Nghiên cứu Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 2 * 2020
B - Khoa học Dược
62
ỨNG DỤNG TÁC NHÂN ĐỐI QUANG TRONG PHÂN TÍCH
ĐỒNG PHÂN KETOPROFEN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN
Nguyễn Thị Minh Phương
*
, Hồ Quốc Việt
*
, Nguyễn Đức Tuấn
*
TÓM TẮT
Mở đầu: Beta-cyclodextrin (
-CD) và các dẫn chất của chúng được sử dụng phổ biến trong các phương
pháp sắc ký khí (GC), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), điện di mao quản (CE),... làm tác nhân đối quang phân
tách các dược chất là đồng phân quang học. So với một số lượng lớn các dược chất quang hoạt rất đa dạng về cấu
trúc và tính chất đang có mặt trên thị trường hiện nay thì số lượng các tác nhân quang hoạt được thương mại hóa
còn ít, giá thành cao. Gần đây nhóm nghiên cứu chúng tôi đã tổng hợp được một số dẫn chất
-CD, với mong
muốn chứng minh hiệu quả của các sản phẩm này trong vai trò làm đối quang để phân tách các đồng phân quang
học bằng CE, đề tài: “Ứng dụng tác nhân đối quang trong phân tích đồng phân ketoprofen bằng phương pháp
điện di mao quản” đã được thực hiện với mục tiêu xây dựng và thẩm định quy trình phân tích đồng phân quang
học ketoprofen bằng phương pháp điện di mao quản dùng tác nhân đối quang tự tổng hợp.
Đối tượng nghiên cứu: Viên nén Ketoprofene Biogaran L.P. 100 mg.
Phương pháp nghiên cứu: Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến độ phân giải của quá trình phân tích đồng
phân ketoprofen bằng phương pháp điện di mao quản như pH dung dịch điện ly nền (BGE), nồng độ dung dịch
điện ly nền, tác nhân đối quang và nồng độ tác nhân đối quang, nồng độ methanol thêm vào dung dịch điện ly
nền. Thẩm định quy trình phân tích bao gồm tính phù hợp hệ thống, tính đặc hiệu, độ lặp lại, khoảng tuyến tính
và độ đúng theo hướng dẫn ICH.
Kết quả: Quy trình phân tích đồng phân ketoprofen bằng phương pháp điện di mao quản đã được xây dựng,
sử dụng hệ điện ly nền phosphat 30 mM pH 6; tác nhân đối quang mono-6-amino-6-deoxy-β-CD 0,1%; 20%
methanol; điện thế 20 kV; nhiệt độ cột 25
o
C; áp suất bơm mẫu 50 mbar; thời gian bơm mẫu 5s; nội chuẩn
levofloxacin 50 µg/ ml, bước sóng phát hiện 260 nm. Kết quả thẩm định cho thấy quy trình phân tích
có tính đặc hiệu; khoảng tuyến tính 2 – 500 µg/ml cho mỗi đồng phân với hệ số tương quan (R
2
>
0,995); độ lặp lại đạt (RSD < 2%) và độ đúng với tỷ lệ phục hồi 98 – 103%.
Kết luận: Quy trình phân tích đồng phân quang học ketoprofen bằng phương pháp điện di mao quản đã
được xây dựng và thẩm định thành công. Quy trình có thể được ứng dụng để phân tích đồng phân ketoprofen
trong nguyên liệu và chế phẩm, xác định tạp đồng phân trong nguyên liệu và chế phẩm dexketoprofen.
Từ khóa: ketoprofen, dexketoprofen, mono-6-amino-6-deoxy-β-CD, điện di mao quản, đồng phân quang học
ABSTRACT
APPLICATION OF CHIRAL SELECTORS FOR ANALYSIS OF KETOPROFEN ENANTIOMERS
BY CAPILLARY ZONE ELECTROPHORESIS
Nguyen Thi Minh Phuong, Ho Quoc Viet, Nguyen Duc Tuan
* Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol. 24 - No. 2 - 2020: 62 - 67
Introduction: Beta-cyclodextrin (β-CD) and its derivatives arecommonly used as the chiral selectors for
analysis of enantiomer drugs by gas chromatography (GC), high performance liquid chromatography (HPLC) and
*
Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh
Tác giả liên lạc: ThS. Nguyễn Thị Minh Phương ĐT: 0909810668 Email: minhphuongvn80@yahoo.com
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 2 * 2020 Nghiên cứu
B - Khoa học Dược 63
capillary electrophoresis (CE). Recently, the requirement for quality control of chiral drugs is increasingly while
the number of commercial chiral selectors is limited and sold with high price. In Vietnam, some of β-
CDderivatives were successfully synthesized by our group. With the desire to prove the effect of these chiral
selectors, this study was carried out to application of chiral selectors for analysis of ketoprofen enantiomers by
capillary zone electrophoresis.
Methods: The subjects of this study was the Ketoprofene Biogaran L.P. 100 mg tablet. In this study, factors
affecting chiral separation in CE, including background eletrolyte (BGE) pH value, BGE concentration, chiral
selector, selector concentration, methanol concentration in BGE were examined. The analytical procedure was
validated as per ICH guideline.
Results: The CZE approach for seperation of ketoprofen enantiomers was successfully developed using 30
mM phosphate buffer pH 6 containing 0.1% mono-6-amino-6-deoxy-β-CD and 20% methanol, 25
o
C, 25 kV,
injection 5 s at 50 mbar; levofloxacin 50 µg/ ml as IS. Validation results showed that the method was suitable for
the CE system, selective, linear range from 2 - 500 µg/ ml for each enantiomer (R > 0.995), precise (RSD < 2%),
and accurate (recoveries in the range of 98 -103 % of the expected values).
Conclusion: The CZE approach for seperation of ketoprofen enantiomers was successfully developed and
validated. This procedure can be applies to analyse ketoprofen enantiomers in raw material or in pharmaceutical
products and to determine the chiral purity of dexketoprofen in raw material or in pharmaceutical products.
Keywords: ketoprofen, dexketoprofen, mono-6-amino-6-deoxy-β-CD, capillary electrophoresis, enantiomer
ĐẶT VẤN ĐỀ
Beta-cyclodextrin (-CD) và các dẫn chất của
chúng được sử dụng phổ biến trong các phương
pháp sắc ký khí (GC), sắc ký lỏng hiệu năng cao
(HPLC), điện di mao quản (CE) làm tác nhân đối
quang tách đồng phân quang học
(1-7)
, đặc biệt
được ứng dụng trong kiểm nghiệm các thuốc
chứa hoạt chất có tính quang hoạt. Để phân tích
các dược chất quang hoạt cần tác nhân đối
quang phù hợp với tính chất của dược chất, đôi
khi để phân tích được các dạng đồng phân của
một chất còn cần phải phối hợp nhiều tác nhân
quang hoạt với nhau. Các thuốc có hoạt chất là
dạng đồng phân riêng lẻ xuất hiện ngày càng
nhiều trên thị trường dược phẩm trong và ngoài
nước do có hoạt tính mạnh và ít tác dụng phụ
hơn dạng racemic của chúng như: S-amlodipin,
levofloxacin, levocetirizin, esomeprazol. So với
một số lượng lớn các dược chất quang hoạt rất
đa dạng về cấu trúc và tính chất đang có mặt
trên thị trường hiện nay thì số lượng các tác
nhân quang hoạt được thương mại hóa còn ít,
giá thành cao. Chính vì vậy, xu hướng của các
nhà nghiên cứu ở các nước hiện nay là tổng
hợp nhiều tác nhân tách đồng phân chuyên
biệt có tính chọn lọc cao và có giá trị kinh tế
(3,6)
.
Gần đây nhóm nghiên cứu chúng tôi đã tổng
hợp được các dẫn chất methyl-
-CD (M-
-
CD), methoxycarbonyl-
-CD (MC-
-CD),
carboxymethyl-
-CD (CM-
-CD) và mono-
6-amino-6-deoxy-β-CD (M6A- β-CD).
Với mong muốn chứng minh hiệu quả của
các sản phẩm này trong vai trò làm tác nhân đối
quang để phân tích các đồng phân quang học
bằng CE, đề tài: “Ứng dụng tác nhân đối quang
trong phân tích đồng phân ketoprofen bằng
phương pháp điện di mao quản” đã được thực
hiện với mục tiêu xây dựng và thẩm định quy
trình phân tích đồng phân quang học ketoprofen
bằng phương pháp điện di mao quản dùng tác
nhân đối quang tự tổng hợp.
NGUYÊN LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thiết bị
Cân phân tích Satorius, máy đo pH
Neomet 240 L, Máy điện di mao quản đầu dò
DAD Agilent CE 7100 (Đức).
Beta cyclodextrin (
-CD) (Himedia),
hydroxypropyl-
-CD (HP-
-CD) (Himedia),
Methyl-
-CD (M-
-CD), carboxymethyl-
-CD
Nghiên cứu Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 2 * 2020
B - Khoa học Dược
64
(CM-
-CD) và mono-6-amino-6-deoxy-β-CD
(M6A- β-CD) tổng hợp tại khoa Dược, Đại học Y
Dược TP. Hồ Chí Minh. Thuốc viên nén
Ketoprofene Biogaran L.P. (ketoprofen
tromethamin) 100 mg, số lô 30461, thuốc viên
nén Infen-25 (dextroketoprofen tromethamin) 25
mg. Ketoprofen tromethamin, levofloxacin
hydroclorid đối chiếu được cung cấp từ Viện
Kiểm Nghiệm TP. Hồ Chí Minh. Dexketoprofen
tromethamin đối chiếu (Sigma).
Dung dịch đối chiếu gốc ketoprofen 2000 ppm
(dung dịch A)
Pha trong methanol.
Dung dịch đối chiếu gốc dexketoprofen 1000
ppm (dung dịch B)
Pha trong methanol.
Dung dịch đối chiếu gốc levofloxacin 500 ppm
(dung dịch C)
Pha trong methanol.
Dung dịch đối chiếu ketoprofen thêm nội chuẩn
(ketoprofen 200 ppm; levofloxacin 50 ppm)
Hút chính xác 2 ml dung dịch A và 2 ml
dung dịch C cho vào bình định mức 20 ml. Thêm
nước vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng
lọc 0,22 µm trước khi dùng.
Dung dịch đối chiếu dexketoprofen thêm nội chuẩn
(dexketoprofen 100 ppm; levofloxacin 50 ppm)
Hút chính xác 2 ml dung dịch B và 2 ml dung
dịch C cho vào bình định mức 20 ml. Thêm nước
vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,22
µm trước khi dùng.
Dung dịch thử ketoprofen 2000 ppm (dung dịch D)
Cân chính xác 20 viên, tính khối lượng trung
bình của một viên, nghiền thành bột mịn. Cân
lượng bột tương ứng với 100 mg ketoprofen cho
vào bình định mức 50 ml. Thêm 30 ml ethanol.
Siêu âm trong 5 phút. Thêm methanol đến vạch
và lắc đều. Lọc qua giấy lọc.
Dung dịch thử dexketoprofen 1000 ppm (dung
dịch E)
Cân chính xác 20 viên, tính khối lượng trung
bình của một viên, nghiền mịn tất cả. Cân lượng
bột tương ứng với 50 mg dexketoprofen cho vào
bình định mức 50 ml. Thêm 30 ml ethanol. Siêu
âm trong 5 phút. Thêm methanol đến vạch và lắc
đều. Lọc qua giấy lọc.
Dung dịch thử ketoprofen thêm nội chuẩn
(ketoprofen 200 ppm; levofloxacin 50 ppm)
Hút chính xác 2 ml dung dịch D và 2 ml
dung dịch C cho vào bình định mức 20 ml. Thêm
nước vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng
lọc 0,22 µm trước khi dùng.
Dung dịch thử dexketoprofen thêm nội chuẩn
(dexketoprofen 100 ppm; levofloxacin 50 ppm)
Hút chính xác 2 ml dung dịch E và 2 ml dung
dịch C cho vào bình định mức 20 ml. Thêm nước
vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,22
µm trước khi dùng.
Dung dịch đệm phosphat 120 mM
Cân chính xác 1,8720 g NaH
2
PO
4
.2H
2
O cho
vào bình định mức 100 ml. Thêm khoảng 60
ml nước khử khoáng. Siêu âm trong 5 phút.
Thêm nước đến vạch và lắc đều. Từ dung dịch
này pha loãng thành dung dịch điện ly nền
với nồng độ mong muốn, điều chỉnh pH bằng
dung dịch natri hydroxit 0,1 M và acid
phosphoric 0,1 M. Dùng dung dịch điện ly nền
để pha dung dịch có chứa tác nhân đối quang
và MeOH với nồng độ khảo sát. Lọc qua màng
lọc 0,22 µm trước khi dùng.
Hoạt hóa cột bằng HCl trong 10 phút, H
2
O
trong 10 phút, NaOH 1M trong 30 phút, H
2
O
trong 30 phút rồi cân bằng với dung dịch điện
ly nền trong 30 phút trước khi tiến hành phân
tích. Đầu mỗi ngày, tiến hành rửa cột với HCl
trong 10 phút, H
2
O trong 10 phút, NaOH 0,1
M trong 10 phút, rồi rửa lại với H
2
O trong 10
phút, sau đó cân bằng với dung dịch điện ly
nền 30 phút. Điều kiện điện di: cột mao quản
silica nung chảy, đường kính trong 50 µm,
chiều dài tổng cộng 56 cm, chiều dài hiệu quả
50 cm; nhiệt độ mao quản 25
o
C; điện thế 20
kV; tiêm mẫu bằng chương trình áp suất 50
mbar × 5 giây; bước sóng phát hiện 260nm.
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 2 * 2020 Nghiên cứu
B - Khoa học Dược
65
Khảo sát các điều kiện: pH dung dịch điện ly
nền: phosphat 5 – 7; nồng độ dung dịch điện
ly nền 20 – 50 mM; tác nhân đối quang: β-CD,
M-β-CD, HP-β-CD, CM-β-CD, M6A-β-CD;
nồng độ tác nhân đối quang: 0,05 – 0,2%; nồng
độ methanol thêm vào 0 – 30%. Điều kiện điện
di được chọn phải có đáp ứng đầu dò cao, thời
gian phân tích hợp lý (< 20 phút), đường nền ít
bị nhiễu, hai đỉnh đồng phân tích nhau hoàn
toàn với độ phân giải Rs > 1,5. Khảo sát điều
kiện rửa cột giữa các lần phân tích, rửa cột
bằng HCl trong 0 – 5 phút, H2O trong 5 phút,
NaOH 0,1 M trong 0 – 5 phút, rồi rửa lại với
H2O trong 5 phút, sau đó cân bằng với dung
dịch điện ly nền 2 phút, mỗi điều kiện rửa cột
được áp dụng cho 4 lần tiêm mẫu liên tiếp để
gia tăng sự lặp lại của phương pháp.
Thẩm định quy trình được thực hiện theo
hướng dẫn của ICH
(8)
.
KẾT QUẢ
Ảnh hưởng của BGE pH đến độ phân giải
Tiến hành điện di dung dịch ketoprofen
hydroclorid với dung dịch điện ly nền
phosphat 30 mM, pH thay đổi từ 5,0 đến 7,0
khoảng cách pH là 0,5; chứa tác nhân đối
quang M6A-β-CD 0,2% và MeOH 20%. Kết
quả cho thấy đồng phân ketoprofen tách tốt
trong khoảng pH 5,0 – 7,0 (R
s
> 1,5) khi pH
tăng thời gian phân tích ngắn lại đồng thời độ
phân giải giảm, ở pH 5,5 và 5,0 thời gian di
chuyển của chất lớn hơn 20 phút. Chọn dung
dịch điện ly nền phosphat pH 6 làm điều kiện
điện di để tách đồng phân ketoprofen.
Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch điện ly nền
đến độ phân giải
Kết quả khảo sát cho thấy, đồng phân
ketoprofen tách tốt trong khoảng nồng độ
dung dịch điện ly nền từ 20 – 50 mM, (R
s
>
1,5), khi nồng độ BGE tăng độ phân giải tăng
lên và thời gian phân tích cũng tăng. Ở nồng độ
BGE 40 mM và 50 mM thời gian di chuyển của
chất phân tích > 20 phút. Chọn dung dịch điện
ly nền phosphat 30 mM pH 6 làm điều kiện
phân tích đồng phân ketoprofen.
Ảnh hưởng của tác nhân đối quang đến độ
phân giải
Tiến hành điện di ketoprofen với dung
dịch điện ly nền phosphat 30 mM, pH 6,
20% MeOH chứa các tác nhân khảo sát β-CD,
M-β-CD, HP-β-CD, CM-β-CD và M6A--β-CD ở
nồng độ khảo sát 0,2%. Kết quả khảo sát cho
thấy trong các loại tác nhân đối quang chỉ có
M6A-β-CD có khả năng tách đồng phân
ketoprofen.
Khảo sát độ phân giải của đồng phân
ketoprofen trong các dung dịch điện ly nền
chứa các nồng độ M6A-β-CD 0,05%, 0,1%,
0,15% và 0,2%.
Khi nồng độ tác nhân tăng độ phân giải tăng,
thời gian phân tích tăng, độ rộng đỉnh và độ bất
đối của đuỉnh trên điện di đồ tăng. Chọn nồng
độ tác nhân 0,1% cho độ phân giải, thời gian
phân tích và độ đối xứng đỉnh phù hợp.
Ảnh hưởng dung môi hữu cơ đến độ phân giải
Tiến hành điện di ketoprofen với dung dịch
điện ly nền phosphat 30 mM, pH 6, MeOH chứa
0,1% M6A-β-CD. Khảo sát độ MeOH thêm vào
dung dịch điện ly nền 0%, 10%, 20% và 30%.
Khi nồng độ MeOH tăng độ phân giải
tăng, thời gian phân tích tăng và độ bất đối
của dỉnh trên điện di đồ giảm, khi tăng nồng
độ MeOH từ 20 – 30% độ phân giải hầu như
không tăng. Chọn nồng độ MeOH 20% làm
điều kiện phân tích.
Ảnh hưởng của điều kiện rửa cột giữa các lần
tiêm mẫu đến sự lặp lại của kết quả điện di
Ở các quy trình rửa sử dụng HCl 0,1 M,
thời gian phân tích ở những lần tiêm mẫu sau
giảm khi tăng thời rửa với HCl 0,1 M. Ở các
quy trình rửa sử dụng NaOH 0,1 M, thời gian
phân tích ở những lần tiêm mẫu sau giảm khi
tăng thời rửa với NaOH 0,1 M. Khi sử dụng
quy trình rửa cột với HCl 0,1 M và NaOH 0,1 M
cho hiệu quả tốt hơn. Quy trình rửa HCl 0,1 M
Nghiên cứu Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 2 * 2020
B - Khoa học Dược
66
trong 5 phút, nước khử khoáng trong 5 phút,
NaOH 0,1 M trong 3 phút, nước khử khoáng
trong 5 phút, hoạt hóa bằng dung dịch đệm có
tác nhân đối quang trong 2 phút phù hợp với
quy trình phân tích đồng phân quang học
ketoprofen.
Thẩm định quy trình
Qua khảo sát đã chọn được quy trình phân
tích đồng phân ketoprofen bằng phương pháp
điện di mao quản: cột mao quản silica nung
chảy, đường kính trong 50 µm, chiều dài tổng
cộng 56 cm, chiều dài hiệu quả 50 cm; nhiệt độ
mao quản 25
o
C; điện thế 20 kV; tiêm mẫu bằng
chương trình áp suất 50 mbar × 5 giây; bước sóng
phát hiện 260nm; dung dịch điện ly nền:
phosphat 30 mM, pH 6, có chứa 0,1% M6A-β-CD
và 20% MeOH. Tiến hành thẩm định quy trình
theo hướng dẫn của ICH thu được kết quảvề
tính phù hợp hệ thống thể hiện trong Bảng 1.
Tính đặc hiệu được thể hiện khi tiến hành
điện di mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu thử và
mẫu thử thêm chuẩn với điều kiện đã khảo
sát. Kết quả tỷ số thời gian di chuyển giữa các
đỉnh trong mẫu thử so với chuẩn nội
levofloxacin tương đương với tỉ số thời gian di
chuyển giữa các đỉnh trong mẫu chuẩn so với
chuẩn nội levofloxacin, điện di đồ mẫu trắng
không có đỉnh trùng với đỉnh của mẫu đối
chiếu, diện tích đỉnh chuẩn hóa, chiều cao của
đỉnh của dung dịch thử thêm chất đối chiếu tăng
lên so với mẫu thử, được thể hiện ở Hình 1.
Hình 1. Điện di đồ mẫu trắng (a), mẫu chuẩn
ketoprofen (b), mẫu thử ketoprofen (c) và mẫu thử
ketoprofen thêm chuẩn ketoprofen (d), mẫu thử
ketoprofen thêm chuẩn dexketoprofen (e), mẫu chuẩn
dexketoprofen (f) và mẫu thử dexketoprofen (g)
Kết quả khoảng tuyến tính, độ lặp lại và độ
đúng của quy trình phân tích được thể hiện
trong Bảng 2. Kết quả thẩm định cho thấy quy
trình phân tích có tính đặc hiệu; khoảng tuyến
tính 2 - 500 µg/ cho mỗi đồng phân ml với hệ số
tương quan cao (R >0,995); độ lặp lại đạt (RSD
<2%) và độ đúng với tỷ lệ phục hồi 98 - 103%.
Bảng 1. Kết quả tính phù hợp hệ thống
Thông số Thống kê (n=6)
Racemic
Dexketoprofen
levoketoprofen
dexketoprofen
Tỷ số CorrArea*
Trung bình
0,824
0,828
0,847
RSD (%)
1,47
1,70
1,50
Tỷ số t
M
(phút)*
Trung bình
1,935
2,038
2,059
RSD (%)
0,91
0,82
0,77
Độ phân giải R
S
Trung bình
3,31
*CorrArea được tính bằng tỷ lệ diện tích đỉnh hiệu chuẩn của đỉnh đồng phân ketoprofen và diện tích đỉnh hiệu chuẩn của
đỉnh nội chuẩn levofloxacin; t
M
được tính bằng tỷ lệ thời gian di chuyển của đỉnh đồng phân ketoprofen và thời gian di chuyển
của đỉnh nội chuẩn levofloxacin
Bảng 2. Kết quả khoảng tuyến tính, độ lặp lại và độ đúng
Thông số
Racemic
Dexketoprofen
Khoảng tuyến tính (µg/ml)
2 – 500 (R
2
= 0.999)
Độ lặp lại (n = 6)
RSD = 1,61%
Độ đúng (n = 9)
98 – 102%
BÀN LUẬN
Trong quá trình điện di, khi pH giảm, sẽ làm
giảm cường độ dòng EOF, vì vậy khi pH giảm
tốc độ di chuyển tương đối của chất phân tích sẽ
phụ thuộc nhiều hơn bởi tốc độ điện di của