Các thông số chất lượng của fucoidan và một số sản phẩm khác được phân lập từ rong mơ (Sargassum) Thừa Thiên Huế

Chia sẻ: Bình Bình | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:10

Thêm vào BST

Báo xấu

77
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Trong bài báo này, fucoidan cùng với các sản phẩm khác như alginate, laminaran, mannitol, các hợp chất màu chlorophyll, carotenoid đã được tách chiết từ rong mơ (Sargassum) và cấu tạo của chúng đã được xác nhận bằng UV-Vis, IR, 13C-NMR. Các thông số chất lượng của fucoidan được xác định bằng phương pháp phenol-axit sulfurictrắc quang, Kjeldahl, F-AAS, ICP-MS, tạo dẫn xuất-GC-MS… đã cho thấy fucoidan đạt yêu cầu của sản phẩm thương mại.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Các thông số chất lượng của fucoidan và một số sản phẩm khác được phân lập từ rong mơ (Sargassum) Thừa Thiên Huế

TẠP CHÍ KHOA HỌC, Đại học Huế, Tập 74A, Số 5, (2012), 141-150 CÁC THÔNG SỐ CHẤT LƯỢNG CỦA FUCOIDAN VÀ MỘT SỐ SẢN PHẨM KHÁC ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ RONG MƠ (SARGASSUM) THỪA THIÊN HUẾ Trần Thị Văn Thi, Lê Trung Hiếu, Lê Thị Lành Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế Tóm tắt. Trong bài báo này, fucoidan cùng với các sản phẩm khác như alginate, laminaran, mannitol, các hợp chất màu chlorophyll, carotenoid đã được tách chiết từ rong mơ (Sargassum) và cấu tạo của chúng đã được xác nhận bằng UV-Vis, IR, 13 C-NMR. Các thông số chất lượng của fucoidan được xác định bằng phương pháp phenol-axit sulfurictrắc quang, Kjeldahl, F-AAS, ICP-MS, tạo dẫn xuất-GC-MS… đã cho thấy fucoidan đạt yêu cầu của sản phẩm thương mại. 1. Đặt vấn đề Rong mơ (Sargassum) là một loài rong thuộc ngành rong nâu (Phaeophyta), sống tập trung ở vùng ven biển, tại các vùng có bãi đá ngầm. Thành phần chính của rong mơ là các polysaccaride (cellulose, alginate, laminaran, fucoidan) [2], ngoài ra còn có mannitol, gibberellin, cytokinin,… và nhiều loại vitamin. Việt Nam có bờ biển trải dài với nhiều bãi đá ngầm, thích hợp cho sự phát triển của nhiều loài rong, trong đó có rong mơ với trữ lượng đáng kể (khoảng 35000 tấn/năm [4]) và đa dạng về loài (khoảng 78 loài [4], [5]). Tuy nhiên, nguồn lợi này vẫn chưa được chú ý khai thác ở nước ta. Tại Thừa Thiên Huế, vẫn chưa có số liệu cụ thể đánh giá trữ lượng của rong mơ nhưng đã có một số tài liệu cho biết chúng tập trung nhiều tại vùng biển Lăng Cô [5]. Nguồn lợi mà rong mơ đem lại cho thế giới rất lớn. Các sản phẩm truyền thống của nó là mannitol (35000 tấn/năm), alginate (hàng triệu tấn/năm) [1]. Trong khoảng chục năm gần đây, các nhà khoa học còn phát hiện rong mơ có chứa một thành phần quan trọng khác, đó chính là fucoidan với những hoạt tính sinh học quí giá như chống đông cục máu, kháng khuẩn, kháng virut (kể cả virut HIV), chống nghẽn tĩnh mạch, chống ung thư,... [6]. Fucoidan là một polysaccaride sulfat phân cực, có thành phần chính là  L – fucose, thường chứa nhóm sulfat ở vị trí 2 hoặc 4. Ngoài ra, còn chứa một lượng nhỏ các đường đơn như galactose, xylose, mannose,…và axit guluconic.  Công trình được hoàn thành với sự tài trợ về kinh phí của Đề tài khoa học công nghệ trọng điểm của Bộ Giáo dục và Đào tạo. 141 142 Các thông số chất lượng của fucoidan và một số sản phẩm khác… Hiện nay, trên thế giới cũng như trong nước đã có nhiều công trình nghiên cứu tách chiết riêng lẻ alginate, fucoidan, mannitol. Tuy nhiên, chưa có công bố nào về việc xây dựng qui trình tách chiết đồng thời các sản phẩm có giá trị trong rong mơ. Nghiên cứu của chúng tôi hướng đến mục tiêu này. 2. Thực nghiệm 2.1. Thu và xử lý mẫu rong mơ Bốn loài rong mơ được thu hái vào thời vụ đầu tháng 5/2006, tháng 5/2008 và tháng 5/2009 ở vùng biển Lăng Cô – Thừa Thiên Huế. Mẫu rong sau khi thu hái về được phân loại, rửa sạch bằng nước máy, đem phơi khô rồi sấy khô ở 600C trong 3 giờ, giã vụn và bảo quản. Các mẫu rong được định danh tại Khoa Sinh học – Trường Đại học Khoa học Huế, gồm 4 loài sau: - Mẫu A: loài Sargassum henslowianum C. Ag. Ex J. Ag (Rong mơ Henslow) - Mẫu B: loài Sargassum heterocystum Mont (Rong mơ dị nang) - Mẫu C: loài Sargassum gracile J. Ag (Rong mơ mịn) - Mẫu D: loài Sargassum polycystum C. Ag (Rong mơ nhiều phao) Ngoài ra, chúng tôi còn nghiên cứu một mẫu hỗn hợp (không phân loài). 2.2. Tiến hành tách chiết và tinh chế các hợp chất có trong rong mơ Qui trình tách chiết fucoidan và các hợp chất khác trong rong mơ được tiến hành qua các giai đoạn sau: 2.2.1. Tách mannitol, chất màu chlorophyll, carotenoid và các chất ít phân cực khác: Dung môi được sử dụng cho giai đoạn này là cồn 960. Sau đó, tiến hành chưng cất thu hồi cồn để tái sử dụng. Tiến hành tách mannitol thô, tinh chế bằng cách kết tinh lại và kết tinh phân đoạn nhiều lần để loại chất màu và muối ăn. Tinh chế chất màu bằng ete petrol, sử dụng sắc ký cột dùng hệ dung môi cloroform/metanol với các tỷ lệ khác nhau để phân lập thành hỗn hợp các chlorophyll và hỗn hợp các carotenoid. 2.2.2. Chiết tổng fucoidan, laminaran và alginate theo thứ tự bằng các dung môi phân cực khác nhau - Dung dịch NaCl 0,05 M, nhiệt độ 80-85 0C - Dung dịch HCl 0,01 M, nhiệt độ phòng - Dung môi Na2CO3 3 %, nhiệt độ 70-75 0C TRẦN THỊ VĂN THI, LÊ TRUNG HIẾU, LÊ THỊ LÀNH 143 2.2.3. Tách alginate ra khỏi dịch chiết chứa fucoidan, laminaran và thu hồi alginate - Đối với dịch chiết NaCl và HCl: dùng tác nhân là muối CaCl2 để tạo kết tủa Ca-alginate - Đối với dịch chiết Na2CO3: tách alginate ra khỏi dịch chiết dưới dạng kết tủa axit alginic - Chuyển aginate về dạng Na-alginate bằng tác nhân Na2CO3 2,1% và tinh chế 2.2.4. Kết tủa fucoidan và laminaran bằng C2H5OH 960: Sử dụng cồn 960 để kết tủa laminaran và fucoidan từ dịch chiết, lọc lấy kết tủa, sau đó hòa tan kết tủa bằng nước cất 2.2.5. Kết tủa fucoidan bằng CTAB 3%: Cho từ từ CTAB 3% và dịch chứa laminaran và fucoidan để kết tủa fucoidan dưới dạng CTAB-fucoidan. Lọc lấy kết tủa và thu dịch chứa laminaran 2.2.6. Thu hồi laminaran từ dịch chiết và tinh chế: Sử dụng C2H5OH 960 để kết tủa laminaran rồi tinh chế bằng cách thẩm tách 2.2.7. Chuyển kết tủa CTAB-fucoidan sang Na-fucoidan và tinh chế sản phẩm: Sử dụng dung dịch NaCl 3 M để chuyển fucoidan về dạng Na-fucoidan. Sau đó tinh chế sản phẩm bằng cách thẩm tách. 2.3. Định tính các sản phẩm thu được bằng các phương pháp phổ - Phổ UV-Vis được ghi trên máy UV-Vis (T800). - Phổ IR được ghi trên máy Shimadzu FT-IR 8010 M - Phổ môi là D2O 13 C-NMR được ghi trên máy Bruker Advance 500-NMR ở 3430C, dung 2.4. Xác định các chỉ tiêu đặc trưng cho thông số chất lượng của fucoidan 2.4.1. Xác định hàm lượng sulfate của fucoidan bằng phương pháp khối lượng: Sử dụng tác nhân BaCl2 0,1 M để tạo kết tủa BaSO4 với sản phẩm đã thủy phân của fucoidan. Sau đó định lượng BaSO4 rồi suy ra hàm lượng sulfate có trong mẫu 2.4.2. Xác định tổng carbohydrate trong fucoidan theo phương pháp phenolsulfuric [5] 2.4.2.1. Xây dựng đường chuẩn - Cân chính xác 0,1000 gam D-Glucose cho vào bình định mức 100 ml rồi định mức bằng nước cất, nồng độ D-Glucose là 1 mg/ml (1000 g/ml). - Lấy 50 ml dung dịch trên pha thành 500 ml, nồng độ D-Glucose là 100 g/l. - Lần lượt lấy 0; 25; 50; 75; 100 ml dung dịch Glucose trên pha thành 100 ml, 144 Các thông số chất lượng của fucoidan và một số sản phẩm khác… thu được dãy dung dịch D-Glucose có nồng độ là 0; 25; 50; 75; 100 g/ml. - Mỗi mẫu lấy 1 ml cho vào ống nghiệm có nút đậy, thêm vào mỗi ống nghiệm 1 ml dung dịch phenol 5%, 5 ml H2SO4 đậm đặc, lắc đều các ống nghiệm. - Đặt các ống nghiệm vào cốc nước sôi 2 phút rồi làm lạnh ở nhiệt độ phòng 30 phút. - Đo độ hấp thụ quang của các dung dịch này ở bước sóng 490 nm, ta thu được các giá trị A1, A2, A3, A4, A5. - Từ kết quả thu được, ta xây dựng đường chuẩn. 2.4.2.2. Đo mẫu thực - Cân chính xác 0,2500 gam fucoidan thành phẩm hòa tan và định mức thành 25 ml bằng nước cất, nồng độ fucoidan là 10 mg/ml (10000 g/ml). - Lấy 0,75 ml dung dịch trên pha thành 100 ml, nồng độ 75 g/ml. - Lấy 1 ml dung dịch trên cho vào ống nghiệm có nút đậy, thêm 1 ml dung dịch phenol 5%, 5 ml H2SO4 đậm đặc, lắc đều ống nghiệm. Đặt ống nghiệm vào cốc nước sôi 2 phút rồi làm lạnh ở nhiệt độ phòng 30 phút. - Đo mật độ quang của dung dịch này ở bước sóng 490 nm. Dựa vào phương trình đường chuẩn, suy ra tổng carbohydrat có trong mỗi mẫu fucoidan hoặc alginate hay laminaran. 2.4.3. Xác định hàm lượng protein trong sản phẩm fucoidan: Sử dụng phương pháp Kjehdal để xác định hàm lượng nitơ, từ đó suy ra hàm lượng protein có trong mẫu thông qua biểu thức liên hệ giữa hàm lượng nitơ và protein (% protein = % N x 6,25 [5]). 2.4.4. Xác định hàm lượng kim loại trong sản phẩm fucoidan Xác định hàm lượng các kim loại bằng phương pháp quang phổ hấp thụ ngọn lửa (F-AAS) và phương pháp khối phổ plasma cao tần cảm ứng (ICP-MS) tại phòng thí nghiệm Vật liệu, Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội và được xác định đối chứng tại Trung tâm kỹ thuật đo lường chất lượng 2, Đà Nẵng. 2.4.5. Xác định thành phần monosaccharide của fucoidan bằng phương pháp tạo dẫn xuất và ghi GC-MS [9] 2.4.5.1. Nguyên tắc: Thủy phân fucoidan thành các monosaccharide, chuyển các monosaccharide sang dẫn xuất alditol acetate, rồi định tính và định lượng bằng GC–MS. 2.4.5.2. Tiến hành - Thủy phân fucoidan: Mẫu fucoidan khô (2 mg) cho vào ống nghiệm có nút vặn, thêm vào 0,2 mg inositol, 3 ml acid trifloroacetic 2 M, tiến hành thủy phân trong 2 giờ ở 120oC. Cho bay hơi đến khô trong dòng khí nitơ ở nhiệt độ 40oC rồi thêm 5 ml MeOH TRẦN THỊ VĂN THI, LÊ TRUNG HIẾU, LÊ THỊ LÀNH 145 cho bay hơi, lặp lại hai lần. - Khử sản phẩm thủy phân của fucoidan: Cho vào ống nghiệm có chứa sản phẩm fucoidan đã thủy phân, 3 ml NaBH4 0,25 M vừa pha trong NH4OH 1 M rồi để yên 30 phút ở 20oC. Thêm vào hỗn hợp phản ứng 5 ml acid acetic 10% trong MeOH, cho bay hơi đến khô, lặp lại hai lần. Cho vào ống nghiệm 5 ml MeOH, bay hơi đến khô, lặp lại hai lần. - Acetyl hóa sản phẩm khử: Cho vào ống nghiệm trên 2 ml dung dịch anhydride acetic:pyridin = 1:1 (v/v) ở 100oC trong 20 phút. Cho bay hơi hỗn hợp phản ứng, thêm vào 5 ml toluene, cho bay hơi đến khô, lặp lại hai lần. - Chiết sản phẩm đã acetyl hóa bằng etyl acetate. - Xác định thành phần đường bằng GC–MS trên máy Gas Chromatograph Mass Spectrometer Shimadzu GCMS–QP 2010 với cột DB-5 tại Trung tâm kiểm nghiệm Thuốc-Thực phẩm-Mỹ phẩm Huế. Chương trình nhiệt độ là: 65oC, giữ 1 phút, tăng đến 250oC với tốc độ gia nhiệt là 8oC/phút, giữ 10 phút, tổng thời gian ghi là 34 phút/mẫu.. 3. Kết quả và thảo luận 3.1. Hàm lượng các hợp chất tách được từ các loài rong khác nhau Hàm lượng các sản phẩm đã tách ra từ các loài rong được trình bày ở bảng 1. Bảng 1. Hàm lượng các hợp chất tách chiết được từ các loài rong mơ Thừa Thiên Huế Các Hàm lượng các hợp chất (%) mẫu rong Chlorophyll Carotenoid Mannitol Laminaran Alginate Fucoidan A - - 5,56 3,72-3,85 21,22-21,99 5,36-5,44 B - - 8,94 3,76-3,81 23,68-25,49 6,97-6,99 C - - 12,66 4,15-4,26 16,84-18,04 7,57-7,79 D - - 9,47 4,27-4,42 35,15-41,61 8,36-8,43 Hỗn hợp 0,32 1,23 11,84 3,78-3,95 28,89-30,03 6,79-6,97 Ghi chú: (-): không khảo sát. Hàm lượng mannitol trong các mẫu rong nghiên cứu tương đối cao so với các tài liệu tham khảo, cao nhất là mẫu C (12,66%). Hàm lượng alginate dao động trong khoảng 16,84-41,63% so với nguyên liệu khô, trong đó cao nhất là loài D (Sargassum polycystum C. Ag.) (41,63%), cao hơn so với kết quả mà các tác giả khác đã công bố trước đây [4]. Hàm lượng fucoidan trong các mẫu rong dao động trong khoảng 5,368,43%, cao nhất cũng là mẫu D (8,43%). Hàm lượng laminaran thấp hơn so với các tài liệu tham khảo (3,72-4,42%) [2].