Nghiên cứu công nghệ đông lạnh bảo tồn tinh dịch chó Malinois

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

ĐẶNG ĐÌNH THÀNH

NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ ĐÔNG LẠNH BẢO TỒN

TINH DỊCH CHÓ MALINOIS

Chuyên ngành:

Chăn nuôi

Mã số:

60.62.01.05 Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Nguyễn Bá Mùi

2. TS. Đỗ Văn Thu

NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào.

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám

ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Tác giả luận văn

Đặng Đình Thành

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới hai người thầy của tôi PGS. TS. Nguyễn Bá Mùi và TS. Đỗ Văn Thu người đã hướng cho tôi những ý tưởng khoa học, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn này.

Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể phòng Sinh học tế bào sinh sản, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành khóa học và luận văn này.

Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể cán bộ công nhân viên Cục Cảnh sát quản lý, huấn luyện và sử dụng động vật ngiệp vụ (K204) - Bộ Công an đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện nghiên cứu này.

Tôi xin cảm ơn tất cả các thầy cô giáo Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã dạy dỗ, chia sẻ, động viên, giúp tôi vượt qua mọi khó khăn để hoàn thành tốt khóa học và nghiên cứu của mình.

Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn đến bố mẹ, gia đình, bè bạn, những người luôn bên tôi, động viên, góp ý và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu.

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Tác giả luận văn

Đặng Đình Thành

MỤC LỤC

Lời cam đoan ..................................................................................................................... i

Lời cảm ơn ........................................................................................................................ ii

Mục lục ........................................................................................................................... iii

Danh mục các từ viết tắt .................................................................................................. vi

Danh mục bảng ............................................................................................................... vii

Danh mục hình ............................................................................................................... viii

Danh mục sơ đồ ............................................................................................................... ix

Trích yếu luận văn ............................................................................................................ x

Thesis abstract .................................................................................................................. xi

Phần 1. Mở đầu ............................................................................................................... 1

1.1.

Tính cấp thiết của đề tài ...................................................................................... 1

1.2. Mục tiêu .............................................................................................................. 2

1.3.

Ý nghĩa khoa học của đề tài ................................................................................ 2

Phần 2. Tổng quan tài liệu ............................................................................................. 3

2.1.

Tổng quan về chó Malinois ................................................................................ 3

2.2.

Tinh dịch chó ...................................................................................................... 3

2.2.1. Tinh thanh ........................................................................................................... 4

2.2.2. Tinh trùng ........................................................................................................... 4

2.2.3. Hình thái- cấu tạo của tinh trùng. ...................................................................... 4

2.2.4. Đặc tính của tinh trùng chó. ................................................................................ 5

2.3. Một số chỉ tiêu sinh học tinh dịch chó ................................................................ 7

2.3.1. Lượng tinh dịch (Vml) ........................................................................................ 7

2.3.2. Hoạt lực tinh trùng (A%). ................................................................................... 8

2.3.3. Nồng độ tinh trùng (C) ....................................................................................... 9

2.3.4. Tinh trùng kỳ hình (K%) .................................................................................... 9

2.3.5. Tổng số tinh trùng tiến thẳng trong một lần lấy tinh (V.A.C) .......................... 10

2.3.6. Tỷ lệ tinh trùng sống (Ls%) .............................................................................. 10

iii

2.4.

Đặc điểm lý hoá của tinh dịch chó ................................................................... 11

2.4.1. Tỷ trọng của tinh dịch (d). ................................................................................ 11

2.4.2. Áp lực thẩm thấu (posm). ................................................................................. 11

2.4.3. Năng lực đệm của tinh dịch (β). ....................................................................... 11

2.4.4. Độ nhớt của tinh dịch.(η) .................................................................................. 11

2.4.5. pH của tinh dịch. ............................................................................................... 11

2.5.

Nguyên tắc xây dựng môi trường đông lạnh bảo tồn tinh dịch chó ................. 12

2.6.

Nghiên cứu môi trường đông lạnh bảo tồn tinh dịch chó ................................. 13

2.7.

Thụ tinh nhân tạo cho chó ................................................................................ 15

2.7.1. Sơ lược về quá trình giao phối và phóng tinh. .................................................. 15

2.7.2. Các chu kỳ động dục của chó cái. .................................................................... 16

2.7.3. Thụ tinh nhân tạo. ............................................................................................. 17

2.8.

Tình hình phát triển và sử dụng chó malinois tại Việt Nam ............................. 19

Phần 3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu ............................................................ 20

3.1.

Địa điểm nghiên cứu ......................................................................................... 20

3.2.

Thời gian nghiên cứu ........................................................................................ 20

3.3.

Đối tượng nghiên cứu ....................................................................................... 20

3.4.

Nội dung nghiên cứu ........................................................................................ 21

3.4.1. Đánh giá một số chỉ tiêu sinh học và tính chất lý hóa học của tinh dịch

chó Malinois ..................................................................................................... 21

3.4.2. Nghiên cứu công nghệ đông lạnh tinh dịch chó Malinois và ứng dụng

sản xuất tinh chó đông lạnh bảo tồn ở -196C.................................................. 21

3.4.3. Sản xuất tinh chó Malinois đông lạnh .............................................................. 21

3.5.

Phương pháp nghiên cứu .................................................................................. 22

3.5.1. Phương pháp lấy tinh ........................................................................................ 22

3.5.2. Phương pháp nghiên cứu sinh học tinh dịch chó .............................................. 22

3.5.3. Nghiên cứu môi trường bảo tồn ........................................................................ 23

3.5.4. Phương pháp xử lý số liệu ................................................................................ 29

Phần 4. Kết quả vào thảo luận ..................................................................................... 30

4.1.

Sinh học tinh dịch chó Malinois ....................................................................... 30

4.1.1. Một số đặc điểm sinh học tinh dịch chó Malinois ............................................ 30

4.1.2. Tính chất lý hóa của tinh dịch chó Malinois .................................................... 35

4.2.

Nghiên cứu hoàn thiện công nghệ đông lạnh tinh dịch chó và ứng dụng

sản xuất tinh chó Malinois đông lạnh bảo tồn ở -196c ................................... 36

4.2.1. Tính chất hóa - lý của một số môi trường đông lạnh tinh dịch ........................ 36

4.2.2. Ảnh hưởng của glycerol và dimethyl sulfoxide (DMSO) lên chất lượng

tinh đông lạnh ................................................................................................... 36

4.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ glycerol lên chất lượng tinh đông lạnh ..................... 38

4.2.4. Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung phần môi trường có glycerol lên chất

lượng tinh đông lạnh ......................................................................................... 40

4.2.5. Ảnh hưởng của thời gian ủ tinh dịch trước đông lạnh lên phẩm chất tinh

đông lạnh .......................................................................................................... 41

4.2.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ đông lạnh lên chất lượng tinh đông lạnh ................... 43

4.2.7. Ảnh hưởng của tốc độ giải đông lên phẩm chất tinh đông lạnh ....................... 44

4.2.8. Kết quả sản xuất đông lạnh tinh dịch của chó .................................................. 46

4.2.9. Kết quả kiểm tra định kỳ chất lượng tinh chó Malinois đông lạnh .................. 49

4.3.

Kết quả thụ tinh nhân tạo cho chó Malinois ..................................................... 51

Phần 5. Kết luận và kiến nghị ...................................................................................... 53

5.1.

Kết luận ............................................................................................................. 53

5.2.

Kiến nghị .......................................................................................................... 53

Tài liệu tham khảo .......................................................................................................... 54

Phụ lục .......................................................................................................................... 57

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Độ nhớt



Năng lực đệm



Hoạt lực tinh trùng

Nồng độ tinh trùng

Tỷ trọng

DMSO

Dimethyl sulfoxide

Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình

OEP

Orvus ES Paste

Posm

Áp lực thẩm thấu

Tỷ lệ tinh trùng sống

TTNT

Thụ tinh nhân tạo

Lượng tinh dịch

V.A.C

Tổng số tinh trùng tiến thẳng

Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt

DANH MỤC BẢNG

Bảng 4.1. Một số chỉ tiêu sinh học tinh dịch chó Malinois (n=54) .............................. 31

Bảng 4.2. Tính chất lý hóa của tinh dịch chó Malinois (n= 54) ................................... 35

Bảng 4.3. Một số tính chất hoá - lý của các môi trường đông lạnh tinh dịch

(n=20) ........................................................................................................... 36

Bảng 4.4. So sánh ảnh hưởng của glycerol và DMSO lên chất lượng tinh dịch

(n=54) ........................................................................................................... 37

Bảng 4.5. Ảnh hưởng của nồng độ glycerol trong môi trường lên chất lượng tinh

đông lạnh (n=54) .......................................................................................... 39

Bảng 4.6. Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung môi trường có glycerol lên chất

lượng tinh chó đông lạnh (n=30) ................................................................. 40

Bảng 4.7. Ảnh hưởng của thời gian ủ tinh dịch trước đông lạnh lên phẩm chất

tinh đông lạnh (n=30)................................................................................... 42

Bảng 4.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ đông lạnh lên chất lượng tinh đông lạnh

(n=30) ........................................................................................................... 43

Bảng 4.9. Ảnh hưởng của tốc độ giải đông (nhiệt độ và thời gian) lên chất lượng

tinh đông lạnh – giải đông (n=40)................................................................ 44

Bảng 4.10. Hoạt lực tinh trùng trong quá trình đông lạnh (n=30) ................................. 47

Bảng 4.11. Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình trong quá trình đông lạnh (n=30) .......................... 48

Bảng 4.12. Tỷ lệ sống của tinh trùng trong quá trình đông lạnh (n=30) ........................ 49

Bảng 4.13. Hoạt lực tinh trùng của tinh đông lạnh trong thời gian bảo tồn ở -

1960C (n=16) ................................................................................................ 49

Bảng 4.14. Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình của tinh đông lạnh trong thời gian bảo tồn ở -

1960C (n=16) ................................................................................................ 50

Bảng 4.15:. Kết quả thụ tinh nhân tạo bằng tinh chó Malinois đông lạnh ...................... 52

vii

DANH MỤC HÌNH

Hình 3.1. Chó Malinois đực tham gia nghiên cứu ....................................................... 20

Hình 4.1. Tinh trùng sống - chết .................................................................................. 33

Hình 4.2. Tinh trùng kỳ hình của chó Malinois ........................................................... 34

Hình 4.3. Ảnh hưởng của chất bảo vệ lạnh lên hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh ..... 38

Hình 4.4. Ảnh hưởng của nồng độ glycerol lên hoạt lực tinh trùng trước và sau

đông lạnh ...................................................................................................... 39

Hình 4.5. Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung môi trường có glycerol lên hoạt lực

tinh trùng sau đông lạnh ............................................................................... 41

Hình 4.6. Ảnh hưởng của thời gian ủ tinh dịch trước khi đông lạnh lên hoạt lực

tinh trùng ...................................................................................................... 42

Hình 4.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ đông lạnh lên hoạt lực của tinh trùng ................... 44

viii

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 3.1. Quy trình thụ tinh nhân tạo cho chó sử dụng tinh đông lạnh dạng cọng rạ ....... 29

Sơ đồ 4.1. Quy trình đông lạnh tinh dịch chó Malinois ................................................ 46

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Tên tác giả: Đặng Đình Thành

Tên Luận văn: “Nghiên cứu công nghệ đông lạnh bảo tồn tinh dịch chó Malinois”

Ngành: Chăn nuôi

Mã số: 60.62.01.05

Tên cơ sở đào tạo : Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Mục đích nghiên cứu

Xây dựng công nghệ đông lạnh bảo tồn tinh dịnh chó Malinois, phục vụ thụ tinh

nhân tạo và bảo tồn nguồn gene.

Phương pháp nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu

Chó Malinois nuôi tại Cục Cảnh sát quản lý, huấn luyện và sử dụng động vật

nghiệp vụ (K204) – Bộ Công an.

Sử dụng 07 chó Malinois đực và 10 chó Malinois cái. Chó đực trong độ tuổi từ

1,5 – 3 tuổi, khỏe mạnh; chó cái từ 2 - 3 tuổi, đã đẻ 1 – 2 lứa, khỏe mạnh.

Nội dung nghiên cứu

- Đánh giá một số chỉ tiêu sinh học và tính chất lý hóa học của tinh dịch chó

Malinois.

- Nghiên cứu công nghệ đông lạnh tinh dịch chó Malinois và ứng dụng sản xuất

tinh chó đông lạnh bảo tồn ở -196C.

- Sản xuất tinh chó Malinois đông lạnh.

Phương pháp nghiên cứu

- Theo phương pháp của Chemineau (1991) để đánh giá một số chỉ tiêu sinh học và tính chất lý hóa học của tinh dịch chó Malinois: Lượng tinh dịch (V), Hoạt lực tinh trùng (A), Nồng độ tinh trùng (C), Tổng số tinh trùng tiến thẳng (V.A.C), Tỷ lệ tinh trùng sống (LS), Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình (K).

- Môi trường đông lạnh tinh dịch chó bao gồm: Tris(hydroxylmethyl), citric acid, fructosse, lactose, raffinose, lòng đỏ trứng, glycerol, streptomycin, penicillin và nước cất hai lần.

Kết quả chính và kết luận

- Chọn được môi trường 1 làm môi trường đông lạnh phù hợp với tinh dịch chó

Malinois.

- Đã sản xuất và bảo tồn được 219 liều tinh chó Malinois đông lạnh cọng rạ (hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh 38 - 40%). Tinh chó đông lạnh có chất lượng ổn định trong thời gian bảo tồn ở nitơ lỏng -1960C.

THESIS ABSTRACT

Master candidate: Đang Đinh Thanh

Thesis title: “Research technology preserving frozen semen Malinois dogs”

Major: Aliman Sciece

Code: 60.62.01.05

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA)

Research Objectives : Construction technology conservation frozen semen

Malinois dog, served artificial insemination and genetic resource conservation.

Materials and Methods

Malinois dog breeding at the Police management Department management,

training and professional animal use (K204) - The Ministry of Public Security.

Malinois dogs used 07 male and 10 female Malinois dogs. Males aged 1.5 to 3

years old, healthy; bitch from 2-3 years old, was laying 1-2 litters, healthy.

Research content

Evaluation of biological indicators of chemical and physical properties of semen

Malinois dogs.

- Technology research Malinois dog frozen semen and sperm production

applications preserved frozen dog in -196C.

- Production of frozen crystals Malinois dogs.

Methods:

According to the method of Chemineau (1991) to evaluate biological indicators of

chemical and physical properties of the Malinois dog semen: semen volume (V), sperm

motility (A), sperm concentration (C), total sperm straight (VAC), Proportion of live

sperm (LS), sperm abnormality Ratio (K).

- The semen extender was used for freezing containing: Tris (hydroxylmethyl)

aminomethane, citric acid,

fructosse,

lactose,

raffinose, egg yolk, glycerol,

streptomycin, penicillin and bidistilled water.

Main findings and conclusions

- Select one the freezing extender for Malinois dog semen.

- Has the production and conservation are 219 frozen semen straws Malinois dogs

(motile sperm frozen after 38-40%). Dog frozen crystals with stable quality during

conservation in liquid nitrogen -196C.

PHẦN 1. MỞ ĐẦU

1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Malinois là giống chó chăn cừu của Bỉ có ngoại hình khá giống chó chăn

cừu của Đức nên thường được gọi là Berger Bỉ. Giống chó này linh hoạt và có

chỉ số thông minh cao. Chúng được lực lượng Cảnh sát huấn luyện, sử dụng vào

các chuyên khoa như: bảo vệ - truy tìm dấu vết hơi, giám biệt mùi hơi người,

lùng sục phát hiện các chất đặc định (ma túy, thuốc nổ), tìm kiếm cứu nạn, chống

khủng bố...

Chó Malinois mới được nhập khẩu vào nước ta khoảng 4 năm gần đây. Sau

một thời gian nuôi dưỡng, huấn luyện chó Malinois được đánh giá là thích hợp với

điều kiện của Việt Nam. Hiện nay, nhu cầu sử dụng chó Malinois vào mục đích an

ninh, quốc phòng tương đối lớn. Tuy nhiên, giá thành nhập khẩu của giống chó này

cao, đồng thời mất nhiều chi phí cho việc nuôi thích nghi sau khi nhập về.

Hiện nay, tại Cục Cảnh sát quản lý, huấn luyện và sử dụng động vật

nghiệp vụ (K204) – Bộ Công an đang nuôi dưỡng một đàn chó Malinois thuần

chủng. Ở ngoài dân, cũng có 1 số lượng chó Malinois được nuôi dưỡng sử dụng

cho việc bảo vệ và làm kinh tế. Tuy nhiên, do chưa có một hệ thống nhân giống

theo quy hoạch, việc nuôi dưỡng tự phát và phối giống thiếu kiểm soát đã làm

mất đi những đặc điểm, khả năng vốn có của giống chó này.

Công nghệ đông lạnh tinh dịch chó và phương pháp thụ tinh nhân tạo cho

chó được cho là giải pháp hiệu quả với những khó khăn trong công tác lưu giữ và

phát triển đàn chó thuần chủng đã được các nhà khoa học thuộc Phòng Sinh học

tế bào sinh sản, Viện Công nghệ sinh học tiến hành nghiên cứu từ những năm

2005. Trải qua hơn 1 thập kỉ nghiên cứu và phát triển, các nhà khoa học đã nhận

được những kết quả nghiên cứu khả quan và từng bước đang hoàn thiện những

kết quả nghiên cứu của mình. Tuy nhiên, những kết quả nghiên cứu về đông lạnh

tinh dịch chó hiện đang áp dụng chung cho một số giống chó nghiên cứu như:

Berger (Đức), Labrado, Cooker, Phú Quốc... Do vậy, việc nghiên cứu chuyên sâu

về công nghệ đông lạnh tinh dịch cho từng giống chó là rất cần thiết để có thể

nâng cao hiệu quả của việc lưu giữ và bảo tồn tinh dịch chó.

Việc phát triển đàn chó Malinois thuần chủng có chất lượng cao là vấn đề cấp thiết và đang được quan tâm đặc biệt bởi các đơn vị an ninh, quốc phòng. Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn đó, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài.

“Nghiên cứu công nghệ đông lạnh bảo tồn tinh dịch chó Malinois”

1.2. MỤC TIÊU

Xây dựng công nghệ đông lạnh bảo tồn tinh dịnh chó Malinois, phục vụ

thụ tinh nhân tạo và bảo tồn nguồn gene.

1.3. Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI

- Nghiên cứu có hệ thống một số đặc điểm sinh học tinh dịch và một số tính

chất lý hóa học của tinh dịch chó Malinois.

- Xây dựng môi trường và quy trình đông lạnh tinh cọng rạ của chó Malinois. Từ đó nâng cao hiệu quả của việc bảo tồn tinh dịch chó Malinois đồng thời góp phần phát triển đàn chó Malinois có chất lượng cao phục vụ công tác an

ninh, quốc phòng.

PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. TỔNG QUAN VỀ CHÓ MALİNOİS

Malinois là giống chó được đặt tên theo thành phố Malines của Bỉ. Nó là một trong bốn loài chó chăn cừu của Bỉ: Chó Malinois linh hoạt và có chỉ số thông minh cao, vượt trội trong những công việc như truy tìm ma túy, phát hiện bom mìn, vật liệu nổ, bảo vệ, canh gác, tìm kiếm cứu nạn, chăn gia súc, kéo xe, kéo vật nặng, dẫn đường cho người khiếm thị và hỗ trợ người khuyết tật.

Chó Malinois có một cơ thể vuông vắn: chó đực cao từ 61 - 66 cm, trọng lượng khoảng 25 – 30 kg; chó cái cao 56 – 61 cm, trọng lượng khoảng 20 –25 kg. Ngực sâu, lưng hơi thoải dần từ vai xuống, kích cỡ toàn bộ đầu thủ phù hợp với cơ thể, hộp sọ phẳng với độ dài và rộng tương đồng nhau. Mõm hơi nhọn và dài bằng chiều dài của hộp sọ, mặt hơi gãy, mũi đen và cặp môi khít, mắt nâu, tai dựng hình tam giác, đuôi khỏe xương đuôi tiến tới sát khuỷu chân sau, bàn chân

hình như chân mèo.

Chó Malinois có bộ lông kép ngắn, thẳng chống chịu được thời tiết khăc nhiệt, màu lông có thể là nâu sẫm tới đỏ, màu gụ tới đen. Mặt và tai màu đen. Bộ lông mượt và ngắn của Malinois dễ chăm sóc, thường thay lông theo mùa, hai lần

trong năm (mùa hè và mùa đông).

Tuổi thọ của chó Malinois khoảng từ 12 - 14 năm, lứa đẻ trung bình 06 - 10 con. Giống chó này khỏe mạnh, cứng cáp không có những vấn đề nghiêm trọng về sức khỏe nào. Chó Malinois có thể biểu hiện hành vi chăn gia súc một

cách bản năng như rượt đuổi và chạy quanh, di chuyển dễ dàng trong nhiều giờ.

2.2. TINH DỊCH CHÓ

Tinh dịch là dịch tiết của cơ quan sinh dục đực khi con đực thực hiện

thành công phản xạ sinh dục.

Tinh dịch được sinh ra ở dịch hoàn và nó được hoàn thiện chức năng ở

mào tinh, giữ lại ở đó.

Tinh dịch gồm hai phần: Tinh thanh chiếm 95-97% và tinh trùng

chiếm 3-5%.

2.2.1. Tinh thanh

Tinh thanh là hỗn hợp những chất lỏng được tiết ra từ các tuyến sinh dục

phụ, nó không giống dịch thể của cơ thể. Tinh thanh chủ yếu là nước. Tuỳ theo

từng loại gia súc khác nhau mà lượng nước khác nhau. Tinh thanh có tác dụng

rửa tuyến niệu đạo sinh dục, đóng cửa cổ tử cung, kích thích cơ quan sinh dục

của con cái hoạt hoá, nuôi sống tinh trùng ngoài cơ thể.

Thành phần chất tiết của các tuyến sinh dục phụ cũng như thứ tự tiết của

chúng trong phóng xạ phóng tinh có ý nghĩa sinh lý đặc biệt. Đầu tiên tuyến cầu

liệu đạo tiết, thứ đến tinh trùng cùng với chất tiết của tuyến tiền liệt, và tinh hoàn

phụ, cuối cùng là chất tiết của tuyến tinh nang.

Tuyến tiền liệt ở chó rất phát triển. Tuyến tiền liệt có những lỗ đổ vào

niệu đạo, dịch tiết của tuyến không trong suốt, có tính kiềm nhằm tác dụng trung

hoà độ axit trong lòng niệu đạo và H2CO3 do tinh trùng sản sinh ra trong quá

trình hoạt động.

Tuyến tinh nang tiết ra một thứ keo màu trắng hoặc vàng chứa men

Vegikinaza và globulin. Chất keo này gặp dịch tiết của tuyến tiền liệt thì kết lại

tạo ra một cái nút để đóng cổ tử cung sau quá trình giao phối trực tiếp. Mục đích

không cho tinh trùng chảy ngược ra ngoài. Trong thụ tinh nhân tạo người ta

nhanh chóng lọc bỏ keo phèn đó vì nếu không nó sẽ hấp thụ nước và một số

lượng lớn tinh trùng làm tinh trùng bị kết dính.

Trong dịch tiết này còn có cả đệm phosphate và carbonate là hợp chất

quan trọng vì chúng giữ tinh dịch được ổn định.

2.2.2. Tinh trùng

Tinh trùng được sinh ra từ những ống sinh tinh ở dịch hoàn. Tinh trùng là

tế bào sinh dục đực (đây là tế bào duy nhất có khả năng tự vận động) đã hoàn

chỉnh về hình thái, cấu tạo và đặc tính sinh lý, sinh hoá học bên trong và có khả

năng thụ tinh. Nói cách khác tinh trùng là tế bào sinh dục đực đã qua kỳ phân

chia giảm nhiễm, đã thành thục và có khả năng thụ tinh.

2.2.3. Hình thái- cấu tạo của tinh trùng.

Hình thái tinh trùng của chó nói chung có dạng con nòng nọc. Chiều dài đầu

gấp đôi chiều rộng và bề dày không đáng kể.

Tinh trùng gồm 3 phần khác nhau: Đầu, cổ- thân, đuôi

* Phần đầu

Trong màng trên cùng của đầu là hệ thống acrosom

Phần trước của đầu được bao phủ một mũ mỏng, tức bao đầu (Galea

Capitis). Dưới lớp này có cấu tạo hình dải gọi là thể ngọn.

Trong bao đầu tập trung enzyme hyaluronidara, enzyme này giúp tinh

trùng chui qua màng phóng xạ của trứng trong quá trình thụ tinh.

Khi bảo tồn, hệ thống acrosom dễ bị trương phồng lên, rời khỏi đầu tinh

trùng, làm tinh trùng mất khả năng thụ tinh, nhất là trong môi trường nhược

trương. Sau hệ thống acrosom là nhân tinh trùng. Nhân chiếm 76,7-80,3%, nó là

kho duy nhất chứa nhân tố di truyền của con đực.

* Phần cổ- thân

Phần cổ thân dính với phần đầu rất lỏng lẻo, điều đó phù hợp với quá trình

thụ tinh là khi xâm nhập vào trứng thì cổ bị gẫy và đuôi rơi ra. Nhưng chính vì

nó dễ bị đứt bởi tác động cơ giới, nhiệt và hoá chất dẫn đến giảm tỉ lệ thụ tinh

hoặc tinh trùng không có khả năng thụ tinh.

* Phần đuôi

Bao quanh phần đuôi là màng chung của tinh trùng. Cấu tạo của đoạn đuôi

gồm 2 sợi dọc ở trung tâm và 9 đôi sợi dọc khác bao quanh, ngoài ra còn có sợi

xoắn, các sợi này được xếp theo như vòng tròn đồng tâm. Ở phía trên xếp mau

hơn, to hơn và chúng được duỗi ra ở phần đuôi tạo thành chùm tơ đuôi. Chùm tơ

đuôi không bi màng bao phủ, chúng được tự do hoạt động như một mái chèo

giúp tinh trùng vận động.

2.2.4. Đặc tính của tinh trùng chó. a. Đặc tính chuyển động:

Đuôi ngoằn ngoèo uốn khúc dao dộng gây xung động để tự tiến tới trước.

Ngoài tinh trùng có đầu giống như quả lê nên tự nó chuyển động quanh trục của

thân nó. Sự rung động của đuôi kết hợp với sự quay của trục giữa làm cho tinh

trùng có khả năng vận động.

+ Các phương thức vận động:

-Vận động tiến thẳng: Đây là phương thức vận động đặc trưng của tinh

trùng, có vectơ chuyển động không thay đổi. Chỉ có những tinh trùng chuyển

động tiến thẳng mới có khả năng thụ tinh cho nên chỉ tiêu vận động tiến thẳng

chính là chỉ tiêu đánh giá chất lượng tinh trùng.

-Vận động xoay tròn: Đây là phương thức hoạt động với vectơ chuyển

động thay đổi, do vậy chúng không có khả năng gặp được tế bào trứng trong

đường sinh dục cái.

-Vận động lắc lư: Đây là phương thức hoạt động không có vectơ, đó là

tinh trùng vận động lắc lư tại chỗ, sức sống yếu nên cũng không có khả năng

thụ tinh.

b. Đặc tính lội ngược dòng nước:

Tinh trùng chuyển động được nhờ đuôi lái, do đó nó có thể chuyển động

ngược dòng nước và cũng có xu hướng lội ngược dòng nước.

c. Đặc tính tiếp xúc:

Đối với một vật lạ, tinh trùng có đặc tính bao vây xung quanh vật lạ ấy

d. Đặc tính tiếp xúc với hoá chất:

Trong ống dẫn trứng có tiết ra chất hoá học, kích thích tinh trùng hưng

phấn, làm tinh trùng tập trung lại và tiến đến tế bào trứng. Chất hoá học này là

chất fertilizing.

e. Đặc tính tiếp xúc với điện:

Trong ống dẫn trứng hay tử cung có một điện thế mà bản thân tinh trùng

mang điện nên cũng có điện thế, đặc tính của dòng điện chạy từ cao tới thấp nên

tinh trùng chuyển động có phương hướng nhất định.

f. Khả năng trao đổi chất:

Sự trao đổi chất điển hình trong tinh trùng gồm có 2 phần: Glycose và

hô hấp

+ Glycose: pH tinh dịch bảo tồn trong invitro giảm dần theo thời gian, đó

là vì tinh trùng phân huỷ fructose trong tinh thanh để tạo axit lactic, axit lactic

được sản sinh theo con đường Ebden-meyerhof.

Trong điều kiện yếm khí một số axit lactic được sản sinh ra và đi vào chu

trình tricacbonxylic và được phân huỷ thành cacbonic và nước. Chỉ số phân huỷ

fructose được sử dụng để đánh giá chất lượng tinh dịch.

+ Hô hấp: Tinh trùng nhận năng lượng chủ yếu thông qua hô hấp trong

điều kiện hiếu khí. Quá trình hô hấp của tinh trùng chủ yếu là sử dụng oxy để đốt

cháy cơ chất có trong bản thân nó hoặc sẽ oxy hoá triệt để hơn đường có trong

tinh dịch.

2.3. MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH HỌC TINH DỊCH CHÓ

Nghiên cứu các đặc điểm sinh học tinh dịch của chó có vai trò rất quan

trọng, là cơ sở khoa học để pha chế các môi trường pha loãng và đông lạnh. Căn

cứ vào các chỉ tiêu sinh học tinh dịch, có thể đánh giá phẩm chất tinh dịch, giúp

tuyển chọn được đực giống có phẩm giống tốt phục vụ cho thụ tinh nhân tạo và

bảo tồn quỹ gen. Nghiên cứu về đặc điểm tinh dịch chó, Kojima (2001) đã nhận

thấy rằng: thể tích tinh dịch và tổng số tinh trùng trong một lần lấy tinh thấp,

nhưng nồng độ tinh trùng, hoạt lực, sức sống và hình thái của tinh trùng chó là

tương đương với các loài khác. Một số chỉ tiêu sinh học tinh dịch đã được nghiên

cứu: pH 7,6; thể tích tinh dịch 0,212 ml; nồng độ tinh trùng 361 triệu/ ml; tổng số

tinh trùng 84 triệu/ ml; hoạt lực tinh trùng 77 %; sức sống tinh trùng 77 %; tỷ lệ

tinh trùng kỳ hình 11 % (Đỗ Văn Thu, 2010).

2.3.1. Lượng tinh dịch (Vml)

Lượng tinh dịch là số lượng tinh dịch xuất ra trong một lần lấy tinh

(ml/lần). Salisbury (1987) lượng tinh dịch là chỉ tiêu kiểm tra đánh giá chất

lượng tinh trùng. Lượng tinh dịch là chỉ tiêu về số lượng nhưng có ý nghĩa rất

quan trọng về mặt sinh học, kỹ thuật và kinh tế. Lượng tinh dịch có liên quan đến

khả năng thụ thai vì nó liên quan tới số lượng và chất lượng tinh trùng.

Lượng tinh dịch là chỉ tiêu sản xuất sinh học nên chịu ảnh hưởng của

nhiều yếu tố nội, ngoại cảnh, chính vì vậy mà lượng tinh dịch biến động ở mỗi cá

thể trong cùng một giống và từng điều kiện khai thác. Nếu lấy tinh hai lần thì

lượng tinh lần hai thường ít hơn lượng tinh lần một. Khoảng cách lấy tinh là một

ngày cho lượng tinh ít hơn khi khoảng cách lấy tinh là hai ngày trở nên .

Lượng tinh không những phụ thuộc vào khoảng cách lấy tinh mà còn phụ

thuộc vào độ tuổi, mùa vụ, chế độ dinh dưỡng…

Theo Corteei (1997) (dẫn từ Đỗ Văn Thu, 2010) cho rằng lượng tinh dịch

còn chịu ảnh hưởng của phương pháp lấy tinh. Lấy tinh bằng kích thích xung

điện cho lượng tinh nhiều hơn lấy tinh bằng âm đạo giả, lượng tinh nhiều hay ít

còn phụ thuộc vào tính dục của con đực và dụng cụ lấy tinh…

Mùa vụ cũng ảnh hưởng đến lượng tinh dịch. Vào mùa sinh sản thì lượng

tinh dịch của chó cao hơn mùa không sinh sản. Điều này chứng minh rằng trong

mùa sinh sản thì hormone sinh dục đực Testosterol tăng, nó kích thích các tuyến

sinh dục phụ tiết tinh thanh.

2.3.2. Hoạt lực tinh trùng (A%).

Hoạt lực tinh trùng là chỉ sự vận động tiến thẳng của tinh trùng, đây là chỉ

tiêu kiểm tra thường xuyên và là chỉ tiêu chất lượng của tinh dịch.

Hoạt lực tinh trùng càng cao thì chất lượng tinh dịch càng tốt. Đỗ Văn

Thu (2010), chứng minh sức sống của đời sau phụ thuộc vào sức sống của tinh

trùng, tinh trùng có sức sống mạnh thì khả năng sinh trưởng phát dục, sức đề

kháng với bệnh tật…của đời sau cao. Hoạt lực của tinh trùng là đặc điểm cơ bản

của tinh trùng, chúng có liên quan đến khả năng thụ tinh của tinh trùng. Tinh

trùng có hoạt lực tốt thì tỷ lệ thụ tinh cao và ngược lại.

Hoạt lực tinh trùng phụ thuộc nhiều yếu tố nội, ngoại cảnh như: nhiệt độ

môi trường, độ ẩm môi trường, giống, lứa tuổi… Nhiệt độ môi trường thích hợp

để tinh trùng vận động là 35-37%. Nếu nhiệt độ cao thì làm cho tinh trùng bị

chết, nhiệt độ thấp thì làm cho hoạt lực của tinh trùng giảm, thậm chí là ngừng

hoạt động, đây là cơ sở để bảo tồn và đông lạnh tinh dịch chó.

Theo Chemiheau (1991) và EvasG (1987) (dẫn từ Trần Xuân Khôi,2013),

ở động vật hoạt động sinh sản diễn ra theo mùa, vì vậy vào mùa sinh sản thì hoạt

lực của tinh trùng cao hơn hẳn vào mùa không sinh sản.

Hoạt lực tinh trùng còn phụ thuộc vào cường độ lấy tinh và khoảng cách

giữa hai lần lấy tinh. Theo Samsuddin (1997) (dẫn từ Trần Xuân Khôi, 2013)

các lần lấy tinh khác nhau kế tiếp nhau 20 phút thì hoạt lự tinh trùng khác nhau

không có ý nghĩa. Khoảng cách lấy tinh sau một ngày thì hoạt lực tinh trùng thấp

hơn hai ngày hay trên hai ngày.

2.3.3. Nồng độ tinh trùng (C)

Nồng độ tinh trùng là chỉ tiêu đánh giá chất lượng và số lượng của tinh

dịch. Salisbury (1987) cho rằng nồng độ tinh trùng là chỉ tiêu quan trọng trong

thực tiễn thụ tinh nhân tạo, nó liên quan mật thiết tới tỷ lệ thụ thai và số lượng

con đẻ ra. Nồng độ tinh trùng liên quan mật thiết và thường là tỷ lệ thuận với

hoạt lực tiến thẳng và hoạt tính của enzyme dehdrgenase

Hazop (1945) (trích dẫn Đỗ Văn Thu, 2010) cho rằng nồng độ tinh trùng

và sức kháng là những chỉ tiêu có ỹ nghĩa cho khả năng thụ tinh của tinh trùng.

Nồng độ tinh trùng là chỉ tiêu về sức sản xuất sinh học nên phụ thuộc vào nhiều

yếu tố:

Khoảng cách lấy tinh, Chemineau (1996), nhận thấy khoảng cách lấy tinh

giữa hai lần lấy tinh là một ngày thì nồng độ tinh trùng là 180 triệu/ml thấp hơn

khi khoảng cách lấy tinh giữa hai lần là hai ngày trở lên (220triệu/ml).

Nồng độ tinh trùng của chó chịu ảnh hưởng của phương pháp lấy tinh tần

suất khai thác tinh và chế độ chăm sóc nuôi dưỡng…

Mùa vụ cũng ảnh hưởng đến nồng độ của tinh trùng. Trong mùa sinh sản

thì nồng độ tinh trùng thấp hơn trong mùa không sinh sản.

2.3.4. Tinh trùng kỳ hình (K%)

Tinh trùng kỳ hình là những tinh trùng có hình dạng khác thường so với

tinh trùng bình thường, điều này ảnh hưởng không tốt đến khă năng vận động

và trao đổi chất của tinh trùng. Chính vì vậy mà khả năng thụ tinh của tinh

trùng giảm, có khi không có khả năng thụ thai. Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình là chỉ

tiêu đánh giá chất lượng tinh dịch. Có hai thời kỳ có thể gây ra tình trạng kỳ

hình của tinh trùng:

- Ngay trong quá trình sinh tinh trùng. Điều này xảy ra thường bắt nguồn

từ những nguyên nhân có liên quan nhiều với bệnh lý.

- Sau khi tinh trùng được sinh ra trong quá trình xuất tinh. Trường hợp

này xảy ra thường liên quan tới các tác nhân ngoại cảnh và kỹ thuật không đúng

khi xử lý, kiểm tra tinh dịch.

Theo Chemineau (1999) (dẫn từ Đỗ Văn Thu, 2010) tinh trùng kỳ hình có

các dạng sau:

- Tinh trùng không bình thường ở phần đầu như: hai đầu, đầu nhỏ, đầu to,

đầu vẹo.

- Tinh trùng kỳ hình ở phần đuôi : cụt đuôi, đuôi dài, đuôi ngắn, đuôi gấp khúc.

- Tinh trùng có giọt tế bào chất ở giữa thân. Tinh trùng có giọt tế bào chất

ở xa điểm giữa của tinh trùng.

2.3.5. Tổng số tinh trùng tiến thẳng trong một lần lấy tinh (V.A.C)

Tổng số tinh trùng tiến thẳng trong một lần lấy tinh là chỉ tiêu quan trọng

để đánh giá chất lượng đực giống.

Nghiên cứu chỉ tiêu V.A.C nhận thấy khi V.A.C cao thì thường thể hiện

phẩm chất tinh dịch tốt, hiệu quả pha loãng cao. Samsuddin (1997) cho rằng tổng

số tinh trùng trong một lần lấy tinh khác nhau nhiều giữa lần lấy tinh thứ nhất so

với lần lấy tinh thứ hai, nếu khoảng cách giữa hai lần lấy tinh là 20 phút. Khoảng

cách lấy tinh là một ngày cho chỉ tiêu V.A.C thấp hơn khi khoảng cách lấy tinh là

hai ngày trở lên. Lấy tinh bốn lần trong một tuần sẽ làm giảm V.A.C. Lấy tinh

hai lần trong một tuần là hợp lý.

Theo Corteel (1997) (dẫn từ Đỗ Văn Thu, 2010) thì V.A.C thay đổi theo

mùa vụ lấy tinh, ở mùa sinh sản thì V.A.C cao hơn mùa không sinh sản.

2.3.6. Tỷ lệ tinh trùng sống (SL%)

Tỷ lệ tinh trùng sống là chỉ tiêu kiểm tra thường xuyên để đánh giá chất

lượng tinh trùng. Chỉ tiêu này có liên quan chặt chẽ đến khả năng thụ thai. Mào

tinh là nơi cuối cùng để tinh trùng hoàn thiện và dự trữ ở đó. Ở đây tinh trùng ở

trạng thái không hoạt động nên hai tháng vẫn có khả năng thụ tinh, nếu quá thời

gian trên thì tinh trùng sẽ không có khả năng thụ tinh mà bị chết và được hấp thu.

Khi tác nhân nào đó tác động bất lợi đến quá trình sinh tinh, tình trạng sức khoẻ

của đực giống thì tỷ lệ tinh trùng sống sẽ giảm. Tỷ lệ sống của tinh trùng còn phụ

thuộc vào nhiều yếu tố khác như chế độ dinh dưỡng, chế độ lấy tinh.

2.4. ĐẶC ĐIỂM LÝ HOÁ CỦA TINH DỊCH CHÓ

2.4.1. Tỷ trọng của tinh dịch (d).

Tỷ trọng tinh dịch là đặc điểm có ý nghĩa về kỹ thuật sinh học. Các giống

chó khác nhau thì có tỷ trọng tinh dịch là khác nhau.

2.4.2. Áp lực thẩm thấu (posm).

Áp lực thẩm thấu của tinh dịch giữ vai trò hết sức quan trọng với tinh

trùng. Áp lực cao hay thấp sẽ ảnh hưởng tới sức sống của tinh trùng nhất là khi

tinh trùng được pha loãng trong các môi trường nhân tạo.

Nếu áp lực thẩm thấu quá ưu trương hay quá nhược trương thì đều ảnh

hưởng tới sức sống của tinh trùng.

2.4.3. Năng lực đệm của tinh dịch (β).

Năng lực đệm của tinh dịch thể hiện khả năng duy trì độ pH của tinh dịch.

Năng lực đệm của tinh dịch có liên quan mật thiết đối với các chất trong tinh dịch.

Tinh dịch của mỗi loài, mỗi cá thể có độ pH là khác nhau.

2.4.4 .Độ nhớt của tinh dịch.(η)

Độ nhớt của tinh dịch phụ thuộc vào tỷ trọng và thành phần chất nhầy

trong tinh dịch. Độ nhớt của tinh dịch và độ nhớt của môi trường pha loãng có

ảnh hưởng tới khả năng vận động của tinh trùng. Khi độ nhớt cao thì sức căng

mặt ngoài lớn tác động lên màng bọc tinh trùng làm căng lực ma sát, cản trở tinh

trùng vận động.

2.4.5. pH của tinh dịch.

Đây là chỉ tiêu quan trọng khi nghiên cứu tinh dịch, phải được kiểm tra

thường xuyên. Độ pH của tinh dịch là tổng pH của các dịch tiết từ tuyến sinh dục

phụ. Độ pH của tinh dịch có tương quan nghịch với nồng độ tinh trùng, nồng độ

tinh trùng cao hay thấp đều làm thay đổi pH của tinh dịch. Độ pH của tinh dịch

có vai trò quan trọng đối với sức sống của tinh trùng. Khi môi trường có tính

kiềm sẽ kích thích tinh trùng vận động, làm tăng chất thải vào môi trường, đồng

thời làm tiêu hao năng lượng lớn, dẫn đến tinh trùng chóng chết. Đặc biệt khi chế

độ dinh dưỡng thay đổi thì pH của tinh dịch cũng thay đổi, vì thế mà chúng ta

chú ý đến những yếu tố để đảm bảo tinh dịch chó có chất lượng tốt, tăng tỷ lệ thụ

thai khi phối giống.

2.5. NGUYÊN TẮC XÂY DỰNG MÔI TRƯỜNG ĐÔNG LẠNH BẢO TỒN TINH DỊCH CHÓ

Áp lực thẩm thấu của môi trường phải tương đương với áp lực thẩm

thấu của tinh dịch.

Tinh trùng chỉ sống trong môi trường đẳng trương, nếu môi trường ưu

trường hay nhược trương sẽ làm ảnh hưởng đến hình thái tinh trùng. Nếu môi

trường ưu trương sẽ làm tinh trùng teo lại, môi trường nhược trương sẽ làm tinh

trùng trương phồng lên, do đó tinh trùng sẽ bị chết nhanh chóng.

Độ pH của môi trường phải tương đương với độ pH của tinh dịch hoặc

toan yếu.

Hoạt động của tinh trùng luôn gắn liền với sự thay đổi pH, vì quá trình

trao đổi chất của tinh trùng luôn phụ thuộc vào hoạt tính của các enzyme. Các

enzyme này xúc tiến các phản ứng sinh học chỉ trong một giới hạn pH nhất định.

Mục đích của môi trường pha loãng là duy trì sức sống của tinh trùng càng lâu

càng tốt, do vậy pH của môi trường nhỏ hơn pH của tinh dịch, của các enzyme

dẫn đến làm giảm quá trình trao đổi chất của tinh trùng, hạn chế sự tiêu hao năng

lượng dự trữ của tinh trùng, kéo dài thời gian sống của tinh trùng.

Môi trường phải có năng lực đệm.

Nguyên tắc này nhằm mục đích duy trì pH của tinh dịch ổn định, khử một

số chất độc đối với tinh trùng do quá trình trao đổi chất của tinh trùng tạo ra, đảm

bảo sức sống và quá trình trao đổi chất của tinh trùng được thuận lợi.

Môi trường phải có tỷ lệ các chất điện giải và chất không điện giải

thích hợp.

Chất điện giải là chất cần thiết trong môi trường pha loãng để tạo ra môi

trường có áp lực thẩm thấu tương đương với áp lực thẩm thấu của tinh dịch , ổn

định pH của môi trường… Nhưng chính các chất điện giải lại là tác nhân chính

gây ra hiện tượng tụ dính. Để ngăn ngừa tình trạng trên môi trường pha loãng

phải có các chất không điện giải, thông thường tỷ lệ chất điện giải và chất không

điện giải là 2/9.

Tỷ trọng môi trường phải tương đương với tỷ trọng của tinh dịch. Mục đích tránh hiện tượng tinh trùng bị lực đẩy acsimet làm nổi lên trên

hoặc áp lực thuỷ tĩnh làm ảnh hưởng đến hình thái của tinh trùng.

Độ nhớt của môi trường tương đương với độ nhớt của tinh dịch. Nguyên tắc này cũng nhằm tránh tình trạng sức căng mặt ngoài tác động

lên màng bọc tinh trùng và ma sát nội quá lớn khi tinh trùng vận động.

2.6. NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG ĐÔNG LẠNH BẢO TỒN TINH DỊCH CHÓ

Chất chống sốc lạnh cho tinh trùng trong quá trình đông lạnh và bảo tồn đã giúp cho tinh trùng không bị phá vỡ cấu trúc tế bào khi nhiệt độ hạ thấp, đây là vấn đề đã được nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu và thu được nhiều kết quả có ích. Chất chống sốc lạnh cho tinh trùng được nghiên cứu và sử dụng nhiều trong đông lạnh tinh dịch là Glycerol và Dimethyl sulforxide. Các nghiên cứu của Silva (2003) đã chỉ ra rằng, chất lượng tinh trùng chó sau đông lạnh không phụ thuộc vào số lần pha Glycerol vào môi trường. Các nghiên cứu sử dụng môi trường nước dừa và Glycerol ở các nồng độ 4%, 6% và 8% của Cardoso (2003), đã đưa ra kết quả không có sự khác nhau về tỷ lệ sống và tỷ lệ tinh trùng vận động. Tuy nhiên, trong môi trường có nồng độ Glycerol lớn hơn 6% thì có tỷ lệ tinh trùng kỳ hình thấp nhất.

Rohloff (1978), đã nghiên cứu ảnh hưởng của Glycerol và DMSO lên phẩm chất tinh trùng trong đông lạnh tinh dịch chó. Kết quả thu được là Glycerol có tác dụng bảo vệ lạnh tốt hơn so với DMSO. Thêm vào đó, việc sử dụng kết hợp hai chất này có ảnh hưởng tốt hơn lên phẩm chất tinh dịch sau đông lạnh so với bổ sung riêng lẻ từng chất với điều kiện tinh pha được ủ ở 50C trong vòng 50 phút. Nghiên cứu cũng đưa ra kết luận là bổ sung Glycerol 8% và DMSO 1% vào tinh dịch đã pha với môi trường sau đó ủ trong thời gian 30 phút có khả năng bảo quản tinh dịch đông lạnh tốt nhất.

Silva (2003), đã nghiên cứu ảnh hưởng của việc bổ sung Glycerol vào môi trường đông lạnh có thành phần cơ bản là Tris - lòng đỏ trứng gà đến chất lượng tinh trùng sau đông lạnh. Glycerol được bổ sung một lần hoặc bổ sung 3 lần, khoảng cách giữa các lần là 05 phút. Kết quả nhận được là sau đông lạnh, hoạt lực tinh trùng tiến thẳng và sức sống của tinh trùng khác nhau không có ý nghĩa giữa hai phương pháp bổ sung Glycerol. Glycerol có thể bổ sung vào môi trường đông lạnh tinh dịch chó một lần hoặc nhiều lần, nhưng bổ sung một lần thuận tiện và dễ áp dụng trong thực tế.

Yildiz (2000), đã chỉ ra rằng các loại đường có ảnh hưởng đáng kể đến chất lượng tinh trùng trong suốt quá trình cân bằng và đông lạnh. Các loại đường glactose, lactose, trehalose, maltose và sucrose được bổ sung vào môi trường bảo quản làm

giảm tỷ lệ phần trăm acrosom bị phá huỷ trong các mẫu được cân bằng. Sự bổ sung đường không giúp cải thiện sức vận động và khả năng sống sót trong quá trình cân bằng. Các disaccarit, ngoại trừ lactose, đã làm giảm tỷ lệ tinh trùng chết, đồng thời làm giảm tỷ lệ acrosom bị phá huỷ sau giải đông. Tuy vậy, bổ sung các loại đường

này không có tác dụng cải thiện khả năng vận động của tinh trùng sau giải đông.

Tsutsui (2000), nhận thấy bổ sung 0,5 - 1% OEP (orvus Es Paste) vào môi trường đông lạnh tinh dịch chó giúp cải thiện được sức sống của tinh trùng sau

giải đông.

Pena (2000), nghiên cứu ảnh hưởng của việc bổ sung Equex vào môi trường Tris, pha loãng tinh dịch theo một và hai bước, đông lạnh theo hai phương pháp, giải đông ở hai tốc độ khác nhau đến sức sống của tinh trùng chó sau giải đông ở 380C. Kết quả cho thấy bổ sung Equex vào môi trường pha loãng đông lạnh tinh dịch đã có tác dụng tốt lên sức sống tinh trùng sau đông lạnh. Pha môi trường với tinh dịch theo hai bước cho sức sống tinh trùng sau đông lạnh cao hơn so với pha một bước. Tinh đông lạnh dạng cọng rạ được giải đông ở nhiệt độ 700C trong khoảng thời gian 8 giây.

Koutsarova (1997), đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của pentoxifylline đến sức sống tinh trùng của chó trong tinh tươi và tinh giải đông sau đông lạnh. Nồng độ pentoxifylline 0,0036 mol/l hoặc 0,0072 mol/l đã được thêm vào tinh tươi. Nồng độ pentoxifylline 0,0072 mol/l đã được thêm vào tinh dịch trước khi đông lạnh. Kết quả cho thấy bổ sung pentoxifylline vào môi trường có ảnh hưởng làm tăng đáng kể tỷ lệ tinh trùng tiến thẳng trong tinh tươi và ảnh hưởng có lợi đến việc

duy trì hoạt lực trong quá trình đông lạnh tinh dịch chó (Đỗ Văn Thu, 2010).

Nghiên cứu nhằm xác định ảnh hưởng của tinh thanh đối với sự vận động, sức sống và tính nguyên vẹn acrosom của tinh trùng pha loãng và đông lạnh của Sirivaidyapong (2001), đã chỉ ra rằng tinh pha loãng bảo tồn ở 40C trong 6 giờ hoặc bảo quản ở 40C trước khi đông lạnh thì hoạt lực tinh trùng, sức sống tinh trùng và tính nguyên vẹn của acrosom khác nhau không có ý nghĩa thống kê trong điều kiện để tinh thanh hay loại bỏ tinh thanh trước khi pha loãng tinh dịch với môi trường. Tuy nhiên hoạt lực tinh trùng và sức sống tinh trùng giảm có ý nghĩa thống kê sau khi đông lạnh tinh dịch khi mà môi trường bảo quản có tinh thanh. Pena (2000), so sánh tỷ lệ pha loãng giải đông và nồng độ tinh trùng (50.106, 100. 106, 200. 106, 400. 106) trong đông lạnh tinh chó, kết quả sau đông

lạnh cho thấy: đông lạnh ở nồng độ tinh trùng 200.106/ml cho kết quả tốt nhất, tỷ lệ pha loãng giải đông 1:4 hoặc 1:2 cho sức sống tinh trùng cao hơn tỷ lệ 1:1.

Tốc độ đông lạnh tinh dịch có ảnh hưởng lên chất lượng tinh trùng sau

đông lạnh. Tác giả Yu (2002), khi tiến hành đông lạnh tinh dịch chó với tốc độ

giảm nhiệt độ -0,5, -3, -11, -58 hoặc -209C/phút thấy rằng hoạt lực tinh trùng

sau đông lạnh thấp trong trường hợp tốc độ đông lạnh thấp, hoạt lực cao nhất khi

tốc độ giảm nhiệt độ là -11C/phút (Đỗ Văn Thu, 2010). Hoạt lực tinh trùng giảm

có ý nghĩa khi tốc độ đông lạnh cao. Các phương pháp đông lạnh tinh dịch đã

được Nizanski (2001), so sánh trong thí nghiệm đông lạnh tinh dịch dạng viên

hoặc dạng cọng rạ loại 0,25 ml hoặc cọng rạ loại 0,5 ml. Kết quả cho thấy sau

đông lạnh, ở dạng viên hoạt lực tinh trùng tiến thẳng và tỷ lệ tinh trùng có

acrosom bình thường cao hơn có ý nghĩa so với dạng cọng rạ có kích thước 0,25

ml, nhưng khác nhau không có ý nghĩa giữa dạng viên so với dạng cọng rạ 0,5

ml. Burgess (2001), nghiên cứu sự thay đổi cấu trúc của tinh trùng trong quá

trình đông lạnh tinh dịch cho thấy trong thời gian ủ tinh trùng ở 37C, tinh trùng

không bị thay đổi về cấu trúc, nhưng đông lạnh tinh dịch ở nhiệt độ thấp đã làm

thay đổi cấu trúc tinh trùng, tăng số tinh trùng có acrosom không bình thường, tỷ

lệ tinh trùng sống giảm so với trước khi đông lạnh (Đỗ Văn Thu, 2010).

Tinh đông lạnh được giải đông ở 700C trong 8 giây hoặc 370C trong 1 phút. Sức vận động của tinh trùng được kiểm tra hàng giờ từ lúc giải đông đến 7 giờ sau giải đông, tinh giải đông được ủ ở 38 0C. Tính nguyên vẹn của màng và trạng thái acrosom được đánh giá ở các thời điểm 1 giờ, 3 giờ, 6 giờ sau giải

đông. Sức sống tinh trùng sau giải đông tốt nhất trong trường hợp giải đông tinh đông lạnh ở 370C trong 1 phút giây.

2.7. THỤ TINH NHÂN TẠO CHO CHÓ

2.7.1. Sơ lược về quá trình giao phối và phóng tinh

Giao phối là chuỗi phản xạ không điều kiện, Bẩm sinh phức liên hoàn gồm hưng phấn, cương cứng, giao cấu, phóng tinh. Tiến trình này xảy ra khi con đực đã thánh thục. Phản xạ giao phối là một phản xạ mạnh của hệ thần kinh, nó ức chế các phản xạ khác. Ở chó trong mùa giao phối chó đực có thể đi hoang không cần ăn uống vì chó cái tiết ra một pheramon để hấp dẫn đồng loại, do đó

chúng rất dễ gặp nhau trong mùa giao phối.

Khoảng thời gian chó đực được đưa đến trước chó cái và giao phối là rất biến đổi, nó phụ thuộc vào nhiều tác nhân. Tuy nhiên, chúng có những biểu hiện: Đầu tiên chó đực nhảy lên lưng chó cái và dập mạnh làm lộ ra một phần dương vật khỏi bao quy đầu, phóng một ít chất lỏng trong, đây chính là tinh thanh của pha thứ nhất, chứa rất ít tinh trùng. Khi giao phối dương vật chó không cần cương cứng vì trong dương vật chó có xương dương vật, nó tạo được độ cứng cần thiết để đưa dương vật vào âm đạo, trong giai đoạn này có một số cơ chế và những động tác cùng lúc. Trước hết, dương vật sưng lên, thể hổng dương vật chứa đầy máu, gây sự gia tăng về kích thước, đực biệt là tuyến hành dương vật, nó tạo thành khối hình cầu trên thân dương vật, đồng thời có sự co thắt cả vách âm đạo và âm môn, giúp dương vật bị khoá chặt trong đường sinh dục chó cái. Cũng trong thời gian này chó đực sẽ phóng tinh lần hai, lần này rất nhiều tinh trùng. Thể tích tinh của pha này biến đổi từ 0,5-2 ml và được lưu giữ ở phía trước của âm đạo chó cái, gần nhưng chưa tới cổ tử cung. Do chó đực không có khả năng giữ cơ thể của nó lâu trên lưng chó cái nên xảy ra hiện tượng “dính lẹo”. Thời gian “dính lẹo” có thể kéo dài từ 0,5-1 giờ, trong thời gian này sẽ diễn ra quá trình phóng tinh pha thứ ba. Việc giao phối có thành công hay không không liên quan đến thời gian “dính lẹo”

vì thời gian này ở những chó khác nhau là rất khác nhau.

2.7.2. Các chu kỳ động dục của chó cái

Chu kỳ động của chó cái được nghỉ ngơi chia làm 4 giai đoạn: Trước động dục, động dục, sau động dục và nghỉ ngơi. Theo Feldman and Nelson (1996), khoảng thời gian của các chu kỳ động dục tuỳ theo giống, điều kiện chăm sóc,

quản lý, dinh dưỡng và bệnh lý.

Giai đoạn trước động dục Được xác định khi có dấu hiệu sưng phồng và tiết dịch ở âm hộ đến khi nó cho phép chó đực chồm nhẩy và giao phối. Trong giai đoạn này chó cái có những dấu hiệu như: âm hộ sưng đỏ, chảy máu và tiết dịch. Giai đoạn này kéo dài từ 6 đến 11 ngày,

thương là 9 ngày, nhưng cũng có thể chỉ 2 ngày và cũng có thể kéo dài 25 ngày.

Giai đoạn động dục Đây là giai đoạn chịu đựa của chó cái, nó cho phép chó đực chồm nhảy và giao phối, lúc này có thể coi là ngày đầu tiên của giai đoạn động cụ, âm hộ giảm sưng, trở nên mềm nhăn da, dịch tiết có màu hống lợt, hơi dẻo và trong. Giai đoạn này kéo dài từ 3 đến 21 ngày, trung bình là 9 ngày, nhưng cũng có khi chỉ xảy ra 1-2 ngày hoặc kéo dài 18-20 ngày, vì thế rất khó xác định thoòi gian động

dục của chó cái kéo dài bao lâu.

Giai đoạn sau động dục

Nếu giai đoạn động dục không được phối hay phối không đậu thì tiếp theo sẽ là giai đoạn này. Được xác định từ khi chó cái chấm dứt giai đoạn động dục đứng ỳ, giai đoạn này kéo dài khoảng 56-58 ngày nếu chó mang thai hoặc 60-100 ngày nếu chó không mang thai. Thường thì thời gian này kéo dài 2 tháng.

Giai đoạn nghỉ ngơi

Kể từ khi chấm dứt giai đoạn sau động dục đến khi bắt đầu giai đoạn trước động dục tiếp theo, thực tế rất khó xác định giao điểm của giai đoạn sau động dục và giai đoạn nghỉ ngơi, đây là giai đoạn yên tĩnh giữa tuyến não thuỷ và buồng trứng, giai đoạn này kéo dài 4,5 tháng.

Tóm lại, chu kỳ động dục bình thường của một chó cái diễn ra như sau: giai đoạn trước động dục kéo dài 9 ngày, giai đoạn động dục kéo dài 7-9 ngày, giai đoạn sau động dục kéo dài 58 ngày, nghỉ ngơi khoảng 4,5 tháng.

2.7.3. Thụ tinh nhân tạo.

2.7.3.1. Xác định thời điểm phối giống thích hợp

Thời điểm phối giống thích hợp sẽ năm trong giai đoạn động dục, cụ thể là thời gian mê đực, sự xuất noãn sẽ sảy ra sau 48 giờ kể từ thời điểm bước qua giai đoạn động dục. Trên chó để xác định thoòi điểm phối giống thương dựa vào các phương pháp:

- Phương pháp lâm sàng : Dựa vào biểu hiện như dịch tiết ở âm hộ lợt màu, dẻo trong, âm hộ mễm nhẵn da, có biểu hiện mê đực, đứng im cho chó đực chồ nhảy và chấp nhận phối giống.

- Phương pháp phi lâm sàng:

+ Dựa vào sự biến đổi của tế bào biểu mô ở âm đạo: Theo Olson (1982), trong giai đoạn động dục thì trên tiêu bản vết phết dịch âm đạo có đến 90% tế bào bề mặt, 5% tế bào gốc, có nhiều vi khuẩn hiện diện tấn công vào tế bào bề mặt.

+Dựa vào máy xác định thời điểm rụng trứng Dramisnski: nguyên tắc hoạt động của máy là đo hàm lượng estrogen trong dịch tiết âm hộ chó cái trong giai đoạn trước động dục và động dục.

2.7.3.2. Thụ tinh nhân tạo sử dụng tinh đông lạnh

Thụ tinh nhân tạo chó bằng tinh đông lạnh trên đá nitơ khô đã thu được kết quả cách đây ba mươi năm Seager (1977). Tuy nhiên tỷ lệ thụ thai thấp hơn so với tinh nguyên (Linde and Forsberg, 1991). Silva (1996), cho rằng: thụ tinh

nhân tạo chó bằng tinh nguyên hoặc tinh đông lạnh, chó cái được thụ tinh kép vào ngày thứ 3 và ngày thứ 5 sau khi xác định được đỉnh của LH. Tổng thể tích tinh dịch để phối giống đối với thụ tinh âm đạo là 5ml, đối với thụ tinh dạ con là 2ml. Chó cái được thụ tinh bằng tinh đông lạnh đạt tỷ lệ thụ thai là 60%, chó được thụ tinh với tinh tươi đạt tỷ lệ thụ thai là 100%. Fontbonne (1993), đã so sánh hai phương pháp thụ tinh âm đạo và thụ tinh dạ con cho chó bằng tinh đông lạnh, kết quả cho thấy thụ tinh dạ con cho tỷ lệ thụ tinh (75,3%) cao hơn có ý nghĩa so với thụ tinh âm đạo (52,6%) (Đỗ Văn Thu, 2010). Linde and Forsberg (1993), thụ tinh cho chó bằng tinh tươi và thụ tinh âm đạo, thụ tinh bằng tinh đông lạnh và thụ tinh dạ con. Tỷ lệ thụ thai đối với tinh nguyên và tinh đông lạnh tương ứng là 54,7% và 39%. Nếu xác định được chính xác chu kỳ động dục, các tỷ lệ này là 62,3% và 51,1%. Tỷ lệ thụ thai ở chó cho phối tự nhiên cao hơn thực sự (88,6%) so với thụ tinh nhân tạo bằng tinh tươi. Tỷ lệ thụ thai và số con trong một lứa tăng lên khi phối giống kép so với phối đơn. Farstad (1989), đã tiến hành thụ tinh nhân tạo chó với tinh đông lạnh, hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh đạt 60%, thụ tinh đơn và thụ tinh kép với khoảng cách hai lần là 01 - 02 ngày, kết quả thu được cho thấy: tỷ lệ thụ thai khi được thụ tinh đơn thấp hơn so với thụ tinh kép (64% so với 69%). Việc xác định đúng thời điểm thụ tinh là cần thiết cho thụ thai khi thụ tinh với tinh đông lạnh. Tsutsui (2000), nghiên cứu thụ tinh nhân tạo sử dụng tinh đông lạnh. Tinh dịch được đông lạnh trong môi trường có chứa 7% glycerol và 0,7% Orvus ES Paste (OEP). Thụ tinh nhân tạo trong dạ con có tỷ lệ thụ thai cao (90%), số con trung bình/lứa: 3,6. Chó cái được thụ tinh sử dụng tinh đông lạnh mà trong môi trường không được bổ sung OEP đều không thụ thai. Khi thụ tinh âm đạo với các nồng độ khác nhau thấy rằng nồng độ tinh trùng 20.106 có thể đạt được sự thụ thai. Nhưng tốt nhất là thụ tinh trong dạ con bằng tinh đông lạnh mà trong môi trường có bổ sung OEP. Linde and Forsberg (1999), đã tiến hành thụ tinh nhân tạo trong tử cung trên 167 chó và thụ tinh âm đạo trên 141 chó. Tỷ lệ đẻ sau khi thụ tinh nhân tạo trong tử cung đạt 84,4% cao hơn hẳn so với thụ tinh âm đạo (58,9%). Số con/lứa cũng có sự khác nhau thực sự, đạt 5,4 - 3,0 con /lứa khi thụ tinh tử cung và đạt 4,0 - 2,7 con/ lứa khi thụ tinh âm đạo. Thomassen (2001), đã thử nghiệm thụ tinh nhân tạo cho chó bằng tinh đông lạnh trên 312 con, thuộc 70 giống khác nhau (183 liều tinh nhập ngoại và 129 liều tinh sản xuất trong nước) thu được tỷ lệ đẻ 70%, số con trung bình một lứa là 5,3 con. Thụ tinh trong cổ tử cung kết quả tỷ lệ đẻ (71%) cao hơn thụ tinh trong âm đạo (29%). Thời điểm thụ tinh chính xác sẽ cho tỷ lệ đẻ và số con trong

một lứa cao hơn. Thụ tinh kép cho tỷ lệ đẻ và số con trong một lứa cao hơn thụ tinh đơn. Tinh đông lạnh có hoạt lực tinh trùng thấp hơn 50% hoặc tỷ lệ kỳ hình lớn hơn 20% cho tỷ lệ thụ tinh thấp. Tinh đông lạnh có hoạt lực tinh trùng lớn hơn 50% và tỷ lệ tinh trùng kỳ hình thấp hơn 20% thu được tỷ lệ mang thai cao hơn. Pinto (1999), đã tiến hành thụ tinh nhân tạo chó bằng tinh bảo quản lạnh (bảo quản ở 50C), kết quả đạt được 95% chó cái thụ tinh; số con trung bình một lứa là 7,1, kết quả này không khác nhau so với thụ tinh nhân tạo bằng tinh nguyên.

2.8. TÌNH HÌNH PHÁT TRİỂN VÀ SỬ DỤNG CHÓ MALİNOİS TẠİ VİỆT NAM

Chó Malinois mới được nhập khẩu, nuôi dưỡng và huấn luyện ở nước ta khoảng 4 năm gần đây. Sau một thời gian, chó Malinois được đánh giá là thích hợp cao với điều kiện của Việt Nam. Hiện nay, nhu cầu sử dụng chó Malinois tại các đơn vị an ninh, quốc phòng là tương đối lớn. Tuy nhiên, giá thành nhập khẩu của giống chó này tương đối cao, đồng thời mất nhiều chi phí cho việc nuôi thích nghi sau khi nhập về.

Hiện nay, tại Cục Cảnh sát quản lý, huấn luyện và sử dụng động vật nghiệp vụ (K204) – Bộ Công an đang nuôi dưỡng một đàn Malinois thuần chủng. Ở ngoài dân, cũng có 1 số lượng lớn chó Malinois được nuôi dưỡng sử dụng cho việc bảo vệ và làm kinh tế. Tuy nhiên, do chưa có một hệ thống nhân giống theo quy hoạch, việc nuôi dưỡng tự phát và phối giống thiếu kiểm soát đã làm mất đi những đặc điểm, khả năng vốn có của giống chó này.

Với vai trò quan trọng của chó Malinois nói riêng và chó nghiệp vụ nói chung, trong thời gian vừa qua, Phòng sinh học tế bào sinh sản, Viện Công nghệ Sinh học đã được giao nhiệm vụ thực hiện đề tài: “Nghiên cứu công nghệ bảo tồn tinh dịch và thụ tinh nhân tạo chó nghiệp vụ của ngành Công an” và “Ứng dụng công nghệ bảo tồn tinh dịch và thụ tinh nhân tạo chó để nhân giống và bảo tồn một số giống chó nghiệp vụ của ngành Công an” do tiến sĩ Đỗ Văn Thu làm chủ nhiệm. Kết quả của 2 đề tài trên đã bảo tồn được tinh dịch ở dạng pha loãng và đông lạnh, thành công trong thụ tinh nhân tạo chó góp phần phát triển đàn chó có chất lượng cao phục vụ cho công tác an ninh và Quốc phòng.

Tuy nhiên, công nghệ đông lạnh tinh dịch chó hiện nay vẫn được áp dụng chung trên tất cả các giống chó nghiên cứ như: Berger (Đức), Labrado, Cooker, Phú Quốc... Do vậy, việc có được công nghệ đông lạnh tinh dịch dành riêng cho giống chó Malinois việc làm rất cần thiết.

PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

+ Cục Cảnh sát quản lý, huấn luyện và sử dụng động vật nghiệp vụ

(K204) – Bộ Công an.

+ Phòng sinh học tế bào sinh sản – Viện công nghệ sinh học – Viện Hàn

lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

3.2. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

Từ tháng 6/2015 – 6/2016

3.3. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Chó Malinois nuôi tại Cục Cảnh sát quản lý, huấn luyện và sử dụng động

vật nghiệp vụ (K204) – Bộ Công an.

Sử dụng 07 chó Malinois đực và 10 chó Malinois cái. Chó đực trong độ

tuổi từ 1,5 – 3 tuổi, khỏe mạnh; chó cái từ 2 - 3 tuổi, đã đẻ 1 – 2 lứa, khỏe mạnh.

Hình 3.1. Chó Malinois đực tham gia nghiên cứu

3.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

3.4.1. Đánh giá một số chỉ tiêu sinh học và tính chất lý hóa học của tinh dịch

chó Malinois

- Nghiên cứu một số đặc điểm tinh dịch: lượng tinh dịch, hoạt lực của tinh

trùng, nồng độ tinh trùng, tỷ lệ tinh trùng sống, tỷ lệ tinh trùng kỳ hình, tổng số

tinh trùng tiến thẳng trong lần lấy tinh.

- Nghiên cứu tính chất lý - hóa học tinh dịch: áp lực thẩm thấu, năng lực

đệm, độ nhớt, tỷ trọng, pH tinh dịch.

3.4.2. Nghiên cứu công nghệ đông lạnh tinh dịch chó Malinois và ứng dụng

sản xuất tinh chó đông lạnh bảo tồn ở -196C

3.4.2.1. Nghiên cứu về môi trường

- Nghiên cứu một số tính chất lý - hóa học của môi trường đông lạnh: áp

lực thẩm thấu, năng lực đệm, độ nhớt, tỷ trọng, pH môi trường.

- Ảnh hưởng của môi trường đông lạnh lên chất lượng tinh đông lạnh

- Nghiên cứu ảnh hưởng của Glycerol và DMSO lên chất lượng tinh đông lạnh.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Glycerol lên chất lượng tinh đông lạnh

- Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung phần môi trường có glycerol lên chất lượng

tinh đông lạnh.

3.4.2.2. Ảnh hưởng của thời gian ủ tinh dịch và tốc độ đông lạnh giải đông lên

chất lượng tinh đông lạnh

- Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian ủ tinh dịch trước đông lạnh lên chất

lượng tinh đông lạnh.

- Ảnh hưởng của phương pháp đông lạnh lên chất lượng tinh đông lạnh.

- Nghiên cứu tốc độ giải đông (nhiệt độ và thời gian) tinh chó đông lạnh.

3.4.3. Sản xuất tinh chó Malinois đông lạnh

3.4.3.1. Đánh giá chất lượng tinh chó Malinois đông lạnh trong quá trình bảo tồn ở -1960C

- Đánh giá chất lượng tinh chó Malinois đông lạnh trong thời gian bảo tồn ở - 1960C thông qua các chỉ tiêu: hoạt lực của tinh trùng, sức sống của tinh trùng sau giải đông và ủ ở 37C, tỷ lệ tinh trùng sống, tỷ lệ tinh trùng kỳ hình.

3.4.3.2. TTNT cho chó Malinois để thử nghiệm tinh đông lạnh sản xuất được

- Thụ tinh nhân tạo cho chó bằng tinh đông lạnh.

- Đánh giá khả năng sinh sản của chó cái được TTNT.

3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.5.1. Phương pháp lấy tinh

Sau khi xem xét, lựa chọn chó Malinois đực đạt yêu cầu, tiến hành khai

thác tinh dịch. Trong quá trình khai thác tinh dịch không cho chó đực giao phối

trực tiếp ít nhất là 03 ngày trước thời điểm lấy tinh. Thời gian khai thác tinh vào

buổi sáng, tinh dịch được khai thác bằng phương pháp massage trong một không

gian yên tĩnh.

Quá trình khai thác tinh gồm các bước sau:

- Kích thích ở phần tự do của quy đầu cho đến khi nó xuất ra chất dịch

trong (tinh thanh), đó là pha thứ nhất của quá trình xuất tinh.

- Khi chó đực bắt đầu dập mạnh để chuẩn bị xuất tinh ở pha thứ hai thì thôi

không kích thích nữa mà phải bóp chặt, tạo một áp lực mạnh ở tuyến hành dương

vật để xuất toàn bộ tinh dịch của pha này.

- Sau khi chó đực xuất hết tinh thì tiếp tục kích thích cho đến khi tinh thanh

ra hết, mục đích là giúp rửa sạch lòng dương vật của chó đực.

Chú ý: người khai thác tinh chỉ dùng lọ hứng phần tinh dịch của pha thứ

hai của quá trình phóng tinh (vì pha này chứa nhiều tinh trùng) còn những pha

khác thì bỏ qua.

3.5.2. Phương pháp nghiên cứu sinh học tinh dịch chó

3.5.2.1. Lượng tinh dịch (V)

Theo phương pháp của Chemineau (1991), xác định thể tích tinh dịch qua

ống hút pipet thuỷ tinh có chia độ hoặc xác định qua phễu hứng tinh đã chia độ,

đặt lọ thuỷ tinh trên mặt phẳng nằm ngang và đọc kết quả ở vạch cong dưới của

mặt tinh dịch.

3.5.2.2. Hoạt lực tinh trùng (A)

Theo phương pháp của Chemineau (1991), sức hoạt động được tính bằng

tỷ lệ % tinh trùng có hoạt động tiến thẳng so với tổng số tinh trùng có trong vi

trường quan sát được.

3.5.2.3. Nồng độ tinh trùng (C)

Theo phương pháp của Chemineau (1991), dùng buồng đếm hồng cầu và bạch cầu (kiểu Neubouer) và ống pha loãng hồng cầu. Pha loãng tinh dịch 100 - 200 lần bằng dung dịch NaCl 3% (hút tinh dịch đến vạch 0,5 - 1,0 rồi hút NaCl

3% đến vạch 101).

3.5.2.4. Tổng số tinh trùng tiến thẳng (V.A.C)

Theo John B.Herrick and Self (1962), tổng số tinh trùng tiến thẳng trong một lần lấy tinh = lượng tinh dịch (ml) x nồng độ tinh trùng/ml x hoạt lực tinh

trùng tiến thẳng (%) (Đỗ Văn Thu, 2010).

3.5.2.5. Tỷ lệ tinh trùng sống (LS)

Theo phương pháp của Chemineau (1991).

Dung dịch nhuộm: Eosin: 1g; Nigrosin: 2g; Natri – citrate: 5,5g; H20:

3,57g; nước cất 2 lần: 100 ml.

pH dung dịch nhuộm: 6,7 - 6,8; áp suất thẩm thấu 310 miliosmol/kg.

3.5.2.6. Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình (K)

Theo phương pháp của William (1921), kết hợp vơi phương pháp

Cheminau (1991) (Đỗ Văn Thu, 2010).

3.5.3. Nghiên cứu môi trường bảo tồn 3.5.3.1. Xác định pH

Đo bằng giấy đo pH của Trung Quốc hoặc máy đo pH Mettler 320.

3.5.3.2. Áp lực thẩm thấu (posm)

Đo bằng máy đo áp lực thẩm thấu (Osmometre), đơn vị: miliosmol/kg

3.5.3.3. Tỷ trọng (d)

Dùng bình đo tỷ trọng (picrometre).

Công thức tính:

M oM

d =

Trong đó: d: tỷ trọng

M: khối lượng chất lỏng cần đo cùng thể tích

M0: khối lượng nước cất 2 lần

3.5.3.4. Độ nhớt (  )

Sử dụng nhớt kế Oswald hoặc micropipet, xác định độ nhớt ở 200C.

Công thức tính:

td . o td .

 =

Trong đó:

: độ nhớt tương đối so với nước cất 2 lần

d0: tỷ trọng nước cất 2 lần

d: tỷ trọng chất lỏng cần đo

t0: thời gian chảy của nước cất qua phần phình hoặc qua mao quản

t: thời gian chảy của chất lỏng qua phần phình hoặc qua mao quản.

3.5.3.5. Năng lực đệm ( )

Theo phương pháp của Salisbury (1978), đối với HCl 0,1N, dùng một lọ con khô, sạch, trung tính, có dung tích 5 - 10 ml. Cho vào đó 1 ml (hoặc 0,5 ml) chất lỏng cần kiểm tra, đo pH chất lỏng. Dùng ống hút vi lượng nhỏ dung dịch HCl 0,1N (n = 3,6) vào lọ trên cho đến khi pH = 4,0. Ghi lại độ chênh lệch pH

(dpH).

100

Công thức tính:



na . . dpH

1000 v .



Trong đó:

: Năng lực đệm tính trong 1000 lít chất lỏng

a: Lượng axit đã dùng (lượng HCl 0,1N )

n: Đương lượng gam của axit HCl 0,1N

dpH: Chênh lệch pH trước và sau sử lý

v: Lượng chất lỏng đã dùng

3.5.3.6. Môi trường đông lạnh tinh dịch chó ở -1960C

- Môi trường 1: Tris 3,634 g - Citric acid 1,99 g - fructose 0,5 g - lòng đỏ trứng gà 14 ml - penicillin 100 mg - streptomycin 100 mg - nước cất hai lần đủ 100 ml.

Phần A của môi trường không chứa Glycerol, phần B chứa 13% (v/v) Glycerol.

- Môi trường 2: Tris 1,3625 g - fructose 0,375 g - lactose 1,5 g - raffinose 2,7 g - citric acid 0,7615 g - lòng đỏ trứng gà 20 ml - penicillin 100 mg - streptomycin 100 mg - nước cất hai lần đủ 100 ml. Phần A của môi trường không

chứa Glycerol, phần B chứa 13% (v/v) Glycerol. 3.5.3.7. Đông lạnh tinh dịch chó ở -1960C Chuẩn bị dụng cụ và hoá chất:

a. Dụng cụ:

Các dụng cụ cần thiết gồm: dụng cụ pha môi trường, thu nhận tinh dịch,

kiểm tra tinh dịch.

Dụng cụ pha môi trường: các ống đong, bình tam giác có thể tích tương

ứng với lượng môi trường cần pha, đũa thuỷ tinh.

Dụng cụ thu nhận tinh dịch: cốc hứng tinh, các lọ thu mẫu bằng thuỷ tinh có thể tích 20 - 30 ml, các pipet pasteur nhựa, pipet thuỷ tinh 5 ml, nhiệt kế có thang đo 1000C.

Dụng cụ kiểm tra tinh dịch: kính hiển vi có độ phóng đại từ 40 đến 1000

lần, lam kính, lamen, bộ đếm hồng cầu, các ống eppendorf 1,5ml.

Các dụng cụ bằng thuỷ tinh được rửa sạch, tráng lại bằng nước cất sau đó bằng cồn, và sấy khô. Các dụng cụ bằng nhựa được rửa sạch, tráng bằng nước cất

và bằng cồn sau đó để khô tự nhiên.

b. Hoá chất:

Tris(hydroxymethyl)aminomethane, citric acid, fructose, Raffinose, penicillin, streptomycin, glycerol, lòng đỏ trứng gà, nước cất hai lần, eosin 5%, dung dịch nước muối sinh lý 0.85%, dung dịch nước muối 3%, cồn sát

trùng 70%.

Pha môi trường đông lạnh

Chuẩn bị môi trường đông lạnh: môi trường đông lạnh có các thành phần gồm: Tris 3,634 g - Citric acid 1,99 g - fructose 0,5 g - lòng đỏ trứng gà 14 ml - penicillin 100 mg - streptomycin 100 mg - nước cất hai lần đủ 100 ml. Để pha môi trường, nước cất hai lần được đun cách thuỷ đến sôi. Pha tris, citric acid, fructose với lượng nước vừa đủ, dùng đũa thuỷ tinh đánh tan, để nguội, sau đó bổ sung các kháng sinh, lòng đỏ trứng gà và dùng khuấy từ khuấy đều trong 30 phút. Sau khi pha, môi trường được chia làm 2 phần (môi trường A và môi trường B),

môi trường B được bổ sung glycerol với nồng độ 13 % (v/v) sau đó tiếp tục dùng khuấy từ khuấy đều trong 45 phút (chú ý: không khuấy quá mạnh để không làm chín lòng đỏ trứng). Môi trường sau khi pha được bảo quản ở 40C.

Thu nhận tinh dịch

Cần thiết có tối thiểu 1 người tham gia lấy tinh dịch và 1 người sẵn sàng kiểm tra mẫu. Tinh dịch được thu nhận bằng phương pháp massage, tinh được phóng trực tiếp vào cốc thuỷ tinh đã làm ấm ở 340C. Chỉ thu tinh dịch ở pha thứ hai của quá trình xuất tinh (pha giàu tinh trùng nhất).

Kiểm tra tinh dịch

Ngay sau khi thu nhận, tinh dịch được ghi lại thể tích trên cốc hứng tinh, chuyển tinh dịch vào cốc đựng mẫu, đưa vào nước ấm 340C đã chuẩn bị sẵn. Kiểm tra ngay pH của tinh dịch bằng giấy đo pH (pH của tinh dịch chó ổn định và dao động trong khoảng 6,5 - 7,0. Khi pH tinh dịch nằm ngoài khoảng dao

động đó, tinh dịch thường có chất lượng không tốt).

Kiểm tra hoạt lực tinh trùng tiến thẳng: một giọt tinh dịch được lấy ra và nhỏ lên lam kính, đậy lamen và đưa lên kính hiển vi kiểm tra ở độ phóng đại 100

và 400 lần. Hoạt lực được đánh giá theo phần trăm, với thang điểm 100%.

Kiểm tra nồng độ tinh trùng: tinh dịch được pha loãng 200 lần với dung dịch NaCl 3% bằng ống trộn hồng cầu và được đếm ngay, sử dụng buồng đếm

Newbouer.

Tỷ lệ tinh trùng sống và tỷ lệ tinh trùng kỳ hình: lấy một giọt tinh dịch được nhuộm bằng thuốc nhuộm eosin, làm tiêu bản quét. Tỷ lệ tinh trùng sống được đếm ngay lập tức trong vòng 1 - 2 phút sau khi nhuộm, đếm tối thiểu 200 tinh trùng có trên tiêu bản. Sau 2 phút, không nên đếm tiếp vì có thể sẽ không còn chính xác. Tiêu bản kỳ hình được làm cùng với tiêu bản sống chết, nhưng được để lại kiểm tra trong thời gian ủ mẫu ở 40C.

Pha loãng tinh dịch với môi trường

Sau khi đã xác định được nồng độ tinh dịch, pha loãng tinh dịch với môi trường A đã được cân bằng nhiệt trong cùng bể nước ấm ủ tinh dịch ở 34oC. Khi pha môi trường nên để môi trường chảy từ từ theo thành cốc đựng mẫu và lắc nhẹ cốc để tinh dịch hoà tan vào môi trường một cách từ từ. Lượng môi trường được tính toán để sao cho trong một cọng rạ có tổng số khoảng 150 triệu tinh trùng. Cốc

chứa tinh đã pha loãng được đặt vào trong một cốc khác có chứa nước được lấy từ chính bể cân bằng tinh dịch và được chuyển vào tủ bảo ôn ở nhiệt độ 40C.

Chú ý: tất cả các thao tác kiểm tra tinh dịch và pha loãng nên được làm

trong khoảng từ 5 - 10 phút.

Các bước chuẩn bị và đông lạnh tinh dịch chó

Bước 1. In cọng rạ

Đưa cọng rạ vào máy in, các thông số trên cọng rạ gồm: giống, tên (số

hiệu), nơi lấy tinh, ngày sản xuất tinh, nơi sản xuất.

Bước 2. Cân bằng tinh dịch và cọng rạ trong tủ bảo ôn ở 40 C trong 2 giờ.

Sau đó bổ sung môi trường B và tiếp tục ủ thêm 2 giờ.

Bước 3. Nạp tinh pha loãng vào cọng rạ:

Đưa cọng rạ đã được in số liệu vào máy, sau đó đưa tinh pha loãng của những con có số hiệu tương ứng lên máy lắc từ và để máy đóng cọng tự động. Sau khi nạp tinh, các cọng rạ được xếp lên khay và đưa ngay vào tủ cân bằng ở 40C.

Bước 4. Ủ tinh cọng rạ trong tủ cân bằng nhiệt độ 40 C trong thời gian 3 giờ.

Bước 5. Đông lạnh tinh cọng rạ: Nhiệt độ buồng đông lạnh được hạ dần

xuống -165oC trong 10 phút.

Bước 6. Thả tinh cọng rạ ở -1650C vào nitơ lỏng -1960C. Tinh cọng rạ được đựng trong các ống. Tinh cọng rạ sau 24 giờ bảo tồn trong nitơ lỏng, một cọng rạ được lấy ra một cách ngẫu nhiên từ mỗi mẫu tinh để giải đông và đánh

giá hoạt lực tiến thẳng, tỷ lệ tinh trùng kỳ hình, tỷ lệ tinh sống của tinh trùng

Bước 7. Giải đông tinh cọng rạ ở nước ấm 370C trong khoảng 30 giây - 60 giây. Bước 8. Kiểm tra chất lượng định kỳ: tinh cọng rạ bảo tồn ở -196 0C được

kiểm tra sau 1 tháng, sau 3 tháng và sau 4 tháng .

3.5.3.8. Phương pháp TTNT chó Malinois sử dụng tinh đông lạnh a. Dụng cụ, hoá chất và vật liệu

- Súng bắn tinh.

- Vaseline.

- Cồn khử trùng 70%.

- Nitơ lỏng và hộp đựng, panh sắt, kéo - Tinh cọng rạ bảo quản trong nitơ lỏng ở -1960C.

- Nước ấm 370C.

- Đồng hồ bấm giờ.

- Nhiệt kế có thang độ 100.

- Các thiết bị khác phục vụ cho giải đông, đánh giá chất lượng tinh dịch và

thụ tinh nhân tạo.

b. Tiến hành

- Kiểm tra chất lượng tinh dịch trước khi sử dụng thụ tinh nhân tạo (chỉ sử

dụng tinh dịch có hoạt lực tinh trùng sau giải đông ≥ 30%).

- Tinh đông lạnh dạng cọng rạ được giải đông bằng cách nhúng vào nước ấm

ở 370C trong 1 phút.

- Lắp cọng rạ vào súng bắn tinh đã được khử trùng bằng cồn 70% và được bôi

trơn bằng vaseline.

Thao tác thụ tinh nhân tạo

Giữ chó cái ở tư thế đứng, toàn bộ thân tạo thành một đường thẳng, điều

này giúp cho việc đưa súng bắn tinh vào tử cung một cách dễ dàng.

Tay thuận cầm súng bắn tinh, tay còn lại kích thích nhẹ vào âm đạo của

chó cái.

Tay thuận đưa súng bắn tinh vào âm đạo. Hướng súng bắn tinh chết từ

dưới lên trên với góc 45 độ, sau khi đưa được súng bắn tinh vào âm đạo, súng

bắn tinh có hướng song song với lưng của chó cái, tay kia vẫn kích thích nhẹ

nhàng vào âm đạo.

Súng bắn tinh được đưa vào khoảng 15-30 cm thì gặp cổ tử cung (cảm

giác khựng lại do gặp cổ tử cung). Thao tác nhẹ nhàng đưa đầu súng bắn tinh qua

cổ tử cung. Tiếp theo đó tay kia cố định súng bắn tinh ở điểm gần âm đạo, tay

thuận nhẹ nhành đẩy tinh dịch trong cọng rạ vào trong tử cung của chó cái. Sau

đó nhẹ nhàng đưa súng bắn tinh ra khỏi âm đạo, vỗ nhẹ vào hông để tạo phản xạ

đóng cổ tử cung, tránh tinh dịch chảy ra ngoài.

Theo dõi chó cái đã phối giống. Sau một tháng phối giống, khám thai

cho chó.

Toàn bộ qui trình thụ tinh nhân tạo cho chó sử dụng tinh đông lạnh dạng

cọng rạ được tóm tắt theo sơ đồ dưới đây:

QUY TRÌNH THỤ TINH NHÂN TẠO CHÓ SỬ DỤNG TINH ĐÔNG LẠNH

A ≥ 30%

Giải đông tinh cọng rạ bằng nước ấm 370C trong 1 phút Chuẩn bị dụng cụ thụ tinh nhân tạo

Lắp tinh cọng rạ vào súngbắn tinh Khử trùng và bôi vaseline cho súng bắn tinh

Dẫn tinh cho chó cái thụ tinh nhân tạo Theo dõi chó cái sau phối giống

Sơ đồ 3.1. Quy trình thụ tinh nhân tạo cho chó sử dụng tinh đông lạnh

dạng cọng rạ

3.5.4. Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu được xử lý theo chương trình phần mềm Excel 2007 và minitab 16.0.

PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀO THẢO LUẬN

4.1. SINH HỌC TINH DỊCH CHÓ MALINOIS

4.1.1. Một số đặc điểm sinh học tinh dịch chó Malinois

Kết quả nghiên cứu một số đặc điểm sinh học tinh dịch chó Malinois trình

bày ở bảng 4.1, cho thấy:

4.1.1.1. Thể tích tinh dịch

Thể tích tinh dịch chó ít và khác nhau giữa các cá thể trong cùng giống

chó Malinois và giữa các lần khai thác tinh. Thể tích tinh dịch trung bình của

giống chó Malinois là 1,94 ml. Trong đó, chó Ken có thể tích tinh dịch cao

nhất (2,58 ml), thấp nhất là chó Kaido (1,3 ml). Các chó: Ken (2,58ml), Zon

(2,05 ml), Fido (2,17ml), Miki (2,46 ml) cao hơn có ý nghĩa so với Kaido (1,3

ml), Cori (1,65ml) và Nick (1,35 ml). Thể tích tinh dịch chó Malinois trong

nghiên cứu của chúng tôi thấp hơn so với nghiên cứu của Riselaere et al.

(2002), thể tích tinh dịch chó thu được trong một lần lấy tinh là 3,9 ml. Tuy

nhiên, thể tích tinh dịch phụ thuộc vào lượng tinh thanh. Vì vậy, thể tích tinh

dịch chó Malinois thu được không phản ảnh rõ phẩm chất tinh dịch. Qua

nghiên cứu, chúng tôi nhận thấy: nếu mẫu tinh dịch chứa nhiều tinh thanh thì

phẩm chất tinh dịch thường kém.

4.1.1.2. Hoạt lực tinh trùng tiến thẳng

Hoạt lực tiến thẳng của tinh trùng phụ thuộc nhiều vào chế độ dinh

dưỡng, chăm sóc, tần suất khai thác tinh dịch và đặc biệt phụ thuộc vào sự thay

đổi thời tiết (nhiệt độ và ẩm độ), sự thay đổi thời tiết giữa các mùa.

Trong cùng giống chó Malinois, các cá thể khác nhau thì hoạt lực tinh

trùng khác nhau. Các chó nghiên cứu thì chó Ken, Cori, Fido, Miki, hoạt lực

tương ứng là 75,21%; 73,58%; 74,09; 74,02 cao hơn không có ý nghĩa (P >0,05)

so với các chó Kaido (70,45%), Zon (72,09%) và Nick (71,42%). Kết quả chúng

tôi thu được về hoạt lực tinh trùng tiến thẳng của chó Malinois thấp hơn so với

kết quả nghiên cứu của các tác giả của Riselaere và Cộng sự (2002), hoạt lực tiến

thẳng của tinh trùng chó là 78,7%.

Tên chó

Kaido

Ken

Zon

Cori

Fido

Nick

Miki

Trung bình

V (ml/lần)

1,30a ± 0,20

2,58b± 0,52

2,05b ± 0,34

1,65c ± 0,75

2,17b ± 0,45

1,35a ± 0,21

2,46b± 0,50

1,94 ± 0,45

A (%)

70,45 ± 3,75

75,21 ± 8,17

72,09 ± 7,07

73,58 ± 9,22

74,09 ± 6,21

71,42 ± 3,64

74,02 ± 8,25

72,86 ± 7,07

C(Triệu/ml)

240,48 ±14,15 241,30 ± 9,25

250,16± 9,18

265,73 ± 20,14

253,52± 7,89

245,43 ±14,52 239,30 ± 9,18

245,53 ± 10,66

V.A.C(Triệu/lần)

211,70a ± 24,16 445,28b ± 30,53 369,70b ± 22,6 322,62c ± 26,06

372,70b ± 19,5

215,77a ± 24,37 439,28b ± 30,09

329,42 ± 25,73

SL (%)

79,63 ± 27,34 85,44 ± 19,25

79,22 ± 13,52

87,61 ± 11,30

78,29 ± 13,17

80,35 ± 27,28 84,36 ± 29,22

81,55 ± 20,34

18,45a ± 9,22

17,45a ± 6,28

20,02b ± 8,30 18,85a ± 5,97

20,56b ± 7.59

18,64a ± 9,17

17,52a ± 6,42

18,85 ± 7,47

K (%)

6,50 ± 0,14

6,76 ± 0,31

6,73 ± 0,08

6,63 ± 0,17

6,84 ± 0,12

6,62 ± 0,15

6,68 ± 0,35

6,71 ± 0,32

Ghi chú: Các giá trị trong cùng một hàng có chữ cái (a, b,c) khác nhau thì sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0,05)

Bảng 4.1. Một số chỉ tiêu sinh học tinh dịch chó Malinois (n=54)

4.1.1.3. Nồng độ tinh trùng

Nồng độ tinh trùng phụ thuộc vào từng cá thể và các lần khai thác tinh

khác nhau, kỹ thuật khai thác tinh dịch và chế độ chăm sóc, nuôi dưỡng. Qua

theo dõi chúng tôi thấy những mẫu tinh dịch có nồng độ tinh trùng cao thường có

hoạt lực tinh trùng tiến thẳng tốt, phẩm chất tinh dịch tốt.

Nồng độ tinh trùng của các chó nghiên cứu thu được cao nhất ở chó Cori

(265,73 triệu/ml) và thấp nhất ở chó Miki (239,30 triệu/ml). Nồng độ tinh trùng

khác nhau không có ý nghĩa (P> 0,05) giữa các chó Malinois được nghiên cứu.

Kết quả này khá phù hợp với nghiên cứu của Farstadw (2000), Andersen

(1975). Tác giả cho rằng nồng độ tinh trùng của chó không cao, khoảng 250 triệu/ ml

nhưng kết quả này lại cao hơn nghiên cứu cuả Riselaerevà Cộng sự (2002) nồng độ tinh

trùng 204 triệu/ ml.

Qua nghiên cứu, chúng tôi nhận thấy: những mẫu tinh dịch có nồng độ tinh

trùng cao thường tinh trùng có hoạt lực tiến thẳng cao, phẩm chất tinh dịch tốt.

4.1.1.4. Tổng số tinh trùng tiến thẳng

Các chó được chọn để nghiên cứu là giống chó Malinois, được nuôi trong

cùng điều kiện chuồng trại, chế độ thức ăn và chế độ luyện tập của Cục Cảnh sát

quản lý, huấn luyện và sử dụng động vật nghiệp vụ (K204) – Bộ công an. Tuy

vậy, do phụ thuộc vào các yếu tố cá thể, độ tuổi nên tổng số tinh trùng tiến thẳng

trong một lần lấy tinh của các chó khác nhau có ý nghĩa (P < 0,05). Cụ thể, trong

07 chó Malinois được nghiên cứu, chó Ken có tổng số tinh trùng tiến thẳng cao

nhất (445,28 triệu/ lần), sau đó đến các chó Miki (439,28 triệu/ lần), Fido

(372,70 triệu/ lần), Zon (369,70 triệu/ lần), Cori (322,62 triệu/ lần), Nick (215,77

triệu/ lần) thấp nhất là tổng số tinh trùng tiến thẳng trong một lần khai thác của

chó Kaido (211,70 triệu/ lần).

Vì tổng số tinh trùng tiến thẳng trong một lần khai thác tinh xác định chất

lượng tinh dịch, chỉ số V.A.C cao thì phẩm chất tinh dịch tốt và ngược lại. Vậy qua

việc so sánh chỉ số V.A.C của 07 chó Malinois được nghiên cứu, có thể rút ra kết luận

chó Ken có phẩm chất tinh dịch tốt nhất, chó Kaido có phẩm chất tinh dịch kém nhất.

Kết quả của chúng tôi thấp hơn kết quả nghiên cứu của của Riselaere và Cộng

sự (2002), tổng số tinh trùng tiến thẳng trong một lần lấy tinh là 780,30 triệu/ ml.

4.1.1.5. Tỷ lệ tinh trùng sống

Trong 07 chó Malinois được nghiên cứu, tỷ lệ tinh trùng sống cao nhất ở chó Cori (87,61%) và thấp nhất ở Fido (78,29%). Tuy nhiên, tỷ lệ tinh trùng sống khác nhau không có ý nghĩa thống kê giữa các chó được nghiên cứu (P > 0,05)

Tỷ lệ tinh trùng sống trung bình của chó Malinois là 81,55% thấp hơn so với kết

quả nghiên cứu của Riselaere và cs. (2002) là 94%.

Hình 4.1. Tinh trùng sống - chết

4.1.1.6. Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình

Qua theo dõi chúng tôi nhận thấy các mẫu tinh dịch có nồng độ tinh

trùng thấp hoặc khai thác với mật độ dày thường có tỷ lệ tinh trùng kỳ hình cao.

Bảng 4.1 cho thấy: tỷ lệ tinh trùng kỳ hình cao nhất ở chó Fido (20,56%) và thấp nhất ở chó Ken (17,45%). Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình ở các chó Fido (20,56%), Zon (20,02%) cao hơn có ý nghĩa (P< 0,05) so với các chó Kaido (18,45%), Ken (17,45%), Cori (18,85%), Nick (18,64 %) và Miki (17,52%). Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình của các chó: Kaido, Ken, Cori, Nick, Miki khác nhau không

có ý nghĩa (P> 0,05).

Với tỷ lệ tinh trùng kỳ hình của các chó nêu trên, thì tinh dịch của các chó này đều đủ tiêu chuẩn để sử dụng trong thụ tinh nhân tạo. Tuy nhiên, vì tỷ lệ tinh trùng kỳ

hình phản ánh chất lượng tinh dịch, tỷ lệ tinh trùng kỳ hình cao thì chất lượng tinh

dịch kém, từ đây có thể kết luận phẩm chất tinh dịch của chó Fido là kém nhất.

Hình 4.2. Tinh trùng kỳ hình của chó Malinois

4.1.1.7. pH tinh dịch

Qua nghiên cứu, chúng tôi nhận thấy pH của tinh dịch chó Malinois nằm trong khoảng 6,50 – 6,84. Cụ thể, chó Kaido (6,50); Ken (6,76), Zon (6,73), Cori

(6,63), Fido (6,84), Nick (6,62), Miki (6,68).

Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học tinh dịch, đã giúp sơ bộ đánh giá phẩm chất tinh dịch của giống chó Malinois nuôi tại Cục Cảnh sát quản lý, huấn luyện và sử dụng động vật nghiệp vụ (K204) – Bộ Công an. Nhờ việc kiểm tra, đánh giá chất lượng tinh dịch chó Malinois, có thể xác định được chó đực có phẩm chất tinh dịch tốt, sẽ sử dụng tối đa để khai thác tinh dịch phục vụ cho việc đông lạnh tinh dịch và TTNT, chó có phẩm chất tinh dịch kém thì hạn chế sử dụng tinh dịch của những con này, đồng thời tìm biện pháp để nâng cao phẩm chất tinh dịch của những con chó Malinois này. Đặc biệt, với những con đực giống tốt, nhưng trong một thời gian, phẩm chất tinh dịch đột nhiên kém, chúng ta có thể nhận thấy sự thay đổi về phẩm chất tinh dịch chó, nhờ đó đưa ra những khuyến cáo cho người trực tiếp nuôi dưỡng, huấn luyện chó Malinois để cải thiện chế độ tập luyện, khẩu phần ăn, chế độ khai thác tinh dịch nhằm phục hồi phẩm chất tinh dịch chó, tránh để

mất đi những đực giống tốt.

Trước khi tiến hành đông lạnh tinh dịch để bảo tồn và TTNT, nếu không tiến hành kiểm tra một số chỉ tiêu sinh học tinh dịch thì không thể xác định được có

những mẫu tinh dịch chỉ chứa tinh thanh, hoàn toàn không có tinh trùng, vẫn tiến hành cho phối giống tự nhiên thì dù chó cái có tốt, thời gian phối giống thích hợp

cũng không thể thành công.

Như vậy, để quá trình đông lạnh tinh dịch bảo tồn ở -1960C và TTNT được hiệu quả cần thiết phải đánh giá một số chỉ tiêu sinh học tinh dịch của chó

Malinois trước khi thực hiện.

4.1.2. Tính chất lý hóa của tinh dịch chó Malinois

Chúng tôi nghiên cứu tính chất lý hóa của tinh dịch chó Malinois, từ đó

làm cơ sở nghiên cứu môi trường phù hợp để đông lạnh tinh dịch chó Malinois.

Kết quả nghiên cứu được trình bày ở bảng 4.2.

Tên đực giống

Tỷ trọng so với nước cất

Kaido Ken Zon Cori Fido Nick Miki Trung bình

Áp lực thẩm thấu (miliosmol/kg) 335,43 ± 4,51 342,85 ± 5,65 354,55 ± 5,16 368,69 ± 3,87 345,85 ± 6,85 371,52 ± 4,73 346,18 ± 3,56 349,12 ± 4,27

Năng lực đệm đối với axit HCl 0,1N 1278,75a ± 7,26 1251,89a ± 9,35 1326,65b ± 6,29 1359,53b ± 8,24 1342,87b ± 8,38 1324,52b ± 7,36 1297,45a ± 6,26 1321,19 ± 8,38

1,04 ± 0,31 1,03 ± 0,28 1,02 ± 0,36 1,02 ± 0,35 1,03 ± 0,42 1,02 ± 0,19 1,02 ± 0,45 1,03 ± 0,18

Độ nhớt so với nước cất 3,27a ± 0,37 3,25a± 0,28 3,27a ± 0,43 2,87b ± 0,19 3,37a± 0,34 3,35a ± 0,28 2,85b ± 0,32 3,12 ± 0,23

Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột có chữ cái (a,b) khác nhau thì sai khác có ý nghĩa thống kê

(P<0,05)

Bảng 4.2. Tính chất lý hóa của tinh dịch chó Malinois (n= 54)

Từ kết quả của bảng 4.2, chúng ta thấy:

Áp lực thẩm thấu tinh dịch của chó Nick cao nhất (371,52 miliosmol/kg), sau đó đến chó Cori (368,69 miliosmol/kg), chó Zon (354,55 miliosmol/kg), Miki (346,18 miliosmol/kg), Fido (345,85 miliosmol/kg), Ken (342,85 miliosmol/kg), thấp nhất là ALTT của chó Kaido (335,43 miliosmol/kg). Tuy nhiên, sự sai khác này không có ý nghĩa thống kê (P>0,05). Vậy khi lựa chọn môi trường đông lạnh tinh dịch chó Malinois, môi trường phù hợp phải có ALTT

không quá chênh lệch khoảng giá trị: 335,43 – 371,52 miliosmol/kg.

Năng lực đệm đối với axit HCl 0,1N của chó Cori cao nhất (1359,53) và thấp nhất ở chó Ken (1251,89). Như vậy, môi trường đông lạnh tinh dịch chó Malinois

phải có năng lực đệm không quá chênh lệch khoảng giá trị: 1251,89 – 1359,53.

Tỷ trọng so với nước cất của tinh dịch các chó Malinois được nghiên cứu lần lượt là: Kaido (1,04), Ken (1,03), Zon (1,02), Cori (1,02), Fido (1,03), Nick (1,02), Miki (1,02). Như vậy, khi lựa chọn môi trường đông lạnh tinh dịch chó Malinois, những môi trường có tỷ trọng so với nước cất tương đương với khoảng

giá trị 1,02 - 1,04 thì phù hợp.

Độ nhớt tinh dịch so với nước cất của các chó Malinois được nghiên cứu nằm trong khoảng 2,85 – 3,37. Cụ thể, độ nhớt tinh dịch của các chó nghiên cứu lần lượt là Kaido (3,27), Ken (3,25), Zon (3,27), Cori (2,87), Fido (3,37), Nick (3,35) và Miki (2,85). Vậy những môi trường đông lạnh tinh dịch chó Malinois

phải không quá chênh lệch khoảng giá trị 2,85 – 3,27.

4.2. NGHIÊN CỨU HOÀN THIỆN CÔNG NGHỆ ĐÔNG LẠNH TINH DỊCH CHÓ VÀ ỨNG DỤNG SẢN XUẤT TINH CHÓ MALINOIS ĐÔNG LẠNH BẢO TỒN Ở -196C

4.2.1. Tính chất hóa - lý của một số môi trường đông lạnh tinh dịch

Năng lực đệm

Tỷ trọng

Độ nhớt

Môi trường

Áp lực thẩm thấu (miliosmol/kg)

360,50  5,45

1331  144

1,025  0,05

3,225  0,62

6,62  0,09

MT 1

445,96 10,40

1344  269

1,040  0,09

2,758  0,72

6,96  0,06

MT 2

Bảng 4.3. Một số tính chất hoá - lý của các môi trường đông lạnh tinh dịch (n=20)

Từ kết quả bảng 4.3, nghiên cứu đã cho thấy một số tính chất lý hoá học của 2 môi trường đông lạnh tinh dịch chó. Trong đó môi trường 1 và môi trường 2 có các chỉ số lần lượt là: áp lực thẩm thấu là 360,5 và 445,96; năng lực đệm

1331 và 1344; tỷ trọng 1,025 và 1,040; độ nhớt 3,225 và 2,758; pH 6,62 và 6,96.

Căn cứ trên các chỉ số lý hóa học của tinh dịch chó Malinois thì môi

trường 1 hoàn toàn phù hợp để đông lạnh tinh dịch chó Malinois.

4.2.2. Ảnh hưởng của glycerol và dimethyl sulfoxide (DMSO) lên chất lượng tinh đông lạnh Hoạt lực tiến thẳng của tinh trùng trước đông lạnh khi môi trường có bổ sung glycerol (74,25%) và DMSO (72,50%) tương đương nhau và cao hơn có ý nghĩa thống kê (P<0,05) so với hoạt lực tiến thẳng của tinh trùng trước đông lạnh

khi môi trường được bổ sung glycerol kết hợp với dimethyl sulfoxide (67,45%).

Hoạt lực tiến thẳng của tinh trùng sau đông lạnh khi môi trường có bổ sung glycerol (39,80%) cao hơn có ý nghĩa thống kê (P<0,05) so với hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh khi môi trường bổ sung DMSO (34,05%) và khi bổ sung

glycerol kết hợp với dimethyl sulfoxide (30,55%).

Tỷ lệ kỳ hình của tinh trùng trước và sau đông lạnh khác nhau không có ý

nghĩa dưới ảnh hưởng của các chất bảo vệ lạnh được bổ sung vào môi trường.

Tỷ lệ sống của tinh trùng trước đông lạnh thấp hơn có ý nghĩa thống kê (P<0,05) trong trường hợp bổ sung glycerol kết hợp với dimethyl sulfoxide (76.70%) so với bổ sung riêng glycerol (82,50%) hoặc dimethyl sulfoxide (83,25%). Tỷ lệ sống của tinh trùng trước khi đông lạnh trong trường hợp bổ sung glycerol khác nhau không có ý nghĩa so với bổ sung dimethyl sulfoxide. Glycerol có ảnh hưởng tích cực lên tỷ lệ sống của tinh trùng sau đông lạnh. Tỷ lệ sống của tinh trùng sau đông lạnh cao hơn có ý nghĩa trong trường hợp môi trường có glycerol (65,45%) so với môi trường có dimethyl sulfoxide (59,55%)

và môi trường glycerol kết hợp với dimethyl sulfoxide (52,50%).

Hoạt lực tinh trùng (%)

Tỷ lệ kỳ hình của tinh trùng (%)

Tỷ lệ sống của tinh trùng (%)

Chất bảo vệ lạnh

Trước đông lạnh

đông lạnh

74,25a

39,80a

19,05

21,65

82,50a

65,45a

Glycerol 6,5%

± 3,15

± 3,32

± 2,055

± 2,45

± 3,20

± 3,25

72,50a

34,05b

18,50

21,60

83,25a

59,55b

DMSO 6.5%

± 4,15

± 2,35

± 3,25

± 2,10

± 4,40

± 2,54

67,45b

30,55c

19,40

23,85

76,70b

52,50c

Glycerol 3,25% + DMSO 3,25%

± 3,55

± 3,05

± 2,25

± 3,55

± 3,40

± 3,14

Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột có chữ cái (a,b,c) khác nhau thì sai khác có ý nghĩa thống kê

(P<0,05)

Bảng 4.4. So sánh ảnh hưởng của glycerol và DMSO lên chất lượng tinh dịch (n=54)

Với kết quả nhận được, cho thấy: glycerol là chất bảo vệ lạnh có ảnh

hưởng tích cực trong đông lạnh tinh dịch chó.

Hình 4.3. Ảnh hưởng của chất bảo vệ lạnh lên hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh

4.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ glycerol lên chất lượng tinh đông lạnh

Kết quả cho thấy glycerol có ảnh hưởng tích cực hơn trong quá trình đông lạnh tinh dịch chó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ glycerol lên chất lượng tinh dịch. Bổ sung glycerol vào môi trường đông lạnh với nồng độ 6,5%, 7% hoặc 8% thu được hoạt lực tiến thẳng của tinh trùng sau giải đông (40,61%, 39,03%, 37,03%) cao hơn có ý nghĩa so với bổ sung glycerol nồng độ 4% hoặc 10% (31,84%; 27,17%). Nồng độ glycerol 10% cho hoạt lực tiến thẳng của tinh trùng sau giải đông thấp, nhưng với nồng độ glycerol 10% có tác dụng tốt bảo vệ cấu trúc của tinh trùng trong quá trình đông lạnh và bảo tồn ở -1960C. Tỷ lệ kỳ hình của tinh trùng sau đông lạnh, giải đông đạt 23,96% trong trường hợp bổ sung 10% glycerol vào môi trường. Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình sau đông lạnh khác nhau không có ý nghĩa trong các trường hợp bổ sung glycerol với

các nồng độ 4%, 6,5%, 7%, 8%.

Kết quả của chúng tôi tương đồng với nghiên cứu của Trần Xuân Khôi (2013) trên chó Berger, bổ sung glycerol 6,5% - 7% cho tác dụng tốt nhất khi

đông lạnh tinh dịch.

Hoạt lực tinh trùng (%)

Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình (%)

Tỷ lệ tinh trùng sống (%)

Nồng độ Glycerol (%)

Trước động lạnh

Sau động lạnh

20,54 

26,49 

Glycerol 4,0

1,48

1,42

20,22 

25,46 

Glycerol 6,5

2,71

1,40

20,90 

26,01 

Glycerol 7,0

2,21

1,58

20,77 

26,03 

Glycerol 8,0

2,57

1,23

20,51 

23,96 

Glycerol 10,0

Trước động lạnh 70,84a  5,18 74,61a  3,52 73,34a  2,88 71,82a  3.85 66,92b  3,82

Sau động lạnh 31,84a  3,65 40,61b  3,14 39,03b  2,72 37,03b  2,68 27,17a  1,54

1,51

1,19

Trước động lạnh 81,63a  3,42 84,14a  3,05 82,18a  2,63 79,39a  4,11 76,42b  3,84

Sau động lạnh 54,14a  2,03 61,45b  3,83 62,24 b 3,62 57,86a  2,35 45,56c  4.71

Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột có chữ cái (a,b,c) khác nhau thì sai khác có ý nghĩa thống kê

(P<0,05)

Bảng 4.5. Ảnh hưởng của nồng độ glycerol trong môi trường lên chất lượng tinh đông lạnh (n=54)

Hình 4.4. Ảnh hưởng của nồng độ glycerol lên hoạt lực tinh trùng trước và sau đông lạnh

Tỷ lệ sống của tinh trùng sau đông lạnh, giải đông cao hơn có ý nghĩa trong trường hợp bổ sung glycerol với nồng độ 6,5 hoặc 7% so với nồng độ 4%, 8% hoặc 10%. Kết quả cho thấy bổ sung glycerol vào môi trường với nồng độ 6,5%

hoặc 7% có ảnh hưởng tốt lên sức sống của tinh trùng trong quá trình đông lạnh và bảo tồn ở -1960C.

4.2.4. Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung phần môi trường có glycerol lên chất lượng tinh đông lạnh

Hoạt lực tiến thẳng của tinh trùng trước đông lạnh khác nhau không có ý nghĩa ở các thời điểm bổ sung glycerol. Bổ sung phần môi trường có glycerol vào tinh dịch ở thời điểm sau 2 giờ ủ tinh pha loãng ở 40C, cho hoạt lực tiến thẳng của tinh trùng sau đông lạnh cao nhất (43,48%) và cao hơn có ý nghĩa so với với bổ sung môi trường có glycerol ở thời điểm 0 giờ (31,56%), 1giờ (37,65%), 3 giờ (35,49%) và 4 giờ (32,54%). Hoạt lực tiến thẳng của tinh trùng sau đông lạnh thấp nhất (31,56%) trong trường hợp bổ sung môi trường có

glycerol ở thời điểm 0 giờ.

Hoạt lực tinh trùng (%)

Tỷ lệ kỳ hình của tinh trùng (%)

Tỷ lệ sống của tinh trùng (%)

Thời điểm bổ sung glycerol

0 giờ

1 giờ

2 giờ

3 giờ

4 giờ

Trước đông lạnh 70,25 ± 3,12 73,60 ± 4,15 72,28 ± 3,47 70,75 ± 3,35 70,90 ± 2,54

Sau đông lạnh 31,56a ± 4,34 37,65b ± 3,39 43,48c ± 3,27 35,49b ± 2,42 32,54a ± 3,39

Trước đông lạnh 18,65 ± 2,35 20,24 ± 3,16 19,58 ± 2,42 21,70 ± 2,24 19,29 ± 3,08

Sau đông lạnh 24,25 ± 2,23 25,45 ± 3,09 24,45 ± 2,27 23,40 ± 2,37 25,85 ± 3,25

Trước đông lạnh 82,42 ± 4,35 80,71 ± 3,26 85,57 ± 4,46 82,25 ± 4,08 80,68 ± 5,32

Sau đông lạnh 55,43a ± 3,28 62,47b ± 3,36 65,04b ± 2,57 58,45a ± 3,42 59,39a ± 2,24

Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột có chữ cái (a,b,c) khác nhau thì sai khác có ý nghĩa thống kê

(P<0,05)

Bảng 4.6. Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung môi trường có glycerol lên chất lượng tinh chó đông lạnh (n=30)

Tỷ lệ kỳ hình của tinh trùng trước và sau đông lạnh khác nhau không có ý

nghĩa (P>0,05) ở các thời điểm bổ sung môi trường có glycerol.

Tỷ lệ sống của tinh trùng trước đông lạnh (85,57%) trong trường hợp bổ sung môi trường có glycerol ở thời điểm 2 giờ cao hơn có ý nghĩa (P<0,05) so với thời điểm bổ sung môi trường có glycerol ở thời điểm 0, 1, 3 hoặc 4 giờ (tỷ lệ

sống của tinh trùng tương ứng là 82,42%, 80,71%, 82,25%, 80,68%). Với kết quả nhận được cho thấy bổ sung phần môi trường có glycerol ở thời điểm sau 2 giờ ủ tinh dịch ở 40C cho phẩm chất tinh dịch sau đông lạnh tốt hơn so với bổ sung ở thời điểm 0 giờ, 1 giờ, 3 giờ hoặc 4 giờ.

Hình 4.5. Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung môi trường có glycerol lên hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh

4.2.5. Ảnh hưởng của thời gian ủ tinh dịch trước đông lạnh lên phẩm chất tinh đông lạnh

Thời gian ủ tinh dịch trước đông lạnh ảnh hưởng không có ý nghĩa lên hoạt lực tiến thẳng của tinh trùng trước đông lạnh, nhưng ảnh hưởng có ý nghĩa lên hoạt lực tiến thẳng của tinh trùng sau đông lạnh. Thời gian ủ tinh dịch trước đông lạnh cho hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh ở 4 giờ (32,45%), 6 giờ (38,65%), 8 giờ (38,78%) hoặc 10 giờ (36,96%) cao hơn có ý nghĩa (P<0,05) so với hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh khi ủ với thời gian 2 giờ (26,54%) trước đông lạnh. Thời gian ủ tinh dịch trước đông lạnh 6 giờ cho hoạt lực tiến thẳng của tinh trùng sau đông lạnh khác nhau không có ý nghĩa so với thời gian ủ tinh dịch 8 giờ hoặc 10 giờ.

Thời gian ủ tinh dịch trước đông lạnh ảnh hưởng không có ý nghĩa lên tỷ lệ kỳ hình của tinh trùng trước đông lạnh. Tuy nhiên, tỷ lệ tinh trùng kỳ hình sau đông lạnh có sự sai khác có ý nghĩa thống kê khi ủ tinh dịch ở các khoảng thời gian khác nhau. Cụ thể, ủ tinh dịch trong thời gian 2 giờ trước đông lạnh cho tỷ lệ tinh trùng kỳ hình là 27,29%, cao hơn có ý nghĩa so với tỷ lệ tinh trùng kỳ hình khi ủ tinh dịch trong thời gian 4,6,8,10 giờ (24,34%, 23,46%, 24,85%, 22,74).

Hoạt lực tinh trùng (%)

Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình (%)

Tỷ lệ tinh trùng sống (%)

Thời gian ủ tinh dịch trước đông lạnh

Trước đông lạnh

Sau đông lạnh

Trước đông lạnh

Sau đông lạnh

Trước đông lạnh

Sau đông lạnh

2 giờ

4 giờ

6 giờ

69,25  2,13 70,18  0,86 69,23  1,38

26,54a  1,26 32,45b  2,38 38,65c  1,35

20,87  2,35 20,78  1,72 20,59  2,15

27,29a  2,18 24,34b  1,34 23,46b  2,24

75,67  2,15 75,58  0,46 74,76  2,35

47,45a  4,36 67,29b  2,41 69,39b  1,46

8 giờ

70,24  2,18

38,78c  2,12

19,46  2,27

24,85b  3,57

76,49  2,24

68,27b  2,43

10 giờ

70,69  2,52

36,96c  2,27

20,45  2,41

22,74b  2,29

74,57  3,29

67,54b  2,29

Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột có chữ cái (a,b,c) khác nhau thì sai khác có ý nghĩa thống kê

(P<0,05)

Bảng 4.7. Ảnh hưởng của thời gian ủ tinh dịch trước đông lạnh lên phẩm chất tinh đông lạnh (n=30)

Hình 4.6. Ảnh hưởng của thời gian ủ tinh dịch trước khi đông lạnh lên hoạt lực tinh trùng

Thời gian ủ tinh dịch trước đông lạnh ảnh hưởng không có ý nghĩa lên tỷ lệ sống của tinh trùng trước đông lạnh, nhưng ảnh hưởng có ý nghĩa lên tỷ lệ sống của tinh trùng sau đông lạnh. Tỷ lệ sống của tinh trùng sau đông lạnh cao hơn có ý nghĩa trong trường hợp ủ tinh dịch 4 giờ, 6 giờ, 8 giờ, 10 giờ so với ủ tinh dịch trong khoảng thời gian 2 giờ. Tỷ lệ sống của tinh trùng khác nhau không có ý nghĩa khi ủ tinh dịch ở các khoảng thời gian 4 giờ (67,29%), 6 giờ (69,39%), 8 giờ (68,27%), 10 giờ (67,54%). Với kết quả nhận được, cho thấy thời gian ủ tinh dịch trước đông lạnh là 6 - 8 giờ cho hoạt lực của tinh trùng sau

đông lạnh tốt.

Kết quả của chúng tôi tương đồng với nghiên cứu của Trần Xuân Khôi (2013) khi nghiên cứu trên chó Berger (thời gian ủ tinh dịch trước đông lạnh trong 7 giờ).

4.2.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ đông lạnh lên chất lượng tinh đông lạnh

Chỉ tiêu theo dõi

Hoạt lực tinh trùng (%)

Trước đông lạnh 50C 70,70  1,22

Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình (%)

21,07  1,83

Tỷ lệ tinh trùng sống (%)

73,18  2,61

Sau đông lạnh -1300C 32,42a  3,27 25,92  0,99 49,14a  4,54

Sau đông lạnh -1650C 39,70b  3,71 23,84  1,61 68,15b  1,39

Ghi chú: Các giá trị trong cùng một hàng có chữ cái (a,b) khác nhau thì sai khác có ý nghĩa thống kê

(P<0,05) và ngược lại

Bảng 4.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ đông lạnh lên chất lượng tinh đông lạnh (n=30)

Tinh dịch sau khi nạp vào cọng rạ và tiếp tục ủ ở 40C trong 3 giờ được chuyển vào buồng đông lạnh. Hai chương trình đông lạnh tinh dịch được thực hiện: làm lạnh tinh cọng rạ đến -1300C hoặc -1650C sau đó nhúng vào nitơ lỏng - 1960C. Kết quả về ảnh hưởng của hai nhiệt độ đông lạnh lên chất lượng tinh sau đông lạnh - giải đông được thể hiện ở bảng 4.8. Kết quả cho thấy: phương pháp đông lạnh tinh dịch ảnh hưởng có ý nghĩa thống kê lên phẩm chất tinh dịch sau đông lạnh. Phương pháp hạ nhiệt độ tinh dịch xuống -1650C có tác dụng duy trì hoạt lực tiến thẳng của tinh trùng sau đông lạnh (39,70%) cao hơn có ý nghĩa thống kê (P<0,05) so với hoạt lực tiến thẳng của tinh trùng sau đông lạnh (32,42%) khi giảm nhiệt độ tinh dịch xuống -1300C trước khi nhúng tinh cọng rạ vào nitơ lỏng -1960C. Tỷ lệ sống của tinh trùng sau đông lạnh (68,15%) cao hơn có ý nghĩa thống kê (P<0,05) khi hạ nhiệt độ tinh dịch xuống -1650C so với tỷ lệ

T1: Trước đông lạnh T2: Đông lạnh xuống -130 C T3: Đông lạnh xuống -165 C

70.7

39.7

%) ( g n ù r t h n i t

32.42

c ự

l t ạ o H

sống của tinh trùng sau đông lạnh (49,14%) trong trường hợp hạ nhiệt độ tinh dịch xuống -1300C. Phương pháp đông lạnh tinh dịch ảnh hưởng không có ý nghĩa lên tỷ lệ kỳ hình của tinh trùng sau đông lạnh (25,92% so với 23,84%). Kết luận phương pháp hạ nhiệt độ tinh dịch xuống -1650C trước khi nhúng tinh cọng rạ vào nitơ lỏng có ảnh hưởng tốt hơn lên phẩm chất tinh trùng sau đông lạnh so với phương pháp hạ nhiệt độ tinh dịch xuống -1300C.

Hình 4.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ đông lạnh lên hoạt lực của tinh trùng

4.2.7. Ảnh hưởng của tốc độ giải đông lên phẩm chất tinh đông lạnh

Nhiệt độ giải đông (0C)

Thời gian giải đông (giây)

Hoạt lực tinh trùng sau giải đông (%)

Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình sau giải đông (%)

39,50  2,35

24,36  2,67

39,38  3,57

26,58  2,49

39,80  2,69

26,42  2,58

40,65  3,35

27,37  3,34

Tỷ lệ tinh trùng sống sau giải đông (%) 62,29a  3,35 72,41b  2,85 71,48 b 3,47 73,59 b 2,56

Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột có chữ cái (a,b) khác nhau thì sai khác có ý nghĩa thống kê

(P<0,05)

Bảng 4.9. Ảnh hưởng của tốc độ giải đông (nhiệt độ và thời gian) lên chất lượng tinh đông lạnh – giải đông (n=40)

Tinh đông lạnh cọng rạ được giải đông theo hai phương pháp (giải đông

chậm và giải đông nhanh). Giải đông chậm: nhúng tinh cọng rạ vào nước ấm 370C trong khoảng thời gian 15 giây, 30 giây, 60 giây. Giải đông nhanh: nhúng tinh đông lạnh vào nước nóng 700C trong khoảng thời gian 8 giây. Kết quả ảnh

hưởng của phương pháp giải đông và tốc độ giải đông lên phẩm chất tinh trùng

sau đông lạnh giải đông được thể hiện ở bảng 9. Kết quả cho thấy: phương pháp

giải đông tinh đông lạnh ảnh hưởng không có ý nghĩa lên hoạt lực tinh trùng sau

đông lạnh. Tuy nhiên, trong thực tế nên chọn phương pháp giải đông chậm, vì

phương pháp này có độ an toàn cao hơn phương pháp giải đông nhanh. Các

phương pháp giải đông tinh đông lạnh ảnh hưởng không có ý nghĩa lên tỷ lệ tinh

trùng kỳ hình và hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh.

Tốc độ giải đông tinh đông lạnh có ảnh hưởng lên tỷ lệ tinh trùng sống sau đông lạnh - giải đông. Giải đông tinh đông lạnh ở nhiệt độ 370C, trong các khoảng thời gian 30 giây hoặc 60 giây và giải đông ở nhiệt độ 70oC trong thời

gian 8 giây cho tỷ lệ tinh trùng sống cao hơn có ý nghĩa thống kê (P<0,05) so với giải đông ở nhiệt độ 37oC trong thời gian 15 giây.

Qua phân tích kết quả cho thấy giải đông tinh đông lạnh ở nhiệt độ 370C

với thời gian là 30 giây, 60 giây cho kết quả tốt về phẩm chất tinh trùng sau giải

đông và dễ áp dụng trong thực tiễn thụ tinh nhân tạo cho chó.

Tóm lại, nghiên cứu đã cho thấy, bổ sung Glycerol nồng độ 6,5% hoặc 7%

sau 2 giờ ủ có khả năng duy trì sức sống của tinh trùng tốt nhất. Thời gian ủ tinh dịch trước đông lạnh tối thiểu là 4 giờ. Giải đông tinh cọng dạ ở 370C trong 30

giây hoặc 60 giây cho kết quả phẩm chất tinh dịch tốt.

Dựa trên các kết quả nghiên cứu có được, chúng tôi đã xây dựng quy trình

công nghệ đông lạnh tinh dịch Malinois nhằm bảo tồn tinh dịch, phục vụ công

tác bảo tồn nguồn gen và thụ tinh nhân tạo.

Sơ đồ 4.1. Quy trình đông lạnh tinh dịch chó Malinois

4.2.8. Kết quả sản xuất đông lạnh tinh dịch của chó

4.2.8.1. Hoạt lực tinh trùng trong quá trình đông lạnh

Dựa trên phẩm chất tinh dịch của 7 chó Malinois nghiên cứu, chúng tôi

lựa chọn 4 cá thể chó Malinois chó phẩm chất tinh dịch tốt nhất để sản xuất tinh

đông lạnh cọng rạ.

Sau khi ổn định quy trình đông lạnh tinh dịch chó, đã thử nghiệm sản xuất được 219 liều tinh đông lạnh của 4 chó Malinois (chó Ken 60 liều, chó Zon 54 liều, chó Fido 50 liều, chó Miki 55 liều ). Hoạt lực tiến thẳng của tinh trùng sau giải đông đạt trung bình 40,45% (chó Ken: 40,52%, chó Zon: 38,29%, chó Fido:

41,36%, chó Miki: 40,58%).

Chỉ tiêu

Ken

Zon

Fido

Miki

74,58 ± 3,47 73,59 ± 2,52 74,36 ± 2,72 73,69± 2,34 74,05 ± 2,27

Hoạt lực tinh trùng của tinh nguyên (%)

70,36 ± 2,43 69,48 ± 3,27 68,96 ± 2,45 68,53±2,86 69,47 ± 3,42

Hoạt lực tinh trùng trước đông lạnh (%)

40,52 ± 4,46 38,29 ± 2,17 41,36 ± 3,67 40,58 ± 2,53 40,45 ± 3,74

Hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh (%)

219

Số cọng có hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh ≥30%.

Bảng 4.10. Hoạt lực tinh trùng trong quá trình đông lạnh (n=30)

Hoạt lực tinh trùng giảm dần trong quá trình ủ tinh dịch trước đông lạnh. Trong quá trình đông lạnh tinh dịch, sự giảm nhiệt độ đã gây hiện tượng sốc nhiệt đối với tinh trùng là nguyên nhân làm giảm hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh so với trước đông lạnh. Tuy nhiên hoạt lực của tinh trùng sau đông lạnh giải đông đạt tiêu chuẩn bảo tồn phục vụ cho thụ tinh nhân tạo và bảo tồn nguồn gen

chó Malinois.

So sánh với kết quả nghiên cứu của Đỗ Văn Thu (2010), hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh của chó Malinois(40,45%) tương đương với kết quả trên chó

Berger (40,84%) và Labrador(41,62%) nhưng cao hơn trên chó Cocker (38,75%).

4.2.8.2. Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình trong quá trình đông lạnh

Tinh nguyên sử dụng để đông lạnh có tỷ lệ tinh trùng kỳ hình trung bình là: 18,39%. Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình tăng dần trong khoảng ủ tinh dịch ở 40C trước đông lạnh (21,48%), như vậy với nhiệt độ 40C đã có ảnh hưởng đến cấu trúc hình thái của tinh trùng. Đông lạnh tinh dịch ở nhiệt độ âm là nguyên nhân

chính làm tăng tỷ lệ tinh trùng kỳ hình sau giải đông (25,23%). Kết quả này

tương đồng với kết quả của Đỗ Văn Thu (2010) khi sản xuất tinh đông lạnh chó

Berger và Labrador (25,31%). Trong thành phần của môi trường đông lạnh tinh

dịch có chất bảo vệ lạnh glycerol có tác dụng bảo vệ cấu trúc của tế bào tinh

trùng, tránh được hiện tượng kết tinh của nước trong quá trình đông lạnh, vì vậy

tỷ lệ kỳ hình của tinh trùng sau đông lạnh tuy tăng nhưng vẫn nằm trong giới hạn

cho phép để bảo tồn.

Chỉ tiêu đánh giá

Ken

Zon

Fido

Miki

18,25 ± 2,74 17,53 ± 2,41 18,62 ± 2,43 18,15 ± 2,26 18,39 ± 2,74

Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình của tinh nguyên (%)

20,63 ± 3,38 21,28 ± 2,58 22,42 ± 2,46 21,56 ± 2,52 21,48 ± 3,67

Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình của tinh pha loãng trước đông lạnh (%)

25,49 ± 3,19 23,76 ± 4,37 26,53 ± 4,59 25,87± 3,46 25,23 ± 4,38

Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình của tinh sau đông lạnh - giải đông (%)

Bảng 4.11. Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình trong quá trình đông lạnh (n=30)

4.2.8.3. Tỷ lệ sống của tinh trùng trong quá trình đông lạnh

Sự vận động của tinh trùng trong thời gian ủ tinh dịch đã làm tiêu hao

năng lượng dự trữ của tinh trùng, đặc biệt sự hạ nhiệt độ xuống dưới âm độ là

nguyên nhân giảm tỷ lệ sống của tinh trùng trong quá trình đông lạnh tinh dịch.

Tỷ lệ sống của tinh trùng ngay sau khai thác tinh đạt giá trị trung bình 87,69%.

Tỷ lệ sống của tinh trùng giảm trong thời gian ủ trước đông lạnh và đạt giá trị

trung bình 82,12%. Sự giảm nhiệt độ trong quá trình đông lạnh tinh dịch và sự

tăng nhiệt độ trong quá trình giải đông tinh đông lạnh là những yếu tố chủ yếu

ảnh hưởng đến giảm tỷ lệ sống của tinh trùng sau đông lạnh - giải đông. Tỷ lệ

sống của tinh trùng sau đông lạnh - giải đông đạt giá trị trung bình 69,34%. Kết

quả này thấp hơn không đáng kể so với kết quả sản xuất tinh đông lạnh trên chó

Berger của Đỗ Văn Thu (2010) là 70,52%. Với kết quả nhận được, cho thấy quy

trình đông lạnh tinh dịch chó Malinois mà chúng tôi đã nghiên cứu có tính ổn

định và đã sản xuất được 219 liều tinh cọng rạ có chất lượng tốt đảm bảo cho thụ

tinh nhân tạo và bảo tồn nguồn gen của chó Malinois.

Chỉ tiêu

Ken

Zon

Fido

Miki

87,43 ± 2,18 88,75 ± 3,35 86,38 ± 3,42 87,19 ± 2,58 87,69 ± 3,35

Tỷ lệ tinh trùng sống của tinh nguyên (%)

81,29 ± 3,34 84,21 ± 2,26 80,41 ± 2,57 81,13 ± 3,17 82,12 ± 2,67

Tỷ lệ tinh trùng sống của tinh dịch pha loãng trước đông lạnh (%)

70,46 ± 5,46 68,24 ± 4,15 69,54 ± 5,36 68,96 ± 3,65 69,34 ± 4,52

Tỷ lệ tinh trùng sống của tinh sau đông lạnh - giải đông (%)

Bảng 4.12. Tỷ lệ sống của tinh trùng trong quá trình đông lạnh (n=30)

4.2.9. Kết quả kiểm tra định kỳ chất lượng tinh chó Malinois đông lạnh 4.2.9.1. Hoạt lực tiến thẳng của tinh trùng chó Malinois đông lạnh trong thời gian bảo tồn ở -1960C

Tinh dịch chó Malinois sau khi đông lạnh được giải đông để đánh giá hoạt lực tiến thẳng của tinh trùng sau giải đông và trong thời gian bảo tồn ở -1960C. Chúng tôi giải đông tinh ở các thời điểm: ngay sau khi đông lạnh, sau 01 tháng, sau 03 tháng và sau 04 tháng. Kết quả đánh giá hoạt lực tiến thẳng của tinh trùng

sau giải đông của tinh đông lạnh chó Malinois được thể hiện ở bảng 4.13.

Hoạt lực tinh trùng tương ứng với thời gian bảo tồn

Mẫu tinh

đông lạnh

Sau đông lạnh

Sau 01 tháng

Sau 03 tháng

Sau 04 tháng

40,85%

40,50%

40,00%

Ken

38,75%

38,00%

Zon

41,62%

40,25%

40,00%

Fido

40,50%

40,00%

Miki

40,43%

39,69%

39,50%

Trung bình

Bảng 4.13. Hoạt lực tinh trùng của tinh đông lạnh trong thời gian bảo tồn ở -1960C (n=16)

Hoạt lực tinh trùng tiến thẳng sau giải đông giảm không có ý nghĩa trong thời gian bảo tồn. Ở cả 4 chó Malinois, hoạt lực tiến thẳng của tinh trùng sau giải đông tương đối ổn định ở tất cả các thời điểm giải đông: sau đông lạnh, sau 1 tháng, sau 3 tháng, sau 4 tháng bảo tồn. Cụ thể hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh của 4 chó Ken, Zon, Fido, Miki lần lượt là 40.85%; 38,75%; 41,62% và 40,05%. Hoạt lực tinh trùng của 4 chó trên ở thời điểm sau 3 tháng bảo tồn là 40,00%, 38,00%, 40,00%, 40,00% và ở thời điểm sau 4 tháng bảo tồn là 40,00%, 38,00%,

40,00%, 40,00%.

Với kết quả kiểm tra hoạt lực của tinh trùng sau giải đông cho thấy tinh

đông lạnh có chất lượng ổn định trong quá trình bảo tồn ở -1960C.

4.2.9.2. Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình của tinh đông lạnh trong thời gian bảo tồn ở - 1960C

Chúng tôi tiến hành giải đông tinh cọng rạ đông lạnh tại các thời điểm: ngay sau khi đông lạnh, sau 01 tháng, sau 03 tháng và sau 04 tháng, kết quả được

trình bày ở bảng 4.14.

Tỷ lệ kỳ hình của tinh trùng sau đông lạnh - giải đông tương ứng với thời gian bảo tồn

Mẫu tinh đông lạnh

Sau đông lạnh

Sau 01 tháng

Sau 03 tháng

Sau 04 tháng

Ken

24,27%

24,35%

24,59%

24,55%

Zon

25,39%

25,62%

25,77%

25,80%

Fido

23,41%

23,78%

23,98%

Miki

24,36%

24,51%

24,85%

24,90%

24,36%

24,56%

24,80%

24.80%

Trung bình

Bảng 4.14. Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình của tinh đông lạnh trong thời gian bảo tồn ở -1960C (n=16)

Số liệu thu được cho thấy, tỷ lệ tinh trùng kỳ hình trong cùng một giống chó ở các thời điểm giải đông khác nhau không có ý nghĩa thống kê (P>0,05). Cụ thể, đối với chó Ken, tỷ lệ tinh trùng kỳ hình trung bình được giải đông ngay sau khi đông lạnh là 24,27%. Sau 03 tháng bảo tồn, tỷ lệ này là 24,59%, và sau 4 tháng là 24,55%. Tương tự đối với 3 chó còn lại, sự khác nhau về tỷ lệ tinh trùng kỳ hình sau đông lạnh – giải đông khác nhau không có nghĩa thống kê. Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình sau đông lạnh – giải đông giữa các chó thí nghiệm khác nhau không có ý nghĩa thống kê (P>0,05).

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, chất lượng của tinh trùng bị ảnh hưởng lớn bởi các yếu tố thời gian khai thác, chất lượng con giống và môi trường bảo quản. Môi trường bảo quản có vai trò quan trọng trong việc duy trì chất lượng của tinh dịch trong thời gian bảo tồn, đảm bảo khả năng thụ tinh của tinh trùng sau khi giải đông. Ở nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành giải đông tinh đông lạnh ở nhiều thời điểm khác nhau, kết quả cho thấy tỷ lệ tinh trùng kỳ hình khác nhau không có ý nghĩa ở tinh dịch được giải đông ở thời điểm ngay sau đông lạnh và sau 04 tháng bảo quản. Điều này bước đầu cho phép chúng tôi kết luận, môi trường bảo quản đang sử dụng là phù hợp cho việc đông lạnh và bảo quản tinh dịch chó Malinois trong nitơ lỏng ở -1960C.

4.3. KẾT QUẢ THỤ TINH NHÂN TẠO CHO CHÓ MALINOIS

Chúng tôi tiến hành sử dụng tinh đông lạnh dạng cọng rạ của 4 chó Ken, Zon, Fido, Miki bảo tồn trong nitơ lỏng ở -1960C để thụ tinh nhân tạo cho 10 chó cái giống tại Cục Cảnh sát quản lý, huấn luyện và sử dụng động vật nghiệp vụ (K204) - Bộ Công an. Tỉ lệ mang thai đạt 60%, số con sinh ra là 44 trong đó tỉ lệ đực/cái là 22/20. Số chó con trung bình là 7 con/lứa. Khối lượng sơ sinh của chó con đạt trung bình 352g/con, tương đương với khối lượng sơ sinh của chó con

sinh ra do phối giống tự nhiên (350g/kg).

Có 4 chó không mang thai, tuy nhiên, việc chó không mang thai có rất nhiều nguyên nhân gây ra. Trong khuôn khổ của đề tài, chúng tôi không có đủ điều kiện và thời gian để đánh giá chính xác về nguyên nhân không mang thai ở

4 chó cái này.

Các tinh cọng rạ sử dụng cho thụ tinh có chất lượng đồng đều, hoạt lực tinh trùng sau giải đông đạt 38 - 40%. Sử dụng các cọng rạ có thể tích 0,25 ml, phối 2 cọng rạ/một lần (tương đương 50 x106 tinh trùng) và phối 2 lần. Khoảng cách thời gian giữa 2 lần phối là 48 giờ.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng hầu hết là các tinh cọng rạ có thời gian bảo tồn từ 20 ngày đến 70 ngày. Kết quả cho thấy tinh trùng chó Malinois được bảo quản dạng đông lạnh trong nitơ lỏng vẫn có chất lượng cao và ổn định theo thời gian. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa lớn, thành công trong nghiên cứu công nghệ đông lạnh tinh chó Malinois sẽ giúp cho việc bảo tồn nguồn gen quí

của những con chó có chất lượng tốt.

Số con

Liều phối (Cọng rạ

Khối lượng sơ sinh trung bình

Ngày đẻ

Đực

Cái

Chó cái giống

Ngày phối giống lần 1

Ngày phối giống lần 2

Tên đực giống

Hoạt lực tinh trùng sau giải đông

0,25 ml)

(g)

(22)

(20)

Ken

Igor

05.01. 2016

07.01. 2016

09.03.2016

320

Ken

Daisy

08.01. 2016

10.01. 2016

11.03.2016

375

Zon

Monika

15.01. 2016

17.01. 2016

Không chửa

Zon

Lady

27.01.2016

29.01.2016

28.03.2016

336

Fido

Melisa

28.01.2016

30.01.2016

Không chửa

Ken

Elsa

08.02.2016

10.02.2016

10.04.2016

381

Miki

Benzi

11.02. 2016

13.02. 2016

15.04.2016

306

Miki

Mony

12.02. 2016

14.02. 2016

Không chửa

Fido

Lusa

16.02.2016

18.02.2016

17.04.2016

394

Fido

Sera

25.02.2016

27.02.2016

Không chửa

Tổng số: 42 con

352

Bảng 4.15. Kết quả thụ tinh nhân tạo bằng tinh chó Malinois đông lạnh

PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

5.1. KẾT LUẬN

- Đánh giá được một số chỉ tiêu sinh học và tính chất lý - hóa học của tinh dịch chó Malinois. Lượng tinh dịch chó 1,94 ml, hoạt lực tinh trùng tiến thẳng 72,86%, nồng độ tinh trùng 245,53 triệu/ml, tỷ lệ tinh trùng sống 82,70%, tỷ lệ tinh trùng kỳ hình 18,85%, pH 6,71, Áp lực thẩm thấu 344,12 miliosmol/kg, năng

lực đệm 1314,19, tỷ trọng 1,03, độ nhớt 3,12.

- Xây dựng thành công môi trường đông lạnh tinh dịch chó Malinois. Đồng thời nghiên cứu được ảnh hưởng của một số yếu tố ảnh hưởng đến phẩm chất tinh dịch chó Malinois sau đông lạnh – giải đông: bổ sung chất bảo vệ lạnh glyceron 6,5 - 7% vào môi trường đông lạnh, thời gian ủ tinh dịch trong khoảng 6 - 8 giờ.

- Thụ tinh nhân tạo cho chó Malinois sử dụng tinh đông lạnh bảo tồn ở - 1960C. Tỷ lệ thụ thai đạt 60%, số chó con sinh ra là 42 con , số con trung bình là 7 con/ổ, tỷ lệ đực cái 22/20, khối lượng sơ sinh của chó con 352g/con.

5.2. KIẾN NGHỊ

Cho áp dụng công nghệ đông lạnh tinh dịch và TTNT chó Malinois vào

thực tiễn sản xuất.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Đỗ Văn Thu (2010). Ứng dụng công nghệ bảo tồn tinh dịch và thụ tinh nhân tạo chó để nhân giống và bảo tồn một số giống chó nghiệp vụ của ngành Công an. Báo cáo tổng kết đề tài cấp Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2. Đỗ Văn Thu và Nguyễn Anh (2008). Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học tinh dịch chó nghiệp vụ phục vụ cho công tác bảo tồn và thụ tinh nhân tạo. Tạp chí sinh học. 03(30). tr. 169-175.

3. Đỗ Văn Thu, Nguyễn Anh và Nguyễn Tuấn Anh (2008). Nghiên cứu môi trường

pha loãng tinh dịch chó bảo tồn ở 5oC. Tạp chí sinh học. 01(30). tr. 87-93.

4. Đỗ Văn Thu, Đoàn Việt Bình, Lê Thành Đô, Lê Thị Huệ, Trần Xuân Khôi và Võ Thị Ninh (2013). Nghiên cứu ảnh hưởng của Glycerol và ethylene glycol lên chất lượng tinh chó đông lạnh bảo tồn ở -196oC. Báo cáo hội nghị khoa học công nghệ sinh học toàn quốc, tr. 917-921.

Trần Xuân Khôi (2013). Nghiên cứu hoàn thiện công nghệ đông lạnh tinh dịch chó Berger. Luận văn Thạc sỹ, Đại học Thái Nguyên.

Tài liệu nước ngoài

6. Andersen (1975). Insermination with frozen dog semen based on a new

insermination technique. Zuchthygien. Vol 10. pp. 1-4

7. Cardoso Rde. C., A. R. Silva, D. C. Uchoa and L. D. da Silva (2003). Cryopreservation of canine semen using a coconut water extender with egg yolk and three different glycerol concentrations. Theriogenology. Vol 59(3-4). pp. 743- 751.

8. Chemineau and Y. Caynie (1991). Training manual on artificial insemination in

sheepand goats. FAO. Animal production and Health. 83 – Rome, Italia.

Farstad W. and K. A. Berg (1989). Factors influencing the success rate of artificial insemination with frozen semen in the dog. Journal of reproduction and fertility. Supplement. Vol 39. pp. 289-292.

technology

in canid species.

10. Farstad W. (2000). Assisted reproductive Theriogenology. Vol 53 (1). pp. 175-186.

11. Hermansson U. and C. Linde-Forsberg (2006). Freezing of stored, chilled dog

spermatozoa. Theriogenology. Vol 65. pp. 584-593.

Tài liệu trong nước

12. Linde-Forsberg C. and M. Forsberg (1993). Results of 527 controlled artificial inseminations in dogs. Journal of reproduction and fertility. Supplement. Vol 47. pp. 313-323.

13. Linde-Forsberg C., B. Strom Holst and G. Govette (1999). Comparison of fertility data from vaginal vs intrauterine insemination of frozen-thawed dog semen: a retrospective study. Theriogenology. Vol 52(1). pp. 11-23.

14. Linde-Forsberg C. (1991). Achieving canine pregnancy by using frozen or chilled extended semen. Vet Clin North Am Small Anim Pract. Vol 21(3). pp 467-485.

15. Nizanski W., A. Dubiel, W. Bielas and G. J. Dejneka (2001). Effects of three cryopreservation methods and two semen extenders on the quality of dog semen after thawing. Journal of reproduction and fertility. Supplement. Vol 57. pp. 365-369.

16. Pena A. and C. B. Linde-Forsberg (2000). Effects of spermatozoal concentration and post-thaw dilution rate on survival after thawing of dog spermatozoa. Theriogenology Vol 54(5). pp. 703-718.

17. Pinto C. R., D. L. Paccamonti and B. E. Eilts (1999). Fertility in bitches artificially

inseminated with extended, chilled semen. Theriogenology. Vol 52(4). pp. 609-616.

18. Platz C. C. and S. W. Seager (1977). Successful pregnancies with concentrated

frozen canine semen. Lab Anim Sci. Vol 27(6). pp. 1013-1016.

19. Rijsselaere T., A. Van Soom, D. Maes, A. de Kruif (2002). Effect of in vivo survival of fresh diluted canine spermatozoa.

centrifugation on Theriogenology. Vol 57. pp. 1669-1681.

20. Rohloff D., C. Laiblin and S. Heidrich (1978). Cryoprotective ability of glycerin and DMSO in the deep freezing of dog sperm. Berl Munch Tierarztl Wochenschr. Vol 91(2). pp. 31-33.

21. Rota A., A. Frishling, I. Vannozzi, F. Camillo and S. Romagnoli (2001). Effect of the inclusion of skimmed milk in freezing extenders on the viability of canine spermatozoa after thawing. Journal of reproduction and fertility. Supplement. Vol 57. pp. 377-381.

22. Rota A., B. Strurm and C. Linde-Forsberg (1995). Effects of seminal plasma and three extenders on canine semen stored at 40C. Theriogenology. Vol 44. pp. 855-900.

23. Salisbury G. W. W. (1978). Physiology of reprodution and artificial insemination of cattle, Second Edition, Fracisco. WW. H. Framan and Company Samsuddin M, Y. Amiri and M.M.U Bhuiyan.

24. Seager S. W. and C. C. Platz (1977). Artificial insemination and frozen semen in

the dog. Vet Clin North Am. Vol 7(4). pp. 757-764.

25. Silva A. R., R. C. Cardoso, D. C. Uchoa and L. D. Silva (2003). Quality of canine semen submitted to single or fractionated glycerol addition during the freezing process. Theriogenology. Vol 59(3-4). pp. 821-829.

26. Silva L. D., K. Onclin, B. Lejeune and J. P. Verstegen (1996). Comparisons of intravaginal and intrauterine insemination of bitches with fresh or frozen semen. Vet Rec. Vol 138(7). pp. 154-157.

27. Sirivaidyapong S., P. Ursem, M. M. Bevers and B. Colenbrander (2001). Effect of prostatic fluid on motility, viability and acrosome integrity of chilled and frozen- thawed dog spermatozoa. Journal of reproduction and fertility. Supplement. Vol 57. pp. 383-386.

28. Thomassen R., W. Farstad, A. Krogenaes, J. A. Fougner and K. A. Berg (2001). Artificial insemination with frozen semen in dogs: a retrospective study. Journal of reproduction and fertility. Supplement. Vol 57. pp. 341-346.

29. Tsutsui T., T. Tezuka, Y. Mikasa, H. Sugisawa, N. Kirihara, T. Hori and E. Kawakami (2003). Artificial insemination with canine semen stored at a low temperature. The Journal of Veterinary Medical Science. Vol 65(3). pp. 307-312.

30. Yildiz C., A. Kaya, M. Aksoy and T. Tekeli (2000). Influence of sugar supplementation of the extender on motility, viability and acrosomal integrity of dog spermatozoa during freezing. Theriogenology. Vol 54(4). pp. 579-585.