/ml) trong 48 giờ.

+ Pha MTT nhuộm từ kit của promega theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

+ Thêm 30 ul/giếng thử chất nhuộm nói trên

+ Để ủ trong bóng tối thêm 4 giờ và đọc kết quả bằng máy ELISA reader bước sóng

525nm

3.7.2. Xác định hoạt tính sinh học của các mẫu rhIL2MN biểu hiện trong E. coli BL21

Nguyên lí của phép thử sinh học: Tế bào CTLL-2 là tế bào hoàn toàn phụ thuộc

vào IL-2. Khi môi trường nuôi cấy không được bổ sung IL-2 thì tế bào sẽ chết trong

khoảng 24 - 48 h. Vì thế, dòng tế bào CTLL2 được xem là dòng chuẩn để xác định hoạt

tính của IL-2 tự nhiên cũng như tổng hợp. Khi bổ sung IL-2 vào môi trường nuôi cấy,

tuỳ theo hoạt tính của IL-2 mà tế bào CTLL2 sẽ duy trì sự sống và được kích hoạt để

phát triển và sinh sản. Hoạt tính của IL-2 càng mạnh thì khả năng hoạt hoá sự phát

triển và sinh sản của tế bào CTLL2 càng tốt. Dựa vào nguyên lí trên, khi cần xác định

hoạt tính của mẫu IL-2 nào đó thì chỉ cần xác định khả năng hoạt hoá tế bào CTLL2

của mẫu nghiên cứu so với đối chứng âm (không được bổ sung IL-2 vào môi trường

nuôi cấy).

Sau khi sàng lọc từ 15 mẫu IL-2 tái tổ hợp được tổng hợp trong tế bào E. coli và

tinh chế bằng sắc kí ái lực, chúng tôi đã lựa chọn ra mẫu rhIL2MN có hoạt tính tốt nhất

để tiến hành thí nghiệm tiếp nhằm định tính và định lượng hoạt tính sinh học của

chúng. Với việc sử dụng tế bào CTLL2 phụ thuộc IL-2 trong phép thử sinh học do

chúng tôi thiết lập, mẫu rhIL2MN được kiểm tra và so sánh với sản phẩm IL-2 của

Trung Quốc và Hoa Kỳ. Các dữ liệu được trình bày và minh hoạ ở bảng 3 và hình 38.

Bảng 3. Dữ liệu kiểm tra hoạt tính của các mẫu rhIL-2MN tái tổ hợp

% Hoạt hoá tế bào CTLL-2

Tên mẫu

Giá trị ED50 (μg/ml)

0,125 μg/ml

0,25 μg/ml

0,5 μg/ml

1 μg/ml

2 μg/ml

36,9

42,7

58,3

59,1

81,6

0,373

rhIL2MN

24,2

43,4

60,9

72,5

90,7

0,352

M-TQ

66,9

124,5

107,6

83,8

191,2

0,052

M-US

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

Hoạt tính của rhIL-2MN

250

200

150

rhIL2MN

100

M-TQ

h n í t t ạ o H %

M-US

0.5

1.5

2.5

Nồng độ m ẫu thử

Hình 38. Xác định và so sánh hoạt tính của các mẫu IL-2 thử nghiệm

Kết quả thí nghiệm cho thấy, cả 3 mẫu thử đều có khả năng hoạt hoá và duy trì sự sống

cho tế bào CTLL2. Mẫu thí nghiệm từ Hoa Kỳ cho thấy hoạt tính cao nhất và khả năng

hoạt hoá lên tới 191% (gấp 1,91 lần) so với đối chứng âm (không được bổ sung IL-2

vào môi trường nuôi cấy). Mẫu rhIL2MN do chúng tôi tổng hợp có hoạt tính tốt, khả

năng hoạt hoá tế bào CTLL2 đạt 81,6%. Khả năng hoạt hoá này cho thấy các mẫu

nghiên cứu đã duy trì và tăng sinh đối với tế bào CTLL2 phục thuộc IL-2. Hoạt tính

của mẫu rhIL2MN nghiên cứu là thấp hơn so với mẫu của Hoa Kỳ và gần tương đương

với thương phẩm IL-2 của Trung Quốc. Việc mẫu IL-2 của Mỹ có hoạt tính vượt trội

so với mẫu của Trung Quốc và của đề tài tạo ra có thể được giải thích là do trong sản

phẩm IL-2 của Mỹ do hãng BD cung cấp thì ngoài IL-2 ra nó còn chứa concanavalin A

(ConA, 10 ug/ml) là chất kích thích phân chia tế bào (mitogen) và dịch chiết nuôi tế

bào lách. Đây là những chất kích thích phát triển mạnh tế bào IL-2 trong nuôi cấy.

Với kết quả thu được ở trên, chúng tôi đã tiến hành quy đổi và xác định hoạt

tính cho các mẫu thí nghiệm theo quy chuẩn quốc tế. Kết quả được trình bày ở bảng 4.

Bảng 4. Đơn vị hoạt tính của các mẫu IL-2 thử nghiệm

STT

Tên mẫu

Giá trị quy đổi (U/mg)

Giá trị ED50 (μg/ml)

0,352

rhIL2MN

0,373

M-TQ

0,052

2,7 x 106 2,9 x 106 2 x 107

M-US

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

So sánh kết quả trên, chúng tôi nhận thấy đơn vị hoạt tính của các mẫu rhIL2MN là tương đối tốt. Mẫu của Hoa Kỳ đạt tới 2 x 107 U/mg và là mẫu có hoạt tính tốt nhất. Mẫu rhIL2MN đạt hoạt tính cao nhất 2,7 x 106 U/mg, gần tương đương với thương phẩm IL-2 đang được bán trên thị trường Trung Quốc 2,9 x 106 U/mg.

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

3.7.3. Xác định hoạt tính sinh học của mẫu rhIL2 biểu hiện trong P. pastoris

Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng mẫu rhIL2 được tổng hợp bởi tế bào

nấm men P. pastoris và chưa làm sạch để nghiên cứu khả năng kích thích phát triển

của tế bào CTLL-2 nuôi cấy in vitro. Các mẫu sản phẩm IL-2 của Trung Quốc và Hoa

Kỳ được sử dụng làm đối chứng dương. Số liệu về khả năng kích hoạt sự phát triển của

tế bào CTLL-2 của các mẫu thử được trình bày ở bảng 5 và hình 39.

rhIL-2 TQ1 3.9 86.1 35.5 26.8 9.0 1.0

33.2 126.1 117.1 128.7 83.9 15.2

US 663.5 320.0 169.0 111.0 72.9 40.6

Mẫu TNo % hoạt hoá 2 μg/ml 1 μg/ml 0.5 μg/ml 0.25 μg/ml 0.125 μg/ml

Bảng 5. Khả năng hoạt hoá tế bào CTLL-2 phát triển của mẫu ở nồng độ thử khác nhau

Hoạt tính của rhIL-2 Hoạt tính của rhIL-2

Hoạt tính của nhIL2

350

300

250

rhIL-2 nhIL-2

200

TQ1

150

h n í t t ạ o H %

100

0.5

1.5

2.5

Nồng độ mẫu thử

Hình 39. Đồ thị minh hoạ sự phát triển của tế bào CTLL-2 dưới tác động của các IL-2 khác nhau (rhIL2: VN, TQ1: Trung Quốc, US: Mỹ).

Kết quả thí nghiệm cho thấy, cả 3 mẫu thử đều có khả năng hoạt hoá và duy trì

sự sống cho tế bào CTLL2. Với kết quả thu được, chúng tôi đã tiến hành xác định giá

trị ED50 (nồng độ mà chất thử kích hoạt được 50% sự phát triển của tế bào CTLL-2),

đồng thời tiến hành qui đổi và xác định đơn vị hoạt tính cho các mẫu thí nghiệm theo

qui chuẩn quốc tế. Kết quả được trình bày ở bảng 6.

Tên mẫu

STT 1. 2. 3. Giá trị ED50 (μg/ml) 0,25 1,32 0,037 Giá trị qui đổi (U/mg) 4 x 106 7,6 x 105 2,7 x 107 rhIL-2 M-TQ M-US

Bảng 6. Đơn vị hoạt tính của các mẫu rhIL-2 thử nghiệm

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

Kết quả trên cho thấy, mẫu thí nghiệm từ Hoa Kỳ cho thấy hoạt tính cao nhất và

khả năng hoạt hoá lên tới 663,5% (gấp 6,63 lần) so với đối chứng âm (không được bổ

sung IL-2 vào môi trường nuôi cấy) ở nồng độ thử chất cao nhất (20 ug/ml). Đơn vị hoạt tính của mẫu này đạt tới 2,7 x 107 U/mg. Ở các nồng độ thử chất tăng dần, hoạt

tính của mẫu này cũng tăng dần, cho thấy hoạt tính của mẫu thử rất ổn định và đáng tin

cậy. Mẫu rhIL-2 do chúng tôi tổng hợp có hoạt tính tốt, có khả năng hoạt hoá tế bào

CTLL-2. Khả năng hoạt hoá của mẫu rhIL-2 đạt 126,1%. Đơn vị hoạt tính của mẫu này đạt tới 4 x 106 U/mg. Mặc dù là mẫu IL-2 được lấy trực tiếp từ dịch nuôi cấy chưa

qua tinh chế, thế nhưng kết quả cho thấy hoạt tính của IL-2 vẫn rất cao, đặc biệt là ở

nồng độ thấp ban đầu (0,25 và 0,5 μg/ml), chứng tỏ rhIL2MN biểu hiện trong nấm men

có thể có hoạt tính riêng cao hơn so với biểu hiện trong E. coli. Ở những nồng độ thử

cao hơn (1 và 2 μg/ml) chế phẩm rhIL2 biểu hiện trong nấm men có dấu hiệu giảm

hoạt tính, có thể là do các protein còn lẫn trong chế phẩm gây hiệu ứng ức chế sinh

trưởng của tế bào CTLL-2. Đây là một kết quả rất quan trọng trong việc lựa chọn tế

bào chủ để sản xuất IL-2 sau này.

Mẫu IL-2 của Trung Quốc có hoạt tính thấp hơn so với các lần thử trước đây. Nguyên

nhân có thể là mẫu IL-2 của Trung Quốc bị giảm hoạt tính trong quá trình bảo quản.

3.7.4. Kết luận.

trong nấm men có thể cao hơn so với hoạt tính của rhIL2MN biểu hiện trong E. coli đạt 4 x 106 U/mg. Cả hai dạng IL-2 tái tổ hợp tổng hợp từ E. coli và nấm men đều có khả

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

năng kích hoạt sự phát triển tế bào CTLL-2.

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

3.8. THỬ NGHIỆM IL-2 TÁI TỔ HỢP TRÊN MÔ HÌNH TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

3.8.1. Kết quả nghiên cứu

3.8.1.1. Gây ung thư thực nghiệm đường tiêu hóa cho chuột nhắt trắng bằng hóa chất AOM 3.8.1.2. Nghiên cứu hoạt tính kháng u báng Sarcoma 180 của rhIL2MN

3.8.2. Kết luận

3.8.1. Kết quả nghiên cứu

Theo một số các công trình nghiên cứu của FDA (Mỹ) cho thấy IL-2 đã được sử

dụng trong điều trị hai loại ung thư là ung thư hắc tố (melanoma) và ung thư thận ác

tính. Tuy nhiên IL-2 có vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy sự hoạt hóa các tế bào

miễn dịch vì vậy IL-2 cũng có thể được sử dụng trong điều trị các bệnh ung thư khác.

Để nghiên cứu thử nghiệm IL-2 tái tổ hợp trên mô hình tế bào động vật chúng tôi đã

tiến hành gây ung thư thực nghiệm đường tiêu hóa cho chuột do việc gây ung thư

đường tiêu hóa dễ hơn so với gây ung thư biểu mô thận và ung thư hắc tố. Ngoài ra, số

lượng bệnh nhân ung thư thận và ung thư hắc tố ở Việt nam hiếm gặp hơn so với ung

thư đường tiêu hóa, do vậy đề tài đã tiến hành thử nghiệm IL-2 tái tổ hợp trên chuột bị

ung thư đường tiêu hóa để có thể tiếp tục nghiên cứu thử nghiệm trên bệnh nhân ung

thư đường tiêu hóa giai đoạn muộn.

3.8.1.1. Gây ung thư thực nghiệm đường tiêu hóa cho chuột nhắt trắng bằng hóa

chất AOM

i) Tỷ lệ phát sinh u ở ruột chuột dưới tác dụng của hóa chất AOM

- 10 chuột khỏe mạnh được dùng làm đối chứng sinh học

- 108 chuột được tiêm hóa chất AOM để gây ung thư đường tiêu hóa, trong đó:

• 46 chuột được dùng làm đối chứng ung thư, trong số này 15 con được mổ ở tuần

thứ 14 để xác định tỷ lệ phát sinh u. 31 con còn lại tiếp tục nuôi đến tuần thứ 40

để làm đối chứng ung thư về mô bệnh học.

• 31 con được điều trị bằng IL2 tái tổ hợp của Trung Quốc

• 31 con được điều trị bằng IL2 tái tổ hợp của Việt nam (do Viện CNSH cung cấp)

- Kết quả về tỷ lệ phát sinh u ở ruột chuột thu được sau 14 tuần kể từ khi tiêm

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

AOM là 50%. Khối u là những tổn thương tiền ác tính niêm mạc ruột (ACF) sẽ

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

dẫn tới ung thư. Kết quả được minh họa trên các hình 40, 41, 42, 43.

- Kết quả xác định số lượng u/ ruột một con chuột ở tuần thứ 40 sau khi tiêm

AOM được trình bày ở bảng 7.

Bảng 7. Số trung bình của u ở ruột 1 chuột trong các lô thí nghiệm

Số Số lượng Số chuột có u Trung bình số

TT Lô thí nghiệm chuột TN u/ruột 1 chuột Số lượng (%)

1 Đối chứng sinh học 10 2 20 1,5 ± 0,5

2 Đối chứng ung thư 31 22 71 4,4 ± 0,3

3 Điều trị bằng IL2 TQ 31 24 77 4,8 ± 0,5

4 Điều trị bằng IL2 VN 31 23 74 4,8 ± 0,4

Bảng 7 cho thấy có 2/10 (20%) chuột khỏe mạnh xuất hiện 1 đến 2 u ở đoạn

ruột già từ manh tràng đến trực tràng (trung bình 1,5 ± 0,5 u/ruột 1 chuột). Còn ở các

chuột được tiêm AOM thì có tới 71 đến 77% số chuột có u. Điều đó chứng tỏ quy trình

gây ung thư đường ruột bằng hóa chất AOM tại phòng thí nghiệm của chúng tôi đã đạt

được kết quả như mục tiêu của đề tài đặt ra. Tuy nhiên không có sự khác biệt có ý

nghĩa thống kê về trung bình số u/ruột 1 chuột giữa các lô thí nghiệm điều trị bằng IL2

của TQ và VN so với lô đối chứng ung thư sau 40 tuần thí nghiệm.

Để làm rõ thêm ảnh hưởng của AOM đến sự phát sinh u ở đường ruột của chuột

thí nghiệm, chúng tôi tiến hành khảo sát về mô bệnh học.

Hình 40. Niêm mạc đại tràng chuột nhắt trắng bình thường (Chụp dưới kính lúp)

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

Hình 41. Niêm mạc đại tràng chuột nhắt trắng bị ung thư (1) , (2) ,(3), (4) là các u xuất hiện sau 14 tuần tiêm AOM (Chụp dưới kính lúp)

Hình 42. Niêm mạc đại tràng chuột nhắt trắng bình thường (Chụp dưới kính hiển vi)

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

Hình 43. Niêm mạc đại tràng chuột nhắt trắng bị ung thư (1) Vùng bị ung thư, (2) Vùng bình thường (Chụp dưới kính hiển vi)

ii) Nghiên cứu mô bệnh học ruột chuột thí nghiệm

Kết quả nghiên cứu mô bệnh học ruột chuột thí nghiệm được trình bày, chú giải

và nhận xét trên các hình 44, 45, 46, 47.

Trên các tiêu bản hiển vi mô ruột chúng tôi không phát hiện được sự sai khác về

hình thái tế bào và mô giữa các lô chuột ung thư được điều trị bằng IL2 so với lô đối

chứng ung thư. Có thể chế phẩm IL2 tái tổ hợp không có tác dụng đối với loại ung thư

đường ruột nói trên. Do vậy chúng tôi quyết định thử hoạt tính kháng u của IL2 tái tổ

hợp lên một mô hình ung thư khác - là mô hình ung thư báng Sarcoma 180.

Hình 44. Tiêu bản hiển vi mô học lông nhung ruột chuột nhắt trắng bình thường: Các tế bào biểu mô hình trụ đơn lớp xếp sát nhau, các tế bào lõi lông nhung có dạng hình thoi (thuộc mô liên kết) (PĐ: 100 x 10)

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

Hình 45. Tiêu bản hiển vi mô bệnh học lông nhung ruột chuột nhắt trắng bị ung thư dưới tác động của AOM: Các tế bào mất biệt hoá, nhân bắt màu đậm, phân bố lộn xộn ( PĐ: 60 x 10)

Hình 46. Tế bào biểu mô niêm mạc bị giải biệt hóa, đang chuyển dạng thành ung thư, có nhân lớn và tăng sắc do bắt màu kiềm đậm (PĐ: 100 x 10)

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

Hình 47. Tế bào mô liên kết ở lõi lông nhung bị giải biệt hóa, phân bố lộn xộn, đang chuyển dạng thành ung thư, có nhân lớn và tăng sắc (PĐ: 100 x 10)

a - Các tế bào biểu mô không còn hình trụ điển hình

b - Các tế bào biểu mô liên kết ở lõi lông nhung mất dạng hình thoi

iii) Về hiện tượng di căn

Khi mổ chuột vào tuần thứ 40 sau tiêm hóa chất AOM, chúng tôi quan sát gan

của toàn bộ chuột bị ung thư đường ruột nhưng không phát hiện thấy các nốt di căn tới

cơ quan này. Có lẽ thời gian 40 tuần đối với ung thư thực nghiệm đường ruột là còn

quá ngắn, khối u chưa đủ độ "chín muồi" để xảy ra hiện tượng di căn vì theo Valhalla,

1999 gây ung thư bằng AOM phải mất 52 tuần mới có di căn.

iv) Công thức bạch cầu của máu ngoại vi ở chuột thí nghiệm

Máu của chuột ở các lô thí nghiệm đã được lấy vào các ống nghiệm có chứa

chất chống đông Heparin để phân tích thành phần bạch cầu. Thí nghiệm này đã không

có kết quả do máu bị đông trước khi đưa vào máy phân tích. Có thể do chất lượng của

Heparin đã không đạt yêu cầu. Chúng tôi đã không lặp lại được thí nghiệm này do thời

gian (40 tuần) cũng như kinh phí không cho phép.

3.8.1.2. Nghiên cứu hoạt tính kháng u báng Sarcoma 180 của IL-2.

i) Gây u báng Sarcoma 180 cho chuột nhắt trắng Swiss

Để có mô hình u báng thực nghiệm, 120 chuột nhắt đực trắng dòng Swiss 8 tuần

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

tuổi, trọng lượng trung bình 20 ± 1 gam được cấy truyền 106 TB vào xoang bụng 1

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

chuột, sau đó chia lô thí nghiệm. Kết quả 100% chuột ở lô đối chứng có u báng, thấy

rõ bụng báng vào ngày thứ 4-5 sau cấy truyền (Xem hình 48)

Hình 48. Chuột nhắt trắng Swiss khoẻ mạnh (a) và mang u báng Sarcoma 180 sau 12 ngày cấy truyền (b)

ii) Tiêm chế phẩm IL2 tái tổ hợp

Hai ngày sau cấy truyền ung thư, các chuột ở lô thí nghiệm được tiêm chế phẩm

IL-2 tái tổ hợp của Việt Nam và Trung Quốc liều 600.000 UI/kg với lượng 0,2 ml/con

x 4 lần, cách nhật. Đến ngày thứ 14 sau cấy truyền, tiến hành mổ chuột để khảo sát các

chỉ tiêu nghiên cứu.

iii) Xác định các chỉ tiêu nghiên cứu

Sinh khối u, tỷ số phát triển (GR%) và tỷ số ức chế u (IR%) được tổng hợp và

trình bày trên bảng 8 và các hình 49, 50, 51.

Bảng 8. Định lượng các khối u báng Sarcoma 180 khi mổ chuột thí nghiệm

Thể tích mỗi u (ml)

Sinh khối TBUT (ml)

GR (%)

IR (%)

Lô thí nghiệm

Số ml/con

số ml/con

8,0

5,5

6,2

4,1

7,4

4,8

7,0

4,2

8,0

4,3

7,3

4,6

100

ĐCUT (10 con)

8,0

4,2

6,4

4,6

7,2

4,7

8,1

4,4

7,9

5,1

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

3,0

2,0

3,5

2,5

4,0

2,5

0,0

7,8

4,5

3,3

2,6

56,5

43,5

0,0

5,7

3,5

Tiêm (ip) IL2 Việt nam liều 600.000 IU/kg x 4

2,5

1,5

5,0

4,0

1,6

0,8

3,5

2,5

0,0

6,5

4,5

3,4

3,2

3,7

2,0

1,4

30,4

69,6

2,5

1,5

0,0

Tiêm (ip) IL2 T.Quốc liều 600.000 IU/kg x 4

0,0

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

Hình 49. Ảnh minh họa sinh khối tế bào ung thư Sarcoma 180: Đối chứng ung thư (1), Tác động của IL2-VN (2), Tác động của IL2-TQ (3)

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

A B

ĐCUT (Tiêm NaCl 0,9%)

Tiêm IL2 của VN

Tiêm IL2 của TQ

GR%

120%

a w k o t i .

100%

80%

60%

40%

20%

+++

H a ủ c u g n á h k h n í t t ạ o h á i g h n á đ g n a h T

§CUT

IL2.TQ

IL2.VN

L« thÝ nghiÖm

Hình 50. Sự giảm sinh khối u báng Sarcoma 180 dưới tác động của IL2 tái tổ hợp

Hình 51. Biểu đồ so sánh tỷ số phát triển u giữa các lô thí nghiệm - Chế phẩm IL2.VN đạt hiệu lực kháng u (+).

- Chế phẩm IL2.TQ đạt hiệu lực kháng u (++).

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

(Theo thang đánh giá hoạt tính kháng u của H.ITOKAWA, 1989)

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

iv) Hình ảnh tế bào ung thư Sarcoma 180

Hình 52. Tế bào ung thư báng Sarcoma 180 ở lô đối chứng (x1000) Tế bào hình cầu, tỷ lệ nhân/tế bào chất lớn, trong tế bào có những giọt lipit làm giảm trọng lượng của tế bào và thích nghi với đời sống trôi nổi trong thể dịch.

Hình 53. Tế bào ung thư báng Sarcoma 180 ở lô tiêm chế phẩm IL2.VN

Tế bào bị thoái hoá theo kiểu không bào hoá (Vaccuolization). Tế bào chất ở

vùng ngoại vi tạo nên những mụn phồng (blebs) và sẽ dần bị tróc ra khỏi tế bào. Tế bào

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

sẽ chết theo kiểu hoại thư (necrosis).

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

n

Hình 54. Tế bào ung thư báng Sarcoma 180 dưới tác động của chế phẩm IL2.TQ Tế bào bị chết theo kiểu hoại thư (Necrosis) (n).

Hình 55. Tế bào ung thư báng Sarcoma 180 bình thường dưới kính hiển vi điện tử truyền qua (x10.000). N - Nhân, HN - Hạch nhân, TBC - Tế bào chất, L - Lipid, M - Màng tế bào

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

Hình 56. Tế bào ung thư báng Sarcoma 180 dưới tác động của IL2 VN (x10.000) Tế bào chết theo kiểu hoại thư. N - Nhân - bị phân cắt, chất nhiễm sắc bắt màu đậm và dính vào màng nhân; HN - Hạch nhân,

TBC - Tế bào chất - đang tan rã, L - Lipid, LT - Lông tơ.

Hình 57. Tế bào u báng Sarcoma 180 dưới tác động của IL2 TQ (x10.000) N - Nhân - bị phân thành nhiều thùy, NSC - Nhiễm sắc chất - tập trung thành từng khối

lớn bám sát màng nhân, HN - Hạch nhân, TBC - Tế bào chất - bị tan rữa dần, M -

Màng tế bào lồi lõm, mn - màng nhân - tách dần khỏi tế bào chất (khe sáng), LT - lông

tơ. Tế bào có xu hướng chết theo kiểu chỉ còn nhân trần (nude).

v) Kết quả theo dõi thời gian sống thêm của chuột ung thư được điều trị bằng IL2

Kết quả theo dõi thời gian sống thêm của chuột bị ung thư dưới tác dụng điều trị

của IL-2 được ghi chép hàng ngày, tính thời gian sống trung bình, tỷ lệ sống sót và thời

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

gian sống thêm được trình bày trên bảng 9 và hình 58.

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

Bảng 9. Tác động của chế phẩm IL2-TQ và IL2-VN lên thời gian sống thêm

của chuột nhắt trắng Swiss mang u báng Sarcoma 180

Lô ĐC

Lô IL2- TQ

Lô IL2- VN

Số lượng chuột chết trong quá trình thí nghiệm 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 TB (ngày) ILS%

% sống sót 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

Ngày sống 21 23 23 24 25 25 25 32 35 40 27,3 18,6

Ngày sống 24 29 29 29 38 39 40 40 40 40 34,8 51,3

% sống sót 90 80 70 60 50 40 40 40 40 40

Ngày sống 19 20 20 20 22 23 24 25 27 30 23 0

% sống sót 90 80 70 60 50 40 30 20 10 10

Thời gian sống của các lô chuột thí nghiệm

120

100

§CUT

IL2-TQ

IL2-VN

số ngày

19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39

Hình 58. Đồ thị biểu diễn thời gian sống thêm của các lô chuột thí nghiệm

- Lô đối chứng ung thư sau 30 ngày chuột bị chết hết. - Lô tiêm IL2.TQ sau 35 ngày vẫn còn sống sót 10%. - Lô tiêm IL2.VN sau 39 ngày vẫn còn sống sót 40%.

Kết quả trên bảng 9 và hình 58 cho thấy chế phẩm IL-2 Việt Nam tuy làm giảm

sinh khối u ít hơn IL-2 Trung quốc nhưng lại có tác dụng kéo dài thời gian sống thêm

của chuột ung thư được điều trị bằng IL2-VN nhiều hơn IL2-TQ. Trong công thức đối

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

chứng không tiêm IL-2 chuột gây ung thư thực nghiệm chết hoàn toàn sau 30 ngày gây

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

ung thư (10/10), còn trong trường hợp tiêm IL-2 của trung Quốc sau 40 ngày chỉ còn 1

con sống, trong lúc đó còn 4 con chuột được tiêm chế phẩm IL-2 Việt Nam còn sống.

Đây mới là kết quả nghiên cứu sơ bộ bước đầu thế nhưng nó cho ta một ấn tượng tốt về

tác dụng của chế phẩm IL-2 của VN. Tuy nhiên, do cơ chế của hiện tượng này chưa rõ

cho nên rất cần được tiếp tục nghiên cứu thêm.

3.8.2. Kết luận

1. Hóa chất AOM (Azoxymethane) tiêm dưới da cho chuột nhắt trắng Swiss với

liều 15 mg/con/lần/tuần (2 tuần), sau 40 tuần đã gây ung thư đường ruột cho 71% số

chuột. Kết quả này đã đạt mục tiêu của đề tài đặt ra. Tuy nhiên khi được điều trị bằng

IL-2 tái tổ hợp của TQ và VN (với liều 600.000 U/kg) thì sự thay đổi về số lượng u là

không rõ rệt.

2. Trên các tiêu bản mô bệnh học của ruột chuột nhắt trắng được tiêm AOM

thấy rõ các tế bào đã và đang chuyển dạng thành các tế bào ung thư. Nhưng khi được

điều trị bằng IL-2 tái tổ hợp (TQ và VN) vẫn không thấy rõ hiệu quả.

3. Trên mô hình ung thư báng thực nghiệm Sarcoma 180 trong xoang bụng của

chuột nhắt trắng khi tiêm chế phẩm IL-2 tái tổ hợp (TQ và VN) với liều 600.000 U/kg,

đã có những hiệu quả như sau:

- IL2 TQ đã làm giảm 69,6% sinh khối u, đạt hiệu lực kháng u (++).

- IL2 VN đã làm giảm 43,5% sinh khối u, đạt hiệu lực kháng u (+).

- Về hình thái học hiển vi và siêu vi, IL2 (TQ và VN) đều làm tăng số lượng tế

bào ung thư báng chết theo kiểu hoại thư (necrosis).

- Về thời gian sống thêm của chuột mang ung thư báng được điều trị bằng IL2

cho thấy kết quả như sau:

• IL2 TQ làm tăng thời gian sống thêm lên 18,6% so với đối chứng (0%).

Đến ngày thứ 40 (kết thúc thí nghiệm) vẫn còn 10% số chuột sống sót

(1/10 chuột thí nghiệm).

IL2 VN làm tăng thời gian sống thêm lên 51.3% so với đối chứng. Khi •

kết thúc thí nghiệm vẫn còn tới 40 % số chuột sống sót (4/10 chuột thí

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

nghiệm).

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

3.9. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG IL-2

Trong quá trình thí nghiệm chúng tôi đã chuyển 3 mẫu rhIL2MN sang Viện

Kiểm định quốc gia Vacxin và Chế phẩm sinh học để đánh giá chất lượng và Dược

điển Việt Nam. Mỗi mẫu được cung cấp với số lượng 45 ml (1 mg/ml).

3.9.1. Hiệu giá của sản phẩm IL-2 (Xác định trên dòng tế bào NK)

- Mẫu số 1: 427 U/ml, tương đương 0,43% so với mẫu đối chứng, không đạt yêu

cầu về hiệu giá.

- Mẫu số 2: 3000 U/ ml, tương đương 3% so với mẫu đối chứng, không đạt yêu cầu

về hiệu giá.

- Mẫu số 3: 98.470 U/ ml, tương đương 98,5% so với mẫu đối chứng, đạt yêu cầu

về hiệu giá so với mẫu chuẩn.

3.9.2. Tính vô trùng của sản phẩm IL-2

- Mẫu số 1: Sau 14 ngày không có vi khuẩn và vi nấm mọc, đạt yêu cầu về vô trùng.

- Mẫu số 2: Sau 14 ngày không có vi khuẩn và vi nấm mọc, đạt yêu cầu về vô trùng.

- Mẫu số 3: Sau 14 ngày không có vi khuẩn và vi nấm mọc, đạt yêu cầu về vô trùng.

3.9.3. Tính an toàn của sản phẩm IL-2

- Mẫu số 1: Trong 7 ngày theo dõi, chuột xù lông, tuy có tăng trọng không đạt yêu

cầu về an toàn.

- Mẫu số 2: Trong 7 ngày theo dõi, chuột khỏe mạnh và tăng trọng, đạt yêu cầu về

an toàn.

- Mẫu số 3: Trong 7 ngày theo dõi, chuột khỏe mạnh và tăng trọng, đạt yêu cầu về

an toàn.

3.9.4. Chất gây sốt của sản phẩm IL-2

- Mẫu số 1: Tổng nhiệt độ chênh lệch của 3 thỏ là 7,30C, không đạt yêu cầu về chất

gây sốt.

- Mẫu số 2: Tổng nhiệt độ chênh lệch của 3 thỏ là 4,50C, không đạt yêu cầu về chất

gây sốt.

- Mẫu số 3: Tổng nhiệt độ chênh lệch của 3 thỏ là 1,10C, đạt yêu cầu về chất gây

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

sốt

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

3.9.5. Tính chất lý hóa của sản phẩm

(cid:153) Mẫu số 1:

- Dung dịch trong suốt, không màu

- pH 7,3

- Không có chất thimerosal bảo quản

- Không có protein ngoại lai

- Đạt yêu cầu về tính chất lý hóa

(cid:153) Mẫu số 2:

- Dung dịch trong suốt, không màu

- pH 7,2

- Không có chất thimerosal bảo quản

- Không có protein ngoại lai

- Đạt yêu cầu về tính chất lý hóa

(cid:153) Mẫu số 3:

- Dung dịch trong suốt, không màu

- pH 7,1

- Không có chất thimerosal bảo quản

- Không có protein ngoại lai

- Đạt yêu cầu về tính chất lý hóa

3.9.6. Kết luận

Trong số 3 mẫu rhIL2MN được tiến hành đánh giá thì chỉ có mẫu số 3 đạt tiêu

chuẩn về hiệu giá, tính vô trùng, tính an toàn, đạt yêu cầu về tính chất lý hóa và hàm

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

lượng chất gây sốt trong ngưỡng cho phép.

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

CHƯƠNG 4

TỔNG QUÁT HOÁ VÀ ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ THU ĐƯỢC

4.1. KẾT QUẢ VỀ KHOA HỌC

Trong thời gian 30 tháng từ tháng 1/2005 đến hết tháng 6/2007, đề tài KC.04.33 đã

thu được kết quả chính như sau:

01. Đề tài đã tạo được dòng cDNA mang gen IL-2 của người từ RNA tổng số tách từ tế

bào lách bằng kỹ thuật RT-PCR. Kết quả xác định trình tự nucleotide của dòng gen này cho

thấy có 4 biến đổi về nucleotide đơn so với trình tự NP_000577 đã đăng kí trong Ngân hàng

dữ liệu gen quốc tế là A36G, G54T, T74C và C389T. Tuy nhiên chỉ có 2 trong 4 biến đổi

nucleotide này làm thay đổi các gốc amino acid tương ứng trong phân tử protein. Đó là thay

đổi T74C dẫn đến thay thế leucine ở vị trí 25 bằng serine (L25S) và thay đổi C389T dẫn đến

thay thế serine ở vị trí 130 thành leucine (S130L).

02. Bằng kỹ thuật tạo đột biến điểm định hướng nhờ các đoạn oligonucleotid tổng hợp,

chúng tôi đã tạo thành công các đột biến điểm của gen IL-2 ở các vị trí: i) làm mất điểm

glycosyl hoá bằng đột biến thay thế các gốc amino acid tại điểm nhận biết để glycosyl hóa

Alanine-Proline-Threonine tại tận cùng đầu N của phân tử IL-2 thành Alanine-Methionine-

Alanine; ii) đột biến gốc Cystein ở vị trí 125 thành Serine để loại bớt khả năng tạo sai cầu

disulfide giữa gốc Cystein này với 2 gốc ở vị trí 58 và 105 trong phân tử IL-2; iii) gây hồi

biến gốc Serine ở vị trí 25 thành Leucine để protein tái tổ hợp có cấu trúc và hoạt tính sinh học giống với thương phẩm ProleukinRIL-2, từ đó mở ra khả năng thương mại của chế phẩm

IL-2 trên thị trường Việt Nam.

03. Với mục đích tìm được hệ biểu hiện thích hợp nhất để có thể tạo ra lượng lớn protein

tái tổ hợp có hoạt tính, đề tài đã tiến hành biểu hiện IL-2 trên các hệ khác nhau như trong tế

bào E. coli và trong nấm men P. pastoris. Kết quả là chúng tôi đã biểu hiện thành công protein

IL-2 tái tổ hợp trong tế bào vi khuẩn E. coli BL21 (DE3) với hệ vector pET32c(+). Kết quả

Western blot cho thấy protein lai Trx-rhIL2MN có khả năng bắt cặp đặc hiệu của với kháng

thể kháng IL-2, chứng tỏ protein IL-2 tái tổ hợp đã được tổng hợp đúng cấu trúc không gian

và có hoạt tính. Ngoài ra chúng tôi cũng đã nhận dạng được rhIL2MN bằng phương pháp khối

phổ. Kết quả cho thấy protein nhận được đúng là hIL-2. Chủng vi khuẩn E. coli tái tổ hợp có

khả năng tổng hợp IL-2 đạt khoảng 90 mg/L IL-2, cao gấp nhiều lần so với dự tính (40 μg/L).

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

100

Đối với hệ biểu hiện trong nấm men P. pastoris GS115, chúng tôi đã biểu hiện thành công IL-

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

2 dạng riêng lẻ và protein tái tổ hợp rhIL-2 có kích thước 15,4 kDa. Protein biểu hiện được

trong nấm men có khả năng bắt cặp đặc hiệu với kháng thể kháng IL-2 của người.

04. Đề tài đã xây dựng được quy trình lên men đối với các chủng vi vật tái tổ hợp

mang gen IL-2 ở quy mô bình tam giác và trong hệ thống lên men 5L và 14L. Các

thông số điều khiển quá trình lên men IL-2 trong 2 hệ thống bình lên men Bioflo110 đã

được tối ưu để thu được lượng lớn protein tái tổ hợp như pH môi trường 6,0; nhiệt độ 37 oC; sục khí 0,5 vvm (lít khí/ lít môi trường/ phút); tốc độ khuấy 200 vòng/ phút, nhiệt độ cảm ứng là 300C khi OD bắt đầu đạt 0.6. Sản phẩm tích lũy cao nhất ở thời

điểm sau khi cảm ứng 5 giờ. Kết quả lên men trong cả hai hệ thống 5 lít và 14 lít đều

cho xấp xỉ 70-80 g sinh khối ướt/lít và 192 mg protein lai Trx-IL-2/ lít. Kết quả này mở

ra triển vọng cho đề tài có khả năng sản xuất chế phẩm IL-2 ở quy mô công nghiệp.

05. Đã tinh chế thành công protein lai Trx-rhIL2MN với kích thước khoảng 32 kDa bằng

phương pháp sắc ký ái lực. Phần rhIL2MN được tách khỏi các thành phần không mong muốn

Trx-Stag-Histag trong cấu trúc protein lai Trx-rhIL2MN bằng cách cắt với enzyme

enterokinase và sắc ký ái lực. Protein rhIL2MN thu được có kích thước khoảng 15,4 kDa.

06. Trên mô hình tế bào CTLL-2 nuôi cấy in vitro, chúng tôi đã tiến hành các phép

thử sinh học để xác định hoạt tính của chế phẩm IL-2 tái tổ hợp tinh sạch. Kết quả so

sánh với sản phẩm IL-2 của Trung Quốc và Hoa Kỳ cho thấy sản phẩm IL-2 có hoạt tính hoạt tính đạt 2,7 x 106 U/mg, tương đương với sản phẩm IL-2 của Trung Quốc 2,9 x 106 U/mg. Hoạt tính của rhIL-2 biểu hiện trong nấm men mặc dù chưa được tinh chế nhưng có hoạt tính khá cao khi thử nghiệm trên dòng tế bào CTTL2 đạt 4 x 106 U/mg.

07. Trên mô hình tế bào động vật, chúng tôi đã tiến hành gây ung thư thực nghiệm trên

chuột bằng hoá chất AOM, kết quả thử nghiệm IL-2 của VN và IL-2 của TQ cho thấy IL2 TQ

đã làm giảm 69,6% sinh khối u, còn IL2 VN đã làm giảm 43,5% sinh khối u. Khi tiến hành

các nghiên cứu về thời gian sống thêm của chuột bị ung thư được điều trị bằng IL-2 cho thấy

IL2 TQ có thể làm tăng thời gian sống thêm lên 18,6% so với đối chứng (0%) còn IL2 VN có

thể làm tăng thời gian sống thêm lên 51.3% so với đối chứng. Các kết quả nghiên cứu tác

động điều trị của IL-2 trên mô hình tế bào động vật đã chứng tỏ chế phẩm IL-2 do Việt Nam

sản xuất có hoạt tính và đạt hiệu lực kháng u báng ở chuột bị ung thư.

08. Chế phẩm IL-2 tái tổ hợp do đề tài tạo ra đã được đánh giá đạt yêu cầu về hiệu

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

101

giá, an toàn, nồng độ chất chí nhiệt tố trong khoảng cho phép.

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

4.2. TỔNG HỢP CÁC SẢN PHẨM ĐẠT ĐƯỢC SO VỚI ĐĂNG KÝ

Bảng 10. Các dòng gen và dòng vector tạo ra của đề tài

TT

Đơn vị đo

Tên sản phẩm

Tên sản phẩm và chỉ tiêu chất lượng chủ yếu

1 Gen IL-2 người

Gen

Vectơ

Gen mã hóa cho protein IL-2 người Vectơ pET32-rhIL2MM biểu hiện gen IL-2 đột biến mất khả năng glycosyl hoá và chuyển gốc Cys125 thành Ser125 trong E. coli. Vectơ pET32-rhIL2MN biểu hiện gen IL-2 đột biến chuyển Ser thành Leu ở vị trí 25 trong E. coli

Vectơ

Vectơ pPIC-Trx-rhIL2MN

Vectơ

Vectơ pPICZ-Trx-rhIL2MN

Vectơ

Vectơ pPIC9-rhIL2

Vectơ biểu hiện gen IL-2 đột biến mất khả năng glycosyl hoá và chuyển gốc Cys ở vị trí 125 thành Ser trong E. coli bằng hệ pET32. Vector biểu hiện gen IL-2 đột biến chuyển Ser thành Leu ở vị trí 25 trong E. coli bằng hệ pET32 Vectơ biểu hiện gen IL-2 trong P. pastoris bằng hệ pPIC9. Vectơ biểu hiện gen IL-2 trong P. pastoris bằng hệ pPICZα Vectơ biểu hiện gen IL-2 dạng tự nhiên trong P. pastoris bằng hệ pPIC9

Chủng vi sinh vật

Chủng E. coli biểu hiện gen IL-2 MN trong vector pET32.

Chủng vi sinh vật

Chủng P. pastoris tái tổ hợp có khả năng tổng hợp IL-2MN

IL-2 tái tổ hợp dạng đột biến thương phẩm Proleukin-2

Chủng E. coli biểu hiện gen IL-2 MN đạt khoảng 90 mg/L IL-2, cao gấp 2000 lần so với dự kiến Chủng P. pastoris tái tổ hợp có khả năng tổng hợp IL-2MN đạt khoảng 5 mg/L, cao gấp 100 lần so với dự kiến 200 mg IL-2 tái tổ hợp dạng thương phẩm có độ tinh khiết đạt 99%

Bảng 11. Sản phẩm khoa học của đề tài

Chỉ tiêu kinh tế - kỹ thuật

TT

Tên sản phẩm đăng ký

Số lượng

Kết quả đạt được

Kế hoạch Quy trình tạo chủng E. coli đạt 40 μg protein/lit.

01 quy trình tạo chủng E. coli biểu hiện gen IL-2 đạt khoảng 90 mg/L IL- 2, cao gấp 2000 lần so với dự kiến.

Quy trình tạo chủng P. pastoris đạt 50 μg protein tái tổ hợp/lit.

01 quy trình tạo chủng P. pastoris tái tổ hợp có khả năng tổng hợp IL-2 đạt khoảng 5 mg/L, cao gấp 100 lần so với dự kiến.

Quy trình tạo chủng E. coli có khả năng tổng hợp IL-2 tái tổ hợp. Quy trình tạo chủng P. pastoris có khả năng tổng hợp IL-2 tái tổ hợp ở dạng ngoại bào.

Quy trình biểu hiện gen IL-2 trong E. coli

Các thông số về điều kiện cảm ứng biểu hiện gen IL-2 trong E. coli.

Quy trình biểu hiện gen IL-2 trong P. pastoris.

Các thông số về điều kiện cảm ứng biểu hiện gen IL-2 trong P. pastoris.

01 quy trình biểu hiện gen IL-2 trong E. coli với các điều kiện thích hợp như cảm ứng với nồng độ IPTG 1 mM, nhiệt độ nuôi cấy 30oC và thời gian thu mẫu sau 3 giờ cảm ứng. 01 quy trình biểu hiện gen IL-2 trong P. pastoris với điều kiện cảm ứng biểu hiện ở nhiệt độ 300C, nồng độ methanol 0,5% và thu mẫu sau 72 giờ cảm ứng.

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

102

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

Quy trình lên men chủng E. coli tái tổ hợp.

Các thông số về điều kiện lên men tối ưu đối với chủng E. coli tái tổ hợp.

Quy trình lên men chủng P. pastoris tái tổ hợp.

Các thông số về điều kiện lên men tối ưu đối với chủng P. pastoris tái tổ hợp.

01 quy trình lên men chủng E. coli tái tổ hợp chứa gen IL-2 trong hệ thống lên men Bioflo110 dung tích 5 L và 14 L với các thông số tối ưu cho quá trình lên men như pH môi trường 6,0; nhiệt độ 37oC; sục khí 0,5 vvm (lít khí/ lít môi trường/ phút); tốc độ khuấy 200 vòng/ phút, nhiệt độ cảm ứng là 300C khi OD bắt đầu đạt 0,6. 01 quy trình lên men chủng P. pastoris tái tổ hợp chứa gen IL-2 trong hệ thống lên men Bioflo110 dung tích 5 L và 14 L với các thông số tối ưu cho quá trình lên men như pH môi trường 6,0; nhiệt độ 30 oC; sục khí 2 vvm (lít khí/ lít môi trường/ phút); tốc độ khuấy 200 vòng/ phút, nhiệt độ cảm ứng là 300C khi OD bắt đầu đạt 1.

Quy trình tách chiết và tinh chế protein tái tổ hợp từ chủng E. coli.

01 quy trình tách chiết và tinh chế protein tái tổ hợp từ chủng E. coli đạt độ tinh sạch 99% và đặc hiệu với kháng thể kháng IL-2 của người.

Quy trình tách chiết và tinh chế protein tái tổ hợp đủ độ sạch và độ đặc hiệu cao. Quy trình tổng thể về sản xuất IL-2 tái tổ hợp.

Các thông số về tác dụng của IL-2 đối với động vật thực nghiệm.

Quy trình công nghệ tổng hợp sản xuất interleukin-2. Phương pháp nghiên cứu tác động của IL-2 tái tổ hợp lên động vật thực nghiệm và trên tế bào CTLL-2 nuôi cấy in vitro.

Đánh giá chất lượng IL-2 tái tổ hợp theo tiêu chuẩn quốc tế.

200 mg

Interleukin-2 tái tổ hợp dạng đột biến thương phẩm Proleukin-2.

01 quy trình tổng thể sản xuất IL-2 tái tổ hợp trong tế bào E. coli và P. pastoris 01 phương pháp nghiên cứu tác động của IL-2 tái tổ hợp lên động vật thực nghiệm và 01 phương pháp nghiên cứu tác động của IL-2 tái tổ hợp trên tế bào CTLL-2 nuôi cấy in vitro. Trung tâm Quốc gia kiểm định vacxin đã đánh giá chế phẩm IL-2 đạt tiêu chuẩn về hiệu giá, tính vô trùng, tính an toàn, đạt yêu cầu về tính chất lý hóa và hàm lượng chất gây sốt trong ngưỡng cho phép. Đã tổng hợp đủ 200 mg IL-2 tái tổ hợp đạt độ tinh khiết 99% để đưa đi thử nghiệm trên động vật thực nghiệm, trên tế bào CTLL-2 nuôi cấy in vitro và đánh giá chất lượng IL-2.

Chế phẩm IL-2 an toàn, không có chất gây sốt, đảm bảo điều kiện vô trùng. Độ tinh khiết đạt 99%. Liều lượng đủ để thử nghiệm với 10 bệnh nhân ung thư đường tiêu hóa giai đoạn muộn pha II.

40 μg IL-2/L

Chủng E. coli mang gen IL-2

1 chủng

01 chủng E. coli mang gen IL-2 đạt hiệu suất 90 mg IL-2/L

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

103

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

50 μg IL-2/L

Chủng P. pastoris mang gen IL-2

1 chủng

14 Đào tạo

02 thạc sỹ 06 cử nhân

01 chủng P. pastoris mang gen IL- 2 đạt hiệu suất 5 mg IL-2/L, tăng 100 lần so với đăng ký. - 3 thạc sỹ (sẽ bảo vệ trong năm 2007 và 2008) - 3 cử nhân - 2 kỹ thuật viên nâng cao trình độ.

15 Bài báo

- Trong nước: đã đăng 5 bài, sẽ đăng thêm 2 bài và đã đăng ký Bằng độc quyền giải pháp hữu ích.

Tổng kết và đánh giá đề tài

Báo cáo tổng kết đề tài đã được hội đồng nghiệm thu cấp cơ sở chấp nhận.

Trong nước: 3-5 bài Nước ngoài: 1-2 bài Được hội đồng khoa học chấp nhận.

4.3. TRÌNH ĐỘ CÔNG NGHỆ

1. Trong quá trình thực hiện đề tài trình độ công nghệ về phân lập và biểu hiện gen

trong các hệ biểu hiện khác nhau như trong E. coli, trong nấm men P. pastoris của

2. Lần đầu tiên ở Việt Nam đã hoàn thiện được các quy trình biểu hiện, lên men, tách

cán bộ tham gia đề tài đã đạt trình độ quốc tế.

chiết, tinh chế IL-2 tái tổ hợp từ các chủng vi khuẩn và nấm men. Đây là cơ sở quan

trọng để xây dựng được quy trình công nghệ tổng hợp sản xuất IL-2 tiến tới phục

3. Các phương pháp nghiên cứu sử dụng trong đề tài từ khâu phân lập gen, đến biểu

vụ cho việc sản xuất chế phẩm IL-2 tái tổ hợp trên quy mô công nghiệp ở nước ta.

hiện, thu hồi và tinh chế, nghiên cứu tác động của IL-2 tái tổ hợp lên mô hình động

vật thí nghiệm và trên tế bào CTLL-2 nuôi cấy in vitro đều đạt trình độ quốc tế, các

4. Các kết quả nghiên cứu thu được của đề tài khẳng định trình độ của các cán bộ

số liệu, hình ảnh và bảng biểu báo cáo được đưa ra là đáng tin cậy.

nghiên cứu khoa học nước ta trên lĩnh vực công nghệ sinh học hiện đại ngang tầm

với các nước trong khu vực và trên thế giới. Các kết quả khoa học của đề tài không

chỉ có ý nghĩa khoa học mà còn có ý nghĩa thực tiễn cao, góp phần phục vụ cho nền

y học của Việt Nam trong tương lai.

4.4. KHẢ NĂNG ÁP DỤNG

Chế phẩm Interleukin-2 do đề tài tạo ra tại Viện CNSH đã được chứng minh là có hoạt

tính tương đương với sản phẩm nước ngoài. Điều này mở ra triển vọng sản xuất và ứng

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

104

dụng chế phẩm này trong việc điều trị bệnh ung thư đối với các bệnh nhân ở Việt Nam.

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

4.5. ĐÀO TẠO

Bảng 12. Danh sách các học viên được đào tạo

TT Năm

Họ và tên

Tên luận án

Bậc đào tạo

Đào tạo thạc sỹ

Thạc sỹ

Lê Thị Thanh

2005- 2007

Vũ Minh Đức

Thạc sỹ

Đặng Trần Hoàng

Thạc sỹ

Gây tạo mô hình ung thư đường ruột ở chuột nhắt trắng dòng Swiss bằng hóa chất và nghiên cứu mô bệnh học của nó Nghiên cứu biểu hiện Interleukin-2 trong hệ nấm men P. pastoris GS115 Nghiên cứu biểu hiện Interleukin-2 trong E. coli BL21 (DE3)

2006- 2008 2006- 2008 Đào tạo cử nhân

2006 Nguyễn Lê Hải Ly

Cử nhân

2006 Vũ Đình Quang

Cử nhân

2006 Kiều Thị Thu Hà

Cử nhân

Nghiên cứu điều kiện lên men chủng E. coli tái tổ hợp dùng cho sản xuất Interleukin-2 của người Gây u thực nghiệm đường ruột trên chuột bằng hóa chất Azoxymethane Sự biến đổi cấu trúc niêm mạc ruột non chuột nhắt trắng Swiss dưới tác động của hóa chất Azoxymethane và hiệu ứng kháng u của chế phẩm Interleukin-2 tái tổ hợp

Bảng 13. Danh sách các cán bộ được nâng cao trình độ

TT

Họ và tên

Nội dung đào tạo

Cơ quan

Thời gian đào tạo

2005-2007

Nguyễn Thị Nga

Viện CNSH

2005-2007

Nguyễn Thị Trang

Viện CNSH

Nâng cao kỹ thuật làm Bioassay và nuôi cấy tế bào động vật invitro Nâng cao kỹ thuật làm Bioassay và nuôi cấy tế bào động vật invitro

4.6. HỢP TÁC QUỐC TẾ

Bảng 14. Danh sách các cơ quan hợp tác quốc tế

Cơ quan

Tên đối tác

Nội lai tác

Viện CNSH

- Biomedical Center, Fermentation Pilot Plant of Uppsala University, Sweden.

Hợp tác nghiên cứu công nghệ lên men các chủng vi sinh tái tổ hợp và thu hồi sản phẩm.

Viện CNSH GS. J.M. Pezzuto, trường Đại

học Hawaii, Hoa kỳ

Cung cấp dòng tế bào CTLL-2 để thử nghiệm hoạt tính sinh học của IL-2 tái tổ hợp

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

105

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

4.7. TÌNH HÌNH SỬ DỤNG KINH PHÍ

Tổng kinh phí SNKH: 2 100 000 000 đồng (Hai tỷ một trăm triệu đồng)

Kinh phí đề tài đã nhận:

- Năm 2005: 1 450 000 000 đồng

- Tháng 1/ 2006 - 6/2007: 550 000 000 đồng Tổng kinh phí đã quyết toán: 2 000 000 000 đồng

Bảng 15. Kinh phí phân bổ cho các hạng mục

STT

Mục

Hạng mục chi

Số tiền(đồng)

Ghi chú

(*) theo biểu HĐ5 số CV 204/cnsh ngày 7/6/2007 và quyết định số 1202/QĐ- BKHCN ngày 03/7/07

1 2 3 4 5

114 (*) 102+119 117 145 102+111+112(*) +115+134

493 000 000 1 312 904 700 10 500 000 21 000 000 162 595 300

Thuê khoán chuyên môn Nguyên vật liệu + Năng lượng Sửa chữa nhỏ Thiết bị máy móc Chi phí khác

Tổng

2 000 000 000

4.8. DANH SÁCH CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ

1. Đặng Trần Hoàng, Vũ Minh Đức, Phùng Thu Nguyệt, Trương Nam Hải

(2005), Biểu hiện gen Interleukin-2 của người bị đột biến tại các điểm glycosyl

hóa và gốc Cys 125 trong E. coli. Tạp chí Công nghệ sinh học 3(2): 149-154

2. Đặng Trần Hoàng, Bùi Thị Huyền, Vũ Minh Đức, Đặng Thành Nam, Trần

Thị Hường, Nguyễn Hồng Thanh, Phan Văn Chi, Trương Nam Hải (2005),

Biểu hiện gen mã hóa Interleukin-2 của người (rh-IL2MN) trong E. coli bằng hệ

pET32 và nhận dạng protein tái tổ hợp bằng phương pháp khối phổ. Tạp chí Công

nghệ sinh học 3(4): 439-444.

3. Vũ Minh Đức, Nguyễn Tiến Minh, Đặng Trần Hoàng, Trần Thị Hường,

Nguyễn Hồng Thanh, Đinh Duy Kháng, Trương Nam Hải (2005) Gây hồi biến

thay thế Ser25 thành Leu và biểu hiện protein lai Thioredoxin rhInterleukin-2

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

106

(Trx-rhIL2MN) trong P. pastoris. Tạp chí Công nghệ sinh học 3(4): 445-452.

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

4. Trần Thị Hường, Nguyễn Hồng Thanh, Đặng Trần Hoàng, Vũ Minh Đức, Phạm

Thị Bích Hợp, Trương Nam Hải (2006) Nghiên cứu điều kiện biểu hiện Interleukin-

2 của người trong chủng E. coli BL21. Tạp chí Công nghệ sinh học 4(2): 1-8.

5. Nguyễn Nam Long, Nguyễn Bích Nhi, Phan Văn Chi (2005) Tách dòng gen mã

hóa Interleukin-2 của người. Tạp chí Y học Việt Nam, 310 (5): 26-30.

6. Đỗ Thị Thảo, Đỗ Thị Phương, Vũ Minh Đức, Đặng Trần Hoàng, Trương

Nam Hải (2006) Xác định hoạt tính sinh học của Interleukin 2 (IL-2) tái tổ hợp bằng

phép thử sinh học trên tế bào CTLL2. Đã gửi đăng ở Tạp chí Công nghệ sinh học.

7. Trần Công Yên, Nguyễn Thị Quỳ, Lê Thị Thanh, Bùi Thị Vân Khánh, Kiều Thị

Thu Hà, (2007) Nghiên cứu hoạt tính chống ung thư của Interleukin-2 tái tổ hợp trên mô

hình ung thư thực nghiệm in vivo. Sẽ gửi đăng trong tạp chí Sinh học số đặc biệt về Hội

nghị Khoa học Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong Khoa học Sự sống năm 2007.

8. Đã đăng ký Bằng độc quyền giải pháp hữu ích về “Chủng vi khuẩn tái tổ hợp có khả

năng tổng hợp Interleukin-2 của người” tại Cục sở hữu trí tuệ, Bộ Khoa học và Công

nghệ (tháng 10/2006).

4.9. HẠN CHẾ CỦA ĐỀ TÀI

Với sự cố gắng nỗ lực của tập thể các cán bộ nghiên cứu, đề tài đã hoàn thành được

hầu hết các nội dung nghiên cứu trong thuyết minh và hợp đồng nghiên cứu. Các kết quả

thu được của đề tài có ý nghĩa quan trọng trong việc triển khai sản xuất và ứng dụng chế

phẩm IL-2 trong điều trị cho các bệnh nhân ung thư. Tuy nhiên, do thời gian quá ngắn và

kinh phí được cung cấp rất muộn nên việc thực hiện đề tài đã gặp một số khó khăn ảnh

hưởng đến việc thực hiện các nội dung đã đăng ký. Vì vậy, một số nội dung của đề tài đã

được điều chỉnh so với đăng ký ban đầu. Kết quả đạt được của đề tài mới chỉ là bước đầu,

vì vậy một số nội dung của đề tài vẫn cần phải được tiếp tục nghiên cứu để hoàn thiện.

Dưới đây là bảng tóm tắt các nội dung đã thực hiện theo đăng ký ban đầu và một

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

107

số nội dung xin điều chỉnh.

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

Bảng 16. Tóm tắt các nội dung công việc thực hiện và nội dung xin điều chỉnh

TT

Các nội dung xin điều chỉnh

Nội dung đăng ký (theo thuyết minh đề tài 01/2005)

1 Tạo dòng gen IL-2 2 Tạo đột biến gen IL-2

Không Không

Không

Xin điều chỉnh chưa thực hiện

Không

Xin điều chỉnh chưa thực hiện

Biểu hiện gen IL-2 trong các hệ biểu hiện khác nhau Nghiên cứu điều kiện lên men các chủng vi sinh vật tái tổ hợp mang gen IL-2 ở quy mô 5 và 14 lít Tách chiết và tinh chế IL-2 từ dịch lên men và nghiên cứu tính chất của nó Xây dựng công nghệ thu hồi, bảo quản và đóng gói chế phẩm IL-2 Thử nghiệm IL-2 trên mô hình tế bào CTLL-2 nuôi cấy in vitro và động vật thí nghiệm Đánh giá chất lượng IL-2 theo tiêu chuẩn quốc tế Nghiên cứu và thử nghiệm khả năng sử dụng IL-2 tái tổ hợp trong điều trị các bệnh ung thư đường tiêu hoá giai đoạn muộn tại bệnh viện K

Trong quá trình thực hiện đề tài chúng tôi có đề nghị điều chỉnh một số nội dung

đăng ký ban đầu, cụ thể như sau:

- Không thực hiện tiếp phần tạo chủng nấm men mang gen Trx-rhIL2MN: lý do là

sau khi biểu hiện trong nấm men protein lai Trx-rhIL2MN bị protease của tế bào

nấm men phân hủy do đó không thể sử dụng chủng nấm men này để tổng hợp Il-2

và thực hiện các bước tiếp theo như lên men và tinh chế sản phẩm nhận được. Sự

điều chỉnh này đã được Bộ KH&CN chấp thuận trong đợt kiểm tra định kỳ vào

cuối năm 2005 (Báo cáo định kỳ HD5 (kỳ I) ngày 27/11/2005 đã được Bộ

KH&CN phê duyệt).

- Do thời gian thực hiện đề tài chỉ có 30 tháng nên đề tài chưa kịp thực hiện trọn vẹn

2 nội dung là “Xây dựng công nghệ thu hồi, bảo quản và đóng gói chế phẩm IL-2”

và “Nghiên cứu và thử nghiệm khả năng sử dụng IL-2 tái tổ hợp trong điều trị các

bệnh ung thư đường tiêu hoá giai đoạn muộn tại bệnh viện K”. Hồ sơ xin phép Hội

đồng Y đức của Bộ Y tế và thử nghiệm chế phẩm IL-2 trên các bệnh nhân đòi hỏi

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

108

thời gian rất lâu, ít nhất là 1 năm nên đề tài không thể thực hiện kịp. Việc điều

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

chỉnh này đã được Bộ KH&CN chấp nhận (Quyết định số 1202/QĐ-BKHCN ký

ngày 03/07/2007 của Bộ KH&CN). Phần kinh phí (100 triệu đồng) để thực hiện

các nội dung này đã được hoàn trả lại ngân sách.

- Theo kế hoạch đề tài định tổ chức đi tham quan và học tập tại CHLB Đức, nhưng

đã tổ chức đi sang Công ty sản xuất IL-2 tại thành phố Thẩm Dương, Tỉnh Liêu

Ninh Trung Quốc. Bộ KH&CN đã chấp thuận điều chỉnh này (Quyết định số 1202/

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

109

QĐ-BKHCN ký ngày 03/07/2007 của Bộ KH&CN).

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

5.1. KẾT LUẬN

Đề tài đã đạt được các kết quả sau:

- Phân lập được gen mã hóa cho protein IL-2 người từ ARN tổng số tách từ tế

bào lách người bằng kỹ thuật RT-PCR.

- Đã thành công trong việc tạo gen IL-2 đột biến mất khả năng glycosyl hoá tại

đầu N và mất 1 gốc Cys ở vị trí 125 để hạn chế việc tạo sai cầu disulfide trong

phân tử Il-2. Hồi biến thành công đột biến Ser ở vị trí 25 thành Leu trong dòng

gen IL-2 phân lập từ bệnh nhân Việt Nam.

- Thiết kế thành công vector pET32-rhIL2MN chứa gen IL-2 đột biến để biểu

hiện trong E. coli

- Thiết kế thành công vectơ pPIC-rhIL2MN để biểu hiện IL-2 dạng riêng lẻ trong

nấm men P. pastoris

- Đã tạo thành công chủng E. coli tái tổ hợp có khả năng biểu hiện gen rhIL2MN

với lượng IL-2 đạt khoảng 90 mg/L, cao gấp 2000 lần so với dự kiến.

- Đã tạo thành công chủng P. pastoris tái tổ hợp có khả năng tổng hợp rhIL2MN

đạt khoảng 5 mg/L, cao gấp 100 lần so với dự kiến.

- Đã xây dựng quy trình biểu hiện IL-2 tái tổ hợp trong E. coli và trong P.

pastorisvới ở qui mô lên men dung tích 5L và 14L với các điều kiện thích hợp

cho quá trình lên men.

- Đã xây dựng quy trình tách chiết và tinh chế protein tái tổ hợp từ chủng E. coli

đạt độ tinh sạch cao (99%) và đặc hiệu với kháng thể kháng IL-2 của người.

Chế phẩm IL-2 nhận được đáp ứng được các điều kiện kiểm định và có hoạt

tính tương đương với sản phẩm của nước ngoài.

- Đã xây dựng được phương pháp nghiên cứu tác động của IL-2 tái tổ hợp lên

động vật thực nghiệm và trên tế bào CTLL-2 nuôi cấy in vitro.

- Đề tài đã công bố được 5 bài báo, 2 bài đã gửi tới các tạp chí khoa học và sẽ được

đăng trong thời gian tới. Đề tài đã tiến hành đăng ký Bằng độc quyền giải pháp hữu

ích về “Chủng vi khuẩn tái tổ hợp có khả năng tổng hợp Interleukin-2 của người”

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

110

tháng 10 năm 2006 và đã nhận được công văn của Cục Sáng chế nhận đơn để xem xét.

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

- Đề tài đã góp phần trong việc đào tạo 3 Thạc sỹ khoa học, 3 Cử nhân công nghệ sinh

học và 2 nghiên cứu viên được nâng cao tay nghề.

5.2. ĐỀ NGHỊ

Để có thể tiếp tục phát triển tiếp các kết quả nghiên cứu, chúng tôi đề xuất một số

kiến nghị sau:

01. Tiếp tục hoàn thiện và nâng cao hiệu quả quy trình sản xuất IL-2 tái tổ hợp ở các

hệ biểu hiện trong E. coli và trong tế bào nấm men P. pastoris trên quy mô lớn

hơn làm cơ sở cho việc triển khai sản xuất sản phẩm này và ứng dụng trong thực

tiễn.

02. Tiến hành tiếp tục các nội dung nghiên cứu là i) Công nghệ thu hồi, bảo quản,

đóng gói IL-2, ii) Thử nghiệm lâm sàng chế phẩm IL-2 tái tổ hợp trên bệnh nhân

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

111

ung thư đường tiêu hóa giai đoạn muộn tại bệnh viện K trong giai đoạn tiếp theo.

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

1. Nguyễn Thanh Đạm. (2004). Miễn dịch điều trị bệnh ung thư. Nhà xuất bản Y học. 2. Nguyễn Văn Đạt, Nguyễn Thanh Thuỷ, Nguyễn Huy Hoàng, Nông Văn Hải, Lê Trần Bình, Trương Nam Hải, (2000). Biểu hiện gen mã hoá cho protein bất hoạt ribôxôm của mướp đắng trong nấm men P. pastoris. Báo cáo khoa học Hội nghị Sinh học Quốc Gia, 44-47.

3. Nguyễn Thị Trung, Đỗ Thị Huyền, Nguyễn Thanh Thuỷ, Phạm Thuý Hồng,

Trương Nam Hải, (2002) Biểu hiện gen mã hóa cho β-amylaza từ hạt đậu tương trong

nấm men P. pastoris. Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 40(3): 14-19.

4. Hà Văn Huân, Lê Thị Bích Thảo, Phan Văn Chi (2003) Biểu hiện và tinh chế protein

lai HSP2. Tạp chí Y học Việt Nam 284(5): tr. 6-9.

5. Nguyễn Thuý Hà, Nguyễn Bích Nhi, Đỗ Khắc Hiếu & Phan Văn Chi (2003) Khả năng ức chế các dòng tế bào ung thư nuôi cấy in vitro của Trichobakin tái tổ hợp. Tạp chí Y học Việt Nam 284(5): 26-30.

6. Nguyễn Nam Long, Nguyễn Bích Nhi, Phan Văn Chi (2005) Tách dòng gen mã hóa

Interleukin-2 của người. Tạp chí Y học Việt Nam 310(5): 26-30.

7. Đặng Trần Hoàng, Vũ Minh Đức, Phùng Thu Nguyệt, Trương Nam Hải (2005) Biểu hiện gen Interleukin-2 của người rhIL2 MM bị đột biến tại các điểm glycosyl hóa và gốc Cys 125 trong E. coli. Tạp chí Công nghệ Sinh học 3(2): 149-154.

8. Đặng Trần Hoàng, Bùi Thị Huyền, Vũ Minh Đức, Đặng Thành Nam, Trần Thị Hường, Nguyễn Hồng Thanh, Phan Văn Chi, Trương Nam Hải (2005) Biểu hiện gen mã hóa Interleukin-2 của người (rh-IL2 MN) trong E. colibằng hệ pET32 và nhận dạng protein tái tổ hợp bằng phương pháp khối phổ. Tạp chí Công nghệ sinh học 3(4): 439-444.

9. Vũ Minh Đức, Nguyễn Tiến Minh, Đặng Trần Hoàng, Trần Thị Hường, Nguyễn Hồng Thanh, Đinh Duy Kháng, Trương Nam Hải (2005) Gây hồi biến thay thế Ser 25 thành Leu và biểu hiện protein lai thioredoxin-rhInterleukin-2 (Trx-rhIL2MN) trong P. pastoris. Tạp chí Công nghệ Sinh học 3(4): 445-452.

10. Trần Công Yên, Nguyễn Thị Quỳ (2001) Một chặng đường nghiên cứu ung thư thực

nghiệm (1987-2001), Hội thảo Quốc tế Sinh học, Hà nội tháng 7/2001. 285-290.

1. Ardizzoni A, Bonavia M, Viale M, Baldini E, Mereu C, VeRNA A, et al. (1994) Biologic and clinical effects of continuous infusion interleukin-2 in patients with non- small cell lung cancer. Cancer 73:1353–1360.

2. Armstrong A, Eaton D, Ewing J. (2001) Cellular immuno therapy for cancer. Br Med J

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

112

TÀI LIỆU TIẾNG ANH

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

323:1289–1293.

3. Atzpodien J, Kirchner H (1990). Cancer, cytokine, and toxic cells: Interleukin-2 in the

immuno therapy of human neoplasms. Klin Wochenscher. 68(1): 1-11.

4. Atzpodien J, Kirchner H, Illiger HJ, Metzner B, Ukena D, Schott H, Funke PJ, Gramatzki M, Jurgenson S, Wandert T, Patzelt T, Reitz M. (2001). IL-2 in combination with IFN- alpha and 5-FU versus tamoxifen in metastatic renal cell carcinoma: long-term results of a controlled randomized clinical trial. Br J Cancer. 19;85(8):1130-6.

5. Atzpodien J, Kirchner H, Illiger HJ, Metzner B, Ukena D, Schott H, Funke PJ, Gramatzki M, Jurgenson S, Wandert T, Patzelt T, Reitz M. (2001). IL-2 in combination with IFN- alpha and 5-FU versus tamoxifen in metastatic renal cell carcinoma: long-term results of a controlled randomized clinical trial. Br J Cancer. 19;85(8): 1130-6.

6. Baneyx F (1999) Recombinant protein expression in Escherichia coli. Curr Opin

Biotech. 10:411-421.

7. Bayer AL, Yu A, Adeegbe D, Malek TR (2005) Essential role for interleukin -2 for CD4+ CD25+ T regulatory cell development during the neonatal period. J Exp Med 201: 769-777.

8. Bazan, J.F (1992) Unraveling the structure of IL-2. Science 257: 410–413.

9. Bergmann L (1990). The clinical significance of interleukin-2. Onkologie, 13(6): 416-

422.

10. Bordin V, Giani L, Meregalli S, Bukovec R, Vaghi MM, Mandala M, Paolorossi F, Ardizzoia A, Tancini G, BRNAi S, Frigerio F, Fumagalli L, Bordoni A, Valsuani G, Di Felice G, Lissoni P. (2000). Five-year survival results of subcutaneous low-dose immuno therapy with interleukin-2 alone in metastatic renal cell cancer patients. Urol Int. 64(1):3-8.

11. Buzio C, Andrulli S, Santi R, Pavone L, Passalacqua R, Potenzoni D, Ferrozzi F, Giacosa R, Vaglio A. (2001). Long-term immuno therapy with low-dose interleukin-2 and interferon-alpha in the treatment of patients with advanced renal cell carcinoma. Cancer. 1;92(9):2286-2296.

12. Brivio F, Lissoni P, Tisi E, Erba L, BRNAi S, Tancini G, et al.(1992) Effects of a preoperative therapy with interleukin-2 on surgery-induced lymphocytopenia in cancer patients. Oncology 49:215–218.

13. Buccheri G, Marino P, Preatoni A, Ferrigno D, Moroni GA. (1991) Soluble interleukin-2 receptor in lung cancer. An indirect marker of tumor activity. Chest 99:1433–1437.

14. Bukowski RM. (1997) Natural history and therapy of metastatic renal cell carcinoma:

the role of interleukin-2. Cancer . 80:1198–1220.

15. Chomczynski P, Sacchi N. (1987). Anal Biochem. 162:156–160.

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

113

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

16. Degrave W, Tavernier J, Duerinck F, Plaetinck G, Devos R, Fiers W (1983) Cloning and structure of the human interleukin 2 chromosomal gen. EMBO J 2(12): 2349- 2353.

17. Devos R, Plaetinck G, Cheroute H, Simons H, Degrave W, Tavernier J, Remaut E, Fiers W (1983) Molecular cloning of human interleukin 2 cDNA and its expression in E. coli. Nucleic Acids Res. 11: 4307-4323.

18. Dillman R.O., Church C., Barth N.M., Oldham R.K. and Wiemann M.C. (1997). Long-term survival after continuous infusion interleukin-2. Cancer Biother Radiopharm. 12(4):243-248.

19. Dore JM, Gras E, Wijdenes (1997) Expression and activity of a recombinant chimeric protein composed of pokeweed antiviral protein and of human interleukin-2. FEBS Letters. 402(1): 50-52.

20. De Vita F, Turitto G, Di Gracia M, Frattolillo A, Catalano G. (1998) Analysis of interleukin-2/interleukin-2 receptor system in advanced non-small cell lung cancer. Tumori 84:33–38.

21. Dutcher JP, Creekmore S, Weiss GR, Margolin K, Markowitz AB, Roper M, et al.(1989) A phase II study of interleukin-2 and LAK cells in patients with metastatic malignant melanoma. J Clin Oncol 7:477–485.

22. Fujita T, Takaoka C, Matsui H, Taniguchi T (1983) Structure of the human

interleukin 2 gen. Proc. Natl. Acad. Sci. 80:7437-7441.

23. Fukushima K, Yamashita K (2001) Interleukin-2 carbonhydrate recognition

modulates CTLL-2 cell proliferation. J. Biol. Chem. 276(10): 7351-7356.

24. Fisher RI, Rosenberg SA, Fyfe G. (2000) Long-term survival update for high-dose recombinant interleukin-2 in patients with renal cell carcinoma. Cancer J Sci Am 6 (Suppl 1):S55–S57.

25. Gaffen SL, Liu KD (2004) Overview of interleukin -2 function, production and clinical

applications. Cytokine 28: 109- 123

26. Gez E, Rubinov R, Gaitini D, Meretyk S, Best LA, Native O, Stein A, Erlich N, Beny A, Zidan J, Haim N, Kuten A. (2002). Interleukin-2, interferon-alpha, 5- fluorouracil, and vinblastine in the treatment of metastatic renal cell carcinoma: a prospective phase II study: the experience of Rambam and Lin Medical Centers 1996- 2000. Cancer. 15;95(8):1644-1649.

27. http://www.aidsmeds.com/news/

28. http://www.cytoshop.com/

29. http://www.microvet.arizona.edu/Courses/MIC419/Tutorials/cytokines.html,

30. http://www.microvet.arizona.edu/Courses/MIC419/Tutorials/cytokines.html

31. http://www.proleukin.com/index.html

32. http://www.proleukin.com/index.html.

33. Javier CS, Foucras G, Guo L, Chiodetti L, Young HA, Jane HL, Zhu J, Paul WE (2004)

Interleukin 2 plays a central role in Th2 differentiation. PNAS. 101(11): 3880-3885.

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

114

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

34. Jansen RL, Slingerland R, Goey SH, Franks CR, Bolhuis RL, Stoter G. (1992) Interleukin-2 and interferon-alpha in the treatment of patients with advanced non small cell lung cancer. J Immunol, 12:70–73.

35. Ju G et al (1987) Structure-function analysis of human interleukin 2. J. Bio. Chem.

262(12): 5723-5731.

36. Kimura H, Yamaguchi Y. (1995) Adjuvant immuno therapy with interleukin-2 and lymphokine-activated killer cells after noncurative resection of primary lung cancer. Lung Cancer, 13:31–44.

37. Kradin RL, Kurnick JT, Lazarus DS, Preffer FI, Dubinett SM, Pinto CE, et al. (1989); Tumor-infiltrating lymphocytes and interleukin-2 in treatment of advanced cancer. Lancet 18:577–580.

38. Krastev Z, Koltchakov V, Tomov B, Koten JW. (2003), Non-melanoma and non-renal interleukin-2. Hepatogastroenterology

treated with

cell carcinoma malignancies 50:1006–1016.

39. Liang SM, Lee N, Zoon KC, Manischewitz JF, Chollet A, Liang CM, Quinnan GV (1988) Biological characterization of human interleukin 2 mutant proteins. J. Biol. Chem. 263(10): 4768-4772.

40. Liang SM, Thatcher DR, Liang CM, Allet B (1985) Studies of structure-activity

relationships of human interleukin-2. J. Biol. Chem. 261(1): 334-337.

41. Liu Y Liu Y, Su C, Hu YH, Ouyang KQ, Cai SX (2005) Studies on fermentation conditions and purification of mutant human interleukin -2 expressed in P. pastoris. Sheng Wu Gong Cheng Xued Bao 21(3): 430-434

42. Legha SS, Buzaid AC. (1993) Role of recombinant interleukin-2 in combination with interferon and chemotherapy in the treatment of advanced melanoma. Semin Oncol 2:27–32.

43. Lissoni P, BRNAi S, Ardizzoia A, Paolorossi F, Tisi E, Crispino S, Tancini G. (1992) Intracavitary administration of interleukin-2 as palliative therapy for neoplastic effusions. Tumori 78:118–120.

44. Lissoni P, BRNAi S, Rovelli F, Tancini G. (1991) Lower survival in metastatic cancer patients with reduced interleuin-2 blood concentrations. Preliminary report. Oncology 48:125–127.

45. Lissoni P, BRNAi S, Tancini G, Ardizzoia A, Ricci G, Aldeghi R, et al. (1994), A randomized study with subcutaneous low-dose interleukin-2 alone vs interleukin-2 plus the pineal neurohormone melatonin in advanced solid neoplasms other than renal cancer and melanoma. Br J Cancer 69:196–199.

in metastatic renal cell carcinoma patients

46. Lissoni P, Bordin M, Vaghi L, Fumagalli L, Bordoni A, Mengo S, et al. (2002), Ten- year survival results treated with monoimmuno therapy with subcutaneous low-dose interleukin-2. Anticancer Res 22:1061–1064.

47. Lissoni P, Mandala M, Curigliano G, Ferretti G, Moro C, Ardizzoia A, et al. (2001), Progress report on the palliative therapy of 100 patients with neoplastic effusions by

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

115

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

intracavitary low-dose interleukin-2. Oncology. 60:308–312.

48. Lissoni P, Meregalli S, Fossati V, Paolorossi F, BRNAi S, Tancini G, Frigerio F. (1994) A randomized study of immuno therapy with low-dose subcutaneous interleukin- 2 plus melatonin vs chemotherapy with cisplatin and etoposide as first-line therapy for advanced non-small cell lung cancer. Tumori 80:464–467.

49. McDermott D F, Atkins M B (2004) Application of IL-2 and other cytokines in renal

cancer. Expert Opin. Bio. Ther. 4(4): 455-468.

50. Mantovani G, Maccio A, Mulas C, Massa E, Madeddu C, Mura L, et al. (2002) Dose-intense phase II study of weekly cisplatin and epidoxorubicin plus medroxyprogesterone acetate and recombinant interleukin-2 in stage IIIB-IV non-small cell lung cancer. Oncology Rep 9:661–670.

51. Masotti A, Fumagalli L, Morandini GC. (1997) Intrapleural administration of recombinant interleukin-2 in non-small cell lung cancer with neoplastic pleural effusion. Monaldi Arch Chest Dis 52:225-228.

52. Melioli G, Ratto GB, Ponte M, Guastella M, Semino C, Fantino G, et al. (1999) Treatment of stage IIIB non-small-cell lung cancer with surgery followed by infusion of tumor infiltrating lymphocytes and recombinant interleukin-2: a pilot study. J Immunology 1996; 19:224–230.

53. Mier JW, Atkins MB. (2001) Pharmacology of cancer biotherapeutics. Interleukin-2. Cancer principles and practice of oncology, 6th edition. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; pp. 471–477..

54. Nelson B H, Willerford D M (1998) Biology of the interleukin-2 receptor. Adv.

Immunol. 70: 1-81.

55. Neri B, Doni L, Gemelli MT, Fulignati C, Turrini M, Di Cello V, Dominici A, Maleci M, Mottola A, Ponchietti R, Raugei A, Valsuani G, Cini G. (2002). Phase II trial of weekly intravenous gemcitabine administration with interferon and interleukin-2 immuno therapy for metastatic renal cell cancer. J Urol. 168(3):956-958.

56. Naumnik W, Chyczewska E. (2001) The clinical significance of serum soluble interleukin 2 receptor (s IL-2R) concentration in lung cancer. Folia Histochem Cytobiol 39:185–186.

57. Parkinson D, Abrams J, Wiernick P, Rayner AA, Margolin KA, Van Echo DA, et al.(1990) Interleukin-2 therapy in patients with metastatic malignant melanoma: a phase II study. J Clin Oncol 1990; 8:1650–1656.

58. Pectasides D, Varthalitis J, Kostopoulou M, Mylonakis A, Triantaphyllis D, Papadopoulou M, Dimitriadis M, Athanassiou A. (1998). An outpatient phase II study of subcutaneous interleukin-2 and interferon-alpha-2b in combination with intravenous vinblastine in metastatic renal cell cancer. Oncology. 55(1):10-15.

59. Ravaud A, Trufflandier N, Ferriere JM, Debled M, Palussiere J, Cany L, Gaston R, Mathoulin-Pelissier S, Bui BN. (2003). Subcutaneous interleukin-2, interferon alpha-2b and 5-fluorouracil in metastatic renal cell carcinoma as second-line treatment after failure of previous immuno therapy: a phase II trial. Br J Cancer. 15;89(12):2213-8.

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

116

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

60. Robb RJ, Kutny RM, Panico M, Morris HR, Chowdhry V (1984) Amino acid sequence and post-translational modification of human interleukin 2. Proc Nat Acad Sci Mỹ.81: 6486-6490.

61. Ryan CW, Vogelzang NJ, Stadler WM. (2002). A phase II trial of intravenous gemcitabine and 5-fluorouracil with subcutaneous interleukin-2 and interferon-alpha in patients with metastatic renal cell carcinoma. Cancer. 15; 94(10):2602-2609.

62. Ratto GB, Melioli G, Zino P, Mereu C, Mirabelli S, Fantino G, et al. (1995) Immuno therapy with the use tumor-infiltrating lymphocytes and interleukin-2 as adjuvant treatment in stage III non-small-cell lung cancer. A pilot study. J Thorac Cardiovasc Surg; 109:1212–1217.

63. Ratto GB, Zino P, Mirabeli S, Minuti P, Aquilina R, Fantino G, et al. (1996) A randomized trial of adoptive Immuno therapy with tumor-infiltrating lymphocytes and interleukin-2 versus standard therapy in the postoperative treatment of resected non- small cell lung carcinoma. Cancer 78:244–251.

64. Rosenberg SA, Lotze MT, Muul LM, Chang AE, Avis FP, Leitman S, et al. (1997) A progress report on the treatment of 157 patients with advanced cancer using lymphokine- activated killer cells and interleukin-2 or high dose interleukin-2 alone. N Engl J Med 316:889–897.

65. Rubin J. (1993) Interleukin-2: its biology and clinical application in patients with

cancer. Cancer Invest 11:460–472.

66. Sambrook J, Russell DW (2001). Cold spring laboratory Harbor Press.

67. Sambrook J, Russell DW (2001) Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold

Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.

68. Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T. (1989). Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Habor laboratory, Cold Spring Habor Laboratory Press, New York.

69. Schiller JH, Morgan-Ihrig Ch, Levitt ML.(1995) Concomitant administration of interleukin-2 plus tumor necrosis factor in advanced non-small cell lung cancer. Am J Clin Oncol 18:47–51.

70. Steiner G, Tschachler E, Tani M, Malek TR, Shevach EM, Holter W, et al. (1986) Interleukin-2 receptors on cultured marine epidermal Langerhans cells. J Immunol 137:155–159.

71. Smith KA, Cantrell DA (1985) Interleukin 2 regulates its own receptors. Proc. Natl.

Acad. Sci. 82:864-868.

72. Soori G, Dillman RO, Wiemann MC, Stark JJ, Tai F, DePriest CB, Church CK and Schulof R (2002). Phase II trial of subcutaneous interleukin-2, subcutaneous interferon- alfa, 5-fluorouracil and cis-retinoic acid in the treatment of renal cell carcinoma: final results of cancer biotherapy researcg group 94-10. Cancer Biother Radiopharm. 17(2): 165-173.

73. Taniguchi T, Matsui H, Fujita T, Hatakeyama M, Kashima N, Fuse A, Hamuro J,

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

117

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

Nishi-Takaoka C, Yamada G (1986) Molecular analysis of the interleukin-2 system. Immunol. Rev. 92: 121-133.

74. Taniguchi T, Matsui H, Fujita T, Takaoka C, Kashima N, Yoshimoto R, Hamuro J (1983) Structure and expression of a cloned cDNA for human interleukin-2. Nature 302: 305-310.

75. Testa U, Montesoro E, Bulgarini D, Samoggia P, Masciulli R, Habetswallner D, Care A, Mariani G, Giannella G, Boccoli G, et al (1990). Interleukin-2 in cancer therapy. Ann Ist Super Sanita. 26(3-4): 283-334.

76. Tester WJ, Kim KM, Krigel RL, Bonomi PD, Glick JH, Asbury RF, et al. (1999) A randomized phase II study of interleukin-2 with or without beta-interferon for patients with advanced non-small cell lung cancer. A Eastern Cooperative Oncology Group study (PZ586). Lung Cancer; 25:199–206.

77. Yang JC, Sherry RM, Steinberg SM, Topalian SL, Schwartzentruber DJ, Hwu P, et al. (2003) Randomized study of high-dose and low-dose interleukin-2 in patients with metastatic renal cancer. J Clin Oncol; 21:3127–3132.

78. Yang SC, Gimm EA, Parkinson DR, Carinhas J, Fry KD, Mendiguren-Rodriguez A, et al. (1991) Clinical and immunomodulatory effects of combination immuno therapy with low-dose interleukin-2 and tumor necrosis factor in patients with advanced non- small cell lung cancer: a phase I trial. Cancer Res 51:3669–3676.

79. Yano T, Sugio K, Yamazaki K, KAse S, Yamaguchi M, Ondo K, et al. (1999) Postoperative adjuvant adoptive immuno therapy with lymph node-LAK cells and IL-2 for pathologic stage I non-small cell lung cancer. Lung Cancer 26:143–148.

80. Yasumoto K, Miyazaki K, Nagashima A, Ishida T, Kuda T, Yano T, Sugimachi K, et al. (1987) Induction of lymphokine-activated killer cells by intrapleural instillation of recombinant interleukin-2 in patients with pleurisy due to lung cancer. Cancer Res 47: 2184–2187.

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007

118

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC --------(cid:194)(cid:194)(cid:194)--------

.

VKHCNVN V.CNSH

.

H S N C V

N C H K B

B K H C N

V C N S H

Báo cáo tóm tắt tổng kết Khoa học và Kỹ thuật Đề tài

NGHIÊN CỨU TẠO INTERLEUKIN-2 TÁI TỔ HỢP

DÙNG CHO ĐIỀU TRỊ UNG THƯ

Mã số:

KC. 04. 33

Chủ nhiệm đề tài:

PGS. TS. TRƯƠNG NAM HẢI

Cơ quan chủ trì:

Viện Công nghệ sinh học

Cơ quan chủ quản:

Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Thời gian thực hiện:

01/2005 ‐ 06/2007

Hà Nội - 2007

Bản báo cáo viết xong ngày 15/12/2007. Tài liệu này được chuẩn bị trên cơ sở kết quả thực hiện Đề tài cấp Nhà nước, mã số KC. 04. 33 Mọi sao chép phải được sự đồng ý của Viện Công nghệ sinh học.

Báo cáo tóm tắt Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

LỜI MỞ ĐẦU

Ung thư là sự phát triển và phân chia không bình thường của các tế bào do bị đột biến gen ở tế bào soma. Ở Việt Nam hàng năm nước ta có khoảng 150000 bệnh nhân bị ung thư và khoảng 1/3 số bệnh nhân đã bị chết vì các bệnh ung thư (theo số liệu thống kê tại bệnh viện K, Hà nội và Trung tâm u bướu thành phố Hồ Chí Minh). Do vậy việc điều trị bệnh ung thư đang trở nên cấp thiết và quan trọng trong mục tiêu chăm sóc sức khỏe cộng đồng của nước ta. Hiện nay các phương pháp điều trị bệnh ung thư thường đang được sử dụng là phương pháp chiếu xạ, giải phẫu hay sử dụng hoá chất trong quá trình trị liệu. Tuy nhiên các phương pháp này thường gây nên các tác dụng phụ do tính không đặc hiệu có thể giết cả các tế bào ung thư lẫn tế bào thường và ảnh hưởng lớn tới sức khỏe của bệnh nhân ung thư. Do vậy phương pháp điều trị ung thư bằng miễn dịch trị liệu đã được ứng dụng một cách có hiệu quả để tiêu diệt chọn lọc các tế bào ung thư. Đây là phương pháp mới được áp dụng ở Việt Nam trong những năm gần đây để điều trị cho các bệnh nhân ung thư. Liệu pháp điều trị ung thư miễn dịch đã bước đầu thành công với nhiều loại ung thư như ung thư tế bào máu, ung thư thận, ung thư bàng quang, u trung mô ác tính, u màng não, ung thư tuyến giáp, u hắc tố... IL-2 là một cytokine quan trọng kích thích sự tăng sinh các tế bào chuyên biệt của hệ thống miễn dịch như tế bào T, tế bào NK để tấn công và tiêu diệt các tế bào ung thư. Ngày nay với sự phát triển của kỹ thuật di truyền phục vụ cho y dược, các sản phẩm cytokine của người có thể được tổng hợp dưới dạng tái tổ hợp để điều trị các bệnh ung thư. Tuy nhiên, hiện nay ở nước ta hướng nghiên cứu tạo thuốc IL-2 dạng tái tổ hợp dùng cho điều trị ung thư vẫn chưa được tiến hành. Bộ Y tế Việt Nam rất khuyến khích việc tự sản xuất thuốc trong nước để chữa trị cho bệnh nhân ung thư ở nước ta.

Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn và khả năng về kỹ thuật và nhân lực, trong chương trình khoa học KC.04, Viện CNSH phối hợp cùng 3 cơ quan nghiên cứu đầu ngành trong cả nước để tiến hành đề tài KC.04.33 “Nghiên cứu tạo Interleukin-2 tái tổ hợp dùng cho điều trị bệnh ung thư’’.

Thực hiện từ 01/2005 – 06/2007

Báo cáo tóm tắt Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC

1.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU Ở NƯỚC NGOÀI

Ung thư là sự phát triển không bình thường của tế bào do sai sót của quá trình điều khiển ở mức độ phân tử xảy ra trong quá trình sống của tế bào. Các tế bào khối u có thể trở thành khối u lành tính (tumor) hoặc khối u ác tính (cancer). Tuy nhiên tế bào ung thư có thể lan sang các mô xung quanh và lan truyền trong cơ thể để tạo nên khối u thứ cấp, quá trình này gọi là di căn. Cho đến nay ung thư vẫn là một trong những căn bệnh nan y và đứng đầu trong những bệnh gây tử vong. Các phương pháp điều trị chính hiện đang được dùng là giải phẫu, chiếu xạ hay hóa chất. Một liệu pháp khác cũng đã được sử dụng để điều trị ung thư có hiệu quả là liệu pháp miễn dịch có sử dụng các chất cytokine để kích hoạt hệ thống miễn dịch của cơ thể người nhằm nhận biết và tiêu diệt các tế bào ung thư ác tính.

Trong các loại ung thư có thể được điều trị bằng liệu pháp miễn dịch, 2 dạng ung thư là u hắc tố (melanoma) và ung thư thận ác tính bước đầu đã được điều trị có kết quả nhờ interleukin-2 (IL-2). IL-2 là một lymphokine quan trọng thúc đẩy sự hoạt hóa của các tế bào T. IL-2 lần đầu tiên được phát hiện vào năm 1975 như là một nhân tố kích thích sự tăng sinh của các tế bào T và đây là một trong số các cytokine được nghiên cứu kỹ nhất bởi chức năng quan trọng của nó trong hệ thống miễn dịch. Các kết quả nghiên cứu cho thấy, với việc sử dụng IL-2 trong điều trị ung thư có thể làm tăng khả năng sống sót cho các bệnh nhân. Theo nghiên cứu của Rosenberg 1980 tại National Cancer Institute (NCI, Spain) cho thấy, khi điều trị cho các bệnh nhân ung thư thận ác tính bằng IL-2 với các liều lượng khác nhau có thể làm giảm tỷ lệ di căn của các khối u từ 15-20%, ngoài ra IL-2 còn có vai trò quan trọng trong việc điều trị các bệnh ung ác tính khác như ung thư bạch cầu, ung thư phổi, ung thư buồng trứng… Trong những năm gần đây, các nhà khoa học đang quan tâm nghiên cứu sâu về chức năng của IL-2 trong hệ miễn dịch với vai trò có thể nhận biết các kháng nguyên lạ như các tế bào ung thư và phát triển các phương pháp trị liệu mới chống lại những thay đổi của tế bào như ức chế các nhân tố phát triển khối u và các tín hiệu dẫn truyền, cảm ứng quá trình tự chết của tế bào (appotosis), liệu pháp miễn dịch sử dụng các cytokine, sử dụng vaccine chống ung thư và các liệu pháp gen. Phương pháp điều trị miễn dịch trị liệu bằng IL-2 có thể kết hợp với các yếu tố miễn dịch khác như TNF, melatonin, Interferon (IFN)-alpha, IFN-beta, LAK- lymphokine-activated killer và TIL để có thể tăng cường hiệu quả sử dụng IL-2 trong điều trị ung thư [55, 72].

Ngày nay cùng với sự phát triển của Công nghệ sinh học hiện đại và các thành tựu của kỹ thuật di truyền, các protein tái tổ hợp sử dụng cho mục đích y học ngày càng được quan tâm. Hãng Amgen Pharmaceutical (Mỹ) đã phát triển sản phẩm ProleukinRIL-2 (aldesleukin) để điều trị trên các bệnh nhân ung thư hắc tố và ung thư biểu mô thận. Sự thử nghiệm chế phẩm ProleukinRIL-2 trên mô hình động vật và trên cả những bệnh nhân bị ung thư cho thấy chúng có khả năng làm giảm các tỷ lệ di căn của các khối u, có hoạt tính sinh học, không bị kết tủa và sử dụng dễ dàng nên thường được sử dụng nhiều trong điều

Thực hiện từ 01/2005 – 06/2007

Báo cáo tóm tắt Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

trị bằng phương pháp miễn dịch trị liệu. Hiện nay chế phẩm Proleukin IL-2 có đang được bán rộng rãi trên thị trường Anh và Mỹ. Ngoài ra ProleukinRIL-2 còn có khả năng kích thích hoạt động của hệ miễn dịch, do vậy chúng có thể được sử dụng trong điều trị cho các bệnh nhân bị nhiễm HIV.

1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC

Theo số liệu thống kê ở các bệnh viện lớn của nước ta như Bệnh viện K, Trung tâm u bướu thành phố Hồ Chí Minh thì số bệnh nhân bị ung thư đã tăng lên đáng kể trong những năm gần đây. Trong số 150000 trường hợp bị ung thư xuất hiện mới hàng năm ở nước ta thì có khoảng trên 50000 bệnh nhân đã bị tử vong vì căn bệnh này. Thực tiễn ở Việt Nam cho thấy phẫu thuật cắt bỏ khối u được phát triển rộng rãi và sớm nhất trong điều trị ung thư. Còn đối với phương pháp hoá trị liệu và xạ trị thì thường thì mới chỉ xuất hiện ở Việt Nam từ đầu thế kỷ 20 tại Viện Radium, nay gọi là bệnh viện K Hà nội. Phương pháp điều trị miễn dịch trị liệu có ưu điểm hơn hẳn so với những phương pháp điều trị khác. Miễn dịch trị liệu là phương pháp tăng cường khả năng chống trả bệnh tật của cơ thể, làm tăng sức chịu đựng của bệnh nhân và đồng thời có khả năng ngăn ngừa sự phát triển của tế bào ung thư. Ở Việt Nam, phương pháp hóa trị liệu mới chỉ được triển khai trong vòng 15 năm trở lại đây, còn phương pháp miễn dịch trị liệu thì vẫn đang còn đang trong thời kỳ nghiên cứu. Đây là phương pháp trị liệu mới cần phải được phát triển mạnh mẽ hơn nữa để đem lại hiệu quả trong việc điều trị cho các bệnh nhân bị ung thư. Với sự kết hợp nhiều phương pháp điều trị ung thư, y học đã đem lại nhiều hy vọng để cứu sống cho các bệnh nhân bị ung thư.

Hiện nay, hướng nghiên cứu sản xuất thuốc dưới dạng protein tái tổ hợp như IL-2 để dùng trong liệu pháp miễn dịch trị liệu vẫn chưa được phát triển ở Việt Nam. Viện Công nghệ sinh học là một trong những viện nghiên cứu đầu ngành trong cả nước cũng đã tiến hành nghiên cứu để tạo ra các sản phẩm phục vụ trong y học. Trong giai đoạn hiện nay, Bộ Y tế Việt Nam rất khuyến khích việc nghiên cứu tự sản xuất thuốc trong nước với giá thành rẻ và chất lượng tốt để chữa bệnh, đặc biệt cho đối tượng bệnh nhân nghèo chiếm đa số. Xuất phát từ những nhu cầu thực tế và khả năng của mình, đề tài KC.04.33 đã tiến hành việc chế tạo thuốc IL-2 dùng trong điều trị bệnh ung thư. Đề tài đã phối hợp cùng các cơ quan đầu ngành trong cả nước để tiến hành thực hiện các nội dung nghiên cứu này.

Thực hiện từ 01/2005 – 06/2007

Báo cáo tóm tắt Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

CHƯƠNG 2 LỰA CHỌN ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI

Đề tài KC.04.33 tập trung nghiên cứu sản xuất protein tái tổ hợp IL-2 phục vụ cho việc điều trị các bệnh ung thư. Đây là một trong những hướng nghiên cứu mới của Viện CNSH. Việc thực hiện thành công mục tiêu đề tài đặt ra không chỉ có ý nghĩa về mặt khoa học mà còn góp phần giảm khoảng cách về trình độ khoa học giữa Việt Nam và các nước trên thế giới, đồng thời việc nghiên cứu áp dụng các quy trình kỹ thuật hiện đại thuộc lĩnh vực công nghệ sinh học sẽ góp phần nâng cao trình độ các cán bộ kỹ thuật, đào tạo đại học và sau đại học.

2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CẦN THỰC HIỆN

• Tạo dòng gen IL-2 • Tạo đột biến điểm của gen IL-2 • Biểu hiện gen IL-2 trong các hệ biểu hiện khác nhau • Nghiên cứu và tối ưu điều kiện lên men các chủng tái tổ hợp mang gen IL-2 • Tách chiết và tinh chế IL-2 từ dịch lên men • Nghiên cứu độc tính của IL-2 trên tế bào CTLL-2 và trên mô hình nuôi cấy động vật • Đánh giá chất lượng của IL-2.

2.3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Vật liệu

• Vật liệu sinh học (chủng vi sinh vật, plasmid và động vật thí nghiệm)

- Các chủng vi khuẩn như E. coli DH5α, E. coli BL21 (DE3) và chủng nấm men P. pastoris GS115 được sử dụng làm các chủng tách dòng và biểu hiện gen. Các plasmid pCR2.1, plasmid pET32c (+), pPIC9 và pPICZαA được sử dụng làm các vector tách dòng và biểu hiện gen. - Nguồn gen IL-2 từ tế bào của người do phòng Hóa sinh protein, Viện Công nghệ sinh học Việt Nam cung cấp. Nguồn tế bào CTLL2 được mua từ ngân hàng tế bào Hoa Kỳ ATCC do sự giúp đỡ của GS. J. M Pezzuto, hiệu trưởng Trường đại học Hawaii, Mỹ để đánh giá hoạt tính sinh học của chế phẩm IL-2.

- Chuột bạch, chuột lang, chuột nhắt trắng và thỏ được sử dụng trong các thí nghiệm in vivo

• Các loại sinh phẩm, vật tư và hóa chất

Các loại sinh phẩm, vật tư hóa chất đều được mua từ các hãng và đạt tiêu chuẩn quốc tế.

• Máy móc và thiết bị

- Các máy móc và thiết bị đều được sử dụng trong các phòng thí nghiệm Trọng điểm công

nghệ gen do nhà nước đầu tư. 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu

- Tách chiết RNA tổng số và thông tin. - Tách chiết DNA plasmid và genomic - Tổng hợp cDNA nhờ enzyme phiên mã ngược và nhân gen bằng kỹ thuật PCR. - Cắt và nối DNA bằng các enzyme hạn chế và ligase. - Biến nạp DNA vào tế bào E. coli, nấm men và biểu hiện gen. - Điện di trên gel agarose 0,8% và tinh chế các đoạn DNA từ gel agarose.

Thực hiện từ 01/2005 – 06/2007

Báo cáo tóm tắt Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

Tách RNA tổng số từ tế bào lách người

Tổng hợp cDNA

C 125

1-A P T

Gen IL-2

Đưa vào vector tách dòng pCR 2.1

đột biến1

đột biến 2

S-25

Gen rhIL2MM

S 125 x

1-A M A x

Đưa vào vector biểu hiện pET 32 a (+)

Hồi biến

- Tách chiết và tinh chế interleukin-2 từ dịch lên men bằng cột sắc ký ái lực - Điện di trên gel polyacrylamide 12,5% - Lên men các chủng tái tổ hợp trên các nồi 5 lít và 14 lít. - Định tính và định lượng hoạt tính IL-2 bằng dòng tế bào CTLL2. - Thử nghiệm tác dụng của interleukin-2 với động vật ung thư thực nghiệm. - Đánh giá chất lượng của IL-2. Tạo dòng gen Tách dòng và biểu hiện

Gen rhIL2MN

S 125 x

L-25 x

1-A M A x

Biểu hiện gen rhIL2MN

Biểu hiện protein dạng tự nhiên rhIL2MN trong P. pastoris (pPIC9)

Biểu hiện protein dạng lai Trx- rhIL2MN trong E. coli (pET32c) và trong P. pastoris (pPIC9 and pPICZ)

rhIL2MN

Trx

His

EnK

Protein IL-2 lai

Tinh sạch bằng sắc ký ái lực

rhIL2MN

Trx His

EnK

Cắt bằng enterokinase

Tinh sạch và tinh chế IL-2

rhIL2MN

Tinh chế IL-2 bằng sắc ký lọc

gel và sắc ký ái lực

ạ

IL2 tái tổ hợp tinh s ch

Đánh giá chất lượng của IL-2

Thử nghiệm IL-2 trên mô hình nuôi cấy tế bào CTLL-2

Thử nghiệm IL-2 trên động vật ung thư thực nghiệm

Hình 1. Tóm tắt nội dung nghiên cứu theo sơ đồ

Thực hiện từ 01/2005 – 06/2007

Báo cáo tóm tắt Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

CHƯƠNG 3 NHỮNG NỘI DUNG VÀ KẾT QUẢ ĐÃ THỰC HIỆN

3.1. KẾT QUẢ TẠO DÒNG GEN IL-2

3.1.1. Kết quả tách chiết RNA tổng số từ người và tổng hợp cDNA mã hóa gen IL-2

RNA tổng số được tách từ các tế bào lách người sử dụng Trizol (Invitrogen) theo Chomczynski và cộng sự. Nhân gen bằng kỹ thuật RT-PCR sử dụng kit SuperScript One Step RT-PCR (Invitrogen) với cặp mồi được thiết kế dựa theo trình tự của gen IL-2 thành thục, kích thước 399 bp đã được đăng kí trên ngân hàng dữ liệu gen quốc tế NCBI với số đăng kí NP_000577 có trình tự như sau:

IL2_Fw: 5’- GCC ATG GCA CCT ACT TCA AGT TCT ACA -3’ IL2_Rv: 5’- GCG GAT CCT AAG TCA GTG TTG AGA TGA-3’ Nhân gen bằng kỹ thuật PCR:

Đoạn gen IL-2 được nhân lên bằng kỹ thuật RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu có dạng một băng DNA có kích thước khoảng 400 bp tương đương với kích thước của đoạn gen IL-2 cần nhân theo thiết kế (Hình 2).

Sản phẩm PCR nhân gen IL-2 được gắn vào vector tách dòng pCR 2.1-TA (Invitrogen) và được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α. Các dòng tế bào được chọn lọc, DNA plasmid được tách chiết và làm sạch theo Sambrook và cộng sự. DNA plasmid của các dòng tế bào đã được chọn lọc sau khi cắt bằng enzyme EcoR I được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% (Hình 3).

M 1

2 M 1 2

bp

Sản phẩm PCR

Sản phẩm cắt Sản phẩm cắt

500 400

500 400 300 200 100

300

Hình 3. Kết quả cắt kiểm tra DNA các plasmid bằng enzyme EcoR I.

Hình 2. Sản phẩm PCR nhân gen IL-2 M: Chuẩn 100 bp; Đường chạy 1, 2: Sản phẩm PCR

Đường chạy M: DNA chuẩn; Đường chạy 2 và 3 là các plasmid của các dòng 1 và 2 sau khi được xử lý bằng EcoR I

3.1.2. Xác định trình tự nucleotide của gen IL-2

Trình tự nucleotide IL-2 được so sánh với trình tự gen IL-2 đã đăng kí trên ngân hàng dữ liệu gen quốc tế NCBI với số đăng ký là NP_000577 và phân tích bằng phần mềm ABI PRISM® 3100 Avant Data Collection v1.0 và Clustal-X (Hình 4).

Thực hiện từ 01/2005 – 06/2007

Báo cáo tóm tắt Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

A36

G54T

T74C

C389T

GenBank GCACCTACTTCAAGTTCTACAAAGAAAACACAGCTACAACTGGAGCATTTACTGCTGGAT 60 IL2 GCACCTACTTCAAGTTCTACAAAGAAAACACAGCTGCAACTGGAGCATTTACTTCTGGAT *************************** * GenBank TTACAGATGATTTTGAATGGAATTAATAATTACAAGAATCCCAAACTCACCAGGATGCTC 120 IL2 TTACAGATGATTTCGAATGGAATTAATAATTACAAGAATCCCAAACTCACCAGGATGCTC * GenBank ACATTTAAGTTTTACATGCCCAAGAAGGCCACAGAACTGAAACATCTTCAGTGTCTAGAA 180 IL2 ACATTTAAGTTTTACATGCCCAAGAAGGCCACAGAACTGAAACATCTTCAGTGTCTAGAA GenBank GAAGAACTCAAACCTCTGGAGGAAGTGCTAAATTTAGCTCAAAGCAAAAACTTTCACTTA 240 IL2 GAAGAACTCAAACCTCTGGAGGAAGTGCTAAATTTAGCTCAAAGCAAAAACTTTCACTTA GenBank AGACCCAGGGACTTAATCAGCAATATCAACGTAATAGTTCTGGAACTAAAGGGATCTGAA 300 IL2 AGACCCAGGGACTTAATCAGCAATATCAACGTAATAGTTCTGGAACTAAAGGGATCTGAA GenBank ACAACATTCATGTGTGAATATGCTGATGAGACAGCAACCATTGTAGAATTTCTGAACAGA 360 IL2 ACAACATTCATGTGTGAATATGCTGATGAGACAGCAACCATTGTAGAATTTCTGAACAGA ** GenBank TGGATTACCTTTTGTCAAAGCATCATCTCAACACTGACT 399 IL2 TGGATTACCTTTTGTCAAAGCATCATCTTAACACTGACT Hình 4. Kết quả so sánh trình tự IL-2 nhận được với trình tự trên ngân hàng gen quốc tế NCBI với số đăng ký là NP_000577; GenBank: trình tự NP_000577; IL-2: trình tự mẫu

Kết quả phân tích trên hình 4 cho thấy, so với gen IL-2 đã được đăng kí trên ngân hàng dữ liệu gen quốc tế với số đăng kí NP_000577 có chiều dài là 469 bp (mã hóa cho 153 amino acid), thì gen IL-2 đã tách dòng có 4 nucleotide đơn thay đổi.

Leu →Ser (25)

Ser →Leu (130)

Hình 5. So sánh trình tự amino acid đã được dịch mã của gen IL-2 nhận được Protein_IL-2) và trình tự amino acid đã đăng kí trên ngân hàng dữ liệu gen quốc tế với số đăng ký NP_000577.

Kết quả hình 5 cho thấy, trong 4 biến đổi về nucleotide trên có hai biến đổi về amino acid là i) ở vị trí 25, Leu biến đổi thành Ser và ii) ở vị trí 130, Ser biến đổi thành Leu. Như vậy trình tự gen IL-2 nhận được đã có 2 thay đổi về amino acid so với trình tự NP_000577. Điều đó cho thấy sự đa dạng của gen IL-2 ở các tộc người khác nhau.

Thực hiện từ 01/2005 – 06/2007

Báo cáo tóm tắt Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

3.2. KẾT QUẢ TẠO ĐỘT BIẾN GEN IL-2

125 3.2.1. Tạo đột biến điểm làm mất điểm glycosyl hóa và thay thế Cys

bằng Ser

Ala3 CC ATG GCT

tca agt tct aca aag aaa

AGT TAG TGT TGA GAT GAT GCT TTG CGA AAA GG

TCA

Trong thiết kế trình tự cặp mồi oligonucleotide dùng để nhân đoạn gen rhIL2 bằng kỹ thuật PCR, một số đột biến đã được đưa vào trong trình tự mồi để đạt các mục đích sau: i) biến đổi điểm nhận biết glycosyl hóa APT ở đầu N của IL-2 thành AMA bằng cách sử dụng đoạn mồi xuôi mã hóa cho vùng đầu N của IL-2 có chứa các trình tự nucleotide ATG (mã hóa cho Met2) thay cho CCT (mã hóa cho Pro2) và trình tự GCT (mã hóa cho Ala3) thay cho ACT (mã hóa cho Thr3); ii) Thay thế gốc Cystein ở vị trí 125 thành Serine bằng cách thay trình tự TGT (mã hóa cho Cys125) bằng TCG (mã hóa cho Ser125) trên đoạn mồi ngược; iii) Hồi biến gốc Leucine ở vị trí 130 thành Serine bằng cách thay TTA (mã hóa cho Leu130) bằng TCA (mã hóa cho Ser130) trên đoạn mồi ngược. Các thay đổi này được thể hiện trên trình tự các đoạn mồi xuôi và ngược dùng để nhân gen IL-2 như được trình bày dưới đây: Met 5’-Forward: AG Nco I 3’-Reverse: AGGCGGCCGC Not I Stop Ser130 Ser125

Gen rhIL2 sau khi nhân lên được gắn vào vector tách dòng pCR2.1-TOPO

(Invitrogen) tại hai vị trí enzyme hạn chế Nco I và Not I tạo nên vector tái tổ hợp pCR-rhIL2.

1 2

1 2 3 4 5 6 7 M 8 9 10

bp

1000

400

750 500 250

1000 750 500 250

Hình 6. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8% Đường chạy 1: DNA chuẩn 1kb Đường chạy 2 : Sản phẩm PCR

Hình 7. Kết quả cắt kiểm tra DNA plasmid các dòng biến nạp bằng Not I và Nco I Đường chạy M: DNA chuẩn 1kb (Fermentas) Đường chạy1-10: Sản phẩm cắt bằng Not I và Nco I

Kết quả điện di trên hình 6 cho thấy sản phẩm PCR thu được có một băng DNA duy nhất với kích thước khoảng 400 bp tương đương với kích thước của đoạn gen rhIL2. Như vậy sản phẩm PCR thu được là đặc hiệu và sử dụng để nối vào vector tách dòng pCR2.1. Kết quả cắt các DNA plasmid của các dòng tế bào chọn lọc được kiểm tra trên gel agarose 0,8% (Hình 7) cho thấy dòng số 4 và số 10 văng ra một băng tương đương với kích thước gen rhIL2 (khoảng 400 bp). Như vậy đoạn gen rhIL2 đã được tách dòng vào vector pCR2.1.

Dòng số 4 và 10 được chọn lọc và tiến hành xác định trình tự trên máy đọc trình tự ABI PRISM®3100 Avant Genetic Analyzer. So sánh kết quả đọc trình tự gen dòng số 4 mang gen rhIL2 đã đột biến với trình tự gen IL-2 đăng kí trên ngân hàng dữ liệu quốc tế (Gen Bank) cho thấy vị trí

Thực hiện từ 01/2005 – 06/2007

Báo cáo tóm tắt Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

Ala1 Pro2 Thr3 Ser4 Ser5 Ser6 Thr7 Lys8

nhận biết quá trình glycosyl hóa gồm có trình tự nucleotide CCT (mã hóa cho Pro2) được thay thế bằng ATG (mã hóa cho Met2), trình tự ACT (mã hóa cho Thr3) được thay thế bằng GCT (mã hóa cho Ala3) và trình tự TGT (mã hóa cho Cys125) được thay bằng TCG (mã hóa cho Ser125) và Leu130 thành Ser130. Như vậy chúng tôi đã tạo đột biến thành công trong gen rhIL2 (Hình 8) Phe124 Cys125 n126 Se 127 Ile128 Ile129

A

Ala1

r4 Ser5 Ser6 Thr7 Lys8

n126 Ser127 Ile128 Ile129

Met2

3Ala

Phe12

4 Ser125 Gl

B

Hình 8. Kết quả đọc trình tự nucleotide của dòng số 4 chứa gen rhIL2 A: Trình tự nucleotide của rhIL2 trên GenBank trước khi đột biến tại vị trí Pro2, Thr3 và Cys125 B: Trình tự nucleotide của rhIL2 sau khi đột biến thành Met2, Ala3 và Ser125 3.2.2. Gây hồi biến Ser25 thành Leu25

Ase I

NotI Stop

Như trình bày ở trên, gen IL-2 chúng tôi tách dòng được từ tế bào lách người Việt Nam có một điểm khác so với các trình tự IL-2 chuẩn đó là gốc leucine ở vị trí 25 biến đổi thành Serine, do đó để tạo đột biến thay thế Ser thành Leu chúng tôi dùng phương pháp tạo đột biến bằng mồi oligonucleotide. Đoạn mồi oligonucleotide ngược chiều tạo đột biến thay thế Ser25 thành Leu25 với bộ ba 5’CAG 3’ là bộ ba đối mã của 5’CTG 3’ – mã hoã cho Leu và trình tự ATTAAT là vị trí nhận biết của enzyme hạn chế Ase I. (1) Mồi xuôi: 5’-TCGAATTCAGCGATAAAATTATTCACCTG-3’ EcoR I (2) Mồi ngược hồi biến: 5’-AGATTAATTCCATTCAGAATCATCTGTAAATC-3’ (3) Mồi ngược: 5’-AGGCGGCCGCTCAAGTTAGTGTTGAGATGATGCTTTGCGAAAAGG-3’ Bộ ba CAG ở mồi (2) là đối mã của GTC, bộ ba mã hóa cho Leu ở vị trí 25 của IL-2

Đoạn gen để tạo đột biến điểm hồi biến Ser thành Leu được nhân lên bằng PCR nhờ cặp mồi (1) và (2) có kích thước khoảng 600 bp. Đoạn gen Trx-rhIL2MM được nhân lên bằng PCR nhờ cặp mồi (1) và (3) có kích thước khoảng 900 bp. Cả hai gen trên được đưa vào vector tách dòng pTZ57R/T tạo thành các plasmid tái tổ hợp pTZ600 và pTZ900. Các plasmid này được biến nạp vào vi khuẩn E. coli DH5α khả biến và được tách chiết theo phương pháp của Sambrook (2001) và kiểm tra trên gel agarose 0.8%. Sau đó xử lý DNA plasmid bằng enzyme hạn chế. Plasmid pTZ600 được cắt bằng hai enzyme EcoR I và Ase I, plasmid pTZ900 được cắt bằng hai enzyme Ase I và Not I, plasmid pPIC9 được cắt bằng hai enzyme Not I và EcoR I. Các đoạn DNA tinh sạch

Thực hiện từ 01/2005 – 06/2007

Báo cáo tóm tắt Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

được nối với nhau bằng T ligase tạo thành plasmid pPIC-Trx-rhIL2MN. Plasmid tái tổ hợp được biến nạp vào vi khuẩn E. coli DH5α. DNA plasmid từ thể biến nạp được tách chiết và kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%. Trong số các plasmid tách được có một dòng có kích thước lớn hơn so với đối chứng, kết quả cắt bằng enzyme dòng plasmid này cho thấy có văng ra một băng DNA có kích thước khoảng 900 bp như mong muốn. Kết quả tạo hồi biến Ser thành Leu ở vị trí 25 được khẳng định bằng đọc trình tự gen (Hình 9).

24 Ile Ser Asn Gly Ile Asn 29 24 Ile Leu Asn Gly Ile Asn 29

Hình 9. Kết quả đọc trình tự gen đã hồi biến (phải) so với gen chưa hồi biến (trái) 3.3. KẾT QUẢ BIỂU HIỆN IL-2 TRONG CÁC HỆ BIỂU HIỆN KHÁC NHAU

Trong quá trình biểu hiện gen IL-2 chúng tôi đã tiến hành biểu hiện song song trong cả 2 hệ E. coli và nấm men P. pastoris. Vì khi biểu hiện gen eukaryot (gen IL-2 người) trong tế bào E. coli thường xảy ra hiện tượng protein tổng hợp được tồn tại ở dạng thể vùi và mất hoạt tính. Gen IL-2 biểu hiện trong vector pET32c(+) được nối với Thioredoxin của E. coli để biểu hiện tốt hơn và tồn tại ở dạng tan nhiều hơn ở dạng biểu hiện một mình trong E. coli. 3.3.1. Biểu hiện gen lai Trx-rhIL2MN trong tế bào E. coli 3.3.1.1. Biểu hiện gen lai Trx-rhIL2MN với hệ vector pET32c (+) trong E. coli.

Để đảm bảo chắc chắn cho quá trình biểu hiện, cấu trúc gen Trx-rhIL2MN trong vector pET32c (+) được kiểm tra bằng cách xác định trình tự gen. Kết quả cho thấy không có một sự thay đổi nào trong trình tự của gen IL-2 trong vector biểu hiện và trình tự các vùng nối giữa gen Trx và IL-2 có chứa các điểm His-tag và điểm cắt cho enterokinase chính xác như dự tính.

1 2 3

kDa

1

2

3

4

5

kDa

116

66.2

32 kDa

28 32 kDa

18.4

14.4

Hình 10. Điện di SDS-PAGE protein rhIL2 trên gel polyacrylamide 12,5 %

Hình 11. Điện di protein rhIL2 dạng tan và không tan trên gel polyacrylamide 12.5%

Đường chạy 5: Protein chuẩn Đường chạy 1-4: Protein rhIL2 được cảm ứng bằng IPTG 1mM sau 0, 1, 2, 3 giờ

Đường chạy 1: Protein tái tổ hợp dạng tan Đường chạy 2: Protein chuẩn Đường chạy 3: Protein tái tổ hợp dạng không tan

Thực hiện từ 01/2005 – 06/2007

Báo cáo tóm tắt Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

Kết quả trên hình 10 cho thấy, protein Trx-rhIL2MN đã được biểu hiện với kích thước khoảng 32 kDa, như vậy protein lai Trx-rhIL2MN đã được biểu hiện dưới dạng dung hợp với Thioredoxin. Chúng tôi đã xác định một cách tương đối lượng IL-2 tái tổ hợp tổng hợp được trong tế bào E. coli thông qua việc so sánh lượng protein lai Trx-rhIL2MN trên bản điện di với các băng protein chuẩn đã biết về lượng. Kết quả hình 11 cho thấy protein phần lớn protein lai Trx-rhIL2MN biểu hiện đều ở dạng tan (85%) và chỉ có một lượng nhỏ protein ở dạng không tan (15%) trong tổng số protein. 3.3.1.2. Kiểm tra khả năng bắt cặp đặc hiệu của Trx- rhIL2MN với kháng thể kháng hIL-2 của người bằng phương pháp Western blot

Kết quả điện di trên hình 12 cho thấy protein tái tổ hợp Trx-rhIL2MN có khả năng bắt cặp đặc hiệu với kháng thể kháng hIL-2 của người. Trên đường chạy 1, ngoài băng protein chính với khối lượng khoảng 32 kDa còn xuất hiện 1 băng mờ với kích thước xấp xỉ 70 kDa. Đây có thể là sản phẩm dimer của IL-2. Từ kết quả trên cho thấy chúng tôi đã thiết kế và biểu hiện thành công protein tái tổ hợp IL-2 của người trong các tế bào E. coli.

1 2 3

kDa 70

Hình 12. Western blot với kháng thể kháng hIL-2

15,4 kDa

55 35 25 18 10

Đường chạy 1: Protein dung hợp Trx-rhIL2MN Đường chạy 2: hIL-2 chuẩn Đường chạy 3: Protein chuẩn

Băng protein với kích thước 32 kDa được thu lại bằng việc cắt gel trên bản điện di SDS-PAGE, thuỷ phân bằng enzyme trypsin tạo ra các mảnh peptide. Hỗn hợp peptide thu được sẽ được phân tách qua cột sắc ký C18 trên hệ sắc ký lỏng Nano HPLC thành các phân đoạn nhỏ. Các peptide thu được qua sắc ký sẽ được trực tiếp thu nhận và ion hoá bởi nguồn ion hoá ESI (ElectroSpray Ionization) tạo thành các ion đa điện tích và được phân tích tự động qua hệ thống khối phổ. Phổ MS/MS các mảnh peptide được so sánh với ngân hàng protein trên NCBI qua sử dụng phần mềm Mascot v1.8 (Hình 13, Hình14).

3.3.1.3. Nhận dạng protein biểu hiện bằng phương pháp khối phổ

L N I D Q N P G T A P K

B

A

Hình 13. Ảnh phổ MS/MS của mảnh peptide 634,4 dalton mang điện tích +2 của Trx được nhận dạng. A – phổ TOF MS, B – phổ MS/MS.

Thực hiện từ 01/2005 – 06/2007

Báo cáo tóm tắt Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

H L Q C L E E E L K P L E E V L N L A

B

A

Hình 14. Ảnh phổ TOF MS và MS/MS của mảnh peptide 874,6 dalton mang điện tích 2+ của IL-2 được nhận dạng. A – phổ TOF MS, B – phổ MS/MS.

gi|575449 E. coli thioredoxin gen gi|386818 Interleukin 2

TT Thioredoxin

Interleukin 2

GIPTLLLFK

DLISNINVIVLELK

LNIDQNPGTAPK

HLQCLEEELKPLE EVLNLAQSK

IIHLTDDSFDTDVLK

MIAPILDEIADEYQGK

SDKIIHLTDDSFDTDVLK

Hình 15. Các peptide nhận dạng được qua khối phổ từ băng protein có kích thước 32 kDa

Kết quả xác định cho thấy protein thu nhận được qua biểu hiện ở trên là IL-2 (Hình 15), hơn nữa protein thioredoxin cũng được tìm thấy trên cùng một mẫu phân tích khối phổ. Điều này khẳng định rằng gen IL-2 đã được biểu hiện dưới dạng lai cùng với thioredoxin ở tế bào E. coli. 3.3.2. Biểu hiện gen lai Trx-rhIL2MN trong nấm men P. pastoris.

Song song với việc biểu hiện gen IL-2 trong tế bào E. coli, chúng tôi cũng tiến hành biểu hiện protein dung hợp Trx-rhIL2MN cả trong nấm men P. pastoris để protein này có thể được tiết ra dưới dạng ngoại bào và giúp cho quá trình tinh sạch protein dễ dàng hơn. Tạo chủng nấm men mang gen Trx-rhIL2-MN Sau khi thiết kế thành công hai plasmid pPIC-Trx-rhIL2MN và pPICZ-Trx-rhIL2MN, chúng tôi cắt hai plasmid này lần lượt bằng Sal I và Sac I rồi biểu hiện trong P. pastoris GS115 (hình 16).

2 3 4

Hình 16. Ảnh biểu hiện gen Trx-rhIL-2MN

kDa 110 90 70

Đường chạy 1: Dịch nuôi cấy tế bào chứa pPICZ-Trx-rhIL2MN Đường chạy 2: Protein chuẩn (Fermentas) Đường chạy 3: IL-2 chuẩn Đường chạy 4: Dịch nuôi cấy tế bào chứa pPIC-Trx-rhIL2MN

45 35 25 18 10

Thực hiện từ 01/2005 – 06/2007

Báo cáo tóm tắt Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

2 3 4

kDa

Kết quả điện di sản phẩm protein biểu hiện trong nấm men P. pastoris trên hình 17 cho thấy băng protein với kích thước dự đoán 32 kDa của protein lai Trx-rhIL2MN không thấy xuất hiện. Thay vào đó, ở đường chạy số 1 với mẫu dịch nuôi cấy của chủng P. pastoris GS115 mang pPIC-Trx-rhIL2MN biểu hiện bằng hệ vector pPICZα chỉ có hai băng với kích thước khoảng 18 và 19 kDa, còn trong đường chạy số 4 với mẫu dịch nuôi cấy của chủng P. pastoris GS115 mang pPICz-Trx-rhIL2MN biểu hiện bằng hệ pPICZα lại xuất hiện 3 băng với các kích thước là khoảng 15, 17, 19 kDa. Điều này có thể là do các protease trong môi trường nuôi cấy nấm men đã cắt ở giữa các protein dung hợp tạo nên các protein có kích thước nhỏ hơn. Để kiểm tra khả năng này chúng tôi làm Western Blot để kiểm tra tính liên kết đặc hiệu của các băng protein bị cắt với kháng thể kháng IL-2 (Hình 17).

110 90

Hình 17. Ảnh Western Blot với kháng thể kháng IL-2.

55 45 35 25 18 10

Xho I

TCA AGT TAG TGT TGA GAT GAT GCT TTG CGA AAA GGT 3’

stop

Việc biểu hiện trong nấm men có thuận lợi hơn so với biểu hiện trong E. coli là protein sau khi biểu hiện có thể được tiết ra môi trường do đó thuận tiện hơn cho việc tinh chế. Ngoài ra, tế bào nấm men không tổng hợp các chất chí nhiệt tố như tế bào E. coli do đó sản phẩm tạo ra an toàn hơn so với con đường tổng hợp từ E. coli. Tuy nhiên kết quả biểu hiện protein lai Trx- rhIL2MN với các hệ vector pPIC9 và pPICZαA trong nấm men P. pastoris cho thấy protein dung hợp này đã bị phân cắt do các protease tiết ra trong môi trường nuôi cấy nấm men. Do đó chúng tôi đã tiến hành thêm việc biểu hiện gen IL-2 dạng đơn không lai với protein Trx trong nấm men P. pastoris. Đoạn gen mã hóa cho interleukin-2 ở dạng tự nhiên (kí hiệu là rhIL2) được nhân lên từ khuôn là pET32-rhIL2MN bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu là: 5'-Tct ctc gag aaa aga* gag gct gaa gct gca cct act tca agt tct-3' 5’ AGGCGGCCGC Nco I Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên hình 18 cho thấy xuất hiện băng DNA có kích thước khoảng 400 bp, đúng với kích thuớc của đoạn gen mã hóa cho IL2. Đoạn gen rhIL2 được gắn trực tiếp vào vector pPIC9 tại vị trí cắt của hai enzyme hạn chế là Xho I và Nco I. Vector tái tổ hợp pPIC9-rhIL2 được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α trên môi trường chọn lọc có

Thực hiện từ 01/2005 – 06/2007

Trên hình 17 ta thấy ở cả hai mẫu dịch nuôi cấy chỉ có các băng protein với kích thước khoảng 19 kDa mới bắt đặc hiệu với kháng thể kháng IL-2 chứng tỏ băng protein này còn chứa đoạn protein rhIL2MN. Còn các băng protein khác đều không có khả năng bắt cặp đặc hiệu với kháng thể kháng hIL-2. 3.3.3. Kết quả biểu hiện gen rhIL2 ở dạng riêng lẻ trong nấm men P. pastoris

Báo cáo tóm tắt Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

chứa Amp (100μg/ml). Plasmid tái tổ hợp (pPIC9-rhIL2) của các dòng tế bào này được tách chiết và xử lý bằng enzyme hạn chế Xho I và Nco I. Những plasmid chọn lọc được sẽ tiếp tục được xác định trình tự DNA để khẳng định chắc chắn đã có đoạn gen rhIL2 gắn vào.

1 M

Hình 18. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8%

Đường chạy M : DNA chuẩn Đường chạy 1: Đoạn gen rhIL2

500 400 300 200 100

Trên ảnh điện di hình 19 xuất hiện băng protein có kích thước khoảng 15,4 kDa, phù

hợp với kích thước của interleukin-2 dạng tự nhiên.

M 1

116

M

18.4 14

rhIL2 15,4 kDa

1 2 3

Hình 19. Điện di SDS-PAGE sản phẩm biểu hiện rhIL2 trong nấm men P. pastoris Đường chạy M : Protein chuẩn, Đường chạy 1: Protein rhIL2 biểu hiện Sau khi điện di trên gel 12,5% polyacrylamide, các băng protein được chuyển sang màng PVDF. Sau đó màng được phủ kháng thể IgG kháng IL-2 của người được tạo ra từ chuột rồi phủ kháng thể kháng IgG chuột gắn alkaline phosphatase. Phản ứng hiện màu với BCIP và NBT (Hình 20).

65 45

Hình 20. Ảnh Western Blot với kháng thể kháng IL-2

25.5

Đường chạy 1: Mẫu IL-2 đối chứng của Trung Quốc Đường chạy 2: Protein chuẩn Đường chạy 3: Protein rhIL-2

rhIL2 15,4 kDa

Kết quả điện di trên hình 20 cho thấy protein tái tổ hợp rhIL2 có khả năng bắt cặp đặc hiệu với kháng thể kháng hIL-2 của người. Kết quả nhận được cho thấy chúng tôi đã thiết kế và biểu hiện thành công protein tái tổ hợp rhIL-2 của người ở dạng riêng lẻ và tiết ra môi trường nuôi cấy trong các tế bào nấm men P. pastoris. Kết quả này mở ra thêm cơ hội sản xuất

Thực hiện từ 01/2005 – 06/2007

Báo cáo tóm tắt Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

protein IL-2 từ nấm men và có thể đơn giản hóa quá trình tinh chế, đặc biệt là thuận lợi trong việc làm sạch các chất chí nhiệt tố trong sản phẩm cuối cùng. 3.4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN CÁC CHỦNG TÁI TỔ HỢP MANG GEN IL-2 Ở BÌNH TAM GIÁC VÀ TRONG HỆ THỐNG LÊN MEN 5L, 14L 3.4.1. Kết quả lên men tổng hợp IL-2 tái tổ hợp ở bình tam giác

1 2 3 M

1 2 3 4 5 6 7 8 M

M 1 2 3

1 2 3 4 5 6 M

Để xây dựng quy trình lên men chủng vi sinh vật tái tổ hợp mang gen IL-2 quy mô bình tam giác, chúng tôi phải tiến hành khảo sát các nhân tố ảnh hưởng đến quá trình biểu hiện protein và từ đó lựa chọn điều kiện nuôi cấy thích hợp nhất. Các nhân tố chủ yếu ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình sinh trưởng, phát triển và tổng hợp protein của chủng bao gồm nhiệt độ nuôi cấy, nồng độ chất cảm ứng IPTG, nồng độ Amp trong môi trường và đặc biệt là thời gian để thu hồi sinh khối. Đây cũng là một số yếu tố rất quan trọng và liên quan trực tiếp đến quá trình lên men lớn và giá thành của sản phẩm.

Hình 22. Khảo sát nồng độ Amp Đường chạy 1-3: Nồng độ

Amp từ 100, 150, 200 μg/ml

Hình 24. Thời gian thu mẫu Đường chạy 1-6: 0-5 giờ, Đường chạy M: Protein chuẩn

Hình 21. Khảo sát nồng độ IPTG Đường chạy 1-8 : Nồng độ IPTG từ 0, 1, 10, 50, 100, 500, 1000 μM IPTG Đường chạy M: Protein chuẩn

Hình 23. Khảo sát nhiệt độ Đường chạy M: Protein chuẩn, Đường chạy 1- 3 : Nhiệt độ 280C, 300C, 370C

Đường chạy M : Protein chuẩn

Dựa vào các kết quả trên hình 21, 22, 23, 24 chúng tôi đã xây dựng quy trình lên men trong bình tam giác và lên men chủng tái tổ hợp mang gen rhIL-2 như sau: Nuôi cấy khuẩn lạc riêng rẽ qua đêm trong môi trường LBA lỏng qua đêm ở 370C, 230 vòng/phút và nồng độ Amp cuối cùng đạt 100 μg/ml. Ly tâm 5 phút ở tốc độ 5000 vòng/ phút để thu tế bào từ nuôi cấy qua đêm. Hoà tế bào lại trong môi trường LBA mới với độ pha loãng 100 lần. Nuôi lắc ở 370C đến khi độ hấp thụ của dịch nuôi cấy ở 600 nm đạt 0,5 - 0,6. Bổ sung IPTG vào mẫu dịch nuôi cấy sao cho nồng độ IPTG cuối cùng đạt 100 μM và nuôi lắc ở 300C trong 5 giờ. 3.4.2. Kết quả lên men sản xuất IL-2 tái tổ hợp trong hệ thống Bioflo 110 dung tích 5L và 14L. Chuẩn bị giống cho lên men:

Nhân giống E. coli BL21 trong bình tam giác dung tích 250 ml chứa 50 ml môi trường LBA, nuôi trên máy lắc tròn 200 vòng/ phút, nhiệt độ 37oC trong 14 giờ. Ly tâm huyền dịch tế bào 5000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ dịch nổi. Rửa tế bào bằng nước muối sinh lý (NaCl 0,9%) vô trùng; ly tâm loại bỏ dịch rửa rồi hòa lại trong 50 ml môi trường LBA mới. Lên men: Khởi động hệ thống Bioflo 110 và chương trình phần mềm BioCommand Plus. Thiết lập chế độ lên men trong bình như sau: pH môi trường 6,0; nhiệt độ 37 oC; sục khí 0,5 vvm (lít khí/ lít môi trường/ phút); tốc độ khuấy 200 vòng/ phút.

Bổ sung 5 ml dung dịch đặc Amp vô trùng vào bình lên men. Cấy 50 ml huyền dịch tế

Thực hiện từ 01/2005 – 06/2007

Báo cáo tóm tắt Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

bào đã chuẩn bị ở trên. Lấy mẫu đo mật độ tế bào (OD600nm) ở 0 giờ.

Các thông số chủ yếu của quá trình lên men, ví dụ nhiệt độ, độ pH, tốc độ khuấy, nồng độ oxy hòa tan dO2, được điều khiển và lưu trữ tự động bởi chương trình phần mềm BioCommand Plus. Điều chỉnh tốc độ khuấy trong phạm vi 200-500 vòng/ phút và sục khí 0,5-0,75 vvm để duy trì dO ≥ 30%. Phân tích mẫu: Sinh khối tế bào: Đo mật độ quang (OD) của huyền dịch tế bào ở bước sóng 600 nm trên máy phổ kế. Đồng thời, sinh khối tế bào ướt của các mẫu lấy từ bình lên men cũng được xác định. Cảm ứng sinh tổng hợp Interleukin-2:

Mật độ tế bào trong bình lên men được theo dõi liên tục cho tới khi OD đạt 0,6. Ở thời điểm đó, cảm ứng sinh tổng hợp IL-2 bằng bổ sung 10 ml dung dịch đặc IPTG và hạ nhiệt độ lên men xuống tới 300C. Từ đó, sau mỗi giờ lại lấy một mẫu cho các phân tích như đo OD, xác định sinh khối tế bào và lượng IL-2 tạo thành. Thu hồi sản phẩm: Sau 5 giờ cảm ứng, thu sinh khối tế bào bằng ly tâm 5000 vòng/ phút trong 10 phút trên máy Sorvall. Tế bào được rửa sạch bằng nước muối sinh lý, hòa lại trong dung dịch đệm thích hợp để xử lý thu hồi Interleukin-2. Sinh khối ở thời điểm kết thúc lên men xấp xỉ 70-80 g tế bào ướt/ lít và IL-2 dạng lai là khoảng 185-192 mg/ lít.

1 2

IL-2 Batch No7

7.5

2.5

6.5

32 kDa

H p

1.5

D O

5.5

0.5

4.5

Run time (h)

OD600

Hình 26. Điện di protein tái tổ hợp Trx-rhIL2MN trên polyacryamide gel 12,5%

Hình 25. Quá trình phát triển của chủng E. coli Bl21 và sinh tổng hợp Interleukin-2.

Đường chạy 1: Protein chuẩn Đường chạy 2: Mẫu lên men gen Trx-rhIL2MN

Kết quả điện di trên hình 26 cho thấy protein Trx-rhIL2MN có kích thước 32 kDa đã biểu hiện thành công trong hệ thống lên men Bioflo110 dung tích 5L và 14L. Kết quả này mở ra triển vọng có thể sản xuất IL-2 tái tổ hợp trên quy mô lớn. 3.5. KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT, TINH CHẾ IL-2 TỪ DỊCH LÊN MEN VÀ NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT 3.5.1. Tách chiết và tinh chế IL-2 bằng sắc ký ái lực

Sau khi biểu hiện thành công protein tái tổ hợp Trx-rhIL2MN trong vi khuẩn E. coli BL21 (DE3), IL-2 từ dịch phá tế bào E. coli được tinh chế bằng cột sắc ký ái lực Histrap HP của hãng Amersham. Các bước thực hiện tinh chế trên cột được thực hiện theo hướng dẫn của hãng như đã trình bày ở phần phương pháp. Các protein không mong muốn bị rửa khỏi cột trong khi protein lai Trx- rhIL2MN có vùng His-tag nên được giữ lại và được đẩy ra ở nồng độ imidazole 300 mM. Quá trình tinh sạch protein bằng cột sắc ký được lặp lại 2 lần để đảm bảo độ sạch của protein thu được.

Thực hiện từ 01/2005 – 06/2007

Báo cáo tóm tắt Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

Protein tái tổ hợp IL-2 tinh sạch bằng cột sắc ký ái lực lần 1 (Hình 27) và lần 2 (Hình 28)

1 2

được điện di kiểm tra trên SDS-PAGE 12,5%.

116

116 66,2 45

66,2

Trx-rhIL2MN

18,4

14,4

Hình 27. Điện di protein tinh sạch lần 1 Hình 28. Điện di protein tinh sạch lần 2 Đường chạy 1: Protein chuẩn, Đường chạy 1: Protein chuẩn, Đường chạy 2: Protein Trx-rhIL2MN Đường chạy 2: Protein Trx-rhIL2MN

1 2 3

116

66.2

30 kDa

45 35 25

Kết quả kiểm tra trên hình 27 cho thấy sau khi tinh sạch ái lực lần 1 protein tái tổ hợp Trx-rhIL2MN vẫn bị lẫn với một số protein khác, tuy nhiên sau khi tinh sạch lần 2 thì tại đường chạy số 2 (hình 28) chỉ xuất hiện một băng protein đơn nhất với kích thước phân tử khoảng 32 kDa. Kích thước của các băng protein này phù hợp với kích thước băng protein Trx-rhIL2MN. Điều này chứng tỏ protein tái tổ hợp Trx-rhIL2MN biểu hiện trong E. coli BL21 (DE3) đã được tinh sạch thành công. 3.5.2. Cắt protein dung hợp bằng Enterokinase và lọc IL-2 qua cột sắc ký ái lực và kiểm tra khả năng bắt cặp đặc hiệu của IL-2 bằng Western blot Sau khi biểu hiện được protein dưới dạng lai Trx-IL2MN chúng tôi có thể loại bỏ các thành phần Trx- Stag-Histag không mong muốn ra khỏi cấu trúc protein IL2 tái tổ hợp bằng cách cắt protein này với enterohinase và loại Trx-Stag-Histag khỏi phần IL-2 bằng cột sắc ký ái lực. Lúc này phần Trx-Stag- Histag sẽ được giữ lại trên cột, còn phần IL-2 sẽ ra khỏi cột và được thu lấy. Sản phẩm cắt sẽ được kiểm tra bằng điện di SDS-PAGE trên gel polyacrylamide 12,5% (Hình 29) Hình 29. Điện di sản phẩm protein cắt bằng enterokinase Đường chạy 1: rhIL2MN cắt bằng enterokinase Đường chạy 2: Protein chuẩn Đường chạy 3: hIL2 chuẩn

15,4 kDa

Kết quả trên hình 29 cho thấy trong đường chạy số 1 với sản phẩm cắt protein lai Trx- rhIL2MN bằng enterokinase và sau khi tinh chế 1 lần nữa qua cột His-tag trong dịch protein không bám trên cột thấy xuất hiện băng protein kích thước xấp xỉ 15,4 kDa tương đương với băng protein interleukin-2 chuẩn ở đường chạy 3. Ngoài băng protein chính với khối lượng 15,4 kDa còn xuất hiện 1 băng rất mờ với kích thước khoảng 30 kDa trong cả hai đường chạy 1 và 3 (protein IL-2 chuẩn). Đây có thể là sản phẩm dimer của IL-2. Sau khi thu được IL-2 tái tổ hợp chúng tôi tiến hành xử lý chế phẩm với kit (Affi-Prep Polymyxin) để loại bỏ chất chí nhiệt tố.

Thực hiện từ 01/2005 – 06/2007

Báo cáo tóm tắt Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

Hiệu quả của quá trình tinh chế IL-2 trình bày ở trên được tóm tắt trong bảng 1. Từ 930 mg protein tổng số từ dịch chiết tế bào E. coli ban đầu chúng tôi thu được 8 mg IL-2 tinh sạch. Chế phẩm IL-2 tinh chế có hoạt tính sinh học đạt 2,7x106 thử nghiệm trên dòng tế bào CTLL2, còn trên dòng tế bào NK hoạt tính của chế phẩm này đạt 9,8x104. Kết quả xác định hoạt tính của IL-2 được trình bày chi tiết hơn trong các phần sau (Phần 3.7 và 3.9).

Bảng 1. Kết quả tinh chế IL-2 tái tổ hợp từ dịch thô

Các bước tinh sạch

Thể tích (ml)

Protein IL-2 (mg)

Dịch thô Sắc ký ái lực lần 1 Loại muối lần 1 Sắc ký ái lực lần 2 Loại muối lần 2 Sắc ký ái lực sau khi cắt enterokinase Loại pyrogen

1000 207 200 36 19 12 8

930 270 196 103 57 14 8

3.6. KẾT QUẢ BƯỚC ĐẦU VỀ BẢO QUẢN MẪU IL2 Chúng tôi chưa có đủ thời gian để nghiên cứu một cách đầy đủ điều kiện bảo quản chế phẩm IL-2 tạo được. Kết quả dưới đây mới chỉ là kết quả ban đầu đối với IL-2 dạng lai Trx-rhIL2MN và cũng chỉ mới với điều kiện mẫu đông khô. Đây là một bước quan trọng trong quá trình chuẩn bị mẫu IL-2. Các mẫu IL-2 dạng Trx-rhIL2MN sau khi tinh chế bằng sắc ký ái lực được gom lại sau các lần tinh chế trước khi cắt với enterokinase. Nếu bảo quản ở dạng dung dịch thường không được lâu và ổn định, do đó chúng tôi đã đông khô mẫu trước khi dùng tiếp cho phản ứng cắt bằng enzyme enterokinase. Điều kiện bảo quản được tiến hành như sau. Dung dịch chứa Trx-IL2MN sau khi tinh chế bằng sắc ký ái lực được chia ra các lọ penicilin với nồng độ 1 mg/ml, giữ trong -850C trong 24h và được tiến hành đông khô. Mẫu IL-2 ở dạng đông khô được tiếp tục bảo quản ở 40C. Kết quả trên hình 30 cho thấy sau 12 tuần mẫu Trx-IL2MN vẫn giữ được chất lượng và không bị phân hủy trong điều kiện bảo quản.

M 1 2 3

Hình 30. Mẫu Trx-IL2MN giữ ở dạng đông khô sau các

khoảng thời gian bảo quản khác nhau

Đường chạy 1, 2, 3: Trx-IL2MN sau các thời gian bảo

Đường chạy M: Maker protein chuẩn Trx- IL2MN quản 4, 8 và 12 tuần

- Môi trường nuôi cấy tế bào: RPMI 1640 kèm theo 2 mM L-glutamine, 1,5 g/L sodium bicarbonate, 4,5 g/L glucose, 10 mM HEPES, và 1,0 mM sodium pyruvate, ngoài ra bổ sung 2 mM L-glutamine, 1mM sodium pyruvate, 10% T-STIM Con A và 10% fetal bovine serum – FBS (GIBCO).

Thực hiện từ 01/2005 – 06/2007

3.7. THỬ NGHIỆM IL-2 TÁI TỔ HỢP TRÊN MÔ HÌNH TẾ BÀO CTLL2 3.7.1. Điều kiện tối ưu để nhân và bảo quản dòng tế bào CTLL2

Báo cáo tóm tắt Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

- Thực hiện bảo quản và cất giữ dòng tế bào CTLL2 trong nitơ lỏng với số lượng 20 ống. + Bảo quản: Tế bào phát triển khỏe mạnh sẽ được lựa chọn, để bảo quản trong nitơ lỏng

bằng môi trường cất giữ có 5% DMSO (Dimethyl Sulfoxide) và 10% FBS.

Hình 31. Hình ảnh tế bào CTLL-2 nuôi cấy in vitro

Đã xác lập được phép thử sinh học có sử dụng Non-radioactive proliferation kit của

Promega để định tính và định lượng mẫu interleukin 2 tái tổ hợp cụ thể: + Ủ mẫu ở 5-6 nồng độ khác nhau cùng với tế bào phụ thuộc interleukin CTLL2 (1 x 105 tế

bào/ml) trong 48 giờ.

+ Pha MTT nhuộm từ kit của promega theo hướng dẫn của nhà sản xuất. + Thêm 30 ul/giếng thử chất nhuộm nói trên + Để ủ trong bóng tối thêm 4 giờ và đọc kết quả bằng máy ELISA reader bước sóng 525nm 3.7.2. Xác định hoạt tính sinh học của các mẫu IL-2 tái tổ hợp biểu hiện trong E.coli BL21

Sau khi sàng lọc từ 15 mẫu IL-2 tái tổ hợp được tổng hợp trong tế bào E. coli và tinh chế bằng sắc kí ái lực, chúng tôi đã lựa chọn ra mẫu rhIL2MN có hoạt tính tốt nhất để tiến hành thí nghiệm tiếp nhằm định tính và định lượng hoạt tính sinh học của chúng. Với việc sử dụng tế bào CTLL2 phụ thuộc IL-2 trong phép thử sinh học do chúng tôi thiết lập, mẫu rhIL2MN được kiểm tra và so sánh với sản phẩm IL-2 của Trung Quốc và Hoa Kỳ. Các dữ liệu được trình bày và minh hoạ ở bảng 2 và hình 32.

Tên mẫu

2 μg/ml 1 μg/ml

Bảng 2. Dữ liệu kiểm tra hoạt tính của các mẫu IL-2 tái tổ hợp % Hoạt hoá tế bào CTLL2 0,25 μg/ml 42,7 43,4 83,8

0,125 μg/ml 36,9 24,2 66,9

0,5 μg/ml 58,3 60,9 107,6

59,1 72,5 124,5

81,6 90,7 191,2

Giá trị ED50 (μg/ml) 0,373 0,352 0,052

rhIL2MN M-TQ M-US

Hoạt tính của rhIL-2MN

250

200

150

rhIL2MN

100

M-TQ

h n í t t ạ o H %

M-US

0.5

1.5

2.5

Nồng độ m ẫu thử

Hình 32. Xác định và so sánh hoạt tính của các mẫu IL-2 thử nghiệm

Thực hiện từ 01/2005 – 06/2007

Báo cáo tóm tắt Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

Kết quả thí nghiệm cho thấy, cả 3 mẫu thử đều có khả năng hoạt hoá và duy trì sự sống cho tế bào CTLL2. Mẫu thí nghiệm từ Hoa Kỳ cho thấy hoạt tính cao nhất và khả năng hoạt hoá lên tới 191% (gấp 1,91 lần) so với đối chứng âm (không được bổ sung IL-2 vào môi trường nuôi cấy). Mẫu rhIL2MN do chúng tôi tổng hợp có hoạt tính tốt, khả năng hoạt hoá tế bào CTLL2 đạt 81,6%. Khả năng hoạt hoá này cho thấy các mẫu nghiên cứu đã duy trì và tăng sinh đối với tế bào CTLL2 phục thuộc IL-2. Hoạt tính của mẫu rhIL2MN nghiên cứu là thấp hơn so với mẫu của Hoa Kỳ và gần tương đương với thương phẩm IL-2 của Trung Quốc. Việc mẫu IL-2 của Mỹ có hoạt tính vượt trội so với mẫu của Trung Quốc và của đề tài tạo ra có thể được giải thích là do trong sản phẩm IL-2 của Mỹ do hãng BD cung cấp thì ngoài IL-2 ra nó còn chứa concanavalin A (ConA, 10 ug/ml) là chất kích thích phân chia tế bào (mitogen) và dịch chiết nuôi tế bào lách. Đây là những chất kích thích phát triển mạnh tế bào IL-2 trong nuôi cấy. Với kết quả thu được ở trên, chúng tôi đã tiến hành quy đổi và xác định hoạt tính cho các mẫu thí nghiệm theo quy chuẩn quốc tế. Kết quả được trình bày ở bảng 3. Bảng 3. Đơn vị hoạt tính của các mẫu IL-2 thử nghiệm

STT 1. 2. 3.

Giá trị ED50 (μg/ml) 0,352 0,373 0,052

Giá trị quy đổi (Units/mg) 2,7 x 106 2,9 x 106 2 x 107

Tên mẫu rhIL2MN M-TQ M-US

So sánh kết quả trên, chúng tôi nhận thấy đơn vị hoạt tính của các mẫu rhIL2MN là tương đối tốt. Mẫu của Hoa Kỳ đạt tới 2 x 107 Units/mg và là mẫu có hoạt tính tốt nhất. Mẫu rhIL2MN đạt hoạt tính cao nhất 2,7 x 106 Units/mg, gần tương đương với thương phẩm IL-2 đang được bán trên thị trường Trung Quốc 2,9 x 106 Units/mg. 3.7.3. Xác định hoạt tính sinh học của mẫu rhIL2 biểu hiện trong P. pastoris

Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng mẫu rhIL2 và các mẫu sản phẩm IL-2 của Trung Quốc và Hoa Kỳ làm đối chứng dương. Số liệu về khả năng kích hoạt sự phát triển của tế bào CTLL-2 của các mẫu thử được trình bày ở bảng 4 và hình 33. Bảng 4. Khả năng hoạt hoá tế bào CTLL-2 phát triển của các mẫu thí nghiệm ở các nồng độ thử khác nhau:

Mẫu TNo

rhIL2 TQ1 3.9 86.1 35.5 26.8 9.0 1.0

33.2 126.1 117.1 128.7 83.9 15.2

US 663.5 320.0 169.0 111.0 72.9 40.6

% hoạt hoá 2 μg/ml 1 μg/ml 0.5 μg/ml 0.25 μg/ml 0.125 μg/ml

Hoạt tính của rhIL2

Hoạt tính của nhIL2

350

300

250

h n

nhIL-2

200

TQ1

150

í t t ạ o H %

100

0.5

1.5

2.5

Nồng độ mẫu thử

Hình 33. Đồ thị minh hoạ sự phát triển của tế bào CTLL-2 dưới tác động của chất thử ở các nồng độ khác nhau.

Thực hiện từ 01/2005 – 06/2007

Báo cáo tóm tắt Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

Kết quả thí nghiệm cho thấy, cả 3 mẫu thử đều có khả năng hoạt hoá và duy trì sự sống cho tế bào CTLL2. Với kết quả thu được, chúng tôi đã tiến hành xác định giá trị ED50 (nồng độ mà chất thử kích hoạt được 50% sự phát triển của tế bào CTLL-2), đồng thời tiến hành qui đổi và xác định đơn vị hoạt tính cho các mẫu thí nghiệm theo quy chuẩn quốc tế (bảng 5).

Bảng 5. Đơn vị hoạt tính của các mẫu rhIL2 thử nghiệm

STT

Tên mẫu

1. 2. 3.

Giá trị ED50 (μg/ml) 0,25 1,32 0,037

Giá trị qui đổi (Units/mg) 4 x 106 7,6 x 105 2,7 x 107

rhIL2 M-TQ M-US

Kết quả trên cho thấy, mẫu thí nghiệm từ Hoa Kỳ cho thấy hoạt tính cao nhất và khả năng hoạt hoá lên tới 663,5% (gấp 6,63 lần) so với đối chứng âm (không được bổ sung IL-2 vào môi trường nuôi cấy) ở nồng độ thử chất cao nhất (20 ug/ml). Đơn vị hoạt tính của mẫu này đạt tới 2,7 x 107 U/mg. Ở các nồng độ thử chất tăng dần, hoạt tính của mẫu này cũng tăng dần, cho thấy hoạt tính của mẫu thử rất ổn định và đáng tin cậy. Mẫu rhIL-2 do chúng tôi tổng hợp có hoạt tính tốt, có khả năng hoạt hoá tế bào CTLL-2. Khả năng hoạt hoá của mẫu rhIL-2 đạt 126,1%. Đơn vị hoạt tính của mẫu này đạt tới 4 x 106 U/mg. Mặc dù là mẫu IL-2 được lấy trực tiếp từ dịch nuôi cấy chưa qua tinh chế, thế nhưng kết quả cho thấy hoạt tính của IL-2 vẫn rất cao, đặc biệt là ở nồng độ thấp ban đầu (0,25 và 0,5 μg/ml), chứng tỏ rhIL2MN biểu hiện trong nấm men có thể có hoạt tính riêng cao hơn so với biểu hiện trong E. coli. Ở những nồng độ thử cao hơn (1 và 2 μg/ml) chế phẩm rhIL2MN biểu hiện trong nấm men có dấu hiệu giảm hoạt tính, có thể là do các protein còn lẫn trong chế phẩm gây hiệu ứng ức chế sinh trưởng của tế bào CTLL-2. Đây là một kết quả rất quan trọng trong việc lựa chọn tế bào chủ để sản xuất IL-2 sau này.

Kết quả nghiên cứu độc tính của rhIL-2MN biểu hiện trong E. coli cho thấy mẫu đạt hoạt tính cao nhất 2,7 x 106 U/mg, gần tương đương với thương phẩm IL-2 đang được bán trên thị trường Trung Quốc là 2,9 x 106 U/mg. Hoạt tính của rhIL2MN biểu hiện trong nấm men có thể cao hơn so với hoạt tính của rhIL-2MN biểu hiện trong E. coli đạt 4 x 106 Units/mg. Cả hai dạng IL-2 tái tổ hợp tổng hợp từ E. coli và nấm men đều có khả năng kích hoạt sự phát triển tế bào CTLL-2.

3.8. THỬ NGHIỆM IL-2 TÁI TỔ HỢP TRÊN MÔ HÌNH TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

Theo một số các công trình nghiên cứu của FDA (Mỹ) cho thấy IL-2 đã được sử dụng trong điều trị hai loại ung thư là ung thư hắc tố (melanoma) và ung thư thận ác tính. Tuy nhiên IL-2 có vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy sự hoạt hóa các tế bào miễn dịch vì vậy IL-2 cũng có thể được sử dụng trong điều trị các bệnh ung thư khác. Để nghiên cứu thử nghiệm IL- 2 tái tổ hợp trên mô hình tế bào động vật chúng tôi đã tiến hành gây ung thư thực nghiệm đường tiêu hóa cho chuột do việc gây ung thư đường tiêu hóa dễ hơn so với gây ung thư biểu mô thận và ung thư hắc tố. Ngoài ra, số lượng bệnh nhân ung thư thận và ung thư hắc tố ở Việt nam hiếm gặp hơn so với ung thư đường tiêu hóa, do vậy đề tài đã tiến hành thử nghiệm IL-2 tái tổ hợp trên chuột bị ung thư đường tiêu hóa để có thể tiếp tục nghiên cứu thử nghiệm trên bệnh nhân ung thư đường tiêu hóa giai đoạn muộn.

Thực hiện từ 01/2005 – 06/2007

Báo cáo tóm tắt Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

3.8.1. Gây ung thư thực nghiệm đường tiêu hóa cho chuột nhắt trắng bằng hóa chất AOM - Tiêm truyền AOM dưới da cho chuột với liều 15mg/con/lần/tuần x 2 tuần. - Cho chuột uống 0,2ml dầu Ôliu 1 lần/tuần x 14 tuần để kích thích sự phát triển của u. - 14 tuần sau khi tiêm AOM tiến hành mổ chuột để kiểm tra sự phát sinh u ở đại trực tràng (bằng cách bổ dọc đại trực tràng, rửa bằng dung dịch sinh lý NaCl 0,9%, cố định bằng cồn 70o trong 20 phút, nhuộm xanh methylen 0,04% ở 4 0C trong 15 phút sau đó quan sát dưới kính lúp và chụp ảnh). Nghiên cứu mô bệnh học ruột chuột dưới tác dụng của IL2 - Gây ung thư thực nghiệm đường ruột cho chuột bằng hóa chất AOM. - 30 ngày sau khi truyền hóa chất, chuột Việt Nam điều trị bằng chế phẩm IL2 (của Việt Nam và Trung quốc) theo phác đồ sau:

• Chuột được điều trị cách tuần trong hai đợt, mỗi đợt cách nhau 30 ngày. • Đợt I : Tiêm dưới da IL2 liều 600000 IU/ kg/ lần x 5 lần/ tuần x 5 tuần

Song song với điều trị bằng IL2, chuột được uống dầu Oliu với liều 0,2 ml/con/lần/tuần x 14 tuần.

• Đợt II: tiếp tục điều trị như đợt I nhưng ngừng cho chuột uống dầu Oliu.

- Tuần thứ 40 sau khi truyền hóa chất, chuột được mổ để:

• Lấy ruột làm tiêu bản hiển vi mô bệnh học theo kỹ thuật thường quy. Quan sát tiêu bản và chụp ảnh dưới kính hiển vi Olympus BH2 với hệ thống chụp ảnh tự động.

• Quan sát các nốt di căn lên gan (nếu có). • Lấy máu để xét nghiệm công thức bạch cầu.

Nghiên cứu hoạt tính kháng u báng của IL2 - Gây u báng thực nghiệm trong xoang bụng cho 120 chuột: 106 TBUT Sarcoma 180 được cấy truyền vào xoang bụng mỗi chuột. - Hai ngày sau cấy truyền ung thư, các chuột ở lô thí nghiệm được tiêm (i.p cách nhật) chế phẩm IL2 tái tổ hợp của Việt nam và Trung quốc, liều 600.000 IU/kg với lượng 0,2ml/con x 4 lần . - Ngày thứ 14 sau cấy truyền tiến hành mổ chuột để khảo sát các chỉ tiêu nghiên cứu sau :

• Sinh khối u: là thể tích tế bào ung thư phát triển trong xoang bụng chuột sau ly tâm (ml). • Tỷ số phát triển u (%) :

Sinh khối trung bình của u ở lô thí nghiệm

GR = --------------------------------------------------- x 100% Sinh khối trung bình của u ở lô đối chứng • Tỷ số ức chế u (%): IR = (100 - GR) x 100% • Đánh giá hiệu lực kháng u của các chế phẩm theo thang H.Itokawa (1989): GR từ 0 đến 10% (+++), từ 11 đến 40% (++), từ 41 đến 70% (+), trên 70% (-).

- Làm tiêu bản hiển vi quang học và hiển vi điện tử để đánh giá tác động của IL2 lên hình thái cấu trúc của tế bào u báng Sarcoma 180 Nghiên cứu thời gian sống thêm của chuột ung thư được điều trị bằng IL2 - Gây u báng thực nghiệm trong xoang bụng cho 30 chuột và điều trị bằng các chế phẩm IL2. Số chuột trên được chia làm 3 lô: Lô đối chứng ung thư và 2 lô điều trị bằng IL2 của TQ và VN - Ngày thứ 14 sau cấy truyền không tiến hành mổ chuột mà tiếp tục theo dõi và ghi nhật kí thời gian sống của chuột ở các lô cho đến ngày thứ 40.

Thực hiện từ 01/2005 – 06/2007

Báo cáo tóm tắt Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

- Xác định thời gian sống trung bình (ngày) của chuột ở mỗi lô và tính thời gian sống kéo dài thêm của chuột (ILS%) ở các lô được điều trị bằng IL2:

3.8.2. Kết quả nghiên cứu Gây ung thư thực nghiệm đường tiêu hóa cho chuột nhắt trắng bằng hóa chất AOM i) Tỷ lệ phát sinh u ở ruột chuột dưới tác dụng của hóa chất AOM - 10 chuột khỏe mạnh được dùng làm đối chứng sinh học - 108 chuột được tiêm hóa chất AOM để gây ung thư đường tiêu hóa, trong đó:

• 46 chuột được dùng làm đối chứng ung thư, trong số này 15 con được mổ ở tuần thứ 14 để xác định tỷ lệ phát sinh u. 31 con còn lại tiếp tục nuôi đến tuần thứ 40 để làm đối chứng ung thư về mô bệnh học. 31 con được điều trị bằng IL2 tái tổ hợp của Trung Quốc. 31 con được điều trị bằng IL2 tái tổ hợp của Việt nam (do Viện CNSH sản xuất) - Kết quả về tỷ lệ phát sinh u ở ruột chuột thu được sau 14 tuần kể từ khi tiêm AOM là 50%. Khối u là những tổn thương tiền ác tính niêm mạc ruột (ACF) sẽ dẫn tới ung thư. Kết quả được minh họa trên các hình 34, 35, 36, 37.

Kết quả xác định số lượng u/ ruột một con chuột ở tuần thứ

40 sau khi tiêm AOM (bảng 6).

Bảng 6. Số trung bình của u ở ruột 1 chuột trong các lô thí nghiệm

Lô thí nghiệm

Số chuột có u

Số lượng chuột TN

1 2 3 4

Đối chứng sinh học Đối chứng ung thư Điều trị bằng IL2 TQ Điều trị bằng IL2 VN

10 31 31 31

Số lượng 2 22 24 23

(%) 20 71 77 74

Trung bình số u/ruột 1 chuột 1,5 ± 0,5 4,4 ± 0,3 4,8 ± 0,5 4,8 ± 0,4

Bảng 6 cho thấy có 2/10 (20%) chuột khỏe mạnh xuất hiện 1 đến 2 u ở đoạn ruột già từ manh tràng đến trực tràng (trung bình 1,5 ± 0,5 u/ruột 1 chuột). Còn ở các chuột được tiêm AOM thì có tới 71 đến 77% số chuột có u. Điều đó chứng tỏ quy trình gây ung thư đường ruột bằng hóa chất AOM tại phòng thí nghiệm của chúng tôi đã đạt được kết quả như mục tiêu của đề tài đặt ra. Tuy nhiên không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về trung bình số u/ruột 1 chuột giữa các lô thí nghiệm điều trị bằng IL2 của Trung quốc và Việt Nam so với lô đối chứng ung thư sau 40 tuần thí nghiệm. Để làm rõ thêm ảnh hưởng của AOM đến sự phát sinh u ở đường ruột của chuột thí nghiệm, chúng tôi tiến hành khảo sát về mô bệnh học.

Hình 34. Niêm mạc đại tràng chuột nhắt trắng bình thường (Chụp dưới kính lúp)

Hình 36. Niêm mạc đại tràng chuột nhắt trắng bình thường (Chụp dưới kính hiển vi)

Hình 35. Niêm mạc đại tràng chuột nhắt trắng bị ung thư (1) , (2) ,(3), (4) là các u xuất hiện sau 14 tuần tiêm AOM (Chụp dưới kính lúp)

Hình 37. Niêm mạc đại tràng chuột nhắt trắng bị ung thư (1) Vùng bị ung thư, (2) Vùng bình thường (Chụp dưới kính hiển vi)

Thực hiện từ 01/2005 – 06/2007

Báo cáo tóm tắt Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

ii) Nghiên cứu mô bệnh học ruột chuột thí nghiệm

Kết quả nghiên cứu mô bệnh học ruột chuột thí nghiệm được trình bày, chú giải và

nhận xét trên các hình 38, 39, 40, 41.

Trên các tiêu bản hiển vi mô ruột chúng tôi không phát hiện được sự sai khác về hình thái tế bào và mô giữa các lô chuột ung thư được điều trị bằng IL2 so với lô đối chứng ung thư. Có thể chế phẩm IL2 tái tổ hợp không có tác dụng đối với loại ung thư đường ruột nói trên. Do vậy chúng tôi quyết định thử hoạt tính kháng u của IL2 tái tổ hợp lên một mô hình ung thư khác - là mô hình ung thư báng Sarcoma 180

Hình 40. Tế bào biểu mô niêm mạc bị giải biệt hóa, đang chuyển dạng thành ung thư, có nhân lớn và tăng sắc do bắt màu kiềm đậm (PĐ: 100 x 10)

Hình 39. Tiêu bản hiển vi mô bệnh học lông nhung ruột chuột nhắt trắng bị ung thư dưới tác động của AOM: Các tế bào mất biệt hoá, nhân bắt màu đậm, phân bố lộn xộn ( PĐ: 60 x 10

Hình 41. Tế bào mô liên kết ở lõi lông nhung bị giải biệt hóa, phân bố lộn xộn, đang chuyển dạng thành ung thư, có nhân lớn và tăng sắc (PĐ: 100 x 10) a - Các tế bào biểu mô không còn hình trụ điển hình b - Các tế bào biểu mô liên kết ở lõi lông nhung mất dạng hình thoi

Hình 38. Tiêu bản hiển vi mô học lông nhung ruột chuột nhắt trắng bình thường: Các tế bào biểu mô hình trụ đơn lớp xếp sát nhau, các tế bào lõi lông nhung có dạng hình thoi (thuộc mô liên kết)(PĐ:100 x 10) iii) Về hiện tượng di căn Khi mổ chuột vào tuần thứ 40 sau tiêm hóa chất AOM, chúng tôi quan sát gan của toàn bộ chuột bị ung thư đường ruột nhưng không phát hiện thấy các nốt di căn tới cơ quan này. Có lẽ thời gian 40 tuần đối với ung thư thực nghiệm đường ruột là còn quá ngắn, khối u chưa đủ độ "chín muồi" để xảy ra hiện tượng di căn vì theo Valhalla, 1999 gây ung thư bằng AOM phải mất 52 tuần mới có di căn. iv) Công thức bạch cầu của máu ngoại vi ở chuột thí nghiệm Máu của chuột ở các lô thí nghiệm đã được lấy vào các ống nghiệm có chứa chất chống đông Heparin để phân tích thành phần bạch cầu. Thí nghiệm này đã không có kết quả do máu bị đông trước khi đưa vào máy phân tích. Có thể do chất lượng của Heparin đã không đạt yêu cầu. Chúng tôi đã không lặp lại được thí nghiệm này do thời gian (40 tuần) cũng như kinh phí không cho phép. Nghiên cứu hoạt tính kháng u báng Sarcoma 180 của IL2. i) Gây u báng Sarcoma 180 cho chuột nhắt trắng Swiss Để có mô hình u báng thực nghiệm, 120 chuột nhắt đực trắng dòng Swiss 8 tuần tuổi, trọng lượng trung bình 20 ± 1 gam được cấy truyền 106 TB vào xoang bụng 1 chuột, sau đó chia lô thí nghiệm. Kết quả 100% chuột ở lô đối chứng có u báng, thấy rõ bụng báng vào ngày thứ 4-5 sau cấy truyền (Xem hình 42)

Thực hiện từ 01/2005 – 06/2007

Báo cáo tóm tắt Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

Hình 42. Chuột nhắt trắng Swiss khoẻ mạnh (a) và mang u báng Sarcoma 180 sau 12 ngày cấy truyền (b)

ii) Tiêm chế phẩm IL tái tổ hợp

ĐCUT (Tiêm NaCl 0,9%)

Tiêm IL2 của VN

Tiêm IL2 của TQ

Hai ngày sau cấy truyền ung thư, các chuột ở lô thí nghiệm được Việt Nam) chế phẩm IL2 tái tổ hợp của Việt Nam và Trung quốc liều 600000UI/kg với lượng 0,2 ml/ con x 4 lần, cách nhật. Đến ngày thứ 14 sau cấy truyền, tiến hành mổ chuột để khảo sát các chỉ tiêu nghiên cứu. iii) Xác định các chỉ tiêu nghiên cứu Sinh khối u, tỷ số phát triển và tỷ số ức chế u được trình bày trên bảng 7 và các hình 43, 44, 45.

Hình 44. Sự giảm sinh khối u báng Sarcoma 180 dưới tác động của IL2 tái tổ hợp

Hình 43 Ảnh minh họa sinh khối tế bào ung thư Sarcoma 180: Đối chứng ung thư (1), Tác động của IL2 VN (2), Tác động của IL2 TQ (3)

GR%

120%

100%

-

80%

a w k o t i .

+

60%

40%

++

20%

h n í t t ạ o h á i g h n á đ g n a h T

H a ủ c u g n á h k

++

IL2.TQ

IL2.VN

§CUT

L« thÝ nghiÖm

Hình 45. Biểu đồ so sánh tỷ số phát triển u giữa các lô thí nghiệm

- Chế phẩm IL2 VN đạt hiệu lực kháng u (+). - Chế phẩm IL2 TQ đạt hiệu lực kháng u (++).

(Theo thang đánh giá hoạt tính kháng u của H.ITOKAWA, 1989)

Thực hiện từ 01/2005 – 06/2007

Báo cáo tóm tắt Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

Bảng 7. Định lượng các khối u báng Sarcoma 180 khi mổ chuột thí nghiệm

GR (%)

IR (%)

Lô thí nghiệm

Sinh khối TBUT (ml) TB 4,6

100

Thể tích mỗi u (ml) TB 7,3

ĐCUT (10 con)

3,3

2,6

56,5

43,5

Tiêm (ip) IL2 VN liều 600.000 IU/kg x 4

2,0

1,4

30,4

69,6

Tiêm (ip) IL2 TQ liều 600.000 IU/kg x 4

số ml/con 5,5 4,1 4,8 4,2 4,3 4,2 4,6 4,7 4,4 5,1 2,0 2,5 2,5 0,0 4,5 0,0 3,5 1,5 4,0 0,8 2,5 0,0 4,5 3,2 2,0 1,5 0,0 0,0 0,0 0,0

Số ml/con 8,0 6,2 7,4 7,0 8,0 8,0 6,4 7,2 8,1 7,9 3,0 3,5 4,0 0,0 7,8 0,0 5,7 2,5 5,0 1,6 3,5 0,0 6,5 3,4 3,7 2,5 0,0 0,0 0,0 0,0 iv) Hình ảnh tế bào ung thư Sarcoma 180

Hình 47. Tế bào ung thư báng Sarcoma 180 ở lô tiêm chế phẩm IL2 VN

Hình 48. Tế bào ung thư báng Sarcoma 180 dưới tác động của chế phẩm IL2 TQ Tế bào bị chết theo kiểu hoại thư (Necrosis) (n).

Hình 46. Tế bào ung thư báng Sarcoma 180 ở lô đối chứng Tế bào hình cầu, tỷ lệ nhân/tế bào chất lớn, trong tế bào có những giọt lipit làm giảm trọng lượng của tế bào và thích nghi với đời sống trôi nổi trong thể dịch.

Thực hiện từ 01/2005 – 06/2007

Báo cáo tóm tắt Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

Hình 49. Tế bào ung thư báng Sarcoma 180 bình thường dưới kính hiển vi điện tử truyền qua (x10.000). N - Nhân, HN - Hạch nhân, TBC - Tế bào chất, L - Lipid, M - Màng tế bào

Hình 50. Tế bào ung thư báng Sarcoma 180 dưới tác động của IL2 VN (x10.000) Tế bào chết theo kiểu hoại thư. N - Nhân - bị phân cắt, chất nhiễm sắc bắt màu đậm và dính vào màng nhân; HN - Hạch nhân, TBC - Tế bào chất - đang tan rã, L - Lipid, LT - Lông tơ

Hình 51. Tế bào u báng Sarcoma 180 dưới tác động của IL2 TQ (x10.000) N - Nhân - bị phân thành nhiều thùy, NSC - Nhiễm sắc chất - tập trung thành từng khối lớn bám sát màng nhân, HN - Hạch nhân, TBC - Tế bào chất - bị tan rữa dần, M - Màng tế bào lồi lõm, mn - màng nhân - tách dần khỏi tế bào chất (khe sáng), LT - lông tơ. Tế bào có xu hướng chết theo kiểu chỉ còn nhân trần (nude).

v) Kết quả theo dõi thời gian sống thêm của chuột ung thư được điều trị bằng IL2 Kết quả theo dõi thời gian sống thêm của chuột bị ung thư dưới tác dụng điều trị của IL2 được ghi chép hàng ngày, tính thời gian sống trung bình, tỷ lệ sống sót và thời gian sống thêm được trình bày trên bảng 8 và hình 52.

Bảng 8. Tác động của chế phẩm IL2-TQ và IL2-VN lên thời gian sống thêm của chuột nhắt trắng Swiss mang u báng Sarcoma 180

STT chuột

Lô ĐCUT

Lô IL2- Việt Nam

Ngày sống 19 20 20 20 22 23 24 25 27 30 23 0

% sống sót 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

Lô IL2- Trung Quốc Ngày sống 21 23 23 24 25 25 25 32 35 40 27,3 18,6

% sống sót 90 80 70 60 50 40 30 20 10 10

Ngày sống 24 29 29 29 38 39 40 40 40 40 34,8 51,3

% sống sót 90 80 70 60 50 40 40 40 40 40

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 TB (ngày) ILS%

Thời gian sống của các lô chuột thí nghiệm

Hình 52. Đồ thị biểu diễn thời gian sống thêm của các

120

lô chuột thí nghiệm

100

§CUT

IL2-TQ

IL2-VN

số ngày

19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39

- Lô đối chứng ung thư sau 30 ngày chuột bị chết hết. - Lô tiêm IL2 Trung Quốc sau 35 ngày vẫn còn sống sót 10%. - Lô tiêm IL2 Việt Nam sau 39 ngày vẫn còn sống sót 40%.

Qua trên ta thấy IL2 Việt Nam tuy làm giảm sinh khối u ít hơn IL2 Trung quốc nhưng lại có tác dụng kéo dài thời gian sống thêm của chuột ung thư được điều trị bằng IL2-VN nhiều hơn

Thực hiện từ 01/2005 – 06/2007

Báo cáo tóm tắt Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

IL2-TQ. Kết quả nghiên cứu bước đầu này cho ta một ấn tượng tốt về IL2-VN, nhưng chưa rõ cơ chế, cần nghiên cứu thêm. 3.9. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG IL-2 Mỗi thử nghiệm được thực hiện 3 lần. Kết quả dưới đây là trung bình cộng của 3 lần thực hiện: 3.9.1. Hiệu giá của sản phẩm IL-2

- Mẫu số 1: 427 đvqt/ ml, tương đương 0,43% so với mẫu đối chứng, không đạt yêu cầu về

hiệu giá.

- Mẫu số 2: 3000 đvqt/ ml, tương đương 3% so với mẫu đối chứng, không đạt yêu cầu về hiệu giá. - Mẫu số 3: 98.470 đvqt/ ml, tương đương 98,5% so với mẫu đối chứng, đạt yêu cầu về

hiệu giá.

3.9.2. Tính vô trùng của sản phẩm IL-2

- Mẫu số 1: Sau 14 ngày không có vi khuẩn và vi nấm mọc, đạt yêu cầu về vô trùng. - Mẫu số 2: Sau 14 ngày không có vi khuẩn và vi nấm mọc, đạt yêu cầu về vô trùng. - Mẫu số 3: Sau 14 ngày không có vi khuẩn và vi nấm mọc, đạt yêu cầu về vô trùng.

3.9.3. Tính an toàn của sản phẩm IL-2

- Mẫu số 1: Trong 7 ngày theo dõi, chuột xù lông, tuy có tăng trọng không đạt yêu cầu về

an toàn.

- Mẫu số 2: Trong 7 ngày theo dõi, chuột khỏe mạnh và tăng trọng, đạt yêu cầu về an toàn. - Mẫu số 3: Trong 7 ngày theo dõi, chuột khỏe mạnh và tăng trọng, đạt yêu cầu về an toàn.

3.9.4. Chất gây sốt của sản phẩm IL-2

- Mẫu số 1: Tổng nhiệt độ chênh lệch của 3 thỏ là 7,3 C, không đạt yêu cầu về chất gây sốt - Mẫu số 2: Tổng nhiệt độ chênh lệch của 3 thỏ là 4,5 C, không đạt yêu cầu về chất gây sốt - Mẫu số 3: Tổng nhiệt độ chênh lệch của 3 thỏ là 1,10C, đạt yêu cầu về chất gây sốt

3.9.5. Tính chất lý hóa của sản phẩm

(cid:153) Mẫu số 1:

- Dung dịch trong suốt, không màu, pH 7,3 - Không có chất thimerosal bảo quản - Không có protein ngoại lai - Đạt yêu cầu về tính chất lý hóa

(cid:153) Mẫu số 2:

- Dung dịch trong suốt, không màu, pH 7,2 - Không có chất thimerosal bảo quản - Không có protein ngoại lai - Đạt yêu cầu về tính chất lý hóa

(cid:153) Mẫu số 3:

- Dung dịch trong suốt, không màu, pH 7,1 - Không có chất thimerosal bảo quản - Không có protein ngoại lai - Đạt yêu cầu về tính chất lý hóa

Trong số 3 mẫu rhIL2MN được tiến hành đánh giá thì chỉ có mẫu số 3 đạt tiêu chuẩn về hiệu giá, tính vô trùng, tính an toàn, đạt yêu cầu về tính chất lý hóa và hàm lượng chất gây sốt trong ngưỡng cho phép..

Thực hiện từ 01/2005 – 06/2007

Báo cáo tóm tắt Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

CHƯƠNG 4 TỔNG QUÁT HOÁ VÀ ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ THU ĐƯỢC

4.1. KẾT QUẢ VỀ KHOA HỌC Trong thời gian 30 tháng từ tháng 1/2005 đến hết tháng 6/2007, đề tài KC.04.33 đã thu

được kết quả chính như sau:

01. Đề tài đã tạo được dòng cDNA mang gen IL-2 của người từ RNA tổng số tách từ tế bào lách bằng kỹ thuật RT-PCR. Kết quả xác định trình tự nucleotide của dòng gen này cho thấy có 4 biến đổi về nucleotide đơn so với trình tự NP_000577 đã đăng kí trong Ngân hàng dữ liệu gen quốc tế là A36G, G54T, T74C và C389T. Tuy nhiên chỉ có 2 trong 4 biến đổi nucleotide này làm thay đổi các gốc amino acid tương ứng trong phân tử protein. Đó là thay đổi T74C dẫn đến thay thế leucine ở vị trí 25 bằng serine (L25S) và thay đổi C389T dẫn đến thay thế serine ở vị trí 130 thành leucine (S130L).

02. Bằng kỹ thuật tạo đột biến điểm định hướng nhờ các đoạn oligonucleotid tổng hợp, chúng tôi đã tạo thành công các đột biến điểm của gen IL-2 ở các vị trí: i) làm mất điểm glycosyl hoá bằng đột biến thay thế các gốc amino acid tại điểm nhận biết để glycosyl hóa Alanine-Proline-Threonine tại tận cùng đầu N của phân tử IL-2 thành Alanine-Methionine-Alanine; ii) đột biến gốc Cystein ở vị trí 125 thành Serine để loại bớt khả năng tạo sai cầu disulfide giữa gốc Cystein này với 2 gốc ở vị trí 58 và 105 trong phân tử IL-2; iii) gây hồi biến gốc Serine ở vị trí 25 thành Leucine để protein tái tổ hợp có cấu trúc và hoạt tính sinh học giống với thương phẩm ProleukinRIL-2, từ đó mở ra khả năng thương mại của chế phẩm IL-2 trên thị trường Việt Nam.

03. Với mục đích tìm được hệ biểu hiện thích hợp nhất để có thể tạo ra lượng lớn protein tái tổ hợp có hoạt tính, đề tài đã tiến hành biểu hiện IL-2 trên các hệ khác nhau như trong tế bào E. coli và trong nấm men P. pastoris. Kết quả là chúng tôi đã biểu hiện thành công protein IL-2 tái tổ hợp trong tế bào vi khuẩn E. coli BL21 (DE3) với hệ vector pET32c(+). Kết quả Western blot cho thấy protein lai Trx- rhIL2MN có khả năng bắt cặp đặc hiệu của với kháng thể kháng IL-2, chứng tỏ protein IL-2 tái tổ hợp đã được tổng hợp đúng cấu trúc không gian và có hoạt tính. Ngoài ra chúng tôi cũng đã nhận dạng được rhIL2MN bằng phương pháp khối phổ. Kết quả cho thấy protein nhận được đúng là hIL-2. Chủng vi khuẩn E. coli tái tổ hợp có khả năng tổng hợp IL-2 đạt khoảng 90 mg/L IL-2, cao gấp nhiều lần so với dự tính (40 μg/L). Đối với hệ biểu hiện trong nấm men P. pastoris GS115, chúng tôi đã biểu hiện thành công IL-2 dạng riêng lẻ và protein tái tổ hợp rhIL-2 có kích thước 15,4 kDa. Protein biểu hiện được trong nấm men có khả năng bắt cặp đặc hiệu với kháng thể kháng IL-2 của người.

04. Đề tài đã xây dựng được quy trình lên men đối với các chủng vi vật tái tổ hợp mang gen IL-2 ở quy mô bình tam giác và trong hệ thống lên men 5L và 14L. Các thông số điều khiển quá trình lên men IL-2 trong 2 hệ thống bình lên men Bioflo110 đã được tối ưu để thu được lượng lớn protein tái tổ hợp như pH môi trường 6,0; nhiệt độ 37 oC; sục khí 0,5 vvm (lít khí/ lít môi trường/ phút); tốc độ khuấy 200 vòng/ phút, nhiệt độ cảm ứng là 300C khi OD bắt đầu đạt 0.6. Sản phẩm tích lũy cao nhất ở thời điểm sau khi cảm ứng 5 giờ. Kết quả lên men trong cả hai hệ thống 5 lít và 14 lít đều cho xấp xỉ 70-80 g sinh khối ướt/lít và 192 mg protein lai Trx-IL-2/ lít. Kết quả này mở ra triển vọng cho đề tài có khả năng sản xuất chế phẩm IL-2 ở quy mô công nghiệp.

05. Đã tinh chế thành công protein lai Trx-rhIL2MN với kích thước khoảng 32 kDa bằng phương pháp sắc ký ái lực. Phần rhIL2MN được tách khỏi các thành phần không mong muốn Trx-Stag-Histag

Thực hiện từ 01/2005 – 06/2007

Báo cáo tóm tắt Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

trong cấu trúc protein lai Trx-rhIL2MN bằng cách cắt với enzyme enterokinase và sắc ký ái lực. Protein rhIL2MN thu được có kích thước khoảng 15,4 kDa.

06. Trên mô hình tế bào CTLL-2 nuôi cấy in vitro, chúng tôi đã tiến hành các phép thử sinh học để xác định hoạt tính của chế phẩm IL-2 tái tổ hợp tinh sạch. Kết quả so sánh với sản phẩm IL-2 của Trung Quốc và Hoa Kỳ cho thấy sản phẩm IL-2 có hoạt tính hoạt tính đạt 2,7 x 106 U/mg, tương đương với sản phẩm IL-2 của Trung Quốc 2,9 x 106 U/mg. Hoạt tính của rhIL-2 biểu hiện trong nấm men mặc dù chưa được tinh chế nhưng có hoạt tính khá cao khi thử nghiệm trên dòng tế bào CTTL2 đạt 4 x 106 U/mg.

07. Trên mô hình tế bào động vật, chúng tôi đã tiến hành gây ung thư thực nghiệm trên chuột bằng hoá chất AOM, kết quả thử nghiệm IL-2 của VN và IL-2 của TQ cho thấy IL2 TQ đã làm giảm 69,6% sinh khối u, còn IL2 VN đã làm giảm 43,5% sinh khối u. Khi tiến hành các nghiên cứu về thời gian sống thêm của chuột bị ung thư được điều trị bằng IL-2 cho thấy IL2 TQ có thể làm tăng thời gian sống thêm lên 18,6% so với đối chứng (0%) còn IL2 VN có thể làm tăng thời gian sống thêm lên 51.3% so với đối chứng. Các kết quả nghiên cứu tác động điều trị của IL-2 trên mô hình tế bào động vật đã chứng tỏ chế phẩm IL-2 do Việt Nam sản xuất có hoạt tính và đạt hiệu lực kháng u báng ở chuột bị ung thư.

08. Chế phẩm IL-2 tái tổ hợp do đề tài tạo ra đã được đánh giá đạt yêu cầu về hiệu giá, an

toàn, nồng độ chất chí nhiệt tố trong khoảng cho phép.

4.2. TỔNG HỢP CÁC SẢN PHẨM ĐẠT ĐƯỢC SO VỚI ĐĂNG KÝ

Bảng 9. Các dòng gen và dòng vector tạo ra của đề tài

TT

Đơn vị đo

Tên sản phẩm

Tên sản phẩm và chỉ tiêu chất lượng chủ yếu

1 Gen IL-2 người

Gen

Vectơ

125

Vectơ

Gen mã hóa cho protein IL-2 người Vectơ pET32-rhIL2MM biểu hiện gen IL-2 đột biến mất khả năng glycosyl hoá và chuyển gốc Cys thành Ser125 trong E. coli. Vectơ pET32-rhIL2MN biểu hiện gen IL-2 đột biến chuyển Ser thành Leu ở vị trí 25 trong E. coli

Vectơ

Vectơ pPIC-Trx-rhIL2MN

Vectơ

Vectơ pPICZ-Trx-rhIL2MN

Vectơ

Vectơ pPIC9-rhIL2

6 Vectơ biểu hiện gen IL-2 dạng tự nhiên trong P. pastoris bằng hệ pPIC9

Chủng E. coli biểu hiện gen IL-2 MN trong vector pET32.

Chủng vi sinh vật

Chủng P. pastoris tái tổ hợp có khả năng tổng hợp IL-2MN

Chủng vi sinh vật

IL-2 tái tổ hợp dạng đột biến thương phẩm Proleukin-2

Thực hiện từ 01/2005 – 06/2007

Báo cáo tóm tắt Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

Bảng 10. Sản phẩm khoa học của đề tài

Chỉ tiêu kinh tế - kỹ thuật

TT

Số lượng

Tên sản phẩm đăng ký

Kết quả đạt được

Kế hoạch Quy trình tạo chủng E. coli đạt 40 μg protein/lit.

01 quy trình tạo chủng E. coli biểu hiện gen IL-2 đạt khoảng 90 mg/L IL- 2, cao gấp 2000 lần so với dự kiến.

Quy trình tạo chủng P. pastoris đạt 50 μg protein tái tổ hợp/lit.

01 quy trình tạo chủng P. pastoris tái tổ hợp có khả năng tổng hợp IL-2 đạt khoảng 5 mg/L, cao gấp 100 lần so với dự kiến.

Quy trình tạo chủng E. coli có khả năng tổng hợp IL-2 tái tổ hợp. Quy trình tạo chủng P. pastoris có khả năng tổng hợp IL-2 tái tổ hợp ở dạng ngoại bào.

Quy trình biểu hiện gen IL-2 trong E. coli

oC và thời

Các thông số về điều kiện cảm ứng biểu hiện gen IL-2 trong E. coli.

Quy trình biểu hiện gen IL-2 trong P. pastoris.

Các thông số về điều kiện cảm ứng biểu hiện gen IL-2 trong P. pastoris.

Quy trình lên men chủng E. coli tái tổ hợp.

Các thông số về điều kiện lên men tối ưu đối với chủng E. coli tái tổ hợp.

Quy trình lên men chủng P. pastoris tái tổ hợp.

Các thông số về điều kiện lên men tối ưu đối với chủng P. pastoris tái tổ hợp.

Quy trình tách chiết và tinh chế protein tái tổ hợp từ chủng E. coli. Quy trình công nghệ tổng hợp sản xuất interleukin-2.

Quy trình tách chiết và tinh chế protein tái tổ hợp đủ độ sạch và độ đặc hiệu cao. Quy trình tổng thể về sản xuất IL-2 tái tổ hợp.

01 quy trình biểu hiện gen IL-2 trong E. coli với các điều kiện thích hợp như cảm ứng với nồng độ IPTG 1 mM, nhiệt độ nuôi cấy 30 gian thu mẫu sau 3 giờ cảm ứng. 01 quy trình biểu hiện gen IL-2 trong P. pastoris với điều kiện cảm ứng 0 biểu hiện ở nhiệt độ 30 C, nồng độ methanol 0,5% và thu mẫu sau 72 giờ cảm ứng. 01 quy trình lên men chủng E. coli tái tổ hợp chứa gen IL-2 trong hệ thống lên men Bioflo110 dung tích 5 L và 14 L với các thông số tối ưu cho quá trình lên men như pH môi oC; sục khí trường 6,0; nhiệt độ 37 0,5 vvm (lít khí/ lít môi trường/ phút); tốc độ khuấy 200 vòng/ phút, nhiệt độ cảm ứng là 300C khi OD bắt đầu đạt 0,6. 01 quy trình lên men chủng P. pastoris tái tổ hợp chứa gen IL-2 trong hệ thống lên men Bioflo110 dung tích 5 L và 14 L với các thông số tối ưu cho quá trình lên men như pH môi trường 6,0; nhiệt oC; sục khí 2 vvm (lít khí/ lít độ 30 môi trường/ phút); tốc độ khuấy 200 vòng/ phút, nhiệt độ cảm ứng là 300C khi OD bắt đầu đạt 1. 01 quy trình tách chiết và tinh chế protein tái tổ hợp từ chủng E. coli đạt độ tinh sạch 99% và đặc hiệu với kháng thể kháng IL-2 của người. 01 quy trình tổng thể sản xuất IL-2 tái tổ hợp trong tế bào E. coli và P. pastoris

Thực hiện từ 01/2005 – 06/2007

Báo cáo tóm tắt Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

Các thông số về tác dụng của IL-2 đối với động vật thực nghiệm.

Phương pháp nghiên cứu tác động của IL-2 tái tổ hợp lên động vật thực nghiệm và trên tế bào CTLL-2 nuôi cấy in vitro.

Đánh giá chất lượng IL-2 tái tổ hợp theo tiêu chuẩn quốc tế.

Chế phẩm IL-2 an toàn, không có chất gây sốt, đảm bảo điều kiện vô trùng.

200 mg

Interleukin-2 tái tổ hợp dạng đột biến thương phẩm Proleukin-2.

Độ tinh khiết đạt 99%. Liều lượng đủ để thử nghiệm với 10 bệnh nhân ung thư đường tiêu hóa giai đoạn muộn pha II.

40 μg IL-2/L

Chủng E. coli mang gen IL-2

1 chủng

50 μg IL-2/L

Chủng P. pastoris mang gen IL-2

1 chủng

14 Đào tạo

02 thạc sỹ 06 cử nhân

15 Bài báo

Trong nước: 3-5 bài Nước ngoài: 1-2 bài

Tổng kết và đánh giá đề tài

Được hội đồng khoa học chấp nhận.

01 phương pháp nghiên cứu tác động của IL-2 tái tổ hợp lên động vật thực nghiệm và 01 phương pháp nghiên cứu tác động của IL-2 tái tổ hợp trên tế bào CTLL-2 nuôi cấy in vitro. Trung tâm Quốc gia kiểm định vacxin đã đánh giá chế phẩm IL-2 đạt tiêu chuẩn về hiệu giá, tính vô trùng, tính an toàn, đạt yêu cầu về tính chất lý hóa và hàm lượng chất gây sốt trong ngưỡng cho phép. Đã tổng hợp đủ 200 mg IL-2 tái tổ hợp đạt độ tinh khiết 99% để đưa đi thử nghiệm trên động vật thực nghiệm, trên tế bào CTLL-2 nuôi cấy in vitro và đánh giá chất lượng IL-2. 01 chủng E. coli mang gen IL-2 đạt hiệu suất 90 mg IL-2/L 01 chủng P. pastoris mang gen IL- 2 đạt hiệu suất 5 mg IL-2/L, tăng 100 lần so với đăng ký. - 3 thạc sỹ (sẽ bảo vệ trong năm 2007 và 2008) - 3 cử nhân - 2 kỹ thuật viên nâng cao trình độ. - Trong nước: đã đăng 5 bài, sẽ đăng thêm 2 bài và đã đăng ký Bằng độc quyền giải pháp hữu ích. Báo cáo tổng kết đề tài đã được hội đồng nghiệm thu cấp cơ sở chấp nhận.

4.3. TRÌNH ĐỘ CÔNG NGHỆ

1. Trong quá trình thực hiện đề tài trình độ công nghệ về phân lập và biểu hiện gen trong các hệ biểu hiện khác nhau như trong E. coli, trong nấm men P. pastoris của cán bộ tham gia đề tài đã đạt trình độ quốc tế.

2. Lần đầu tiên ở Việt Nam đã hoàn thiện được các quy trình biểu hiện, lên men, tách chiết, tinh chế IL-2 tái tổ hợp từ các chủng vi khuẩn và nấm men. Đây là cơ sở quan trọng để xây dựng được quy trình công nghệ tổng hợp sản xuất IL-2 tiến tới phục vụ cho việc sản xuất chế phẩm IL-2 tái tổ hợp trên quy mô công nghiệp ở nước ta.

3. Các phương pháp nghiên cứu sử dụng trong đề tài từ khâu phân lập gen, đến biểu hiện, thu hồi và tinh chế, nghiên cứu tác động của IL-2 tái tổ hợp lên mô hình động vật thí nghiệm và trên tế bào CTLL-2 nuôi cấy in vitro đều đạt trình độ quốc tế, các số liệu, hình ảnh và bảng biểu báo cáo được đưa ra là đáng tin cậy.

Thực hiện từ 01/2005 – 06/2007

Báo cáo tóm tắt Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

4. Các kết quả nghiên cứu thu được của đề tài khẳng định trình độ của các cán bộ nghiên cứu khoa học nước ta trên lĩnh vực công nghệ sinh học hiện đại ngang tầm với các nước trong khu vực và trên thế giới. Các kết quả khoa học của đề tài không chỉ có ý nghĩa khoa học mà còn có ý nghĩa thực tiễn cao, góp phần phục vụ cho nền y học của Việt Nam trong tương lai.

4.4. KHẢ NĂNG ÁP DỤNG Chế phẩm Interleukin-2 do đề tài tạo ra tại Viện CNSH đã được chứng minh là có hoạt tính tương đương với sản phẩm nước ngoài. Điều này mở ra triển vọng sản xuất và ứng dụng chế phẩm này trong việc điều trị bệnh ung thư đối với các bệnh nhân ở Việt Nam. 4.5. ĐÀO TẠO

Bảng 11. Danh sách các học viên được đào tạo

TT Năm

Họ và tên

Tên luận án

Bậc đào tạo

Đào tạo thạc sỹ

Lê Thị Thanh

Thạc sỹ

2005- 2007

Vũ Minh Đức

Thạc sỹ

Đặng Trần Hoàng

Thạc sỹ

2006- 2008 2006- 2008 Đào tạo cử nhân

2006

Cử nhân

Nguyễn Lê Hải Ly

2006

Vũ Đình Quang

Cử nhân

2006

Kiều Thị Thu Hà

Cử nhân

Bảng 12. Danh sách các cán bộ được nâng cao trình độ

TT

Họ và tên

Nội dung đào tạo

Cơ quan

Thời gian đào tạo

2005-2007

Nguyễn Thị Nga

Viện CNSH

2005-2007

Nguyễn Thị Trang

Viện CNSH

Nâng cao kỹ thuật làm Bioassay và nuôi cấy tế bào động vật invitro Nâng cao kỹ thuật làm Bioassay và nuôi cấy tế bào động vật invitro

Thực hiện từ 01/2005 – 06/2007

Báo cáo tóm tắt Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

4.6. HỢP TÁC QUỐC TẾ

Bảng 13. Danh sách các cơ quan hợp tác quốc tế

Tên đối tác

Nội lai tác

Cơ quan Viện CNSH

- Biomedical Center, Fermentation Pilot Plant of Uppsala University, Sweden. Viện CNSH GS. J.M. Pezzuto, trường Đại

học Hawaii, Hoa kỳ

- Hợp tác nghiên cứu công nghệ lên men các chủng vi sinh tái tổ hợp và thu hồi sản phẩm. - Cung cấp dòng tế bào CTLL-2 để thử nghiệm hoạt tính sinh học của IL- 2 tái tổ hợp

4.7. TÌNH HÌNH SỬ DỤNG KINH PHÍ Tổng kinh phí SNKH: 2 100 000 000 đồng (Hai tỷ một trăm triệu đồng) Kinh phí đề tài đã nhận: - Năm 2005: 1 450 000 000 đồng - Tháng 1/ 2006 - 6/2007: 550 000 000 đồng Tổng kinh phí đã quyết toán: 2 000 000 000 đồng

Bảng 14. Kinh phí phân bổ cho các hạng mục

Hạng mục chi

Số tiền(đồng)

Ghi chú (*) theo biểu HĐ5 số CV 204/cnsh ngày 7/6/2007 và quyết định số 1202/QĐ- BKHCN ngày 03/7/07

STT 1 2 3 4 5

Thuê khoán chuyên môn Nguyên vật liệu + Năng lượng Sửa chữa nhỏ Thiết bị máy móc Chi phí khác

Mục 114 () 102+119 117 145 102+111+112() +115+134

493 000 000 1 312 904 700 10 500 000 21 000 000 162 595 300 2 000 000 000

Tổng

4.8. DANH SÁCH CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ

1. Đặng Trần Hoàng, Vũ Minh Đức, Phùng Thu Nguyệt, Trương Nam Hải (2005), Biểu hiện gen Interleukin-2 của người bị đột biến tại các điểm glycosyl hóa và gốc Cys 125 trong E. coli. Tạp chí Công nghệ sinh học 3(2): 149-154

2. Đặng Trần Hoàng, Bùi Thị Huyền, Vũ Minh Đức, Đặng Thành Nam, Trần Thị Hường, Nguyễn Hồng Thanh, Phan Văn Chi, Trương Nam Hải (2005), Biểu hiện gen mã hóa Interleukin-2 của người (rh-IL2MN) trong E. coli bằng hệ pET32 và nhận dạng protein tái tổ hợp bằng phương pháp khối phổ. Tạp chí Công nghệ sinh học 3(4): 439-444.

3. Vũ Minh Đức, Nguyễn Tiến Minh, Đặng Trần Hoàng, Trần Thị Hường, Nguyễn Hồng Thanh, Đinh Duy Kháng, Trương Nam Hải (2005) Gây hồi biến thay thế Ser25 thành Leu và biểu hiện protein lai Thioredoxin rhInterleukin-2 (Trx-rhIL2MN) trong P. pastoris. Tạp chí Công nghệ sinh học 3(4): 445-452.

Thực hiện từ 01/2005 – 06/2007

Báo cáo tóm tắt Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

4. Trần Thị Hường, Nguyễn Hồng Thanh, Đặng Trần Hoàng, Vũ Minh Đức, Phạm Thị Bích Hợp, Trương Nam Hải (2006) Nghiên cứu điều kiện biểu hiện Interleukin-2 của người trong chủng E. coli BL21. Tạp chí Công nghệ sinh học 4(2): 1-8.

5. Nguyễn Nam Long, Nguyễn Bích Nhi, Phan Văn Chi (2005) Tách dòng gen mã hóa

Interleukin-2 của người. Tạp chí Y học Việt Nam, 310 (5): 26-30.

6. Đỗ Thị Thảo, Đỗ Thị Phương, Vũ Minh Đức, Đặng Trần Hoàng, Trương Nam Hải (2006) Xác định hoạt tính sinh học của Interleukin 2 (IL-2) tái tổ hợp bằng phép thử sinh học trên tế bào CTLL2. Đã gửi đăng ở Tạp chí Công nghệ sinh học.

7. Trần Công Yên, Nguyễn Thị Quỳ, Lê Thị Thanh, Bùi Thị Vân Khánh, Kiều Thị Thu Hà, (2007) Nghiên cứu hoạt tính chống ung thư của Interleukin-2 tái tổ hợp trên mô hình ung thư thực nghiệm in vivo. Sẽ gửi đăng trong tạp chí Sinh học số đặc biệt về Hội nghị Khoa học Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong Khoa học Sự sống năm 2007.

8. Đã đăng ký Bằng độc quyền giải pháp hữu ích về “Chủng vi khuẩn tái tổ hợp có khả năng tổng hợp Interleukin-2 của người” tại Cục sở hữu trí tuệ, Bộ Khoa học và Công nghệ (tháng 10/2006).

4.9. HẠN CHẾ CỦA ĐỀ TÀI

Với sự cố gắng nỗ lực của tập thể các cán bộ nghiên cứu, đề tài đã hoàn thành được hầu hết các nội dung nghiên cứu trong thuyết minh và hợp đồng nghiên cứu. Các kết quả thu được của đề tài có ý nghĩa quan trọng trong việc triển khai sản xuất và ứng dụng chế phẩm IL-2 trong điều trị cho các bệnh nhân ung thư. Tuy nhiên, do thời gian quá ngắn và kinh phí được cung cấp rất muộn nên việc thực hiện đề tài đã gặp một số khó khăn ảnh hưởng đến việc thực hiện các nội dung đã đăng ký. Vì vậy, một số nội dung của đề tài đã được điều chỉnh so với đăng ký ban đầu. Kết quả đạt được của đề tài mới chỉ là bước đầu, vì vậy một số nội dung của đề tài vẫn cần phải được tiếp tục nghiên cứu để hoàn thiện.

Dưới đây là bảng tóm tắt các nội dung đã thực hiện theo đăng ký ban đầu và một số nội

dung xin điều chỉnh.

Bảng 15. Tóm tắt các nội dung công việc thực hiện và nội dung xin điều chỉnh

Các nội dung xin điều chỉnh

TT

Nội dung đăng ký (theo thuyết minh đề tài 01/2005)

1 Tạo dòng gen IL-2 2 Tạo đột biến gen IL-2

Không Không

Không

Xin điều chỉnh chưa thực hiện

6 Xây dựng công nghệ thu hồi, bảo quản và đóng

Không

gói chế phẩm IL-2 Thử nghiệm IL-2 trên mô hình tế bào nuôi cấy CTLL-2 và động vật thí nghiệm

Không

Xin điều chỉnh chưa thực hiện

8 Đánh giá chất lượng IL-2 theo tiêu chuẩn quốc tế Nghiên cứu và thử nghiệm khả năng sử dụng IL- 2 tái tổ hợp trong điều trị các bệnh ung thư đường tiêu hoá giai đoạn muộn tại bệnh viện K

Thực hiện từ 01/2005 – 06/2007

Báo cáo tóm tắt Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

Trong quá trình thực hiện đề tài chúng tôi có đề nghị điều chỉnh một số nội dung đăng ký

ban đầu, cụ thể như sau:

- Không thực hiện tiếp phần tạo chủng nấm men mang gen Trx-rhIL2MN: lý do là sau khi biểu hiện trong nấm men protein lai Trx-rhIL2MN bị protease của tế bào nấm men phân hủy do đó không thể sử dụng chủng nấm men này để tổng hợp Il-2 và thực hiện các bước tiếp theo như lên men và tinh chế sản phẩm nhận được. Sự điều chỉnh này đã được Bộ KH&CN chấp thuận trong đợt kiểm tra định kỳ vào cuối năm 2005 (Báo cáo định kỳ HD5 (kỳ I) ngày 27/11/2005 đã được Bộ KH&CN phê duyệt).

- Do thời gian thực hiện đề tài chỉ có 30 tháng nên đề tài chưa kịp thực hiện trọn vẹn 2 nội dung là “Xây dựng công nghệ thu hồi, bảo quản và đóng gói chế phẩm IL-2” và “Nghiên cứu và thử nghiệm khả năng sử dụng IL-2 tái tổ hợp trong điều trị các bệnh ung thư đường tiêu hoá giai đoạn muộn tại bệnh viện K”. Hồ sơ xin phép Hội đồng Y đức của Bộ Y tế và thử nghiệm chế phẩm IL-2 trên các bệnh nhân đòi hỏi thời gian rất lâu, ít nhất là 1 năm nên đề tài không thể thực hiện kịp. Việc điều chỉnh này đã được Bộ KH&CN chấp nhận (Quyết định số 1202/QĐ-BKHCN ký ngày 03/07/2007 của Bộ KH&CN). Phần kinh phí (100 triệu đồng) để thực hiện các nội dung này đã được hoàn trả lại ngân sách.

- Theo kế hoạch đề tài định tổ chức đi tham quan và học tập tại CHLB Đức, nhưng đã tổ chức đi sang Công ty sản xuất IL-2 tại thành phố Thẩm Dương, Tỉnh Liêu Ninh Trung Quốc. Bộ KH&CN đã chấp thuận điều chỉnh này (Quyết định số 1202/ QĐ-BKHCN ký ngày 03/07/2007 của Bộ KH&CN).

Thực hiện từ 01/2005 – 06/2007

Báo cáo tóm tắt Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

5.1. KẾT LUẬN Đề tài đã đạt được các kết quả sau: - Phân lập được gen mã hóa cho protein IL-2 người từ ARN tổng số tách từ tế bào lách

người bằng kỹ thuật RT-PCR.

- Đã thành công trong việc tạo gen IL-2 đột biến mất khả năng glycosyl hoá tại đầu N và mất 1 gốc Cys ở vị trí 125 để hạn chế việc tạo sai cầu disulfide trong phân tử Il-2. Hồi biến thành công đột biến Ser ở vị trí 25 thành Leu trong dòng gen IL-2 phân lập từ bệnh nhân Việt Nam.

- Thiết kế thành công vector pET32-rhIL2MN chứa gen IL-2 đột biến để biểu hiện

trong E. coli

- Thiết kế thành công vectơ pPIC-rhIL2MN để biểu hiện IL-2 dạng riêng lẻ trong nấm

men P. pastoris

- Đã tạo thành công chủng E. coli tái tổ hợp có khả năng biểu hiện gen rhIL2MN với

lượng IL-2 đạt khoảng 90 mg/L, cao gấp 2000 lần so với dự kiến.

- Đã tạo thành công chủng P. pastoris tái tổ hợp có khả năng tổng hợp rhIL2MN đạt

khoảng 5 mg/L, cao gấp 100 lần so với dự kiến.

- Đã xây dựng quy trình biểu hiện IL-2 tái tổ hợp trong E. coli và trong P. pastorisvới ở qui mô lên men dung tích 5L và 14L với các điều kiện thích hợp cho quá trình lên men. - Đã xây dựng quy trình tách chiết và tinh chế protein tái tổ hợp từ chủng E. coli đạt độ tinh sạch cao (99%) và đặc hiệu với kháng thể kháng IL-2 của người. Chế phẩm IL-2 nhận được đáp ứng được các điều kiện kiểm định và có hoạt tính tương đương với sản phẩm của nước ngoài.

- Đã xây dựng được phương pháp nghiên cứu tác động của IL-2 tái tổ hợp lên động vật

thực nghiệm và trên tế bào CTLL-2 nuôi cấy in vitro.

- Đề tài đã công bố được 5 bài báo, 2 bài đã gửi tới các tạp chí khoa học và sẽ được đăng trong thời gian tới. Đề tài đã tiến hành đăng ký Bằng độc quyền giải pháp hữu ích về “Chủng vi khuẩn tái tổ hợp có khả năng tổng hợp Interleukin-2 của người” tháng 10 năm 2006 và đã nhận được công văn của Cục Sáng chế nhận đơn để xem xét.

- Đề tài đã góp phần trong việc đào tạo 3 Thạc sỹ khoa học, 3 Cử nhân công nghệ sinh học và 2

nghiên cứu viên được nâng cao tay nghề.

5.2. ĐỀ NGHỊ Để có thể tiếp tục phát triển tiếp các kết quả nghiên cứu, chúng tôi đề xuất một số kiến

nghị sau:

01. Tiếp tục hoàn thiện và nâng cao hiệu quả quy trình sản xuất IL-2 tái tổ hợp ở các hệ biểu hiện trong E. coli và trong tế bào nấm men P. pastoris trên quy mô lớn hơn làm cơ sở cho việc triển khai sản xuất sản phẩm này và ứng dụng trong thực tiễn.

02. Tiến hành tiếp tục các nội dung nghiên cứu là i) Công nghệ thu hồi, bảo quản, đóng gói IL-2, ii) Thử nghiệm lâm sàng chế phẩm IL-2 tái tổ hợp trên bệnh nhân ung thư đường tiêu hóa giai đoạn muộn tại bệnh viện K trong giai đoạn tiếp theo.

Thực hiện từ 01/2005 – 06/2007

Báo cáo tóm tắt Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

1. 2.

4. 5.

Nguyễn Thanh Đạm. (2004). Miễn dịch điều trị bệnh ung thư. Nhà xuất bản Y học. Nguyễn Văn Đạt, Nguyễn Thanh Thuỷ, Nguyễn Huy Hoàng, Nông Văn Hải, Lê Trần Bình, Trương Nam Hải, (2000). Biểu hiện gien mã hoá cho protein bất hoạt ribôxôm của mướp đắng trong nấm men P. pastoris. Báo cáo khoa học Hội nghị Sinh học Quốc Gia, 44-47. Nguyễn Thị Trung, Đỗ Thị Huyền, Nguyễn Thanh Thuỷ, Phạm Thuý Hồng, Trương Nam Hải, (2002) Biểu hiện gen mã hóa cho β-amylaza từ hạt đậu tương trong nấm men P. pastoris. Tạp chớ Khoa học và Cụng nghệ, 40(3): 14-19. Hà Văn Huân, Lê Thị Bích Thảo, Phan Văn Chi (2003) Biểu hiện và tinh chế protein lai HSP2. Y học Việt Nam 284(5): tr. 6-9. Nguyễn Thuý Hà, Nguyễn Bích Nhi, Đỗ Khắc Hiếu & Phan Văn Chi (2003) Khả năng ức chế các dòng tế bào ung thư nuôi cấy in vitro của Trichobakin tái tổ hợp . Y học Việt Nam 284(5): 26-30. Nguyễn Nam Long, Nguyễn Bích Nhi, Phan Văn Chi (2005) Tách dòng gen mã hóa Interleukin-2 của người. Tạp chí Y học Việt Nam 310(5): 26-30. Đặng Trần Hoàng, Vũ Minh Đức, Phùng Thu Nguyệt, Trương Nam Hải (2005) Biểu hiện gen Interleukin-2 của người rhIL2 MM bị đột biến tại các điểm glycosyl hóa và gốc Cys 125 trong E. coli. Tạp chí Công nghệ Sinh học 3(2): 149-154. Đặng Trần Hoàng, Bùi Thị Huyền, Vũ Minh Đức, Đặng Thành Nam, Trần Thị Hường, Nguyễn Hồng Thanh, Phan Văn Chi, Trương Nam Hải (2005) Biểu hiện gen mã hóa Interleukin-2 của người (rh-IL2 MN) trong E. colibằng hệ pET32 và nhận dạng protein tái tổ hợp bằng phương pháp khối phổ. Tạp chí rhIL2ghệ Sinh học 3(4): 439-444. Vũ Minh Đức, Nguyễn Tiến Minh, Đặng Trần Hoàng, Trần Thị Hường, Nguyễn Hồng Thanh, Đinh Duy Kháng, Trương Nam Hải (2005) Gây hồi biến thay thế Ser 25 thành Leu và biểu hiện protein dung hợp thioredoxin-rhInterleukin-2 (Trx-rhIL2MN) trong P. pastoris. Tạp chí Công nghệ Sinh học 3(4): 445-452.

10. Trần Công Yên, Nguyễn Thị Quỳ (2001) Một chặng đường nghiên cứu ung thư thực nghiệm (1987-2001), Hội thảo Quốc tế Sinh

học, Hà nội tháng 7/2001. 285-290.

TÀI LIỆU TIẾNG ANH 1. Ardizzoni A, Bonavia M, Viale M, Baldini E, Mereu C, VeRNA A, et al. (1994) Biologic and clinical effects of continuous infusion

interleukin-2 in patients with non-small cell lung cancer. Cancer 73:1353–1360.

2. Armstrong A, Eaton D, Ewing J. (2001) Cellular immuno therapy for cancer. Br Med J 323:1289–1293.

3. Atzpodien J, Kirchner H (1990). Cancer, cytokine, and toxic cells: Interleukin-2 in the immuno therapy of human neoplasms. Klin

Wochenscher. 68(1): 1-11.

4. Atzpodien J, Kirchner H, Illiger HJ, Metzner B, Ukena D, Schott H, Funke PJ, Gramatzki M, Jurgenson S, Wandert T, Patzelt T, Reitz M. (2001). IL-2 in combination with IFN- alpha and 5-FU versus tamoxifen in metastatic renal cell carcinoma: long-term results of a controlled randomized clinical trial. Br J Cancer. 19;85(8):1130-6.

5. Atzpodien J, Kirchner H, Illiger HJ, Metzner B, Ukena D, Schott H, Funke PJ, Gramatzki M, Jurgenson S, Wandert T, Patzelt T, Reitz M. (2001). IL-2 in combination with IFN- alpha and 5-FU versus tamoxifen in metastatic renal cell carcinoma: long-term results of a controlled randomized clinical trial. Br J Cancer. 19;85(8): 1130-6.

6. Baneyx F (1999) Recombinant protein expression in Escherichia coli. Curr Opin Biotech. 10:411-421. 7. Bayer AL, Yu A, Adeegbe D, Malek TR (2005) Essential role for interleukin -2 for CD4+ CD25+ T regulatory cell development during

the neonatal period. J Exp Med 201: 769-777.

8. Bazan, J.F (1992) Unraveling the structure of IL-2. Science 257: 410–413.

9. Bergmann L (1990). The clinical significance of interleukin-2. Onkologie, 13(6): 416-422.

10. Bordin V, Giani L, Meregalli S, Bukovec R, Vaghi MM, Mandala M, Paolorossi F, Ardizzoia A, Tancini G, BRNAi S, Frigerio F, Fumagalli L, Bordoni A, Valsuani G, Di Felice G, Lissoni P. (2000). Five-year survival results of subcutaneous low-dose immuno therapy with interleukin-2 alone in metastatic renal cell cancer patients. Urol Int. 64(1):3-8.

11. Buzio C, Andrulli S, Santi R, Pavone L, Passalacqua R, Potenzoni D, Ferrozzi F, Giacosa R, Vaglio A. (2001). Long-term immuno therapy with low-dose interleukin-2 and interferon-alpha in the treatment of patients with advanced renal cell carcinoma. Cancer. 1;92(9):2286-2296.

12. Brivio F, Lissoni P, Tisi E, Erba L, BRNAi S, Tancini G, et al.(1992) Effects of a preoperative therapy with interleukin-2 on surgery-

induced lymphocytopenia in cancer patients. Oncology 49:215–218.

13. Buccheri G, Marino P, Preatoni A, Ferrigno D, Moroni GA. (1991) Soluble interleukin-2 receptor in lung cancer. An indirect marker

of tumor activity. Chest 99:1433–1437.

14. Bukowski RM. (1997) Natural history and therapy of metastatic renal cell carcinoma: the role of interleukin-2. Cancer . 80:1198–1220.

15. Chomczynski P, Sacchi N. (1987). Anal Biochem. 162:156–160.

16. Degrave W, Tavernier J, Duerinck F, Plaetinck G, Devos R, Fiers W (1983) Cloning and structure of the human interleukin 2

chromosomal gen. EMBO J 2(12): 2349- 2353.

17. Devos R, Plaetinck G, Cheroute H, Simons H, Degrave W, Tavernier J, Remaut E, Fiers W (1983) Molecular cloning of human

interleukin 2 cDNA and its expression in E. coli. Nucleic Acids Res. 11: 4307-4323.

18. Dillman R.O., Church C., Barth N.M., Oldham R.K. and Wiemann M.C. (1997). Long-term survival after continuous infusion

interleukin-2. Cancer Biother Radiopharm. 12(4):243-248.

19. Dore JM, Gras E, Wijdenes (1997) Expression and activity of a recombinant chimeric protein composed of pokeweed antiviral protein

and of human interleukin-2. FEBS Letters. 402(1): 50-52.

20. De Vita F, Turitto G, Di Gracia M, Frattolillo A, Catalano G. (1998) Analysis of interleukin-2/interleukin-2 receptor system in

advanced non-small cell lung cancer. Tumori 84:33–38.

21. Dutcher JP, Creekmore S, Weiss GR, Margolin K, Markowitz AB, Roper M, et al.(1989) A phase II study of interleukin-2 and LAK

cells in patients with metastatic malignant melanoma. J Clin Oncol 7:477–485.

Thực hiện từ 01/2005 – 06/2007

Báo cáo tóm tắt Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

22. Fujita T, Takaoka C, Matsui H, Taniguchi T (1983) Structure of the human interleukin 2 gen. Proc. Natl. Acad. Sci. 80:7437-7441.

23. Fukushima K, Yamashita K (2001) Interleukin-2 carbonhydrate recognition modulates CTLL-2 cell proliferation. J. Biol. Chem.

276(10): 7351-7356.

24. Fisher RI, Rosenberg SA, Fyfe G. (2000) Long-term survival update for high-dose recombinant interleukin-2 in patients with renal cell

carcinoma. Cancer J Sci Am 6 (Suppl 1):S55–S57.

25. Gaffen SL, Liu KD (2004) Overview of interleukin -2 function, production and clinical applications. Cytokine 28: 109- 123

26. Gez E, Rubinov R, Gaitini D, Meretyk S, Best LA, Native O, Stein A, Erlich N, Beny A, Zidan J, Haim N, Kuten A. (2002). Interleukin-2, interferon-alpha, 5-fluorouracil, and vinblastine in the treatment of metastatic renal cell carcinoma: a prospective phase II study: the experience of Rambam and Lin Medical Centers 1996-2000. Cancer. 15;95(8):1644-1649.

27. http://www.aidsmeds.com/news/

28. http://www.cytoshop.com/

29. http://www.microvet.arizona.edu/Courses/MIC419/Tutorials/cytokines.html,

30. http://www.microvet.arizona.edu/Courses/MIC419/Tutorials/cytokines.html

31. http://www.proleukin.com/index.html

32. http://www.proleukin.com/index.html.

33. Javier CS, Foucras G, Guo L, Chiodetti L, Young HA, Jane HL, Zhu J, Paul WE (2004) Interleukin 2 plays a central role in Th2 differentiation.

PNAS. 101(11): 3880-3885.

34. Jansen RL, Slingerland R, Goey SH, Franks CR, Bolhuis RL, Stoter G. (1992) Interleukin-2 and interferon-alpha in the treatment of

patients with advanced non small cell lung cancer. J Immunol, 12:70–73.

35. Ju G et al (1987) Structure-function analysis of human interleukin 2. J. Bio. Chem. 262(12): 5723-5731.

36. Kimura H, Yamaguchi Y. (1995) Adjuvant immuno therapy with interleukin-2 and lymphokine-activated killer cells after noncurative

resection of primary lung cancer. Lung Cancer, 13:31–44.

37. Kradin RL, Kurnick JT, Lazarus DS, Preffer FI, Dubinett SM, Pinto CE, et al. (1989); Tumor-infiltrating lymphocytes and

interleukin-2 in treatment of advanced cancer. Lancet 18:577–580.

38. Krastev Z, Koltchakov V, Tomov B, Koten JW. (2003), Non-melanoma and non-renal cell carcinoma malignancies treated with

interleukin-2. Hepatogastroenterology 50:1006–1016.

39. Liang SM, Lee N, Zoon KC, Manischewitz JF, Chollet A, Liang CM, Quinnan GV (1988) Biological characterization of human

interleukin 2 mutant proteins. J. Biol. Chem. 263(10): 4768-4772.

40. Liang SM, Thatcher DR, Liang CM, Allet B (1985) Studies of structure-activity relationships of human interleukin-2. J. Biol. Chem.

261(1): 334-337.

41. Liu Y Liu Y, Su C, Hu YH, Ouyang KQ, Cai SX (2005) Studies on fermentation conditions and purification of mutant human

interleukin -2 expressed in P. pastoris. Sheng Wu Gong Cheng Xued Bao 21(3): 430-434

42. Legha SS, Buzaid AC. (1993) Role of recombinant interleukin-2 in combination with interferon and chemotherapy in the treatment of

advanced melanoma. Semin Oncol 2:27–32.

43. Lissoni P, BRNAi S, Ardizzoia A, Paolorossi F, Tisi E, Crispino S, Tancini G. (1992) Intracavitary administration of interleukin-2 as

palliative therapy for neoplastic effusions. Tumori 78:118–120.

44. Lissoni P, BRNAi S, Rovelli F, Tancini G. (1991) Lower survival in metastatic cancer patients with reduced interleuin-2 blood

concentrations. Preliminary report. Oncology 48:125–127.

46. Lissoni P, Bordin M, Vaghi L, Fumagalli L, Bordoni A, Mengo S, et al. (2002), Ten-year survival results in metastatic renal cell

carcinoma patients treated with monoimmuno therapy with subcutaneous low-dose interleukin-2. Anticancer Res 22:1061–1064.

47. Lissoni P, Mandala M, Curigliano G, Ferretti G, Moro C, Ardizzoia A, et al. (2001), Progress report on the palliative therapy of 100

patients with neoplastic effusions by intracavitary low-dose interleukin-2. Oncology. 60:308–312.

48. Lissoni P, Meregalli S, Fossati V, Paolorossi F, BRNAi S, Tancini G, Frigerio F. (1994) A randomized study of immuno therapy with low-dose subcutaneous interleukin-2 plus melatonin vs chemotherapy with cisplatin and etoposide as first-line therapy for advanced non- small cell lung cancer. Tumori 80:464–467.

49. McDermott D F, Atkins M B (2004) Application of IL-2 and other cytokines in renal cancer. Expert Opin. Bio. Ther. 4(4): 455-468.

51. Masotti A, Fumagalli L, Morandini GC. (1997) Intrapleural administration of recombinant interleukin-2 in non-small cell lung cancer

with neoplastic pleural effusion. Monaldi Arch Chest Dis 52:225-228.

53. Mier JW, Atkins MB. (2001) Pharmacology of cancer biotherapeutics. Interleukin-2. Cancer principles and practice of oncology, 6th

edition. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; pp. 471–477..

54. Nelson B H, Willerford D M (1998) Biology of the interleukin-2 receptor. Adv. Immunol. 70: 1-81.

55. Neri B, Doni L, Gemelli MT, Fulignati C, Turrini M, Di Cello V, Dominici A, Maleci M, Mottola A, Ponchietti R, Raugei A, Valsuani G, Cini G. (2002). Phase II trial of weekly intravenous gemcitabine administration with interferon and interleukin-2 immuno therapy for metastatic renal cell cancer. J Urol. 168(3):956-958.

56. Naumnik W, Chyczewska E. (2001) The clinical significance of serum soluble interleukin 2 receptor (s IL-2R) concentration in lung

cancer. Folia Histochem Cytobiol 39:185–186.

57. Parkinson D, Abrams J, Wiernick P, Rayner AA, Margolin KA, Van Echo DA, et al.(1990) Interleukin-2 therapy in patients with

metastatic malignant melanoma: a phase II study. J Clin Oncol 1990; 8:1650–1656.

58. Pectasides D, Varthalitis J, Kostopoulou M, Mylonakis A, Triantaphyllis D, Papadopoulou M, Dimitriadis M, Athanassiou A.

Thực hiện từ 01/2005 – 06/2007

Báo cáo tóm tắt Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

(1998). An outpatient phase II study of subcutaneous interleukin-2 and interferon-alpha-2b in combination with intravenous vinblastine in metastatic renal cell cancer. Oncology. 55(1):10-15.

59. Ravaud A, Trufflandier N, Ferriere JM, Debled M, Palussiere J, Cany L, Gaston R, Mathoulin-Pelissier S, Bui BN. (2003). Subcutaneous interleukin-2, interferon alpha-2b and 5-fluorouracil in metastatic renal cell carcinoma as second-line treatment after failure of previous immuno therapy: a phase II trial. Br J Cancer. 15;89(12):2213-8.

60. Robb RJ, Kutny RM, Panico M, Morris HR, Chowdhry V (1984) Amino acid sequence and post-translational modification of human

interleukin 2. Proc Nat Acad Sci Mỹ.81: 6486-6490.

61. Ryan CW, Vogelzang NJ, Stadler WM. (2002). A phase II trial of intravenous gemcitabine and 5-fluorouracil with subcutaneous

interleukin-2 and interferon-alpha in patients with metastatic renal cell carcinoma. Cancer. 15; 94(10):2602-2609.

64. Rosenberg SA, Lotze MT, Muul LM, Chang AE, Avis FP, Leitman S, et al. (1997) A progress report on the treatment of 157 patients with advanced cancer using lymphokine-activated killer cells and interleukin-2 or high dose interleukin-2 alone. N Engl J Med 316:889– 897.

65. Rubin J. (1993) Interleukin-2: its biology and clinical application in patients with cancer. Cancer Invest 11:460–472.

66. Sambrook J, Russell DW (2001). Cold spring laboratory Harbor Press.

67. Sambrook J, Russell DW (2001) Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. 68. Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T. (1989). Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Habor laboratory, Cold

Spring Habor Laboratory Press, New York.

69. Schiller JH, Morgan-Ihrig Ch, Levitt ML.(1995) Concomitant administration of interleukin-2 plus tumor necrosis factor in advanced

non-small cell lung cancer. Am J Clin Oncol 18:47–51.

70. Steiner G, Tschachler E, Tani M, Malek TR, Shevach EM, Holter W, et al. (1986) Interleukin-2 receptors on cultured marine

epidermal Langerhans cells. J Immunol 137:155–159.

71. Smith KA, Cantrell DA (1985) Interleukin 2 regulates its own receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. 82:864-868.

72. Soori G, Dillman RO, Wiemann MC, Stark JJ, Tai F, DePriest CB, Church CK and Schulof R (2002). Phase II trial of subcutaneous interleukin-2, subcutaneous interferon-alfa, 5-fluorouracil and cis-retinoic acid in the treatment of renal cell carcinoma: final results of cancer biotherapy researcg group 94-10. Cancer Biother Radiopharm. 17(2): 165-173.

73. Taniguchi T, Matsui H, Fujita T, Hatakeyama M, Kashima N, Fuse A, Hamuro J, Nishi-Takaoka C, Yamada G (1986) Molecular

analysis of the interleukin-2 system. Immunol. Rev. 92: 121-133.

74. Taniguchi T, Matsui H, Fujita T, Takaoka C, Kashima N, Yoshimoto R, Hamuro J (1983) Structure and expression of a cloned

cDNA for human interleukin-2. Nature 302: 305-310.

75. Testa U, Montesoro E, Bulgarini D, Samoggia P, Masciulli R, Habetswallner D, Care A, Mariani G, Giannella G, Boccoli G, et al

(1990). Interleukin-2 in cancer therapy. Ann Ist Super Sanita. 26(3-4): 283-334.

77. Yang JC, Sherry RM, Steinberg SM, Topalian SL, Schwartzentruber DJ, Hwu P, et al. (2003) Randomized study of high-dose and

low-dose interleukin-2 in patients with metastatic renal cancer. J Clin Oncol; 21:3127–3132.

78. Yang SC, Gimm EA, Parkinson DR, Carinhas J, Fry KD, Mendiguren-Rodriguez A, et al. (1991) Clinical and immunomodulatory effects of combination immuno therapy with low-dose interleukin-2 and tumor necrosis factor in patients with advanced non-small cell lung cancer: a phase I trial. Cancer Res 51:3669–3676.

79. Yano T, Sugio K, Yamazaki K, KAse S, Yamaguchi M, Ondo K, et al. (1999) Postoperative adjuvant adoptive immuno therapy with

lymph node-LAK cells and IL-2 for pathologic stage I non-small cell lung cancer. Lung Cancer 26:143–148.

80. Yasumoto K, Miyazaki K, Nagashima A, Ishida T, Kuda T, Yano T, Sugimachi K, et al. (1987) Induction of lymphokine-activated killer cells by intrapleural instillation of recombinant interleukin-2 in patients with pleurisy due to lung cancer. Cancer Res 47:2184–2187.

Thực hiện từ 01/2005 – 06/2007

Báo cáo tóm tắt Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

MỤC LỤC

LỜI MỞ ĐẦU....................................................................................................................................... 2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC ............ 3 1.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU Ở NƯỚC NGOÀI.................................................................... 3 1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC....................................................................... 4 CHƯƠNG 2.LỰA CHỌN ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 5 2.1. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI.......................................................................................................... 5 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CẦN THỰC HIỆN ....................................................................... 5 2.3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................... 5 2.3.1. Vật liệu ................................................................................................................................ 5 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu ...................................................................................................... 5 CHƯƠNG 3. NHỮNG NỘI DUNG VÀ KẾT QUẢ ĐÃ THỰC HIỆN ........................................... 7 3.1. KẾT QUẢ TẠO DÒNG GEN IL-2 ............................................................................................ 7 3.1.1. Kết quả tách chiết RNA tổng số từ người và tổng hợp cDNA mã hóa gen IL-2........................ 7

125

bằng Ser

3.2.1. Tạo đột biến điểm làm mất điểm glycosyl hóa và thay thế Cys 3.2.2. Gây hồi biến Ser thành Leu

3.1.2. Xác định trình tự nucleotide của gen IL-2........................................................................... 7 3.2. KẾT QUẢ TẠO ĐỘT BIẾN GEN IL-2 ..................................................................................... 9 125 ................... 9 25 .......................................................................................... 10 3.3. KẾT QUẢ BIỂU HIỆN IL-2 TRONG CÁC HỆ BIỂU HIỆN KHÁC NHAU ........................ 11 3.3.1. Biểu hiện gen lai Trx-rhIL2MN trong tế bào E. coli......................................................... 11 3.3.2. Biểu hiện gen lai Trx-rhIL2MN trong nấm men P. pastoris.............................................. 13 3.3.3. Kết quả biểu hiện gen rhIL2 ở dạng tự nhiên trong nấm men P. pastoris ......................... 14

3.4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN CÁC CHỦNG TÁI TỔ HỢP MANG GEN IL-2 Ở BÌNH TAM GIÁC VÀ TRONG HỆ THỐNG LÊN MEN 5L, 14L.............. 16 3.4.1. Kết quả lên men tổng hợp IL-2 tái tổ hợp ở bình tam giác................................................ 16 3.4.2. Kết quả lên men sản xuất IL-2 tái tổ hợp trong hệ thống Bioflo 110 dung tích 5L và 14L......... 16

3.5. KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT, TINH CHẾ IL-2 TỪ DỊCH LÊN MEN VÀ NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT .................................................................................................................................... 17 3.5.1. Tách chiết và tinh chế IL-2 bằng sắc ký ái lực .................................................................. 17 3.5.2. Cắt protein dung hợp bằng Enterokinase và lọc IL-2 qua cột sắc ký ái lực và kiểm tra

khả năng bắt cặp đặc hiệu của IL-2 bằng Western blot............................................................... 17 3.6. KẾT QUẢ BƯỚC ĐẦU VỀ BẢO QUẢN MẪU IL-2 ............................................................ 19 3.7. THỬ NGHIỆM IL-2 TÁI TỔ HỢP TRÊN MÔ HÌNH TẾ BÀO CTLL2 ........................................ 19 3.7.1. Điều kiện tối ưu để nhân và bảo quản dòng tế bào CTLL2............................................... 19 3.7.2. Xác định được hoạt tính sinh học của các mẫu IL-2 tái tổ hợp ......................................... 20 3.7.3. Xác định hoạt tính sinh học của mẫu rhIL2 biểu hiện trong P. pastoris ........................... 21 3.8. THỬ NGHIỆM IL-2 TÁI TỔ HỢP TRÊN MÔ HÌNH TẾ BÀO ĐỘNG VẬT ....................... 22 3.8.1. Gây ung thư thực nghiệm đường tiêu hóa cho chuột nhắt trắng bằng hóa chất AOM.......................22 3.8.2. Kết quả nghiên cứu............................................................................................................ 24 3.9. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG IL-2 ........................................................................... 29 3.9.1. Hiệu giá của sản phẩm IL-2 ................................................................................................... 29

Thực hiện từ 01/2005 – 06/2007

Báo cáo tóm tắt Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

3.9.2. Tính vô trùng của sản phẩm IL-2........................................................................................... 29 3.9.3. Tính an toàn của sản phẩm IL-2 ............................................................................................ 29 3.9.4. Chất gây sốt của sản phẩm IL-2 ............................................................................................. 29 3.9.5. Tính chất lý hóa của sản phẩm............................................................................................... 29 CHƯƠNG 4. TỔNG QUÁT HOÁ VÀ ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ THU ĐƯỢC .............................. 30 4.1. KẾT QUẢ VỀ KHOA HỌC..................................................................................................... 30 4.2. TỔNG HỢP CÁC SẢN PHẨM ĐẠT ĐƯỢC SO VỚI ĐĂNG KÝ......................................... 31 4.3. TRÌNH ĐỘ CÔNG NGHỆ ....................................................................................................... 33 4.4. KHẢ NĂNG ÁP DỤNG........................................................................................................... 33

4.5. ĐÀO TẠO................................................................................................................................. 34 4.6. HỢP TÁC QUỐC TẾ ............................................................................................................... 35 4.7. TÌNH HÌNH SỬ DỤNG KINH PHÍ......................................................................................... 35 4.8. DANH SÁCH CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ...................................................................... 35 4.9. HẠN CHẾ CỦA ĐỀ TÀI ......................................................................................................... 36 CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ.......................................................................................... 38 5.1. KẾT LUẬN............................................................................................................................... 38 5.2. ĐỀ NGHỊ .................................................................................................................................. 38 ................................................................................................................. 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO

MỤC LỤC CÁC BẢNG

Bảng 1. Kết quả tinh chế IL-2 tái tổ hợp từ dịch thô ..............................................................19

Bảng 2. Dữ liệu kiểm tra hoạt tính của các mẫu IL-2 tái tổ hợp.............................................20

Bảng 3. Đơn vị hoạt tính của các mẫu IL-2 thử nghiệm.........................................................21

Bảng 4. Khả năng hoạt hoá tế bào CTLL-2 phát triển của các mẫu thí nghiệm ở các

nồng độ thử khác nhau.............................................................................................................21

Bảng 5. Đơn vị hoạt tính của các mẫu rhIL2 thử nghiệm.......................................................22

Bảng 6. Số trung bình của u ở ruột 1 chuột trong các lô thí nghiệm ......................................24

Bảng 7. Định lượng các khối u báng Sarcoma 180 khi mổ chuột thí nghiệm ........................27

Bảng 8. Tác động của chế phẩm IL2-TQ và IL2-VN lên thời gian sống thêm.......................28

của chuột nhắt trắng Swiss mang u báng Sarcoma 180...........................................................28

Bảng 9. Các dòng gen và dòng vector tạo ra của đề tài ..........................................................31

Bảng 10. Sản phẩm khoa học của đề tài .................................................................................32

Bảng 11. Danh sách các học viên được đào tạo......................................................................34

Bảng 12. Danh sách các cán bộ được nâng cao trình độ.........................................................34

Bảng 13. Danh sách các cơ quan hợp tác quốc tế ...................................................................35

Bảng 14. Kinh phí phân bổ cho các hạng mục........................................................................35

Bảng 15. Tóm tắt các nội dung công việc thực hiện và nội dung xin điều chỉnh ...................36

Thực hiện từ 01/2005 – 06/2007

Báo cáo tóm tắt Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

MỤC LỤC CÁC HÌNH Hình 1. Tóm tắt nội dung nghiên cứu theo sơ đồ .......................................................................6 Hình 2. Sản phẩm PCR nhân gen IL-2 .......................................................................................7 Hình 3. Kết quả cắt kiểm tra DNA các plasmid bằng enzyme EcoR I. .....................................7 Hình 4. Kết quả so sánh trình tự IL-2 nhận được với trình tự trên ngân hàng gen quốc tế NCBI ... 8 Hình 5. So sánh trình tự amino acid đã được dịch mã của gen IL-2 nhận được (Protein_IL-2) 8 và trình tự amino acid đã đăng kí trên ngân hàng dữ liệu gen....................................................8 quốc tế với số đăng ký NP_000577.............................................................................................8 Hình 6. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8% ...............................................................9 Hình 7. Kết quả cắt kiểm tra DNA plasmid các dòng biến nạp bằng Not I và Nco I .................9 Hình 8. Kết quả đọc trình tự nucleotide của dòng số 4 chứa gen rhIL2 ...................................10 Hình 9. Kết quả đọc trình tự gen đã hồi biến (phải) so với gen chưa hồi biến (trái) ................11 Hình 10. Điện di SDS-PAGE protein rhIL2 trên gel polyacrylamide 12,5%...........................11 Hình 11. Điện di protein rhIL2 dạng tan và không tan trên gel polyacrylamide 12,5%...........11 Hình 12. Western blot với kháng thể kháng hIL-2 ...................................................................12 Hình 13. Ảnh phổ MS/MS của mảnh peptide 634,4 dalton mang điện tích +2 của Trx được nhận dạng. A – phổ TOF MS, B – phổ MS/MS. .......................................................................12 Hình 14. Ảnh phổ TOF MS và MS/MS của mảnh peptide 874,6 dalton mang điện tích 2+ của IL-2 được nhận dạng. A – phổ TOF MS, B – phổ MS/MS.......................................................13 Hình 15. Các peptide nhận dạng được qua khối phổ từ băng protein có kích thước 32 kDa.........13 Hình 16. Ảnh biểu hiện gen Trx-rhIL-2MN .............................................................................13 Hình 17. Ảnh Western Blot với kháng thể kháng IL-2.............................................................14 Hình 18. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 0.8% ...........................................................15 Hình 19. Điện di SDS-PAGE sản phẩm biểu hiện rhIL2 trong nấm men P. pastoris.............15 Hình 20. Ảnh Western Blot với kháng thể kháng IL-2.............................................................15 Hình 21. Khảo sát nồng độ IPTG.................................................................................................16 Hình 22. Khảo sát nồng độ Amp ................................................................................................16 Hình 23. Khảo sát nhiệt độ...........................................................................................................16 Hình 24. Thời gian thu mẫu .........................................................................................................16 Hình 25. Quá trình phát triển của chủng E. coli Bl21 và sinh tổng hợp Interleukin-2. ............17 Hình 26. Điện di protein tái tổ hợp Trx-rhIL2MN trên polyacryamide gel 12,5% ................17 Hình 27. Điện di protein tinh sạch lần 1 ...................................................................................18 Hình 28. Điện di protein tinh sạch lần 2 ...................................................................................18 Hình 29. Điện di sản phẩm protein cắt bằng enterokinase .......................................................18 Hình 30. Mẫu Trx-IL2MN giữ ở dạng đông khô sau các khoảng thời gian bảo quản khác nhau.....19 Hình 31. Hình ảnh tế bào CTLL-2 nuôi cấy in vitro ................................................................20 Hình 32. Xác định và so sánh hoạt tính của các mẫu IL-2 thử nghiệm ....................................20

Thực hiện từ 01/2005 – 06/2007

Báo cáo tóm tắt Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

Hình 33. Đồ thị minh hoạ sự phát triển của tế bào CTLL-2 dưới tác động của chất thử ở .....21 các nồng độ khác nhau...............................................................................................................21 Hình 34. Niêm mạc đại tràng chuột nhắt trắng bình thường ....................................................24 Hình 35. Niêm mạc đại tràng chuột nhắt trắng bị ung thư .......................................................24 Hình 36. Niêm mạc đại tràng chuột nhắt trắng bình thường ....................................................24 Hình 37. Niêm mạc đại tràng chuột nhắt trắng bị ung thư .......................................................24 Hình 38. Tiêu bản hiển vi mô học lông nhung ruột chuột nhắt trắng bình thường: .................25 Hình 39. Tiêu bản hiển vi mô bệnh học lông nhung ruột chuột nhắt trắng bị ung thư dưới tác động của AOM ..........................................................................................................................25 Hình 40. Tế bào biểu mô niêm mạc bị giải biệt hóa, đang chuyển dạng..................................25 Hình 41. Tế bào mô liên kết ở lõi lông nhung bị giải biệt hóa, phân bố lộn xộn, đang chuyển dạng thành ung thư, có nhân lớn và tăng sắc (PĐ: 100 x 10)....................................................25 Hình 42. Chuột nhắt trắng Swiss khoẻ mạnh (a) và mang u báng Sarcoma 180 sau 12 ngày cấy truyền (b)......................................................................................................................................26 Hình 43. Ảnh minh họa sinh khối tế bào ung thư Sarcoma 180:..............................................26 Hình 44. Sự giảm sinh khối u báng Sarcoma 180 dưới tác động của IL2 tái tổ hợp ................26 Hình 45. Biểu đồ so sánh tỷ số phát triển u giữa các lô thí nghiệm .........................................26 Hình 46. Tế bào ung thư báng Sarcoma 180 ở lô đối chứng (x1000) ......................................27 Hình 47. Tế bào ung thư báng Sarcoma 180 ở lô tiêm chế phẩm IL2.VN ...............................27 Hình 48. Tế bào ung thư báng Sarcoma 180 dưới tác động của chế phẩm IL2.TQ .................27 Hình 49. Tế bào ung thư báng Sarcoma 180 bình thường dưới kính hiển vi điện tử truyền qua ......28 Hình 50. Tế bào ung thư báng Sarcoma 180 dưới tác động của IL2 VN (x10.000).................28 Hình 51. Tế bào u báng Sarcoma 180 dưới tác động của IL2 TQ (x10.000) ...........................28 Hình 52. Đồ thị biểu diễn thời gian sống thêm của các lô chuột thí nghiệm............................28

Thực hiện từ 01/2005 – 06/2007

Báo cáo tóm tắt Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

Lêi c¶m ¬n

PGS. TS. TRƯƠNG NAM HẢI

Thực hiện từ 01/2005 – 06/2007