T¹P CHÝ Y häc viÖt nam tẬP 544 - th¸ng 11 - QuyỂN 2 - sè ĐẶC BIỆT - 2024
357
ĐÁNH GIÁ TỒN LƯU TẾ BÀO ÁC TÍNH TRÊN NGƯỜI BỆNH
ĐA U TỦY XƯƠNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP F-PCR KẾT HỢP
ĐIỆN DI MAO QUẢN CÁC KIỂU TÁI SẮP XẾP GEN IG
Cao Sỹ Luân1,3, Lê Ngọc Bảo Tâm4, Đoàn Thị Tuyết Thu1,
Phù Ch Dũng1, Phan Thị Xinh1,2
TÓM TẮT42
Mục tiêu: Đánh giá tồn lưu tế bào ác tính
(TLTBAT) trên ngưi bệnh đưc chẩn đoán đa u
tủy xương bằng phương pháp F-PCR kết hp
điện di mao quản các kiểu tái sắp xếp (TSX) gen
IG. Đối tượng và phương pháp: Nghiên cứu mô
tả loạt ca đưc thực hiện trên 65 ngưi bệnh
đưc chẩn đoán mắc đa u tủy xương tại Bệnh
viện Truyền máu Huyết học trong thi gian từ
tháng 03/2022 đến tháng 06/2023. Nghiên cứu đã
thực hiện phản ứng F-PCR kết hp điện di mao
quản các kiểu TSX gen IG để đánh giá TLTBAT
trên ngưi bệnh đa u tủy xương. Kết quả: Chúng
tôi đã xác định đưc dng tương bào ác tnh dựa
trên các kiểu TSX gen IG biểu hiện đơn dng
trên 61 trưng hp (93,85%) ở thi điểm chẩn
đoán. Chúng tôi ghi nhận có 34 (55,7%) trưng
hp TLTBAT (+) và 27 (44,3%) trưng hp
TLTBAT (-) tại thi điểm sau điều trị. Khi phân
tích mối liên hệ giữa kết quả TLTBAT với giai
đoạn bệnh theo R-ISS cho thấy không có sự khác
1Bệnh viện Truyền máu Huyết học
2Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh
3Đại học Cửu Long
4Trung tâm Công nghệ sinh học Thành phố Hồ
Chí Minh
Chịu trách nhiệm chính: Cao Sỹ Luân
SĐT: 0917862262
Email:luancs@bth.org.vn
Ngày nhận bài: 30/7/2024
Ngày phản biện khoa học: 01/8/2024
Ngày duyệt bài: 17/9/2024
nhau có ý nghĩa thống kê giữa kết quả TLTBAT
với đặc điểm giai đoạn bệnh (p > 0,05). Mặt
khác, kết quả đánh giá mối liên hệ giữa TLTBAT
với mức độ đáp ứng dựa trên tiêu chuẩn IMWG
cho thấy có sự khác nhau có ý nghĩa thống kê (p
≤ 0,05) giữa tỷ lệ TLTBAT (-) và TLTBAT (+) ở
các mức độ đáp ứng điều trị bệnh khác nhau. Kết
luận: Chúng tôi đã xác định đưc 44,3% trưng
hp TLTBAT (-) và 55,7% trưng hp TLTBAT
(+) bằng phương pháp F-PCR kết hp điện di
mao quản sử dụng các kiểu TSX gen IG. Chúng
tôi cũng xác định có mối liên hệ có ý nghĩa thống
kê giữa kết quả TLTBAT với mức độ đáp ứng
điều trị theo tiêu chuẩn IMWG.
Từ khoá: Đa u tủy xương, tái sắp xếp gen
IG, điện di mao quản, tồn lưu tế bào ác tính
SUMMARY
EVALUATION OF MINIMAL
RESDUAL DISEASE IN MULTIPLE
MYELOMA PATIENTS USING F-PCR
COMBINED WITH CAPILLARY
ELECTROPHORESIS METHOD OF IG
GENE REARRANGEMENT
Objectives: Evaluate minimal residual
disease (MRD) in patients diagnosed with
multiple myeloma using F-PCR combined with
capillary electrophoresis method of IG gene
rearrangements. Subjects and methods: The
study describes a series of cases conducted on 65
patients diagnosed with multiple myeloma from
March 2022 to June 2023 at the Blood
Transfusion and Hematology Hospital. F-PCR
KỶ YẾU CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH HUYẾT HỌC - TRUYỀN MÁU
358
combined with capillary electrophoresis of IG
gene rearrangements were performed to evaluate
MRD in multiple myeloma patients. Results: We
identified the malignant plasma cell lineage
based on the clonal IG gene rearrangements in 61
cases (93.85%) at the time of diagnosis. We
identified 34 (55.7%) cases of MRD (+) and 27
(44.3%) cases of MRD (-) at the time after
treatment. When analyzing the relationship
between MRD results and disease stage
according to R-ISS, it showed that there was no
statistically significant difference between MRD
results and disease stage (p > 0.05). On the other
hand, the results of evaluating the relationship
between the level of MRD and response based on
IMWG standards show that there was a
statistically significant difference (p ≤ 0.05)
between the level of MRD (-) and MRD (+) at
different levels of response to treatment.
Conclusions: We have identified 44.3% of cases
of MRD (-) and 55.7% of cases of MRD (+) by
F-PCR combined with capillary electrophoresis
of IG gene rearrangements. We also determined
that there was a statistically significant
relationship between MRD results and the level
of treatment response according to IMWG
standards.
Keywords: Multiple myeloma, IG gene
rearrangement, capillary electrophoresis, minimal
residual disease.
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh đa u tủy xương (ĐUTX) là một
bệnh lý huyết học ác tnh, liên quan đến sự
tăng sinh đơn dng của các tương bào ác tnh
trong tủy xương (1). Nhiều phương pháp điều
trị đã đưc áp dụng như hóa trị liệu, xạ trị,
ghép tế bào gốc tạo máu, liệu pháp miễn dịch
và thuốc trúng đch (1,2,3). Tuy nhiên, vẫn
chưa có phương pháp điều trị hiệu quả cho
ĐUTX nên ngưi bệnh sau khi đạt lui bệnh
hoàn toàn vẫn có khả năng tái phát trở lại (4).
Đánh giá tồn lưu tế bào ác tính (TLTBAT)
trên ngưi bệnh ĐUTX có ý nghĩa rất quan
trọng trong quá trnh điều trị. Việc phát hiện
một lưng nhỏ các tương bào ác tnh sau
điều trị sẽ cung cấp thêm thông tin hữu ích
cho bác sĩ lâm sàng trong việc đánh giá mức
độ đáp ứng với phác đồ điều trị và tiên lưng
bệnh chnh xác hơn.
Một đặc điểm đặc trưng của các tương
bào ác tính là việc sản xuất một lưng lớn
các kháng thể đơn dng. Mỗi kháng thể đơn
dng đưc mã hoá bởi một kiểu tái sắp xếp
(TSX) gen IG chuyên biệt. Kiểu TSX gen IG
đặc trưng cho từng dng tương bào đưc sử
dụng như một dấu ấn phân tử trong việc phát
hiện các dng tương bào ác tnh.
Phản ứng F-PCR kết hp điện di mao
quản giúp xác định đưc quần thể tương bào
ác tính với kiểu TSX gen IG biểu hiện đơn
dòng tại thi điểm chẩn đoán. Sau thi gian
điều trị, mẫu dịch hút tủy xương của ngưi
bệnh đưc thu nhận và thực hiện lại phản
ứng F-PCR kết hp điện di mao quản với
chính kiểu TSX gen IG đặc trưng tại thi
điểm chẩn đoán để xác định mức độ giảm
biểu hiện của dng tương bào ác tnh qua đó
đánh giá đưc TLTBAT ở ngưi bệnh. Độ
nhạy của phương pháp F-PCR kết hp điện
di mao quản các kiểu TSX gen IG theo
Martínez Sánchez (5) là trong khoảng 10-3 đến
10-4.
Việc xác định dng tương bào ác tnh
dựa trên kiểu TSX gen IG biểu hiện đơn
dòng tại thi điểm chẩn đoán của ngưi bệnh
ĐUTX đã đưc báo cáo trong một nghiên
cứu trước đây của nhóm (6). Vì vậy, nghiên
T¹P CHÝ Y häc viÖt nam tẬP 544 - th¸ng 11 - QuyỂN 2 - sè ĐẶC BIỆT - 2024
359
cứu này sẽ tiến hành bước tiếp theo để đánh
giá TLTBAT trên ngưi bệnh ĐUTX bằng
phương pháp F-PCR kết hp điện di mao
quản dựa trên dấu ấn phân tử là các kiểu
TSX gen IG đặc trưng cho ngưi bệnh.
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu: Ngưi bệnh
đưc chẩn đoán ĐUTX tại Bệnh viện Truyền
máu Huyết học (BV TMHH) trong thi gian
từ tháng 03/2022 đến tháng 06/2023.
Phương pháp nghiên cứu:
Thiết kế nghiên cứu: Mô tả loạt ca
Phương pháp tiến hành: Thực hiện phản
ứng F-PCR kết hp điện di mao quản các
kiểu TSX gen IG biểu hiện đơn dng đã
đưc xác định ở thi điểm chẩn đoán của
ngưi bệnh cho mẫu ở giai đoạn sau điều trị
tấn công (4 chu kì) với phác đồ VCD hoặc
VRD để xác định tính chất dng là đơn dng
hay đa dng, đồng thi ghi nhận chiều cao
của đỉnh sóng tương ứng đặc trưng cho dng
tương bào ác tnh.
Thu thập mẫu dịch hút tuỷ xương: Thu
thập khoảng 2ml thể tích mẫu dịch hút tuỷ
xương của ngưi bệnh, bảo quản mẫu trong
chất chống đông EDTA và chuyển đến
phòng thí nghiệm của khoa Di truyền học
phân tử - BV TMHH.
Ly trích DNA: Tách chiết DNA từ mẫu
dịch hút tuỷ xương bằng bộ kit ReliaPrepTM
Blood gDNA Miniprep System (Promega,
Hoa Kỳ) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Sản phẩm DNA sau ly trch đưc kiểm tra
nồng độ, độ tinh sạch và pha loãng để thu
đưc nồng độ 50 ng/ul.
Thực hiện phản ứng F-PCR: Các đoạn
mồi đưc thiết kế dựa trên trình tự chuỗi
DNA của các gen IG trong cơ sở dữ liệu của
GenBank, khảo sát trên vùng trình tự của gen
chuỗi nặng IGH và hai gen chuỗi nhẹ IGK và
IGL. Thực hiện phản ứng PCR trong máy
luân nhiệt theo chu kỳ nhiệt đã đưc tối ưu
hóa. Sản phẩm PCR sau đó đưc điện di trên
thạch agarose 2% để đánh giá mức độ biểu
hiện của kiểu TSX gen IG khảo sát. Với các
mẫu có băng điện di đậm hơn so với chứng
dương th đưc xác định là biểu hiện mạnh
và đưc phân tch điện đi mao quản để xác
định tính chất dòng.
Điện di mao quản sản phẩm F-PCR: Sản
phẩm PCR đưc xác định là biểu hiện mạnh
từ kết quả điện di trên thạch agarose 2%
đưc pha loãng với Nanopure water theo tỉ lệ
dựa trên độ đậm của băng điện di trên thạch
agarose, sau đó ha tan với 10μl Hi-di
formamide, 1μl ILS500 (thang chuẩn). Hỗn
hp điện di đưc biến tính ở 96ºC trong 3
phút và sốc nhiệt ở 0ºC trong 3 phút trước
khi tiến hành điện di mao quản bằng máy
ABI 3500 (Applied Biosystems, Hoa Kỳ).
Kết quả sẽ đưc phân tích bằng phần mềm
GeneMapper để xác định tính chất của dòng
tương bào là đơn bào hay đa bào.
Kiểu TSX gen IG đặc trưng cho dng
tương bào ác tnh đưc xác định khi kết quả
điện di mao quản xuất hiện đỉnh sóng có vị
tr tương ứng với kch thước sản phẩm PCR
của các kiểu TSX gen IG đã đưc khảo sát
và có chiều cao hơn t nhất 2,5 lần so với
đỉnh sóng tương ứng của mẫu chứng dương,
là mẫu của ngưi bnh thưng (Hình 1):
KỶ YẾU CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH HUYẾT HỌC - TRUYỀN MÁU
360
Hình 1: Kết quả đin di mao quản sản phẩm PCR kiểu tái sắp xếp gen IGK (Vk-Jk5)
(xuất hiện một đỉnh sóng tại vị trí 153bp
và cao hơn gấp 2,5 lần so với đỉnh sóng
tương đương của ngưi bnh thưng)
Đánh giá TLTBAT: Với những trưng
hp sau điều trị vẫn còn ghi nhận sự biểu
hiện đơn dng của kiểu TSX gen IG đặc
trưng cho dng tương bào ác tnh trên kết
quả điện di mao quản, thì mức độ giảm biểu
hiện kiểu TSX gen IG đưc tính dựa vào
công thức sau:
Trong đó:
• H1 là chiều cao đỉnh sóng tín hiệu
huỳnh quang tương ứng với kiểu TSX gen
IG đặc trưng của mẫu sau điều trị đưc pha
loãng theo tỷ lệ là 1/𝑛1.
• H2 là chiều cao đỉnh sóng tín hiệu
huỳnh quang tương ứng với kiểu TSX gen
IG đặc trưng của mẫu lúc chẩn đoán đưc
pha loãng theo tỷ lệ là 1/𝑛2.
Các ca đưc ghi nhận có kết quả
TLTBAT (+) khi sản phẩm PCR của ngưi
bệnh sau thi gian điều trị vẫn ghi nhận đưc
đỉnh sóng tại vị tr tương ứng với kiểu TSX
gen IG lúc chẩn đoán. Cn ngưi bệnh đưc
ghi nhận có kết quả TLTBAT (-) khi sau điều
trị không còn xuất hiện đỉnh sóng tại vị trí
tương ứng với kiểu TSX gen IG như lúc chẩn
đoán hoặc có sự giảm biểu hiện kiểu TSX
gen IG đặc trưng trên 3 log (tương ứng độ
nhạy ở mức 10-3).
III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Đặc điểm của dân số nghiên cứu
Trong thi gian nghiên cứu, chúng tôi đã
tiến hành đánh giá trên 65 ngưi bệnh đưc
chẩn đoán ĐUTX tại BV TMHH. Về độ tuổi,
tại thi điểm chẩn đoán, ngưi bệnh có độ
tuổi trung bình là 60 tuổi, trong đó ngưi
bệnh nhỏ tuổi nhất là 36 tuổi và lớn tuổi nhất
là 79 tuổi. Đa phần ngưi bệnh đưc chẩn
đoán ĐUTX sau 40 tuổi, trong đó, ngưi
bệnh thuộc nhóm từ 40-60 tuổi chiếm
T¹P CHÝ Y häc viÖt nam tẬP 544 - th¸ng 11 - QuyỂN 2 - sè ĐẶC BIỆT - 2024
361
46,15%, và nhóm ngưi bệnh trên 60 tuổi
chiếm 49,23%. Chỉ một số lưng t ngưi
bệnh lúc chẩn đoán là có độ tuổi nhỏ hơn 40,
chiếm tỷ lệ 4,62%. Về giới tính, chúng tôi
ghi nhận có trên 55% trưng hp ngưi bệnh
là nữ, cho thấy tỷ lệ mắc bệnh ĐUTX ở nữ
giới cao hơn so với nam giới theo như số liệu
từ nghiên cứu này (tỷ lệ nam: nữ là 0,8:1).
Ngưi bệnh thưng gặp các triệu chứng
lâm sàng, hay còn gọi là đặc điểm CRAB
gồm có tăng Calci trong máu, suy thận, thiếu
máu và tổn thương xương có thể gây gãy
xương bệnh lý. Trong đó, tổn thương xương
trong nghiên cứu của chúng tôi chiếm tỷ lệ
cao nhất, cho thấy tất cả ngưi bệnh đều bị
tổn thương t nhất 1 xương lúc chẩn đoán.
Tình trạng thiếu máu cũng là một đặc điểm
thưng gặp ở ngưi bệnh ĐUTX, chiếm tới
76,92%. Suy thận đưc ghi nhận trên 24 ca,
chiếm tỷ lệ 36,92%. Tỷ lệ ngưi bệnh tăng
Calci máu chiếm phần trăm thấp nhất so với
các đặc điểm còn lại, chiếm 13,84% (Bảng 1).
Bảng 1: Đặc điểm sinh học của người bnh ĐUTX
Đặc điểm
Số ca (N=65)
Tỷ lệ
Thiếu máu (Hb < 10g/dL)
50
76,92%
Suy thận (Creatinine > 177 umol/L)
24
36,92%
Tăng Calci máu (canxi ion > 0.25 mmol/L so với giới hạn trên)
9
13,84%
Tổn thương xương
65
100%
Thể bệnh
IgG
39
60%
IgA
15
23,07%
Tiết chuỗi nhẹ đơn thuần
11
16,93%
Giai đoạn bệnh theo R-ISS
Giai đoạn I
4
6,15%
Giai đoạn II
50
76,92%
Giai đoạn III
11
16,93%
Về đặc điểm thể bệnh, phần lớn ngưi
bệnh ĐUTX trong nghiên cứu là thể toàn tiết,
cụ thể có 39 ca là thể tiết IgG (chiếm tỷ lệ
60%) và 15 ca là thể tiết IgA (chiếm tỷ lệ
23,07%). Số lưng ngưi bệnh thuộc thể tiết
chuỗi nhẹ đơn thuần khá thấp, chỉ có 11 ca
với tỷ lệ là 16,93%. Về đặc điểm giai đoạn
bệnh theo R-ISS, theo kết quả ghi nhận đưc
ở giai đoạn chẩn đoán, ngưi bệnh đa phần ở
giai đoạn II theo phân loại R-ISS, với
76,92% trưng hp. Tỷ lệ ngưi bệnh ở giai
đoạn I và giai đoạn III thấp hơn đáng kể, lần
lưt là 6,15% và 16,93%.
Đánh giá TLTBAT bằng phương pháp
F-PCR kết hợp điện di mao quản dựa trên
kiểu TSX gen IG
Các trưng hp ngưi bệnh biểu hiện
đơn dng các kiểu TSX gen IG ở thi điểm
chẩn đoán đưc theo di điều trị và đánh giá
TLTBAT. Trong nghiên cứu của chúng tôi,
có 61 trưng hp (93,85%) ở thi điểm chẩn
đoán xác định đưc dng tương bào ác tnh
dựa trên các kiểu TSX gen IG biểu hiện đơn
dòng (Hình 2). Các ca bệnh này sẽ đưc theo
di điều trị, tiến hành thu nhận mẫu sau giai
đoạn điều trị tấn công để đánh giá TLTBAT
bằng phương pháp F-PCR kết hp điện di
mao quản.